ES2321131T3 - Ensayo intraoperativo de ganglios linfaticos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de realización de un ensayo intraoperativo de diagnóstico molecular para su empleo en la detección de metástasis de melanoma, que comprende las etapas de: análisis de una muestra de tejido de ganglio linfático de un paciente por extracción de ARN del ganglio linfático; amplificación y detección del ácido nucleico; y determinación de si la presencia de más de un marcador excede un valor de corte, en el que el mencionado ARN se extrae en menos de 8 minutos y en el que el procedimiento se realiza en un período de no más de 35 minutos.
Description
Ensayo intraoperativo de ganglios
linfáticos.
Esta invención se refiere al campo del
diagnóstico molecular.
La implicación de ganglios linfáticos es el
factor pronóstico más fuerte en muchos tumores sólidos y la
detección de micrometástasis de ganglios linfáticos es de gran
interés para los patólogos y cirujanos. La evaluación actual de
ganglios linfáticos implica el examen microscópico de cortes de
tejido teñidos con H&E y tiene tres limitaciones importantes:
(a) se pierden fácilmente células individuales de tumores o focos
pequeños de células; (b) el resultado no se consigue rápidamente,
lo que significa que cualquier resultado positivo en un
procedimiento de ganglio linfático centinela requiere una segunda
cirugía para eliminar ganglios linfáticos axilares y (c) sólo se
estudian uno o dos cortes de tejido, por lo que la vasta mayoría de
cada ganglio no se examina. La realización de cortes en serie ayuda
a obviar la cuestión de errores en el muestreo y la
inmunohistoquímica (IHC) puede ayudar a identificar células
tumorales individuales. La combinación de estos procedimientos, sin
embargo, es demasiado costosa y requiere mucho tiempo para análisis
de rutina, estando limitada a casos especiales tales como el examen
de ganglios linfáticos centinelas.
Con frecuencia, las decisiones quirúrgicas están
basadas en el análisis intraoperativo de cortes congelados de
ganglios linfáticos; sin embargo, la sensibilidad de estos
procedimientos es relativamente mala, oscilando de
50-70% con respecto a la patología estándar de
H&F, lo que conduce a una cuantía inaceptablemente alta de
cirugías secundarias. La supervivencia de cinco años de pacientes de
cáncer de mama en etapas 0 y I que no tienen implicación de
ganglios linfáticos es de 92% y 87%, respectivamente. Por otra
parte, La supervivencia de cinco años de pacientes con cáncer de
mama en etapas más tardías que tienen implicaciones de ganglios
linfáticos disminuye significativamente. Por ejemplo, la
supervivencia de pacientes con cáncer de mama en etapa II es de
sólo 75%, en etapa III de 46% y en etapa IV de 13%. Aunque los
pacientes de cáncer de mama de ganglios histológicamente negativos
han mejorado su supervivencia, 20-30% de los
pacientes de ganglios histológicamente negativos adolecen de
enfermedad recurrente. Muy probablemente, esto es debido a
limitaciones de las técnicas en curso para la detección de
micrometástasis, incluidas cuestiones relacionadas con el muestreo
de ganglios y la mala sensibilidad para detectar células
individuales de tumores o focos pequeños de tumores.
Además de la necesidad de una detección más
precisa y sensible de metástasis en ganglios de cáncer de mama, hay
una necesidad similar de un ensayo rápido y sensible de ganglios de
melanoma así como de una detección más precisa de márgenes
quirúrgicos en particular en la actuación intraoperativa.
La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es una
herramienta poderosa en el campo de la biología molecular que
podría ser útil en esta actuación. Esta técnica permite la
replicación/amplificación de pequeñas cantidades de fragmentos de
ácidos nucleicos en cantidades que se pueden analizar de manera
significativa. Además, con el desarrollo de la
RT-PCR (Q-RT-PCR)
cuantitativa en tiempo real, esta tecnología se ha hecho más fiable
así como posible de ser automatizada. La
Q-RT-PCR está menos sometida a la
contaminación y proporciona la cuantificación de la expresión de
genes. Tal cuantificación se podría aplicar para la detección de
micrometástasis en ensayos intraoperativos de ganglios linfáticos.
La PCR en el diagnóstico intramolecular, a pesar de sus ventajas,
tiene varias limitaciones que hacen que sea difícil de aplicar en la
práctica diagnóstica clínica típica, en particular, en la práctica
intraoperativa.
Una de tales limitaciones es el tiempo que se
tarda en realizar las diagnosis por PCR. Las típicas reacciones de
PCR duran horas, no minutos. Es necesario disminuir el tiempo que se
tarda en realizar una reacción de PCR si la técnica ha de ser útil
intraoperativamente. Además, aunque la
Q-RT-PCR puede proporcionar
resultados cuantitativos, hasta ahora no se han conocido valores de
corte para distinguir resultados positivos de los negativos basados
en tal tecnología ni se ha aclarado qué fragmentos de ácidos
nucleicos se detectan mejor y se correlacionan con la presencia de
micrometástasis. Existen también otros procedimientos para la
amplificación y detección de fragmentos de ácidos nucleicos y cada
uno adolece de problemas similares.
La comunidad médica aceptaría un ensayo de
ganglios linfáticos molecular intraoperativo que obviara las
dificultades existentes.
El procedimiento es un ensayo de ganglios
linfáticos intraoperativo para micrometástasis. Un cirujano
identifica un ganglio linfático centinela durante la cirugía de
acuerdo con procedimientos conocidos. Se eliminan ganglios
centinelas y se preparan como se describe más adelante. Luego se
extrae rápidamente ácido nucleico (por ejemplo, ARN) de los
ganglios centinelas. Se amplifican y detectan luego marcadores
indicativos de micrometástasis. El cirujano actúa luego basándose
en el resultado de la detección de tales marcadores.
El ensayo se basa muy preferiblemente en un
procedimiento rápido de PCR y RT-PCR que permita la
ejecución de una reacción de PCR completa en minutos, lo que
permite el uso de PCR en diagnosis intraoperativas para detectar
micrometástasis en ganglios linfáticos centinelas.
En un aspecto de la descripción, un
procedimiento diagnóstico molecular intraoperativo incluye las
siguientes etapas realizadas en el transcurso de un procedimiento
quirúrgico: obtención de una muestra de tejido de un paciente;
extracción de ARN de la muestra; análisis de la muestra por
amplificación y detección de ácido nucleico; y determinación de si
la presencia de uno o más marcadores de expresión de genes excede un
valor de corte. El valor de corte puede ser un valor absoluto o un
valor relativo respecto a la expresión de un gen de control.
En otro aspecto de la descripción, los
marcadores de expresión de genes son fragmentos de ácido nucleico
específicos para un tejido particular, tal como un tejido de
mama.
En otro aspecto más de la descripción, los
marcadores de expresión de genes son fragmentos de ácido nucleico
indicativos de malignidad.
En otro aspecto más de la descripción, las
muestras de ganglios linfáticos se homogeneizan y diluyen para
asegurar que se ha extraído suficiente ARN a pesar del procedimiento
de extracción acelerado.
En otro aspecto más de la descripción, los
marcadores son los de mamaglobulina (Sec ID nº. 17) y PIP (Sec. Nº.
18), B305D (en particular, isoformo C, Sec. ID. nº. 14), B726 (Sec.
