KR20040094650A

KR20040094650A - 수술중 림프절 분석

Info

Publication number: KR20040094650A
Application number: KR1020040031122A
Authority: KR
Inventors: 애트킨스데이비드; 배커스존; 벨리로버트; 로젠스티븐; 화이트로버트
Original assignee: 베리덱스 엘엘씨
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-05-03
Publication date: 2004-11-10
Also published as: CA2464874C; DK1526187T3; BRPI0401651B1; AR044160A1; PT1526187E; EP1526187A3; DE602004019150D1; PT1757705E; EP2199406A1; CN100577815C; CN1618987A; CL2004000922A1; EP1953246A3; EP1757705A3; EP1526187A2; EP1757705B1; ATE401423T1; ES2321131T3; EP1757705A2; DE602004015037D1

Abstract

미세전이(micrometastasis)에 대한 수술중 림프절 분석에서, 외과의사는 수술 도중 공지 방법에 따라 전초 림프절(sentinel lymph node)을 확인한다. 전초 림프절은 제거되고, 핵산의 추출을 위해 준비된다. 그 다음, 핵산(예: RNA)은 전초 림프절로부터 신속하게 추출된다. 미세전이를 표시하는 마커(marker)가 존재한다면 증폭 및 검출된다.

Description

수술중 림프절 분석{INTRAOPERATIVE LYMPH NODE ASSAY}

본 발명은 분자적 진단의 기술분야에 관한 것이다.

림프절 연루(involvement)는 여러 고형 종양에서 가장 강한 진단 인자이고, 림프절 미세전이의 검출은 병리학자 및 외과의사에게 큰 관심의 대상이다. 현재의 림프절 평가는 H&E-염색된 조직 섹션의 현미경 조사를 포함하며, 3개의 주요 제한, 즉 (a) 단일 종양 세포, 또는 세포들의 작은 포커스(focus)들이 쉽게 놓치고, (b) 그 결과가 신속하게 이용가능하지 않는데, 이는 전초 림프절 절차에서의 긍정적인 결과에는 부수 림프절의 제거를 위한 제 2 수술이 요구됨을 의미하며, (c) 단지 1 또는 2개의 조직 섹션을 연구하므로 각 절의 거의 대부분은 비조사된 상태로 존재하는 제한을 갖는다. 연속적인 섹션 작업은 샘플 작업 도중 오류 문제점을 해결하는 데 도움이 될 수 있고, 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC)은 개별 종양 세포를 확인하는 데 도움이 될 수 있다. 그러나, 이들 방법의 조합은 너무 고비용이고, 통상의 분석에 대해 시간 소모적이며, 전초 림프절 조사와 같은 특정 경우들에 국한된다.

수술 절개는 흔히 림프절의 수술중 동결 섹션 분석에 기초하지만, 이들 방법의 감도는 표준 H&E 병리학에 비해 50 내지 70%를 나타내고, 허용하기 어려울 빈도의 제 2 수술들을 초래하게 되어 비교적 불량하다. 림프절 연루를 갖지 않은 제 0 단계 및 제 I 단계의 유방암 환자의 5년 생존율은 각각 92% 및 87%이다. 반면, 림프절 연루를 갖는 제 I 단계 후 유방암 환자의 5년 생존율은 크게 감소된다. 예를 들면, 제 II 단계의 유방암 환자의 생존율은 단지 7%이고, 제 III 단계는 46%이고, 제 IV 단계는 13%이다. 비록 림프절 음성 유방암 환자가 개선된 생존율을 나타낼 지라도, 조직학적으로 림프절 음성 환자의 20 내지 30%는 질병 재발을 겪게 된다. 이는 크게는 절 샘플링과 관련된 조직을 비롯한 미세전이 검출에서의 현재의 기술의 한계, 및 개별 종양 세포들 또는 작은 종양 포커스를 검출하기 위한 감도의 불량 때문인 듯 하다.

유방암 절에서의 더욱 정확하고 민감한 전이 검출에 대한 요구와 더불어, 특히 수술중 세팅에서 수술 마진(margin)의 더욱 정확한 검출 뿐만 아니라 흑색종 절에서의 신속하고 민감한 시험에 대한 유사한 요구가 존재한다.

중합효소 쇄 반응(PCR)은 이 세팅에 유용한 분자생물학 분야의 강력한 도구이다. 이 기술은 소량의 핵산 분절을 의미있는 방식으로 분석될 수 있는 양으로 복제/증폭시킨다. 실시간 정량 RT-PCR(Q-RTPCR)의 개발과 더불어, 이 기술은 자동조작이 가능할 뿐만 아니라 더욱 신뢰할 수 있게 되었다. Q-RT-PCR은 더욱 적게 오염되며 유전자 발현의 정량화를 제공한다. 이러한 정량화는 수술중 림프절 분석에서 미세전이의 검출을 위해 적용될 수 있었다. 분자적 진단에서의 PCR은 그의이점에도 불구하고 전형적인 임상 진단 세팅에서 특히 수술중 세팅에 적용하기 어렵다는 몇몇 제한을 갖는다.

이러한 제한중 하나는 전형적으로 PCR 진단을 실시하는 데 걸리는 시간이다. 전형적인 PCR 반응은 분 단위가 아닌 수시간 걸린다. PCR 진단을 실시하는 데 소용되는 시간을 감소시키는 것이 수술중 유용한 기술에 있어 필요한 것이다. 또한, 비록 Q-RT-PCR이 정량적 결과를 제공할 수 있을 지라도, 이러한 기술에 기초한 부정적인 결과로부터 긍정적인 결과를 구별하기 위한 컷오프(cutoff) 값이 현재까지 전혀 공지되어 있지 않거나, 또는 핵산 분절이 가장 우수하게 검출하여 미세전이의 존재와 관련되어 있는지가 분명하지 않다. 핵산 분절의 증폭 및 검출을 위한 다른 방법들이 또한 존재하며 각각은 유사한 문제점을 갖는다.

현존하는 어려움을 극복하는 수술중 분자적 림프절 분석은 의학 협회에 의해서 잘 수용될 것이다.

