BRPI0818787B1 - composição secada para pcr de partida quente com estabilidade de longa duração, método de preparação da mesma, kit para pcr de partida quente e método para ampliar o ácido nucleico - Google Patents

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"COMPOSIÇÃO SECADA PARA PCR DE PARTIDA QUENTE COM ESTABILIDADE DE LONGA DURAÇÃO, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DA MESMA, KIT PARA PCR DE PARTIDA QUENTE E MÉTODO PARA AMPLIAR O ÁCIDO NUCLÉICO" CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma composição secada para PCR de partida quente com estabilidade de longa duração e a um uso da mesma, mais precisamente, a uma composição secada para PCR de partida quente que está estabilizada e tem capacidade de armazenagem (vida útil) de longa duração por adição de uma quantidade requerida de polióis, pirofosfato inorgânico (referido como "PPi" daqui por diante), e pirofosfatase (referida como "PPase" daqui por diante) à composição de PCR convencional.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA A especificidade da PCR é determinada pela alta severidade de um primer que se liga a uma sequência-alvo de genes. Todos os ingredientes necessários para a ampliação do gene são misturados na temperatura ambiente, antes da pré-desnaturação. Assim, durante esta mistura, ocorre a iniciação em baixa severidade. A polimerase conserva a sua atividade de enzima em uma baixa temperatura, assim, quando ocorre a iniciação, pode ser gerado um produto da PCR. Portanto, esta iniciação em baixa severidade é uma outra causa crítica da ampliação não específica, juntamente com a complexidade da sequência-alvo de DNA e a baixa temperatura de reação. A ampliação não específica consome primers e outros ingredientes limitados nas concentrações enquanto os ciclos da PCR se repetem, sugerindo que uma reação não específica propriamente dita atua como um inibidor competitivo. A ampliação não específica causa um sério problema, particularmente na detecção de um DNA-alvo com um baixo número de cópias, na ampliação de uma amostra de DNA em uma baixa concentração, e na PCR multiplex usando diferentes primers de uma vez.

Em um esforço para superar o referido problema da PCR, desenvolveu-se a "PCR de partida quente". A PCR de partida quente é um tipo de PCR para obter um produto da PCR mais puro, que permite a mistura em alta temperatura de cada reagente, de modo que a especificidade da PCR pode ser aumentada por impedimento da iniciação em baixa severidade que frequentemente ocorre na temperatura ambiente e a oligomerização de um primer não específico. O modo mais simples de realizar a PCR de partida quente é abrir o tubo de reação quente e adicionar os ingredientes necessários nele. Entretanto, este método pode expor a mistura de reação à contaminação, formar aerossol, e causar evaporação. Um outro modo de realizar a PCR de partida quente é gerar uma barreira física entre os ingredientes necessários, por exemplo, entre um primer e um molde. Como uma barreira eletrofísica, tem sido geralmente usada a cera de parafina. Precisamente, uma mistura de reação é coberta com a cera de parafina e, quando a cera estiver endurecida, os reagentes (reagentes de partida) são carregados sobre ela, à qual se adiciona óleo mineral. Então, a temperatura da máquina de PCR é elevada para 70°C - 90°C. Então, a cera é dissolvida e a mistura de reação e os reagentes de partida são misturados, resultando na PCR. Conforme explicado, a dissolução da cera e a mistura dos ingredientes ocorrem precisamente em altas temperaturas. Assim, de acordo com este método, facilita-se a iniciação em alta severidade, facilita-se também a ampliação simultânea das diferentes amostras de DNA, e garante-se a capacidade de armazenagem de longa duração da mistura de reação devida à camada de cera e óleo. Entretanto, o dito método é laborioso e demora muito (Bassan, B.J. e Caentno-Anolles, G. Bio-techniques, 14:30-34, 1993). Além disso, o óleo mineral usado como uma barreira da evaporação pode contaminar as amostras de PCR, que estão presentes como bandas não contendo DNA, tornando difícil a análise quantitativa dos dados da PCR. Portanto, para melhorar este método, foi proposto usar glóbulos de parafina sozinhos para a PCR de partida quente. Os glóbulos de parafina formam uma camada sólida até 55°C. Assim, um primer não se mistura bem com um DNA molde na temperatura ambiente e, somente quando a temperatura de reação for maior do que o ponto de fusão da parafina, um primer é misturado com um DNA molde, sugerindo que ele poderia aumentar a especificidade da PCR. A parafina existe no fundo do tubo da microcentrífuga, desse modo a coleta da amostra é fácil e custa pouco. Portanto, os glóbulos de parafina são esperados serem um candidato promissor para melhorar a PCR de partida quente (Wainwright, L.A. e Seifert, H.S., Biotechni-ques, 14:34-36, 1993).

Um outro método de PCR de partida quente é caracterizado por utilizar petrolato, tal como o AmpliGrease, em vez de cera de parafina. Este método é similar ao método acima descrito que utiliza cera e óleo. Precisamente, uma mistura de reação é separada em duas camadas, uma mistura de fundo e uma mistura de topo. O petrolato é adicionado entre as duas misturas para impedir que as duas misturas sejam misturadas na temperatura ambiente. O petrolato começa a derreter em uma temperatura mais baixa (ponto de fusão aproximado: 50°C) do que o ponto de fusão da cera e não é endurecido novamente por esfriamento, que é a diferença do método convencional que utiliza a cera (Horton, R.M., Hoppe, B.L. e Conti-Tronconi., Biotechniques, 16:42-43, 1994). Entretanto, este método tem desvantagens quando a quantidade de amostra for grande. Ou seja, quando uma amostra for usada em excesso, a mistura de fundo e a mistura de topo não se misturam bem por causa da diferença na massa específica entre as duas misturas. Assim, este método somente é efetivo na reação com um volume pequeno de amostra.

Utilizam-se outros métodos, tais como usar glóbulos de reação preparados por revestimento de uma mistura de reação secada sobre solução de trealose com cera (Kaijalai-nen, S. e col., Nucleic Acids Res., 212959-2960, 1993) ou adicionar diferentes solventes orgânicos, tais como PEG, DMSO, Glicerol, etc., usados como aceleradores da PCR, a uma mistura de reação para aumentar a eficiência da PCR de partida quente (Pomp, D. e col., Biotechniques, 10:58-59, 1991).

Conforme explicado aqui antes, têm sido efetuados estudos e tentativas para uma PCR de partida quente eficaz e reconhece-se bem a necessidade da PCR de partida quente. No entanto, a PCR de partida quente ainda está limitada no uso e não pode ser aplicada aos diversos campos de experimentos, considerando-se os aspectos econômicos e as capacidades limitadas. Infelizmente, o resultado da PCR de partida quente usando glóbulos de parafina não tem sido tão eficaz quanto o resultado da PCR convencional. A PCR de partida quente recente é somente útil com a Taq DNA polimerase (Enneth, G., Christy, J., Atwood, S. M., e Daiss, J. L 1994, Biotechnology, 12; 506-509). Ou seja, para realizar a PCR de partida quente com outras polimerases, cada anticorpo específico para uma polimerase termoestável tem de ser separadamente construído, tendo um tempo de preparação longo e altos custos.

Para superar o dito problema, desenvolveu-se a PCR de partida quente usando o PPi e a PPase termoestável (Patente coreana Ns 10-0292883 e Patente US Ns 6951744). Particularmente, este método é caracterizado quando uma reação pela polimerase, na temperatura ambiente, é suprimida pela adição de PPi que se liga fortemente aos íons de magnésio, essenciais para a polimerização do DNA, e então a PPase é reagida em alta temperatura para eliminar o PPi, a partir do que se inicia uma reação. Este método é aplicável não obstante os tipos de polimerase e tem uma vantagem de manter uma temperatura de reação constante por eliminação contínua do PPi gerado a partir do dNTP durante a reação pela polimerase. Porém, assim que a mistura principal da PCR de partida quente for preparada por este método, a pirofosfatase começa a decompor o PPi lentamente a partir do Mg2+, mesmo em uma baixa temperatura, de modo que o DNA seja ativado, resultando na diminuição do efeito da PCR de partida quente. Além disso, a PPase é muito instável. Desse modo, logo que ela é adicionada à mistura principal da PCR, ela perde a sua atividade na temperatura ambiente ou a 4°C. Dessa forma, este tipo de mistura principal de PCR não pode ser armazenado na temperatura ambiente ou a 4°C e deve ser armazenado a -20°C. Para evitar o referido problema, a PPase deve ser armazenada separadamente em um recipiente diferente e, quando ela for adicionada a uma reação, ela deve ser adicionada separadamente com o PPi, causando inconveniência, em comparação com a mistura principal da PCR convencional geralmente usada, e problemas na reprodutibilidade.

RESUMO DA INVENÇÃO É um objetivo da presente invenção, para superar os ditos problemas, proporcionar uma composição secada para a PCR de partida quente tendo reprodutibilidade, estabilidade e capacidade de armazenagem de longa duração melhoradas e, como consequência, tendo aplicabilidade melhorada em diagnóstico e testes de genes diversos, e um método para produzir a mesma.

DESCRICÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

Os presentes inventores completaram esta invenção confirmando que a composição secada para a PCR de partida quente, preparada por adição de PPi e PPase à mistura de reação da PCR que compreende tampão de reação, MgCI2, 4 tipos de dNTPs e DNA po-limerase e sua secagem, tem mais vantagens de eliminar um produto não específico, repro-dutibilidade e estabilidade aumentadas, armazenagem e capacidade de armazenagem de longa duração simples e conveniência no uso, comparada com a composição convencional para a PCR. A composição secada para a PCR de partida quente da presente invenção é preparada por secagem da mistura de reação que compreende tampão de reação, MgCI2, 4 tipos de dNTPs, DNA polimerase, PPi e PPase, em um tubo de reação. A mistura de reação pode adicionalmente compreender primers, sondas, moldes de ácidos nucléicos, e corantes fluorescentes.

Pode ser usada qualquer PPase no mercado como a PPase da presente invenção, sem limitação, a qual é preferivelmente exemplificada pela Tte-pirofosfatase inorgânica (Si-bEnzyme Ltd.) originada da E. coli, na qual é clonado o Thermus thermophilus B35 originado do gene da pirofosfatase inorgânica, e a Pto-pirofosfatase inorgânica (Bioneer Corporation, república da Coréia) originada da E. coli, na qual é clonado o Picrophilus torridus originado do gene da pirofosfatase inorgânica. 1 unidade de Pto-pirofosfase inorgânica é definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 40 nmoles de fosfato a partir de piro-fosfato, por 1 minuto. A reação é realizada usando-se Tris-HCI (pH 7,5), MgCI2 a 5 mM, e PPi a 2,0 mM, com o volume total de reação de 0,5 ml, a 70°C, por 10 minutos. O corante fluorescente neste documento é selecionado a partir do grupo que consiste em SyBr Green, EtBr e HRdye. O tampão de reação neste documento é preferivelmente o Tris-HCI a 10 mM, o KCI a 40 mM, pH 9. O teor de PPi na composição de PCR é preferivelmente 0,3 - 5,0 mM, mais preferivelmente 0,95 - 3,0 mM, e mais preferivelmente ainda 2,0 mM. Se o teor de PPi for maior do que 5,0 mM, a concentração de PPase necessita aumentar proporcionalmente. Então, o rendimento do produto da PCR será diminuído. Se o teor de PPi for menor do que 0,3 mM, a atividade de captura do Mg2+ da composição de PCR será reduzida, resultando no efeito insatisfatório de inibição sobre o produto de reação não específico produzido por iniciação não específica. O teor de PPase na composição de PCR é preferivelmente mais do que 30 a 200 mU por 20 μΙ de mistura de PCR, mais preferivelmente 50-100 mU e mais preferivelmente ainda cerca de 80 mU. Se o teor de PPase for maior do que 200 mM por 20 μΙ de mistura de reação, a confirmação do resultado somente é possível em concentração excessiva quando o DNA com número alto de cópias for usado como um molde, comparado a quando o DNA com número baixo de cópias for usado como um molde, e a reatividade for também reduzida, resultando na diminuição do produto da PCR. Se o teor de PPase for menor do que 30 mU por 20 μΙ de mistura de PCR, o produto da PCR não específico é produzido (ver a Figura 3). Os 4 tipos de dNTPs neste documento são dATP, dTTP, dGTP e dCTP. Qualquer DNA polimerase conhecida para aqueles versados na técnica pode ser usada nesta invenção, sem limitação, e particularmente a polimerase tendo a atividade de 5’->3’ exonuclease, a polimerase tendo a atividade de 3’->5' exonuclease, e a polimerase não tendo nenhuma das atividades de 5'->3' exonuclease e 3'->5' exonuclease podem ser usadas independentemente ou juntas. A polimerase tendo a atividade de 5'->3' exonuclease é exemplificada pela Taq DNA polimerase. A polimerase tendo a atividade de 3'->5' exonuclease é exemplificada pela Pfu DNA polimerase ou TLA DNA polimerase (Bioneer Corporation, república da Coréia). A polimerase não tendo nenhuma das atividades de 5'->3' exonuclease e 3'->5’ exonuclease é exemplificada pela Top DNA polimerase (Bioneer Corporation, república da Coréia). O teor de DNA polimerase na composição de PCR é 0,1 - 10 U (unidade), preferivelmente 0,5 - 2 U, e mais preferivelmente 1 U. As Taq, Pfu, Top e TLA DNA polimerases têm as características conforme mostradas na Tabela 1.

