KR20090043282A - 안정화된 핫스타트 ｐｃｒ용 건조 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핫스타트 PCR용 건조 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한 반응튜브내에 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP, DNA 중합효소를 포함하는 수용액에 피로포스페이트와 피로포스파타제를 첨가하여 반응혼합물을 제조하고, 상기 반응혼합물을 건조시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 안정성 및 장기보관성이 개선된 핫스타트 PCR 건조 조성물 제조방법 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법에 관한 것이다. 본 발명의 핫스타트 PCR용 건조 조성물은 피로포스페이트와 피로포스파타제를 동시에 첨가하고 건조시킴으로써 기존의 핫스타트 PCR 조성물에 비해 편리성, 안정성 및 장기보관성이 향상되었으며, 핫스타트 PCR, 멀티플렉스 PCR, 또는 실시간 정량 PCR 방법 등에 유용하게 사용될 수 있다.
핫스타트 PCR, 피로포스페이트, 피로포스파타제, 안정화된 PCR, 정량 PCR

Description

안정화된 핫스타트 ＰＣＲ용 건조 조성물{Dried Composition for hot-start PCR with Long-Term Stability}
본 발명은 안정화된 핫스타트 PCR용 건조 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 통상의 PCR 조성물에 소정 농도의 다가알코올류, 무기 피로포스페이트(inorganic pyrophosphate, 이하 "PPi"라 약칭함)와 피로포스파타제(pyrophosphatase, 이하 "PPase"라 약칭함)를 추가로 함유하고 건조시킴으로써 조성물의 안정성 및 장기보관성이 강화된 안정화된 핫스타트 PCR용 건조 조성물에 관한 것이다.
PCR 반응에 있어서 특이성(specificity)은 표적 유전자 서열에 결합하는 프라이머의 높은 스트린전시(stringency)에 의해 결정된다. 그러나, PCR 수행시 유전자 증폭을 위해 필요한 모든 성분들은 유전자의 초기 변성 전에 실온에서 혼합되므로, 이 조건에서 낮은 스트린전시의 프라이밍(priming)이 발생하게 된다. 낮은 온도에서도 중합효소의 활성이 유지되므로 프라이밍이 발생할 경우 이에 따른 증폭산물이 생성되기 때문에, 이러한 낮은 스트린전시의 프라이밍은 표적 DNA 서열의 복잡성, 낮은 반응 온도 등과 더불어 비특이적인 증폭을 증가시키는 주요한 요인이 되며, 비특이적 증폭은 반복되는 PCR에 있어서 프라이머 및 제한된 농도의 다른 필요 성분들을 소비해 버리기 때문에 결과적으로 경쟁적인 저해제로서 작용하게 된다. 비특이적 증폭은 특히 낮은 사본수(copy number)의 표적 DNA 검출, 낮은 농도의 DNA 시료의 증폭 및 여러 가지 프라이머를 동시에 사용하는 멀티플렉스 PCR을 수행하는데 있어서 커다란 문제점으로 지적되고 있다.
일반적인 PCR에서 나타나는 이러한 문제점을 해결하기 위한 노력의 결과로 "핫스타트 PCR"이 개발되었다. 핫스타트 PCR은 보다 깨끗한 PCR 산물을 수득하기 위한 방법의 하나로서, 높은 온도 조건에서 반응물들을 혼합함으로써 실온에서 발생하는 낮은 스트린전시의 프라이밍 및 그로 인한 비특이적인 프라이머의 올리고머화를 방지하여 PCR의 특이성을 증가시키는 효과적인 방법이다.
핫스타트 PCR을 실시하는 가장 단순한 방법은 뜨거운 반응 튜브를 열고 결여된 성분들을 첨가하는 것이지만, 이 방법은 반응 혼합물을 오염에 노출시키고, 에어로졸을 형성하며, 증발을 일으키는 등의 단점을 가지고 있다. 다른 핫스타트 PCR 방법으로는 필수성분, 예를 들면 프라이머와 주형 사이에 물리적 차단막을 생성하는 방법이 있다. 이러한 차단막 중에서 전기물리적 차단막으로는 통상적으로 파라핀 왁스가 사용되어 왔다. 즉, 파라핀 왁스를 반응 혼합물 위에 덮고, 왁스가 굳으면 그 위에 시약(출발시약)을 가한 다음, 미네랄 오일을 가하고 유전자 증폭장치의 온도를 70℃ 내지 90℃로 상승시키면, 왁스가 용해되면서 반응혼합물과 출발시약 간의 혼합이 이루어져 PCR 반응이 진행된다. 이와같이, 높은 온도에서만 왁스 용해와 필수성분들의 혼합이 정확하게 일어나기 때문에, 높은 스트린전시의 프 라이밍만이 잘 일어나고, 여러 가지 유전자 시료의 증폭을 동시에 수행할 수 있으며, 왁스와 오일층으로 인해 오랜 기간 반응혼합물의 저장이 용이하다는 등의 장점이 있다. 그러나, 상기 방법은 다루기가 번거롭고 시간이 오래 걸린다는 문제점이 있다(참조: Bassan, B.J. and Caentno-Anolles, G., Biotechniques, 14:30-34, 1993). 또한, 증발 차단막으로 사용되는 미네랄 오일이 PCR 시료를 오염시켜 비-DNA-함유 밴드로 나타나게 되어 정량적인 PCR 데이터 해석을 어렵게 하기 때문에, 파라핀 비드(bead)만을 핫스타트 PCR에 이용하는 개선책이 대두되었다. 파라핀 비드는 55℃ 이하에서 고체층을 형성하므로, 실온에서는 프라이머와 주형 DNA의 혼합이 이루어지지 않고, 반응온도가 파라핀의 융점 이상이 되었을 때에만 프라이머와 주형 DNA의 혼합이 이루어지므로 PCR 반응의 특이성을 증가시킬 수 있다. 또한, 파라핀은 미세원심분리 튜브의 바닥에 존재하여 시료의 수거가 쉽고 가격이 저렴하기 때문에, 파라핀 비드의 사용은 핫스타트 PCR을 개선시키기 위한 방법으로 선호되어 왔다(Wainwright, L.A. and Seifert, H.S., Biotechniques, 14:34-36, 1993).
다른 핫스타트 PCR 방법으로는 파라핀 왁스 대신 앰플리그리즈(AmpliGrease)와 같은 석유 젤리를 사용하는 방법이 있다. 이 방법도 왁스와 오일을 사용하는 방법과 유사한 방법으로서, 반응 혼합물을 하부 혼합물(bottom mix)과 상부 혼합물(top mix)의 두 층으로 분리하고, 그 사이에 석유 젤리를 첨가하여 두 혼합물이 실온에서 혼합되는 것을 방지하는 것인데, 석유 젤리는 왁스보다 낮은 온도 조건(융점 약 50℃)에서 녹기 시작하여 용액을 형성하고, 냉각에 의해 다시 굳어지지 않는다는 점이 종래의 왁스를 사용하는 방법과 다른 점이다(Horton, R.M., Hoppe, B.L. and Conti-Tronconi., Biotechniques, 16:42-43, 1994). 그러나, 이 방법은 시료의 양이 많을 경우 상부와 하부 혼합물 사이의 밀도 차이로 인해 혼합이 제대로 일어나지 않아 반응효율이 저하되기 때문에, 적은 부피의 시료에만 적용될 수 있다는 한계점을 갖고 있다.
이외에도, 트레할로스(trehalose) 용액으로 건조시킨 반응혼합물을 왁스로 코팅하여 제조한 반응 비드를 이용하거나(Kaijalainen, S. et al., Nucleic Acids Res., 212959-2960, 1993), PCR 촉진제로 사용되는 여러 유기용매(PEG, DMSO, Glycerol 등)를 적정농도로 첨가함으로써 핫스타트 PCR의 효율을 높이는 방법들이 제시되었다(참조: Pomp, D. et al., Biotechniques, 10:58-59, 1991).
상술한 바와 같이, 핫스타트 PCR에 대한 많은 연구가 수행되어 왔고, 그 필요성을 인식하고 있음에도 불구하고, 경제성이나 사용상의 제한적 요인으로 인해 다양하게 실험에 응용되지 않고 있는 실정이며, 실제 파라핀 비드를 이용하여 핫스타트 PCR을 수행한 결과는 일반적인 PCR 결과에 비해 그리 효과가 크지 않다는 것이 현 상황이다. 또한, 현재의 핫스타트 PCR법은 Taq DNA 중합효소에만 적용 가능한 방법으로(Enneth, G., Christy, J., Atwood, S. M., and Daiss, J. L. 1994, Biotechnology, 12; 506-509), 다른 종류의 중합효소를 이용하여 핫스타트 PCR을 수행하기 위해서는 이에 각각의 내열성중합효소에 대한 특이적인 항체를 각각 별도로 제작하여야 하며, 이로 인해 비용과 오랜 제작기간이 필요하다는 단점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 PPi와 내열성 PPase를 이용한 핫스타트 방 법이 개발되었다(대한민국 특허등록 제10-0292883호 및 미국 특허 제6951744호). 이 방법은 DNA 중합에 필수적인 마그네슘 이온과 강하게 결합하는 PPi를 첨가해주어 상온에서 중합효소반응을 억제한 다음 고온에서 PPase를 반응시켜 PPi를 제거하여 반응을 시작시키는 원리로서, 중합효소의 종류와 상관없이 일반적으로 적용할 수 있고, 또한 중합효소 반응시 dNTP로부터 발생하는 PPi를 지속적으로 제거해줌으로서 지속적으로 반응속도를 유지시킬 수 있는 장점이 있다. 그러나, 이 방법을 이용하여 핫스타트 PCR 마스터믹스 용액을 만들어 놓으면 낮은 온도에서도 피로포스파타제가 Mg2 + 이온으로부터 서서히 PPi를 분해하여 DNA 중합효소의 활성이 나타나게 되고, 결국 원하는 핫스타트 PCR 효과는 상실하는 결과가 발생한다. 또한 PPase는 매우 불안정하기 때문에 PCR 마스터믹스 용액으로 만들어 두면 상온 또는 4℃에서 PPase의 활성이 오래가지 못하는 문제가 있다. 따라서 이러한 PCR 마스터믹스 용액은 상온 또는 4℃에서의 보관이 불가능하게 되며, 반드시 -20℃에서 보관을 하여야 한다. 그러므로, PPase를 별도 분리용기에 보관하고, 반드시 반응시작 시에 PPi와 PPase를 별도로 분리하여 가해주어야 하기 때문에 PCR에 일반적으로 사용되는 PCR 마스터믹스 용액에 비해 사용이 번거롭고 재현성 부분에서도 불리하다는 문제점이 있었다.
본 발명에서는 상기 문제점들을 개선하고 종래의 핫스타트 PCR 조성물의 안정성 및 장기보관성을 증가시킴으로서, 각종 유전자 진단, 검사 등에 유용하게 사용할 수 있는 재현성이 더욱 개선된 핫스타트 PCR용 건조 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 PCR 반응 혼합물에 PPi 및 PPase를 추가한 다음 건조시킴으로써 비특이 산물의 제거, 재현성이 더욱 높아짐과 동시에, 건조된 조성물의 안정성, 보관의 간편성 및 장기보관성이 기존의 핫스타트 조성물에 비해 크게 증가될 뿐만 아니라 종래 조성물에 비해 간편하게 사용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명의 안정화된 핫스타트 PCR용 건조 조성물의 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 핫스타트 PCR용 건조 조성물은 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP, DNA 중합효소, PPi 및 PPase를 포함하는 반응혼합물을 한 반응 튜브 내에서 건조시킴으로써 제조된다. 상기 반응혼합물은 필요에 따라 프라이머, 프로브, 주형 핵산, 형광염료 등을 추가로 포함해도 된다.
상기 PPase는 시판되는 통상의 PPase를 제한없이 사용할 수 있으며, B35 (Thermus thermophilus B35) 유래의 무기 피로포스파타제 유전자를 클론화한 대장 균에서 유래된 티티이(Tte)-무기 피로포스파타제(Sibzyme 사) 또는 바이오니아사의 피크로필러스 토리두스(Picrophilus torridus) 유래의 무기 피로포스파타제 유전자를 클론화한 대장균에서 유래된 프토(Pto)-무기 피로포스파타제를 사용하는 것이 바람직하다. 프토(Pto)-무기 피로포스파타제 효소의 1 유닛은 1분간 피로포스페이트로부터 포스페이트 40nmole을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의되며, Tris-HCl(pH 7.5), 5 mM MgCl2, 2.0 mM Ppi를 사용하고, 반응 부피를 0.5 ㎖로 하여, 70℃에서 10분 반응으로 확인한다.
또한, 상기 반응용 완충용액은 10 mM TrisHCl, 40 mM KCl, pH 9.0을 사용하는 것이 바람직하며, PPi는 PCR 조성물에 0.3 내지 5.0 mM, 바람직하게는 0.95 내지 3.0 mM, 가장 바람직하게는 2.0 mM의 농도로 포함시켜 사용할 수 있다. PPi 농도가 5.0 mM 보다 높을 경우에는 비례적으로 PPase 농도 또한 높게 적용하여야 하는데, 이 경우 PCR 증폭산물의 양이 감소할 수 있다. 또한, PPi 농도가 0.3 mM 보다 낮을 경우에는 PCR 반응조성물 중의 Mg2 + 이온을 포집하는 능력이 떨어져 비특이적 프라이밍(mispriming)에 의한 비특이산물의 생성을 억제하는 효과를 얻을 수 없다. 또한, PPase는 PCR 혼합물에 20 ㎕당 30 초과 200 mU 이하, 바람직하게는 50 내지 100 mU, 보다 바람직하게는 약 80 mU를 포함시켜 사용한다. PPase 농도가 20 ㎕당 200 mU 보다 높을 경우에는 높은 사본수의 주형에 적용시 낮은 사본수의 주형에 적용시보다 과농도에서 그 결과가 확인되고, PCR 반응성이 감소되어 증폭산물이 현저하게 감소될 수 있으며, PPase 처리 농도가 20 ㎕당 30 mU 이하일 경우에는 비 특이 반응산물이 생성된다(도 3 참조). 상기 4종의 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP를 나타낸다. DNA 중합효소는 공지된 임의의 DNA 중합효소를 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 이 중에서도 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소, 및 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소를 단독으로 사용하거나, 또는 상기 DNA 중합효소들을 조합하여 사용할 수 있다. 상기 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소의 예로는 Taq DNA 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소의 예로는 Pfu DNA 중합효소 또는 TLA DNA 중합효소(바이오니아 사), 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소의 예로는 Top DNA 중합효소((주)바이오니아 사)를 들 수 있다. DNA 중합효소는 PCR 조성물에 0.1 내지 10 U(unit), 바람직하게는 0.5 내지 2 U, 가장 바람직하게는 1 U의 농도로 포함시켜 사용할 수 있다. 상기 Taq, Pfu, Top 및 TLA DNA 중합효소는 하기 표 1과 같은 특성을 갖는다.
