BRPI0401651B1 - métodos e kit para conduzir um ensaio diagnóstico molecular intra-operatório - Google Patents

Abstract

"ensaio de linfonodo intra-operatório". em um ensaio de linfonodo intra-operatório para micrometástase, um cirurgião identifica um nodo de linfa sentinela durante a cirurgia de acordo com métodos conhecidos. os nodos sentinela são removidos e preparados para a extração de ácido nucléico. o ácido nucléico (por exemplo, rna) é então rapidamente extraído dos nodos sentinela. os marcadores indicativos de micrometástase, se presente, são então amplificados e detectados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E KIT PARA CONDUZIR UM ENSAIO DIAGNÓSTICO MOLECULAR INTRA-OPERATÓRIO".

Fundamento A presente invenção refere-se ao campo de diagnósticos moleculares. O envolvimento de linfonodo é o fator prognóstico mais forte em muitos tumores sólidos, e a detecção de micrometástases de linfonodo e de grande interesse para patologistas e cirurgiões. A avaliação de linfonodo corrente envolve exame microscópico de seções de tecido manchado por H&E e sofre de três maiores limitações: (a) células de tumor único, ou pequenos focos de células, são facilmente não achadas; (b) o resultado não é rapidamente disponibilizado, significando que qualquer resultado positivo em um procedimento de linfonodo sentinela requer uma segunda cirurgia para remoção de linfonodos axilares e (c) apenas uma ou duas seções de tecido são estudadas, e desse modo a vasta maioria de cada nodo é deixada não examinada. Seccionamento serial pode ajudar a superar a emissão de erro de amostragem, e imunohistoquímica (IHC) pode ajudar a identificar células de tumor individuais. A combinação destes métodos, entretanto, é muito cara e demorada para análise de rotina e é limitada a casos especiais tais como exame de linfonodo sentinela.

Decisões cirúrgicas são freqüentemente com base em análise de linfonodos de seção congelada intra-operatória; entretanto, a sensibilidade destes métodos é relativamente fraca, variando de 50 a 70% com relação à patologia de H&E padrão, induzindo a uma taxa inaceitavelmente elevada de segundas cirurgias. A sobrevivência de cinco anos de pacientes de câncer de mama estágio 0 e I que não têm envolvimento de linfonodo é de 92% e 87%, respectivamente. Por outro lado, a sobrevivência de cinco anos de pacientes de câncer de mama de estágio tardio que têm envolvimento de lifonodo cai significantemente. Por exemplo, a sobrevivência de câncer de mama Estágio II é de apenas 75%, Estágio III de 46%, e Estágio IV de 13%. Embora pacientes de câncer de mama negativo de nodo tenham sobrevivência melhorada, 20 a 30% de pacientes histologicamente negativos de nodo sofrem reincidência da doença. Isto é o mais provável devido âs limitações de técnicas correntes na detecção de micrometástases incluindo emissões relacionadas à amostragem de nodo e má sensibilidade para detectar células de tumor individuais ou locais de tumor pequenos.

Em adição a uma necessidade de detecção de metástase mais precisa e sensível em nodos de câncer de mama, existe uma necessidade similar de um teste rápido e sensível em nodos de melanoma bem como na detecção mais precisa de margens cirúrgicas, particularmente na fixação intra-operatória. A reação de cadeia de polimerase (PCR) é uma ferramenta poderosa no campo de biologia molecular que poderia ser útil nesta fixação. Esta técnica provê quantidades pequenas de replicação/amplificação de fragmentos de ácido nucléico em quantidades que podem ser analisadas de um modo significativo. Além disso com o desenvolvimento de RT-PCR quantitativa de tempo-real (Q-RTPCR),esta tecnologia tem tomado-se mais segura bem como receptiva à automação. A Q-RT-PCR é menos sujeita à contaminação e fornece quantificação de expressão de gene. Tal quantificação poderia ser aplicada para a detecção de micrometástases em ensaios de nodo de linfa intra-operatórios. A PCR em diagnósticos moleculares, a despeito de suas vantagens, tem diversas limitações que a tornam difícil de aplicar em fixação diagnostica clínica típica, particularmente na fixação intra-operatória.

Uma tal limitação é o tempo que ela tipicamente leva para realizar as diagnoses de PCR. As reações de PCR típica leva horas, não minutos. Diminuir o tempo que ela leva para realizar uma reação de PCR é necessário se a técnica deve ser intraoperatoriamente útil. Além disso, embora a Q-RT-PCR possa fornecer resultados quantitativos, até hoje não se soube de nenhum valor de corte conhecido para distinguir resultados positivos de negativos com base em tal tecnologia nem ficou claro que os fragmentos de ácido nucléico são melhor detectados e correlacionados com a presença de uma micrometástase. Existem também outros métodos para a amplificação e detecção de fragmentos de ácido nucléico e cada um sofre de problemas similares.

Um ensaio de linfonodo molecular intra-operatório que supera as dificuldades existentes seria bem aceito pela comunidade médica.

Sumário da Invenção A invenção é um ensaio de linfonodo intra-operatório para mi-crometástase. Um cirurgião identifica um nodo de linfa sentinela durante a cirurgia de acordo com os métodos conhecidos. Os nodos sentinela são removidos e preparados como abaixo descrito. O ácido nucléico (por exemplo, RNA) é então rapidamente extraído dos nodos sentinela. Os marcadores indicativos de micrometástase, se presente, são então amplificados e detectados. O cirurgião então realiza ação com base no resultado da detecção de tais Marcadores. O ensaio é mais preferivelmente com base em um método de PCR rápido e RT-PCR que permite a execução de uma completa reação de PCR em minutos desse modo permitindo o uso de PCR em diagnoses intra-operatórias para detecção de micrometástases em linfonodos sentinela.

Em um aspecto da invenção, um método diagnóstico molecular intra-operatório inclui as seguintes etapas conduzidas durante o curso de um procedimento cirúrgico: obtenção de uma amostra de tecido de um paciente; extração de RNA da amostra, analisando a amostra por amplificação e detecção de ácido nucléico; e determinação de se a presença de um ou mais Marcadores de expressão de gene excede um valor de corte. O valor de corte pode ser um valor absoluto ou um valor relativo à expressão de um gene de controle.

Em um outro aspecto da invenção, os Marcadores de expressão de gene são fragmentos de ácido nucléico específicos para tecido particular tal como tecido de mama.

Em ainda outro aspecto da invenção, os Marcadores de expressão de gene são fragmentos de ácido nucléico indicativos de malignidade.

Em ainda outro aspecto da invenção as amostras de linfonodos são homogeneizadas e em seguida diluídas para assegurar que RNA suficiente é extraído a despeito de um método de extração aviado.

Em ainda outro aspecto da invenção os Marcadores são aqueles de mamaglobina (Seq. ID N2 17) e ou PIP (Seq ID N2 18), B305D (particularmente, isoforma C, Seq ID N214), B726 (Seq ID N215), GABA (Seq ID N2 16) ou 08E (Seq ID N2 _) no caso de diagnósticos de câncer de mama e tirosinase (Seq ID N2 22) e MART1 (Seq ID N2 21) no caso de melanoma.

Em ainda outro aspecto da invenção, micrometástases são detectadas intra-operatóriamente por um método que inclui as etapas de: obter RNA de um linfonodo sentinela; realizar um método de RT-PCR quantitativo específico para um ou mais genes de interesse e determinar se a presença do Marcador excede um corte predeterminado. O valor de corte pode ser um valor absoluto ou um valor relativo para a expressão de gene de controle.