본 발명은 미세전이에 대한 수술중 림프절 분석에 관한 것이다. 외과의사는 공지 방법에 따라 수술중 전초 림프절을 확인한다. 전초 림프절은 후술되는 바와 같이 제거되어 준비된다. 이어, 핵산(예: RNA)은 전초 림프절로부터 신속하게 추출된다. 그 다음, 미세전이를 표시하는 마커가 존재한다면 증폭 및 검출된다. 이어서, 외과의사는 이러한 마커의 검출의 결과에 기초하여 조치를 취한다.

상기 분석은, 전초 림프절에서의 미세전이를 검출하기 위해 수 분내에 완결PCR 반응의 실행을 허용함으로써 수술중 진단시 PCR의 사용을 허용하는, PCR 및 RT-PCR법에 기초하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 한 실시양태에서, 수술중 분자 진단은 외과수술 과정 동안 실시되는 단계들, 즉 환자로부터 조직 샘플을 수득하는 단계; 상기 샘플로부터 RNA를 추출하여 핵산 증폭 및 검출에 의해 샘플을 분석하는 단계; 및 하나 이상의 유전자 발현 마커의 존재가 컷오프 값을 초과하는지를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 컷오프 값은 절대 값 또는 조절 유전자의 발현과 관련된 값일 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 유전자 발현 마커는 유방 조직과 같은 특정 조직에 대한 특정 핵산 단편이다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, 유전자 발현 마커는 악성을 표시하는 핵산 단편이다.

본 발명의 추가의 또다른 실시양태에서, 림프절 샘플은 균질화된 후 희석되어 신속하게 처리되는 추출 방법에도 불구하고 충분한 RNA가 추출되는 것을 보장한다.

본 발명의 추가의 또다른 실시양태에서, 마커는 맘마글로빈(mammaglobin)(서열 번호 17), 유방암 진단의 경우, PIP(서열 번호: 18), B305D(구체적으로는 이소 형태 C, 서열 번호 14), B726(서열 번호 15), GABA(서열 번호 16) 또는 O8E(서열 번호 __), 및 흑색종의 경우 티로시나아제(서열 번호 22) 및 MART 1(서열 번호 21)의 것들이다.

본 발명의 추가의 또다른 실시양태에서, 미세전이는 전초 림프절로부터 RNA를 수득하는 단계; 하나 이상의 대상 유전자에 특징적인 정량적 RT-PCR 방법을 수행하여 마커의 존재가 소정의 컷오프를 초과하는지를 측정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수술중 검출된다. 상기 컷오프 값은 절대값 또는 조절 유전자의 발현과 관련된 값일 수 있다.

본 발명의 추가의 또다른 실시양태에서, 키트는 미세전이에 관한 수술중 림프절 분석을 수행하기 위한 시약을 함유한다.

본 발명은 암 진단을 위한 수술중 방법을 제시한다. 이들 방법은 림프절로부터 핵산을 추출하는 신속한 방법, 및 전이를 표시하는 핵산 단편(이러한 단편은 본원에서 "마커"로서 지칭됨)을 증폭 및 검출하는 방법을 이용한다.

본 발명의 방법의 중요 실시양태는 특정 유전자의 발현을 표시하는 마커의 신속한 증폭 및 검출이다. 단, 이러한 방법이 수술중 분석에 대해 허용가능한 기간(즉, 약 35분 미만)내에 수행될 수 있는 한, 임의의 신뢰성있고 민감한 특정 방법이 사용될 수 있다. 이로는 PCR법, 롤링 써클 증폭법(Rolling Circle Amplification method, RCA), 리가제 연쇄 반응법(Ligase Chain Reation method, LCR), 스트랜드 치환 증폭법(Strand Displacement Amplification method, SDA), 핵산 서열 기초 증폭법(Nucleic Acid Sequence Based Amplification method, NASBA) 및 기타 방법을 포함한다. 이와 관련된 신속한 분자 진단으로는 QRT-PCR을 비롯한 정량적 PCR 방법이 가장 바람직하다.

사용된 증폭법과 관계없이, 분석을 실시하기 위해 사용되는 조직을 정확히 채취하는 것이 중요하다. 여기에는 전초 림프절의 적절한 절단 및 처리 뿐 아니라 그로부터의 RNA의 추출도 포함된다. 수득되고 나면 존재하는 모든 암 세포가 검출되도록 적절하게 림프절을 처리하는 것이 중요하다.

조직 샘플로부터 핵산을 추출하는데 다양한 기법이 사용될 수 있다. 각 경우의 표준 실행은 시간 소모적이며, 이러한 목적으로 고안된 시판 키트를 사용하는 경우일지라도 어려울 수 있다. 전형적인 시판 핵산 추출 키트는 핵산을 추출하는데 15분 이상이 걸린다. 본 발명의 방법에서, 핵산은 8분 미만, 바람직하게는 6분 미만에 추출된다. 이러한 신속한 추출은 벨리(R. Belly), 토너(J. Toner) 및 배커스(J. Backus)에 의해 "세포 및 조직으로부터의 신속한 RNA 추출(Rapid Extraction of RNA From Cells And Tissues)"이라는 명칭의 동일자 특허 출원(본원에 참조로 인용됨)의 목적이다.