Taq. DNA 중합효소 Pfu DNA 중합효소 Top DNA 중합효소 TLA DNA 중합효소
5'->3' 엑소뉴클레아제 활성 YES NO NO NO
3'->5' 엑소뉴클레아제 활성 NO YES NO YES
말단 트랜스퍼라제 활성 YES NO YES NO
에러율(x10-6) 4.91 1.90 미확인 미확인
절편의 크기 ≤ 10 kbp ≤ 5 kbp ≤ 10 kbp ≤ 15 kbp
최적 활성 온도(℃) 72 72 72 72
Half life(분, 95℃에서) 80 미확인 미확인 미확인
MgCl2(mM) 1.5 - 1.5 1.0
MgSO4(mM) - 2.0 - -
KCl(mM) 40 10 30 70
최적 pH(25℃에서) 9.0 8.8 9.0 9.0
한편, 본 발명의 안정화된 건조 PCR용 조성물은 실험상의 편의, PCR 반응산물에 의한 오염방지, DNA 중합효소와 dNTP의 안정화 및 반응성의 향상을 위하여 핵산에 대해 비반응성인 염료 물질 및/또는 다가알코올류를 추가로 포함할 수 있다.
상기에서, "비반응성 염료 물질"이라 함은 PCR 반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어야 하며, 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 크실렌 시아놀(xylene cyanole), 브로모크레졸 레드(bromocresol red), 크레졸 레드(cresol red) 등의 수용성 염료를 들 수 있고, 이중에서도 크실렌시아놀을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비반응성 염료 물질은 전체 조성물에 대해 0.0001 내지 0.01 중량%의 함량으로 포함될 수 있으며, 0.001 내지 0.005 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하고, 0.001 내지 0.003 중량%의 함량으로 포함되는 것이 보다 바람직하다. 만일, 상기 비반응성 염료 물질이 0.0001 중량% 미만의 함량으로 첨가되는 경우에는 PCR 반응후의 분석을 위한 아가로스젤 전기영동시 염료의 농도가 낮아 시료의 이동을 육안으로 관측하기 어렵다는 문제점이 있고, 비반응성 염료 물질이 0.01 중량% 초과의 함량으로 첨가되는 경우에는 PCR 반응시 고농도의 수용성 염료가 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 아가로스젤로의 침강이 이루어진 후 전기영동시 시료의 이동을 방해할 수 있다는 문제점이 있다.
또한, 상기 다가알코올류는 본 발명의 건조 조성물을 보다 안정화시키기 위한 추가 안정화물질로 사용될 수 있으며, 글루코스, 글리세롤, 만니톨, 갈락시톨, 글루시톨, 솔비톨 중 하나 이상의 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 다가알코올류는 10 내지 500 mM의 함량으로 포함될 수 있으며, 50 내지 300 mM의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 만일, 다가알코올류가 500 mM을 초과하게 되면 수용성 중합체 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어려우며, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어렵고, 건조후 형성되는 건조물의 부피가 필요이상으로 커지며, PCR 반응을 위해 유전자 용액과 멸균된 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, PCR 반응시 고농도의 수용성 중합체가 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다. 그리고, 10 mM 미만이면 건조시 대상효소와 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어려우며 또한, 용액의 점도가 너무 낮아 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 건조되는 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 있다. 본 발명에서는 다가알코올류 이외에도 안정화물질로서 젤라틴, 소혈청알부민, PEG-8000을 사용하는 것이 가능하다.
상기 건조는 일반적인 상온건조, 가온건조, 예를 들면 40 내지 60℃에서의 가온건조, 또는 동결건조, 감압건조와 같은 공지의 건조 방법에 의해 수행될 수 있으며, 조성물의 성분이 손실되지 않는 한 임의의 건조 방법이 제한없이 사용가능하다. 건조법은 사용되는 효소의 종류 및 양에 따라 상이하게 적용될 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게는 동결건조 또는 진공원심분리를 이용한 감압 건조 방법이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용한 핫스타트 PCR 방법을 제공하며, 이때 통상의 PCR 이외에도 멀티플렉스 PCR, 실시간 PCR, 실시간 정량 PCR과 같은 임의의 핵산 증폭 방법이 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 PPase는 바람직하게는 70℃ 이상의 고온에서도 열에 안정한 열안정성 효소로서, PCR 반응과정 동안 열에 안정하여, PPase는 Taq DNA 중합효소가 반응하는 온도조건과 유사하게 효소 활성을 나타내기 때문에, PPase에 의해 유리되어 떨어져 나온 Mg2 + 이온은 Taq DNA 중합효소에 의해 적절하게 PCR 반응에 이용되어 비특이적 증폭산물의 생성을 억제하고 원하는 산물만을 증폭해 낼 수 있다. 결과적으로, PPi와 PPase를 포함하는 본 발명의 안정화된 핫스타트 PCR 건조 조성물은 종래의 핫스타트 PCR 마스터믹스 용액이 가지고 있던 문제점을 해결하였으며, 조성물의 안정성이 향상되었을 뿐만 아니라 번거로움 없이 원하는 표적 산물만을 선택적으로 증폭시킬 수 있어서 정확한 증폭 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 안정화된 핫스타트 PCR 건조 조성물은 종래에 보고된 여러 가지 PCR 조성물과 비교하여 다음과 같은 이점들이 있다:
1) 본 발명에 사용되는 모든 PCR 반응 혼합물의 구성 성분은 하나의 혼합물로 제조하여 미리 건조시켜 놓은 후 사용하게 됨으로써, PCR 반응 동안에 별도의 혼합 과정이 필요하지 않으므로 반응중 혼합으로 인한 오류를 방지할 수 있다. 특히, PPase 작용에 의한 핫스타트 효과의 상실 및 비특이 산물의 발생제거, 실험상의 편의, PCR 반응산물에 의한 오염방지, DNA 중합효소 및 dNTP의 안정화 및 반응성을 향상시킬 수 있다.
2) 핵산에 비반응성인 염료나 추가 안정화제를 함께 섞어 사용하는 경우, 사용성 및 안정성이 더욱 증가되고, 저장이 용이해진다.
2) 일반적인 PCR 방법에 따라 반응을 진행시킬 수 있으므로, 고온에서의 장시간의 전처리가 요구되지 않는다.
3) 본 발명의 핫스타트 PCR 건조 조성물은 종래 PCR용 조성물보다 경제적이다.
4) 낮은 스트린전시의 프라이밍에 의한 증폭산물의 생성을 방지하므로, 다양한 시료를 동시에 사용하여 멀티플렉스 PCR 반응을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 한 튜브내에 상기 핫스타트 PCR용 건조 조성물을 포함하는 것으로 이루어지는 핫스타트 PCR용 키트를 제공한다. 상기 키트는 통상적인 PCR용 키트의 제조방법에 준하여 제조할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 안정화된 핫스타트 PCR 건조 조성물은 상온에서의 안정성 및 장기보관성이 종래에 비하여 향상되어, 상온보관이 가능하게 되었고, 재현성이 확보되었을 뿐만 아니라, 필요한 성분들이 모두 포함되어 있으므로 멀티플렉스 PCR이나 실시간 정량 PCR 방법 등에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. PCR 반응을 억제시키는 PPi 농도 측정
본 발명자들이 기출원한 특허(출원번호: 10-1999-0004361)에서는 낮은 사본수를 갖는 엘시니아 페스티스의 게놈 DNA를 주형으로 PCR 반응을 억제시키는 PPi 농도를 측정한 바 있으나, 본 발명에서는 낮은 사본수의 표적 DNA 뿐만 아니라 높은 사본수의 표적 DNA에 대해서도 낮은 스트린전시의 프라이밍을 효과적으로 억제할 수 있는 PPi 농도를 결정하고자 하였다.
이를 위하여, Taq DNA 중합효소가 포함된 프리믹스(10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq DNA 중합효소 및 안정화제를 포함하는 프리믹스, 바이오니아사)를 이용하였고, 주형 DNA로는 람다 DNA 5.0 ng를 사용하였으며, 프라이머는 137 bp의 PCR 증폭산물을 생성하는 서열번호 1로 기재되는 L137_F 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 L137_R 프라이머를 20 ㎕ 반응당 각각 10 pmole 씩 사용하였다. PCR 반응을 억제시키는 PPi를 최종 0.30, 0.35, 0.45, 0.50, 0.60, 0.65, 0.75, 0.80, 0.90, 0.95, 1.30, 1.50, 1.80, 2.0, 2.5 및 3.00 mM의 농도가 되도록 첨가하였다.
PCR 반응을 위한 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 94℃에서 30초 동안 변성 단계와 53℃에서 40초 동안 어닐링 단계 및 72℃에서 40초 동안 신장 단계를 1 반응 주기로 하여 총 36회 반응 주기로 진행하였고, 이후 72℃에서 5분 동안 최종 신장 단계를 진행하였다. PCR 반응에 대한 증폭 결과는 2.0% 아가로스가 포함된 0.5x TBE 버퍼(Trizma base, Borice Acid 및 0.5 M EDTA, pH 8.0)를 이용한 전기영동으로 확인하였다.
그 결과, 높은 사본수의 람다 DNA를 사용한 경우에는 0.95 mM 이상의 PPi가 첨가된 PCR 반응물에서 증폭산물이 생성되지 않음을 확인하였다(도 1, 레인 10 내지 레인 16 참조). 상기 결과로부터, PCR 반응 수행시에 PPi를 일정농도 이상 첨가하면 PCR 반응이 효과적으로 차단되는데, 높은 사본수의 표적 DNA에 대해서는 0.95 mM 이상의 PPi를 첨가하는 것이 바람직하고, 2.0 mM 이상의 PPi를 첨가하는 것이 보다 바람직하며, PPi 농도가 낮아질수록 PCR 반응 억제 효과도 낮아지게 됨을 확인하였다.
실시예 2. 높은 PPi 농도에서 PCR 반응을 회복시키는 PPase 활성 측정
본 발명자들이 기출원한 특허(출원번호: 10-1999-0004361)에서는 낮은 사본수를 갖는 엘시니아 페스티스 게놈 DNA를 주형으로 PCR 반응을 회복시키는 PPase 활성만을 측정한 바 있으나, 본 발명에서는 낮은 사본수의 표적 DNA 뿐만 아니라 높은 사본수의 표적 DNA에 대해서도 PPi에 대한 PCR 억제를 효과적으로 회복시킬 수 있는 PPase 농도를 결정하고자 하였다.
Taq DNA 중합효소가 포함된 프리믹스(10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq. DNA 중합효소 및 다가알코올을 포함하는 프리믹스)와 Pfu DNA 중합효소가 포함된 프리믹스(10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Pfu DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 다가알코올류를 포함하는 프리믹스, 바이오니아사)를 이용하였고, 주형 DNA로는 람다 DNA 2.5 ng를 사용하였으며, 프라이머는 137 bp의 PCR 증폭산물을 생성하는 서열번호 1로 기재되는 L137_F 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 L137_R 프라이머를 20 ㎕ 반응당 각각 10 pmole 씩 사용하였다. PCR 반응을 억제시키기 위한 PPi는 1.0 mM 농도가 되도록 첨가하였고, 억제되었던 PCR 반응을 유도하기 위하여 PPase(sibzyme 사)를 20 ㎕ 반응당 각각 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.3, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2 및 0.1 mU씩 처리하였다. 이후, 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 PCR 및 전기영동을 수행하여 반응산물에 대한 결과를 확인하였다.
그 결과, 3.2 mU 내지 200 mU PPase를 처리할 경우, Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소를 이용한 경우 모두에서 PCR 반응이 다시 진행되어 증폭산물이 생성됨을 확인하였다. 특히, 12.5 mU 내지 100 mU PPase를 처리한 조건에서는 PPi와 PPase를 처리하지 않은 음성대조군과 거의 동일한 정도의 PCR 반응성을 확인하였다(도 2). 상기 결과로부터, PPase는 PPi가 억제시킨 PCR 반응을 효과적으로 복구시켜 핫스타트 PCR 방법의 장점인 비특이적 PCR 증폭산물의 생성을 억제시키고 PCR 반응성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 낮은 PPi 농도에서 PCR 반응을 회복시키는 PPase 활성 측정
Taq DNA 중합효소가 포함된 프리믹스(10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq DNA 중합효소 및 다가알코올 포함)를 이용하였고, 주형 DNA로는 인간 게놈 DNA 2.0 ng를 사용하였으며, 프라이머는 1.5 kbp의 PCR 증폭산물을 생성하는 p65 프라이머(서열번로 20) 및 p83 프라이머(서열번호 21)를 20 ㎕ 반응당 각각 10 pmole 씩 사용하였다. PCR 반응을 억제시키기 위한 PPi는 0.15 내지 0.25 mM 농도가 되도록 첨가하였고, 0.25 mM PPi에 대해 억제되었던 PCR 반응을 유도하기 위하여 PPase(Sibzyme 사)를 20 ㎕ 반응당 각각 300, 200, 100, 50 및 10 mU씩 처리하였다. 이후, 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 PCR 및 전기영동을 수행하여 반응산물에 대한 결과를 확인하였다.