ID nº.15), GABA (Sec. ID nº. 16) o OBE (Sec. ID. nº. ) en el caso
de diagnósticos de cáncer de mama y tirosinasa (Sec. ID nº. 22) y
MART 1 (Sec ID nº. 21) en el caso de melanoma.
En otro aspecto más de la invención, las
micrometástasis se detectan intraoperativamente por un procedimiento
que incluye las etapas de obtención de ARN de un ganglio linfático
centinela; realización de un procedimiento cuantitativo de
RT-PCR específico para uno o más genes de interés y
determinación de si la presencia del marcador excede un corte
predeterminado. El valor del corte puede ser un valor absoluto o un
valor relativo respecto a la expresión de un gen de control.
En todavía una realización más de la invención,
los equipos contienen reactivos para realizar ensayos
intraoperativos de ganglios linfáticos por micrometástasis.
Se presentan procedimientos intraoperativos para
diagnósticos de cáncer. Estos procedimientos emplean un
procedimiento rápido de extracción de ácidos nucleicos de un
ganglio linfático y un procedimiento de amplificación y detección
de fragmentos de ácido nucleico indicativos de metástasis
(fragmentos que se denominan aquí "marcadores").
Un aspecto importante de los procedimientos es
la rápida amplificación y detección de los marcadores indicativos
de la expresión de ciertos genes. Con tal que tales procedimientos
se puedan realizar en un período aceptable para un ensayo
intraoperativo (esto es, de no más de aproximadamente 35 minutos),
se puede usar cualquier procedimiento fiable, sensible y
específico. Esto incluye procedimientos de PCR, procedimientos de
amplificación circular rodante (RCA), procedimientos de reacción en
cadena de ligasa (LCR), procedimientos de amplificación por
desplazamiento de cadena (SDA), procedimientos de amplificación
basados en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) y otros. Los
diagnósticos moléculares rápidos implicados son muy preferiblemente
procedimientos cuantitativos de PCR, incluida la
QRT-PCR.
Independientemente del procedimiento de
amplificación empleado, es importante tomar adecuadamente la muestra
de tejido usada para realizar el ensayo. Esto incluye el corte y el
procesamiento apropiados del ganglio linfático centinela, así como
la extracción del ARN de él. Una vez obtenidos, es importante
procesar apropiadamente los ganglios de manera que se detecten
cualesquiera células cancerosas presentes.
Para extraer ácidos nucleicos de muestras de
tejidos hay disponibles una variedad de técnicas. La práctica
estándar en cada caso requiere tiempo y puede ser difícil incluso
cuando se usa un equipo comercialmente disponible diseñado a este
fin. Los típicos equipos comerciales disponibles para la extracción
de ácido nucleico tardan como mínimo 15 minutos en extraer el ácido
nucleico. En los procedimientos de la presente invención, el ácido
nucleico se extrae en menos de 8 minutos y, preferiblemente, en
menos de 6 minutos. Estos procedimientos rápidos de extracción son
el objeto de una solicitud de patente europea; presentada el mismo
día que esta solicitud reivindicando prioridad de la solicitud de
patente de Estados Unidos US 2004/219534, presentada el 1 de mayo
de 2003; teniendo la referencia de agente PO37591EP; teniendo como
inventores a R. Belly, J. Toner y J. Backus, y titulada
"Extracción Rápida de ARN de Células y Tejidos".
El aislamiento satisfactorio del ARN intacto
generalmente implica cuatro etapas: desmoronamiento eficaz de
células o tejidos, desnaturalización de complejos nucleoproteínicos,
inactivación de ribonucleasa endógena (ARNasa) y eliminación de ADN
y proteína contaminantes. Las propiedades de desmoronamiento y
protectoras del tiocianato de guanidinio (GTC) y el
B-mercaptoetanol para inactivar las ribonucleasas
presentes en los extractos de células hacen que sean los reactivos
preferidos para la primera etapa. Cuando se usan junto con un
tensioactivo tal como dodecilsulfato sódico (SDS), el
desmoronamiento de los complejos nucleoproteínicos se consigue
dejando que se libere en solución el ARN y se aísle exento de
proteína. La dilución de extractos de células en presencia de altas
concentraciones de GTC causa una precipitación selectiva de
proteínas y ADN celular mientras que el ARN permanece en solución.
La centrifugación puede aclarar el lisado de proteínas
precipitadas y preferiblemente se realiza en una columna. Tales
columnas también cizallan el ADN y reducen la viscosidad de la
muestra. Preferiblemente, la purificación del ARN se realiza en una
columna de giro que contiene sílice u otro material. El
desmoronamiento manual de células y tejidos se puede realizar
mediante una trituradora de tejidos desechable como se describe en
la patente U.S. nº. 4.715.545. El tiempo de homogeneización es de 1
a 2 minutos y más preferiblemente es de 30-45
segundos. La muestra se puede procesar luego con una columna de
desmenuzamiento (por ejemplo, QIAshredder, QIAGEN Inc., Valencia,
California, EEUU, o un sustitutivo adecuado) o con un dispositivo de
procesamiento de ARN tal como el equipo de homogeneización de
tejidos por PCR adquirible comercialmente de Omni International
(Warrenton, Virginia, EEUU) para reducir la viscosidad. El ARN se
precipita mediante la columna de giro descrita antes y los tiempos
de centrifugación no son mayores que 30 segundos. Cuando se usan
equipos comerciales de extracción de ARN tales como los asequibles
de QIAGEN, Inc., se usa la filtración en vez de la centrifugación
en todas las etapas excepto en la etapa de secado de la columna.
Típicamente, la muestra se diluye con un volumen igual de etanol al
70% antes de aplicarla a la columna. Después de lavados por
filtración, la columna se seca por centrifugación y se eluye el ARN
en agua exenta de ARNasa. El ARN se separa selectivamente por
precipitación de la solución con etanol y se une a un sustrato
(preferiblemente una membrana o filtro que contiene sílice). La
unión de ARN al sustrato se produce rápidamente debido a la
disociación de las moléculas de agua por las sales caotrópicas,
favoreciendo así la absorción de los ácidos nucleicos por la sílice.
El ARN total unido se purifica más de las sales contaminantes,
proteínas e impurezas celulares por simples etapas de lavado.
Finalmente se eluye el ARN total de la membrana añadiendo agua
exenta de nucleasa. El tiempo total para este protocolo rápido es
menor que 8 minutos y, preferiblemente, menor que 6 minutos.
En resumen: el procedimiento de extracción
rápida de ARN implica las etapas siguientes:
(a) obtención de una muestra que contiene
células del sistema biológico,
(b) opcionalmente, eliminación de la muestra de
células sin ARN de interés para producir una muestra de trabajo,
(c) lisado de las células que contienen ARN que
es de interés para producir un homogeneizado de ellas,
(d) opcionalmente, dilución del
homogeneizado,
(e) puesta en contacto de la muestra de trabajo
homogeneizada humedecida con un sustrato que contiene o que tiene
fijado a él un material al que se une el ARN,
(f) reposo para que la muestra se una al
sustrato,
(g) eliminación de contaminantes y sustancias
que interfieren,
(h) secado del sustrato y
(i) elución de ARN del sustrato.
en los casos en que se usa la centrifugación,
puede realizarse ésta después de las etapas g, h o i y,
preferiblemente, se aplica vacío/filtración en las etapas de
extracción.