Todavia, em uma outra modalidade da invenção, kits contêm reagentes para conduzir ensaio de linfonodo intra-operatório para micrometástases.

Descrição Detalhada Métodos intra-operatórios de diagnósticos de câncer são apresentados. Estes métodos empregam um rápido método de extrair ácidos nucléicos de um linfonodo e um método de amplificar e detectar fragmentos de ácido nucléico indicativos de metástase (tais fragmentos são referidos aqui como "Marcadores").

Um importante aspecto dos métodos inventivos é a rápida amplificação e detecção de Marcadores indicativo da expressão de certos genes. Contanto que tais métodos possam ser conduzidos em um período aceitável para um ensaio intra-operatório (isto é, não mais do que cerca de 35 minutos), qualquer método seguro, sensível e específico pode ser empregado. Isto inclui métodos de PCR, métodos de Amplificação de Círculo de Laminação (RCA), métodos de Reação de Cadeia de Ligase (LCR), métodos de Amplificação de Deslocamento de Filamento (SDA), métodos de Amplificação com base em Seqüência de Ácido Nucléico (NASBA), e outros. Os rápidos diagnósticos moleculares envolvidos são mais preferivelmente métodos de PCR quantitativos, incluindo QRT-PCR.

Independente do método de amplificação empregado, é impor- tante adequadamente amostrar o tecido empregado para conduzir o ensaio. Isto inclui excisão apropriada e processamento do linfonodo sentinela bem como a extração de RNA dele. Uma vez obtido, é importante processar os nodos apropriadamente de modo que quaisquer células cancerosas presentes sejam detectadas.

Uma variedade de técnicas está disponível para extrair ácidos nucléicos de amostras de tecido. A prática padrão em cada caso é demorada e pode ser difícil mesmo quando empregando um Kit comercialmente disponível designado para este propósito. Kits de extração de ácido nucléico comercialmente disponíveis típicos gastam pelo menos 15 minutos para extrair o ácido nucléico. Nos métodos da presente invenção, o ácido nucléico é extraído em menos do que 8 minutos e preferivelmente menos do que 6 minutos. Estes métodos de rápida extração são o objeto de um pedido de patente por R. Belly, J. Toner, e J. Backus de igual data e entitulado "Rapid Extraction Of RNA From Cells And Tissues" que é aqui incorporado por referência. O isolamento bem sucedido de RNA intacto geralmente envolve quatro etapas: rompimento eficaz de células ou tecido, desnaturação de complexos de nucleoproteína, inativação de ribonuclease endógena (RNAa-se) e remoção de proteína e DNA contaminante. As propriedades de rompimento e protetoras de tiocianato de guanidínio (GTC) e B-mercaptoetanol para inativar as ribonucleases presentes em extratos celulares os torna rea-gentes preferidos para a primeira etapa. Quando empregado em conjunto com um tensoativo tal como dodecilsulfato de sódio (SDS), o rompimento de complexos de nucleoproteína é conseguido deixando o RNA ser liberado em solução e isolado sem proteína. Diluição de extratos celulares na presença de concentrações elevadas de GTC causa a precipitação seletiva de proteínas celulares ocorrer enquanto que o RNA permanece em solução. A cen-trifugação pode limpar o lisado de proteínas precipitadas e DNA celular e é preferivelmente realizada através de uma coluna. Tais colunas também ci-salham DNA e reduzem a viscosidade da amostra. A purificação RNA é preferivelmente conduzida em um coluna giratória contendo sílica ou outro material. Rompimento de célula e tecido manual pode ser por meio de um moedor de tecido descartável como descrito na Patente dos Estados Unidos n° 4.715.545. O tempo de homogeneização é dentro de 1 a 2 minutos e é mais preferivelmente de 30 a 45 segundos. A amostra pode então ser processada com uma coluna de trituração (por exemplo, QIAshredder, QIAGEN Inc., Valencia, CA, ou substituto adequado) ou com um dispositivo de processamento de RN A tal como o Kit de Homogeneização de Tecido de PCR comercialmente disponível de Omni International (Warrenton, VA) para reduzir sua viscosidade. O RNA é precipitado por meio da coluna giratória como acima descrito e os tempos de centrifugação não são maiores do que 30 segundo. Quando empregando kits de extração de RNA comerciais tais como aqueles disponibilizados pela Qiagen, Inc., a filtragem é empregada em lugar da centrifugação para todas as etapas exceto para a etapa de secagem de coluna. Tipicamente, a amostra é diluída com um volume igual de 70% de etanol antes da aplicação sobre a coluna. Após lavagens por filtragem, a coluna é secada por centrifugação, e o RNA é diluído em água sem RNAase. O RNA é seletivamente precipitado da solução com etanol e ligado a um substrato (preferivelmente, um filtro ou membrana contendo sílica). A ligação de RNA ao substrato ocorre rapidamente devido ao rompimento das moléculas de água pelos sais caotrópicos, desse modo favorecendo a absorção de ácidos nucléicos à sílica. O RNA total ligado é também purificado de sais contaminantes, impurezas proteínas e celulares por etapas de lavagem simples. Finalmente, o RNA total é eluído da membrana pela adição de água sem nuclease. O tempo total deste protocolo rápido é menor do que 8 minutos e preferivelmente menor do que 6 minutos.

Em síntese, o método de rápida extração de RNA envolve as seguintes etapas: (a) obter uma amostra contendo células do sistema biológico, (b) opcionalmente, remover da amostra, células sem RNA de interesse para produzir uma amostra de trabalho, (c) lisar as células contendo RNA que é de interesse e produzir um homogeneizado delas, (d) opcionalmente, diluir o homogeneizado, (e) contatar amostra de trabalho homogeneizada úmida, com um substrato contendo, ou ao qual é afixado, um material o qual o RNA liga-se, (f) deixar a amostra ligar-se ao substrato, (g) remover os contaminantes e interferentes, (h) secar o substrato, e (i) eluir o RNA do substrato; em casos em que a centrifugação é empregada, ela pode ocorrer após as etapas g, h ou i, e vácuo/filtragem é preferivelmente aplicada em etapas de extração.

Os reagentes envolvidos neste rápido processo de extração são: Tampão de Lise/Ligação (preferivelmente, 4,5M de guanidínio-HCI, 10 mM de fosfato de sódio), Tampão de Lavagem I (preferivelmente, 37% de etanol em 5M de guanidina-HCL, 20 mM de Tris-HCL), Tampão de Lavagem II (preferivelmente, 80% de etanol em 20 mM de NaCI, 2 mM de Tris-HCI), Tampão de eluição, e Água duplamente destilada estéril sem nuclease.

Uma vez que a distribuição de células de câncer em nodos não é uniforme, é preferível que múltiplas seções do nodo sejam amostradas. Opcionalmente, um ou mais nodos podem também ser examinados com base em patologia. Um método para executar igualmente um teste com base molecular e um exame da mesma amostra de nodo por patologia é seccionar o nodo em pelo menos quatro seções com uma seção externa e interna empregada para patologia, e uma seção externa e interna para ser empregada para teste molecular. Como a distribuição de metástases e mi-crometástases em tecidos não é uniforme em nodos ou outros tecidos, uma amostra suficientemente grande deve ser obtida de modo que as metástases não sejam escapadas. Um método para esta emissão de amostragem no presente método é homogeneizar uma grande amostra de tecido, e sub-seqüentemente executar uma diluição da amostra homogeneizada bem misturada a ser empregada em subseqüente teste molecular.