그 결과, 음성대조군에서는 비특이 반응에 따른 생성물이 생성되는 것을 확인하였으며(도 3의 레인 1 및 레인 2), 0.15 mM의 PPi를 처리한 경우에는 PCR 반응물 중의 Mg2 + 이온을 완전하게 포집하지 못하여 약간의 증폭산물이 생성됨을 확인하였다(도 3의 레인 3). 또한, 동일한 PPi 농도일 경우, PPase 농도가 300 mU 이상일 때에는 PCR 반응성이 감소되어 증폭산물이 현저하게 감소되었으며, 50 mU 이하에서는 핫스타트 효과인 비특이 반응물 감소와 특이산물 증가 효과를 확인할 수 없었다(도 3의 레인 6 내지 레인 10 참조).
실시예 4. PPi 와 PPase 를 이용한 멀티플렉스 PCR 반응
상기에서 확인한 PPi 및 PPase 농도 범위에 대하여, 여러 개의 증폭산물에 대한 핫스타트 효과를 확인하기 위하여 멀티플렉스 PCR 반응을 수행하였다. 이를 위하여, 10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 다가알코올을 포함하는 프리믹스(AccuPower ® PCR PreMix, 바이오니아사)에 2.0 mM PPi 및 각각 60 mU 또는 80 mU PPase(Sibzyme 사)를 첨가하여 건조시킨 프리믹스(이하, '프리믹스 1' 및 '프리믹스 3'이라 함), 및 상기 프리믹스에 2.0 mM PPi, 프라이머 및 각각 60 mU 또는 80 mU PPase(Sibzyme 사)를 첨가하여 건조시킨 프리믹스(이하, '프리믹스 2' 및 '프리믹스 4'라 함)를 제조하였다. 대조군으로는 AccuPower ® PCR PreMix 제품(바이오니아사)과 AccuPower ® Hotstart PCR PreMix 제품(바이오니아사)(10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 0.01% Tween 20 및 다가알코올, 튜브당 mAb 20n과 Taq DNA 중합효소 0.25U의 20분 반응액을 포함하는 프리믹스)을 이용하였다.
또한, 10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq DNA 중합효소, 1U Pfu DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 안정화제를 포함하는 종래 프리믹스(AccuPower ® HL PCR PreMix, 바이오니아사)에 2.0 mM PPi 및 각각 60 mU 또는 80 mU PPase(Sibzyme 사)를 첨가하여 건조시킨 프리믹스 (이하, '프리믹스 5' 및 '프리믹스 7'이라 함), 및 상기 프리믹스에 2.0 mM PPi, 프라이머 및 각각 60 mU 또는 80 mU PPase(sibzyme 사)를 첨가하여 건조시킨 프리믹스(이하, '프리믹스 6' 및 '프리믹스 8'이라 함)도 제조하였다. 대조군으로는 AccuPower ® HL PCR PreMix 제품(바이오니아사)을 이용하였다(표 2 참조).
이때, 주형 DNA로는 인간 게놈 DNA 5 ng을 사용하였고, 프라이머로는 211 bp PCR 증폭산물을 생성하는 p53 프라이머(서열번호3) 및 p55 프라이머(서열번호 4) 쌍과, 447 bp의 PCR 증폭산물을 생성하는 p55 프라이머(서열번호 4) 및 p63 프라이머(서열번호 5) 쌍을 20 ㎕ 반응당 각각 5 pmole 씩 사용하였다.
프리믹스 1 프리믹스 2 프리믹스 3 프리믹스 4 프리믹스 5 프리믹스 6 프리믹스 7 프리믹스 8
ppi (mM) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
PPase 농도 (mU_ 60 60 80 80 60 60 80 80
프라이머 유무 무 유 무 유 무 유 무 유
공통 성분 10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, dNTPs, 1U Taq 중합효소, 0.01% Tween 20, 안정화제 10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, dNTPs, 1U Taq 및 Pfu DNA 중합효소, 0.01% Tween 20, 안정화제
PCR 반응 조건은 핫스타트 효과를 확인하기 위하여 먼저 25℃에서 2시간 동안(도 4) 또는 37℃에서 1시간 동안(도 5) 방치하였다. 이후 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 95℃에서 15초 동안 변성 단계, 62℃에서 30초 동안 어닐링 단계 및 72℃에서 40초 동안 신장 단계를 1 반응 주기로 하여 총 35회 반응 주기로 진행하였고, 이후 72℃에서 5분 동안 최종 신장 단계를 진행하였다. 또한, 대조군인 AccuPower ® Hotstart PCR PreMix(바이오니아사)를 사용한 경우에는 먼저 25℃에서 2시간 동안 방치한 후 95℃에서 15분 동안 사전 변성 단계를 진행하였고, 95℃에서 15초 동안 변성 단계, 62℃에서 30초 동안 어닐링 단계 및 72℃에서 40초 동안 신장 단계를 1 반응 주기로 하여 총 35회 반응 주기를 진행한 후 72℃에서 5분 동안 최종 신장 단계를 진행하였다. 이후, PCR 반응에 대한 반응증폭 결과는 2.0% 아가로스가 포함된 0.5x TBE 버퍼를 이용한 전기영동으로 확인하였다.
Taq DNA 중합효소를 이용한 반응 결과에서, PPi와 PPase 및 프라이머를 첨가하여 건조시킨 프리믹스 조건과 PPi와 PPase만을 첨가하여 건조시킨 후 별도로 프라이머를 첨가한 프리믹스 조건 모두에서 대조군인 AccuPower ® PCR PreMix 결과(도 4의 레인 3 및 레인 4)에서 확인된 낮은 PCR 반응성과 밴드의 끌림 현상(smeared band)은 나타나지 않았고, 높은 PCR 반응성과 높은 특이성을 확인하였다(도 4의 레인 5 내지 레인 12). 또한, DNA 중합효소에 대한 단일항체를 이용한 AccuPower ® Hotstart PCR PreMix(바이오니아사)(도 4의 레인 1 내지 레인 2)와 비교하여도 높은 PCR 반응성 및 반응 특이성을 확인하였다. 아울러, Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소를 이용한 반응 결과, PPi와 PPase 및 프라이머를 첨가하여 건조시킨 프리믹스 조건과 PPi와 PPase를 첨가하여 건조시킨 후 별도로 프라이머를 첨가한 프리믹스 조건 모두에서(도 4의 레인 15 내지 레인 22 또는 도 5의 레인 3과 레인 4), Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소가 포함된 AccuPower ® HL PCR premix 결과(도 4의 레인 13 및 레인 14)보다 높은 PCR 반응성과 높은 특이성을 확인하였고, 또한 밴드의 끌림현상이 현저하게 감소됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명에 사용되는 PPase는 PPi가 억제시킨 PCR 반응을 효과적으로 복구시켜 핫스타트 방법의 장점인 비특이적 PCR 증폭산물의 생성을 억제시키고, PCR 반응성을 증가시킴을 확인하였다. 특히, 비특이적 증폭산물을 유발하는 낮은 온도조건에서도 표적 DNA만을 특이적으로 증폭시켰으며, 또한 하나의 증폭산물이 아닌 여러개의 증폭산물에 대한 반응에서도 비특이적 PCR 증폭산물의 생성 억제와 PCR 반응성 증가를 확인하였다(도 4 및 도 5).
실시예 5. PPi 와 PPase 가 포함된 프리믹스 건조물에 대한 안정성 검토
프리믹스 건조물에 대한 열안정성 검토를 위하여, AccuPower ® HL PCR PreMix(상기제법 참조, 바이오니아사)에 2.0 mM PPi와 80 mU PPase(sibzyme 사)를 포함시킨후 건조시켜 건조 프리믹스를 제조하였고, 대조군으로는 상기 프리믹스에 2.0 mM PPi와 80 mU PPase(sibzyme 사)가 없는 것을 이용하였다. 건조방법은 20㎕반응용 2x 용액 10㎕을 수퍼 centra evaporator에서 30분 건조를 상온에서 진공을 걸어서 수행하였다. 주형 DNA로는 인간 게놈 DNA 5 ng를 사용하였고, 프라이머는 211bp PCR 증폭산물을 생성하는 서열번호 3으로 기재되는 p53 프라이머와 서열번호 4로 기재되는 p55 프라이머 쌍과 447 bp PCR 증폭산물을 생성하는 서열번호 4로 기재되는 p55 프라이머와 서열번호 5로 기재되는 p63 프라이머 쌍을 20 ㎕ 반응당 각각 5 pmole씩 첨가하여 사용하였다.
상기와 같이 제조된 건조 조성물을 50℃ 반응기에서 방치하면서 방치후 0일부터 4일까지 1일 간격으로 시료를 채취하였고, 채취된 시료는 PCR 반응 전까지 냉동고에 보관하였다. 이후, 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 PCR 및 전기영동을 수행하여 반응 산물에 대한 결과를 확인하였다. 그 결과, 2.0 mM의 PPi와 80 mU의 PPase를 포함하는 본 발명의 프리믹스와 대조군 프리믹스 모두 50℃ 방치후 4일 경과시까지 PCR 반응성이 유지됨을 확인하였다(도 6a).
또한, 종래 마스터믹스 용액의 안정성과 본 발명의 건조 프리믹스의 안정성을 비교분석하였다. 이를 위하여 핫스타트 마스터믹스 용액을 제조한 후 상온(25℃ 내지 30℃)에서 일정 시간 방치한 후의 안정성 테스트를 수행하였고, 본 발명의 건조 조성물은 50℃에서 시간의 경과에 따른 안정성을 테스트하였다. 프리믹스 조성은 총 20 ㎕ 반응용액으로, 10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 안정화제를 포함하는 조성에 2 mM PPi와 500 U PPase를 첨가하여 제조하였다.
일정시간 방치 후 다음과 같이 PCR 반응을 수행하였는 바, 30℃에서 4시간 1사이클, 94℃에서 5분간 1사이클 이후에, 94℃에서 20초, 55℃에서 40초, 72℃에서 1분을 1주기로 하여 32사이클을 수행한 다음에 72℃에서 5분간 1사이클로 최종반응을 수행하였다. 37℃에서 4시간의 1사이클은 비특이적 결합이 발생하는지의 여부를 확인하기 위해서 수행하였다. 표적 유전자는 인간 게놈 DNA 10 ng을 주형으로 하여 p53 gene을 표적으로 하였고, 프라이머는 레인 1은 P75(서열번호 22)/P73(서열번호 23) 프라이머 쌍을, 레인 2는 P55(서열번호 4)/P53(서열번호 3) 프라이머 쌍을, 레인 3은 P55(서열번호 4)/P63(서열번호 5) 프라이머 쌍을, 레인4는 P75(서열번호 22)/P83(서열번호 21) 프라이머 쌍을, 레인 5는 P55(서열번호 4)/P73(서열번호 23) 프라이머 쌍을, 레인 6은 P65(서열번호 20)/P83(서열번호 21) 프라이머 쌍을, 레인 7은 P55(서열번호 4)/P83(서열번호 21) 프라이머 쌍을 사용하였다. 그 결과를 도 6b 및 도 6c에 나타내었다.
도 6b와 도 6c에서 알 수 있는 바와 같이, 본원 발명의 핫스타트 건조 조성물은 50℃에서 9일까지 방치하여도 반응이 잘 나타남을 확인할 수 있는 반면, 종래 핫스타트 마스터믹스 용액의 경우에는 상온에서 방치 시 2일째부터는 반응 결과가 나오지 않음을 알 수 있으며, 전혀 핫스타트 효과를 확인할 수 없었다.
실시예 6. PPi 와 PPase 가 포함된 프리믹스 건조물에 대한 Long PCR
PPi와 PPase(sibzyme 사)가 포함된 건조 프리믹스 제조물에 대해 람다 DNA를 주형으로 다양한 길이의 증폭 산물을 제조하기 위한 PCR 반응을 수행하였다. 이를 위하여, 1) Taq DNA 중합효소를 포함하는 프리믹스(10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 안정화제를 포함)와 2) Pfu DNA 중합효소를 포함하는 프리믹스(10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Pfu DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 안정화제를 포함), 및 3) Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소를 모두 포함하는 프리믹스(10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq DNA 중합효소, 1U Pfu DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 안정화제를 포함)에 각각 2.0 mM PPi와 80 mU PPase을 공통으로 포함시킨 실시예 5와 같이 건조 핫스타트 PCR 조성물을 제조하였다.
주형 DNA로는 반응당 람다 DNA 20 ng를 사용하였고, 500 bp 내지 15.0 kbp 반응용으로 정방향(forward) 프라이머로는 서열번호 6으로 기재되는 L303050-F 프라이머를 사용하였고, 역방향(reverse) 프라이머로는 500 bp, 1 kbp, 2 kbp, 5.0 kbp, 10.0 kbp, 12.0 kbp 및 15 kbp 생성용으로 각각 서열번호 7 내지 서열번호 13으로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머를 사용하였다. 또한, 20.0 kbp 반응을 위해서는 정방향 프라이머/역방향 프라이머로 각각 서열번호 14 및 서열번호 15로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하였고, 30.0 kbp 반응을 위해서는 정방향 프라이머/역방향 프라이머로 각각 서열번호 16 및 서열번호 17로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하였다.
PCR 반응을 위하여, Taq DNA 중합효소를 이용한 조건과 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소를 함께 적용한 조건에서는 37℃에서 2시간 동안 사전 방치후, 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 94℃에서 30초 동안 변성 단계와 68℃에서 20분 동안 어닐링 단계와 신장 단계를 동시에 진행하는 것을 1 반응 주기로 하여 총 28회 반응 주기를 진행하였고, 이후 72℃에서 10분 동안 최종 신장 단계를 진행하였으며, Pfu DNA 중합효소만을 이용한 조건에서는 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 94℃에서 30초 동안 변성 단계와 68℃에서 20분 동안 어닐링 단계와 신장 단계를 동시에 진행하는 것을 1 반응 주기로 하여 총 28회 반응 주기를 진행하였고, 이후 72℃에서 10분 동안 최종 신장 단계를 진행하였다. PCR 반응에 대한 반응증폭 결과는 1.0% 아가로스가 포함된 0.5x TBE 버퍼를 이용한 전기영동으로 반응산물에 대한 결과를 확인하였다.