\vskip1.000000\baselineskip
Los reactivos implicados en este proceso rápido
de extracción son:
- tampón de lisis/unión (preferiblemente
hidrocloruro de guanidinio 4,5M, fosfato sódico 100 mM),
- tampón de lavado I (preferiblemente etanol al
37% en HCl-guanidina 5M, Tris-HCl 20
mm),
- tampón de lavado II.(preferiblemente etanol al
80% en NaCl 20 mM; Tris-HCl 2 mM),
- tampón de elución y
- agua bidestilada estéril, exenta de
nucleasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que la distribución de células cancerosas
en los ganglios no es uniforme, es preferible tomar muestras de
múltiples cortes. Opcionalmente, también se puede examinar un
ganglio o varios ganglios basándose en la patología. Un
procedimiento para realizar un ensayo de base molecular y un examen
de la misma muestra de ganglio por patología es seccionar el
ganglio en al menos cuatro secciones, usándose una sección exterior
e interior para patología, y una sección exterior e interior para
ensayo molecular. Dado que la distribución de metástasis y
micrometástasis en tejidos no es uniforme, se debe obtener una
muestra de tamaño suficientemente grande de manera que no se
pierdan metástasis. Un enfoque para realizar este muestreo en el
presente procedimiento es homogeneizar una muestra grande de tejido
y posteriormente realizar una dilución de la muestra homogeneizada,
bien mezclada, a usar en posterior ensayo molecular.
Una típica reacción PCR incluye múltiples etapas
de amplificación, o ciclos que amplifican selectivamente especies
de ácidos nucleicos diana. Una típica reacción PCR incluye 3 etapas:
una etapa de desnaturalización en la que se desnaturaliza un ácido
nucleico diana; una etapa de alineamiento en la que un conjunto de
cebadores (cebadores de avance y retroceso) se anilla a cadenas
complementarias de ADN; y una etapa de alargamiento en la que una
polimerasa de ADN termoestable alarga los cebadores. Repitiendo esta
etapa múltiples veces, se amplifica un fragmento de ADN para
producir un amplicón que corresponde a la secuencia de ADN diana.
Las reacciones típicas PCR incluyen 20 o más ciclos de
desnaturalización, alineamiento y alargamiento. En muchos casos,
las etapas de alineamiento y alargamiento se pueden realizar al
mismo tiempo, en cuyo caso, el ciclo contiene sólo dos etapas.
En el procedimiento reivindicado, empleando
RT-PCR, la reacción de amplificación por
RT-PCR se realiza en un tiempo adecuado para la
diagnosis intraoperativa, pudiendo ser la duración de cada una de
estas etapas del orden de segundos y no de minutos.
Específicamente, con ciertos nuevos cicladores se puede generar una
velocidad de rampa térmica de como mínimo aproximadamente 5ºC por
segundo, por lo que se usan amplificaciones por
RT-PCR en 30 minutos o menos. Más preferiblemente,
las amplificaciones se realizan en menos de 25 minutos. Teniendo
esto presente en mente, los siguientes tiempos proporcionados para
cada etapa del ciclo de PCR no incluyen tiempos de rampa. La etapa
de desnaturalización puede realizarse en tiempos de 10 segundos o
menos. De hecho, en algunos cicladores térmicos se puede
seleccionar "0 segundos" en el programa, que puede ser la
duración óptima de la etapa de desnaturalización. Esto es, es
suficiente que el ciclador térmico alcance la temperatura de
desnaturalización. Muy preferiblemente, las etapas de alineamiento y
alargamiento son de menos de 10 segundos cada una y, cuando se
realizan a la misma temperatura, la combinación de la etapa de
alineamiento/alargamiento debe ser inferior a 10 segundos. Algunos
procedimientos de detección homogénea de sondas, sin embargo, pueden
requerir una etapa separada de alargamiento para maximizar un
comportamiento de ensayo rápido. Con el fin de minimizar el tiempo
total de amplificación y la formación de reacciones secundarias no
específicas, típicamente, las temperaturas de alineamiento son
superiores a 50ºC. Más preferiblemente, las temperatura de
alineamiento son superiores a 55ºC.
Por varias razones es deseable para
RT-PCR una reacción individual combinada, sin
intervención del experimentador: (1) riesgo aminorado de error, (2)
riesgo aminorado de contaminación de la diana o el producto y (3)
velocidad de ensayo más alta. La reacción puede ser de una o dos
polimerasas. En el caso de dos polimerasas, una de estas enzimas
típicamente es una polimerasa de ADN basada en ARN (transcriptasa
inversa) y una es una polimerasa termoestable de ADN basada en ADN.
Para maximizar el comportamiento del ensayo, es preferible emplear
una forma de tecnología de "arranque caliente" para estas dos
funciones enzimáticas. Las patentes U.S. nº. 5.411.876 y nº.
5.985.619 proporcionan ejemplos de diferentes enfoques de
"arranque caliente". Los procedimientos preferidos incluyen el
uso de uno o más procedimientos de termoactivación que secuestran
uno o más de los componentes requeridos para una eficiente
polimerización de ADN. Las patentes U.S. nº. 5.550.044 y nº.
5.413.924 describen procedimientos para preparar reactivos para uso
en tales procedimientos. La patente U.S. nº. 6.403.341 describe un
enfoque de secuestro que implica la alteración química de uno de los
componentes de reactivos de la PCR. En la realización más
preferida, tanto las actividades de la polimerasa dependiente de ADN
como de la dependiente de ARN residen en una enzima individual.
Entre otros componentes que se requieren para una amplificación
eficiente están incluidos trifosfatos de nucleósidos, sales
divalentes y componentes tampón. En algunos casos pueden ser
beneficiosos estabilizadores no específicos de ácidos nucleicos y
enzimas.
La especifidad de cualquier diagnóstico
molecular basado en la amplificación descansa mucho, pero no
exclusivamente, en la identidad de los conjuntos de cebadores. Los
conjuntos de cebadores son pares de cebadores oligonucleotídicos de
avance y retroceso que se alinean con una secuencia de ADN diana
para permitir la amplificación de la secuencia diana, produciéndose
por ello un amplicón específico para la secuencia diana. Los
cebadores deben ser capaces de amplificar marcadores del estado de
enfermedad de interés. En el caso de la presente invención, estos
marcadores están dirigidos al cáncer de mama y melanoma.
En el caso del cáncer de mama, el procedimiento
reivindicado implica la amplificación de un marcador de tejido
específico para tejido de mama o tejido de cáncer de mama. Se usa
una combinación de como mínimo dos marcadores de manera que se
detectan de forma clínicamente significativa y fiable células de
mama y/o de cáncer en ganglios linfáticos cuando están presentes.
Preferiblemente, los marcadores se amplifican y detectan en un único
recipiente de reacción al mismo tiempo (esto es, son
multiplejados). Muy preferiblemente, los conjuntos de cebadores son
complementarios de los fragmentos de ácido nucleico específicos para
esos marcadores. Los marcadores incluyen mamagloblina (Sec ID
nº.17) y uno o más (preferiblemente uno) de los siguientes: B305D
(Sec.ID nº. 14), PIP (Sec. ID nº. 18), B726 (Sec ID nº. 15), CABA
(Sec. ID nº. 16) u OBE (Sec. ID. nº. ). La combinación de un
marcador específico para un tejido y un marcador específico para
cáncer proporciona una sensibilidad y una especificidad que exceden
de 90% y 95%, respectivamente. Algunos marcadores existen en varias
isoformas siendo algunas de las isoformas más específicas para un
tejido o cáncer que otras. En el caso del B305D, la isoforma más
preferida es la isoforma C B305D. Es también la isoforma más
preferida en combinación con el marcador de mammaglobina.