손상되지 않은 RNA의 성공적인 단리는 4단계, 즉 세포 또는 조직의 효과적인 붕괴 단계, 핵단백질 착체의 변성 단계, 세포내 리보뉴클레아제(RNA아제)의 불활성화 단계 및 오염 DNA 및 단백질의 제거 단계를 포함한다. 세포 추출물에 존재하는 리보뉴클레아제를 불활성화시키는 구아니디늄 티오시아네이트(GTC) 및 B-머캅토에탄올의 붕괴성 및 보호성으로 인해 이들은 제 1 단계에 바람직한 시약이 된다. 소듐 도데실설페이트(SDS)와 같은 계면활성제와 함께 사용되는 경우, 핵단백질 착체의 붕괴가 이루어지면서 RNA가 용액내로 배출되어 단백질 없이 단리된다. 고농도의 GTC의 존재하에서의 세포 추출물의 희석은 RNA는 용액중에 잔존하면서 세포성단백질의 선택적 침전을 유발시킨다. 원심분리에 의해 침전된 단백질 및 세포성 DNA의 용해물(lysate)을 제거할 수 있으며, 이는 바람직하게는 칼럼을 통해 수행된다. 이러한 칼럼은 또한 DNA에 전단을 가하여 샘플의 점성을 감소시킨다. RNA 정제는 실리카 또는 다른 물질을 갖는 스핀 칼럼 상에서 바람직하게 실시된다. 미국 특허 제 4,715,545 호에 기재된 바와 같은 1회용 조직 분쇄기를 사용하여 수동으로 세포 및 조직을 붕괴시킬 수 있다. 균질화 시간은 1 내지 2분 이내이며 더욱 바람직하게는 30 내지 45초이다. 이어서, 샘플은 단편 칼럼(shredding column)(예컨대, 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠 인코포레이티드(QIAGEN Inc.)의 QIA shredder(퀴아 절단기), 또는 적절한 대체품)을 사용하거나 RNA 처리 장치, 예컨대 옴니 인터네셔날(Omni International)(버지니아주 워렌턴 소재)로부터 입수가능한 PCR 조직 균질화 키트를 사용하여 처리되어 점성을 감소시킬 수 있다. RNA는 상기한 바와 같은 스핀 칼럼을 통해 침전되고, 원심분리 시간은 30초 미만이 된다. 예컨대 퀴아젠 인코포레이티드로부터 입수가능한 시판 RNA 추출 키트를 사용하는 경우, 칼럼 건조 단계를 제외한 모든 단계에서 원심분리 대신 여과가 이용된다. 전형적으로, 샘플은 칼럼에 적용되기 전 동일한 부피의 70% 에탄올을 사용하여 희석된다. 여과에 의해 세척한 후, 칼럼은 RNA아제 부재 물중에서 용출된다. RNA는 에탄올을 갖는 용액으로부터 선택적으로 침전되어 기질(바람직하게는, 실리카-함유 멤브레인 또는 필터)과 결합한다. 카오트로픽(chaotropic) 염에 의한 물 분자의 붕괴로 인해 기질과 RNA는 신속하게 결합함으로써 실리카로의 핵산의 흡수를 유리하게 한다. 결합된 RNA 전체는 간단한 세척 단계에 의해 오염성 염, 단백질 및 세포 불순물로부터 추가로 정제된다. 마지막으로, RNA 전체는 뉴클레아제-부재 물을 첨가하여 멤브레인으로부터 용출된다. 이러한 신속한 프로토콜의 전체 시간은 8분 미만, 바람직하게는 6분 미만이다.

요약하면, 신속한 RNA 추출법은,

(a) 생물학적 시스템으로부터 세포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계;

(b) 선택적으로, 상기 샘플로부터 관심 RNA를 갖지 않는 세포를 제거하여 실험 샘플을 준비하는 단계;

(c) 관심 RNA를 함유하는 세포를 용해하여 그의 균질화물을 제조하는 단계;

(d) 선택적으로, 상기 균질화물을 희석시키는 단계;

(e) 습윤화되고 균질화된 실험 샘플을, RNA가 결합하는 물질을 함유하거나 고착되어 있는 기질과 접촉시키는 단계;

(f) 상기 샘플을 상기 기질과 결합시키는 단계;

(g) 오염물 및 간섭물(interferent)을 제거하는 단계;

(h) 기질을 건조시키는 단계; 및

(i) 기질로부터 RNA를 용출시키는 단계를 포함하며,

원심분리가 사용되는 경우에는 단계 (g), (h) 또는 (i) 이후에 이뤄질 수 있으며, 진공/여과는 추출 단계에서 적용되는 것이 바람직하다.

이러한 신속한 추출 방법과 관련된 시약은 다음과 같다.

용해/결합 완충액(바람직하게는, 4.5M 구아니디늄-HCl, 100mM 소듐 포스페이트),

세척 완충액 I(바람직하게는, 5M 구아니딘-HCl 중의 37% 에탄올, 20mM 트리스-HCl),

세척 완충액 II(바람직하게는, 20mM NaCl 중의 80% 에탄올, 2mM 트리스-HCl),

용출 완충액, 및

뉴클레아제-부재 살균된 2회 증류된 증류수.

절에서 암 세포의 분포는 비균일하기 때문에, 많은 절 부분의 샘플을 취하는 것이 바람직하다. 선택적으로, 또한 하나 이상의 절을 병리학에 기초하여 조사할 수 있다. 분자적 시험 및 병리학에 의한 동일한 절에 대한 조사 모두를 수행하기 위한 한 방법은, 절을 병리학적으로 사용하기 위한 하나의 외부 및 내부 부분을 갖고, 분자적 시험을 위한 하나의 외부 및 내부 부분을 갖는 4개 이상의 부분으로 분할하는 것이다. 조직에서의 전이 및 미세전이의 분포가 절 또는 다른 조직에서 균일하지 않기 때문에, 전이를 놓치지 않도록 충분하게 큰 샘플을 수득해야 한다. 본 방법에서 이런 샘플링 작업에 대한 한 접근법은, 큰 조직 샘플을 균질화하고, 이어서 잘 혼합된 균질화된 샘플을 희석하고, 이어서 분자적 시험에 사용하는 것이다.

전형적인 PCR 반응은 다중 증폭 단계, 또는 표적 핵산 종을 선택적으로 증폭하는 사이클을 포함한다. 전형적 PCR 반응은 다음의 세 단계, 즉 표적 핵산이 변성되는 변성 단계; PCR 프라이머 세트(정방향 및 역방향 프라이머)가 상보적 DNA 스트랜드에 어닐링하는 어닐링 단계; 및 열안정성 DNA 중합효소가 프라이머를 연장시키는 연장 단계를 포함한다. 이 단계를 여러번 반복함에 의해, DNA 단편을 증폭하여 표적 DNA 서열에 상응하는 앰플리콘(amplicon)을 생성한다. 전형적인 PCR 반응은 변성, 어닐링 및 연장 사이클을 20회 이상 포함한다. 많은 경우에서, 어닐링 및 연장 단계는 동시에 수행될 수 있고, 이 경우 사이클은 오직 2 단계만을 포함한다.