Tabela 1 A composição secada estabiizada para PCR da presente invenção pode adicionalmente compreender um corante e/ou polióis que não sejam reativos com o ácido nucléico para a conveniência nos experimentos, para a prevenção de contaminação por produto da PCR, para a estabilização da DNA polimerase e dos dNTPs e para o aperfeiçoamento da reatividade.

Neste documento, o "corante não reativo" é selecionado entre aqueles corantes que não afetam a reação PCR, o qual é exemplificado por corante solúvel, tal como rodamina, tamra, lax, azul bromofenol, xileno cianol, vermelho bromocresol, e vermelho cresol, entre os quais o xileno cianol é mais preferido. O teor preferível de tal corante não reativo na composição inteira é 0,0001-0,01% em peso e mais preferivelmente 0,001-0,005% em peso e mais preferivelmente ainda 0,001-0,003% em peso. Se o teor de corante não reativo for menor do que 0,0001% em peso, isto significa que o teor do corante é muito baixo para analisar o produto da PCR por eletroforese sobre gel de agarose. Ou seja, é muito difícil observar o movimento da amostra a olho nu. Se o teor do corante não reativo for maior do que 0,01% em peso, tal teor alto de um corante solúvel atuará como um inibidor da reação durante a PCR. Além disso, tal concentração alta interrompe o movimento da amostra durante a eletroforese após sedimentação para o gel de agarose.

Os polióis podem ser usados como um estabilizador adicional para a estabilização da composição secada da presente invenção, o qual pode ser um ou mais compostos selecionados a partir do grupo que consiste em glicose, glicerol, manitol, galacsitol, glucitol, e sorbitol. O teor do poliol é preferivelmente 10-500 mM e mais preferivelmente 50-300 mM. Se o teor for maior do que 500 mM, ele é dificilmente preparado como uma solução solúvel em água por causa da solubilidade de um polímero solúvel propriamente dito. Além disso, sob tal concentração alta, a mistura não é satisfatória por causa da alta viscosidade, o volume do produto secado é maior do que o necessário, e a dissolução em água destilada esterilizada e solução de gene para a PCR é difícil. Ademais, um polímero solúvel em alta concentração pode atuar como um inibidor da reação. Ao contrário, se o teor for menor do que 10 mM, a enzima-alvo e as moléculas de água da superfície não poderiam ser revestidas completamente e, com isso, poderiam não ser protegidas adequadamente. Portanto, sob tal concentração baixa, o efeito de estabilização da enzima não é esperado, a secagem não é adequadamente efetuada porque a viscosidade da solução é muito baixa, de modo que a solução se espalha no fundo inteiro do tubo, e a enzima não é completamente protegida. Nesta invenção, além dos polióis, pode ser usada a gelatina, a soro albumina bovina, o The-sit ou o PEG-8000 como um estabilizador. A secagem pode ser efetuada por um dos métodos convencionais, tais como a secagem na temperatura ambiente, a secagem em temperatura elevada (40-60°C), a liofiliza-ção e a secagem a vácuo. Qualquer processo de secagem pode ser usado, sem limitação, desde que nenhum componente da composição seja danificado. O método de secagem pode ser determinado de acordo com o tipo e a quantidade de uma enzima. Nesta inven- ção, pode ser usada a liofilização ou a secagem a vácuo usando centrifugação a vácuo. A composição da presente invenção pode ser usada sem limitação não somente para a PCR convencional, como também para quaisquer métodos de ampliação de ácidos nucléicos, tais como a PCR multiplex, a PCR em tempo real, e a PCR em tempo real quantitativa. A PPase usada nesta invenção é uma enzima termoestável que é estável mesmo em alta temperatura de pelo menos 70°C. Assim, ela é estável durante os processos inteiros de PCR. A PPase é ativada na temperatura onde a Taq DNA polimerase for reagida. Assim, o Mg2+ isolado pela PPase pode ser adequadamente usado para a PCR pela ação da Taq DNA polimerase, o que resulta na inibição da produção de um produto de PCR não específico. Ou seja, somente o produto-alvo pode ser produzido. Portanto, a composição secada estabilizada para a PCR de partida quente da presente invenção, que compreende PPi e PPase, poderia superar os problemas da solução de mistura principal convencional para a PCR de partida quente e não somente tem estabilidade melhorada, porém também tem capacidade de ampliar o alvo seletivamente, indicando que uma ampliação exata pode ser obtida. A composição secada estabilizada para a PCR de partida quente da presente invenção tem as seguintes vantagens, comparada com as composições de PCR convencionais: 1) Cada componente da mistura de reação da PCR neste documento é misturado conjuntamente e esta mistura é secada antes do uso. Assim, o processo de mistura não é necessário durante a PCR, o que é vantajoso na prevenção de um erro por mistura. As outras vantagens são a prevenção da ineficácia da partida quente pela PPase, a inibição de um produto de PCR não específico, a conveniência nos experimentos, a prevenção de contaminação pelo produto da PCR, a estabilização da DNA polimerase e dos dNTPs, e o aperfeiçoamento da reatividade. 2) Um corante não reativo ou um estabilizador adicional é adicionado ao ácido nu-cléico, resultando no aperfeiçoamento da usabilidade e da estabilidade, bem como tendo uma capacidade de armazenagem de longa duração. 3) A composição pode ser aplicada aos processos de PCR gerais e não necessita de um pré-tratamento de longo tempo em altas temperaturas. 4) A composição secada para a PCR de partida quente da presente invenção é mais econômica do que a composição de PCR convencional. 5) Ela é capaz de prevenir a geração de produto da PCR por iniciação em baixa severidade, de modo que ela pode ser efetivamente usada para a PCR multiplex usando a-mostras diversas simultaneamente. A presente invenção também proporciona um método de preparação da composi- ção secada para a PCR de partida quente. O método de preparação da presente invenção inclui as etapas de preparar uma mistura de reação por mistura de um tampão de reação, MgCI2, 4 tipos de dNTPs, DNA po-limerase, pirofosfato e pirofosfatase; e secar a mistura de reação. O teor do pirofosfato na mistura de reação final é 0,3-5 mM, e mais preferivelmente 0,95-3,0 mM. O teor da pirofosfatase é 30-200 mU/20 μΙ e mais preferivelmente 50-100 mil. A DNA polimerase é uma ou mais enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste na polimerase tendo a atividade de 5'->3' exonuclease, na polimerase tendo a atividade de 3'->5' exonuclease, e na polimerase não tendo nenhuma das atividades de 5'->3' exonuclease e 3'->5' exonuclease. A mistura de reação pode adicionalmente compreender um ou mais componentes selecionados a partir do grupo que consiste em primers ou sondas, um corante fluorescente que se liga ao DNA, ácido nucléico de molde, um corante não reativo com o ácido nucléico, poliol, gelatina, soro albumina bovina, Thesit e PEG-8000. O corante fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em SyBr Green, EtBr e HRdye. O corante é selecionado a partir do grupo que consiste em rodamina, tamra, lax, azul bromofenol, xileno cianol, vermelho bromocresol, e vermelho cresol. A presente invenção também proporciona um kit para a PCR de partida quente composto da dita composição secada para PCR de partida quente. O kit pode ser preparado pelo método de construção convencional para o kit de PCR. A presente invenção também proporciona um método para ampliar o ácido nucléico usando a dita composição secada para a PCR de partida quente. O método compreende as seguintes etapas: misturar uma amostra compreendendo ácido nucléico de molde e a composição secada para a PCR de partida quente; induzir uma reação para ampliar a mistura de reação; e analisar o produto ampliado do ácido nucléico de molde. Neste momento, a PCR é realizada por PCR multiplex, PCR em tempo real ou PCR em tempo real quantitativa.