En el caso de melanoma, el procedimiento
reivindicado implica la amplificación de marcadores específicos para
el cáncer melanoma Así, los conjuntos de cebadores son
complementarios de los fragmentos de ácido nucleico específicos
para esos marcadores Los marcadores incluyen uno o más
(preferiblemente dos o más) de los siguientes: tirosinasa (Sec ID
nº. 22) y MART I (Sec ID nº. 21). Estos marcadores proporcionan una
sensibilidad y una especifidad que exceden de 90%.
\newpage
La reacción debe contener también algún medio de
detección de una señal específica. Esto se logra preferiblemente
mediante el uso de un reactivo que detecta una región de una
secuencia de ADN derivada de la polimerización de la secuencia
diana de interés. Los reactivos preferidos para la detección dan una
diferencia de señal mensurable cuando se unen a una secuencia
específica de ácido nucleico de interés. A menudo, estos
procedimientos implican sondas de ácido nucleico que dan una
fluorescencia incrementada cuando se unen a una secuencia de ácido
nucleico específica de interés. El progreso de las reacciones de
PCR del procedimiento inventivo típicamente se controla por
análisis de las velocidades relativas de la producción de amplicones
de cada conjunto de cebadores de PCR. El control de la producción
de amplicones puede realizarse por varios reactivos y procedimientos
de detección, incluidos, sin limitación, cebadores fluorescentes,
sondas fluorógenas y colorantes fluorescentes que se unen a ADN de
cadena doble, balizas moleculares, escorpiones y otros. Un
procedimiento común para controlar una reacción PCR emplea un
ensayo fluorescente de 5' nucleasa. Este procedimiento explota la
actividad de 5'nucleasa de ciertas ADN polimerasas termoestables
(tales como Taq o Tfl ADN polimerasas) para escindir una sonda
oligómera durante el procedimiento de PCR. El oligómero se
selecciona para alinearse con la secuencia diana amplificada en
condiciones de alargamiento. La sonda típicamente tiene un
informador en su extremo 5' y un extintor fluorescente en el
extremo 3'. Mientras que el oligómero está intacto, la señal
fluorescente del informador se apaga. Sin embargo, cuando el
oligómero se digiere durante el proceso de alargamiento, el
informador ya no está en la proximidad del extintor. La acumulación
relativa del informador fluorescente libre para un amplicón dado
puede compararse con la acumulación de los mismos amplicones para
una muestra de control y/o a la de un gen de control, tal como, sin
limitaciones, \beta-actina y PBDG
(porfobilinogendesaminasa) para determinar la abundancia relativa
de un producto de ADNc dado de un ARN dado en una población de ARN.
Los productos y reactivos para un ensayo de
5'-nucleasa son fácilmemte adquiribles en el
comercio, por ejemplo, de Applied Biosystems.
Los reactivos de detección preferidos se
denominan comercialmente "escorpiones" y se describen en las
patentes U.S. nº. 6-326.145 y nº. 5.525.494. Estos
reactivos incluyen una o más moléculas que comprenden un cebador de
cola y un sistema de señalización integrado. El cebador tiene una
región de unión de molde y una cola que comprende un conector y una
región de unión diana. La región diana de unión de la cola se
hibridiza con una secuencia complementaria en un producto de
extensión del cebador. Este acontecimiento de hibridación específica
de una diana está acoplado a un sistema de señalización en el que
la hibridación conduce a un cambio detectable. En reacciones de
PCR, la región de unión diana y la región de cola ventajosamente
están dispuestas de manera que la región de cola permanece de una
sola cadena, esto es, no copiada. Así, la región de cola es no
amplificable en los productos de amplificación por PCR. El conector
comprende un resto de bloqueo que previene la extensión de cadena
mediada por polimerasa en el molde de cebador.
El equipo y el software también son fácilmente
asequibles para controlar y guiar la acumulación de amplicones en
PCR y QRT-PCR incluido el termociclador Smart
Cycler, disponible comercialmente en Cepheld de Sunnyvale,
California, y el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700,
adquirible comercialmente en Applied Biosystems.
En las reacciones de RT-PCR
preferidas, las cantidades de cierta transcriptasa inversa y los
componentes de la reacción PCR son atípicas con el fin de
aprovechar los tiempos de rampa más rápidos de algunos cicladores
térmicos. Específicamente, las concentraciones de cebador son muy
altas.
Las concentraciones típicas de cebador
específico al gen para reacciones de transcriptasa inversa son
inferiores a aproximadamente 20 nM. Para conseguir una rápida
reacción de transcriptasa inversa, del orden de uno o dos minutos,
la concentración del cebador de transcriptasa inversa se aumentó a
más de 20 nM, preferiblemente a como mínimo 50 nM y, típicamente, a
aproximadamente 100 nM. Las concentraciones estándar de cebador de
PCR varían de 100 nM a 300 nM. En reacciones estándar de PCR se
pueden usar concentraciones más altas para compensar variaciones de
Tm. Sin embargo, a los fines que se consideran aquí, las
concentraciones de cebador indicadas son para circunstancias en las
que no se necesita compensar Tm. Se pueden determinar empíricamente
y usar concentraciones de cebadores proporcionalmente más altas si
se desea o es necesario compensar Tm. Para conseguir reacciones
rápidas de PCR, las concentraciones de cebador de PCR típicamente
son mayores que 250 nM, preferiblemente mayores que aproximadamente
300 nM y típicamente de aproximadamente 500 nM.
Los diagnósticos que se usan comercialmente
emplean también preferiblemente uno o más controles internos
positivos que confirman la operación de una reacción de
amplificación particular para un resultado negativo. Entre las
causas potenciales de resultados negativos falsos que se deben
controlar en una reacción RT-PCR están incluidos:
cantidad inadecuada de ARN, degradación del ARN, inhibición de RT
y/o PCR y error del experimentador. En el caso de ensayos de
expresión de genes, es preferible utilizar un gen que se expresa
continuamente en el tejido de interés. PBGD (Seq. ID nº. 20) es un
gen que se usa comúnmente como control interno debido a varios
factores: no contiene pseudogenes conocidos en seres humanos, se
expresa constitutivamente en tejidos humanos y se expresa a un
nivel relativamente bajo y por tanto es menos probable que cause
inhibición de la amplificación de secuencias diana de interés. El
uso de PBGD como control minimiza o elimina dar resultados
experimentales erróneos que se deben a todas las fuentes
potenciales de resultados negativos falsos.
En la comercialización de los procedimientos de
QRT-PCR, ciertos equipos para la detección de ácidos
nucleicos específicos son particularmente útiles. En una
realización, el equipo incluye reactivos para amplificar y detectar
marcadores. Opcionalmente, el equipo incluye reactivos de
preparación de muestras y/o artículos (por ejemplo tubos) para
extraer ácidos nucleicos de tejido de ganglios linfáticos. Los
equipos pueden incluir también artículos para minimizar el riesgo
de contaminación de la muestra (por ejemplo, escalpelo desechable y
superficie para la disección y preparación de ganglios
linfáticos).
