CN104845950A - 对血液中抑制剂具有增加的抗性的热稳定性a型dna聚合酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有增强的对DNA聚合酶活性抑制剂的抗性的DNA聚合酶突变体。所述突变体聚合酶特别适合于含有野生型聚合酶抑制剂的样品中的靶标的PCR扩增。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年2月14日提交的美国临时申请No.61/940,172的优先权。将该申请的内容通过提述完整并入本文。
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。更具体地说,本发明涉及改进的用于进行聚合酶链式反应(PCR)的聚合酶并涉及进行PCR的方法。
发明背景
PCR是应用最广泛的核酸检测方法之一。该方法在感染性疾病和遗传性紊乱的研究和分子诊断中具有广泛应用。在许多应用中,对基于血液的PCR诊断的需求尤多。
一方面,血液是人体循环系统的一个重要部分。它包括许多类型的宿主细胞,包括正常细胞、病变细胞(例如,循环肿瘤细胞),并且,如果宿主是怀孕的母亲,还包括胎儿细胞,以及来自这种细胞的遗传物质,比如microRNA。事实上,基于血液的PCR由于其最小介入性在一些情况下,诸如使用母体血液样品进行胎儿诊断时具有优势,其没有与常规羊水检查相关的流产风险。在某些情况下,血液也含有病原体,如病毒和细菌。对应地,基于血液的诊断可以提供人体内任何给定的时间的情况的即时图景。在另一方面,血液是用于在许多创伤或病理情况下提高生活质量和挽救生命的各种药品和血液制品(例如全血、血浆、抗体、和干细胞)的来源。血液、血浆、和其他血源性成分的治疗用途要求这些成分的捐献尽可能地不受病变细胞(例如肿瘤细胞)或病原体(例如HIV、HBV、和HCV)的污染。参阅,例如,美国申请20130316925、20130157253、20120329061、20120070827、20120034614、20070281307、和20070105121。
然而,基于血液的PCR诊断受到了许多后勤和技术挑战的限制。来自生物样品的核酸诊断(nucleic acid diagnostics)伴随着多方面的挑战。复杂生物样 品,诸如血液和细胞裂解液,具有多种能抑制PCR反应中使用的DNA聚合酶的组分。这些组分包括血液中的血红蛋白、免疫球蛋白G、乳铁蛋白和蛋白酶。尽管已经开发了在尝试PCR反应之前纯化样品的各种规程,但这些步骤通常耗时、费力,并且可能达不到后续PCR所要求的纯化。此外,含有核酸的细胞(例如白细胞和胎儿细胞)仅仅占了血样的一小部分,宝贵的核酸可能在PCR反应步骤之前从样品中丢失。
当操作血液时,一个关键点在于血样应该收集在抗凝剂中以防凝固,因为从凝固的血中分离核酸的效率低下,且大多数细胞将损失在凝块中。然而,在血样收集中例行使用的抗凝剂,如EDTA和肝素等,会干扰或抑制PCR。例如,肝素是高度带负电荷的,会与DNA共提取,从而抑制PCR反应。参阅,例如,García等J.Clin.Microbiol.2002年4月第40卷第4期1567-1568,和Yokota等Journal of Clinical Laboratory Analysis,第13卷,第3版,第133–140页,1999。
因此,需要对上述抑制剂更具抗性且适用于使用血样的PCR反应的试剂,如DNA聚合酶。
发明内容
本发明涉及热稳定性A型DNA聚合酶突变体,其对全血中的抑制剂具有增加的抗性,所述抑制剂包括天然血液组分(红细胞中的血红蛋白、白细胞中的乳铁蛋白)或血浆(免疫球蛋白G)、或添加的抗凝剂(如EDTA和肝素)。
相应地,在一方面,本发明提供了分离的突变的热稳定性A型DNA聚合酶。所述突变体聚合酶包括、其基本组成为、或其组成为:第一突变,其位于野生型Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO:4)的残基507处或在另一种热稳定性A型DNA聚合酶中与所述野生型Taq DNA聚合酶的残基507对应的残基处;和其他突变,它们位于所述野生型Taq DNA聚合酶的残基59、155、245、和749处,或位于另一种热稳定性A型DNA聚合酶中的对应残基处。所述突变体聚合酶具有(i)DNA聚合酶活性和(ii)高于它所来源的野生型DNA聚合酶的对聚合活性抑制剂(例如天然血液组分,或EDTA或肝素等抗凝剂)的抗性。所述突变体聚合酶在野生型Taq DNA聚合酶的残基375或734处或另一种热稳定性A型DNA聚合酶中的对应残基处没有突变。该突变体可还具备与野生型DNA聚合酶比较更快的聚合速率。
在一些实施方案中,所述野生型A型DNA聚合酶包括、其基本组成为、或其组成为选自SEQ ID NOs:1-10的序列。所述突变体DNA聚合酶与选自SEQ ID NOs:1-10的序列具有至少70%(例如75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)的同一性。在一个实例中,所述野生型Taq DNA聚合酶包括、其基本组成为、或其组成为SEQ ID NO:4的序列。换言之,所述突变体聚合酶为突变体Taq DNA聚合酶。
在优选的实施方案中,在所述突变体中的第一突变是基于SEQ ID NO:4的序列的E507K突变。在更优选的实施方案中,所述突变体含有以下5个突变:G59W、V155I、L245M、E507K、和F749I。例如,所述突变体可以是包含、基本组成为或组成为SEQ ID NO:11的序列的突变体。在其他实施方案中,所述突变体可以是具有上述5个突变并且与SEQ ID NO:11的序列具有至少70%(例如75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)同一性的DNA聚合酶。
本发明进一步提供了组合物(例如,用于PCR反应的预混物(master mix)),其包含:(i)上述突变体DNA聚合酶,和(ii)一种或多种选自下组的试剂:含水缓冲液、二价金属(例如,镁)、延伸核苷酸、引物、去污剂、检测剂(例如,特异性或非特异性染料或荧光分子)、和靶核酸模板。还提供了试剂盒,所述试剂盒含有:所述突变体DNA聚合酶或上述组合物、及其包装材料。所述试剂盒可以包括一种或多种选自下组的试剂:含水缓冲液、二价金属、延伸核苷酸、引物、探针、去污剂、检测剂、染料、荧光分子、抗凝剂、和细胞裂解剂。
上述突变体DNA聚合酶可以在引物延伸方法或扩增靶核酸的方法中使用。该方法包括以下步骤:提供疑似含有靶核酸的试验样品(例如,血液样品);使该试验样品与突变体聚合酶、与所述靶核酸的链特异性结合或杂交的引物、以及延伸核苷酸接触而形成混合物;以及在允许聚合酶利用所述靶核酸的序列作为模板延伸引物的条件下温育所述混合物,以实现所述延伸核苷酸的掺入。该方法可以是PCR方法,并且在这种情况下,可以使用与上述靶核酸链的互补物特异性结合或杂交的第二引物。该试验样品可以是以占该混合物的至少1%(2%、5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%)v/v的血液样品。
上述突变体DNA聚合酶、组合物(例如,用于PCR反应的预混物)、和 方法对基于血液样品的PCR反应是特别有用的。例如,它们可以用于对点样在Guthrie卡上的全血(没有抗凝剂)或对血浆(通过将用抗凝剂处理过的全血离心去除细胞而制成)的实时PCR。在这种应用中,全血样品可以部分地纯化(通过附着到Guthrie卡上或通过离心去除红细胞)以去除血红素或其他使荧光检测淬灭的因子。
本发明的另一个方面提供了编码上述突变体DNA聚合酶多肽的分离核酸。所述核酸可以含有与SEQ ID NO:12至少70%(例如,80%、85%、90%、95%、或99%)相同的序列。本发明还提供了包含所述核酸的载体(如表达载体)和包含所述核酸的宿主细胞。所述核酸、载体和宿主细胞可以用于产生本发明的突变体DNA聚合酶多肽。相应地,本发明还提供了产生所述多肽的方法。该方法包括在培养基中在允许由所述核酸编码的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞,并从该经培养的细胞或该细胞的培养基纯化出该多肽。
本发明的一个或多个实施方案的详情在以下说明书中阐明。根据说明书和权利要求书将容易想到本发明的其他特征、目的、和优点。