RT-PCR을 사용하는 방법에서, RT-PCR 증폭 반응은 수술중 진단에 적당한 시간으로 수행되고, 이들 각 단계의 기간은 수 분 범위보다는 수 초 범위일 수 있다. 구체적으로는, 약 5℃/초 이상의 열적 램프 속도(ramp rate)를 가능하게 하는 신규한 특정 가열 사이클러(cycler)를 이용하여, 30분 이하로 RT-PCR 증폭시킨다. 더욱 구체적으로는, RT-PCT 증폭은 25분 이하로 수행된다. 이를 고려하여, PCR 사이클의 각 단계에 제공된 다음의 시간들은 램프 시간(ramp time)을 포함하지 않는다. 변성 단계는 10초 이하로 수행될 수 있다. 실제로, 일부 가열 사이클러는 변성 단계의 최적 기간이 될 수 있는 "0 초"의 세팅 값을 갖는다. 즉, 가열 사이클러가 변성 온도에 충분히 도달된 것을 의미한다. 어닐링 및 연장 단계는 대부분 각각 10초 미만이 가장 바람직하고, 동일한 온도에서 수행되는 경우 어닐링/연장의 조합 단계는 10초 미만이 가장 바람직하다. 그러나, 일부 동종 프로브 탐지 방법은 급속 분석 성능을 최대화하기 위해 분리된 연장 단계를 필요로 할 수 있다. 총 증폭 시간 및 비특정 면 반응의 형성 모두를 최소화하기 위해, 어닐링 온도는 전형적으로 50℃ 초과의 온도이다. 더욱 바람직하게는, 어닐링 온도는 55℃ 초과의 온도이다.

실험자의 개입 없는 RT-PCR에 대한 단일 조합 반응이 여러 가지 이유로 바람직하다: (1) 실험자의 실수로 인한 위험의 감소, (2) 표적 및 생성물 오염에 대한위험의 감소 및 (3) 분석 속도의 증가. 반응은 하나 또는 두 개의 중합효소로 구성될 수 있다. 두 개의 중합효소의 경우, 이 중 하나의 중합효소는 전형적으로 RNA-계 DNA 중합효소(역전사 효소)이고, 다른 하나는 열안정성 DNA-계 DNA 중합효소이다. 분석 성능을 최대화하기 위해, 이런 효소 기능 모두에 대한 "가열 개시(hot start)" 기술 형태를 사용하는 것이 바람직하다. 미국 특허 제 5,411,876 호 및 제 5,985,619 호는 상이한 "가열 개시" 접근법의 예를 제공하고, 이는 본원에 참고로 인용되었다. 바람직한 방법은 충분한 DNA 중합에 필요한 하나 이상의 성분들을 격리시킨(sequester), 하나 이상의 열활성화 방법의 사용을 포함한다. 미국 특허 제 5,550,044 호 및 제 5,413,924 호는 이런 방법에 사용하는 시약의 제조 방법을 기술한다. 미국 특허 제 6,403,341 호는 한 PCR 시약 성분의 화학적 변형을 포함하는 격리(sequestering)를 기술한다. 이들 모두는 본원에 참고로 인용된다. 대부분의 바람직한 실시양태에서, RNA- 및 DNA-의존성 중합효소 활성 모두는 단일 효소에 있다. 충분한 증폭에 필요한 다른 성분은 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 2가 염 및 완충액 성분을 포함한다. 일부 경우에서, 비특이적 핵산 및 효소 안정화제가 유용할 수 있다.

소정의 증폭 기반 분자 진단의 특이성은 프라이머 세트의 일치성에 상당히 의존적이다(단, 전적으로 의존하지는 않는다). 프라이머 세트는 표적 DNA 서열에 어닐링되어 표적 서열이 증폭되어 표적 서열-특이적 앰플리콘을 생성할 수 있게 하는, 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 짝이다. 프라이머는 관심이 되는 질병 상태의 마커를 증폭시킬 수 있어야 한다. 본 발명의 경우에서, 이들마커는 유방암 및 흑색종에 관한 것이다.

유방암의 경우, 본 발명의 방법은 유방 조직 또는 유방암 조직에 특이적인 조직 마커의 증폭을 포함한다. 림프절에서의 유방 및/또는 암 세포를, 이들이 존재하는 경우 임상적으로 중요하고 신뢰성 있게 검출하기 위해 두 개 이상의 마커의 조합이 사용된다. 바람직하게는, 그 마커는 동시에 단일 반응 용기에서 증폭 및 검출된다(즉, 그들은 복합적이다). 가장 바람직하게는, 프라이머 세트는 이런 마커에 대해 특이적인 핵산 단편에 상보적이다. 마커는 맘마글로빈(서열 번호 17) 및 다음 중 하나 이상(바람직하게는 하나)을 포함한다: B305D(서열 번호 14), PIP(서열 번호 18), B726(서열 번호 15), GABA(서열 번호 16) 또는 O8E(서열 번호 ). 조직 특이성 마커 및 암 특이성 마커의 조합은 각각 90% 및 95%를 초과하는 민감성 및 특이성을 제공한다. 일부 마커는, 다른 것들보다 하나의 조직 또는 암에 보다 특이적인 특정 이소 형태(isoform)를 갖는 다양한 이소 형태로 존재한다. B305D의 경우, 가장 바람직한 이소 형태는 B305D 이소 형태 C이다. 또한 맘마글로빈 마커와 조합된 마커가 가장 바람직하다.

흑색종의 경우, 본 발명의 방법은 흑색종 암에 특이적 마커의 증폭을 포함한다. 따라서, 프라이머 세트는 이들 마커에 특이적인 핵산 단편에 상보적이다. 그 마커는 다음 중 하나 이상(바람직하게는 두 개 이상)을 포함한다: 티로시나제(서열 번호 22) 및 MART I(서열 번호 21). 이들 마커는 90%를 초과하는 민감성 및 특이성을 제공한다.