En un equipo preferido, están incluidos los
reactivos necesarios para el procedimiento de
QRT-PCR de un tubo descrito antes, tales como
transcriptasa inversa, cebador de transcriptasa inversa, un conjunto
de los correspondientes cebadores de PCR (preferiblemente para
marcadores y controles), una ADN polimerasa termoestable tal como
Taq polimerasa, y un(os) reactivo(s) de detección
adecuado(s) tales como, no limitativamente, una sonda
escorpión, una sonda para un ensayo fluorescente de 5' nucleasa,
una sonda molecular de baliza, un cebador de colorante individual o
un colorante fluorescente específico para ADN de doble cadena, tal
como bromuro de etidio. Preferiblemente, los cebadores están en
cantidades que dan las altas concentraciones descritas antes. Están
disponibles común y comercialmente ADN polimerasas termoestables en
una variedad de fabricantes. Son otros materiales adicionales del
equipo: tubos o viales de reacción adecuados, una composición de
barrera, típicamente una perla de cera que opcionalmente incluye
magnesio; mezclas de reacción (típicamente 10X) para la
transcriptasa inversa y las etapas de PCR, incluidos tampones y
reactivos necesarios tales como dNTPs; agua exenta de nucleasa o
ARNasa; inhibidor de ARNasa;
ácido(s) nucleico(s) de control y/o cualesquier tampones adicionales, compuestos, cofactores, constituyentes iónicos, proteínas y enzimas, polímeros y similares que se pueden usar en transcriptasa inversa y/o etapas de PCR de reacciones de QRT-PCR. Opcionalmente, los equipos incluyen reactivos y materiales para extracción de ácidos nucleicos.
ácido(s) nucleico(s) de control y/o cualesquier tampones adicionales, compuestos, cofactores, constituyentes iónicos, proteínas y enzimas, polímeros y similares que se pueden usar en transcriptasa inversa y/o etapas de PCR de reacciones de QRT-PCR. Opcionalmente, los equipos incluyen reactivos y materiales para extracción de ácidos nucleicos.
Los ejemplos no limitativos siguientes ayudan a
describir más la invención.
Los ejemplos de la presente invención están
basados en el uso de PCR en tiempo real. En PCR en tiempo real, los
productos de la reacción en cadena de polimerasa se supervisan en
tiempo real durante la fase exponencial de PCR y no en una medición
en el punto final. Por ello, la cuantificación de ADN y ARN es mucho
más precisa y reproductible. Los valores de la fluorescencia se
registran durante cualquier ciclo y representan la cantidad de
producto amplificado en ese punto en la reacción de amplificación.
Cuantos más moldes estén presentes al comienzo de la reacción,
menor es el número de ciclos necesario para alcanzar un punto en el
que se registra primeramente la señal de fluorescencia como
estadísticamente significativa por encima del fondo, que es la
definición de los valores (Ct). El concepto del ciclo umbral (Ct)
permite una cuantificación precisa y reproductible usando
RT-PCR basada en fluorescencia. La detección
homogénea de productos de PCR se realiza preferiblemente basándose
en: (a) colorantes de unión de ADN de doble cadena (por ejemplo,
SYBR Green); (b) sondas fluorógenas (por ejemplo, sondas Taq Man,
balizas moleculares) y (c) cebadores directos marcados (por ejemplo,
cebadores Amplifluor).
Se compró de Genomics Collaborative un total de
16 ganglios H&E positivos 15 muestras de ganglios de mama
H&E negativos. Se cortaron dos trozos de tejido de 30 mg de cada
ganglio.
Parte
I
Se procesó como sigue un trozo de 30 mg de
tejido: se añadieron 600 \mul de tampón RLT y la muestra de
tejido se homogeneizó manualmente durante 20-40 s
mediante una trituradora de tejidos desechable (cat.
15704-126, VWR Scientific, West Chester,
Pensilvania, EEUU). El tubo se centrífugo durante 3 min a velocidad
máxima en una centrifugadora Eppendorf modelo 5415C. El fluido
sobrenadante se pasó a un nuevo tubo y se añadió 1 volumen de
etanol al 70%.
La muestra (700 \mul) se aplicó a una
minicolumna RNeasy puesta en un colector de vacío QIAvac 24 y se
aplicó vacío. Se añadió tampón RWI (700 \mul) y se dejó que la
mezcla filtrara a través de la columna. Se añadió con pipeta a la
columna tampón RPE (500 \mul) y se dejó filtrar a través de la
columna. Se añadieron a la columna otros 500 \mul de tampón RPE y
se dejó que la mezcla filtrara a través de la columna. La columna
RNeasy se puso en un tubo de recogida de 2 ml y se centrífugo en una
microcentrifugadora a la velocidad máxima durante 1 min. Se eluyó
luego el ARN de la columna, pasando la columna RNeasy a un tubo
nuevo de recogida de 1,5 ml, añadiendo 50 \mul de agua exenta de
ARNasa y centrifugando durante 1 min a 8000 X g.
Parte
II
El segundo trozo de 30 mg del tejido de ganglio
linfático se procesó por un protocolo rápido como sigue: (1) la
pieza de tejido se añadió a 600 \mul de tampón RLT y se
homogeneizó manualmente durante 20-40 s con una
trituradora de tejidos desechable; (2) el homogeneizado se
centrífugo a través de una columna QIAshredder durante 30 s a la
velocidad máxima; (3) al lisado se añadió 1 volumen de etanol al
70% y se mezcló con pipeta; (4) la muestra se aplicó luego a una
minicolumna RNeasy puesta en un colector de vacío QIAvac 24 y se
aplicó vacío; (5) se añadieron a la columna 700 \mul de tampón RWI
y se dejó que filtrara a través de la columna; (6) se añadieron a
la columna 500 \mul de tampón RPE y se dejó que filtrara a través
de la columna; (7) se pasó la columna a un tubo de recogida de 2 ml
y se centrífugó durante 30 s a 10.000 rpm; (8) se añadieron a la
membrana 25 \mul de agua exenta de ARNasa y la columna se
centrífugo durante 30 s a 10.000 rpm para eluir el ARN. Todas las
etapas de centrifugación en el protocolo rápido se realizaron en
una centrifugadora VWR modelo 10MVSS.
Se transcribió inversamente el ARN extraído y se
cuantificaron el ARN y el ADN como se ha descrito previamente.
Para los ensayos Taqman se compraron de Applied
Biosystems, Foster City, California: Taqman Core Reagent kit
(equipo de reactivos), tampón de PCR Gene Amp 10 X, Amp Erase
Uracil-N-glicosidasa y ADN
polimerasa Ampli Taq Gold. Todos los otros reactivos se obtuvieron
de fuentes comerciales descritas en el Ejemplo 1. El glicerol se
compró de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, EEUU) y Tween 20
de Eastman Organic Chemicals (Rochester, Nueva York, EEUU).