附图简述
图1显示了可以加以突变而产生本发明的工程改造DNA聚合酶的多种示例热稳定性A型DNA聚合酶的比对。
图2是显示在含有10-50%v/v肝素处理的全血的PCR反应中Taq突变体1C2和2C2扩增人IGF基因的322-bp片段的照片。
图3A-图3C为一组显示在(A)2.5%v/v EDTA处理的全血、(B)25%v/v EDTA处理的全血、和(C)45%v/v EDTA处理的全血的存在下比较Taq突变体1C2的活性和不同来源的DNA聚合酶的活性的照片。
图4A-图4C为一组显示在(A)2.5%v/v肝素处理的全血、(B)25%v/v肝素处理的全血、和(C)45%v/v肝素处理的全血的存在下比较Taq突变体1C2的活性和不同来源的DNA聚合酶的活性的照片。
图5A-图5F为一组显示在含有5-30%v/v肝素处理的全血的PCR反应中6个Taq突变体扩增人IGF基因的322-bp片段的照片。
具体实施方案
本发明部分地基于一个出乎意料的发现,即某些突变体DNA聚合酶比其对应的野生型对存在于血液样品中的抑制剂更具抗性。
1.突变体DNA聚合酶
在第一方面,本发明提供了经遗传工程改造的或突变的、分离的DNA聚合酶,其可能适合在PCR反应中使用。
如本文中公开的,本发明的经工程改造的DNA聚合酶对特定DNA聚合酶的一种或多种抑制剂具有抗性。更具体地说,根据本发明的这个方面的DNA聚合酶与它所来源的野生型DNA聚合酶相比包含至少一个突变,所述突变允许在PCR过程中存在一种或多种可将野生型DNA聚合酶的聚合速率降低到不允许在PCR反应中成功地形成产物的水平的抑制剂的条件下,实现可接受水平的DNA聚合或期望产物的正确扩增。可以使用本领域已知的用于确定聚合酶活性和/或产物形成的任何测定,例如,如在以下实例中描述的测定。
本发明的这个方面的DNA聚合酶典型地具有(i)在SEQ ID NO:4(野生型嗜热水生菌(Thermus aquaticus)Taq DNA聚合酶)的残基507处、或者在另一种热稳定性A型DNA聚合酶中与野生型Taq DNA聚合酶的残基507对应的残基处的第一突变;和(ii)在野生型Taq DNA聚合酶的残基59、155、245、和749处、或者在另一种热稳定性A型DNA聚合酶中的对应残基处的其他突变。图1列出了这种野生型DNA聚合酶的10个实例和它们的一级氨基酸序列的比对。在图1中可以找到每种聚合酶中的对应于SEQ ID NO:4的59、155、245、507、和749的残基。在示例实施方案中,以下突变存在于Taq DNA聚合酶中,或者存在于与SEQ ID NO:4的这些残基对应的残基处:G59W、V155I、L245M、E507K、和F749I。以下显示的是一个示例突变体Taq 1C2的氨基酸序列以及它的编码序列(分别为SEQ ID NOs 11和12),其中所述5个突变加有下划线:
SEQ ID NO:11
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDWDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHILHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDMAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNT TPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTKKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAINMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE
SEQ ID NO:12
ATGCGTGGCATGCTTCCTCTTTTTGAGCCCAAGGGCCGGGTCCTCCTGGTGGACGGCCACCACCTGGCCTACCGCACCTTCCACGCCCTGAAGGGCCTCACCACCAGCCGGGGGGAGCCGGTGCAGGCGGTCTACGGCTTCGCCAAGAGCCTCCTCAAGGCCCTCAAGGAGGACTGGGACGCGGTGATCGTGGTCTTTGACGCCAAGGCCCCCTCCTTCCGCCACGAGGCCTACGGGGGGTACAAGGCGGGCCGGGCCCCCACGCCGGAGGACTTTCCCCGGCAACTCGCCCTCATCAAGGAGCTGGTGGACCTCCTGGGGCTGGCGCGCCTCGAGGTCCCGGGCTACGAGGCGGACGACGTCCTGGCCAGCCTGGCCAAGAAGGCGGAAAAGGAGGGCTACGAGGTCCGCATCCTCACCGCCGACAAAGACCTTTACCAGCTCCTTTCCGACCGCATCCACATCCTCCACCCCGAGGGGTACCTCATCACCCCGGCCTGGCTTTGGGAAAAGTACGGCCTGAGGCCCGACCAGTGGGCCGACTACCGGGCCCTGACCGGGGACGAGTCCGACAACCTTCCCGGGGTCAAGGGCATCGGGGAGAAGACGGCGAGGAAGCTTCTGGAGGAGTGGGGGAGCCTGGAAGCCCTCCTCAAGAACCTGGACCGGCTGAAGCCCGCCATCCGGGAGAAGATCCTGGCCCACATGGACGATCTGAAGCTCTCCTGGGACATGGCCAAGGTGCGCACCGACCTGCCCCTGGAGGTGGACTTCGCCAAAAGGCGGGAGCCCGACCGGGAGAGGCTTAGGGCCTTTCTGGAGAGGCTTGAGTTTGGCAGCCTCCTCCACGAGTTCGGCCTTCTGGAAAGCCCCAAGGCCCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCCCCGCCGGAAGGGGCCTTCGTGGGCTTTGTGCTTTCCCGCAAGGAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTGGCCCTGGCCGCCGCCAGGGGGGGCCGGGTCCACCGGGCCCCCGAGCCTTATAAAGCCCTCAGGGACCTGAAGGAGGCGCGGGGGCTTCTCGCCAAAGACCTGAGCGTTCTGGCCCTGAGGGAAGGCCTTGGCCTCCCGCCCGGCGACGACCCCATGCTCCTCGCCTACCTCCTGGACCCTTCCAACACCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGCGGGGAGTGGACGGAGGAGGCGGGGGAGCGGGCCGCCCTTTCCGAGAGGCTCTTCGCCAACCTGTGGGGGAGGCTTGAGGGGGAGGAGAGGCTCCTTTGGCTTTACCGGGAGGTGGAGAGGCCCCTTTCCGCTGTCCTGGCCCACATGGAGGCCACGGGGGTGCGCCTGGACGTGGCCTATCTCAGGGCCTTGTCCCTGGAGGTGGCCGAGGAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAGGTCTTCCGCCTGGCCGGCCACCCCTTCAACCTCAACTCCCGGGACCAGCTGGAAAGGGTCCTCTTTGACGAGCTAGGGCTTCCCGCCATCGGCAAGACGAAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACCAGCGCCGCCGTCCTGGAGGCCCTCCGCGAGGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCCTGCAGTACCGGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGACCCCTTGCCGGACCTCATCCACCCCAGGACGGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCAGACGGCCACGGCCACGGGCAGGCTAAGTAGCTCCGATCCCAACCTCCAGAACATCCCCGTCCGCACCCCGCTTGGGCAGAGGATCCGCCGGGCCTTCATCGCCGAGGAGGGGTGGCTATTGGTGGCCCTGGACTATAGCCAGATAGAGCTCAGGGTGCTGGCCCACCTCTCCGGCGACGAGAACCTGATCCGGGTCTTCCAGGAGGGGCGGGACATCCACACGGAGACCGCCAGCTGGATGTTCGGCGTCCCCCGGGAGGCCGTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGGCATGTCGGCCCACCGCCTCTCCCAGGAGCTAGCCATCCCTTACGAGGAGGCCCAGGCCTTCATTGAGCGCTACTTTCAGAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAGACCCTGGAGGAGGGCAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCCGCCGCCGCTACGTGCCAGACCTAGAGGCCCGGGTGAAGAGCGTGCGGGAGGCGGCCGAGCGCATGGCCATCAACATGCCCGTCCAGGGCACCGCCGCCGACCTCATGAAGCTGGCTATGGTGAAGCTCTTCCCCAGGCTGGAGGAAATGGGGGCCAGGATGCTCCTTCAGGTCCACGACGAGCTGGTCCTCGAGGCCCCAAAAGAGAGGGCGGAGGCCGTGGCCCGGCTGGCCAAGGAGGTCATGGAGGGGGTGTATCCCCTGGCCGTGCCCCTGGAGGTGGAGGTGGGGATAGGGGAGGACTGGCTCTCCGCCAAGGAGTAA
本发明的这个方面的DNA聚合酶比其野生型对应物对用肝素或EDTA处理的血液更具抗性。这些DNA聚合酶对Taq DNA聚合酶的其他抑制剂也可以更具抗性。这些其他抑制剂的实例包括全血(具有或不具有抗凝剂)、全血的级分(例如使用Guthrie卡血点收集的那些)、或血液成分(如血浆、血红蛋白、血红素、免疫球蛋白G、和乳铁蛋白);细胞裂解物(如含有抑制浓度的多肽的的细胞裂解物);植物物质(如果胶、木聚糖、和酸性多糖类);发现于土壤样 品中的物质(如腐殖酸(humic acid)、黄腐酸(fulvic acid)、和金属离子,包括重金属和重金属离子);和某些有机溶剂。抑制剂的其他非限制性实例包括尿素、有机和酚类化合物(例如,苯酚)、糖原、脂肪、钙、纤维素、硝酸纤维素、矿物油、花粉、滑石粉(glove powder)、SDS和去污剂。各种其他的抑制剂在本领域是已知的,包括但不限于在Kermekchiev等"Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples",Nucleic Acids Research,第1卷,第14页,2008年;和Abu Al-Soud,W.等,"Capacity of Nine Thermostable DNA Polymerases To Mediate DNA Amplification in the Presence of PCR-Inhibiting Samples",Applied and Environmental Microbiology,第64卷,第10期,1998年10月中论述的那些抑制剂。由于来自受试者的血液样品的分析在医疗和法医分析中是重要的,对血液或血液级分中发现的抑制剂(包括普遍添加到血液中稳定血液并且防止凝固的抑制剂(例如,EDTA和/或肝素)的抗性)是根据本发明的突变体酶的一项特征。
在优选的实施方案中,根据本发明的工程改造的DNA聚合酶既具备对至少一种以上提及的DNA聚合酶抑制剂(例如EDTA和/或肝素)的增加的抗性,又具有相比于它们的野生型对应物的增加的DNA聚合速率。因此这样的聚合酶能够以增加的速率从被引发的DNA模板聚合核酸链,即使在众所周知可抑制野生型DNA聚合酶的聚合速率的物质存在下也是如此。
如本文中使用的,术语“遗传工程改造的”可与“突变的”互换使用,指示这样的蛋白质或核酸,其序列已经相对于野生型序列被改变,从而包括不同于其来源的野生型蛋白质或核酸中的对应残基或核苷酸的氨基酸残基或核苷酸。因此根据本发明的突变体包括定点突变体,其中特定的残基已经被有意地改变,包括一个或多个残基的缺失;一个或多个残基的插入;一种A型DNA聚合酶的一个或多个残基被替换为外源序列如另一种A型DNA聚合酶的对应序列。在进行一个或极少数残基的替换/取代而产生突变体的情况下,鉴定“突变体所来源(自其衍生)”的DNA聚合酶是轻而易举的。然而,在序列的区域被其他序列区域替换的情况下,理解这一点即已足够:突变体可以视为“来源于”该突变体对其显示同一性的任何野生型热稳定性A型DNA聚合酶,尤其是以下图1中显示的任何一种示例性野生型DNA聚合酶(SEQ ID NO:1-10)。
在本文中详细论述的示例性实施方案中,本发明的这些DNA聚合酶是野 生型Taq DNA聚合酶的突变体形式,这些DNA聚合酶具有改变的特征,这些改变的特征提供基于突变体聚合酶的有利特性。然而,应当理解的是,本发明不限于以下详细论述的示例性实施方案。例如,本发明包括Taq DNA聚合酶之外的其他聚合酶的突变体,例如任何热稳定性A型家族DNA聚合酶的突变体。这些突变体可以是包括但不限于来自栖热菌属(Thermus)或热袍菌属(Thermatoga)的物种的那些聚合酶的突变体。有很多证据证明,而且本领域技术人员充分理解,各种热稳定性A型DNA聚合酶显示出高水平的序列同一性和保守性。因此,鉴定一种特定的A型DNA聚合酶与另一种DNA聚合酶的残基相对应的残基对于本领域技术人员而言是一件简单的事情。因此,本文提到的野生型Taq DNA聚合酶中的特定突变可以容易地与其他聚合酶中的对应突变关联起来。
图1呈现了若干非限制性示例性热稳定性A型DNA聚合酶的一级氨基酸序列的比对。如在图1中所示,热稳定性A型DNA聚合酶的不同区域高度保守,而其他区域可变。本领域技术人员会立即认识和理解的是,除了在本文中具体地鉴定和论述的这些突变之外,可以在A型DNA聚合酶的可变区中进行突变,而不改变或基本上不改变经突变的酶的聚合酶活性。同样,可以在保守残基处进行保守突变,而不改变或基本上不改变经突变的酶的聚合酶活性。基于突变酶与其他相关酶的比较结构分析在分子生物学领域是普通而有用的技术,其允许技术人员合理地预测给定突变对酶的酶活性的影响。使用氨基酸的结构数据和已知物理性质,本领域技术人员可以突变酶,诸如本发明所涵盖的DNA聚合酶,而不改变或基本上不改变这些酶的基本酶学特性。
如本文中使用的,术语“分离的多肽”指的是已经从与其天然伴随的其他蛋白质、脂质、和核酸分开的多肽。所述多肽可以构成纯化制备物的按干重计至少10%(即包括10%与100%之间的任何百分比,例如,20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、和99%)。可以通过任何适当的标准方法,例如通过柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或HPLC分析测定纯度。可以通过重组DNA技术或通过化学方法产生本发明的分离的多肽。
两个氨基酸序列或两个核酸的“同一性百分比”使用Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990,按照Karlin和Altschul在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中所述改良)来确定。这样的算法 被整合在Altschul等J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序中(版本2.0)。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索,评分=100,字长-12,以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索,评分=50,字长=3,以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在空位的情况下,可以采用空位(Gapped)BLAST,如描述于Altschul等,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997。当采用BLAST和空位BLAST程序时,可以使用对应程序(例如,XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