그 결과, 2.0 mM PPi와 80 mU PPase 및 Taq DNA 중합효소가 포함된 프리믹스 조건의 경우, 500 bp 내지 15.0 kbp 길이의 DNA 증폭을 위한 모든 조건에서 높은 PCR 반응성이 있음을 확인하였고, 특히 15kb 증폭산물에 있어서는 핫스타트 효과인 비특이 반응의 현저한 감소와 높은 PCR 반응성 증가를 확인하였다(도 7). 또한, Pfu DNA 중합효소가 포함된 조건의 경우에는 5.0 kb까지만 PCR 반응성을 확인한 반면, 2.0 mM PPi와 80 mU PPase 및 Pfu DNA 중합효소가 포함된 프리믹스 조건에서는 10.0 kb까지 PCR 반응성을 확인하였다. 즉, PPi와 PPase를 처리한 조건에서 핫스타트 효과인 비특이 반응의 현저한 감소와 높은 PCR 반응성 증가를 확인하였다(도 8). 아울러, 2.0 mM PPi, 80 mU PPase와 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소가 포함된 프리믹스 조건과 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소가 포함된 프리믹스 조건 모두에서 20.0 kb까지 PCR 반응성을 확인하였으며, 특히 1.0 kb 증폭산물 조건에 있어서 PPi와 PPase를 처리한 경우 비특이반응이 제거됨을 확인하였다(도 9). 즉, 핫스타트 효과인 비특이 반응 감소 효과와 높은 PCR 반응성을 확인하였다.
실시예 7. PPi 와 PPase 가 포함된 핫스타트 반응물을 이용한 실시간 PCR 반응
실시간 PCR 검출법을 이용하여 PPi와 PPase(sibzyme 사)를 포함하는 PCR 조성물에 의한 핫스타트 효과를 확인하기 위하여, 2x PCR Premix 용액(10 mM TrisHCl pH 9.0, 50 mM KCl, 2.0 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq. DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 안정화제를 포함)에 20 ㎕ 반응당 0.25x가 되도록 형광물질(Greenstar TM, 바이오니아사)을 첨가하고, PPi와 PPase가 각각 2.0 mM 및 80 mU가 되도록 한 조성물을 제조하였다. 대조군으로는 2x PCR Premix 용액(10 mM TrisHCl pH 9.0, 50 mM KCl, 2.0 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq. DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 안정화제 포함)에 20 ㎕ 반응당 0.25x가 되도록 상기 형광물질을 첨가하였다. 상기 형광물질은 주형 DNA 증폭시 생성하는 이중가닥의 DNA 사이에 끼어들어(intercalation) 발생하는 형광량을 측정함으로써 특이적 염기서열의 형광 프로브 없이도 간편하게 분석할 수 있는 형광물질이다.
주형 DNA로는 반응당 람다 DNA 1 ng을 사용하였고, 프라이머는 90 bp를 PCR 증폭산물로 하는 서열번호 18로 기재되는 L90_F 프라이머 및 서열번호 19로 기재되는 L90_R 프라이머를 20 ㎕ 반응당 각각 10 pmole을 사용하였다. PCR 반응은 ABI 7500 Fsat system 장비(Applied biosystems사)를 이용하여 수행하였고, 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 95℃에서 10초 동안 변성 단계와 60℃에서 15초 동안 어닐링 단계와 신장 단계의 동시 반응을 1 반응 주기로 하여 총 40회 반응 주기를 진행하였다. 이후, 분리 단계(dissociation step)를 진행하여 증폭산물에 대한 멜팅 커브를 작성하여 PCR 증폭산물에 대한 PCR 반응성 및 특이성을 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 선 1과 선 2에 대한 역치 사이클수(threshold cycle)(Ct)는 동일하게 21.19로 확인되었다. 따라서, 실시간 정량 PCR에 대한 PCR 반응성은 PPi와 PPase를 병용처리한 조건이나 미처리한 조건 모두에서 반응성이 일치됨을 확인하였다.
또한, 도 11에 나타난 바와 같이, PPi와 PPase가 포함된 선 1에서는 정확한 증폭산물만이 생성되었다는 하나의 형광피크만이 나타난 반면, PPi와 PPase가 포함되지 않은 선 2는 두개의 증폭산물이 생성되었다는 두개의 형광피크가 나타났다. 이는, 목적하는 PCR 증폭산물 이외에 그보다 작은 크기의 프라이머 다이머 증폭산물이 생성되었음을 의미한다. 또한, 정확한 PCR 증폭산물에 대한 멜팅 온도(Tm)는 실험군(선 1) 및 대조군(선 2)에서 공히 82.8℃로 확인되었고, 프라이머 다이머 밴드에 대한 멜팅 온도(Tm)는 이보다 낮은 75.5℃로 확인되었다.
상기 결과로부터, 본 발명에 사용되는 PPase는 실시간 PCR 반응에서도 PPi가 억제시킨 PCR 반응을 효과적으로 복구시켜 핫스타트 방법의 장점인 비특이적 PCR 증폭산물의 생성을 억제시키고, PCR 반응성을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 반면에, 대조군의 경우에는 증폭산물 이외에도 프라이머 다이머가 생성되어 낮은 특이성을 보인다는 것을 확인하였다.
실시예 8. PPi 와 PPase 가 포함된 핫스타트 반응물을 이용한 실시간 정량 PCR 반응
실시간 정량 PCR을 통하여 PPi와 PPase에 의한 핫스타트 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위하여, 2x PCR Premix 용액(10 mM TrisHCl pH 9.0, 50 mM KCl, 2.0 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Taq DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 다카알코올 포함)에 20 ㎕ 반응당 0.25x의 형광물질(Greenstar TM)을 첨가하고, 2.0 mM PPi 및 80 mU PPase를 첨가한 조성물 1, 및 상기 2x PCR Premix 용액에 20 ㎕ 반응당 0.25x의 형광물질을 첨가하고, 0.5 mM PPi 및 0.3 mU PPase(sibzyme 사)를 첨가한 조성물 2를 제조하였고, 상기 2x PCR Premix 용액에 20 ㎕ 반응당 0.25x 되도록 상기 형광물질만을 첨가한 것을 대조군으로 사용하였다.
주형 DNA로는 반응당 람다 DNA 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg 및 100 fg까지 10배씩 순차희석하여 6 단위(order)가 되도록 하였다. 프라이머는 90 bp를 PCR 증폭산물로 하는 서열번호 18로 기재되는 L90_F 프라이머와 서열번호 19로 기재되는 L90_R 프라이머를 20 ㎕ 반응당 각각 10 pmole을 사용하였다. PCR 반응 및 멜팅커브 작성은 상기 실시예 7에서와 동일하게 수행하였으며, 또한 정량곡선을 이용하여 순차희석된 주형에 대한 PCR 효율(Efficiency, 이하 "E")과 PCR 선형도(Linearity, 이하 "R^2")를 작성하여 핫스타트 효과를 비교 확인하였다.
도 14의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군의 경우에는 도 11에서 확인된 75.5℃에서의 형광피크 결과와는 달리 87.5℃에서도 형광피크가 확인되었다. 즉, 두개의 형광피크중에서 정확한 PCR 증폭산물에 대한 형광피크는 멜팅 온도(Tm) 82.8℃에 해당되는 것이고 멜팅 온도(Tm) 87.5℃에 해당되는 형광피크는 비특이 반응으로 인해 형성된 반응산물로 확인되었다. 원안에서 언급된 형광피크에 있어서, 위쪽부터 아래쪽까지에 대한 람다 DNA 농도는 순차적으로 10 ng, 1 ng, 100 pg 및 10 pg에 대한 멜팅 커브 작성을 통한 결과이다. 따라서, 도 12와 도 13에 대한 실시간 정량 PCR 결과는 비특이반응 증폭산물의 형성이 반영된 것으로서, 정확한 정량 PCR 결과가 아닌 것으로 확인되었다.
또한, 도 17의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 조성물 2의 경우에는 3개의 형광피크가 나타났다. 즉, 정확한 PCR 증폭산물에 대한 멜팅 온도(Tm)인 82.8℃에 해당되는 피크와, 프라이머 다이머로 인한 멜팅 온도(Tm)인 75.5℃에 해당되는 피크(도 17에서의 "I"에 해당) 및 PCR 증폭산물 크기보다 큰 비특이적 증폭산물에 대한 멜팅 온도(Tm)인 87.5℃에 해당되는 피크(도 17에서의 "Ⅱ"에 해당)를 확인하였다. 도 14의 결과와 비교할 때, "Ⅱ"에 해당하는 피크의 크기가 다소 줄어든 것으로부터 핫스타트 효과가 있음은 확인되었으나, 프라이머 다이머와 비특이 증폭산물이 여전히 생성되고 있음을 확인하였다. 따라서, 도 15와 도 16에 대한 실시간 정량 PCR 결과는 비특이반응 증폭산물과 프라이머 다이머로 인한 결과를 포함하는 것으로서, 정확한 정량 PCR 결과를 반영하는 것은 아닌 것으로 판단되었다.
아울러, 도 20의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 조성물 1의 경우에는 정확한 하나의 증폭산물이 생성되었음을 의미하는 한개의 형광피크만이 나타났고, 이에 대한 멜팅 온도(Tm) 82.8℃로 확인되었다. 원안에서 언급된 형광피크에 있어서, 위쪽부터 아래쪽까지에 대한 람다 DNA 농도는 순차적으로 10 ng, 1 ng, 100 pg 및 10 pg에 대한 멜팅 커브 작성을 통한 결과이다. 따라서, 도 18과 도 19에 대한 실시간 정량 PCR 결과는 특이반응 증폭산물로 인한 것으로서, 정확한 정량 PCR 결과를 반영하는 것임을 확인하였다. 즉, PPi와 PPase에 의한 핫스타트 효과는 실시간 qPCR 반응에서도 나타남을 확인하였다. 또한, 기 출원한 특허(출원번호: 10-1999-0004361)에서의 PPi 및 PPase 조건인 조성물 2와 비교할 때, 조성물 1의 경우에는 프라이머 다이머가 발생하지 않고 비특이 반응 산물의 증폭이 최소화됨을 확인하였다.
도 21은 도 14와 도 20에서 확인된 멜팅 커브 작성 결과를 중첩시켜 비교한 도식으로 횡축은 온도변화에 대한 표식이고 종축은 온도 증가에 따른 측정 형광값에 대한 표식이다. w/o(without) PPi+PPase는 2x PCR Premix 용액에 대한 실시간 정량 PCR 반응시의 멜팅 커브로서, 그래프의 선 1 내지 선 4는 순차적으로 DNA 10 ng, 1 ng, 100 pg 및 10 pg에서의 비특이반응 생성물에 대한 형광피크 결과이다. w/ (with) PPi+PPase는 2x PCR Premix 용액에 20 ㎕ 반응당 2.0 mM PPi와 80 mU PPase가 포함된 조건의 실시간 정량 PCR 반응 결과에 대한 멜팅 커브 결과로서, 비특이반응 생성물이 만들어지지 않음을 알 수 있다.
실시예 9. Top DNA 중합효소와 PPi 그리고 PPase 가 포함된 프리믹스 건조물에 대한 PCR 반응
Top DNA 중합효소에 PPi와 PPase가 포함된 프리믹스 제조물에 대해 인간 DNA를 주형으로 다양한 길이의 증폭 산물을 제조하기 위한 PCR 반응을 수행하였다. 이를 위하여, 1) Top DNA 중합효소와 PPi 그리고 PPase(sibzyme 사)를 포함하는 프리믹스(10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Top DNA 중합효소, 0.01% Tween 20, 2.0mM PPi, 80mU PPase 및 안정화제를 포함)와 2) Top DNA 중합효소를 포함하는 프리믹스(10 mM TrisHCl pH 9.0, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP, 1U Top DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 안정화제를 포함)의 건조 조성물을 제조하였다.
주형 DNA로는 반응당 인간 DNA 10 ng를 사용하였고, 약 100 bp 내지 약 1.6 kbp 범위의 증폭산물을 생성하기 위하여, 139 bp 반응을 위해서는 정방향 프라이머/역방향 프라이머로 각각 서열번호 22 및 서열번호 23으로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하였고(도 22, 레인 1 및 레인 8), 211 bp 반응을 위해서는 정방향 프라이머/역방향 프라이머로 각각 서열번호 4 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하였고(도 22, 레인 2 및 레인 9), 447 bp 반응을 위해서는 정방향 프라이머/역방향 프라이머로 각각 서열번호 4 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하였고(도 22, 레인 3 및 레인 10), 618 bp 반응을 위해서는 정방향 프라이머/역방향 프라이머로 각각 서열번호 22 및 서열번호 21로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하였고(도 22, 레인 4 및 레인 11), 1,082 bp 반응을 위해서는 정방향 프라이머/역방향 프라이머로 각각 서열번호 4 및 서열번호 23으로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하였고(도 22, 레인 5 및 레인 12), 1,296 bp 반응을 위해서는 정방향 프라이머/역방향 프라이머로 각각 서열번호 20 및 서열번호 21로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하였고(도 22, 레인 6 및 레인 13), 1,561 bp 반응을 위해서는 정방향 프라이머/역방향 프라이머로 각각 서열번호 4 및 서열번호 21로 기재되는 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하였다(도 22, 레인 7 및 레인 14).
PCR 반응을 위하여, 37℃에서 4시간 동안 사전 방치후, 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 94℃에서 20초 동안 변성 단계와 55℃에서 40초 동안 어닐링 단계와 72℃에서 40초 동안 신장 단계를 진행하는 것을 1 반응 주기로 하여 총 33회 반응 주기를 진행하였고, 이후 72℃에서 5분 동안 최종 신장 단계를 진행하였다. PCR 반응에 대한 반응증폭 결과는 1.6% 아가로스가 포함된 0.5x TBE 버퍼를 이용한 전기영동으로 반응산물에 대한 결과를 확인하였다.