그 반응은 또한 특정 신호를 검출하는 어떤 수단을 함유해야 한다. 이는 관심 표적 서열의 중합으로부터 유도된 DNA 서열의 영역을 검출하는 시약의 사용을 통해 수행되는 것이 바람직하다. 바람직한 검출 시약은 특정 관심 핵산 서열에 결합하는 경우 측정가능한 신호 차이를 제공한다. 종종, 이런 방법은 관심 서열에 결합되는 경우 증가된 형광을 방출하는 핵산 프로브를 포함한다. 본 발명 방법의 PCR 반응의 진행은 전형적으로 각 PCR 프라이머 세트에 대한 상대적인 앰플리콘 생산 속도를 분석하여 모니터링된다. 앰플리콘 생산의 모니터링은 형광 프라이머, 형광단(fluorogenic) 프로브, 및 이중 스트랜드 DNA, 분자 베아콘(beacon), 스코피온(Scorpion) 등에 결합하는 형광 염료를 비제한적으로 포함하는, 많은 검출 시약 및 방법에 의해 수행될 수 있다. 통상적인 PCR 반응의 모니터링 방법은 형광 5' 뉴클레아제 분석을 이용한다. 이 방법은 PCR 공정 도중 올리고머 프로브의 절단(cleave)하는 특정 열안정성 DNA 중합효소(예: Taq 또는 Tfl DNA 중합효소)의 5' 뉴클레아제 활성을 이용한다. 올리고머는 연장 조건 하에서 증폭된 표적 서열에 어닐링하기 위해 선택된다. 전형적으로 프로브는 5' 말단 상의 형광 리포터 및 3' 말단 상의 형광 켄처(quencher) 리포터를 갖는다. 올리고머에 손상을 주지 않는 한, 리포터로부터의 형광 신호는 켄칭된다. 그러나, 연장 공정 도중 올리고머가 소화되면, 형광 리포터는 더 이상 켄처 기능을 수행하지 못 한다. 소정의 앰플리콘에 대한 형광 리포터의 상대적 축적은 대조군 샘플에 대한 동일한 앰플리콘의 축적 및/또는 대조군 유전자, 예컨대 비제한적으로 β-액틴 및 PBDG(porphobilinogen deaminase)에 대한 동일한 앰플리콘의 축적과 비교되어 RNA 집단에서의 소정의 RNA의 비교적 많은 소정의 cDNA 생성물을 측정할 수 있다. 5'뉴클레아제 분석에 대한 제품 및 시약은 상업적으로 용이하게 입수가능하다(예: 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 입수).

바람직한 검출 시약은 통상적으로 "스코피온"이라 불리는 것이고, 미국 특허 제 6,326,145 호 및 제 5,525,494 호에 기술되어 있고, 이들은 본원에 참고로 인용한다. 이들 시약은 테일드(tailed) 프라이머 및 통합 신호 시스템을 포함하는 하나 이상의 분자를 포함한다. 그 프라이머는 주형 결합 영역, 및 링커(linker)와 표적 결합 영역을 포함하는 테일(tail)을 갖는다. 테일 중 표적 결합 영역은 프라이머의 연장 생성물의 상보적 서열과 하이브리드화한다.

이 표적 특이적 하이브리드화가 일어나면 하이브리드화가 탐지가능한 변화를 유도하는 신호 시스템에 커플링된다. 표적 결합 영역 및 테일 영역은 테일 영역이 단일 스트랜딩, 즉 미복제(uncopy) 상태를 유지하기에 유리하게 배열된다. 따라서, 테일 영역은 PCR 증폭 생성물에서는 비증폭성이다. 연결제는 전구체 주형 상에서 중합효소 매개된 쇄 연장을 방지하는 차단 잔기를 포함한다.

스마트 사이클러 써모사이클러(Smart Cycler thermocylcer)[공급원: Cepheid of Sunnvale, California] 및 에이비아이 프리즘 7700 서열 검출 시스템(ABI Prism 7700 Sequence Detection System)[공급원: Applied Biosystems]을 비롯한 PCR 및 QRT-PCR에서 앰프리콘 축적을 조절하고 계측하기 위한 장치 및 소프트웨어도 또한 쉽게 구입할 수 있다.

바람직한 RT-PCR 반응에 있어서 특정 역전사의 양과 PCR 반응 성분은 불규칙적(atypical)이어서 일부 열적 사이클러의 보다 신속한 램프 시간의 이점을 얻는다. 특히, 전구체 농도는 매우 높다.

역전사 반응을 위한 전형적인 유전자 특이적 전구체 농도는 약 20nM 미만이다. 1 내지 2분의 등급에 대해 신속한 전사 반응을 달성하기 위해서 역전사 전구체 농도를 약 20nM 초과, 바람직하게는 약 50nM 이상, 전형적으로는 약 100nM으로 상승시켰다. 표준 PCR 전구체 농도 범위는 100 내지 300nM이다. 더욱 높은 농도를 표준 PCR 반응에 사용하여 Tm 편차를 보상할 수 있다. 그러나, 본원에 있어서 언급된 전구체 농도는 Tm 보상이 불필요한 환경에 대한 것이다. 비례적으로 높은 전구체 농도는 Tm 보상이 필요하거나 바람직한 경우 경험적으로 결정되거나 사용될 수 있다. 신속한 PCR 반응을 달성하기 위해서 PCR 전구체 농도는 전형적으로는 250nM 초과, 바람직하게는 약 300nM 초과, 전형적으로는 약 500nM 초과이다.