上述DNA聚合酶肽/多肽/蛋白质的氨基酸组成可以变化,而不破坏在如本文所述的引物延伸反应条件和/或PCR反应条件下在EDTA-或肝素-处理的血液的存在下催化DNA复制的能力。例如,它可以含有一个或多个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是将某个氨基酸残基替换成具有相似侧链的氨基酸残基的取代。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此,在上述序列如SEQ ID NO:11中预测的非必需氨基酸残基优选地被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替换。或者,可以沿着序列的全部或部分随机地引入突变,诸如通过饱和诱变随机地引入突变,对于得到的突变体,可以筛选其在本文所述的PCR条件下催化DNA复制的能力,以鉴定出保留了如下文(例如在US 20110027833)中所述的活性的突变体。
可以在上述野生型嗜热水生菌Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO:4)的每个残基处或上面提到的其他野生型DNA聚合酶(例如,SEQ ID NO:1-3和5-10)的对应残基处进行多种突变,具体可以提到与本文公开的突变体有关的以下非限制性的突变,这些突变体在SEQ ID NO:4的G59、V155、L245、E507、和F749处具有突变。在一些实施方案中,在这些位置处的每个残基被改变为相应的基于侧链相似性的家族的另一个成员。
正如本领域技术人员会立即认识到,通过在未指明的一个或多个残基处对那些示例性SEQ ID NO进行一个或多个保守取代,可以容易地产生它们的等价序列。这样的等价序列保留了突变体酶的关键聚合酶特征。对于不同氨基酸的各种保守取代在上文进行了论述,并且是本领域已知的。对Taq DNA聚合酶和其他A型DNA聚合酶的DNA聚合酶活性而言的重要区域和残基已得到良好表征,本领域技术人员熟知可以改变哪些区域和残基而不破坏感兴趣的DNA聚合酶的活性。参阅,例如Albà,Replicative DNA polymerases,Genome Biol.2001;2(1):reviews3002.1–reviews3002.4和Steitz,DNA Polymerases:Structural Diversity and Common Mechanisms,June 18,1999The Journal of Biological Chemistry,274,17395-17398。
在图1中提供了选择的一些热稳定性A型聚合酶的示例性比较,以便读者理解这组酶内的保守区和可变区;然而,本领域技术人员将知晓其他可以以基本上不改变本文论述的活性的方式实施的变化。鉴于重组蛋白的产生是当今生物技术领域中的例行程序,并且作为聚合酶测定法,如Taq DNA聚合酶测定法,是众所周知的,并且被广泛地在作为常规测定法实施,使用本文中提供的信息产生根据本发明的突变体聚合酶对于本领域技术人员而言是例行程序。自动化和非常强大的技术与试剂盒允许技术人员快速地和例行地鉴定根据本发明的突变体,并且鉴定感兴趣的聚合酶活性的特定水平(即,在抑制剂存在下的聚合速率)。
本发明还提供了本发明肽、多肽、或蛋白质的功能等价物,所述功能等价物指的是所述肽、多肽、或蛋白质的多肽衍生物,例如具有一个或多个点突变、插入、缺失、截短的蛋白质、融合蛋白、或它们的组合。它基本上保留上述DNA聚合酶在本文所述的PCR条件(例如,含有已用EDTA和/或肝素预处理过的血液样品的PCR反应混合物,所述血液样品占该混合物的至少1%(例如,2%、2.5%、5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%)v/v)下的活性。分离的多肽可以含有SEQ ID NO:11或其功能性片段或等价物。一般而言,功能等价物与SEQ ID NO:11具有至少70%(例如,包括在70%和100%之间(含)的任何数值,例如,70%、75%、80%、85%、90%、95%、和99%)的同一性。
在本发明中描述的多肽可以作为重组多肽获得。为了制备重组多肽,编码它的核酸可以与编码融合伴侣的另一种核酸连接,所述融合伴侣例如谷胱 甘肽-s-转移酶(GST)、6x组氨酸表位标签、或M13基因3蛋白。得到的融合核酸在适合的宿主细胞中表达可通过本领域已知的方法分离的融合蛋白。分离的融合蛋白可以进一步处理,例如通过酶消化进一步处理,以去除所述融合伴侣并且获得本发明的重组多肽。或者,本发明的肽/多肽/蛋白质可以化学合成(参阅例如,Creighton,"Proteins:Structures and Molecular Principles,"W.H.Freeman&Co.,NY,1983)、或通过如本文所述的重组DNA技术产生。为获得另外的指导,技术人员可以查阅Frederick M.Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,2003;和Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,"Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,2001)。
本发明的突变体DNA聚合酶可以提供为纯化或分离的形式,或者可以是组合物的一部分。优选地,在组合物的情况下,这些突变体DNA聚合酶首先被纯化到一定程度,优选地达到高纯度水平(例如,约80%、90%、95%、或99%或更高)。根据本发明的组合物可以是任何期望类型的组合物,但一般为水性组合物,所述水性组合物适合用作用于靶核酸的扩增(尤其是基于血液的扩增,例如通过利用PCR技术)的组合物,或者被包含在这样的组合物中。这些组合物一般包含至少一种不同于突变体DNA聚合酶的物质,例如水、甘油或另一种稳定剂、水性缓冲剂、水性盐缓冲液、二价金属(例如镁)等等。在示例性实施方式中,这些组合物包含PCR反应中通常存在的溶剂、盐、缓冲剂、核苷酸、和其他试剂中的一些或全部。因此,在一些实施方案中,这些组合物包含镁盐(例如,氯化镁或硫酸镁)、一种或多种三磷酸核苷、一种或多种核酸引物或探针、一种或多种另外的核酸聚合酶或其具有期望活性的片段、一种或多种聚合检测剂(例如,特异性或非特异性染料或荧光分子)、和/或用于扩增或测序的一种或多种核酸模板。其他示例性物质包括去污剂、DMSO、DMF、明胶、甘油、甜菜碱、亚精胺、T4基因32蛋白、大肠杆菌SSB、BSA、和硫酸铵。本领域技术人员很清楚各种可以被包括在聚合反应组合物中的物质,因此无需提供穷尽的清单。
2.核酸、载体、和宿主细胞
本发明还提供了编码任何以上提及的突变体DNA聚合酶的核酸。优选地,所述核酸是分离的和/或纯化的。核酸指的是DNA分子(例如,但不限于,cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如,但不限于,mRNA)、或DNA或RNA类似物。DNA或RNA类似物可以从核苷酸类似物合成。核酸分子可以是单链 或双链的。“分离的核酸”是这样的核酸,其结构不同于任何天然存在的核酸或天然存在的基因组核酸的任何片段的结构。因此,该术语覆盖,例如:(a)DNA,其具有某个天然存在的基因组DNA分子的某个部分的序列,但是在该DNA的侧翼并不都是在该分子天然出现的生物体中位于该分子的这个部分侧翼的编码序列;(b)核酸,其已经以一定方式组入到载体或原核生物或真核生物的基因组DNA中,这种方式使得得到的分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不相同;(c)分离的分子,例如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段、或限制性片断;和(d)重组核苷酸序列,其构成杂合基因(即编码融合蛋白的基因)的一部分。