Uma reação de PCR típica inclui etapas múltiplas de amplificação, ou ciclos que seletivamente amplificam espécies de ácido nucléico alvo. Uma reação de PCR típica inclui três etapas: uma etapa de desnaturação na qual um ácido nucléico alvo é desnaturado; uma etapa de anelamento na qual um grupo de iniciadores de PCR (iniciadores dianteiro e retrógrado) anela-se aos filamentos de DNA complementares; e uma etapa de alongamento na qual um DNA polimerase termostável alonga os iniciadores. Repetindo esta etapa múltiplas vezes, um fragmento de DNA é amplificado para produzir um amplicon, correspondendo à seqüência de DNA alvo. As reações de PCR típicas incluem 20 ou mais ciclos de desnaturação, anelamento e alongamento. Em muitos casos, as etapas de anelamento e alongamento podem ser executadas coincidentemente, caso em que o ciclo contém apenas duas etapas.

No método inventivo, empregando RT-PCR, a reação de amplificação de RT-PCR é conduzida em um tempo adequado para diagnose intra-operatória, os comprimentos de cada destas etapas pode ser na faixa de segundos, em vez de minutos. Especificamente, com certos novos ciclizado-res térmicos sendo capazes de gerar uma taxa de rampa térmica de pelo menos cerca de 5°C por segundo, amplificações de RT-PCR em 30 minutos ou menos são empregadas. Mais preferivelmente, as amplificações são conduzidas em menos do que 25 minutos. Com isto em mente, os seguintes tempos fornecidos para cada etapa do ciclo de PCR não inclui tempos de rampa. A etapa de desnaturação pode ser conduzidas para tempos de 10 segundos ou menos. De fato, alguns ciclizadores térmicos tem fixações para "0 segundos" que pode ser a duração ideal da etapa de desnaturação. Isto é, é suficiente que o ciclizador térmico atinja a temperatura de desnaturação. As etapas de anelamento e alongamento são mais preferivelmente menores do que 10 segundos cada, e quando conduzidas na mesma temperatura, a combinação das etapas de anelamento/alongamento pode ser menor do que 10 segundos. Alguns métodos de detecção de sonda homogênea, entretanto, pode requerer uma etapa separada para alongamento para ma- ximizar o rápido desempenho de ensaio. A fim de minimizar igualmente o tempo de amplificação total e a formação de reações colaterais não específicas, as temperaturas de anelamento são tipicamente acima de 50°C. Mais preferivelmente as temperaturas de anelamento são acima de 55°C.

Uma única reação combinada para RT-PCR, com nenhuma intervenção experimentadora, é desejável por diversas razões: (1) risco diminuído de erro experimentador, (2) risco diminuído de contaminação de alvo ou produto e (3) velocidade de ensaio aumentada. A reação pode consistir em uma ou duas polimerases. No caso de duas polimerases, uma destas enzimas é tipicamente um DNA polimerase com base em RNA (transcriptase reversa) e uma é uma DNA polimerase com base em DNA termostável. Para maximizar o desempenho de ensaio, é preferivelmente empregar uma forma de tecnologia "hot start” para ambas destas funções enzimáticas. As Patentes dos Estados Unidos nos 5.411.876 e 5.985.619 fornecem exemplos de diferentes métodos "hot start” e são incorporadas aqui por referência. Os métodos preferidos incluem o uso de um ou mais métodos de termoativação que seqüestram um ou mais dos componentes requeridos para polimeriza-ção de DNA eficaz. As Patentes dos Estados Unidos nos 5.550.044 e 5.413.924 descrevem métodos para preparar reagentes para uso em tais métodos. A Patente dos Estados Unidos n° 6.403.341 descreve um método de seqüestramento que envolve alteração química de um dos componentes reagentes de PCR. Todas são aqui incorporadas por referência. Nas modalidades mais preferidas, ambas as atividades de polimerase dependente de DNA e de RNA residem em uma única enzima. Outros componentes que são requeridos para amplificação eficiente incluem trifosfatos de nucleosí-deo, sais divalentes e componentes de tampão. Em alguns casos, estabilizadores de enzima e ácido nucléico não específicos podem ser benéficos.

Esta especificidade de qualquer diagnóstico molecular com base em amplificação mencionado conta intensamente, porém não exclusivamente, com a identidade dos grupos de iniciador. Os grupos de iniciador são pares de iniciadores de oligonucleotídeo dianteiro e reverso que anelam-se a uma seqüência de DNA alvo para permitir amplificação da seqüência alvo, desse modo produzindo um amplicon específico da seqüência alvo. Os inici-adores devem ser capazes de amplificar Marcadores do estado de doença de interesse. No caso da presente invenção, estes Marcadores são direcionados para câncer de mama e melanoma.

No caso de câncer de mama, o método inventivo envolve a amplificação de um marcador de tecido específico para ou tecido de mama ou tecido de câncer de mama. Uma combinação de pelo menos dois Marcadores é empregada tal que detecção clinicamente significante e segura de células de mama e/ou de câncer em linfonodos seja feita quando presente. Preferivelmente, os Marcadores são amplificados e detectados em um único vaso de reação no mesmo tempo (isto é, elas são multiplexadas). Mais preferivelmente, os grupos de iniciador são complementares aos fragmentos de ácido nucléico específicos para aqueles Marcadores. Os Marcadores incluem mamaglobina (Seq ID Ns 17) e um ou mais (preferivelmente um) dos seguintes : B305D (Seq ID Ne 14), PIP (Seq ID N2 18), B726 (Seq ID Ns 15), GABA (Seq ID Ns 16) ou 08E (Seq ID N2 _). A combinação de um marcador específico de tecido e um marcador específico de câncer fornece sensibilidade e especificidade que excede 90% e 95% respectivamente. Alguns marcadores existem em várias isoformas com certas das isoformas sendo mais específicas para um tecido ou câncer do que outras. No caso de B305D, a isoforma mais preferida é a isoforma C de B305D. Ela é também o Marcador mais preferido em combinação com o Marcador de mamaglobina.