EFEITO VANTAJOSO

Conforme explicado aqui antes, a composição secada para PCR de partida quente da presente invenção tem estabilidade melhorada na temperatura ambiente e capacidade de armazenagem de longa duração, comparada com as composições convencionais, de modo que ela é armazenada na temperatura ambiente durante um longo período e tem reproduti-bilidade. Além disso, a composição inclui cada componente necessário, de modo que ela pode ser efetivamente usada não somente para a PCR multiplex, como também para a PCR em tempo real quantitativa.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A aplicação das modalidades preferidas da presente invenção é mais bem entendi- da com referência aos desenhos que acompanham, onde: a Figura 1 é uma fotografia ilustrando o resultado da eletroforese em gel de agaro-se, em que se apresenta a concentração de PPi que pode inibir a reação PCR. Caminho 1 -caminho 16 apresentam os resultados sobre diferentes concentrações de PPi de, respectivamente, 0,30 mM, 0,35 mM, 0,45 mM, 0,50 mM, 0,60 mM, 0,65 mM, 0,75 mM, 0,80 mM, 0,90 mM, 0,95 mM, 1,30 mM, 1,50 mM, 1,80 mM, 2,00 mM, 2,50 mM e 3,00 mM. M indica marcador ladder de tamanho de DNA de 100 bp (Bioneer Corporation, república da Coréia). a Figura 2 é uma fotografia ilustrando o resultado da eletroforese em gel de agaro-se, em que se apresenta a atividade da PPase que recupera a reação PCR em alta concentração de PPi. Caminho 1 - caminho 16 apresentam os resultados das reações usando a Taq DNA polimerase. O caminho 1 e o caminho 2 indicam controles negativos não tratados com PPi e PPase, o caminho 3 e o caminho 4 indicam os casos somente tratados com 1,0 mM de PPi, e os caminho 5 - caminho 16 ilustram os resultados da PCR efetuada comu-mente na presença de 1,0 mM de PPi, porém com diferentes concentrações de PPase de 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, e 0,1 mU gradualmente. Os caminho 17 -caminho 32 ilustram os resultados das reações usando a Pfu DNA polimerase. O caminho 17 e o caminho 18 indicam os controles negativos não tratados com PPi e PPase, o caminho 19 e o caminho 20 indicam os casos somente tratados com 1,0 mM de PPi, e os caminhos 21 - caminho 32 ilustram os resultados da PCR efetuada comumente na presença de 1,0 mM de PPi, porém com diferentes concentrações de PPase de 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, e 0,1 mU gradualmente. M indica marcador ladder de tamanho de DNA de 100 bp. a Figura 3 é uma fotografia ilustrando o resultado da eletroforese em gel de agaro-se, em que se apresenta a atividade da PPase que recupera a reação PCR em baixa concentração de PPi. O caminho 1 e o caminho 2 indicam controles negativos não tratados com PPi e PPase. Os caminho 3 - caminho 5 indicam os resultados das reações efetuadas com 0,15, 0,2, e 0,25 mM de PPi gradualmente. Os caminho 6 - caminho 10 ilustram os resultados da PCR efetuada comumente com 0,25 mM de PPi, porém com diferentes concentrações de PPase de 300, 200, 100, 50 e 10 mU gradualmente. M indica marcador ladder de tamanho de DNA de 100 bp. a Figura 4 é uma fotografia da eletroforese em gel de agarose ilustrando o resultado da PCR multiplex induzida após uma pré-reação de 2 horas da pré-mistura de PCR secada contendo PPi e PPase, a 25°C. O caminho 1 e o caminho 2 ilustram os resultados da PCR com a Pré-Mistura de PCR de Partida Quente AccuPowet® (Bioneer Corporation, república da Coréia). O caminho 3 e o caminho 4 ilustram os resultados da PCR com a Pré-Mistura de PCR AccuPowefi (Bioneer Corporation, república da Coréia). O caminho 5 e o caminho 6 ilustram os resultados da PCR realizada após adicionar os primers à pré-mistura de PCR 1. O caminho 7 e ο caminho 8 ilustram os resultados das reações com a pré-mistura de PCR 2. O caminho 9 e o caminho 10 indicam os resultados das reações induzidas após adicionar os primers à pré-mistura de PCR 3. O caminho 11 e o caminho 12 ilustram os resultados das reações com a pré-mistura de PCR 4. O caminho 13 e o caminho 14 ilustram os resultados das reações com a Pré-Mistura de PCR AccuPower® HL (Bioneer Corporation, república da Coréia). O caminho 15 e o caminho 16 ilustram os resultados da PCR induzida após adicionar os primers à pré-mistura de PCR 5. O caminho 17 e o caminho 18 ilustram os resultados da PCR com a pré-mistura 6. O caminho 19 e o caminho 20 ilustram os resultados das reações efetuadas após adicionar os primers à pré-mistura 7. O caminho 21 e o caminho 22 ilustram os resultados da PCR com a pré-mistura 8. M indica marcador ladder de tamanho de DNA de 100 bp. a Figura 5 é uma fotografia da eletroforese em gel de agarose ilustrando o resultado da PCR multiplex induzida após uma pré-reação de 2 horas da pré-mistura de PCR secada contendo PPi e PPase, a 37°C. O caminho 1 e o caminho 2 ilustram os resultados da PCR com a Pré-Mistura de PCR AccuPowei® HL (Bioneer Corporation, república da Coréia). O caminho 3 e o caminho 4 ilustram os resultados da PCR com a pré-mistura preparada por adição de 2,0 mM de PPi e 80 mU de PPase à Pré-Mistura de PCR AccuPowet® HL. M indica marcador ladder de tamanho de DNA de 100 bp. a Figura 6 é uma fotografia ilustrando o resultado da eletroforese em gel de agarose, em que se apresenta a estabilidade no curso de tempo da pré-mistura secada compreendendo PPi, PPase, Taq DNA polimerase e Pfu DNA polimerase, na temperatura de reação de 50°C. Os caminhos 1, 3, 5, 7 e 9 ilustram os resultados da PCR com a composição da presente invenção efetuada em um reator a 50°C e deixada nele por 0, 1, 2, 3, e 4 dias. Os caminhos 2, 4, 6, 8 e 10 ilustram os resultados da PCR com a Pré-Mistura de PCR Ac-cuPowei® HL efetuada em um reator a 50°C e deixada nele por 0, 1, 2, 3, e 4 dias. a Figura 7 ilustra a estabilidade da solução de mistura principal de partida quente. A Figura 8 ilustra a estabilidade da composição secada da presente invenção. Os caminhos I, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e M indicam marcadores ladder de tamanho de DNA de 139 bp, 211 bp, 447 bp, 618 bp, 1082 bp, 1296 bp, 1561 bp, e 100 bp, respectivamente. a Figura 9 é uma fotografia da eletroforese em gel de agarose ilustrando o resultado da PCR de kb Longa usando DNA lambda com a pré-mistura secada contendo PPi, PPase e Taq DNA polimerase e a pré-mistura secada contendo Taq DNA polimerase somente. Os caminho 1 - caminho 8 ilustram os resultados da PCR de kb Longa com a pré-mistura contendo a Taq DNA polimerase. Os caminho 9 - caminho 16 ilustram os resultados da PCR de kb Longa com a pré-mistura contendo 2,0 mM de PPi e 80 mU de PPase e a Taq DNA polimerase. O caminho 1 e o caminho 9, o caminho 2 e o caminho 10, o caminho 3 e o caminho II, o caminho 4 e o caminho 12, o caminho 5 e o caminho 13, o caminho 6 e o caminho 14, o caminho 7 e ο caminho 15, o caminho 8 e o caminho 16 indicam os resultados da PCR com os produtos ampliados de, respectivamente, 500 bp, 1.0 kbp, 2,0 kbp, 5,0 kbp, 8,0 kbp, 10,0 kbp, 12,0 kbp, e 15,0 kbp. M1 indica marcador ladder de tamanho de DNA de 1 kb. a Figura 10 é uma fotografia da eletroforese em gel de agarose ilustrando o resultado da PCR de kb Longa usando DNA lambda com a pré-mistura secada contendo PPi, PPa-se e Pfu DNA polimerase e a pré-mistura secada contendo Pfu DNA polimerase somente. Os caminho 1 - caminho 10 ilustram os resultados da PCR de kb Longa com a pré-mistura contendo a Pfu DNA polimerase. Os caminho 11 - caminho 20 ilustram os resultados da PCR de kb Longa com a pré-mistura contendo 2,0 mM de PPi e 80 mU de PPase e a Pfu DNA polimerase. O caminho 1 e o caminho 11, o caminho 2 e o caminho 12, o caminho 3 e o caminho 13, o caminho 4 e o caminho 14, o caminho 5 e o caminho 15, o caminho 6 e o caminho 16, o caminho 7 e o caminho 17, o caminho 8 e o caminho 18, o caminho 9 e o caminho 19, e o caminho 10 e o caminho 20 indicam os resultados da PCR com os produtos ampliados de, respectivamente, 500 bp, 1.0 kbp, 2,0 kbp, 5,0 kbp, 8,0 kbp, 10,0 kbp, 12,0 kbp, 15,0 kbp, 20,0 kbp, e 30,0 kbp. M1 indica marcador ladder de tamanho de DNA de 1 kb e M2 indica marcador ladder lambda/Hind III. a Figura 11 é uma fotografia da eletroforese em gel de agarose ilustrando o resultado da PCR de kb Longa usando DNA lambda com a pré-mistura secada contendo PPi, PPase, Taq DNA polimerase e Pfu DNA polimerase e a pré-mistura secada contendo Taq DNA polimerase e Pfu DNA polimerase. Os caminho 1 - caminho 10 ilustram os resultados da PCR de kb Longa com a pré-mistura contendo a Taq DNA polimerase e a Pfu DNA polimerase e os caminho 11 - caminho 20 ilustram os resultados da PCR de kb Longa com a pré-mistura contendo 2,0 mM de PPi, 80 mU de PPase, a Taq DNA polimerase e a Pfu DNA polimerase. As descrições de cada caminho e do marcador ladder de tamanho são as mesmas conforme dadas na Figura 10. a Figura 12 é um gráfico apresentando a curva que ilustra a fluorescência medida por PCR em tempo real com a solução de pré-mistura contendo a Taq DNA polimerase, o PPi, a PPase, e um material fluorescente (SyBr Green), e com a solução de pré-mistura contendo a Taq DNA polimerase e um material fluorescente. Neste gráfico, o eixo horizontal apresenta um ciclo de reação e o eixo das ordenadas indica a fluorescência medida de a-cordo com o ciclo de reação. A linha azul 1 é a curva que ilustra a fluorescência detectada no grupo experimental e a linha vermelha 2 é a curva que ilustra a fluorescência detectada no grupo de controle. a Figura 13 é um gráfico apresentando a curva de fusão que utiliza a curva de fluorescência confirmada pela PCR em tempo real, a qual ilustra cada PCR com a solução de pré-mistura contendo a Taq DNA polimerase, o PPi, a PPase, e um material fluorescente (Greenstai®), e com a solução de pré-mistura contendo a Taq DNA polimerase e um materi- al fluorescente. Neste gráfico, o eixo horizontal ilustra as mudanças de temperaturas e o eixo das ordenadas ilustra a fluorescência medida de acordo com o aumento da temperatura. A linha vermelha 1 é a curva de fusão do grupo experimental e a linha verde clara 2 é a curva de fusão do grupo de controle. a Figura 14 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR em tempo real quantitativa com a solução de pré-mistura contendo a Taq DNA polimerase e um material fluorescente (Greenstai®). Neste gráfico, o eixo horizontal ilustra o ciclo de reação (referido como "Cy." daqui por diante) e o eixo das ordenadas ilustrou a fluorescência medida durante o ciclo de reação. Cada curva ilustra o resultado da medição da fluorescência por PCR em tempo real quantitativa com 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg ou 100 fg de DNA lambda. a Figura 15 é um gráfico ilustrando a linearidade da curva quantitativa feita por utilização da curva de fluorescência de acordo com as concentrações diluídas gradualmente na Figura 14. Neste gráfico, o eixo horizontal indica o Log dos números substituídos para a fluorescência medida e o eixo das ordenadas indica os ciclos de reação. As curvas indicam os resultados da análise quantitativa com diferentes concentrações de DNA lambda de 100 fg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng e 10 ng, gradualmente, a partir da parte superior da direita até a parte inferior da esquerda. De acordo com a curva quantitativa, a eficiência da PCR era 98% e a linearidade da PCR era 0,9977. a Figura 16 é um gráfico ilustrando a curva de fusão feita por utilização do gráfico de fluorescência da Figura 14. Neste gráfico, o eixo horizontal indica as mudanças de temperatura e o eixo das ordenadas indica a fluorescência medida durante o aumento da temperatura. a Figura 17 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR em tempo real quantitativa com a solução de pré-mistura contendo a Taq DNA polimerase, um material fluorescente {Greenstai®), 0,5 mM de PPi e 0,3 mil de PPase. Neste gráfico, o eixo horizontal e o eixo das ordenadas são os mesmos como descritos na Figura 14. a Figura 18 é um gráfico ilustrando a linearidade da curva quantitativa feita por utilização da curva de fluorescência de acordo com as concentrações diluídas gradualmente na Figura 17. Neste gráfico, o eixo horizontal e o eixo das ordenadas são os mesmos como descritos na Figura 15. De acordo com a curva quantitativa, a eficiência da PCR era 104% e a linearidade da PCR era 0,9989. a Figura 19 é um gráfico ilustrando a curva de fusão feita utilizando o gráfico de fluorescência da Figura 17. Neste gráfico, o eixo horizontal são as mudanças de temperatura e o eixo das ordenadas indica a fluorescência medida durante o aumento da temperatura. a Figura 20 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR em tempo real quantitativa com a solução de pré-mistura contendo a Taq DNA polimerase, um material fluorescente (Greenstai®), 2,0 mM de PPi e 80 mil de PPase. Neste gráfico, o eixo horizontal e o eixo das ordenadas são os mesmos como descritos na Figura 14. a Figura 21 é um gráfico ilustrando a linearidade da curva quantitativa feita por utilização da curva de fluorescência de acordo com as concentrações diluídas gradualmente na Figura 20. Neste gráfico, o eixo horizontal e o eixo das ordenadas indicam o mesmo como descrito na Figura 15. De acordo com a curva quantitativa, a eficiência da PCR era 100% e a linearidade da PCR era 0,9999. a Figura 22 é um gráfico ilustrando a curva de fusão feita utilizando o gráfico de fluorescência da Figura 20. Neste gráfico, o eixo horizontal indica as mudanças de temperatura e o eixo das ordenadas indica a fluorescência medida durante o aumento da temperatura. a Figura 23 é um gráfico ilustrando a comparação por sobreposição da curva de fusão da Figura 16 sobre a curva de fusão da Figura 22. a Figura 24 é uma fotografia da eletroforese em gel de agarose ilustrando o resultado da PCR de kb Longa usando DNA humano com a pré-mistura contendo PPi, PPase, e Top DNA polimerase, e com a pré-mistura contendo Top DNA polimerase somente. Os caminho 1 - caminho 7 ilustram os resultados da PCR de kb Longa usando a pré-mistura contendo o PPi, a PPase e a Top DNA polimerase, e os caminho 8 - caminho 16 ilustram os resultados da PCR de kb Longa usando a pré-mistura contendo a Top DNA polimerase. as Figura 25 - Figura 31 são gráficos ilustrando os resultados da PCR em tempo real com amostras obtidas a partir da composição de pré-mistura secada da presente invenção, armazenada a 50°C, a cada 1-2 dias, até o 95 dia a partir da preparação. Para o grupo de controle, preparou-se uma solução tendo a mesma composição que a pré-mistura secada para o grupo experimental, antes do experimento. as Figura 32 - Figura 40 são gráficos ilustrando os resultados da PCR em tempo real com amostras obtidas a partir da composição de pré-mistura secada da presente invenção, armazenada a 4°C ou a -20°C, a cada semana, até a 7~ semana a partir da preparação. Para o grupo de controle, usou-se uma solução tendo a mesma composição que a pré-mistura secada da presente invenção. a Figura 41 é um gráfico ilustrando os resultados da PCR usando molde de DNA padrão, respectivamente, com a pré-mistura secada para a PCR de partida quente da presente invenção contendo PPi/PPase e com três outras pré-misturas a partir de diferentes fabricantes na presença das mesmas sondas e primers. A Figura 42 é um gráfico ilustrando a fluorescência da pré-mistura secada para a PCR de partida quente da presente invenção contendo PPi/PPase e de três outras pré-misturas, que são apresentadas pela mesma escala Y. Neste gráfico, apresentam-se as diferenças de fluorescência entre os produtos. a Figura 43 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR em tempo real efetuada com a pré-mistura secada contendo PPi e PPase, porém não contendo um estabilizador. A Figura 44 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR em tempo real com a pré-mistura se- cada contendo PPi, PPase e um estabilizador, também sob as mesmas condições. a Figura 45 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR usando a máquina de PCR em tempo real Exicycler versão 3 (Bioneer Corporation, república da Coréia). A Figura 46 ilustra o resultado da PCR usando 7500 Fast (Applied Biosystems). A Figura 47 ilustra o resultado da PCR usando 7500 (Applied Biosystems). A Figura 48 ilustra o resultado da PCR usando Step-One (Applied Biosystems). A Figura 49 ilustra o resultado da PCR usando DNA engine opticon (MJ Research Inc.). a Figura 50 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR em tempo real usando o molde de DNA contendo o gene do vírus do Nilo Ocidental E. A Figura 51 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR em tempo real usando o molde de DNA contendo o gene do vírus da varicela-zoster ORF. A Figura 52 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR em tempo real usando o molde de DNA contendo o gene do antígeno de superfície do HBV. a Figura 53 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR em tempo real usando a pré-mistura secada para a PCR de partida quente. A Figura 54 é um gráfico ilustrando o resultado da PCR em tempo real usando a solução de mistura principal (controle) tendo a mesma composição que a pré-mistura secada. as Figura 55 - Figura 60 são gráficos ilustrando os resultados da PCR em tempo real com as amostras obtidas a partir da pré-mistura secada, armazenada a 50°C, a cada 1-2 dias, até o 92 dia a partir da preparação. Para o controle, utilizou-se uma solução tendo a mesma composição que a pré-mistura. a Figura 61 é um conjunto de gráficos ilustrando os resultados da PCR usando o molde de DNA padrão, respectivamente, com a pré-mistura secada para a PCR de partida quente contendo PPi/PPase e um material fluorescente (Greenstat®), e com três outras pré-misturas de diferentes fabricantes, na presença das mesmas sondas e primers. Nesta figura, apresentam-se as curvas de ampliação. a Figura 62 apresenta as curvas de ampliação e uma linha padrão ilustrando o resultado da PCR em tempo real com a pré-mistura secada contendo PPi e PPase, porém não contendo um grupo de primers específico para o alvo e sonda, realizada no mesmo modo como descrito acima. A Figura 63 apresenta as curvas de ampliação e uma linha padrão ilustrando o resultado da PCR em tempo real com a pré-mistura secada contendo a mesma composição de PPi e PPase e também contendo um grupo de primers específicos para o alvo e sonda também, realizada no mesmo modo como descrito acima.