本发明还提供了具有本文中描述的一个或多个核苷酸序列的重组构建体或载体。构建体的实例包括载体,诸如质粒或病毒载体,在所述载体中以正向或反向插入了本发明核酸序列。在优选的实施方案中,所述构建体进一步包括调节序列,包括与所述序列可操作连接的启动子。大量的适合的载体和启动子对于本领域技术人员是已知的,并且可商购获得。适当的供原核和真核宿主使用的克隆和表达载体还描述于Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)。
载体指的是一种核酸分子,其能够运送已与其连接的另一个核酸分子。所述载体可以能够自主复制或整合到宿主DNA中。载体的实例包括质粒、粘粒、或病毒载体。本发明的载体包括核酸,其处于适合在宿主细胞中表达该核酸的形式。优选地,该载体包括与有待表达的核酸序列可操作连接的一个或多个调节序列。“调节序列”包括启动子、增强子、和其他表达控制元件(例如,多腺苷酸化信号)。调节序列包括指导核苷酸序列的组成型表达的调节序列、以及诱导型调节序列。表达载体的设计可取决于诸多因素,如有待转化、转染、或感染的宿主细胞的选择、期望的蛋白质的表达水平,等等。
表达载体的实例包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列,例如猿猴病毒40(SV40)、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、来源于质粒与噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、和伪狂犬病病毒的衍生物。然而,可以使用任何其他载体,只要它在宿主中可复制和能存活即可。可以通过多种程序将适当的核酸序列插入载体中。一般而言,可以通过本领域已知的程序将编码以上描述的多肽之一的核酸序列插入适当的限制性内切核酸酶位点。这样的程序和有关亚克隆程序在本领 域技术人员的技能范围内。
该表达载体还可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点、和转录终止子。该载体可以包括适当的用于增大表达的序列。另外,该表达载体优选地含有一种或多种可选择标记基因,以提供用于经转化的宿主细胞的选择的表型性状,如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性、或例如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。
含有适当的如上所述的核酸序列以及适当的启动子或控制序列的载体可以用来转化、转染、或感染适当的宿主,以允许该宿主表达上述多肽(例如,SEQ ID NO:11)。合适的表达宿主的实例包括细菌细胞(例如,大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌)、真菌细胞(酵母)、昆虫细胞(例如,果蝇属和草地贪夜蛾(Sf9))、动物细胞(例如,CHO、COS、和HEK 293)、腺病毒和植物细胞。适当宿主的选择在本领域技术人员的技能范围内。在一些实施方案中,本发明提供了通过用具有编码上述的聚合酶多肽之一的核苷酸序列的表达载体转化、转染、或感染宿主细胞来产生上述的聚合酶多肽的方法。然后在允许多肽表达的合适条件下培养这些宿主细胞。
3.方法和用途
本发明的突变体DNA聚合酶适合于各种用途,包括引物延伸、核酸聚合反应、以及其他需要DNA聚合酶的用途。
例如,这些工程改造的突变体DNA聚合酶可以在引物延伸、或自引物或引物组以及核酸模板聚合核酸的方法中使用。一般而言,这些方法包括:(A)使根据本发明的工程改造的DNA聚合酶暴露于(例如合并在一起、混合、接触等等)(1)靶核酸和(2)至少一个适合于引发与该靶核酸的一条链互补的核酸的聚合的引物,并且(B)使聚合酶、靶核酸、一种或多种引物暴露于(例如使其经受)允许核酸从引物(一个或多个)聚合的条件。使聚合酶暴露于其他物质的步骤可以是任何导致所述的物质暴露于彼此,而使得它们能以物理方式相互作用的动作。因此它可以包括将这些物质一起添加到组合物中,将组合物(即,混合物)中的物质混合在一起,等。暴露可以完全或部分人工地进行、或者完全或部分自动地进行(即,通过机械、机器人等)。正如本领域技术人员已知的,可以拷贝、扩增、测序等的核酸有许多种。因此,本发明不限于靶核酸、其序列、长度,等等。此外,本领域技术人员完全清楚在设计用于引发基于靶核酸模板的核酸聚合作用的引物时要考虑的参数。因此,本发明并不限于这 些引物的身份或序列。应理解的是,在期望扩增(例如,PCR)的情况下,应当使用具有不同的序列、并且具有针对靶核酸的相反链上的两个不同序列的特异性的两个引物。另外,使合并的物质暴露于允许聚合的条件的步骤可以是任何允许聚合的动作。适合于聚合的许多条件是本领域已知的,本领域技术人员可以根据情况需要选择任何适当的条件,而不需要不适当或过度的实验。有待考虑的参数包括但不一定限于,盐浓度、金属离子或螯合剂浓度、缓冲剂浓度和身份、去污剂和有机溶剂的有无、聚合酶或其他酶的浓度、核苷酸或修饰的核苷酸的存在或浓度、聚合抑制剂或终止剂的存在或浓度、用于检测聚合产物的探针或染料的存在或浓度、温度、和暴露的时间长度。在示例性实施方案中,允许从引物聚合核酸的条件是用于PCR反应的条件。如本领域技术人员将认识到的,使物质暴露于聚合条件的步骤可以被视为聚合步骤,例如扩增核酸模板的步骤。
这些聚合酶可以有利地在用于核酸的扩增(包括DNA扩增和RNA扩增两者)的PCR反应的任何变化形式或类型中使用。对于RNA模板(例如,mRNA或microRNA)的扩增,可以使用RNA依赖的DNA聚合酶(例如,反转录酶;RT)制作与RNA模板互补的DNA链,且本发明的DNA聚合酶可以用来扩增DNA互补链。
在一些示例性实施方案中,对诸如血液之类的“脏的”样品进行PCR法。一般而言,如本文中使用的,“脏”样品是包含未明确的物质的样品,未明确的物质一般原本存在于靶核酸存在的环境中。因此,脏的样品一般是这样的样品,其中的靶核酸在参加聚合反应之前未被纯化。
因此,聚合酶突变体和有关方法可以通过各种方式使用。例如,它们可以用于检测处于病原体感染早期的血液感染,并且更特别地,用于从受试者(例如患者)的一定体积的血液中检测低浓度的循环中病原体、或者检测生物制品中的病原体。这样的病原体的实例包括真菌、细菌(例如,结核分枝杆菌和幽门螺杆菌)和病毒(例如,HIV、HBV、和HCV)。它们还可以用于检测与癌症或遗传性紊乱相关联的基因突变、标志物或多态性(例如,单核苷酸多态性)。此外,它们还可以用于分析稀有细胞,例如母体血液样品中的胎儿细胞或微转移肿瘤细胞。由于这些细胞的低丰度,并且由于所述生物样品除了感兴趣的稀有细胞之外还包含大部分其他细胞或组织材料,这些细胞的检测常常是复杂的。分析稀有细胞和其他可用性有限的生物材料的能力使得开发侵入性 更小的新诊断方法成为可能。参阅,例如,美国申请20130316925、20130157253、20120329061、20120070827、20120034614、20070281307、20070105121、20050009108、和20020155519。这些参考文献均通过提述整体并入本文。
本发明的这些聚合酶由于具有更高的聚合速率,也特别适合用于“快速PCR”反应,诸如描述于例如US20110027833(其内容通过提述并入本文)中的那些反应。此外,由于它们对发现于血液和血液制品中的抑制剂的抗性,它们尤其适合用于含有血液或血液级分的样品的“快速PCR”反应。优选地,它们很好地适合用于例如含有已经用抗凝剂(如EDTA和肝素)处理过的血液或血液级分的“脏”样品的“快速PCR”反应。
在一些实施方案中,在所述方法中使用具有不同序列的两种或更多种引物。例如,在一些实施方案中使用两种引物,其中一个引物与模板DNA的一条链特异性地结合,另一个引物与该模板DNA的另一条链结合,从而允许产生双链聚合产物。在一些实施方案中,一个引物对于存在于单链RNA模板(例如mRNA)上的序列是特异性的。从第一个引物聚合RNA的第一互补链,从而为第二个引物提供模板。在第一聚合之后,第一引物可以从模板RNA引发聚合,或者可以从DNA互补物引发聚合。在该方法中可以包括具有针对靶核酸的序列特异性的一个或多个核酸探针(当靶为单链时,包括靶的互补链),以提供用于检测的手段。