상업적으로 사용되는 진단은 또한 바람직하게는 네가티브한 결과를 위한 특정한 증폭 반응의 조작을 하나 이상의 내부 양성 조절의 사용을 이용한다. RT-PCR 반응에서 조절되어야 하는 잘못된 네가티브한 결과들의 잠재적인 원인들은 부적절한 RNA 품질, RNA의 분해, RT 및/또는 PCR의 억제 및 실험 오차를 포함한다. 유전자 발현 평가에 있어서는 유익한 조직에서 구성적으로 발현되는 유전자를 이용하는 것이 바람직하다. 대조용으로서 PBGD를 사용하는 경우 잘못된 네가티브한 결과의 모든 잠재적인 원천으로부터 발생하는 오류 결과가 보고되는 것을 최소화시키거나 없애게 된다.

QRT-PCR을 위한 전술한 방법의 상용화에 있어서 특이적 핵산의 참지를 위한 특정한 키트가 특히 유용하다. 하나의 양태에 있어서 키트는 마커를 증폭시키고탐지하기 위한 시약을 포함한다. 임의적으로, 키트는 림프절 조직으로부터 핵산을 추출시키는 샘플 제조 시약 및/또는 제품(예: 튜브)를 포함한다. 키트는 또한 샘플 오염(예: 림프절 해부 및 제조를 위한 폐기가능한 스칼펠(scalpel) 및 표면)의 리스크를 최소화하는 제품을 포함한다.

바람직한 키트에 있어서 상기 1-튜브 QRT-PCR 공정에 필요한 시약에는 예를 들어 역전사효소, 역전사효소 전구체, 상응하는 PCR 전구체 세트(바람직하게는 마커 및 대조를 위한), 열안정성 DNA 중합효소, 예를 들어 Taq 중합효소, 및 적절한 탐지시약(들), 예를 들어 제한됨이 없이 스코피온 프로브, 형광 5 뉴클리아제 평가를 위한 프로브, 분자 베아콘 프로브, 단일 염료 전구체 또는 형광염료 즉이적 내지 이중 스트랜딩된 DNA, 예를 들어 에티듐 브로마이드가 포함된다. 전구체들은 바람직하게는 전술한 고농도를 생성하는 양으로 된다. 열안정성 DNA 중합효소는 다양한 제조업자로부터 통상적으로 그리고 상업적으로 구입할 수 있다. 키트에서의 추가적인 물질은 적당한 반응 튜브 또는 바이알, 장벽(barrier) 조성물, 전형적으로는 왁스 비드(임의적으로는 마그네슘을 포함); 역전사효소 및 PCR 단계를 위한 반응 혼합물(전형적으로는 10배)(dNTP와 같은 필요한 완충액 및 시약을 포함); 뉴클리아제 또는 R나제(R-Nase) 부재의 물; R나제 억제제, 대조 핵산(들) 및/또는 추가적인 완충액, 화합물, 조-요소(co-factor), 이온성분, 단백질 및 효소, 중합체, 및 기타역전사효소 및/또는 QRT-PCR 반응의 PCR 단계에 사용될 수 있는 것 등을 포함한다. 임의적으로 키트는 핵산 추출제 및 물질을 포함한다.

실시예

실시간 PCR

본 발명에서 실시예는 실시간 PCR의 사용에 기초한다. 실시간 PCR에 있어서, 중합효소 쇄 반응의 생성물은 종지점 측정에 의해서 보다는 PCR의 지수 상 동안 실시간으로 모니터링된다. 그러므로 DNA 및 RNA의 정량화는 더욱더 정밀하며 재생가능하다. 형광값은 매사이클마다 기록되며 증폭반응에서의 지점으로 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 반응의 개시시점에서 주형이 많이 존재하면 할수록 형광신호가 (Ct) 값의 정의인 통계적으로 중요한 상기 배경으로서 처음 기록되는 지점에 도달하는 사이클의 수가 적어진다. 항복전압(Ct)의 개념은 형광계 RT-PCR을 사용하여 정확하고 재생가능한 정량화를 허용한다. PCR 생성물의 균일한 탐지는 바람직하게는 (a) 이중 스트랜딩된 DNA 결합 염료(예: SYBR Green), (b) 형광유전자 프로브(예: Taq Man proves, Molecular Beacons), 및 (c) 직접 표지된 전구체(예: 앰플리플루오르(Amplifluor) 전구체)를 기초로 하여 실행된다.

실시예 1. 타크만 분석(Taqman Assay)을 사용한 실시간 PCR을 기준으로 한 종래기술 방법 및 신속한 방법에 의해 추출된 RNA의 비교

16개의 H&E 양성 절 및 15개의 H&E 음성 유방 절 샘플은 모두 게노믹스 콜래보러티브(Genomics Collaborative)로부터 구입하였다. 2개의 30㎎ 조직 단편을 각각의 절로부터 절단하였다.

제 I 부(종래기술)

하나의 30㎎ 조직 단편을 다음과 같이 처리하였다. 600ul의 완충액 RLT를 첨가하고, 조직 샘플을 일회용 조직 분쇄기(미국 펜실배니아주 웨스트 체스트 소재의 브이더블유알 사이언티픽(VWR Scientific)으로부터 구입가능함, 품번 15704-126)로 20 내지 40초간 수동으로 균질화하였다. 튜브를 에펜도르프(Eppendorf) 모델 5415C 마이크로원심분리기에서 최대 속도로 3분간 원심분리하였다. 상청액을 새 튜브로 옮기고, 70% 에탄올 1부피를 첨가하였다.

샘플(700㎕)을 QIAvac 24 진공 매니폴드상에 놓인 RNeasy 미니 칼럼에 적용하고, 진공을 가하였다. 완충액 RWI(700㎕)을 칼럼을 통해 여과시켰다. 완충액 RPE(500㎕)를 피펫으로 칼럼 위에 따르고, 여과시켰다. 또다른 500㎕의 완충액 RPE를 칼럼에 첨가하고, 여과시켰다. RNeasy 칼럼을 2㎖의 수거 튜브에 놓고, 1분간 최대 속도로 마이크로원심분리기에서 원심분리하였다. 그 다음, RNA를 칼럼으로부터 용리시킨 후, RNeasy 칼럼을 새로운 1.5㎖ 수거 튜브에 옮기고, 50ul의 RNAase가 없는 물을 첨가하고, 8000Xg에서 1분간 원심분리하였다.