No caso de melanoma, o método inventivo envolve a amplificação de marcadores específicos para câncer de melanoma. Desse modo, os grupos de iniciador são complementares aos fragmentos de ácido nucléico específicos para aqueles marcadores. Os Marcadores incluem um ou mais (preferivelmente dois ou mais) dos seguintes: Tirosinase (Seq ID Ns 22) e MART I (Seq ID N2 21). Estes Marcadores fornecem a sensibilidade e especificidade que excede 90%. A reação deve também conter alguns métodos de detecção de um sinal específico. Este é preferivelmente executado através do uso de um reagente que detecta uma região de seqüência de DNA derivada de polime- rização da seqüência alvo de interesse. Os reagentes preferidos para detecção fornecem um sinal mensurável diferencial quando ligados a uma seqüência de ácido nucléico específica de interesse. Freqüentemente, estes métodos envolvem sondas de ácido nucléico que fornecem fluorescência aumentada quando ligadas à seqüência de interesse. O progresso das reações de PCR do método inventivo é tipicamente monitorado analisando-se as taxas relativas de produção de amplicon para cada grupo de iniciador de PCR. A monitoração da produção de amplicons pode ser alcançada por diversos reagentes e métodos de detecção incluindo sem limitação, iniciado-res fluorescentes, sondas fluorogênicas e tintas fluorescentes que ligam DNA de filamento duplo, beacons moleculares, Escorpiões, e outros. Um método comum de monitorar uma reação de PCR emprega um ensaio de 5'nuclease fluorescente. Este método explora a atividade de 5'nuclease de certas DNA polimerases termostáveis (tais como DNA polimerases Taq ou Tfl) para clivar uma sonda oligomérica durante o processo de PCR. O oligô-mero é selecionado para anelar-se à seqüência alvo amplificada sob condições de alongamento. A sonda tipicamente tem um repórter fluorescente sobre sua extremidade 5' e um saciador fluorescente do repórter na extremidade 3'. Contanto que o oligômero seja intacto, o sinal fluorescente do repórter é extinguido. Entretanto, quando o oligômero é digerido durante o processo de alongamento, o repórter fluorescente não está mais em proximidade ao extintor. O acúmulo relativo de repórter fluorescente livre para um dado amplicon pode ser comparado ao acúmulo dos mesmos amplicons para uma amostra de controle e/ou para aquela de um gene de controle, tal como, sem limitação, β-Actina e PBDG (desaminase de porfobilinogênio) para determinar a abundância relativa de um dado produto de cDNA e um dado RNA em uma população de RNA. Produtos e reagentes para o ensaio de 5'nuclease fluorescente são facilmente comercialmente disponibilizados, por exemplo pela Applied Biosystems.

Os preferidos reagentes de detecção são comumente referidos como "Escorpiões" e são descritos nas Patentes dos Estados Unidos nos 6.326.145 e 5.525.494 e incorporadas aqui por referência. Estes reagentes incluem uma ou mais moléculas compreendendo um iniciador caudado e um sistema de sinalização integrado. O iniciador tem uma região de ligação padrão e uma cauda compreendendo um ligador e uma região de ligação alvo. A região de ligação alvo na cauda hibridiza para seqüência complementar em um produto de extensão do iniciador. Este evento de hibridização específica alvo é acoplado a um sistema de sinalização onde a hibridização induz a uma alteração detectável. Em reações de PCR a região de ligação alvo e a região de cauda são vantajosamente dispostas tal que a região de cauda permaneça de filamento único, isto é não copiada. Desse modo a região de cauda não é amplificável nos produtos de amplificação de PCR. O ligador compreende uma porção de bloqueio que previne extensão de cadeia mediada por polimerase sobre o padrão de iniciador. O equipamento e software também são facilmente disponibilizados para controlar e monitorar o acúmulo de amplicon em PCR e QRT-PCR incluindo o termociclizador Smart Cycler comercialmente disponibilizado pela Cepheid of Sunnyvale, Califórnia, e o Sistema de Detecção de Seqüência ABI Prism 7700, comercialmente disponibilizado pela Applied Biosystems.

Nas reações de RT-PCR preferidas, as quantidades de certa transcriptase reversa e os componentes de reação de PCR são atípicos a fim de tirar vantagem dos tempos de rampa mais rápidos de alguns ciclizadores térmicos. Especificamente, as concentrações de iniciador são muito elevadas.

As concentrações de iniciador específicas de gene típicas para reações de transcriptase reversa são menores do que cerca de 20 nM. Para obter uma reação de transcriptase reversa rápida na ordem de um a dois minutos, a concentração de iniciador de transcriptase reversa foi elevada para mais do que 20 nM, preferivelmente pelo menos cerca de 50 nM, e tipicamente cerca de 100 nM. As concentrações de iniciador de PCR Padrão variam de 100 nM a 300 nM. Concentrações mais elevadas podem ser empregadas em reações de PCR padrão para compensar para variações Tm. Entretanto, para os propósitos inclusos, as concentrações de iniciador referenciadas são para circunstâncias onde nenhuma compensação de Tm é necessária. Proporcionalmente concentrações mais elevadas de iniciador podem ser empiricamente determinadas e usadas se a compensação Tm é necessária ou desejada. Para obter rápidas reações de PCR, as concentrações de iniciador de PCR tipicamente são maiores do que 250 nM, preferivelmente maiores do que cerca de 300 nM e tipicamente cerca de 500 nM.

Os diagnósticos comercialmente empregados também preferivelmente empregam o uso de um ou mais controles positivos internos que confirmam a operação de uma reação de amplificação particular para um resultado negativo. Causas potenciais de falsos resultados negativos que devem ser controlados em uma reação de RT-PCR incluem: quantidade de RNA inadequada, degradação de RNA, inibição de RT e/ou PCR e erro ex-perimentador. No caso de ensaios de expressão de gene, é preferível utilizar um gene que é constitutivamente expresso no tecido de interesse. PBGF (Seq ID NQ 20) é um gene que é comumente empregado como um controle interno devido a diversos fatores: ele não contém nenhum pseudogene conhecido em seres humanos, é constitutivamente expresso em tecidos humanos e é expresso em um nível relatívamente baixo e portanto é menos provável de causar a inibição da amplificação de sequências alvo de interesse. Uso de PBGD como um controle minimiza ou elimina o relato de resultados errôneos surgindo de todas as fontes potenciais de resultados negativos falsos.

Na comercialização dos métodos descritos para QRT-PCR, certos kits para detecção de ácidos nucléicos específicos são particularmente úteis. Em uma modalidade, o Kit inclui reagentes para amplificar e detectar Marcadores. Opcionalmente, o Kit incluí reagentes de preparação de amostra e/ou artigos (por exemplo, tubos) para extrair ácidos nucléicos de tecido de nodo de linfa. Os kits podem também incluir artigos para minimizar o risco de contaminação de amostra (por exemplo, bisturi descartável e superfície para preparação e dissecação de linfonodo).

Em um kit preferido, os reagentes necessários para o processo de QRT-PCR de um tubo descrito acima são incluídos tais como transcriptase reversa, um iniciador de transcriptase reversa, um grupo de iniciador de PCR correspondente (preferivelmente para Marcadores e controles), uma DNA polimerase termostável, tal como Taq polimerase, e um reagente de detecção adequado, tal como, sem limitação, uma sonda de escorpião, uma sonda para um ensaio de 5'nuclease fluorescente, uma sonda beacon molecular, um iniciador de corante simples ou um corante fluorescente específico para DNA de filamento duplo, tal como brometo de etídio. Os iniciadores são preferivelmente em quantidades que produzem as concentrações elevadas acima descritas. Os DNA polimerases termostáveis são comumente e comercialmente disponibilizadas por diversos fabricantes. Os materiais adicionais no Kit podem incluir: tubos ou frasconetes de reação adequados, uma composição de barreira, tipicamente uma conta de cera, opcionalmente incluindo magnésio; misturas de reação (tipicamente 10X) para a transcriptase reversa e os estágios de PCR, incluindo tampões e reagentes necessários tais como dNTPs; água sem nuclease ou RNase; inibidor de RNase; ácido(s) nucléico(s) de controle e/ou quaisquer tampões adicionais, compostos, co-fatores, constituintes iônicos, proteínas e enzimas, polímeros, e outros que podem ser empregados em transcriptase reversa e/ou estágios de PCR de reações QRT-PCR. Opcionalmente, os kits incluem reagentes e materiais de extração de ácido nucléico.

Os seguintes exemplos não limitantes ajudam a também descrever a invenção.