Los cebadores de mamaglobina (SEQ ID nº. 3 y SEQ
ID nº. 4) fueron sintetizados por Invitrogen Corp. (Carlsbad,
California, EEUU) y la sonda de Taqman de mammglobina (SEQ ID nº. 7)
de Epoch Biosciences (San Diego, California, EEUU). Los cebadores
de PBGD (SEQ ID nº.8 y SEQ ID nº.9) fueron sintetizados por Qiagen
Operon (Alameda, California, EEUU) y la sonda (SEQ ID nº. 23) por
SYNTHEGEN, LLC (Houston, Texas, EEUU), los cebadores de B305D (SEQ
ID nº. 11 y SEQ ID nº. 12) fueron sintetizados en Invitrogen Corp.,
y la sonda (SEQ ID nº. 13) por Applied Biosystems, Inc. Para todas
las sondas Taqman se usaron como colorante y par de extinción
carboxifluoresceína (FAM) y carboxitetrametilrrodamina (TAMRA).
Para los ensayos de Taqman se preparó una mezcla
madre añadiendo 10 \mul de tampón nº. 1 de PCR 10 X, 14 \mul de
MgCl_{2} 25 mM, 8 \mul de dNTP 10 mM, 1 \mul de AmpErase UNG
(1 U/\mul), 16 \mul de glicerol, 1 \mul de Tween 20 al 1%
p/v, 0,75 \mul de AmpliTaq Gold (5U/\mul), 6 \mul de cada
cebador de un acopio 5 M, 0,4 \mul de un acopio 10 \muM de
sonda y agua a un volumen total de 96 \mul. Se añadieron la mezcla
madre (48 \mul) y 2 \mul de cADN de cada muestra de ganglio a
cada pocillo de placa de microtitulación de reacción óptica.
Después de rematar con remates ópticos, las placas se procesaron con
un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900 HT (Applied
Biosystems, Inc., Foster City, California, EEUU). Los reactivos
comerciales, incluidos el equipo de reactivos Taqman PCR Core, los
reactivos de molde de ADN Taqman y los reactivos de detección de
Taqman B-actin se compraron de Applied Biosystems
(Foster City, California, EEUU) y el ensayo se realizó de acuerdo
con el protocolo recomendado por el fabricante. Para el análisis con
el ensayo de mamaglobina se usó un valor umbral de 0,02, de 0,03
para el ensayo de B305D, de 0,08 para el ensayo de
B-actina y de 0,1 para el ensayo de PBDG. En las
Tablas 3 y 4 se dan las medias de la determinación por triplicado en
los ensayos de Taqman.
En la Tabla 1 se presenta una comparación de la
medida en tiempo real de los genes domésticos
B-actina y PBGD. en 15 muestras de ganglios
H&E negativos así como en 16 ganglios H&E positivos y dos
muestras de control de cADN. Los resultados de estos experimentos
indican una buena conformidad entre los valores de Ct obtenidos con
el procedimiento rápido de esta invención y los procedimientos
comerciales estándar (QIAGEN), lo que confirma que el ARN extraído
por el protocolo de extracción rápida de ARN es capaz de ser
inversamente transcripto y amplificado por PCR en cuantía similar
al ARN extraído basándose en un protocolo comercial estándar.
La Tabla 2 compara resultados de expresión de
genes basados en el valor de Ct para los marcadores de cáncer de
mama mamaglobina y B305D con las mismas muestras de ganglios de mama
evaluadas en la Tabla 1. Para determinar si se puede hacer una
correlación entre muestras de ganglios de mama H&E positivos y
H&E negativos basándose en resultados en tiempo real, se
identificó el valor más bajo de Ct para cada marcador en las
muestras de ganglios de H&E negativos para mamaglobina y B305D.
A las muestras H&E positivas se aplicó un corte arbitrario,
pero conservador, de 2,5Ct valores menos que este valor más bajo
entre las muestras H&E negativas. Las muestras que están
sombreadas en la Tabla 2 tienen una expresión más alta para estos
dos marcadores de mama en cuanto a que el valor de Ct es como
mínimo 2,5Ct valores más bajo que un valor de Ct observado entre las
muestras H&E negativas. Había una buena correlación en la
expresión de estos marcadores usando el procedimiento rápido de
esta invención y el protocolo comercial recomendado por el
fabricante (QIAGEN).
Usando mamaglobina como marcador, los valores de
Ct en dos muestras entre las 15 muestras de ganglios H&E no se
correlacionaban estrictamente entre el procedimiento rápido de esta
invención y los protocolos de extracción de ARN QIAGEN. En una de
estas muestras, GCLNC-24, la diferencia en el valor
de Ct era de 0,4, que está dentro del error experimental. La
segunda muestra presentaba diferencias mayores en el valor de Ct
tanto con mamaglobina como con B305D debido a dificultades en la
cuantificación espectral de ARN en estas muestras así como a
posibles problemas de muestreo debidos a la distribución no
uniforme, bien establecida, de metástasis en los ganglios. (Cserni
1999, Metastases in axillary sentinal lymph nodes in breast cancer
as detected by intensive histopathological work up, J. Clin.
Pathol., 52:0922-924).
La finalidad de este ejemplo es demostrar que la
columna QIAshredder se puede usar después de la homogeneización de
tejido de ganglios linfáticos y que la centrifugación del
homogeneizado durante sólo 30 s da una extracción aceptable de
ARN.
Se obtuvo de Genomics Collaborative (Cambridge,
Massachusetts, EEUU) un ganglio axilar de mama que era H&E
negativo. Se mezcló una rodaja de tejido de 490 mg con 5,5 ml de
tampón RLT y se homogeneizó el ganglio. Se eliminaron 600 \mul de
homogeneizado y se extrajo ARN usando la extracción rápida descrita
en el Ejemplo 1. Como control se trataron otros 600 \mul de
homogeneizado usando el mismo procedimiento de extracción rápida,
excepto que se usó una centrifugación durante 3 min en vez de la
columna QIAshredder. Se transcribió inversamente el ARN de cada
reacción y se cuantificó como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se
realizó PCR en tiempo real usando sondas Taqman.
Los resultados de estos estudios indicaron
rendimientos de ARN similares de 0,31 \mug/\mul en el protocolo
que implica el protocolo de QIAshredder en comparación con 0,34
\mug/\mul en el protocolo de centrifugación. Se obtuvo una
relación 260/280 nm idéntica de 2,1 en ambas muestras, lo que indica
un ARN de alta calidad. Los ensayos de PCR en tiempo real indicaron
también valores de Ct similares para mamaglobina con ARN extraído
por la columna QIAshredder en comparación con el protocolo que
implica (22,5 frente a 22,0) así como con B305D (26,7 frente a
26,6) así como con PBDG (29,1 frente a 29,0) de genes domésticos y
B-actina (SEQ ID nº. 19, 18,5 frente a 18,2).
En resumen, este experimento indica resultados
similares de la amplificación por PCR en tiempo real en cuanto a
rendimiento de ARN, calidad y tiempo real con el protocolo que
implica una columna QIAshredder en vez de una etapa de
centrifugación de 3 min después de homogeneización. Esto reduce en
2,5 min el tiempo requerido para realizar la extracción de ARN, lo
que es importante al desarrollar protocolos adecuados para
aplicaciones intraoperativas y otras en las que se requieren
resultados rápidos que afecten al cuidado del paciente.