许多PCR方法包括允许检测聚合(例如,扩增)产物的探针、染料、或其他物质。这样的方法的一个实例是实时PCR。因此,所述方法可以包括在聚合反应中纳入为聚合产物的检测提供条件的物质的步骤。此外,本发明方法涵盖这样的方法:该方法包括一个或多个对照反应,用以确定该方法或特定的方法步骤是否已经成功进行。这些对照反应可以是阳性对照反应或阴性对照反应。本领域技术人员完全能够设计适当的对照反应条件,而没有必要在本文中详述具体步骤。
4.试剂盒
本发明涵盖用于核酸拷贝、引物延伸、或扩增以便检测靶序列的试剂盒和诊断系统。为此,用于本文公开的方法的一种或多种反应成分可以提供为试剂盒的形式,供靶核酸检测中使用。在这样的试剂盒中,适量的一种或多种反应成分被提供在一个或多个容器中或者保持在支持物上(例如,通过静电相互作用或共价结合)。
本文中描述的试剂盒包括上述的一种或多种突变体DNA聚合酶。所述试剂盒可包括容纳本发明的一种或多种突变体DNA聚合酶的一个或多个容器。试剂盒可以包含在单个容器中的单一突变体聚合酶、容纳相同突变体DNA聚合酶的多个容器、容纳本发明的两种或更多种不同的突变体DNA聚合酶的单个容器、或容纳不同突变体DNA聚合酶或容纳两种或更多种突变体DNA聚合酶的混合物的多个容器。本发明试剂盒涵盖DNA聚合酶(一种或多种)和容器的任何组合或排列。在优选的实施方案中,所述试剂盒包括1)含有聚合酶、缓冲剂(含Mg2+)、和核苷酸的3个分开的管或2)含有聚合酶、缓冲成分、Mg2+、和核苷酸的混合物的预混物。试剂盒的使用者可以增加适合的核酸模板或含有这样的模板的试验样品(例如,血液)和引物,这取决于其目的和测定法设计。聚合酶和/或缓冲剂(或预混物)可进一步含有一种或多种去污剂,且还可以含有热启动抗体。用于实时PCR的预混物可另外含有染料。
所述试剂盒还可以含有另外的用于实施上述方法的材料。在一些实施方案中,所述试剂盒含有用于进行利用根据本发明的突变体DNA聚合酶的方法的试剂、材料中的一些或全部。因此所述试剂盒可以包含用于利用本发明的DNA聚合酶进行PCR反应的试剂的一些或全部。这些试剂盒的成分的一些或全部可以提供与含有本发明的聚合酶的容器(一个或多个)分开的容器中。这些试剂盒的另外组分的实例包括但不限于,一种或多种不同的聚合酶、对于对照核酸或对于靶核酸为特异性的一种或多种引物、对于对照核酸或对于靶核酸为特异性的一种或多种探针、用于聚合反应的缓冲剂(处于1X或浓缩的形式)、镁、核苷酸和用于检测聚合产物的一种或多种染料或一种或多种荧光分子。所述试剂盒还可以包括一种或多种以下成分:载体(support)、终止、修饰、或消化试剂、渗透调节物质、和用于探测检测探针的设备。
可以多种形式提供在扩增和/或检测过程中使用的反应成分。例如,可以将这些成分(例如,酶、核苷三磷酸、探针和/或引物)悬浮在水溶液中或者作为冷冻干燥或冻干粉、小丸、或小珠。在后一种情况下,这些成分在复原时形成完全的成分混合物,以供在测定中使用。
试剂盒或系统可以含有对于至少一种测定法足够量的本文中描述的这些成分的任何组合,且可进一步包括以有形形式记载的关于使用这些成分的说明书。在一些应用中,一种或多种反应成分可以提供为在单独的(一般为一次性的)管或等同的容器中的预先量度的单次使用量。利用这样的安排,可以将 有待测试靶核酸的存在的样品添加到单独的管中直接进行扩增。提供在所述试剂盒中的成分的量可以是任何适当的量,且可取决于产品所针对的目标市场。用于确定适当的量的通用指南可见于例如Joseph Sambrook和David W.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001;和Frederick M.Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,2003。
本发明试剂盒可以包含任何量的另外的用于实施本发明方法的试剂或物质。这样的物质包括但不限于:抗凝剂(例如,EDTA和肝素)、用于裂解细胞的试剂(包括缓冲剂)、抑制不需要的核酸酶的二价阳离子螯合剂或其他试剂、用于在确保聚合酶和其他反应成分正确起作用中使用的对照DNA、DNA断裂试剂(包括缓冲剂)、扩增反应试剂(包括缓冲剂)、和洗涤溶液。本发明试剂盒可以提供在任何温度下。例如,对于含有在液体中的蛋白质成分或其复合物的试剂盒的储存,优选地,它们在0℃以下,优选-20℃或以下提供和维持,或以别的方式处于冰冻状态。
其中提供成分的一个或多个容器可以是能够容纳所提供形式的任何常规容器,例如微量离心管、安瓿、瓶子、集成试验装置如流体装置、药筒、侧流装置、或其他类似装置。这些试剂盒可以包括用于在扩增或检测靶核酸中使用的标记或未标记核酸探针。在一些实施方案中,这些试剂盒可以进一步包括在本文中描述的任何方法(例如,使用未经核酸提取和/或纯化的粗基质的方法)中使用这些成分的说明书。
这些试剂盒还可以包括用于容纳所述容器或容器的组合的包装材料。用于这样的试剂盒和系统的典型包装材料包括处于任何构造的容纳反应成分或检测探针的固体基质(例如,玻璃、塑料、纸、箔材、微粒,等),这些构造有多种(例如,管形瓶、微孔滴定板、微阵列,等)。
如本文中使用的,“对抑制剂具有抗性的”DNA聚合酶,指的是这样的DNA聚合酶突变体或变异体,将野生型DNA聚合酶的聚合速率降低到在PCR反应中无法成功形成产物的水平的抑制剂的存在下,其允许PCR过程中DNA聚合或/或期望产物的可接受水平的正确扩增。在某些实施方案中,所述抑制剂是用EDTA或肝素处理过的全血。并且,术语“对抑制剂具有抗性的”还指这样的情况,DNA聚合酶突变体或变异体允许从含有血液样品的PCR反应混合物进行DNA聚合或/和期望产物的可接受水平的正确扩增,所述血 液样品已经用上述的抑制剂预处理过,并且占所述混合物的至少1%(例如,2%、2.5%、5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%)v/v。
如本文中使用的,术语“靶核酸”或“靶”指的是含有靶核酸序列的核酸。靶核酸可以是单链或双链的,并且常常为DNA、RNA、DNA或RNA的衍生物、或其组合。“靶核酸序列”、“靶序列”或“靶区域”表示包含单链核酸的序列的全部或部分的特异性序列。靶序列可以在核酸模板内,后者可以为任何单链或双链核酸的形式。模板可以是纯化或分离的核酸,或者可以是未纯化或未分离的。
如本文中使用的术语“扩增”及其变体可以包括用于产生多核苷酸的至少某一部分的多个拷贝或互补物的任何过程,该多核苷酸一般被称为“模板”。该模板多核苷酸可以是单链或双链的。给定模板的扩增可以导致一群多核苷酸产物的产生,它们统称为“扩增子”。扩增子的这些多核苷酸可以是单链或双链的、或者为两者的混合物。所述模板一般包括靶序列,并且得到的扩增子将包括具有与该靶序列基本上相同或基本上互补的序列的多核苷酸。在一些实施方案中,特定扩增子的多核苷酸是彼此基本上相同的、或基本上互补的;或者在一些实施方案中在给定扩增子内的多核苷酸可以具有彼此不同的核苷酸序列。扩增可以线性或指数方式行进,并且可以涉及给定模板的重复且连续的复制,以形成两个或更多个扩增产物。一些典型的扩增反应涉及基于模板的核酸合成的连续且重复的循环,从而导致多个子代(daughter)多核苷酸的形成,所述子代多核苷酸含有所述模板的核苷酸序列的至少某些部分并且与所述模板共享至少一定程度的核苷酸序列同一性(或互补性)。在一些实施方案中,每个核酸合成的实例,其可以称为扩增的一个“循环”,包括产生游离3’端(例如,通过对dsDNA的一条链切出切口),由此产生引物和引物延伸步骤;任选地,也可以包括另外的变性步骤,其中该模板被部分或完全变性。在一些实施方案中,一轮扩增包括单个扩增循环的给定次数的重复。例如,一轮扩增可以包括某一特定循环的5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100次或更多次重复。在一个示例性实施方案中,扩增包括任何其中特定的多核苷酸模板经受两个连续的核酸合成循环的反应。该合成可以包括依赖于模板的核酸合成。
术语“引物”或“引物寡核苷酸”指的是这样的核酸链或寡核苷酸:其能够与模板核酸杂交,并且充当起始点,用来依照核酸合成的模板核酸的组成纳 入延伸核苷酸。“延伸核苷酸”指的是能够在扩增过程中组入到延伸产物中的任何核苷酸,即DNA、RNA、或DNA或RNA的衍生物,其可以包括标签。