EXEMPLOS

As modalidades práticas e atualmente preferidas da presente invenção são ilustrativas, conforme mostrado nos Exemplos a seguir.

Entretanto, será apreciado que aqueles versados na técnica, no exame desta divulgação, podem fazer modificações e aperfeiçoamentos dentro do espírito e do escopo da presente invenção.

Exemplo 1: Concentração de PPi para inibir a PCR

No pedido de patente anterior (Pedido de Patente Coreano N2: 10-1999-0004361), os presentes inventores investigaram a concentração de PPi capaz de inibir a reação PCR usando DNA genômico de Yersinia pestis, tendo um baixo número de cópias, como um molde. E nesta invenção, os presentes inventores tentaram determinar a concentração de PPi capaz de inibir a iniciação em baixa severidade não somente com um DNA alvo tendo um baixo número de cópias, como também com um DNA alvo tendo um alto número de cópias.

Primeiramente, utilizou-se a pré-mistura (Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, cada 250 μΜ de 4 tipos de dNTPs, 1 U de Taq DNA polimerase e um estabilizador, Bioneer Corporation, república da Coréia) contendo Taq DNA polimerase. 5,0 ng de DNA lambda foram usados como um DNA de molde. O primer L137_F, representado pela SEQ. ID. NO: 1 que gera um produto de PCR de 137 bp de comprimento, e o primer L137_R, representado pela SEQ. ID. NO: 2, foram usados, respectivamente, para a PCR por 10 pmoles por 20 μΙ de reação. O PPi foi adicionado em diferentes concentrações de 0,30, 0,35, 0,45, 0,50, 0,60, 0,65, 0,75, 0,80, 0,90, 0,95, 1,30, 1,50, 1,80, 2,0, 2,5 e 3,00 mM. A PCR foi realizada como se segue; pré-desnaturação a 94°C por 5 minutos, des-naturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 53°C por 40 segundos, ampliação a 72°C por 40 segundos, 36 ciclos a partir da desnaturação até a ampliação, e ampliação final a 72°C por 5 minutos. O resultado da PCR foi confirmado por eletroforese usando tampão de 0,5x TBE (base Trizma, Ácido Bórico e EDTA a 0,5 M, pH 8,0) contendo 2,0% de agarose.

Como resultado, não se gerou um produto ampliado a partir da PCR usando o DNA lambda tendo um alto número de cópias, quando se adicionou pelo menos 0,95 mM de PPI (ver os caminhos 10 - 16, Figura 1). O resultado acima mencionado indica que a reação PCR pode ser interrompida por certa quantidade de PPi e, neste momento, quando um DNA alvo tiver um alto número de cópias, pelo menos 0,95 mM de PPi, mais preferivelmente pelo menos 2,0 mM de PPi são requeridos para inibir a reação. À medida que diminui a concentração de PPi, diminui o efeito de inibição da reação PCR.

Exemplo 2: Atividade da PPase que recupera a reação PCR em alta concentração de PPi No documento de patente anterior (Pedido de Patente Coreano N2: 10-1999-0004361), os presentes inventores investigaram a atividade da PPase de recuperar a reação PCR usando o DNA genômico de Yersinia pestis, tendo um baixo número de cópias, como um DNA de molde. E nesta invenção, os presentes inventores tentaram determinar a concentração de PPase capaz de recuperar a reação PCR inibida pelo PPi, não somente com um DNA alvo tendo um baixo número de cópias, como também com um DNA alvo tendo um alto número de cópias.

Primeiramente, prepararam-se a pré-mistura (Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, cada 250 μΜ de 4 tipos de dNTPs, 1 U de Taq DNA polimerase e po-liol, Bioneer Corporation, república da Coréia) contendo Taq DNA polimerase e a pré-mistura (Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, cada 250 μΜ de 4 tipos de dNTPs, 1 U de Pfu DNA polimerase, 0,01% de Tween 20 e poliol, Bioneer Corporation, república da Coréia) contendo Pfu DNA polimerase. 2,5 ng de DNA lambda foram usados como um DNA de molde. O primer L137_F, representado pela SEQ. ID. NO: 1 que gera um produto de PCR de 137 bp de comprimento, e o primer L137_R, representado pela SEQ. ID. NO: 2, foram usados, respectivamente, para a PCR por 10 pmoles por 20 μΙ de reação. O PPi foi adicionado para inibir a reação PCR na concentração de 1,0 mM. Para recuperar a reação PCR inibida pelo PPi, a PPase (SibEnzyme Ltd) foi adicionada em diferentes concentrações de 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2 e 0,1 mU por 20 μΙ de reação, respectivamente. A PCR e a eletroforese foram realizadas no mesmo modo como descrito no Exemplo 1.

Como resultado, quando foram tratados 3,2 mU - 200 mU de PPase, ambas as PCRs, respectivamente, usando a Taq DNA polimerase e a Pfu DNA polimerase, foram recuperadas para gerar produtos ampliados. Em particular, quando a PPase foi tratada na concentração de 12,5 mU - 100 mU, a reatividade da PCR era quase a mesma que aquela do controle não tratado com PPi e PPase (Figura 2). Este resultado indica que a PPase pode recuperar efetivamente a reação PCR inibida pelo PPi, sugerindo que a reatividade da PCR pode ser aumentada, a qual tinha sido inibida pelo PPi para suprimir a geração de um produto da PCR não específico durante a PCR de partida quente.

Exemplo 3: Medição da atividade da PPase que recupera a reação PCR em baixa concentração de PPi Utilizou-se a pré-mistura (Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, cada 250 μΜ de 4 tipos de dNTPs, 1 U de Taq DNA polimerase e poliol) contendo Taq DNA polimerase. 2,0 ng de DNA genômico humano foram usados como um DNA de molde. O primer P65, representado pela SEQ. ID. NO: 20 que gera um produto de PCR de 1,5 kbp de comprimento, e o primer p83, representado pela SEQ. ID. NO: 21, foram usados, respectivamente, para a PCR por 10 pmoles por 20 μΙ de reação. O PPi foi adicionado para inibir a reação PCR na concentração de 0,15 - 0,25 mM. Para recuperar a reação PCR inibida por 0,25 mM de PPi, a PPase (SibEnzyme Ltd.) foi adicionada em diferentes concentrações de 300, 200, 100, 50 e 10 mU por 20 μΙ de reação, respectivamente. A PCR e a eletroforese foram realizadas no mesmo modo como descrito no Exemplo 1.

Como resultado, gerou-se um produto de reação não específico no controle negativo (caminhos 1 e 2, Figura 3). Quando 0,15 mM de PPi foi tratado, o Mg2+ não foi comple- tamente capturado, de modo que uma pequena quantidade do produto ampliado foi gerado (caminho 3, Figura 3). Quando o PPi foi tratado em quantidade igual para cada PCR, quando a concentração de PPase era mais do que 300 mU, o produto ampliado foi significativamente reduzido pela diminuição da reatividade da PCR. Nesse meio tempo, quando a PPase foi adicionada até 50 mU, o produto de reação não específico não foi inibido e o produto alvo específico não foi aumentado (caminhos 6-10, Figura 3).

Exemplo 4: PCR multiplex usando PPi e PPase Para confirmar o efeito da partida quente nos produtos ampliados, gerados nas ditas concentrações de PPi e PPase, realizou-se a PCR multiplex. Para fazer isso, 2,0 mM de PPi e 60 ml) ou 80 mU de PPase (SibEnzyme Ltd.) foram adicionados à pré-mistura (Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,01% de Tween 20 e poliol) (Pré-Mistura de PCR AccuPowei®, Bioneer Corporation, república da Coréia), que foi então secada (referida como 'pré-mistura 1' e 'pré-mistura 3' daqui por diante). E 2,0 mM de PPi, primer e 60 mU ou 80 mU de PPase (SibEnzyme Ltd.) foram adicionados à dita pré-mistura, que foi então secada (referida como 'pré-mistura 2' e 'pré-mistura 4' daqui por diante). Como um controle, utilizou-se a Pré-Mistura de PCR AccuPower® (Bioneer Corporation, república da Coréia) ou a Pré-Mistura de PCR de Partida Quente AccuPowei® (Bioneer Corporation, república da Coréia) (Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 0,01% de Tween 20 e poliol, contendo 20 n de mAb e 0,25 U de Taq DNA polimerase por 20 min de mistura de reação). 2,0 mM de PPi e 60 mU ou 80 mU de PPase (SibEnzyme Ltd.) foram adicionados à pré-mistura convencional (Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Taq DNA polimerase, 1 U de Pfu DNA polimerase, 0,01% de Tween 20 e um estabilizador) (Pré-Mistura de PCR AccuPowei® HL, Bioneer Corporation, república da Coréia), que foi então secada (referida como 'pré-mistura 5' e 'pré-mistura 7' daqui por diante). E 2,0 mM de PPi, primer e 60 mU ou 80 mU de PPase (SibEnzyme Ltd.) foram adicionados à dita pré-mistura, que foi então secada (referida como 'pré-mistura 6' e 'pré-mistura 8' daqui por diante). Como um controle, utilizou-se a Pré-Mistura de PCR Ac-cuPoweP HL (Bioneer Corporation, república da Coréia) (Tabela 2).

Neste momento, 5 ng de DNA genômico humano foram usados como um DNA de molde e o conjunto de primers compreendendo o primer p53 (SEQ. ID. NO: 3) e o primer p55 (SEQ ID. NO: 4) gerando o produto da PCR de 211 bp e o conjunto de primers compreendendo o primer p55 (SEQ. ID. NO: 4) e o primer p63 (SEQ. ID. NO: 5) gerando o produto da PCR de 447 bp foram usados na concentração de 5 pmoles por 20 μΙ de reação.

Tabela 2 Para confirmar o efeito da partida quente, a mistura de reação foi deixada a 25°C por 2 horas (Figura 4), ou a 37°C por uma hora (Figura 5). Então, a PCR foi realizada como se segue; pré-desnaturação a 94°C por 5 minutos, desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento a 62°C por 30 segundos, ampliação a 72°C por 40 segundos, 35 ciclos a partir da desnaturação até a ampliação, e ampliação final a 72°C por 5 minutos. Neste meio tempo, a PCR de controle com a Pré-Mistura de PCR de Partida Quente AccuPowei® (Bioneer Corporation, república da Coréia) foi realizada como se segue: permanência a 25°C por 2 horas, pré-desnaturação a 95°C por 15 minutos, desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento a 62°C por 30 segundos, ampliação a 72°C por 40 segundos, 35 ciclos a partir da desnaturação até a ampliação, e ampliação final a 72°C por 5 minutos. O resultado da PCR foi confirmado por eletroforese usando tampão de 0,5x TBE contendo 2,0% de agaro-se. A partir do resultado da PCR usando a Taq DNA polimerase, confirmou-se que tanto a pré-mistura secada contendo PPi, PPase e primer, quanto a pré-mistura primeiramente adicionada com PPi e PPase e então secada antes de ser adicionada com primer demonstraram alta reatividade da PCR e alta especificidade (caminhos 5-12, Figura 4), ao contrário da Pré-Mistura de PCR AccuPower® de controle que demonstrou baixa reatividade da PCR e banda pouco nítida (caminhos 3 e 4, Figura 4). A partir da comparação com a Pré-Mistura de PCR de Partida Quente AccuPowei® (Bioneer Corporation, república da Coréia) (caminhos 1 e 2, Figura 4) usando o anticorpo monoclonal contra a DNA polimerase, também se confirmou que as ditas pré-misturas exibiram reatividade da PCR e especificidade de reação altas. A partir do resultado da PCR usando a Taq DNA polimerase e a Pfu DNA polimerase, também se confirmou que a pré-mistura secada depois de ser adicionada com PPi, PPase e primer e a pré-mistura adicionada com PPi e PPase e secada antes de ser adicionada com primer demonstraram reatividade da PCR e especificidade maiores (caminhos 15-22, Figura 4, ou caminhos 3 e 4, Figura 5) do que mostrou a pré-mistura de PCR AccuPowe/® HL (caminhos 13 e 14, Figura 4). A banda pouco nítida foi significativamente reduzida com estas pré-misturas.

Portanto, a PPase usada nesta invenção foi confirmada recuperar eficientemente a reação PCR inibida pelo PPi, sugerindo que o produto da PCR não específico foi inibido, porém a reatividade da PCR foi aumentada, o que significa que ela é vantajosa para a PCR de partida quente. Em particular, um DNA alvo pôde ser especificamente ampliado, mesmo em baixa temperatura, onde um produto da PCR não específico era facilmente gerado. A inibição da ampliação não específica e o aumento da reatividade da PCR foram também confirmados em diversos outros produtos da PCR (Figura 4 e Figura 5).