Exemplos PCR de Tempo real Exemplos na presente invenção são com base no uso de PCR de tempo-real. Em PCR de tempo real os produtos da reação de cadeia de polimerase são monitorados em tempo real durante a fase exponencial de PCR em vez de por uma medição de ponto final. Portanto, a quantificação de DNA e RNA é muito mais precisa e reproduzível. Os valores de fluorescência são registrados durante todos os ciclos e representam a quantidade de produto amplificado para aquele ponto na reação de amplificação. Quanto mais padrões presentes no início da reação, menor o número de ciclos que ele gasta para alcançar um ponto no qual o sinal fluorescente é primeiro registrado como estatisticamente significante acima da base, que é a definição dos valores (Ct). O conceito do ciclo limite (Ct) provê quantificação precisa e reproduzível empregando-se RT-PCR com base em fluorescência. A detecção homogênea de pro- dutos de PCR é preferivelmente realizada com base em: (a) corantes de ligação de DNA de filamento duplo (por exemplo, SYBR Verde), (b) sondas fluorogêni-cas (por exemplo, sondas Taq Man, Molecular Beacons), e (c) iniciadores rotulados direto (por exemplo, iniciadores Amplifluor).

Exemplo 1. Uma comparação de RNA extraído pelo Método Rápido e por Método da Técnica Anterior com base em PCR de peso real com Ensaios Taqman.

Um total de 16 amostras de nodos positivos H&E e 15nodos de mama negativo de H&E foi adquirido da Genomics Collaborative. Duas partes de 30 mg de tecido foram cortadas de cada nodo.

Parte I (Técnica Anterior). Uma parte de 30 mg de tecido foi processada como segue: 600 ul de Tampão RLT foram adicionados e a amostra de tecido foi homogeneizada manualmente por 20 - 40 segundos por meio de um tritu-rador de tecido descartável (cat 15704-126, VWR Scientific, West Chester, PA). O tubo foi centrifugado durante 3 minutos em velocidade máxima em microcen-trífuga Eppendorf modelo 5415C. O fluído de sobrenadante foi transferido para um novo tubo, e 1 volume de 70% de etanol foi adicionado.

Amostra (700 pL) foi aplicada a uma mini coluna RNeasy colocada em um cano de distribuição de vácuo QIAvac 24 e o vácuo foi aplicado. Tampão RWI (700 pL) e deixada filtrar através da coluna. Tampão RPE (500 pL) foi pipetado sobre a coluna e deixado filtrar através dela. Outros 500 pL de Tampão RPE foram adicionados à coluna, e deixados filtrar através dela. A coluna RNeasy foi colocada em um tubo de coleção de 2 ml e centrifugada em um micrófugo em velocidade máxima durante 1 minuto. O RNA foi então eluído da coluna, transferindo a coluna RNeasy para um novo tubo de coleção de 1,5 ml, adicionando 50 ul de água sem RNAase, e centrifugando durante 1 minuto a 8000 X g.

Parte II (Rápida Extração). A segunda parte de 30 mg de tecido de nodo de mama foi processada por um rápido protocolo como segue: (1) A parte de tecido foi adicionada a 600 pL de Tampão RLT e homogeneizada manualmente durante 20 a 40 segundos por meio de um triturador de tecido descartável. (2) O homogeneizado foi centrifugado através de uma coluna Ql- Ashredder durante 30 segundos em velocidade máxima. (3) 1 volume de 70% de etanol foi adicionado ao lisado e misturado por pipetagem. (4) A amostra foi então aplicada a uma mini coluna RNeasy colocada no cano de distribuição de vácuo QIAvac e um vácuo foi aplicado. (5) 700 ul de Tampão RWI foram adicionados à coluna, e deixados filtrar através da coluna. (6) 500 ul de Tampão RPE foram adicionados sobre a coluna e deixado filtrar através dela. (7) A coluna foi transferida para um tubo de coleção de 2 ml, e centrifugada durante 30 segundos a 10.000 rpm. (8) 25 μΙ_ de água sem RNAa-se foram adicionados à membrana e a coluna foi centrifugada durante 30 segundos a 10.000 rpm para eluir o RNA. Todas as etapas de centrifugação no protocolo rápido foram realizadas em uma centrífuga modelo 10 MVSS VWR. O RNA extraído foi transcrito em reverso, e o RNA e cDNA foram quantificados como previamente descrito.

Para ensaios Taqman, Kit Taqman Core Reagent, Tampão 1 Gene Amp 10X PCR, Amp Erase Uracil N-glicosidase, e AmpliTaq Gold DNA polymerase foram adquiridos da Applied Biosystems, Foster City, CA. Todos os outros reagentes foram de fontes comerciais descritas no exemplo 1. O glicerol foi adquirido das Sigma Chemical Co (St. Louis, Mo.) e Tween 20 de Eastman Organic Chemicals (Rochester, NY).

Iniciadores de mamaglobina (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4) foram sintetizados por Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) e a sonda Taqman de mamaglobina (SEQ ID NO: 7) de Epoch Biosciences (San Diego, CA). Os iniciadores de PBGD (SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9) foram sintetizados por QIAGEN Operon (Alameda, CA), e a sonda (SEQ ID NO: 23) por SYNTHE-GEN, LLC (Houston, TX). Os iniciadores B305D (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12) foram sintetizados na Invitrogen Corp e a sondas (SEQ ID NO: 13) por Applied Biosystems, Inc. Para todas as sondas Taqman, carboxifluores-ceína (FAM) e caitoxitetrametilrodamina TAMRA) foram empregadas como o par de extintor e a tinta.

SEQ ID NO. 3 CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA

SEQ ID NO. 4 TCTGTGAGCC AAAGG TCTTG CAGA

SEQ ID NO. 7 6-FAM- TGTTTATGCA ATTAATATAT GACAGCAGTC

TTTGTG- TAMRA

SEQ ID NO. 8 CTGAGGCACC TGGAAGGAGG

SEQ ID NO. 9 CATCTTCATG CTGGGCAGGG SEQ ID NO. 23 6-FAM-CCTGAGGCAC CTGGAAGGAG GCTGCAG TGT- TAMRA

SEQ ID NO. 11 TCTGATAAAG GCCGTACAAT G

SEQ ID NO. 12 TCACGACTTG CTGTTTTTGC TC

SEQ ID NO. 13 6-FAM-ATCAAAAAACA AGCATGGCCTA CACC-TAMRA

Para os ensaios Taqman, uma mistura mestre foi preparada adicionando-se 10 pL de Tampão#1 10 X PCR, 14 pL de 25 mM de MgCI2,8 pL de 10 mM de dNTP's, 1 pL de AmpErase UNG (1 U/pL), 16 pL de glicerol, 1 pL de 1% de peso/volume de Tween 20, 0,75 pL de AmpliTaq Gold (5 U/pL), 6 pL de cada iniciador de uma cepa de 5 pM, 0,4 pL de um estoque de 10 pM de sonda, e água para um volume final de 96 pL. Mistura mestre (48 pL) e 2 pL de cDNA de cada amostra de nodo foram adicionados a cada cavidade de placa de microtítulo de reação óptica. Após tampar com tampas ópticas, as placas foram processadas em um Sistema de Detecção de Se-qüência ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Os reagentes comerciais incluindo Kit Taqman PCR Core Reagent, Taqman DNA Template Reagents, e Taqman B-actin Detection Reagents foram adquiridos da Applied Biosystems (Foster City, CA) e o ensaio foi executado de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Um valor limite de 0,02 foi empregado para análise com o ensaio de mamaglobina, 0,03 para o ensaio B305D, 0,08 para o ensaio de B-actina, e 0,1 para o ensaio de PBDG. A média de determinação triplicada por ensaios Taqman é mostrada nas Tabelas 3 e 4.