“杂交”(“hybridization”)或“杂交”(“hybridize”)或“退火”指的是完全或部分互补的核酸链在规定的杂交条件(例如,严格杂交条件)下以平行或优选反平行方向合在一起形成稳定的双链结构或区域(有时称为“杂交体”)的能力,其中两个组成链通过氢键接合在一起。虽然氢键一般在腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(A和T或U)之间或者在胞嘧啶和鸟嘌呤(C和G)之间形成,其他碱基对也可以形成氢键(例如,Adams等,The Biochemistry of the Nucleic Acids,11th ed.,1992)。
术语“严格杂交条件”或“严格条件”表示其中探针或低聚物与其预期靶核酸序列特异性杂交而不与另一种序列杂交的条件。严格条件可取决于熟知的因素例如GC含量和序列长度而变化,并且可以使用分子生物学领域普通技术人员熟知的标准方法进行预测或凭经验确定(例如,Sambrook,J等1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd ed.,Ch.11,pp.11.47-11.57,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.))。
如本文中公开的,提供了许多数值范围。应当理解的是,还具体公开了在该范围的上限和下限之间的以下限的单位的十分之一为间隔(除非上下文明确地另行指明)的各居间值。在所陈述范围中的任何陈述值或居间值与在该陈述范围中的任何其他的陈述值或居间值之间的各个较小范围涵盖在本发明范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在所述范围,并且在极限值任一者、两者都不、或两者都被包括在这些较小范围中的各个范围也涵盖在本发明范围内,受限于陈述范围中的任何明确排除的极限值。当陈述范围包括极限值之一或两者时,排除这些被包括的极限值的任一者或两者的范围也包括在本发明中。
术语“约”通常指的是指示数值的正或负10%。例如,“约10%”可以指示9%到11%的范围,并且“约1”可以表示从0.9到1.1。“约”的其他含义可以从上下文显而易见,比如四舍五入,因此,例如“约1”还可以表示从0.5到1.4。
如本文中使用的,术语“受试者”指的是具有基因组的任何生物,优选活的动物,例如哺乳动物,为诊断、治疗、观察或实验的对象。受试者的实例可以是人、家畜动物(肉牛和奶牛、绵羊、家禽、猪,等)、或伴侣动物(狗、猫、马,等)。
术语“生物样品”指的是从生物(例如,患者)或从生物的成分(例如,细胞)获得的样品。所述样品可以是任何生物组织、细胞(一个或多个)或流体。所述样品可以是“临床样品”,其为从诸如人类患者或兽医受试者获得的样品。这样的样品包括但不限于,唾液、痰、血液、血细胞(例如,白细胞)、羊水、血浆、精液、骨髓、以及组织或细针活检样品、尿液、腹膜液、和胸膜液,或来自它们的细胞。生物样品还可以包括组织切片,例如为组织学目的取得的冰冻切片。生物样品还可以被称为“患者样品”。生物样品还可以包括基本上纯的或分离的蛋白质、膜制剂、或细胞培养物。
如本文中使用的,当在提及任何组的成分中使用时,术语“接触”及其变化形式包括藉此将这些有待接触的成分混合到同一个混合物(例如,添加到同一隔室或溶液中)中而不一定需要在所述成分之间的实际物理接触的任何过程。可以按任何顺序或任何组合(或子组合)使所述成分接触,并且可以包括随后将一种或一些所述成分任选地在添加其他所述成分之前从该混合物中移除的情形。例如,“使A与B和C接触”包括以下情形中的任一种或全部:(i)将A与C混合,然后将B添加到该混合物中;(ii)将A和B混合成混合物;从该混合物中移除B,然后将C添加到该混合物中;以及(iii)将A添加到B和C的混合物中。“使模板与反应混合物接触”包括以下情形中的任一种或全部:(i)使所述模板与所述反应混合物的第一成分接触以产生混合物;然后以任何顺序或组合将所述反应混合物的其他成分添加到该混合物中;并且(ii)完全在与所述模板混合之前形成所述反应混合物。
如本文中使用的术语“混合物”指的是作为散置的并且未处于任何特定顺序的要素的组合。混合物是异质的并且在空间上不可分开成它的不同组分。要素混合物的实例包括溶解在同一种水溶液中的许多不同的要素、或者随机地或以非特定的顺序附着到固相载体上的许多不同的要素,其中不同的要素并非在空间上不同。换言之,混合物是不可寻址的。具体地说,正如本领域公知和下文描述的,表面结合寡核苷酸的阵列并非表面结合寡核苷酸的混合物,因为表面结合寡核苷酸的种类在空间上不同,而该阵列是可寻址的。
实施例1突变体聚合酶的产生和筛选
通过包含SEQ ID NO:4序列的核酸的随机诱变产生突变体Taq DNA聚合酶,该序列以US 20110027833中描述的方式编码野生型嗜热水生菌Taq DNA聚合酶,该申请的内容通过提述完整并入本文。
简言之,对随机突变体文库在快速循环条件下实施5轮选择,然后进行筛选(在第2、4、和5轮之后),从而鉴定出支持使用缩短的延伸时间扩增的克隆。对于在快速循环条件下的实时PCR过程中相比于野生型Taq DNA聚合酶显示出改良性能的聚合酶,进行DNA测序以鉴定出突变。鉴定出在快速扩增克隆中出现的感兴趣突变,并使用定向诱变进行重组。使用实时PCR在快速循环条件下筛选重组体。鉴定出性能优于野生型Taq亦优于来自初始选择/筛选的表现最好者的突变体聚合酶,加以测序和纯化,进一步表征以鉴定出具有支持利用最短延伸时间的PCR的突变的组合的克隆。
对以上述方式获得的选定突变体聚合酶进一步表征,以评估它们在用抗凝剂(如EDTA和肝素)处理过的血液的存在下从引物聚合核酸链的能力。
实施例2突变体酶对EDTA的抗性的表征
在这个实施例中,进行测定来检验各种突变体酶在终点PCR(End-point PCR)过程中在已经收集且储存在EDTA中的全血存在下扩增靶DNA的能力,已知EDTA抑制Taq DNA聚合酶的活性。
具体地说,用野生型Taq(Taq2000,Agilent Technologies;SEQ ID NO:4)和从其衍生的许多突变体来组装含有终点测定法的典型成分的PCR反应。检验的突变体包括上述突变体Taq 1C2,描述于US 20110027833中的若干突变体,包括Taq 42、Taq 3B、Taq 2C2、和Taq 5A2,以及三个其他的突变体Taq7P、Taq 8P、和Taq 5。下表总结了这这些突变体中的突变:
酶 | G59W | V155I | L245M | L375V | E507K | E734G | F749I | K508R |
Taq 7B(WT) | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
Taq 42 | + | _ | + | + | + | + | + | + |
Taq 2C2 | + | + | + | + | + | + | + | _ |
Taq 1C2 | + | + | + | _ | + | _ | + | _ |
Taq 3B | _ | + | + | _ | + | _ | + | _ |
Taq 1 | + | _ | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
Taq 8P | _ | + | _ | _ | _ | _ | _ | _ |
Taq 5A2 | _ | _ | _ | _ | + | _ | _ | _ |
Taq 7P | _ | _ | _ | _ | _ | _ | + | _ |
Taq 5 | + | + | + | _ | _ | _ | _ | _ |
为了检验这些酶对EDTA的抗性,通过PCR从用EDTA处理过的全血中的人类基因组DNA扩增322个碱基对的人IGF基因靶。EDTA处理过的血液 含有1.8μg/μl K2EDTA。在PCR反应中,血液的终浓度范围为从1%到65%v/v。单独地将人全血作为模板添加到提前等分加样到PCR条管中的酶预混物中。以一式二份的方式测定了各个聚合酶-模板组合。每50μl反应使用50ng的每种酶进行扩增。热循环参数如下:95℃ 5分钟;95℃ 30秒;60℃ 30秒,以及72℃ 1分钟,持续30个循环。
扩增产物在用溴化乙锭预染色的琼脂糖凝胶上分级。产生PCR产物的最高血液量总结在下表中:
酶 | EDTA-血液 |
Taq 7B(WT) | <1% |
Taq 42 | 60% |
Taq 3B | 50% |
Taq 2C2 | 65% |
Taq 5A2 | 45% |
Taq 7P | 15% |
Taq 8P | 15% |
Taq 1C2 | 60% |
Taq 1 | 15% |
结果表明,野生型Taq DNA聚合酶只有当EDTA处理的血液少于反应混合物的1%v/v时才能扩增322-bp产物。相比之下,许多突变体能够在高达50%以上的EDTA处理的血液存在下产生特异性目标产物。其中,Taq 42、Taq2C2、和Taq 1C2对EDTA最具抗性,它们分别能够在60%、65%、和60%的EDTA处理的血液存在下产生特异性目标产物。
实施例3突变体酶对肝素的抗性的表征
肝素是另一种常规使用的抗凝剂。在这个实施例中,进行测定来检验Taq 2C2和Taq 1C2突变体酶在已用肝素处理过的全血的存在下扩增目标DNA的能力。所述肝素化血液含有15.8USP单位/ml的肝素钠。
组装含有用于终点测定法的典型成分的PCR反应,按如上所述方式进行测定,不同的是肝素处理的血液用作每一反应的模板。在PCR反应中,肝素处理的血液的终浓度范围为从10%到50%v/v。结果示于图2中。如图2中 所示,Taq 2C2能够在10-30%v/v的肝素处理的血液存在下产生显著量的特异性目标产物。但是,目标产物的量或产率大体上随着肝素处理的血液的量增加而降低。当肝素处理的血液为30%v/v或更多时,Taq 2C2显示出活性迅速丧失,且在50%v/v的肝素处理的血液的存在下其完全没有活性。相比之下,Taq 1C2在全部测试范围(10%到50%v/v)中都一致地产生显著量特异性产物。更令人惊奇的是,Taq 1C2在10-50%v/v的肝素处理的血液的存在下几乎保持相同的活性水平并产生基本上相等量的产物。
这些结果支持这样的结论,Taq 1C2突变体DNA聚合酶相比于在实施例2中所述的其他抗EDTA的突变体DNA聚合酶具备有利的特性。
进一步进行其他测定法,以相同的方式在SureCycler上检验Taq 1C2、2C2、42、5、5A2、和7P突变体从来自经肝素处理的全血中的人类基因组DNA扩增上述322个碱基对的人IGF基因靶的能力。热循环参数如下:95℃ 5分钟,接着30个循环的95℃ 30秒,60℃ 30秒,和72℃ 1分钟。这些反应混合物含有300nM的每种引物、反应缓冲液(含有15mM Tris pH 8.8、96mM KCl、2%DMSO、2.5mM MgCl2)、dA、dG、dC和dT各200μM、0.5μl的Taq突变体,50ng/l的IN FDB,聚乙二醇苯基醚(Igepal)和吐温-20(Tween-20)各0.5%。离心使碎片沉降后,使各50μl反应混合物中的8μl跑Nusieve TBE凝胶。结果示于图5中。
同样,Taq 1C2突变体在5-30%v/v的肝素处理的血液的存在下几乎保留了相同的活性水平,并产生基本上等同量的产物。并且,Taq 1C2突变体是仅有的一种在30%v/v的肝素处理的血液的存在下扩增了目标DNA的突变体。
实施例4Taq 1C2与商购DNA聚合酶的比较
在这个实施例中,进一步将Taq 1C2突变体DNA聚合酶与多种市售DNA聚合酶进行比较。为此,从血液中扩增的靶是人基因组的一个232-bp的非编码单拷贝区。
简言之,从受试者获得全血样品,根据标准方案用EDTA或肝素处理。将这些样品用作扩增232-bp区的模板。每个PCR反应为50μl的体积,使用Agilent SureCycler(Agilent Technologies,Inc.)循环30X;在所有情况下均使用400nM的每种引物。所使用的DNA聚合酶包括Taq 1C2突变体(“Agilent”)和由若干生产商销售的聚合酶,包括Kapa Biosystems Blood PCR Mix A(“KAPA-A,”Kapa Biosystems)、DNA Polymerase Technology Omni KlenTaq (“KlenTaq,”Sigma-Aldrich Co.LLC)、Clontech Terra Direct(“ClonTech,”Clontech Laboratories,Inc.)和Thermo Scientific Phusion Blood Direct(“Thermo,”Thermo Scientific)。根据生产商的说明组装反应混合物。热循环谱遵循生产商的建议并详述如下:
扩增产物在用溴化乙锭预染色的4%Nusieve琼脂糖凝胶上分级。结果示于图3和图4中,其中分子量梯的增量为100bp,将相同量的各产物(各个50μl反应的8μl或6%)上样到凝胶上。这些DNA聚合酶对EDTA或肝素的抗性排列如下:
如上所示,Taq 1C2突变体的表现优于大多数其他聚合酶。此外,发现Taq 1C2突变体是仅有的一种在45%v/v的肝素化血液存在下显示出良好产率的突变体。Taq 1C2突变体也是仅有的对EDTA和肝素两者都显示出良好抗性的一种突变体。
前述实例和优选实施方案的说明应当理解为说明性的,而本发明仅由权利要求书所限定。可以理解,可以利用以上描述的特征的众多变化形式和组合,而不背离如权利要求书中所描述的本发明。这样的变化形式不应被视为脱离本发明的范围,并且所有这样的变化形式预期都被包含在以下权利要求的范围内。所有在本文中引用的这些参考文献通过提述以其整体并入本文。
Claims (10)
1.一种分离的突变体热稳定性A型DNA聚合酶,其包括:
第一突变,其位于野生型Taq DNA聚合酶的残基507处或位于另一种热稳定性A型DNA聚合酶中与所述野生型Taq DNA聚合酶的残基507对应的残基处;和
位于所述野生型Taq DNA聚合酶的残基59、155、245、和749处或位于另一种热稳定性A型DNA聚合酶中的对应残基处的其他突变,
其中所述突变体聚合酶具有(i)DNA聚合酶活性和(ii)比该突变体聚合酶所来源的野生型DNA聚合酶更高的对聚合活性抑制剂的抗性,并且
其中所述突变体聚合酶在所述野生型Taq DNA聚合酶的残基375或734处或在另一种热稳定性A型DNA聚合酶中的对应残基处没有突变。
2.权利要求1的突变体聚合酶,其中所述野生型A型DNA聚合酶包含选自SEQ ID NO:1-10的序列。
3.权利要求1-2中任一项的突变体聚合酶,其中所述突变体聚合酶具有以下一个或多个特征:
(i)所述突变体聚合酶与选自SEQ ID NO:1-10之一的序列至少70%相同;
(ii)所述突变体聚合酶为突变体Taq DNA聚合酶;
(iii)所述第一突变为E507K突变;
(iv)所述突变体聚合酶包含以下突变:G59W、V155I、L245M、E507K、和F749I;
(v)所述突变体聚合酶包含SEQ ID NO:11的序列,和
(vi)所述突变体聚合酶比所述野生型DNA聚合酶具有更快的聚合速率。
4.权利要求1-3中任一项的突变体聚合酶,其中所述抑制剂为抗凝剂。
5.一种组合物,其包含(i)权利要求1-4中任一项的突变体聚合酶和(ii)一种或多种选自下组的试剂:含水缓冲液、二价金属、延伸核苷酸、引物、去污剂、检测剂、和靶核酸。
6.一种扩增靶核酸的方法,该方法包括:
提供疑似含有靶核酸的试验样品;
使所述试验样品与权利要求1-4中任一项的突变体聚合酶、与所述靶核酸特异性结合的引物、以及延伸核苷酸接触而形成混合物,并且
在允许所述聚合酶利用所述靶核酸的序列作为用于掺入所述延伸核苷酸的模板来延伸所述引物的条件下温育该混合物。
7.权利要求6的方法,其中所述方法具有以下一个或多个特征:(i)所述方法为PCR的方法,(ii)所述试验样品为血液样品,并且(iii)所述混合物含有至少1%v/v的该血液样品。
8.一种分离的核酸、载体、或宿主细胞,其包含编码权利要求1-4中任一项的突变体聚合酶的核苷酸序列。
9.一种产生多肽的方法,所述方法包括在培养基中在允许由所述核酸编码的多肽表达的条件下培养权利要求8的宿主细胞,并从经培养的细胞或所述培养基纯化所述多肽。
10.一种用于扩增靶核酸的试剂盒,所述试剂盒包含(i)权利要求1-4中任一项的突变体聚合酶和(ii)一种或多种选自下组的试剂:含水缓冲液、二价金属、延伸核苷酸、引物、探针、去污剂、检测剂、染料、荧光分子、抗凝剂、和细胞裂解剂。
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