Exemplo 5: Estabilidade da pré-mistura secada contendo PPi e PPase Para investigar a termoestabilidade da pré-mistura secada, 2,0 mM de PPi e 80 mU de PPase (SibEnzyme Ltd.) foram adicionados à Pré-Mistura de PCR AccuPower® HL (Bio-neer Corporation, república da Coréia), seguido por secagem para preparar a pré-mistura secada. A pré-mistura não contendo 2,0 mM de PPi e 80 mU de PPase (SibEnzyme Ltd.) foi usada para o controle. A secagem foi efetuada com 10 μΙ de 2x solução para 20 μΙ de reação no evaporador super centra, na temperatura ambiente, sob condição de vácuo, por 30 minutos. Neste momento, 5 ng de DNA genômico humano foram usados como um DNA de molde e utilizaram-se o conjunto de primers compreendendo o primer p53 representado pela SEQ. ID. NO: 3 e o primer p55 representado pela SEQ. ID. NO: 4, gerando o produto da PCR de 221 bp, e o conjunto de primers compreendendo o primer p55 representado pela SEQ. ID. NO: 4 e o primer p63 representado pela SEQ. ID. NO: 5, gerando o produto da PCR de 447 bp, na concentração de 5 pmoles por 20 μΙ de reação. A composição secada, preparada acima, foi deixada em um reator a 50°C. A amostragem foi efetuada a partir do dia 0 até o dia 4, todos os dias. As amostras obtidas foram armazenadas em um refrigerador até serem usadas para a PCR. A PCR e a eletroforese foram realizadas no mesmo modo conforme descrito no Exemplo 1, para confirmar o produto da PCR. Como resultado, a pré-mistura da presente invenção contendo 2,0 mM de PPi e 80 mU de PPase e a pré-mistura de controle demonstraram reatividade da PCR até o dia 4, desde que elas foram deixadas a 50°C (Figura 6). A estabilidade foi comparada entre a mistura principal convencional e a pré-mistura secada da presente invenção. Para fazer isto, a solução da mistura principal de partida quente foi preparada, a qual se encontrava na temperatura ambiente (25°C-30°C) por algum tempo, seguido pelo teste da estabilidade. A composição secada da presente invenção foi testada quanto à estabilidade a 50°C ao longo do tempo. A composição de 20 μΙ da pré-mistura era como se segue: Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,01% de Tween 20, um estabilizador, 2 mM de PPi e 500 U de PPase.

Após um tempo, a PCR foi realizada como se segue: um ciclo a 30°C por 4 horas, um ciclo a 94°C por 5 minutos, e então a 94°C por 20 segundos, a 55°C por 40 segundos e a 72°C por 1 minuto, que foi repetido 32 ciclos, seguido por ampliação final a 72°C por 5 minutos. O ciclo um efetuado a 37°C por 4 horas era para confirmar a geração da ligação não específica. 10 ng de DNA genômico humano foram usados como um molde para o gene de p53 alvo. O conjunto de primers de p75 (SEQ. ID. NO: 22) / P73 (SEQ. ID. NO: 23) foi usado para o caminho 1, o conjunto de primers de P55 (SEQ. ID. NO: 4) / P53 (SEQ. ID. NO: 3) foi usado para o caminho 2, o conjunto de primers de P55 (SEQ. ID. NO: 4) / P63 (SEQ. ID. NO: 5) foi usado para o caminho 3, o conjunto de primers de p75 (SEQ. ID. NO: 22) / p83 (SEQ. ID. NO: 21) foi usado para o caminho 4, o conjunto de primers de p55 (SEQ. ID. NO: 4) / p73 (SEQ. ID. NO: 23) foi usado para o caminho 5, o conjunto de primers de p65 (SEQ. ID. NO: 20) / p83 (SEQ. ID. NO: 21) foi usado para o caminho 6, o conjunto de primers de p55 (SEQ. ID. NO: 4) / p83 (SEQ. ID. NO: 21) foi usado para o caminho 7. Os resultados são mostrados na Figura 7 e na Figura 8.

Conforme mostrado na Figura 7 e na Figura 8, a composição secada para a PCR de partida quente da presente invenção conservou a reatividade, mesmo após ser deixada por 9 dias a 50°C. Entretanto, a solução da mistura principal de partida quente convencional não teve reatividade a partir do 2- dia após ser deixada na temperatura ambiente, sem exibir o efeito da partida quente.

Exemplo 6: PCR longa com a pré-mistura secada contendo PPi e PPase A PCR foi realizada usando o DNA lambda como um molde com a pré-mistura secada contendo PPi e PPase (SibEnzyme Ltd.) para produzir os produtos ampliados em diferentes comprimentos. Para fazer isto, as composições secadas para a PCR de partida quente foram preparadas no mesmo modo como descrito no Exemplo 5, ou seja, 2,0 mM de PPi e 80 mil de PPase foram comumente adicionados à 1) pré-mistura contendo Taq DNA polimerase (compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,01% de Tween 20 e um estabilizador), 2) pré-mistura contendo Pfu DNA polimerase (compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Pfu DNA polimerase, 0,01% de Tween 20 e um estabilizador), e 3) pré-mistura contendo tanto a Taq DNA polimerase quanto a Pfu DNA polimerase (compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Taq DNA polimerase, 1 U de Pfu DNA polimerase, 0,01% de Tween 20 e um estabilizador). 20 ng de DNA lambda foram usados como um DNA de molde. Para produzir os produtos de 500 bp - 15,0 kbp, foi usado o L303050-F representado pela SEQ. ID. NO: 6 como um primer forward e foram usados os primers reverse representados pelas SEQ. ID. NO: 7 - NO: 13 para produzir os produtos de 500 bp, 1 kbp, 2 kbp, 5,0 kbp, 10,0 kbp, 12,0 kbp e 15 kbp. Para produzir um produto de 20,0 kbp, foi usado o conjunto de primers composto dos primers representados pelas SEQ. ID. NO: 14 e NO; 15. E também, para produzir um produto de 30,0 kbp, foi usado o conjunto de primers composto dos primers representados pelas SEQ. ID. NO: 16 e NO: 17.

Cada uma das misturas de reação contendo a Taq DNA polimerase e Taq DNA po-limerase/Pfu DNA polimerase foi deixada a 37°C por 2 horas, seguido por PCR como se segue: pré-desnaturação a 94°C por 5 minutos, desnaturação a 94°C por 30 segundos, ane-lamento e ampliação a 68°C por 20 minutos, 28 ciclos a partir da desnaturação até a ampliação, e ampliação final a 72°C por 10 minutos. Neste meio tempo, a PCR com a pré-mistura contendo a Pfu DNA polimerase somente foi realizada como se segue; pré-desnaturação a 94°C por 5 minutos, desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento e ampliação a 68°C por 20 minutos, 28 ciclos a partir da desnaturação até a ampliação, e ampliação final a 72°C por 10 minutos. O resultado da PCR foi confirmado por eletroforese usando tampão de 0,5x TBE contendo 1,0% de agarose.

Como resultado, a pré-mistura contendo 2,0 mM de PPi, 80 mU de PPase e Taq DNA polimerase demonstrou alta reatividade da PCR para ampliar o DNA de 500 bp-15,0 kbp, sob cada condição. Em particular, confirmou-se uma inibição significativa de uma reação não específica e uma alta reatividade da PCR, o efeito de partida quente, com o produto ampliado de 15 kbp (Figura 9). Quando a PCR foi realizada com a pré-mistura contendo Pfu DNA polimerase, confirmou-se a reatividade até 5,0 kb, entretanto, quando a PCR foi realizada com a pré-mistura contendo 2,0 mM de PPi, 80 mU de PPase e Pfu DNA polimerase, confirmou-se a reatividade até 10,0 kb. Ou seja, quando o PPi e a PPase foram tratados juntos, confirmou-se uma inibição significativa de uma reação não especifica e uma alta reatividade da PCR, o efeito da partida quente (Figura 10). Também se confirmou que, quando a PCR foi realizada com a pré-mistura contendo 2,0 mM de PPi, 80 mU de PPase, Taq DNA polimerase e Pfu DNA polimerase e quando a PCR foi efetuada com a pré-mistura contendo Taq DNA polimerase e Pfu DNA polimerase, a reatividade foi toda confirmada até 20,0 kb. Particularmente, quando o PPi e a PPase foram tratados juntos para gerar um produto de 1,0 kb, a reação não específica foi eliminada (Figura 11). Ou seja, confirmou-se a inibição significativa de uma reação não específica e a alta reatividade da PCR, o efeito da partida quente.

Exemplo 7: PCR em tempo real usando reaaente de partida quente contendo PPi e PPase Para investigar o efeito da partida quente da composição de PCR contendo PPi e PPase (SibEnzyme Ltd.) por PCR em tempo real, um material fluorescente (Greenstai®, Bi-oneer Corporation, república da Coréia) foi adicionado a 2x solução da pré-mistura de PCR (compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 50 mM, MgCI2 a 2,0 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,01% de Tween 20 e um estabilizador) por 0,25x por 20 μΙ de reação, a qual foram adicionados o PPi e a PPase, respectivamente, por 2,0 mM e 80 mil. Para o controle, um material fluorescente (Greenstai®, Bioneer Corporation, república da Coréia) foi adicionado a 2x solução da pré-mistura de PCR (compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 50 mM, MgCI2 a 2,0 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,01% de Tween 20 e um estabilizador) por 0,25x por 20 μΙ de reação. O material fluorescente acima mencionado facilita a análise simples, sem sonda fluorescente específica para sequência, simplesmente medindo-se a fluorescência gerada no DNA de fita dupla produzido durante a ampliação do DNA, após intercalação do material fluorescente.

Foi usado 1 ng de DNA lambda como um DNA de molde. Foram usados o primer L90_F representado pela SEQ. ID. NO: 18 e o primer L90_R representado pela SEQ. ID. NO: 19, gerando um produto da PCR de 90 bp, respectivamente, na concentração de 10 pmoles por 20 μΙ de reação. A PCR foi realizada usando o sistema ABI 7500 Fast (Applied Biosystems) como se segue; pré-desnaturação a 94°C por 5 minutos, desnaturação a 95°C por 10 segundos, anelamento a 60°C por 15 segundos simultaneamente com a ampliação (40 ciclos). Após a etapa de dissociação, foi preparada a curva de fusão do produto ampliado para confirmar a reatividade da PCR e a especificidade.

Como resultado, conforme mostrado na Figura 12, os ciclos de começo (Ct) da linha 1 e da linha 2 eram ambos 21,19. Assim, a reatividade da PCR da PCR em tempo real quantitativa era igual, quer o PPi ou a PPase fossem tratados, quer não fossem.

Conforme mostrado na Figura 13, um pico fluorescente claro foi observado na linha a partir da PCR com PPi e PPase, indicando que foi gerado um produto ampliado correto. Neste meio tempo, dois produtos ampliados foram confirmados por dois picos fluorescentes na linha a partir da PCR sem PPi e PPase, o que significa que foi gerado um outro produto ampliado de dímero de primers de tamanho pequeno, exceto o produto-alvo. As temperaturas de fusão (Tf) dos produtos-alvo da PCR do grupo experimental (linha 1) e do controle (linha 2) eram ambas 82,8°C. A temperatura de fusão (Tf) da banda de dímero de primers era um pouco menor do que aquela, que era 75°C. A partir dos resultados acima descritos, confirmou-se que a PPase usada nesta invenção recuperava a reação PCR inibida pelo PPi na PCR em tempo real, de modo que ela pôde inibir a produção de PCR não específica, porém aumenta a reatividade de PCR. Ao contrário, no controle, o dímero de primers foi gerado além do produto-alvo da PCR, indicando baixa especificidade.

Exemplo 8: PCR em tempo real quantitativa usando reaaente de partida quente contendo PPi e PPase O efeito da partida quente pelo PPi e a PPase foi examinado por PCR em tempo real quantitativa. Um material fluorescente (Greenstai®, Bioneer Corporation, república da Coréia) foi adicionado a 2x solução da pré-mistura de PCR (compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 50 mM, MgCI2 a 2,0 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Taq DNA poli-merase, 0,01% de Tween 20 e poliol) por 0,25x por 20 μΙ de reação, a qual foram adicionados 2,0 mM de PPi e 80 mU de PPase (SibEnzyme Ltd.), resultando na preparação da composição 1. Um material fluorescente (Greenstai®, Bioneer Corporation, república da Coréia) foi adicionado a 2x solução da pré-mistura de PCR (compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 50 mM, MgCI2 a 2,0 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,01% de Tween 20 e poliol) por 0,25x por 20 μΙ de reação, à qual foram adicionados 0,5 mM de PPi e 0,3 mU de PPase (SibEnzyme Ltd.), resultando na preparação da composição 2. Para o controle, o material fluorescente foi adicionado a 2x solução da pré-mistura de PCR por 0,25x por 20 μΙ de reação. O DNA de molde, DNA lambda, foi diluído gradualmente em 10 vezes, cada vez até 6 ordens de 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, e 100 fg. Foram usados o primer L90_F representado pela SEQ. ID. NO: 18 e o primer L90_R representado pela SEQ. ID. NO: 19, gerando um produto de 90 bp, na concentração de 10 pmoles por 20 μΙ de reação. A PCR e o desenho da curva de fusão foram efetuados no mesmo modo como descrito no Exemplo 7. A eficiência da PCR (referida como "E" daqui por diante) para os moldes diluídos em série e a linearidade da PCR (referida como "RA2" daqui por diante) foram investigados e comparados para confirmar o efeito da partida quente (Figura 14 e Figura 15).