Uma comparação da medição de tempo real dos genes domésticos B-actina e PBDG é mostrada na Tabela 1 em 15 amostras de nodo negativo de H&E bem como 16 amostras de nodos positivo de H&E e duas amostras de cDNA de controle são mostradas na Tabela 1. Resultados destas experiências indicam boa concordância entre valores Ct obtidos com o rápido método desta invenção e métodos comerciais padrão (QIAGEN) confirmando que o RNA extraído pelo protocolo de extração de RNA rápido é capaz de ser transcrito em reverso e PCR amplificado para uma extensão similar como RNA extraído com base em um protocolo comercial padrão. A Tabela 2 compara os resultados de expressão de gene com base no valor Ct para os marcadores de câncer de mama mamaglobina e B305D com as mesmas amostras de nodo de mama avaliadas na Tabela 1. Para determinar se a correlação pode ser feita entre amostras de nodo de mama positivo de H&E e negativo de H&E com base nos resultados de PCR de tempo real, o menor valor Ct para cada marcador nas amostras de nodo negativo de H&E foi identificado por ambos mamaglobina e B305D. Um corte arbitrário, porém conservativo de valores de 2,5 Ct menores do que este menor valor entre as amostras de H&E negativo foi aplicado às amostras de H&E positivo. Amostras que são projetadas na Tabela 2 têm expressão mais elevada para estes dois marcadores de mama, em que o valor Ct é pelo menos valores de 2,5 Ct menores do que um valor Ct observado entre amostras de H&E negativo. Houve uma boa correlação em expressão destes marcadores empregando igualmente o método rápido desta invenção e o protocolo recomendado pelo fabricante comercial (QIAGEN).

Empregando mamaglobina como um marcador, valores Ct em duas amostras entre as 15 amostras de nodos de H&E não correlacionam-se rigorosamente entre o método rápido desta invenção e os protocolos de extração de RNA QIAGEN. Em uma destas amostras, GCLNC-24, a diferença em valor Ct foi de 0,4 que inclui-se no erro experimental. A segunda amostra mostrou uma diferença maior em Ct. Diferenças maiores em valor Ct com ambos mamaglobina e B305D podem ser devido à dificuldades em quantificação espectral de RNA nestas amostras, bem como a possíveis problemas de amostragem devido à distribuição não uniforme bem estabelecida de metástases em nodos. (Csemi, 1999. Metástases em nodos de linfa sentinela axilar em câncer de mama como detectado por elaboração histopatológica intensiva. J. Clin Pathol, 52:0922-924.) Tabela 1: Comparação de RNA extraído pelo método rápido e Método da Técnica Anterior como avaliado por Ensaios Taqman para os Genes Domésticos B-actina e PBDG.

Tabela 2: Comparação de RNA extraído pelo método rápido e pelo Método da Técnica Anterior como avaliado por Ensaios Taqman para os Genes de Câncer Mamaglobina e B305D.

Exemplo 2. Avaliação de uma Coluna QIAshredder É o propósito deste exemplo demonstrar que a coluna QIAshre-dder pode ser empregada após a homogeneização de tecido de nodo de linfa, e que a centrifugação do homogeneizado durante apenas 30 segundos produz extração de RNA aceitável.

Um nodo auxiliar de mama que foi H&E negativo foi obtido de Genomics Collaborative (Cambridge, MA). Uma fatia de 490 mg de tecido foi misturada com 5,5 ml de Tampão RLT, e o nodo foi homogeneizado. Seiscentos microlitros de homogeneizado foram removidos e o RNA foi extraído empregando-se a rápida extração descrita no Exemplo 1. Como um controle, outros 600 μΙ_ de homogeneizado foram tratados empregando-se o mesmo método de extração rápida de RNA exceto que uma centrifugação de 3 minutos foi empregada ao invés da coluna QIAshredder. O RNA de cada reação foi transcrito em reverso e quantificado como descrito no Exemplo 1. A PCR de tempo real foi realizada empregando-se sondas Taqman.

Resultados destes estudos indicaram produções de RNA similares de 0,31 pg^L no protocolo envolvendo o protocolo QIAshredder quando comparado a 0,34 μρ/μΐ. no protocolo de centrifugação. Relação de 260/280 nm de 2,1 idêntica foi obtida em ambas as amostras indicando RNA de qualidade elevada. Os ensaios de PCR de tempo real também indicaram valores Ct similares para Mamaglobina com RNA extraído pela coluna QIAshre-dder quando comparado ao protocolo envolvendo (22,5 versus 22,0), bem como com B305D (26,7 versus 26,6) bem como com os genes domésticos PBDG (29,1 versus 29,0), e B-actina (SEQ ID NO: 19,18,5 versus 18,2).

Em síntese, esta experiência indica resultados de produção de RNA, qualidade e amplificação de PCR de tempo real similares, com o protocolo envolvendo uma QIAshredder ao invés de uma etapa de centrifugação de 3 minutos após a homogeneização. Isto reduz o tempo requerido para realizar a extração de RNA em 2,5 minutos, o que é importante em desenvolvimento de protocolos adequados para aplicações intra-operatórias e outras, nas quais resultados rápidos são requeridos para impactar cuidados do paciente.

Exemplo 3. Efeito de Diluição de Usado em produção e precisão de RNA. 0 seguinte exemplo ilustra o efeito de diluição do lisado em produção de RNA e precisão de recuperação de RNA. Neste exemplo, 20 mg, 10 mg ou 5 mg de tecido de nodo de porco congelado foram cortados. O tecido foi moído empregando-se um Trituradorde Tecido Descartável de 50 ml durante 30 segundos, e as amostras foram vortexadas. Três réplicas foram realizadas para cada peso de nodo. Um ml de cada lisado foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml que foi então centrifugado em um micrófugo Eppendorf em velocidade máxima (14.000 RPM) durante 30 segundos. Setecentos microlitros foram centrifugados através de uma coluna QIAshredder e as amostras foram centrifugadas em velocidade máxima durante 30 segundos. A coluna foi então lavada, a coluna secada, e o RNA eluído como descrito previamente no Exemplo 2, Parte I, etapas 4 - 8. O RNA foi quantificado por meio de um Gene Spec II. Os resultados destes estudos são mostrados nas Tabelas 3 e 4, e ilustram excelente precisão em um peso de tecido de nodo inicial de 2,5 mg homogeneizados em 600 ml de tampão de homogeneização, quando comparado às amostras com pesos maiores incluindo 10 mg e 20 mg de tecido de nodo. Estes resultados indicam que precisão melhorada de recuperação de RNA pode ser obtida em menor peso de nodo. Além disso, espera-se que mais homogeneizados diluídos sejam filtrados mais rápido através de coluna, e que exista ainda menos problemas potenciais com entupimento de filtro.

Tabela 3. Efeito de Diluição de Lisado em Recuperação de RNA.

Tabela 4. Efeito de Diluição Exemplo 4: Teste TaqMan de RNA de amostras de nodo de linfa.