그 결과, 2.0 mM PPi와 80 mU PPase 및 Top DNA 중합효소가 포함된 프리믹스 조건의 경우, 약 100 bp 내지 약 1.6 kbp 길이의 DNA 증폭을 위한 모든 조건에서 4시간의 전처리조건에서도 높은 PCR 반응성과 특이성을 확인하였다(도 22, 레인 1 내지 레인 7). 이와는 반대로, Top DNA 중합효소만 포함된 프리믹스 조건의 경우에서는 약 100 bp 내지 약 1.6 kbp 길이의 DNA 증폭을 위한 모든 조건에서 비특이반응이 발생되거나 반응이 되지 않는 결과를 확인하였다(도 22, 레인 8 내지 레인 14). 상기 결과로부터, Top DNA 중합효소에 PPi와 PPase를 포함한 프리믹스 조건에서도, 핫스타트 효과인 비특이 반응 감소 효과와 높은 PCR 반응성이 있음을 확인하였다.
실시예 10. PPi 와 PPase 가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조 조성물에 대한 보관 안정성 검토
PPi와 PPase(바이오니아 사)가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물에 대한 보관기간 중 안정성을 검토하기 위하여, 웰 당 10 mM Tris-HCl pH 9.2, 60 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTPs, 1U wTfi DNA 중합효소, 0.01% Tween 20, 2.0 mM PPi, 92.5 mU PPase, 1.2 ㎍ 소 혈청 알부민 및 안정화제로 메틸알파 디 글루코피라노사이드(Methyl-α-D- Gluco-Pyranoside: 알파-MG)를 포함시킨 프리믹스 건조물을 제조하였고, 대조군으로는 상기 조성과 동일한 조성의 용액을 매 실험 직전에 제조하여 곧바로 사용하였다. 건조 조건은 SuperCentra 기기(바이오니아사)를 이용하여 외부 온도 설정 40℃, 내부 온도 설정 36℃에서 50분간 건조하였다. 상기와 같이 제조된 프리믹스를 50℃ 반응기에서 보관하면서 보관 후 0일부터 7일까지 매 1일 간격으로 프리믹스 건조물이 담긴 8-웰 스트립을 채취하였고, 채취된 스트립은 실시간 PCR 반응 전까지 냉동고에 보관하거나 채취 당일 대조군 검체와 동일한 조건에서 실시간 PCR 반응을 수행하였다.
실시간 PCR 을 수행에 사용한 프라이머, 프로브 및 표준 주형 DNA 샘플은 다음과 같다. 주형 DNA로는 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella-zoster virus)의 ORF 유전자를 포함하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 사용하였고, 카피수가 1 x 100 ~ 1 x 106 카피/㎕ 범위의 주형 DNA 샘플을 웰 당 10 ㎕씩 첨가하여 사용하였다. 주형 DNA가 포함되지 않은 대조군 샘플로는 동일 부피의 주형 DNA 샘플 대신에 DEPC 처리된 증류수를 사용하였다. 프라이머는 80 bp PCR 증폭산물을 생성하는 서열번호 25로 기재되는 포워드 프라이머(서열: 5'-TGGATGTGGTGTTCCCAAT-3')와 서열번호 26으로 기재되는 리버스 프라이머 쌍(서열: 5'-GTTCAGGCAACCG TTTTGA-3')을 사용하였고, 프로브는 5' 말단에 FAM 형광물질과 3' 말단에 TAMRA 형광물질이 표지된 서열번호 27로 기재되는 TaqMan 기반 프로브(서열: 5'-CTCATACC GAGTTGCATCCAACG-3')를 사용하였다. 서열번호 25와 서열번호 26으로 기재되는 프라이머 쌍은 50 ㎕ 반응당 각각 10 pmole씩 첨가하였고 서열번호 27로 기재된 프로브는 50 ㎕ 반응당 각각 7.5 pmole씩 첨가하여 사용하였다. 이 후 DEPC 처리된 증류수로 웰 당 최종 반응액의 양이 50 ㎕ 되도록 첨가하였다. 건조과정이나 보관과정에서 생길 수 있는 반응성의 차이를 비교하기 위한 대조군으로 프리믹스 건조물을 제조하기 위해 사용된 것과 동일한 조성을 갖는 용액을 매 실험 직전에 제조한 후 곧바로 사용하였으며 프리믹스 건조물과 동일한 조건에서 실시간 PCR 실험을 수행하였다.
실시간 PCR 증폭을 위해 사용한 기기는 엑시사이클러 버전 3.0 장비(바이오니아사)를 사용하였으며, 작동 프로그램 및 분석 프로그램은 기기 제조사에서 정한 방법에 따라 시행하였다. 실시간 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 다음과 같다. 95℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 95℃에서 20초 동안 변성 단계 및 55℃에서 40초 동안 어닐링/신장 단계 및 형광값 검출 단계를 1 반응 주기로 하여 총 45회 반응 주기로 수행 하였다. PCR 증폭 반응 종료 후 반응 산물에 대한 결과는 엑시사이클러 실시간 PCR 장비에서 작동하는 분석 프로그램을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 50℃ 방치 후 8일 경과 시까지 최초 프리믹스 건조물의 반응성과 유사한 결과를 보였으며, 50℃ 방치 후 9일까지 건조 직후의 Rn값과 비교할 때 85% 정도 이상의 형광값이 유지됨을 확인하였다(도 23a 내지 도 23g). 이 50℃ 가속실험 결과를 영하 20℃ 보관조건으로 환산하면 1,152일(3.1년)까지 프리믹스 건조물은 대조군과 유사한 반응성이 유지됨을 유추할 수 있다.(참고문헌: 이상용 저, 신뢰성공학, 1999년, 형설출판사).
실시예 11. PPi 와 PPase 가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물과 동일 조성의 핫스타트 용액 조성물에 대한 냉장 및 냉동보관시 안정성 비교
PPi와 PPase(바이오니아 사)가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물과 동일 조성의 핫스타트 용액 조성물간의 냉장보관(4℃) 및 냉동보관(-20℃)에서의 안정성 비교를 위하여, 실시예 10에 기재된 대로 프리믹스 건조물을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 프리믹스 건조물을 냉장고(4℃) 또는 냉동고(-20℃)에서 보관하면서 보관 후 7주까지 매주 간격으로 스트립을 채취하였고, 채취된 스트립은 실시간 PCR 반응 전까지 냉동고에 보관하거나 채취 당일 동일한 조건에서 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 대조군으로는 상기 조성과 동일한 조성의 핫스타트 용액을 매 실험 직전에 제조하여 곧바로 사용하였다.
실시간 PCR 수행에 사용한 프라이머, 프로브 및 표준 주형 DNA 샘플은 다음과 같다. 주형 DNA로는 B형 간염 바이러스의 표면 항원 유전자(large surface gene)를 포함하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 사용하였고 카피수가 1 x 100 ~ 1 x 106 카피/㎕ 범위의 주형 DNA 샘플을 웰 당 10 ㎕씩 첨가하여 사용하였다. 프라이머는 91 bp PCR 증폭산물을 생성하는 서열번호 28로 기재되는 포워드 프라이머 (서열: 5'-CCAATCACTCACCAACCTCTTGT-3')와 서열번호 29로 기재되는 리버스 프라이머 쌍(서열: 5'-AGCAGGATGAAGAGGAATATGATAAA-3')을 사용하였고, 프로브는 5' 말단에 FAM 형광물질과 3' 말단에 TAMRA 형광물질이 표지된 서열번호 30으로 기재되는 TaqMan 기반 프로브(서열: 5'-TCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGC-3')를 사용하였다. 나머지 실시간 PCR 증폭을 위한 실험 조건은 실시예 10에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하였다.
실시간 PCR 증폭을 위해 사용한 기기는 어플라이드 바이오시스템사의 7500 패스트(Fast) 장비를 사용하였으며, 작동 프로그램 및 분석 프로그램은 기기 제조사에서 정한 방법에 따라 시행하였다. 실시간 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 다음과 같다. 95℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 95℃에서 20초 동안 변성 단계 및 55℃에서 40초 동안 어닐링/신장 단계 및 형광값 검출 단계를 1 반응 주기로 하여 총 45회 반응 주기로 수행 하였다.
그 결과, 본 발명의 핫스타트 프리믹스 건조물을 냉장(4℃)보관 또는 냉동보관(-20℃)한 경우 모두 7주 경과 시까지 최초 프리믹스 건조물의 반응성과 유사한 결과를 보임을 확인하였다(도 24a 내지 도 24e, 도 24h 및 도 24i). 반면에, 대조군으로 사용한 동일 조성의 용액을 사용한 결과, 4℃ 냉장조건에서 3주까지 보관했을 때는 유사한 실시간 PCR 반응성이 유지됨을 확인하였으나, 냉장 7주 보관했을때 반응성이 상실됨을 확인하였다(도 24f 및 도 24g). 상기 결과로부터, 마스터믹스 용액형태로 보관할 경우 4℃ 보관조건에서 3주 이후 급격히 반응성이 상실되는 데 반해, 본 발명의 핫스타트 프리믹스를 사용한 경우는 오랜 기간 반응성이 유지됨을 알 수 있었다.
실시예 12. PPi 와 PPase 가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물과 동일 용도의 종래 제품과의 PCR 반응성 검토
PPi와 PPase가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물과 동일 용도의 종래 제품과의 PCR 반응성을 비교하기 위하여, TaKaRa Premix Ex Taq™ (Takara, Cat#: RR039A), Qiagen QuantiFast™ Probe PCR + ROX Vial Kit (Qiagen, Cat#: 204352) 및 Invitrogen Platinum Quantitative PCR SuperMix-U (Invitrogen, Cat#: 11730-017)를 비교군으로 선택하여 본 발명의 핫스타트 프리믹스 건조물과 PCR 반응성 비교실험을 수행하였다. PPi와 PPase가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물을 제조하기 위한 건조 조건은 실시예 10과 동일한 조건에서 시행되었다.
실시간 PCR 수행에 사용한 프라이머, 프로브 및 표준 주형 DNA 샘플은 다음과 같다. 주형 DNA로는 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)의 E 유전자를 포함하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 사용하였고, 카피수가 2 x 100 ~ 2 x 106 카피/㎕ 범위의 주형 DNA 샘플을 웰 당 5 ㎕씩 첨가하여 사용하였다. 프라이머는 85 bp PCR 증폭산물을 생성하는 서열번호 31로 기재되는 포워드 프라이머 (서열: 5'-GTGGAGGAACAGAGAGACGTTAA TG-3') 와 서열번호 32로 기재되는 리버스 프라이머 쌍 (서열: 5'-TCCCTCTTGTGAGCCC AATG-3')을 사용하였고 프로브는 5' 말단에 FAM 형광물질과 3' 말단에 TAMRA 형광물질이 표지된 서열번호 33으로 기재되는 TaqMan 기반 프로브(서열:5'-TGAG GAACCACACGCCACGAAGC-3')를 사용하였다. 나머지 실시간 PCR 증폭을 위한 실험 조건은 실시예 10에 기재된 것과 동일하게 수행하였다. 3개 회사 제품의 경우 동일한 프라이머, 프로브 및 표준 주형 DNA 샘플을 사용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건과 마스터믹스 제조 조건은 각 회사에서 제시한 조건에 맞춰 진행하였다.
실시간 PCR 증폭을 위해 사용한 기기는 어플라이드 바이오시스템 사의 7500 패스트(Fast) 실시간 PCR 장비를 사용하였으며, 작동 프로그램 및 분석 프로그램은 기기 제조사에서 정한 방법에 따라 시행하였다. PCR 증폭 반응 종료 후 반응 산물에 대한 결과는 어플라이드 바이오시스템 사의 7500 Fast 실시간 PCR 장비에서 작동하는 분석 프로그램을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도표에서 보는 것과 같이 PPi/PPase가 포함된 본 발명의 핫스타트 프리믹스 건조물(Bioneer Premix)과 Takara 사 제품의 경우 웨스트 나일 바이러스 10 카피까지 검출이 가능하였으나, 나머지 두 회사 제품에서는 100 카피까지만 검출되는 것이 확인되었다(도 25a). 또한, 형광값의 정도를 비교한 결과 본 발명의 건조물의 경우 Takara사 제품을 이용하였을 때 나오는 형광값의 두배 이상 높은 형광값을 보임을 확인하였다(도 25b). 상기 결과로부터, 전체적인 PCR 반응성의 측면에서 볼 때, PPi/PPase가 포함된 본 발명의 핫스타트 프리믹스 건조물이 비교 실험한 3가지 대조군 제품보다 월등히 향상된 결과를 보임을 확인하였다.
실시예 13. PPi 와 PPase 가 포함되고 안정화제가 포함되지 않은 핫스타트 프리믹스 건조물에 대한 PCR 반응성 검토
PPi와 PPase(바이오니아 사)가 포함되고 안정화제인 메틸알파 디 글루코피라노사이드(Methyl-α-D-Gluco-Pyranoside; 알파-MG)가 포함되지 않은 핫스타트 프리믹스 건조물에 대한 PCR 반응성과 보관 안정성 검토를 위하여, 실시예 10에 기재된 바대로 프리믹스 건조물을 제조하였고, 대조군으로는 상기와 동일한 조성에서 안정화제인 0.1M 알파-MG를 제거하고 제조된 프리믹스 건조물을 이용하였다. 상기 두 가지 종류의 프리믹스 건조물을 제조하기 위한 건조 조건은 실시예 10과 동일한 조건에서 수행되었다. 상기와 같이 제조된 프리믹스 건조물을 대조군 프리믹스 건조물과 동일한 조건에서 실시간 PCR 반응을 수행하였다.