Conforme mostrado na Figura 16, um pico fluorescente foi observado a 87,5°C no controle, ao contrário do pico fluorescente confirmado a 75°C na Figura 13. Ou seja, o pico fluorescente apresentando o produto-alvo da PCR era o observado na temperatura de fusão (Tf) de 82,8°C e o outro pico fluorescente observado na temperatura de fusão de 87,5°C apresentou um produto de reação não específico. A partir da parte superior até a parte inferior na curva de fusão, a concentração do DNA lambda foi diluída gradualmente de 10 ng, 1 ng, 100 pg e 10 pg. Os resultados da PCR em tempo real quantitativa mostrados na Figura 14 e na Figura 15 indicam que foi gerado um produto de reação não específico. Portanto, estes resultados poderíam não ser considerados como resultados exatos da PCR quantitativa (Figura 17 e Figura 18).

Conforme mostrado na Figura 19, quando foi usada a composição 2, foram observados três picos fluorescentes. Um era o pico observado na temperatura de fusão (Tf) de 82,8°C, que indica o produto-alvo, um outro pico foi observado na temperatura de fusão (Tf) de 75°C, que indica o dímero de primers (Figura 19, T), e o último foi observado na temperatura de fusão (Tf) de 87,5°C, que indica o produto de ampliação não específico (Figura 19, ΊΙ") que era maior do que o produto-alvo. Em comparação com os resultados na Figura 16, o tamanho do pico apresentado por "II" foi um tanto reduzido, indicando o efeito da partida quente. Porém, o dímero de primers e o produto de ampliação não específico ainda foram gerados. Os resultados da PCR em tempo real quantitativa mostrados na Figura 17 e na Figura 18 indicam que o produto de ampliação não específico e o dímero de primers foram também gerados. Portanto, estes resultados não puderam ser considerados como resultados exatos da PCR quantitativa (Figuras 20 e 21).

Conforme mostrado na Figura 22, somente um pico fluorescente foi observado na temperatura de fusão de 82,8°C, quando foi usada a composição 1, sugerindo que foi gerado o produto-alvo exato. Na curva de fusão, as concentrações do DNA lambda eram 10 ng, 1 ng, 100 pg e 10 pg, em série, a partir da parte de cima até a parte de baixo. A Figura 20 e a Figura 21 ilustram os resultados da PCR em tempo real quantitativa indicando os produtos de reação específicos, que significam que os alvos exatos foram ampliados. Ou seja, o efeito da partida quente pelo PPi e pela PPase foi também observado na qPCR em tempo real. Comparada com a composição 2 contendo PPi e PPase (Pedido de Patente Coreano N9: 10-1999-0004361), a composição 1 não produziu dímero de primers e minimizou a produção de um produto de ampliação não específico. A Figura 23 é um gráfico ilustrando a comparação por sobreposição da curva de fusão da Figura 16 sobre a curva de fusão da Figura 22. O eixo horizontal indica as mudanças de temperatura e o eixo das ordenadas apresenta a fluorescência medida durante o aumento da temperatura, s/ (sem) PPi+PPase indica que a curva de fusão resultou da PCR em tempo real quantitativa usando 2x solução de Pré-mistura de PCR. Neste gráfico, as linhas 1 - 4 indicam os picos fluorescentes demonstrando os produtos de ampliação não específicos nas concentrações de 10 ng, 1 ng, 100 pg e 10 pg, gradualmente, d (com) PPi+PPase indica que a curva de fusão resultou da PCR em tempo real quantitativa usando 2x solução de Pré-mistura de PCR contendo 2,0 mM de PPi e 80 mU de PPase por 20 μΙ de reação, sugerindo que não foi gerado um produto de ampliação não específico.

Exemplo 9: PCR usando a pré-mistura secada contendo Top DNA polimerase. PPi e PPase A PCR foi realizada usando o DNA humano como molde com a pré-mistura secada contendo a Top DNA polimerase, o PPi e a PPase, para ampliar os produtos em comprimentos variados. Para fazer isso, foram preparadas 1) a composição secada da pré-mistura contendo a Top DNA polimerase, o PPi e a PPase (SibEnzyme Ltd.) (compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Top DNA polimerase, 0,01% de Tween 20, PPi a 2,0 mM, 80 mU de PPase e um estabilizador) e 2) a composição secada da pré-mistura contendo a Top DNA polimerase (compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de Top DNA polimerase, 0,01% de Tween 20, e um estabilizador). 10 ng de DNA humano foram usados como um DNA de molde. Para ampliar o produto de 139 bp, foi usado o conjunto de primers composto do primer forward representado pela SEQ. ID. NO: 22 e o primer reverse representado pela SEQ. ID. NO: 23 (caminhos 1 e 8, Figura 24). Para ampliar o produto de 211 bp, foi usado o conjunto de primers composto do primer forward representado pela SEQ. ID. NO: 4 e o primer reverse representado pela SEQ. ID. NO: 3 (caminhos 2 e 9, Figura 24). Para ampliar o produto de 447 bp, foi usado o conjunto de primers composto do primer forward representado pela SEQ. ID. NO: 4 e o primer reverse representado pela SEQ. ID. NO: 5 (caminhos 3 e 10, Figura 24). Para ampliar o produto de 618 bp, foi usado o conjunto de primers composto do primer forward representado pela SEQ. ID. NO: 22 e o primer reverse representado pela SEQ. ID. NO: 21 (caminhos 4 e 11, Figura 24). Para ampliar o produto de 1.082 bp, foi usado o conjunto de primers composto do primer forward representado pela SEQ. ID. NO: 4 e o primer reverse representado pela SEQ. ID. NO: 23 (caminhos 5 e 12, Figura 24). Para ampliar o produto de 1.296 bp, foi usado o conjunto de primers composto do primer forward representado pela SEQ. ID. NO: 20 e o primer reverse representado pela SEQ. ID. NO: 21 (caminhos 6 e 13, Figura 24). Para ampliar o produto de 1.561 bp, foi usado o conjunto de primers composto do primer forward representado pela SEQ. ID. NO: 4 e o primer reverse representado pela SEQ. ID. NO: 21 (caminhos 7 e 14, Figura 24). A mistura de reação foi deixada a 37°C por 4 horas, antes da PCR. A PCR foi então efetuada como se segue: pré-desnaturação a 94°C por 5 minutos, desnaturação a 94°C por 20 segundos, anelamento a 55°C por 40 segundos, ampliação a 72°C por 40 segundos, 33 ciclos a partir da desnaturação até a ampliação, e ampliação final a 72°C por 5 minutos. O resultado da PCR foi confirmado por eletroforese usando tampão de 0,5x TBE contendo 1,6% de agarose.

Como resultado, quando foi usada a pré-mistura contendo 2,0 mM de PPi, 80 mU de PPase e Top DNA polimerase, a reatividade da PCR e a especificidade foram excelentes sob cada uma das condições experimentais para ampliar o DNA de 100 bp - 1,6 kbp, mesmo após o pré-tratamento por 4 horas (caminhos 1 - 7, Figura 24). Por outro lado, quando foi usada sozinha a pré-mistura contendo a Top DNA polimerase, foi detectada uma reação não específica ou a reação propriamente dita não foi bem sucedida sob cada uma das condições para ampliar o DNA de 100 bp - 1,k6 kbp (caminhos 8 -14, Figura 24). A partir dos resultados acima mencionados, foram confirmadas uma inibição significativa de uma reação não específica e uma alta reatividade da PCR, o efeito da partida quente, quando foi usada a pré-mistura contendo a Top DNA polimerase, o PPi e a PPase.

Exemplo 10: Estabilidade na armazenagem da composição da pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase Para investigar a estabilidade na armazenagem da composição da pré-mistura de partida quente contendo PPi e PPae (Bioneer Corporation, república da Coréia), foi preparada a pré-mistura secada compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,2, KCI a 60 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de wTfi DNA polimerase, 0,01% de Tween 20, PPi a 2,0 mM, 92,5 mU de PPase, 1,2 pg de BSA e um estabilizador (Metil-a-D-Glico-Piranosídeo: α-MG). Para o controle, foi preparada a solução tendo a mesma composição que a acima descrita, antes do uso. A secagem foi efetuada no SuperCentra (Bioneer Corporation, república da Coréia), em que a temperatura fora do dispositivo foi ajustada a 40°C e a temperatura dentro do dispositivo foi ajustada a 36°C, por 50 minutos. A pré-mistura preparada foi armazenada em um reator a 50°C. A partir do dia 0 até o dia 7, uma tira de 8 poços contendo a pré-mistura foi retirada cada dia. A tira foi armazenada em um congelador até a PCR em tempo real ou usada para a PCR em tempo real no dia da amostragem, sob as mesmas condições como proporcionadas para o controle. O primer, a sonda e o DNA de molde padrão para a PCR em tempo real eram como a seguir. Como um DNA de molde, foi usado o DNA de plasmídio contendo a sequência de gene do vírus da varicela-zoster ORF. O DNA de molde tendo o número de cópias de 1 x 10° ~ 1 x 10® cópias/μΙ foi adicionado a cada poço por 10 μΙ. A água destilada tratada com DEPC foi usada para o controle pelo mesmo volume que o DNA de molde. Foi usado o conjunto de primers composto do primer forward representado pela SEQ. ID. NO: 25 (5'-TGGATGTGGTGTTCCCAAT-3') e do primer reverse representado pela SEQ. ID. NO: 26 (5'-GTTCAGGCAACCGl 11 IGA-3'), gerando o produto da PCR de 80 bp. Como uma sonda, foi usada a sonda à base de TaqMan representada pela SEQ. ID. NO: 27 (5-CTCATACC GAGTTGCATCCAACG-3'), em que o FAM foi marcado na extremidade de 5' e o TAMRA foi marcado na extremidade de 3'. Os primers representados pelas SEQ. ID. NO: 25 e NO: 26 foram adicionados na concentração de 10 pmoles por 50 μΙ de reação. A sonda representada pela SEQ. ID. NO: 27 foi adicionada na concentração de 7,5 pmoles por 50 μΙ de reação. A água destilada tratada com DEPC foi adicionada a cada poço para preparar os 50 μΙ totais de solução de reação. A solução tendo a mesma composição que aquela da pré-mistura secada foi usada para o controle, para comparar a reatividade durante a secagem e a armazenagem, que foi preparada antes do uso. A PCR em tempo real foi efetuada sob as mesmas condições como dadas para a PCR em tempo real com a pré-mistura secada. O Exicycler versão 3.0 (Bioneer Corporation, república da Coréia) foi usado para a PCR em tempo real. O programa de operação e o programa de análise foram executados de acordo com as instruções do fabricante. A PCR em tempo real foi realizada como se segue: pré-desnaturação a 95°C por 5 minutos, desnaturação a 95°C por 20 segundos, anelamen-to/ampliação a 55°C por 40 segundos, e detecção da fluorescência (45 ciclos). No término da PCR, o produto da PCR foi examinado pelo programa de análise operando no dispositivo de PCR em tempo real Excicycler.

Como resultado, a reatividade da pré-mistura secada, armazenada por 8 dias a 50°C, foi similar àquele da pré-mistura secada primária. O valor de Rn subsequente à secagem foi comparado com aqueles de até 9 dias a 50°C. Como resultado, 85% da fluorescên- cia foram mantidos (Figuras 25 - 31). O resultado do experimento a 50°C foi recalculado para investigar a reatividade sob armazenagem a -20°C. Como resultado, a pré-mistura secada era esperada conservar a sua reatividade similar àquela do controle até 1.152 dias (3,1 anos) (Lee sangyong, Reliability engineering, 1999, Hyungseul Publishing Company).