El ejemplo siguiente ilustra el efecto de la
dilución del lisado sobre el rendimiento de ARN y la precisión de
la recuperación de ARN. En este ejemplo. se cortaron 20 mg, 10 mg o
5 mg de tejido de ganglio de cerdo congelado. El tejido se trituró
usando una trituradora de tejidos desechable de 50 ml durante 30 s y
las muestras se centrífugaron por rotación. Para cada peso de
ganglio se hicieron tres replicados. 1 ml de cada lisado se pasó a
un tubo de centrifugadora de 1,7 ml que se centrífugó luego en una
centrifugadora Eppendorf a velocidad máxima (14.000 rpm) durante 30
s. Se centrifugaron 700 microlitros a través de una columna
QIAshredder y las muestras se centrifugaron a la velocidad máxima
durante 30 s. La columna se lavó luego, se secó y se eluyó el ARN
como se ha descrito antes en el Ejemplo 2, parte I, etapas
4-8. Se cuantificó el ARN mediante un Gene Spec II.
Los resultados de estos estudios se presentan en las Tablas 3 y 4 e
ilustran la excelente precisión en un peso inicial de tejido de
ganglio de 2,5 mg homogeneizado en 600 ml de tampón de
homogeneización, en comparación con muestras con mayores pesos que
incluyen 10 mg y 20 mg de tejido de ganglio. Estos resultados
indican que se puede obtener una precisión mejorada de la
recuperación de ARN a peso menor del ganglio. También sería de
esperar que homogeneizados más diluidos filtraran más rápidamente a
través de la columna y que incluso hubiera menos problemas
potenciales de atasco del filtro.
Se sintetizó ADNc a partir de 20 \mug de ARN
total a 42ºC durante 60 min en una mezcla de reacción de 250 \mul
que contenía Tris-Cl 50 mM pH 8,3, KCl 75 mM,
MgCl_{2} 3 mM, DTT 10 mM, 2000U de Superscript, 400 U de Rnasina,
2 \mug de cebador oligo dT, 0,08 mg/ml de BSA y 0,2 mM de cada uno
de dACT, dCTP, dGTP y TTP. El ADNc resultante se diluyó 1:8 en
agua.
2 \mul de cada cADN diluido se amplificaron en
el Applied Biosystems 7900 con un volumen total por pocillo de 50
ml. La amplificación se realizó con el protocolo siguiente: 50ºC
durante 2 min y 95ºC durante 10 min, luego 40 ciclos de 95ºC
durante 15 segundos (s), 60ºC durante 1 min (58ºC para B726) y 68ºC
durante 1 min. Los componentes de la mezcla de reacción y las
concentraciones finales son los siguientes: 1 X tampón A de TaqMan
(ABI), MgCl_{2} 3,5 mM, 0,2 mM de dGTP, dCTP y cATP, dUTP 0,4 mM
(ABI), 0,1 u/ul de Amp/Erase UNG (ABI), 0,0375 U/ul de AmpliTaq
Gold (ABI), 8% de glicerol (Sigma), 0,01% de Tween 20 (Kodak), 0,3
uM de cada cebador (Invitrogen), agua exenta de RNasa/DNasa (Sigma)
y sonda de nucleótido 5'-FAM, 3'TAMRA 40 nM
(Synthegen). A cada conjunto de cebador/sonda se asignó un umbral
de señal relativa respecto a un colorante de referencia interna
(ROX) en el intervalo lineal logarítmico del aumento de la
intensidad fluorescente causado por el aumento de producto de PCR.
Los valores de Ct resultantes se utilizaron para determinar la
expresión relativa de los genes en todas las muestra ensayadas.
La tabla siguiente contiene los valores de Ct
obtenidos para 11 ganglios linfáticos histológicamente negativos y
24 ganglios linfáticos histológicamente positivos. Para cada
marcador se determinó un corte para el carácter positivo
sustrayendo 2,5 ciclos del Ct más bajo observado con las muestras
histológicamente negativas. Las muestras positivas están
sombreadas. Basándose en estos criterios, se determinaron las
velocidades de detección para los marcadores individuales. Se ve
una complementariedad óptima con mamaglobina combinada con B305D
A/C, una combinación que detecta 23/24 muestras histológicamente
positivas. Una combinación de mamaglobina, B305D y GABA detectó la
totalidad de las 24 muestras. Véase la Tabla 3.
Se sintetizó ADNc a partir de 20 \mug de ARN
total a 42ºC durante 60 min en 100 \mul de reacción utilizando
oligocebadores dT anclados. 20 ng de cada ADNc diluido se
amplificaron en el Applied Biosystems 7900 con un volumen total
por pocillo de 50 ml. La amplificación se realizó con el protocolo
siguiente: 94ºC durante 2 min, luego 50 ciclos de: 94ºC durante 15
s, 62ºC durante 15 s y 72ºC durante 45 s. Los componentes de la
mezcla de reacción y las concentraciones finales son los siguientes:
1 X tampón A de PCR (ABI), MgCl_{2} 3,5 mM final, 0,05 mM de
dGTP, dCTP y cATP y TTP, 0,05 U/\mul de Taq polimerasa que
contenía un exceso 5-20X de 2 anticuerpos
anti-Taq (TP4-9 y
TP1-12), 0,2 \muM de cada cebador (Invitrogen),
agua exenta de RNasa/DNasa (Sigma) y una dilución 1:20000 de un
acopio de SYBR Green (Sigma). Las secuencias de amplificación del
cebador fueron idénticas a las empleadas en el ensayo TaqMan de
ganglios linfáticos. Para determinar los valores de Ct se utilizó
un umbral común de 275 unidades de fluorescencia. Los valores de Ct
se convirtieron luego en expresión cuantitativa de gen y se
trazaron en relación con un corte que se supuso que se aproximaba
al nivel mínimo de la expresión de gen requerida para diferenciar
ganglios linfáticos de metástasis de la expresión de fondo.
| Cebador 1, | SEC ID NO 3 - CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA |
| Cebador 2, | SEC ID NO 4 - TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA |
\vskip1.000000\baselineskip
| Cebador 1, | SEC ID NO 11 - TCTGATAAAGGCCGTACAATG |
| Cebador 2, | SEC ID NO 12 - TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC |
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos presentados en las figuras
3-5 muestran la potencia de combinar genes
mamaglobina y signaturas de B305D para obtener alcance de la vasta
mayoría de muestras de cáncer de mama
ARN transcripto in vitro con mamaglobina
(100.000 copias) se diluyó en 20 ng con ARN de leucocitos y se
sometió a amplificación por RT-PCR en una etapa en
un ciclador Cepheid Smart II en una mezcla de reacción que contenía
lo siguiente: Bicina/KOH 50 mM pH 8,2, acetato potásico 115 mM, 8%
v/v de glicerol, 0,2 mg/ml de BSA, trehalosa 150 mM, 0,2% v/v de
Tween 20, tris-Cl 0,2 mM pH 8, MnSO_{4} 3,5 mM,
dATP 0,3 mM, dCTP 0,3 mM, dGTP 0,3 mM, TTP 0,3 mM, 100 U/ml de Tth,
20 ug/ml de anticuerpo TP6-25,3, 0,45 uM de
escorpión de mamaglbina y 0,5 \muM de cebador de mamaglobina.
Las condiciones de PCR fueron las siguientes (el
asterisco denotaba la porción del ciclo en la que se midió la
fluorescencia):
Condición A: 95ºC durante 3 s, 60ºC durante 7
min, 70ºC durante 2 min, luego 40 ciclos de: 95ºC durante 3 s, 54ºC
durante 6 s* y 68ºC durante 6 s; tiempo total = 34 min.