실시간 PCR 수행에 사용한 프라이머, 프로브 및 표준 주형 DNA 샘플은 실시예 11에서 사용한 서열과 동일하다. 주형 DNA로는 B형 간염 바이러스의 표면 항원 유전자(large surface gene)를 포함하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 사용하였고, 카피수가 1 x 100 ~ 1 x 106 카피/㎕ 범위의 주형 DNA 샘플을 웰 당 10 ㎕씩 첨가하여 사용하였다. 나머지 실시간 PCR 증폭을 위한 실험 조건은 실시예 10에 기재된 것과 동일한 조건에서 수행하였다.
실시간 PCR 증폭을 위해 사용한 기기는 어플라이드 바이오시스템사의 7500 패스트 장비를 사용하였으며 작동 프로그램 및 분석 프로그램은 기기 제조사에서 정한 방법에 따라 시행하였다. 실시간 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 다음과 같다. 95℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 95℃에서 20초 동안 변성 단계 및 55℃에서 40초 동안 어닐링/신장 단계 및 형광값 검출 단계를 1 반응 주기로 하여 총 45회 반응 주기로 수행하였다. PCR 증폭 반응 종료 후 반응 산물에 대한 결과는 어플라이드 바이오시스템사의 7500 패스트 장비에서 작동하는 분석 프로그램을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 안정화제가 포함되지 않은 핫스타트 프리믹스 건조물과 대조군인 안정화제가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물의 반응성, 특히 Ct 값은 동일한 표준검체에 대해서 유사한 결과를 보였다(도 26a 및 도 26b). 상기 결과로부터, 안정화제의 첨가가 핫스타트 프리믹스 건조물의 PCR 반응성에는 영향을 주지 않는다는 점을 확인하였다.
실시예 14. 실시간 PCR 장비의 종류에 따른 PPi 와 PPase 가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물의 PCR 반응성 검토
실시간 PCR 장비의 종류에 따른 PPi와 PPase(바이오니아 사)가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물의 PCR 반응성의 변화 유무를 검토하기 위하여, 3군데 회사의 실시간 PCR 장비(5종류)를 사용하여 실험하였다. 프리믹스 건조물의 조성 및 건조 조건은 실시예 10에 기재된 것과 동일하게 수행하였다. 상기와 같이 제조된 프리믹스 건조물에 대해 3군데 회사의 총 5가지 실시간 PCR 장비를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 사용한 실시간 PCR 장비들은 다음과 같다: 엑시사이클러 버전 3(바이오니아사), 어플라이드 바이오시스템 7500, 7500 패스트 장비, 스텝원 장비(어플라이드 바이오시스템사) 및 디엔에이엔진 옵티콘(엠제이리서치). 작동 프로그램 및 분석 프로그램은 기기 제조사에서 정한 방법에 따라 시행하였다. 실시간 PCR 증폭을 위한 반응은 실시예 10에 기재된 바대로 수행하였다. PCR 증폭 반응 종료 후 반응 산물에 대한 결과는 각 실시간 PCR 장비에서 작동하는 분석 프로그램을 이용하여 확인하였다.
실시간 PCR 수행에 사용한 프라이머, 프로브 및 표준 주형 DNA 샘플은 실시예 12에 사용한 서열과 동일하다. 주형 DNA로는 웨스트 나일 바이러스의 E 유전자를 포함하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 사용하였고, 카피수가 2 x 100 ~ 2 x 106 카피/㎕ 범위의 주형 DNA 샘플을 웰 당 5 ㎕씩 첨가하여 사용하였다. 나머지 실시간 PCR 증폭을 위한 실험 조건은 실시예 10에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하였다.
그 결과, 핫스타트 프리믹스 건조물은 여러 가지 장비에서 공통적으로 유사한 결과를 보임을 확인할 수 있었다(도 27a 내지 도 27e). 이는 본 발명의 건조 조성물이 특정 장비에만 제한적으로 사용할 수 있는 것이 아니라 여러 가지 장비에 보편적으로 사용할 수 있음을 보여준다.
실시예 15. 여러 가지 표적 유전자를 이용하여 PPi 와 PPase 가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물의 PCR 반응성 검토
여러 가지 표적 유전자를 이용하여 PPi와 PPase가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물의 PCR 반응성을 비교하기 위하여, 3개의 다른 표적 유전자, 즉 웨스트나일바이러스의 E 유전자, 바리셀라 조스터 바이러스의 ORF 유전자 및 B형 간염 바이러스의 표면항원 유전자를 이용하였다. PPi와 PPase가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물을 제조하기 위한 조건은 실시예 10에 기재된 조건과 동일한 조건에서 시행되었다.
실시간 PCR 수행에 사용한 프라이머, 프로브 및 표준 주형 DNA 샘플은 실시예10, 11, 12에 사용한 서열과 동일하다. 주형 DNA로는 위에서 언급한 3가지 표적 유전자 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 사용하였고 카피수가 2 x 100 ~ 2 x 106 카피/㎕ 범위의 주형 DNA 샘플을 웰 당 5 ㎕씩 첨가하여 사용하였다. 나머지 실시간 PCR 증폭을 위한 실험 조건은 실시예 10에 기재된 것과 동일한 조건에서 수행하였다.
실시간 PCR 증폭을 위해 사용한 기기는 엑시사이클러 버전 3.0 장비(바이오니아사)를 사용하였으며, 작동 프로그램 및 분석 프로그램은 기기 제조사에서 정한 방법에 따라 시행하였다. 실시간 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 다음과 같다. 95℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 95℃에서 20초 동안 변성 단계 및 55℃에서 40초 동안 어닐링/신장 단계 및 형광값 검출 단계를 1 반응 주기로 하여 총 45회 반응 주기로 수행하였다. PCR 증폭 반응 종료 후 반응 산물에 대한 결과는 엑시사이클러 실시간 PCR 장비에서 작동하는 분석 프로그램을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 각각의 유전자 서열, 염기 구성, 증폭되는 표적 서열의 길이가 다른 3가지 표적 유전자 모두에서 유사한 결과를 보였다(도 28a 내지 도 28c). 상기 결과로부터, 본 발명의 핫스타트 프리믹스 건조물은 다양한 표적 유전자에 대해 범용적으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 16. 사이브로그린 형광염료와 PPi 와 PPase 가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물을 이용한 실시간 PCR 반응
실시간 PCR 반응을 이용하여 사이브로그린 형광염료, PPi와 PPase를 포함하는 핫스타트 프리믹스 건조물의 실시간 PCR 반응성을 확인하기 위하여, 최종농도가 10 mM TrisHCl, pH 9.0, 40 mM KCl, 2 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTP (최종농도 0.25mM), 2.5U Top DNA 중합효소, 0.01% Tween 20, 안정화제, 50 ㎕ 반응당 0.6x가 되도록 10x 사이브로그린 형광물질(바이오니아사 Greenstar TM)을 첨가하고, PPi와 PPase(바이오니아 사)가 각각 2.0 mM 및 92.5 mU가 되도록 한 조성물을 제조하였다. 핫스타트 프리믹스 건조 조건은 실시예 10에 기재한 바대로 건조하였다. 대조군으로는 동일 조성의 마스터믹스 용액 형태를 실험 직전에 제조하여 곧바로 사용하였다. 상기 형광물질은 주형 DNA 증폭시 생성하는 이중가닥의 DNA 사이에 끼어들어(intercalation) 발생하는 형광량을 측정함으로써 특이적 염기서열의 형광 프로브 없이도 간편하게 분석할 수 있는 형광물질이다.
주형 DNA로는 람다 DNA(바이오니아사)를 사용하였고, 사용 범위는 0.1 ng에서 0.1 pg 범위를 사용하였다. 프라이머는 127 bp를 PCR 증폭산물로 하는 서열번호 34(서열: 5'-GAACTGATGAGCGATCCGAATAG-3')로 기재되는 L127_F 프라이머 및 서열번호 35 (서열: 5'-CCACCACTGATTAGCGAATGC-3')로 기재되는 L127_R 프라이머를 50 ㎕ 반응당 각각 10 pmole을 사용하였다. PCR 반응은 ABI 7500 Fsat system 장비(Applied biosystems사)를 이용하여 수행하였고, 반응 조건은 95℃에서 1분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 95℃에서 5초 동안 변성 단계와 55℃에서 35초 동안 어닐링 단계와 신장 단계의 동시 반응을 1 반응 주기로 하여 총 40회 반응 주기를 진행하였다. 이후, 분리 단계(dissociation step)를 진행하여 증폭산물에 대한 멜팅 커브를 작성하여 PCR 증폭산물에 대한 PCR 반응성 및 특이성을 확인하였다.
그 결과, 핫스타트 프리믹스 건조물을 이용하였을 때 대조군의 결과와 유사한 결과를 보였다(도 29a 및 도 29b). 따라서, 실시간 정량 PCR에 대한 PCR 반응성은 사이브로그린 형광염료 및 PPi와 PPase를 포함한 핫스타트 프리믹스 건조물에서 유지됨을 확인하였다.
실시예 17. PPi , PPase 및 사이브로그린 형광물질이 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물에 대한 보관 안정성 검토
PPi, PPase 및 사이브로그린 형광물질이 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물에 대한 보관기간 중 안정성 검토를 위하여, 실시예 16에 기재된 바대로 프리믹스 건조물을 제조하였고, 대조군으로는 상기 조성과 동일한 조성의 용액을 이용하였다. 건조 조건은 SuperCentra 기기(바이오니아사)를 이용하여 외부 온도 설정 40℃, 내부 온도 설정 36℃에서 5분간 예열한 후 50분간 건조하였다. 상기와 같이 제조된 프리믹스를 50℃ 반응기에서 보관하면서 보관 후 0일부터 9일까지 매 1일 간격으로 프리믹스 건조물이 담긴 8-웰 스트립을 채취하였고, 채취된 스트립은 실시간 PCR 반응 전까지 냉동고에 보관하거나 채취 당일 대조군 검체와 동일한 조건에서 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 주형 DNA로는 실시예 16에 사용한 것과 동일한 것을 사용하였으며, 실험조건은 실시예 16에 기재된 바대로 수행하였다. PCR 반응 및 결과분석은 상기 실시예 16에서와 동일하게 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 건조 조성물은 50℃ 방치 후 7일 경과 시까지 최초 프리믹스 건조물의 반응성과 유사한 결과를 보였으며, 50℃ 방치 후 9일째에 초기 건조물과 형광값과 비교할 때 형광값이 약간 감소하나 반응성에 영향을 줄 정도가 아님을 확인하였다(도 30a 내지 도30f). 이 50℃ 가속실험 결과를 -20℃ 보관조건으로 환산하면 1152일(3.1년)까지 프리믹스 건조물은 대조군과 유사한 반응성이 유지됨을 유추할 수 있다(참고문헌: 이상용 저, 신뢰성공학, 1999년, 형설출판사).
실시예 18. 사이브로그린 형광염료 및 PPi 와 PPase 가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물과 동일 용도의 종래 제품과의 PCR 반응성 검토
사이브로그린 형광염료 및 PPi와 PPase가 포함된 본 발명의 핫스타트 프리믹스 건조물과 동일 용도의 종래 제품과의 PCR 반응성을 비교하기 위하여, Takara SYBR Premix Ex Taq™(Takara, Cat#:RR041), ABI SYBR® Green PCR Master Mix (ABI, Cat#:4309155) 및 Invitrogen SYBR® GreenER™ qPCR SuperMix Universal (Invitrogen, Cat#:11762-100)을 선택하여 동일 샘플에 대해 비교실험을 수행하였다. 사이브로그린 형광염료 및 PPi와 PPase가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물을 제조하기 위한 건조 조건은 실시예 16에 기재된 조건과 동일한 조건에서 시행되었다.
실시간 PCR 수행에 사용한 프라이머, 프로브 및 표준 주형 DNA 샘플과 실시간 PCR 증폭을 위한 실험 조건은 실시예 16에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하였다. 3개 회사 제품의 경우 동일한 프라이머 및 표준 주형 DNA 샘플을 사용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건과 마스터믹스 제조 조건은 각 회사에서 제시한 조건에 맞춰 진행하였다.
실시간 PCR 증폭을 위해 사용한 기기는 어플라이드 바이오시스템 사의 7500 Fast 실시간 PCR 장비를 사용하였으며, 작동 프로그램 및 분석 프로그램은 기기 제조사에서 정한 방법에 따라 시행하였다. PCR 증폭 반응 종료 후 반응 산물에 대한 결과는 어플라이드 바이오시스템 사의 7500 Fast 실시간 PCR 장비에서 작동하는 분석 프로그램을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 사이브로그린 형광염료 및 PPi/PPase가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물과 3개 회사 제품 모두 유사한 PCR efficiency와 증폭커브를 보였다(도 31).
실시예 19. PPi 와 PPase 가 포함되고 프라이머 쌍 과 형광염료가 표지된 프로브를 포함하여 제조된 핫스타트 프리믹스 건조물에 대한 PCR 반응성 검토
PPi와 PPase(바이오니아 사)가 포함되고 검출 표적에 특이적인 프라이머 쌍과 형광염료가 표지된 프로브를 포함하여 제조된 핫스타트 프리믹스 건조물에 대한 PCR 반응성 검토를 위하여, 웰 당 10 mM Tris-HCl pH 9.2, 60 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 250 μM인 4종류의 dNTPs, 1U wTfi DNA 중합효소, 0.01% Tween 20, 2.0 mM PPi, 37 mU PPase, 1.2 ug 소 혈청 알부민, 및 안정화제로 메틸알파 디 글루코피라노사이드 (Methyl-α-D-Gluco-Pyranoside)를 포함하며 검출 표적에 특이적인 10 pmole 농도의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 최종 반응부피 20 ㎕당 1 ㎕씩 첨가하였고 형광염료가 표지된 프로브 10 pmole 용액을 최종 반응부피 20 ㎕당 1 ㎕ 첨가시킨 프리믹스 건조물을 제조하였고, 대조군으로는 상기 조성에서 프라이머 쌍과 프로브 용액이 첨가되지 않은 조성으로 프리믹스 건조물을 제조하였다. 건조조건은 SuperCentra 기기((주)바이오니아사)를 이용하여 외부 온도 설정 40℃, 내부 온도 설정 36℃에서 25분간 건조하였다. 상기와 같이 제조된 프리믹스 건조물은 대조군 프리믹스 건조물과 동일한 조건에서 실시간 PCR 반응을 수행하였다.