제 II 부(신속한 추출)

두 번째 30㎎의 유방 절 조직 단편을 다음과 같은 신속한 프로토콜에 의해 처리하였다: (1) 조직 단편을 600㎕의 완충액 RLT에 첨가하고, 일회용 조직 분쇄기로 20 내지 40초간 수동으로 균질화하였다, (2) 균질화물을 퀴아절단기 칼럼을 통해 30초간 최대 속도로 원심분리시켰다, (3) 70% 에탄올 1부피를 용균화물에 첨가하고, 피펫으로 옮겨 혼합하였다, (4) 그 다음, 샘플을 QIAvac 24 칼럼 매니폴드상에 놓인 RNeasy 미니 칼럼에 적용하고 진공을 가하였다, (5) 700ul의 완충액 RWI를 칼럼에 첨가하고, 칼럼을 통해 여과시켰다, (6) 500ul의 완충액 RPE를 칼럼 위에 첨가하고, 여과시켰다, (7) 칼럼을 2㎖의 수거 튜브에 옮기고, 10,000rpm에서 30초간 원심분리시켰다, (8) 25㎕의 RNAase가 없는 물을 막에 첨가하고, 칼럼을 10,000rpm에서 30초간 원심분리하여 RNA를 용리시켰다. 모델 10MVSS VWR 원심분리기에서 신속한 프로토콜의 모든 원심분리 단계를 수행하였다.

추출된 RNA를 역전사하고, RNA 및 cDNA를 전술한 바와 같이 정량하였다.

타크만 분석에 있어어, 타크만 코어 시약 키트(Taqman Core Reagent Kit), 유전자 앰프 10X PCR 완충액 1, 앰프 이레이즈 우라실 N-글리코시다제(Amp Erase Uracil N-glycosidase), 및 앰플리태크 골드 DNA 중합효소(AmpliTaq Gold DNA Polymerase)는 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈로부터 구입하였다. 그밖의 모든 시약은 실시예 1에 기재된 상업적 공급처로부터 구입하였다. 글리세롤은 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였고, 트윈(Tween) 20은 이스트만 오가닉 케미칼즈(Eastman Organic Chemicals)(미국 뉴욕주 로체스터)로부터 구입하였다.

맘마글로빈 프라이머(서열번호 3 및 서열번호 4)는 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.)(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 의해 합성되고, 맘마글로빈 타크만 프로브(서열번호 7)는 에포크 바이오사이언스(Epoch Biosciences)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 의해 합성되었다. PBGD 프라이머(서열번호 8 및 서열번호 9)는 QIAGEN 오페론(Operon)(미국 캘리포니아주 앨러미다 소재)에 의해 합성되고, 프로브(서열번호 23)는 신테젠 엘엘씨(SYNTHEGEN, LLC)(미국 텍사스주 휴스턴 소재)에 의해 합성되었다. B305D 프라이머(서열번호 11 및 서열번호 12)는 인비트로젠 코포레이션에서 합성되고 프로브(서열번호 13)은어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드에 의해 합성되었다. 모든 타크만 프로브에 있어서, 카복시플루오레세인(FAM) 및 카복시테트라메틸로다민(TAMRA)은 염료 및 켄처 쌍(quencher pair)으로서 사용되었다.

서열번호 3 CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA

서열번호 4 TCTGTGAGCC AAAGG TCTTG CAGA

서열번호 7 6-FAM-TGTTTATGCA ATTAATATAT GACAGCAGTC TTTGTG-TAMRA

서열번호 8 CTGAGGCACC TGGAAGGAGG

서열번호 9 CATCTTCATG CTGGGCAGGG

서열번호 23 6-FAM-CCTGAGGCAC CTGGAAGGAG GCTGCAG TGT-TAMRA

서열번호 11 TCTGATAAAG GCCGTACAAT G

서열번호 12 TCACGACTTG CTGTTTTTGC TC

서열번호 13 6-FAM-ATCAAAAAACA AGCATGGCCTA CACC-TAMRA

타크만 분석에 있어서, 10㎕의 10X PCR 완충액#1, 14㎕의 25mM MgCl₂, 8㎕의 10mM dNTP's, 1㎕의 앰프이레이즈(AmpErase) UNG(1U/㎕), 16㎕의 글리세롤, 1㎕의 1%w/v 트윈 20, 0.75㎕의 앰플리태크 골드(5U/㎕), 5μM 원료로부터 얻은 각각의 프라이머 6㎕, 0.4㎕의 프로브의 10μM 원료 및 96μ의 최종 부피가 되게 하는 양의 물을 첨가하여 마스터 혼합물을 제조하였다. 마스터 혼합물(48㎕) 및 각각의 절 샘플로부터 얻은 2㎕의 cDNA를 각 광반응 마이크로티터 플레이트 웰에 첨가하였다. 선택 캡으로 캡핑한 후, 상기 플레이트를 ABI 프리즘 7900 HT 서열 검출 시스템(어플라이드 바이오시스템즈 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에서 처리하였다. 타크만 PCR 코어 시약 키트, 타크만 DNA 템플레이트 시약, 및 타크만-B-액틴 검출 시약을 비롯한 시판 시약은 어플라이드 바이오시스템즈(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 구입하였고, 분석은 제작자가 추천하는 프로토콜에 따라 수행하였다. 맘마글로빈 분석을 사용한 분석에서는 0.02, B305D 분석을 사용한 분석에서는 0.03, B-액틴 분석을 사용한 분석에서는 0.08, PBDG 분석을 사용한 분석에서는 0.1의 역치 값을 사용하였다. 타크만 분석에 의해 측정된 트리플리케이트의 평균치를 표 3 및 4에 나타냈다.

15개의 H&E 음성 절 샘플 뿐만 아니라 16개의 H&E 양성 절 샘플에서 하우스키핑(housekeeping) 유전자 B-액틴 및 PBDG을 실시간 측정하여 비교한 것을 표 1에 나타내고, 2개의 대조군 cDNA 샘플을 표 1에 나타낸다. 이러한 실험 결과에서는, 신속한 RNA 추출 프로토콜에 의해 추출되는 RNA가 역전사될 수 있고 표준 상업적 프로토콜을 기준으로 추출되는 RNA와 유사한 정도로 PCR이 증폭될 수 있음을 확인해 주는 표준 상업적 방법(QIAGEN) 및 본 발명의 신속한 방법을 이용하여 수득된 Ct 값 사이에 우수한 일치가 있음을 보여준다.