Transcrição Reversa cDNA foi sintetizado de 20 ug de RNA total a 42°C durante 60 minutos em uma reação de 250 ul contendo 50 mm de Tris-CI pH 8,3, 75 mm de KCI, 3 mM de MgCI2,10 mM de DTT, 2000U de Superscript, 400U de Rnasina, 2 ug de iniciador digo dT, 0,08 mg/ml de BSA e 0,2 mM de cada dACT, dCTP, dGTP e TTP. O cDNA resultante foi diluído 1:8 em água. Amplificação de PCR 2 ul de cada cDNA diluídos foram amplificados no Applied Biosystems 7900 com um volume total por cavidade de 50 ml. A amplificação foi realizada com o seguinte protocolo: 50°C durante 2 minutos e 95°C durante 10 minutos, então 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos (sec), 60°C durante 1 minuto (58°C durante B726) e 68°C durante 1 minuto. Os componentes de mistura de reação e concentrações finais são como segue: Tampão A 1X TaqMan (ABI), 3,5 mM de MgCI2, 0,2 mM de dGTP, dCTP e cATP, 0,4 mM de dUTP (ABI), 0,01 u/ul AmpErase UNG (ABI), 0,0375 U/ul Ampli-Taq Gold (ABI), 8% de Glicerol (Sigma), 0,01% Tween 20 (Kodak), 0,3 uM de cada iniciador (Invitrogen), água livre de RNase/DNase (Sigma) e 40 nM 5-FAM, sonda de oligonucleotídeo 3' TAMRA (Synthegen). Um limite de si- nal relativo para um corante de referência interna (ROX) foi designado para cada grupo de iniciador/sonda na faixa linear logarítmica do aumento em intensidade fluorescente causado pelo aumento em produto de PCR. Os valores Ct resultantes foram utilizados para determinar expressão relativa dos genes através de todas as amostras testadas.

Iniciadores utilizados: Mamaglobina Iniciador 1, SEQ ID NO 3 - CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA

Iniciador 2, SEQ ID NO 4 - TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA

Sonda, SEQ ID NO 7 - FAM-TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTT

TGTG-TAMRA

B305D

Iniciador 1, SEQ ID NO 11 - TCTGATAAAGGCCGTACAATG Iniciador 2, SEQ ID N012 - TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC Sonda, SEQ ID NO 24 - FAM ATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACACC PBGD

Iniciador 1, SEQ ID NO 25 - CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA

Iniciador 2, SEQ ID NO 26 - CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA

Sonda, SEQ ID NO 23 - FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT

-TAMRA

PIP

Iniciador 1, SEQ ID NO 27 - GCTTGGTGGTTAAAACTTACC

Iniciador 2, SEQ ID NO 28 - TGAACAGTTCTGTTGGTGTA

Sonda, SEQ ID NO 29 - FAM-CTGCCTGCCTATGTGACGACAATCCGG- TAMRA

GABA

Iniciador 1, SEQ ID NO 30 - CAATTTTGGTGGAGAACCCG

Iniciador 2, SEQ ID NO 31 - GOTGTCGGAGGTATATGGTG

Sonda, SEQ ID NO 32 - FAM CATTTCAGAGAGTAACATGGACTACACA

TAMRA B726 Iniciador 1, SEQ ID NO 33 - GCAAGTGCCAATGATCAGAGG

Iniciador 2, SEQ ID NO 34 - ATATAGACTCAGGTATACAGACT Sonda, SEQ ID NO 35 - FAM TCCCATCAGAATCCAAACAAGAGGAAG RESULTADOS: A tabela anexa contém os valores Ct obtidos para 11 nodos de linfa de histologia negativa e 24 de histologia positiva. Um corte para positi-vidade para cada marcador foi determinado por subtração de 2,5 ciclos do menor Ct observado com as amostras de histologia negativa. As amostras positivas são denotadas sombreamento. Com base nestes critérios, as taxas de detecção para os marcadores individuais foram determinadas. A com-plementação ideal é observada com mamaglobina combinada com B305D A/C, uma combinação que detecta 23/24 amostras de histologia positiva. Uma combinação de mamaglobina, B305D e GABA detectou todas as 24 amostras. Veja a Tabela 5.

Continuação Corte de 33,8 32,3 33,3 33,6 37,5 Amostras positivas 19/24 17/24 21/24 10/24 11/24 detectadas Tabela 5 Exemplo 5. Marcadores Múltiplos Transcrição Reversa O cDNA foi sintetizado de 20 ug de RNA total a 42°C durante 60 minutos em uma reação de 100 ul utilizando iniciadores dT de oligo ancorado. 20 ng de cada cDNA diluídos foram amplificados sobre o Applied Biosystems 7900 com um volume total por cavidade de 50 ml. A amplificação foi realizada com o seguinte protocolo: 94°C durante 2 minutos, em seguida 50 ciclos de: 94°C durante 15 segundos, 62°C durante 15 segundos e 72°C durante 45 segundos. Os componentes da mistura de reação e as concentrações finais são como segue: Tampão de 1X PCR (ABI), 2,5 mM final de MgCI2, 0,05 mM de dGTP, dCTP e cATP, e TTP, 0,05 U/ul de Taq polimera- se contendo um excesso de 5-20 X de 2 anticorpos anti-Taq (TP4-9 e TP1-12), 0,2 uM de cada iniciador (Invitrogen), água sem RNase/DNase (Sigma) e uma diluição de 1:20000 de um estoque de SYBR Verde (Sigma). As se-qüências de iniciador de amplificação foram idênticas àquelas empregadas em teste TaqMan de linfonodos. Um limite de 275 unidades de fluorescência utilizadas para determinar valores Ct. Os valores Ct foram então convertidos em expressão de gene quantitativa e plotadas com relação a um corte que foi assumido para aproximar o nível mínimo de expressão de gene requerido para diferenciar os linfonodos metastáticos de expressão de base.

Iniciadores utilizados: Mamaglobina Iniciador 1, SEQID NO: 3 CAMCGG ATG AAACT CT GAGCAATGTTG A Iniciador 2, SEQ ID NO: 4 TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA B305D

Iniciador 1, SEQ ID NO: 11 - TCTGATAAAGGCCGTACAATG Iniciador 2, SEQ ID NO: 12 - TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC

Estes dados exibidos na Tabela 6 - 8 Mostra o poder de combinar os genes de assinaturas mamaglobina e B305D para obter a cobertura da vasta maioria de amostras de câncer de mama.

Tabela 6.

Expressão de Mamaglobina em Diferentes Tipos de Célula de Mama.

Tabela 7 Expressão de B305D em Diferentes Tipos de Célula de Mama Tabela 8 Expressão Combinada de Mamaglobina & B305D em Diferentes Tipos de Célula de Mama.

Exemplo 5: RT-PCR rápido de RNA purificado RNA de transcrição in vitro de mamaglobina (100.000 cópias) foi diluído em 20 ng de RNA de célula sangüínea branca e submetido a amplificação de RT-PCR de uma etapa em um Cepheid Smart Cycler II em uma reação contendo o seguinte: 50 mM de Bicina/KOH, pH 8,2, 115 mM de Acetato de Potássio, 8% de volume/volume Glicerol, 0,2 mg/ml de BSA, 150 mM de Trealose, 0,2% de v/v de Tween 20, 0,2 mM de Tris-CI pH 8, 3,5 mM de MnS04, 0,3 mM de dATP, 0,3 mM de dCTP, 0,3 mM de dGTP, 0,3 mM de TTP, 100 U/ml Tth, 20 ug/ml de Anticorpo TP6-25.3, 0,45 uM de Escorpião de Mamaglobina e 0,5 uM de Iniciador de Mamaglobina.