실시간 PCR 수행에 사용한 프라이머, 프로브 및 표준 주형 DNA 샘플은 실시예 11에 사용한 서열과 동일하다. 주형 DNA로는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus)의 표면 항원 유전자(large surface gene)를 포함하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 사용하였고 카피수가 1 x 100~ 1 x 106 카피/㎕ 범위의 주형 DNA 샘플을 웰 당 5 ㎕씩 첨가하였다. 대조군으로 제조된 프라이머 쌍과 프로브 용액이 첨가되지 않은 핫스타트 프리믹스 건조물의 경우, 반응용액에 10 pmole 농도의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 각각 최종 반응부피 20 ㎕당 1 ㎕씩 첨가하였고 형광염료가 표지된 프로브 10 pmole 용액을 최종 반응부피 20 ㎕당 1 ㎕ 첨가하고 DEPC 처리된 증류수 12 ㎕ 첨가하여 웰당 최종 반응부피는 20 ㎕로 맞추어 사용하였다. 건조단계부터 동일 농도, 동일 서열의 프라이머 쌍과 프로브가 이미 첨가되어 건조된 핫스타트 프리믹스 건조물의 경우 단지 DEPC 처리된 증류수를 15 ㎕ 첨가하여 웰당 최종 반응부피는 20 ㎕로 맞추어 사용하였다. 나머지 실시간 PCR 증폭을 위한 실험 조건은 실시예 10에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하였다.
실시간 PCR 증폭을 위해 사용한 기기는 어플라이드 바이오시스템사의 7500 패스트(Fast) 장비를 사용하였으며 작동 프로그램 및 분석 프로그램은 기기 제조사에서 정한 방법에 따라 시행하였다. 실시간 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 다음과 같다. 95℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 95℃에서 20초 동안 변성 단계 및 55℃에서 40초 동안 어닐링/신장 단계 및 형광 값 검출 단계를 1 반응 주기로 하여 총 45회 반응 주기로 수행 하였다. PCR 증폭 반응 종료 후 반응 산물에 대한 결과는 어플라이드 바이오시스템사의 7500 패스트 (Fast) 장비에서 작동하는 분석 프로그램을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 검출 표적에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브가 포함되어 제조된 핫스타트 프리믹스 건조물에서도 대조군인 PPi와 PPase가 포함되고 검출 표적에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브가 포함되지 않고 제조된 핫스타트 프리믹스 건조물의 반응성과 유사한 결과를 얻었다(도 32a 및 도 32b). 이러한 결과는 건조단계에 검출 표적에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 포함시켜 핫스타트 프리믹스 건조물을 제조하여도 PCR 반응성에 큰 영향을 주지 않음을 확인했고 각종 질병에 대한 특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 포함시켜 제조할 경우 효과적인 진단키트로서의 응용이 가능하다는 것을 보여준다.
도 1은 PCR 반응을 억제시키는 PPi 농도를 측정한 결과를 보여주는 아가로스 젤 전기영동 사진이다. 레인 1 내지 레인 16은 각각 0.30 mM, 0.35 mM, 0.45 mM, 0.50 mM, 0.60 mM, 0.65 mM, 0.75 mM, 0.80 mM, 0.90 mM, 0.95 mM, 1.30 mM, 1.50 mM, 1.80 mM, 2.00 mM, 2.50 mM 및 3.00 mM의 PPi를 첨가한 경우를 나타내며, M은 100 bp DNA 크기 마커((주)바이오니아사)를 나타낸다.
도 2는 높은 PPi 농도에서 PCR 반응을 회복시키는 PPase 활성을 측정한 결과를 보여주는 아가로스 젤 전기영동 사진이다. 레인 1 내지 레인 16은 Taq DNA 중합효소를 이용한 반응 결과로서, 레인 1과 레인 2는 PPi 및 PPase를 처리하지 않은 음성대조군이고, 레인 3과 레인 4는 1.0 mM PPi만을 처리한 조건이며, 레인 5 내지 레인 16은 공통적으로 1.0 mM PPi를 처리한 조건에 PPase를 순차적으로 각각 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.3, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 mU 처리한 조건에 대한 PCR　반응 결과이다. 또한, 레인 17 내지 레인 32는 Pfu DNA 중합효소를 이용한 반응 결과로서, 레인 17과 레인 18은 PPi 및 PPase를 처리하지 않은 음성대조군이고, 레인 19와 레인 20은 1.0 mM PPi만을 처리한 조건이며, 레인 21 내지 레인 32는 공통적으로 1.0 mM PPi를 처리한 조건에 PPase를 순차적으로 각각 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.3, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 mU 처리한 조건에 대한 PCR　반응 결과이다. M은 100 bp DNA 크기 마커이다.
도 3은 낮은 PPi 농도에서 PCR 반응을 회복시키는 PPase 활성을 측정한 결과를 보여주는 아가로스 젤 전기영동 사진이다. 레인1 및 레인 2는 PPase를 처리하 지 않은 음성대조군이고, 레인 3 내지 레인 5는 순차적으로 0.15, 0.2 및 0.25 mM의 PPi만을 처리한 조건이며, 레인 6 내지 레인 10은 PPi를 0.25 mM로 처리한 후 PPase를 순차적으로 300, 200, 100, 50 및 10 mU 처리한 조건에 대한 PCR　반응 결과이다. M은 100 bp DNA 크기 마커이다.
도 4는 PPi와 PPase를 포함하는 PCR 프리믹스(premix) 건조물에 대해 25℃에서 2시간 동안 사전반응 후 멀티플렉스(multiplex) PCR 반응시킨 결과를 보여주는 아가로스 젤 전기영동 사진이다. 레인 1과 레인 2는 AccuPower ® Hotstart PCR PreMix(바이오니아사)에 대한 PCR 반응 결과이고 레인 3과 레인 4는 AccuPower ® PCR PreMix 제품(바이오니아사)에 대한 PCR 반응 결과이며, 레인 5와 레인 6은 PCR 프리믹스 1에 프라이머를 첨가한 조건에 대한 반응 결과이고, 레인 7과 레인 8은 PCR 프리믹스 2에 대한 반응 결과이며, 레인 9와 레인 10은 PCR 프리믹스 3에 프라이머를 첨가한 조건에 대한 반응 결과이고, 레인 11과 레인 12는 프리믹스 4에 대한 반응 결과이다. 또한, 레인 13과 레인 14는 AccuPower ® HL PCR PreMix 제품(바이오니아사)에 대한 반응 결과이고, 레인 15와 레인 16은 PCR 프리믹스 5에 프라이머를 첨가한 조건에 대한 반응 결과이며, 레인 17과 레인 18은 프리믹스 6에 대한 PCR 반응 결과이며, 레인 19와 레인 20은 프리믹스 7에 프라이머를 첨가한 조건에 대한 반응 결과이고, 레인 21과 레인 22는 프리믹스 8 조건에 대한 PCR 반응 결과이다. M은 100 bp DNA 크기 마커를 나타낸다.
도 5는 PPi와 PPase가 포함된 PCR 프리믹스 건조물에 대해 37℃에서 2시간 동안 사전반응 후 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 보여주는 아가로스 젤 전기영동 사진이다. 레인 1과 레인 2는 AccuPower ® HL PCR PreMix 바이오니아사)에 대한 PCR 반응 결과이고, 레인 3과 레인 4는 AccuPower ® HL PCR PreMix 제품에 2.0 mM PPi와 80 mU PPase를 첨가하여 제조한 프리믹스의 PCR 반응 결과이다. M은 100 bp DNA 크기 마커를 나타낸다.
도 6a는 PPi, PPase, Taq. DNA 중합효소(polymerase) 및 Pfu DNA 중합효소를 포함하는 프리믹스 건조물에 대하여, 50℃ 반응 온도에서 시간대별로 안정성을 조사한 결과를 보여주는 아가로스 젤 전기영동 사진이다. 레인 1, 레인 3, 레인 5, 레인 7 및 레인 9는 본 발명의 조성물에 대해 순차적으로 50℃ 반응기에서 0일, 1일, 2일, 3일 및 4일동안 방치한 시료에 대한 PCR 반응 결과이고, 레인 2, 레인 4, 레인 6, 레인 8 및 레인 10은 AccuPower ® HL PCR PreMix에 대해 순차적으로 50℃ 반응기에서 0일, 1일, 2일, 3일 및 4일동안 방치한 시료에 대한 PCR 반응 결과이다.
도 6b는 핫스타트 마스터믹스 용액의 안정성을, 도 6c는 본 발명의 건조 조성물의 안정성을 테스트한 것이다. 레인 1은 139 bp, 레인 2는 211 bp, 레인 3은 447 bp, 레인 4는 618 bp, 레인 5는 1082 bp, 레인 6은 1296 bp, 레인 7은 1561 bp, 레인 M은 100 bp DNA 크기 마커를 나타낸다.
도 7은 PPi, PPase 및 Taq DNA 중합효소를 포함하는 프리믹스 건조물과 Taq DNA 중합효소만을 포함하는 프리믹스 건조물에 대하여, 람다(lambda) DNA에 대한 Long kb PCR 반응 결과를 보여주는 아가로스 젤 전기영동 사진이다. 레인 1 내지 레인 8은 Taq DNA 중합효소가 포함된 프리믹스에 대한 Long kb PCR 반응 결과이고, 레인 9 내지 레인 16은 2.0 mM PPi와 80 mU PPase 및 Taq DNA 중합효소가 포함된 프리믹스에 대한 Long kb PCR 반응 결과이다. 레인 1과 레인 9, 레인 2와 레인 10, 레인 3과 레인 11, 레인 4와 레인 12, 레인 5와 레인 13, 레인 6과 레인 14, 레인 7과 레인 15, 레인 8과 레인 16은 각각 500 bp, 1.0 kbp, 2.0 kbp, 5.0 kbp, 8.0 kbp, 10.0 kbp, 12.0 kbp, 15.0 kbp 증폭산물에 대한 PCR 반응 결과를 나타내며, M1은 1kb DNA 크기 마커이다.
도 8은 PPi, PPase 및 Pfu DNA 중합효소를 포함하는 프리믹스 건조물과 Pfu DNA 중합효소만을 포함하는 프리믹스 건조물에 대하여, 람다 DNA에 대한 Long kb PCR 반응 결과를 보여주는 아가로스 젤 전기영동 사진이다. 레인 1 내지 레인 10은 Pfu DNA 중합효소가 포함된 프리믹스에 대한 Long kb PCR 반응 결과이고, 레인 11에서 레인 20은 2.0 mM PPi와 80 mU PPase 및 Pfu DNA 중합효소가 포함된 프리믹스에 대한 Long kb PCR 반응 결과이다. 레인 1과 레인 11, 레인 2와 레인 12, 레인 3과 레인 13, 레인 4와 레인 14, 레인 5와 레인 15, 레인 6과 레인 16, 레인 7과 레인 17, 레인 8과 레인 18, 레인 9와 레인 19, 레인 10과 레인 20은 각각 500 bp, 1.0 kbp, 2.0 kbp, 5.0 kbp, 8.0 kbp, 10.0 kbp, 12.0 kbp, 15.0 kbp, 20.0 kbp, 30.0 kbp 증폭산물에 대한 PCR 반응 결과를 나타내며, M1은 1kb DNA 크기 마커이고, M2는 람다/Hind Ⅲ 크기 마커이다.
도 9는 PPi, PPase, Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소를 포함하는 프리 믹스 건조물과 Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소만을 포함하는 프리믹스 건조물에 대하여, 람다 DNA에 대한 Long kb PCR 반응 결과를 보여주는 아가로스 젤 전기영동 사진이다. 레인 1 내지 레인 10은 Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소가 포함된 프리믹스에 대한 Long kb PCR 반응 결과이고, 레인 11 내지 레인 20은 2.0 mM PPi와 80 mU PPase 및 Taq DNA 중합효소와 Pfu DNA 중합효소가 포함된 프리믹스에 대한 Long kb PCR 반응 결과이다. 각각의 레인 및 크기 마커에 대한 설명은 상기 도 8의 경우와 동일하다.
도 10은 Taq DNA 중합효소가 포함된 PCR Premix 용액에 형광물질(Greenstar TM)과 PPi 및 PPase를 첨가한 경우와, Taq DNA 중합효소가 포함된 PCR Premix 용액에 형광물질만을 첨가한 경우에 대하여, 실시간(real time) PCR 반응을 통한 형광측정 곡선 결과를 보여주는 그래프로서, 횡축은 반응 주기에 대한 표식이고 종축은 반응 주기에 따른 측정 형광값에 대한 표식이며, 푸른색 선 1은 실험군에 대한 형광검출 곡선 결과이고, 붉은색 선 2는 대조군에 대한 형광검출 곡선 결과이다.
도 11은 Taq DNA 중합효소가 포함된 PCR Premix 용액에 형광물질(Greenstar TM)과 PPi 및 PPase를 첨가한 경우와, Taq DNA 중합효소가 포함된 PCR Premix 용액에 형광물질만을 첨가한 경우에 대하여, 실시간 PCR 반응을 통한 형광측정 곡선을 이용하여 멜팅 커브(melting curve)를 작성한 결과를 보여주는 그래프로서, 횡축은 온도변화에 대한 표식이고 종축은 온도 증가에 따른 측정 형광값에 대한 표식이며, 붉은색 선 1은 실험군의 멜팅 커브 작성 결과이고, 연두색 선 2는 대조군에 대한 멜팅 커브 작성 결과이다.