Exemplo 11: Comparação da estabilidade durante a armazenagem a frio e a armazenagem em congelamento entre a pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase e a solução de partida quente tendo a mesma composição que a pré-mistura Para comparar a estabilidade durante a armazenagem a frio (4°C) e a armazenagem em congelamento (-20°C) entre a pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase (Bioneer Corporation, república da Coréia) e a solução de partida quente tendo a mesma composição que a pré-mistura acima mencionada, a pré-mistura secada foi preparada no mesmo modo como descrito no Exemplo 10. A pré-mistura preparada foi armazenada em uma geladeira (4°C) ou em um congelador (-20°C). Uma tira foi retirada a cada semana para a armazenagem por 7 semanas. A tira foi armazenada em um congelador até a PCR em tempo real ou usada para a PCR em tempo real no dia da amostragem, sob as mesmas condições como proporcionadas para o controle. Para o controle, foi preparada a solução de partida quente tendo a mesma composição como acima, antes do uso. O primer, a sonda e o DNA de molde padrão para a PCR em tempo real eram como a seguir. Como um DNA de molde, foi usado o DNA de plasmídio contendo a sequência de gene do antígeno de superfície do HBV (gene de superfície grande). O DNA de molde tendo o número de cópias de 1 x 10° ~ 1 x 106 cópias/μΙ foi adicionado a cada poço por 10 μΙ. Foi usado o conjunto de primers composto do primer forward representado pela SEQ. ID. NO: 28 (5'-CCAATCACTCACCAACCTCTTGT-3') e do primer reverse representado pela SEQ. ID. NO: 29 (5'-AGCAGGATGAAGAGGAATATGATAAA-3'), gerando o produto da PCR de 91 bp. Como uma sonda, foi usada a sonda à base de TaqMan representada pela SEQ. ID. NO: 30 (5'-TCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGC-3'), em que o FAM foi marcado na extremidade de 5' e o TAMRA foi marcado na extremidade de 3'. A PCR em tempo real foi realizada no mesmo modo como descrito no Exemplo 10. O sistema 7500 Fast (Applied Biosystem) foi usado para a PCR em tempo real. O programa de operação e o programa de análise foram executados de acordo com as instruções do fabricante. A PCR em tempo real foi realizada como se segue: pré-desnaturação a 95°C por 5 minutos, desnaturação a 95°C por 20 segundos, anelamento/ampliação a 55°C por 40 segundos, e detecção da fluorescência (45 ciclos).

Como resultado, a pré-mistura de partida quente secada da presente invenção manteve a reatividade até 7 semanas de armazenagem a frio (4°C) ou de armazenagem em congelamento (-20°C) (Figura 32 - Figura 36, Figura 39 e Figura 40). Neste meio tempo, a solução de partida quente de controle, tendo a mesma composição que a dita pré-mistura, demonstrou reatividade similar até 3 semanas de armazenagem a frio (4°C), porém perdeu a reatividade após 7 semanas de armazenagem a frio (Figura 37 e Figura 38). Os resultados acima descritos indicam que, quando a mistura principal for armazenada como uma solução, a reatividade é rapidamente perdida a partir da 3â semana de armazenagem a frio (4°C), porém, quando ela for preparada como uma pré-mistura de partida quente secada, a reatividade pode ser mantida durante um longo período.

Exemplo 12: Reatividade da PCR da pré-mistura secada contendo PPi e PPase e da pré-mistura de partida quente convencional Para comparar a reatividade entre a pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase e a pré-mistura de partida quente convencional, a TaKaRa Premix Ex Taq® (Takara, Ne do Cat.: RR039A), a Qiagen QuantiFast® Probe PCR + ROX Vial Kit (Qiagen, N2 do Cat.: 204352) e a Invitrogen Platinum Quantitative PCR SuperMix-U (Invitrogen, N2 do Cat.: 11730-017) foram selecionadas para os grupos comparativos. A reatividade da PCR foi comparada entre a pré-mistura de partida quente da presente invenção e as selecionadas. A secagem foi efetuada no mesmo modo como descrito no Exemplo 10, para preparar a pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase. O primer, a sonda e o DNA de molde padrão para a PCR em tempo real eram como a seguir. Como um DNA de molde, foi usado o DNA de plasmídio contendo a sequência de gene do vírus do Nilo Ocidental E. O DNA de molde tendo o número de cópias de 2 x 10° ~ 2x10® cópias/μΙ foi adicionado a cada poço por 5 μΙ. Foi usado o conjunto de primers composto do primer forward representado pela SEQ. ID. NO: 31 (5- GTGGAGGAACAGAGAGACGTTAA TG-3') e do primer reverse representado pela SEQ. ID. NO: 32 (5'-TCCCTCTTGTGAGCCC AATG-3'), gerando o produto da PCR de 85 bp. Como uma sonda, foi usada a sonda à base de TaqMan representada pela SEQ. ID. NO: 33 (5-TGAG GAACCACACGCCACGAAGC-3'), em que o FAM foi marcado na extremidade de 5' e o TAMRA foi marcado na extremidade de 3'. A PCR em tempo real foi realizada no mesmo modo como descrito no Exemplo 10. Os mesmos primers, sondas e amostras de DNA de molde padrão foram usados para estes três produtos de pré-mistura de três diferentes empresas e, neste momento, as condições para a PCR em tempo real e a preparação da mistura principal foram ajustadas de acordo com as instruções do fabricante. O sistema 7500 Fast (Applied Biosystem) foi usado para a PCR em tempo real. O programa de operação e o programa de análise foram executados de acordo com as instruções do fabricante. No término da PCR, o produto da PCR foi examinado pelo programa de análise operando no sistema 7500 Fast.

Como resultado, quando foram usadas a pré-mistura secada contendo PPi/PPase da presente invenção (Pré-mistura Dualstar®, Bioneer Corporation) e a pré-mistura da Takara, até 10 cópias do vírus do Nilo Ocidental puderam ser detectadas. Quando foram usados os outros dois produtos, até 100 cópias do vírus do Nilo Ocidental puderam ser detectadas (Figura 41). Os níveis de fluorescência foram também comparados. Como resultado, quando foi usada a pré-mistura secada da presente invenção, a fluorescência era pelo menos duas vezes tão alta quanto a fluorescência obtida quando foi usada a pré-mistura da Takara (Figura 42). Os resultados acima descritos indicam que a pré-mistura de partida quente secada contendo PPi/PPase da presente invenção demonstrou uma reatividade da PCR significativamente maior do que os outros produtos fornecidos a partir de três empresas diferentes.

Exemplo 13: Reatividade da PCR da pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase. porém não contendo um estabilizador Para investigar a reatividade da PCR e a estabilidade da pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase (Bioneer Corporation, república da Coréia), porém não contendo o estabilizador Metil-a-D-Glico-Piranosídeo (α-MG), a pré-mistura secada foi primeiramente preparada no mesmo modo como descrito no Exemplo 10. A pré-mistura de controle tinha a mesma composição que a acima descrita, porém 0,1 M de α-MG foi eliminado dela. As condições de secagem para preparar as pré-misturas secadas eram as mesmas como descritas no Exemplo 10. As PCRs em tempo real com a pré-mistura secada e a pré-mistura de controle foram realizadas sob as mesmas condições. O primer, a sonda e a sequência de amostra de DNA de molde padrão para a PCR em tempo real eram os mesmos como descritos no Exemplo 11. Como um DNA de molde, foi usado o DNA de plasmídio contendo a sequência de gene do antígeno de superfície do HBV (gene de superfície grande). O DNA de molde tendo o número de cópias de 1 x 10° ~ 1 x 106 cópias/μΙ foi adicionado a cada poço por 10 μΙ. As condições para a PCR em tempo real eram as mesmas como descritas no Exemplo 10. O sistema 7500 Fast (Applied Biosystem) foi usado para a PCR em tempo real. O programa de operação e o programa de análise foram executados de acordo com as instruções do fabricante. A PCR em tempo real foi realizada como se segue, pré-desnaturação a 95°C por 5 minutos, desnaturação a 95°C por 20 segundos, anelamento/ampliação a 55°C por 40 segundos, e detecção da fluorescência (45 ciclos). No término da PCR, o produto da PCR foi examinado pelo programa de análise operando no sistema 7500 Fast.

Como resultado, a reatividade da pré-mistura de partida secada não contendo um estabilizador não foi muito diferente da reatividade da pré-mistura de controle contendo um estabilizador. Em particular, os valores de Ct eram similares para a mesma amostra padrão (Figuras 43 e 44). Os resultados acima descritos indicam que a adição de um estabilizador não afeta a reatividade da PCR da pré-mistura de partida quente secada.

Exemplo 14: Reatividade da pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase de acordo com os dispositivos de PCR em tempo real Para investigar se a reatividade da pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase (Bioneer Corporation, república da Coréia) poderia ser diferente pelos dispositivos de PCR em tempo real, foram usados 5 dispositivos diferentes de PCR em tempo real, fornecidos a partir de três empresas. A composição da pré-mistura secada e as condições para a secagem eram as mesmas conforme descritas no Exemplo 10. As PCRs em tempo real foram realizadas com a pré-mistura secada usando os 5 dispositivos de PCR. Os dispositivos de PCR em tempo real usados nesta invenção eram como se seguem: Exicycler versão 3 (Bioneer Corporation, república da Coréia), Applied Biosystem 7500, sistema 7500 Fast, sistema Stepone (Applied Biosystem) e DNA engine opticon (MJ Research Inc.). O programa de operação e o programa de análise foram executados de acordo com as instruções do fabricante. A PCR em tempo real foi realizada no mesmo modo como descrito no Exemplo 10. No término da PCR, o produto da PCR foi examinado pelo programa de análise operando em cada dispositivo de PCR. O primer, a sonda e a sequência de amostra de DNA de molde padrão para a PCR em tempo real eram os mesmos como descritos no Exemplo 12. Como um DNA de molde, foi usado o DNA de plasmídio contendo a sequência de gene do vírus do Nilo Ocidental E. O DNA de molde tendo o número de cópias de 2 x 10o ~ 2 x 106 cópias/μΙ foi adicionado a cada poço por 5 μΙ. As condições para a PCR em tempo real eram as mesmas como descritas no Exemplo 10.

Como resultado, a pré-mistura de partida quente secada mostrou resultados consistentes com os diferentes dispositivos de PCR (Figuras 45 - 49). Portanto, confirmou-se que a composição secada da presente invenção não está limitada a um dispositivo específico, porém é aplicada nos vários dispositivos gerais.

Exemplo 15: Reatividade da PCR da pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase examinada por utilização de genes-alvo variados Para investigar se a reatividade da PCR da pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase poderia ser variada a partir de diferentes genes-alvo ou não, foram utilizados três genes-alvo diferentes (gene do vírus do Nilo Ocidental E, gene do vírus da varicela-zoster ORF e gene do antígeno de superfície do HBV). As condições para a preparação da pré-mistura de partida quente secada contendo PPi e PPase eram as mesmas conforme descritas no Exemplo 10. O primer, a sonda e a sequência de amostra de DNA de molde padrão para a PCR em tempo real eram os mesmos como descritos nos Exemplos 10, 11 e 12. Como um DNA de molde, foi usado o DNA de plasmídio contendo a sequência de gene do vírus do Nilo Ocidental E, gene do vírus da varicela-zoster ORF ou gene do antígeno de superfície do HBV. O DNA de molde tendo o número de cópias de 2 x 10° ~ 2 x 106 cópias/μΙ foi adicionado a cada poço por 5 μΙ. As condições para a PCR em tempo real eram as mesmas como descritas no Exemplo 10. O Exicycler versão 3.0 (Bioneer Corporation, república da Coréia) foi usado para a PCR em tempo real. O programa de operação e o programa de análise foram executados de acordo com as instruções do fabricante. A PCR em tempo real foi realizada como se segue: pré-desnaturação a 95°C por 5 minutos, desnaturação a 95°C por 20 segundos, anelamen-to/ampliação a 55°C por 40 segundos, e detecção da fluorescência (45 ciclos). No término da PCR, o produto da PCR foi examinado pelo programa de análise operando no dispositivo de PCR em tempo real Excicycler.

Como resultado, a reatividade era toda consistente com os três genes-alvo diferentes tendo diferentes sequências de genes, diferentes composições de nucleotídeos e diferentes comprimentos de sequências-alvo ampliadas (Figuras 50 - 52). Os resultados acima descritos indicam que a pré-mistura de partida quente secada da presente invenção pode ser aplicada em uma variedade de genes-alvo.

Exemolo 16: PCR em tempo real usando a pré-mistura de partida quente secada contendo PPi. PPase e corante fluorescente CvBr areen Para investigar a reatividade da pré-mistura de partida quente secada contendo PPi, PPase e corante fluorescente CyBr green, o material fluorescente CyBr green 10x (■Greenstar®, Bioneer Corporation, república da Coréia) foi adicionado na concentração final de 0,6x a 50 μΙ de mistura de reação compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,0, KCI a 40 mM, MgCI2 a 2,0 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada, concentração final: 0,25 mM), 2,5 U de Top DNA polimerase, 0,01% de Tween 20 e um estabilizador, à qual foram adicionados o PPi e a PPase (Bioneer Corporation, república da Coréia) em, respectivamente, 2,0 mM e 92,5 mU, resultando na preparação de uma composição. A secagem da pré-mistura de partida quente foi efetuada no mesmo modo como descrito no Exemplo 10. Para o controle, foi preparada uma solução de mistura principal tendo a mesma composição, antes do uso. O material fluorescente aqui facilita a análise, sem uma sonda fluorescente específica para sequência simplesmente medindo-se a fluorescência gerada a partir do DNA de fita dupla, onde o material fluorescente foi intercalado durante a ampliação do DNA de molde. O DNA lambda (Bioneer Corporation, república da Coréia) foi usado como um molde em diferentes concentrações a partir de 0,1 ng até 0,1 pg. Foram usados o primer L127_F representado pela SEQ. ID. NO: 34 (5 '-GAACTGATGAGCGATCCGAATAG-3') e o primer L127_R representado pela SEQ. ID. NO: 35 (5'-CCACCACTGATTAGCGAATGC-3'), gerando um produto da PCR de 127 bp, na concentração de 10 pmoles por 50 μΙ de reação. A PCR foi realizada usando o sistema ABI 7500 Fast (Applied Biosystems) como se segue; pré-desnaturação a 94°C por 1 minuto, desnaturação a 95°C por 5 segundos, anelamento a 55°C por 35 segundos simultaneamente com a ampliação (40 ciclos). Após a etapa de dissociação, foi preparada a curva de fusão do produto ampliado para confirmar a reatividade da PCR e a especificidade.