As condições foram como segue o asterisco denotou a porção de ciclização na qual a fluorescência foi medida: Condição A - 95°C durante 3 segundos, 60°C durante 7 minutos, 70°C durante 2 minutos, então 40 ciclos de 95°C durante 3 segundos, 54°C durante 6 segundos* e 68°C para 6 segundos - tempo total = 34 minutos.

Condição B - 95°C durante 3 segundos, 60°C durante 3 minutos, então 40 ciclos de 95°C durante 3 segundos, 54°C durante 6 segundos* e 68 para 6 segundos - tempo total = 29 minutos.

Condição C - 95°C durante 3 segundos, 60°C durante 3 minutos, então 40 ciclos de 95°C durante 3 segundos, 58°C durante 6 segundos* e 68 para 6 segundos - tempo total = 26 minutos.

Os resultados deste ensaio são mostrados na seguinte tabela: Como pode ser observado a partir dos dados, a redução da duração da etapa de transcrição reversa de 9 minutos para 3 minutos não tem nenhum impacto discernível sobre o desempenho do ensaio. O aumento da temperatura de anelamento para 58°C tem apenas um impacto mínimo de amplificação e reduz o tempo de RT-PCR total para 26 minutos. Outras re- duções em tempo de ciclização podem ser realizadas por construção de ini-ciador e sonda com temperaturas de ensaio ideal mais elevadas.

Exemplo 6: Ensaio RT-PCR multiplex rápido para detecção de metásta-se de linfonodo (Profético) Neste exemplo, RNA de linfonodo purificado (> 100 ng de RNA total por 100 ul de reação utilizados para reduzir o número de ciclos requerido para gerar um resultado positivo) é submetido a amplificação de RT-PCR de uma etapa em um Ciclizador II Cepheid Smart. A reação contém os seguintes componentes: 50 mM de Bicina / KOH, pH 8,2, 115 mM de Acetato de Potássio, 8% de v/v Glicerol, 0,2 mg/ml de BSA, 150 mM de Trealose, 0,2% de v/v de Tween 20, 0,2 mM de Tris-CI pH 8, 3,5 mM de MnS04 ou Mn(acetato), 0,3 mM de dATP, 0,3 mM de dCTP, 0,3 mM de dGTP, 0,3 mM de TTP, 100 U/ml Tth, 20 ug/ml de Anticorpo TP6-25,3, 0,4 - 0,8 uM de cada Escorpião e iniciador. As seqüências de escorpião e de iniciador são projetadas tal que os eventos de preparação não específica sejam minimizados e tal que eles sejam compatíveis com detecção/amplificação multiplexada com o seguinte perfil de RT-PCR rápida. 95°C durante 3 segundos, 60°C durante 3 minutos, então 32 ciclos de: 95°C durante 1 segundo, 65°C durante 6 segundos* e 72°C durante 3 segundos - tempo de amplificação total = 16 minutos. O método de preparação de amostra rápido descrito é utilizado que gasta < 4 minutos para concluir (refere-se ao exemplo prep. de amostra em aplicação), induzindo a um tempo de ensaio total < 20 minutos.

Para detecção de metástase de câncer de mama para linfono-dos, os seguintes genes são amplificados: mamaglobina, B305D e PBGD. O sinal de B305D e/ou Mamaglobina é indicativo de metástase, enquanto que PBGD é utilizado como um gene doméstico. Neste exemplo, os valores Ct para linfonodos de câncer positivo variam de 12 a 30 para mamaglobina e 12 a 28 para B305D - detecção de qualquer dos genes nesta faixa de Ct é indicativa de um linfonodo de câncer positivo. Neste exemplo, os valores Ct para o gene PBGD de controle devem incluir-se na faixa de 24 a 30 ciclos a fim de um resultado de câncer negativo ser considerado válido.

Para a detecção de metástase de câncer de melanoma para linfonodos, as mesmas condições são utilizadas, com as seguintes exceções: (1) linfonodos suspeitos de conter melanoma são processados e (2) os seguintes genes são amplificados: MARTI, tirosinase e PBGD. Sinal de tiro-sinase e/ou MARTI é indicativo de metástase de melanoma para os linfonodos, enquanto que o PBGD é utilizado como um gene doméstico. Neste exemplo, os valores Ct para linfonodos de câncer positivo variam de 18 a 30 para tirosinase e 12 a 27 para MARTI - a detecção de qualquer dos genes nesta faixa é indicativo de um linfonodo de câncer positivo. Neste exemplo, os valores Ct para o PBGD de gene de controle devem incluir-se na faixa de 24 a 30 ciclos a fim de um resultado de câncer negativo ser considerado válido.

REIVINDICAÇÕES

Claims (20)

1. Método de conduzir um ensaio diagnóstico molecular intra-operatório, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: utilizar uma amostra de tecido de linfonodo de um paciente; analisar a amostra por amplificação e detecção de ácido nucléico; e determinar se a presença de mais do que um Marcador excede um valor de corte.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é empregado para detectar micrometástase.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é empregado para detectar metástase de câncer de mama.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é empregado para detectar metástase de melanoma.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os Marcadores detectam a expressão de um gene correspondendo à Seq ID Ne 17 e um ou mais do grupo consistindo em Seq ID Nos: 14 a 16, Seq IDNe18.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amplificação e detecção de ácido nucléico é conduzida por PCR.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é empregado para detectar micrometástase.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é empregado para detectar metástase de câncer de mama.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é empregado para detectar metástase de melanoma.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os Marcadores são Seq ID Ne 21 e Seq ID Ne 22.

11. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida PCR é RT-PCR.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a reação de transcrição reversa é conduzida durante menos do que 9 minutos.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a reação de transcrição reversa é conduzida durante menos do que 3 minutos.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que um ou mais reagentes de controle interno é adicionado à reação de transcrição reversa.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RNA é extraído do linfonodo (a) lisando-se as células contendo RNA que é de interesse e produzindo um homogeneizado delas, (b) opcionalmente, diluindo o homogeneizado, (c) contatando-se a amostra de trabalho homogeneizada, úmida, com um substrato contendo, ou ao qual é afixado, um material ao qual o RNA liga-se, (d) deixando a amostra ligar-se ao substrato, (e) removendo os contaminantes e interferentes, (f) secando-se o substrato, e (g) eluindo o RNA do substrato; e empregando a filtragem em etapas de extração.

16. Kit para conduzir um ensaio de linfonodo intra-operatório, caracterizado pelo fato de que compreende: reagentes de detecção e amplificação de ácido nucléico.

17. Kit de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os referidos reagentes compreendem iniciadores tendo seqüên-cias para detectar a presença de um grupo de Marcadores selecionados do grupo consistindo em Seq ID Ne 14 -18 e Seq ID Ne21 - 22.

18. Kit de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os iniciadores são selecionados do grupo consistindo em Seq ID Nos. 1-6,812,25 - 28,30 e 33-35.

19. Kit de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende reagentes de RT-PCR.

20. Método compreendendo conduzir um ensaio diagnóstico molecular intra-operatório e tratar um paciente de acordo com o resultado de tal ensaio, caracterizado pelo fato de que o ensaio compreende as etapas de: obter uma amostra de tecido de linfonodo do paciente; analisar a amostra por detecção e amplificação de ácido nucléico; e determinar se a presença de mais do que um Marcador excede um valor de corte.