도 12는 Taq DNA 중합효소가 포함된 PCR Premix 용액에 형광물질(Greenstar TM)만을 첨가한 경우에 대한 실시간 정량(quantitative) PCR 반응 결과를 보여주는 그래프로서, 도식에서의 횡축은 반응 주기에 대한 표식(Cycle, 이하 "Cy.")이고 종축은 반응 주기에 따른 측정 형광값에 대한 표식이며, 첫 번째 그래프에서 여섯 번째 그래프까지 순차적으로 람다 DNA 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg 및 100 fg에 대한 실시간 정량 PCR의 형광측정 결과이다.
도 13은 도 12에서 확인된 순차희석 조건별 형광곡선들을 이용하여 작성된 정량곡선에 있어서의 선형도(linearity)를 보여주는 그래프로서, 도식에서의 횡축은 측정된 형광값에 대한 로그(Log) 치환수치이고 종축은 반응 주기에 대한 표식으로 우측 상단에서 좌측 하단까지 순차적으로 람다 DNA 100 fg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng 및 10 ng에 대하여 작성된 정량곡선 결과이며, 정량곡선 결과에 따른 PCR 증폭효율은 98%, PCR 선형도는 0.9977로 확인되었다.
도 14는 도 12의 형광측정 결과 그래프를 이용하여 멜팅 커브를 작성한 결과를 보여주는 그래프로서, 횡축은 온도변화에 대한 표식이고 종축은 온도 증가에 따른 측정 형광값에 대한 표식이다.
도 15는 Taq DNA 중합효소가 포함된 PCR Premix 용액에 형광물질(Greenstar TM)과 0.5 mM PPi 및 0.3 mU PPase가 포함된 경우에 대한 실시간 정량 PCR 반응 결과를 보여주는 그래프로서, 도식에서의 횡축과 종축은 도 12에서와 동일한 의미이다.
도 16은 도 15에서 확인된 순차희석 조건별의 형광곡선들을 이용하여 작성된 정량곡선에 있어서의 선형도를 보여주는 그래프로서, 도식에서의 횡축과 종축은 도 13에서와 경우와 동일한 의미이며, 정량곡선 결과에 따른 PCR 증폭효율은 104%로 확인되었고, PCR 선형도는 0.9989로 확인되었다.
도 17은 도 15의 형광측정 결과 그래프를 이용하여 멜팅 커브를 작성한 결과를 보여주는 그래프로서, 횡축은 온도변화에 대한 표식이고 종축은 온도 증가에 따른 측정 형광값에 대한 표식이다.
도 18은 Taq DNA 중합효소가 포함된 PCR Premix 용액에 형광물질(Greenstar TM)과 2.0 mM PPi 및 80 mU PPase가 포함된 조건에 대한 실시간 정량 PCR 반응 결과를 보여주는 그래프로서, 도식에서의 횡축과 종축은 도 12에서와 동일한 의미이다.
도 19는 도 18에서 확인된 순차희석 조건별의 형광곡선들을 이용하여 작성된 정량곡선에 있어서의 선형도를 보여주는 그래프로서, 도식에서의 횡축과 종축은 도 13에서와 경우와 동일한 의미이며, 정량곡선 결과에 따른 PCR 증폭효율은 100%, PCR 선형도는 0.9999로 확인되었다.
도 20은 도 18의 형광측정 결과 그래프를 이용하여 멜팅 커브를 작성한 결과를 보여주는 그래프로서, 횡축은 온도변화에 대한 표식이고 종축은 온도 증가에 따 른 측정 형광값에 대한 표식이다.
도 21은 도 14와 도 20의 멜팅 커브를 중첩시켜 비교한 그래프이다.
도 22는 PPi, PPase, Top DNA 중합효소 포함 프리믹스 및 Top DNA 중합효소만을 포함하는 프리믹스 건조물에 대하여, Human DNA에 대한 Long kb PCR 반응 결과를 보여주는 아가로스 젤 전기영동 사진으로서, 레인 1 내지 레인 7은 PPi, PPase, Top DNA 중합효소가 포함된 프리믹스에 대한 Long kb PCR 반응 결과이고, 레인 8 내지 레인 16은 Top DNA 중합효소가 포함된 프리믹스에 대한 Long kb PCR 반응 결과이다.
도 23a 내지 도 23g는 본 발명의 프리믹스 건조물을 50℃에서 보관하면서 9일 경과 시까지 매 1-2 일마다 채취한 샘플에 대해서 실시간 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 그래프로서, 대조군으로는 프리믹스 건조물 제조에 사용한 것과 동일한 조성의 용액을 매 실험 직전에 제조한 후 곧바로 사용하였다.
도 24a 내지 도 24i는 본 발명의 프리믹스 건조물을 냉장(4℃) 또는 냉동 (-20℃) 보관하면서 7주 경과시까지 매주 마다 채취한 샘플에 대해 실시간 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 그래프로서, 대조군으로는 프리믹스 건조물 제조에 사용한 것과 동일한 조성의 용액을 사용하였다.
도 25a는 PPi/PPase가 포함된 본 발명의 핫스타트 프리믹스 건조물과 3군 개 회사 제품을 이용하여 동일한 프로브, 프라이머, 표준 DNA 주형 샘플에 대해 실험한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 25b는 PPi/PPase가 포함된 본 발명의 핫스타트 프리믹스 건조물과 3개 회사 제품의 형광값을 동일한 scale의 Y 값으로 나타낸 그 래프이며, 각 제품간의 형광값의 차이를 보여주는 그래프이다.
도 26a는 PPi와 PPase가 포함되고 안정화제가 포함되지 않은 프리믹스 건조물을 실시간 PCR 증폭조건에서 실험한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 26b는 PPi와 PPase가 포함되고 안정화제가 포함된 프리믹스 건조물을 동일한 조건에서 실험한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 27a는 바이오니아사의 엑시사이클러 버전 3 실시간 PCR 장비를 사용하여 실험한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 27b는 어플라이드 바이오시스템사의 7500 패스트 장비를 사용하여 실험한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 27c는 어플라이드 바이오시스템사의 7500 장비를 사용하여 실험한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 27d는 어플라이드 바이오시스템사의 Step-One 장비를 사용하여 실험한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 27e는 엠제이리서치사의 디엔에이엔진 옵티콘 장비를 사용하여 실험한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 28a는 웨스트 나일 바이러스의 E 유전자를 포함하는 DNA 주형을 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 28b는 바리셀라 조스터 바이러스의 ORF 유전자를 포함하는 DNA 주형을 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 28c는 B형 간염 바이러스의 표면항원 유전자를 포함하는 DNA 주형을 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 29a는 핫스타트 프리믹스 건조물을 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 29b는 대조군으로는 프리믹스 건조물 제조에 사용 한 것과 동일한 조성의 마스터믹스 용액을 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 30a 내지 도30f는 프리믹스 건조물을 50℃ 보관하면서 9일 경과 시까지 매 1-2일마다 채취한 샘플에 대해서 실시간 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 그래프로서, 대조군으로는 프리믹스 건조물 제조에 사용한 것과 동일한 조성의 용액을 사용하였다.
도 31은 사이브로그린 형광염료 및 PPi/PPase가 포함된 핫스타트 프리믹스 건조물과 3개 회사 제품을 이용하여 동일한 프라이머 및 표준 DNA 주형 샘플에 대해 실험한 결과를 보여주는 그래프이며 증폭커브의 양상을 보여주는 그래프이다.
도 32a는 PPi와 PPase가 포함되고 검출 표적에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브가 포함되지 않고 제조된 프리믹스 건조물을 실시간 PCR 증폭조건에서 동일하게 실험한 결과를 보여주는 증폭커브 그래프와 표준선이며 도 32b는 동일한 조성의 PPi와 PPase가 포함되고 검출 표적에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브가 포함되어 제조된 프리믹스 건조물를 동일한 조건에서 실험한 결과를 보여주는 증폭커브 그래프와 표준선이다.
<110> BIONEER Corporation <120> Composition for Hotstart PCR <130> 2006-dpa-0119 <160> 35 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L137_F primer <400> 1 aagaatccgc ataccaggaa 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L137_R primer <400> 2 cagcagcatt ttggaataac c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 primer <400> 3 gccccagctg ctcaccatcg cta 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p55 primer <400> 4 ctcttcctac agtactcccc tgc 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p63 primer <400> 5 ggccactgac aaccaccctt aacc 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L303050-F primer <400> 6 cctgctctgc cgcttcacgc 20 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0.5-R primer <400> 7 tccggataaa aacgtcgatg acatttgc 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1.0-R primer <400> 8 gatgacgcat cctcacgata atatccgc 28 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2.0-R primer <400> 9 ccatgattca gtgtgcccgt ctgg 24 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5.0-R primer <400> 10 cgaacgtcgc gcagagaaac agg 23 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10.0-R primer <400> 11 gcacagaagc tattatgcgt ccccagg 27 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12.0-R primer <400> 12 tcttcctcgt gcatcgagct attcgg 26 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15.0-R primer <400> 13 cttgttcctt tgccgcgaga atgg 24 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20.0-F primer <400> 14 gcctttgcct cgctatacat ttctaaatcg ccttg 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20.0-R primer <400> 15 gatgatcaac tggctttcca aactcgtatt cgtca 35 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30.0-F primer <400> 16 tgctgaacac accagtgtaa gggatgttta tgacg 35 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30.0-R primer <400> 17 agcaattcag atctctcacc taccaaacaa tgccc 35 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L90_F primer <400> 18 ggctgattga ccggcagatt a 21 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L90_R primer <400> 19 gcgggtatag gttttattga tggc 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p65 primer <400> 20 gattgctctt aggtctggcc cctc 24 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p83 primer <400> 21 gtcctgcttg cttacctcgc ttagt 25 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p75 primer <400> 22 gtgttatctc ctaggttggc tctg 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p73 primer <400> 23 caagtggctc ctgacctgga gtc 23 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p85 primer <400> 24 acctgatttc cttactgcct ctggc 25 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for detection of VZV virus DNA <400> 25 tggatgtggt gttcccaat 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for detection of VZV virus DNA <400> 26 gttcaggcaa ccgttttga 19 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for detection of VZV virus DNA <400> 27 ctcataccga gttgcatcca acg 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for detection of HBV virus DNA <400> 28 ccaatcactc accaacctct tgt 23 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for detection of HBV virus DNA <400> 29 agcaggatga agaggaatat gataaa 26 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for detection of HBV virus DNA <400> 30 tcctggctat cgctggatgt gtctgc 26 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for detection of WNV virus DNA <400> 31 gtggaggaac agagagacgt taatg 25 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for detection of WNV virus DNA <400> 32 tccctcttgt gagcccaatg 20 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for detection of WNV virus DNA <400> 33 tgaggaacca cacgccacga agc 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L127_F primer <400> 34 gaactgatga gcgatccgaa tag 23 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L127_R primer <400> 35 ccaccactga ttagcgaatg c 21

Claims (29)

  1. 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP, DNA 중합효소, 피로포스페이트 및 피로포스파타제를 포함하며, 건조된 상태인 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    프라이머 또는 프루브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    DNA에 결합하는 형광 염료를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  4. 청구항 4에 있어서,
    상기 형광염료는 SyBr Green, EtBr 및 HRdye로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    주형 핵산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 피로포스페이트는 최종 반응액을 기준으로 0.3 내지 5 mM의 농도로 포함되고, 상기 피로포스파타제는 20 ㎕당 30 초과 200 mU 이하의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 피로포스페이트는 최종 반응액을 기준으로 0.95 내지 3.0 mM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 피로포스파타제는 20 ㎕당 50 내지 100 mU의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 DNA 중합효소는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소 및 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서,
    핵산에 대해 비반응성인 염료 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 염료 물질은 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서,
    다가 알코올, 젤라틴, 소혈청 알부민, Thesit, PEG-8000로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 멀티플렉스 PCR, 실시간 PCR 및 실시간 정량 PCR로 구성된 군으로부터 선택되는 PCR에 사용되는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  14. 한 반응튜브내에 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP, DNA 중합효소, 피로포스페이트 및 피로포스파타제로 이루어진 반응혼합물을 제공하는 단계 및 상기 반응 혼합물을 건조시켜 건조 조성물을 형성하는 단계를 포함하는 한 반응튜브내의 안정화된 핫스타트 PCR용 건조 조성물의 제조방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 반응혼합물에 하나 이상의 프라이머 또는 프루브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 청구항 14에 있어서,
    상기 반응혼합물에 DNA에 결합하는 형광 염료를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 형광염료는 SyBr Green, EtBr, HRdye 로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 청구항 14에 있어서,
    상기 반응혼합물에 주형 핵산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방 법.
  19. 청구항 14에 있어서,
    상기 피로포스페이트는 최종 반응액을 기준으로 0.3 내지 5 mM의 농도로 포함되고, 상기 피로포스파타제는 20 ㎕당 30 초과 200 mU 이하의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 피로포스페이트는 최종 반응액을 기준으로 0.95 내지 3.0 mM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  21. 청구항 19에 있어서,
    상기 피로포스파타제는 20 ㎕당 50 내지 100 mU의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  22. 청구항 14에 있어서,
    상기 DNA 중합효소는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소 및 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  23. 청구항 14에 있어서,
    상기 반응혼합물에 핵산에 대해 비반응성인 염료 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 염료 물질은 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  25. 청구항 14에 있어서,
    상기 반응혼합물에 다가알코올, 젤라틴, 소혈청 알부민, Thesit, PEG-8000로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  26. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 따른 핫스타트 PCR용 건조 조성물을 포함하는 핫스타트 PCR용 키트.
  27. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 따른 핫스타트 PCR용 건조 조성물을 이용한 핵산 증폭 방법.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 방법은 상기 핫스타트 PCR용 건조조성물에 주형 핵산을 함유한 시료를 혼합하는 단계, 상기 반응혼합물이 증폭될 수 있도록 반응을 수행하는 단계 및 상기 주형 핵산의 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
  29. 청구항 27에 있어서,
    상기 PCR은 멀티플렉스 PCR, 실시간 PCR 및 실시간 정량 PCR로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.
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