Exemplo 17: Estabilidade na armazenagem da pré-mistura secada contendo PPi. PPase e material fluorescente CvBr qreen Para investigar a estabilidade na armazenagem da pré-mistura de partida quente secada contendo PPi, PPase e material fluorescente CyBr green, a pré-mistura secada foi primeiramente preparada no mesmo modo como descrito no Exemplo 16. Para o controle, foi preparada a solução tendo a mesma composição, antes do uso. A secagem foi efetuada no SuperCentra (Bioneer Corporation, república da Coréia), em que a temperatura fora do dispositivo foi ajustada a 40°C e a temperatura dentro do dispositivo foi ajustada a 36°C, por 50 minutos, após pré-aquecimento por 5 minutos. A pré-mistura preparada foi armazenada em um reator a 50°C, durante o que uma tira de 8 poços contendo a pré-mistura secada foi retirada todos os dias, a partir do dia 0 até o dia 9. A tira foi armazenada em um congelador até a PCR em tempo real ou usada para a PCR em tempo real no dia da amostragem, sob as mesmas condições como proporcionadas para o controle. Foi utilizado o mesmo DNA de molde conforme usado no Exemplo 16. As condições experimentais eram também as mesmas como descritas no Exemplo 16. A PCR e a análise dos resultados foram efetuadas no mesmo modo como descrito no Exemplo 16.

Como resultado, a composição secada da presente invenção demonstrou reativida-de similar àquela da composição da pré-mistura primária, mesmo após uma armazenagem de 7 dias a 50°C. No 92 dia de armazenagem a 50°C, a fluorescência foi comparada com aquela da composição secada primária. Como resultado, a fluorescência foi ligeiramente reduzida, porém esta redução não era tão forte de modo a afetar a reatividade (Figuras 55 -60). O resultado do experimento a 50°C foi recalculado para investigar a reatividade sob armazenagem a -20°C. Como resultado, a pré-mistura secada era esperada conservar a sua reatividade similar àquela do controle até 1.152 dias (3,1 anos) (Lee sangyong, Reliability engineering, 1999, Hyungseul Publishing Company).

Exemplo 18: Reatividade da PCR da pré-mistura de partida secada contendo o corante fluorescente CvBr qreen. o PPi e a PPase e da pré-mistura de partida quente convencional Para comparar a reatividade entre a pré-mistura de partida quente secada contendo corante fluorescente CyBr green, PPi e PPase da presente invenção e a pré-mistura de partida quente convencional, a Takara SYBR Premix Ex Taq®(Takara, Ns do Cat.: RR041), a ABI SYBR® Green PCR Master Mix (ABI, Ne do Cat.: 4309155) e a Invitrogen SYBR Gree-nER® qPCR SuperMix Universal (Invitrogen, N5 do Cat.: 11762-100) foram selecionadas para os grupos comparativos. A secagem foi efetuada no mesmo modo como descrito no Exemplo 16, para preparar a pré-mistura de partida quente secada contendo corante fluorescente CyBr green, PPi e PPase. O primer, a sonda e o DNA de molde padrão para a PCR em tempo real foram os mesmos como descritos no Exemplo 16. A PCR em tempo real foi realizada no mesmo modo como descrito no Exemplo 16. Os mesmos primers, sondas e amostras de DNA de molde padrão foram usados para aqueles três produtos de pré-mistura de três diferentes empresas e, neste momento, as condições para a PCR em tempo real e a preparação da mistura principal foram ajustadas de acordo com as instruções do fabricante. O sistema 7500 Fast (Applied Biosystem) foi usado para a PCR em tempo real. O programa de operação e o programa de análise foram executados de acordo com as instruções do fabricante. No término da PCR, o produto da PCR foi examinado pelo programa de análise operando no sistema 7500 Fast.

Como resultado, a pré-mistura de partida quente secada contendo corante fluorescente CyBr green, PPi e PPase demonstrou eficiência da PCR e curva de ampliação similares às três pré-misturas convencionais, fornecidas de três empresas diferentes (Figura 61).

Exemplo 19: Reatividade da PCR da pré-mistura de partida quente secada compreendendo PPi, PPase, grupo de primers e sonda marcada com corante fluorescente Foi investigada a reatividade da PCR da pré-mistura de partida quente secada compreendendo PPi, PPase (Bioneer Corporation, república da Coréia), grupo de primers específico para o alvo e sonda marcada com corante fluorescente. 10 pmoles de grupo de primers específico para o alvo compreendendo um primer forward (1 μΙ/20 μΙ de volume de reação) e um primer reverse (1 μΙ/20 μΙ de volume de reação) e 10 pmoles de sonda marcada com corante fluorescente (1 μΙ/20 μΙ de volume de reação) foram adicionados à mistura de reação compreendendo Tris-HCI a 10 mM pH 9,2, KCI a 60 mM, MgCI2 a 1,5 mM, 4 dNTPs (250 μΜ cada), 1 U de wTfi DNA polimerase, 0,01% de Tween 20, PPi a 2,0 mM, 37 mU de PPase, 1,2 μg de BSA e um estabilizador (Metil-a-D-Glico-Piranosídeo: α-MG), para preparar a pré-mistura secada. Para o controle, foi preparada a pré-mistura secada tendo a mesma composição como a acima descrita, porém não contendo um grupo de primers e uma sonda. A secagem foi efetuada no SuperCentra (Bioneer Corporation, república da Coréia), em que a temperatura fora do dispositivo foi ajustada a 40°C e a temperatura dentro do dispositivo foi ajustada a 36°C, por 25 minutos. A PCR em tempo real foi efetuada sob as mesmas condições. O primer, a sonda e a sequência de amostra de DNA de molde padrão para a PCR em tempo real eram os mesmos como descritos no Exemplo 11. Como um DNA de molde, foi usado o DNA de plasmídio contendo a sequência de gene do antígeno de superfície do HBV (gene de superfície grande). O DNA de molde tendo o número de cópias de 1 x 10° ~ 1 x 106 cópias/μΙ foi adicionado a cada poço por 5 μΙ. A pré-mistura de controle que não continha o grupo de primers e a sonda foi adicionada com 10 pmoles do grupo de primers compreendendo um primer forward (1 μΙ/20 μΙ de volume de reação) e um primer reverse (1 μΙ/20 μΙ de volume de reação) e 10 pmoles de sonda marcada com corante fluorescente (1 μΙ/20 μΙ de volume de reação). 12 μΙ de água destilada tratada com DEPC foram adicionados para fazer com que o volume final fosse 20 μΙ/poço. Para a pré-mistura de partida quente contendo a mesma concentração, o grupo de primers e a sonda de sequências iguais, a partir do começo do processo de secagem, foram adicionados com 15 μΙ de água destilada tratada com DEPC para fazer com que o volume de reação final fosse 20 pL/poço. O restante das condições da PCR em tempo real era o mesmo como descrito no Exemplo 10. O sistema 7500 Fast (Applied Biosystem) foi usado para a PCR em tempo real. O programa de operação e o programa de análise foram executados de acordo com as instruções do fabricante. A PCR em tempo real foi efetuada como se segue: pré-desnaturação a 95°C por 5 minutos, desnaturação a 95°C por 20 segundos, anelamento/ampliação a 55°C por 40 segundos, e detecção da fluorescência (45 ciclos). No término da PCR, o produto da PCR foi examinado pelo programa de análise operando no sistema 7500 Fast.

Como resultado, a reatividade da pré-mistura de partida quente secada contendo o grupo de primers específico para o alvo e a sonda era similar àquela da pré-mistura de partida quente secada de controle, preparada sem o primer específico para o alvo e a sonda, porém contendo PPi e PPase (Figuras 62 e 63). Os resultados acima descritos indicam que, mesmo se a pré-mistura de partida quente for preparada por adição de grupo de primers específico para o alvo e sonda, durante o processo de secagem, a reatividade da PCR não é alterada. Portanto, mostra a possibilidade de aplicação na produção de um kit diagnóstico para diversas doenças contendo um grupo de primers específico para o alvo e sonda na pré-mistura.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS A listagem das sequências está anexada.

Aqueles versados na técnica apreciarão que os conceitos e as modalidades específicas divulgados na descrição precedente podem ser prontamente utilizados como uma base para modificar ou projetar outras modalidades para realizar os mesmos objetivos da presente invenção. Aqueles versados na técnica também apreciarão que tais modalidades equivalentes não saem do espírito e do escopo da invenção, conforme apresentada nas reivindicações em anexo.

REIVINDICAÇÕES

Claims (29)

1. Composição secada para a PCR de partida quente, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende tampão de reação, MgCI2, 4 tipos de dNTPs, DNA polimerase, pirofos-fato e pirofosfatase.

2. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição adicionalmente compreende um grupo de primers ou uma sonda.

3. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição adicionalmente compreende um corante fluorescente que se liga ao DNA.

4. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o corante fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em SyBr Green, EtBr e HRdye.

5. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição adicionalmente compreende ácido nucléico de molde.

6. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o pirofosfato é incluído na concentração de 0,3-5 mM na solução de reação final e a pirofosfatase é incluída na concentração maior do que 30 a 200 mil em 20 μι. da solução de reação final.

7. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o pirofosfato é incluído na concentração de 0,95- 3,0 mM na solução de reação final.

8. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a pirofosfatase é incluída na concentração de 50-100 mU em 20 pL da solução de reação final.

9. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a DNA polimerase é uma ou mais polimerases selecionadas a partir do grupo que consiste na polimerase tendo a atividade de exonuclease 5'->3', na polimerase tendo a atividade de exonuclease 3'->5', e na polimerase não tendo nenhuma das atividades de exonuclease 5'->3' e exonuclease 3'->5'.

10. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição adicionalmente compreende um corante que não é reativo com o ácido nucléico.

11. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o corante é um ou mais materiais selecionados a partir do grupo que consiste em rodamina, tamra, lax, azul de bromofenol, xileno cianol, vermelho de bromocresol, e vermelho de cresol.

12. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição adicionalmente compreende um ou mais materiais selecionados a partir do grupo que consiste em poliol, gelatina, soro al-bumina bovina (BSA), Thesit, e PET-8000.

13. Composição secada para a PCR de partida quente, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é usada para a PCR multiplex, a PCR em tempo real ou a PCR em tempo real quantitativa.

14. Método de preparação da composição secada para a PCR de partida quente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de preparar uma mistura de reação compreendendo tampão de reação, MgCI2,4 tipos de dNTPs, DNA polimerase, piro-fosfato e pirofosfatase em um tubo de reação; e secar a mistura de reação.

15. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de reação adicionalmente compreende um ou mais primers ou sondas.

16. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de reação adicionalmente compreende um corante fluorescente que se liga ao DNA.

17. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o corante fluorescente é selecionado a partir do grupo que consiste em Sy-Br Green, EtBr e HRdye.

18. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de reação adicionalmente compreende ácido nucléico de molde.

19. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o pirofosfato é incluído na concentração de 0,3-5 mM na solução de reação final e a pirofosfatase é incluída na concentração maior do que 30 a 200 mU em 20 pL da solução de reação final.

20. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o pirofosfato é incluído na concentração de 0,95-3,0 mM na solução de reação final.

21. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a pirofosfatase é incluída na concentração de 50-100 mU em 20 pL da solução de reação final.

22. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a DNA polimerase é uma ou mais polimerases selecionadas a partir do grupo que consiste na polimerase tendo a atividade de exonuclease 5'->3', na polimerase tendo a atividade de exonuclease 3'->5', e na polimerase não tendo nenhuma das atividades de exonuclease 5'->3' e exonuclease 3'->5'.

23. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de reação adicionalmente compreende um corante que não é reativo com o ácido nucléico.

24. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o corante é um ou mais materiais selecionados a partir do grupo que consiste em rodamina, tamra, lax, azul de bromofenol, xileno cianol, vermelho de bromocresol, e vermelho de cresol.

25. Método de preparação, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a mistura de reação adicionalmente compreende um ou mais materiais selecionados a partir do grupo que consiste em poliol, gelatina, soro albumina bovina (BSA), Thesit, e PET-8000.

26. Kit para a PCR de partida a quente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma das composições secas para a PCR de partida a quente conforme definidas nas reivindicações 1 a 13.

27. Método para ampliar o ácido nucléico, CARACTERIZADO por utilizar uma das composições secas para a PCR de partida a quente conforme definidas nas reivindicações 1 a 13.

28. Método para ampliar o ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as seguintes etapas: misturar uma amostra contendo ácido nucléico de molde com a composição secada para a PCR de partida quente; realizar uma reação para ampliar a mistura de reação; e analisar o produto ampliado do ácido nucléico de molde.

29. Método para ampliar o ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a PCR é selecionada a partir do grupo que consiste em PCR multiplex, PCR em tempo real e PCR em tempo real quantitativa.