Condición B: 95ºC durante 3 s, 60ºC durante 3
min, luego 40 ciclos de: 95ºC durante 3 s, 54ºC durante 6 s* y 68ºC
durante 6 s; tiempo total = 29 min.
Condición C: 95ºC durante 3 s, 60ºC durante 3
mi, luego 40 ciclos de: 95ºC durante 3 s, 58ºC durante 6 s* y 68ºC
durante 6 s; tiempo total = 26 min.
Los resultados de este ensayo se presentan en la
tabla siguiente.
Como se puede deducir de estos datos, la
reducción de la duración de la etapa de transcripción inversa de 9
a 3 min no tiene un impacto discernible sobre el comportamiento del
ensayo. El aumento de la temperatura de alineamiento a 58ºC tiene
sólo un efecto mínimo de amplificación y reduce el tiempo total de
RT-PCR a 26 min. Se pueden realizar más reducciones
del tiempo del ciclo por construcción del cebador y la sonda con
temperaturas óptimas de ensayo más altas.
En este ejemplo se somete a amplificación por
RT-PCT en una etapa, en un ciclador II Cepheld Smart
II, ARN de ganglio linfático purificado (\geq100 ng de ARN total
por 100 \mul de reacción utilizado para reducir el número total
de ciclos requerido para generar un resultado positivo). La mezcla
de reacción contiene los componentes siguientes: Bicina/KOH 50 mM
pH 8,2, acetato potásico 115 mM, 8% v/v de glicerol, 0,2 mg/ml de
BSA, trehalosa 150 mM, 0,2% v/v de Tween 20, Tris-Cl
0,2 mM pH 8, MnSO_{4} o acetato de Mn 3,5 mM, dATP 0,3 mM, dCTP
0,3 mM, dGTP 0,3 mM, TTP 0,3 mM, 100 U/ml de Tth, 20 \mug/ml de
anticuerpo TP6-25,3, 0,4-0,8 \muM
de cada escorpión y cebador. Las secuencias de escorpión y cebador
están diseñadas de manera que se minimizan acontecimientos de
imprimación no específicos y de manera que son compatibles con la
amplificación/detección múltiple con el siguiente perfil de
RT-PCR rápido:
95ºC durante 3 s, 60ºC durante 3 min, luego 32
ciclos de: 95ºC durante 1 s, 65ºC durante 6 s* y 72ºC durante 3 s -
tiempo total de amplificación = 16 min.
Se utiliza el procedimiento de preparación
rápida de muestras descrito, que tiene una duración \leq4 min
para completarse (respecto a un ejemplo de preparación de muestra en
aplicación), lo que conduce a un tiempo de ensayo total de \leq20
min.
Para la detección de metástasis de cáncer de
mama a ganglios linfáticos se amplifican los genes siguientes
mamaglobina, B305D y PBGD. La señal de mamaglobina y/o B305D es
indicativa de metástasis, mientras que PBGD se utiliza como gen
doméstico. En este ejemplo, los valores de Ct para ganglios
linfáticos cáncer-positivos varían de 12 a 30 para
mammaglobina y de 12 a 28 para B305D; la detección de cualquiera de
los genes en este intervalo de Ct es indicativa de un ganglio
linfático cáncer-positivo. En este ejemplo, los
valores de Ct para el gen de control PBGD deben estar en el
intervalo de 24-30 ciclos para considerar válido un
resultado cáncer-negativo.
Para la detección de metástasis de cáncer de
melanoma a ganglios linfáticos se utilizan las mismas condiciones,
con las excepciones siguientes: (1) se procesan ganglios linfáticos
sospechosos de contener melanoma y (2) se amplifican los genes
siguientes: MART1, tirosinasa y PBGD. La señal de PBGD y/o
tirosinasa es indicativa de metástasis de melanoma a los ganglios
linfáticos, mientras que PBGD se utiliza como gen doméstico. En este
ejemplo, los valores de Ct para ganglios linfáticos
cáncer-positivos varían de 18 a 30 para tirosinasa y
de 12 a 27 para MART 1; la detección de cualquiera de los genes en
este intervalo es indicativo de un ganglio linfático
cáncer-positivo. En este ejemplo, los valores de Ct
del gen de control PBGD deben estar en el intervalo de
24-30 ciclos con el fin de considerar válido un
resultado cáncer negativo.
<110> Johnson & Johnson
\hskip1cmAtkins, David
\hskip1cmBackus, John
\hskip1cmBelly, Robert
\hskip1cmRosen, Steven
\hskip1cmWhite, Robert
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ENSAYO NO OPERATIVO DE GANGLIO
LINFÁTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CDS 5009
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgactgcct tgcctcctca gta
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctgttgct tggacttctc taaaga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaacggatg aaactctgag caatgttga
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> la secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgtgagcc aaaggtcttg caga
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccaacaaa gctcaggaca aca
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagtgactt cgtcatttgg acgta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es una
sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtttatgca attaatatat gacagcagtc tttgtg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgaggcacc tggaaggagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcttcatg ctgggcaggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgaggcacc tggaaggagg ctgcagtgt
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgataaag gccgtacaat g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcacgacttg ctgtttttc tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es una
sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcaaaaaaac aagcatggcc tacacc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1155
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3865
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 503
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 503
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1793
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1377
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1524
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es una
sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgaggcac ctggaaggag gctgcagtgt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es una
sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcaaaaaac aagcatggcc tcacacc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcttcgct gcatcgctga aa
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> La secuencia artificial es un
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagactcctc cagtcaggta ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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Claims (10)
1. Un procedimiento de realización de un ensayo
intraoperativo de diagnóstico molecular para su empleo en la
detección de metástasis de melanoma, que comprende las etapas de:
análisis de una muestra de tejido de ganglio linfático de un
paciente por extracción de ARN del ganglio linfático; amplificación
y detección del ácido nucleico; y determinación de si la presencia
de más de un marcador excede un valor de corte, en el que el
mencionado ARN se extrae en menos de 8 minutos y en el que el
procedimiento se realiza en un período de no más de 35 minutos.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el mencionado ARN se extrae en menos de 6 minutos.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 para
su uso en la detección de micrometástasis.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que los marcadores son SEC ID Nº 21 y SEC ID Nº 22.
5. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la amplificación y detección del
ácido nucleico se realiza por PCR.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en
el que la mencionada PCR es RT-PCR.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que la reacción de transcripción inversa se realiza en menos de
9 minutos.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
el que la reacción de transcripción inversa se realiza en
aproximadamente 3 minutos.
9. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que a la reacción de transcripción
inversa se añaden uno o más reactivos de control interno.
10. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el ARN se extrae de la muestra de
tejido de ganglio linfático:
(a) lisando las células que contienen el ARN de
interés y produciendo un homogeneizado de ellas,
(b) opcionalmente, diluyendo el
homogeneizado,
(c) poniendo en contacto la muestra de trabajo
homogeneizada, humedecida, con un sustrato que contiene, o al que
está fijado, un material al que se une el ARN,
(d) permitir que la muestra se una al
sustrato,
(e) eliminando contaminantes y sustancias que
interfieren,
(f) secando el sustrato y
(g) eluyendo el ARN del sustrato, y
utilizando filtración en las etapas
de
extracción.
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