표 2는 유방암 마커 맘마글로빈의 Ct 값을 기준으로 한 유전자 발현 결과와 표 1에서 평가된 동일한 유방 절 샘플을 갖는 B305D를 비교한다. 실시간 PCR 결과를 기준으로 한 H&E 양성 및 H&E 음성 유방 절 샘플 사이에 상관 관계가 있는지의 여부를 결정하기 위해, H&E 음성 절 샘플의 각각의 마커의 가장 낮은 Ct 값을 맘마글로빈 및 B305D 둘다에 대해 확인하였다. H&E 음성 샘플 중에서 가장 낮은 값보다 적은, 임의의 그러나 전형적인 절단의 2.5Ct 값을 H&E 양성 샘플에 적용시켰다. 표 2에 나타내지 않은 샘플은 이들 2개의 유방 마커에 대해 높은 발현을 갖는데, Ct 값이 H&E 음성 샘플 중에서 관찰된 Ct 값보다 적은 2.5 Ct 값 이상이다. 본 발명의 신속한 방법 및 상업적 제작자가 추천하는 프로토콜(QIAGEN) 둘다를 이용한 이들 마커의 발현에 있어서 우수한 상관관계가 있었다.

마커로서 맘마글로빈을 사용한 경우, 15개의 H&E 절 샘플 중 2개의 샘플의 Ct 값은 본 발명의 신속한 방법 및 QIAGEN RNA 추출 프로토콜 사이에 엄격한 상관관계를 나타내지 않았다. 이들 샘플 중 하나인 GCLNC-24에서, Ct 값간의 차이는 0.4이고, 이는 실험 오차내이다. 두 번째 샘플은, 맘마글로빈 및 B305D 둘다를 사용한 Ct 값에서의 큰 차이가 이들 샘플에서 RNA를 스펙트럼으로 정량하는데 있어서의 어려움 뿐만 아니라 절에서의 메타스타제의 잘 확립된 비균일한 분포로 인해 일어날 수 있는 샘플링 문제에 기인할 수도 있음을 보여주었다(세르니(Cserni)의 문헌[1999, Metastases in axillary sentinel lymph nodes in breast cancer as detected by intensive histopathological work up. J. Clin Pathol, 52:0922-924]).

실시예 2. 퀴아절단기 칼럼의 평가

본 실시예의 목적은 림프절 조직의 균질화 후에 퀴아절단기 칼럼이 사용될 수 있으며, 단지 30초 동안의 균질화물의 원심분리로 허용가능한 RNA 추출이 수득된다는 것을 입증하는 것이다.

H&E-음성인 흉부 겨드랑이 절을 제노믹스 콜래보레이티브(Genomics Collaborative)(메사츄세츠 캠브리지)로부터 얻었다. 조직의 490mg 슬라이스를 완충액 RLT 5.5ml와 혼합하고, 상기 절을 균질화하였다. 균질화물 600ml를 제거하고실시예 1에 기술된 급속 추출법을 사용하여 RNA를 추출하였다. 대조군으로서, 다른 균질화물 600μL를, 퀴아절단기 칼럼 대신 3분 원심분리를 사용한 점을 제외하고는 동일한 급속 RNA 추출 방법을 사용하여 처리하였다. 각 반응으로부터의 RNA를 실시예 1에 기술된 바와 같이 역전사하고 정량화하였다. 실시간 PCR를 타크만 프로브(Taqman probe)를 사용하여 수행하였다.

상기 연구의 결과는 RNA 수율이 원심분리 절차에서의 0.34㎍/㎕에 비해 퀴아절단기 절차를 포함하는 절차에서 0.31㎍/㎕로 유사하다는 것을 지시한다. 두 샘플 모두에서 동일한 2.1의 260/280nm 비율이 얻어졌으며, 이는 고품질 RNA를 지시한다. 또한 실시간 PCR 검정으로 맘마글로빈에 대한 유사한 Ct값이 관련 절차에 비해 퀴아절단기 칼럼에 의해 추출된 RNA(22.5 대 22.0), B305D(26.7 대 26.6), 하우스키핑 유전자 PBDG(29.1 대 29.0), 및 B-액틴(서열 번호 19, 18.5 대 18.2)에 대해 얻어진다는 것이 지시된다.

요약하면, 본 실험은 균질화 후에 3분 원심분리 단계 대신 퀴아절단기를 포함하는 절차로 유사한 RNA 수율, 품질 및 실시간 PCR 증폭 결과가 얻어진다는 것을 지시한다. 이는 RNA 추출을 수행하는데 소요되는 시간을 2.5분 단축시키며, 이는 환자 관리를 수행하는데 빠른 결과가 요구되는 수술 및 다른 용도에 적합한 절차를 개발하는데 중요하다.

실시예 3. 용해물 희석이 RNA 수율 및 정확도에 미치는 영향

하기 실시예는 용해물 희석이 RNA 수율 및 RNA 복구의 정확도에 미치는 영향을 설명한다. 이 실시예에서, 동결된 돼지 절 조직 20mg, 10mg 또는 5mg을 절단하였다. 조직을 50ml 일회용 조직 그라인더를 사용하여 30초 동안 분쇄하고, 샘플을 와동시켰다. 각 절 중량에 대해 3회 반복 수행하였다. 각 용해물 1ml를 1.7ml 미세원심분리관에 옮긴 후 에펜도르프 마이크로퓨지(microfuge)에서 최대 속도(14,000RPM)로 30초 동안 원심분리하였다. 700㎕를 퀴아절단기 칼럼을 통해 원심분리하고 샘플을 최대 속도로 30초 동안 원심분리하였다. 이후 칼럼을 세척하고, 칼럼을 건조시키고, 앞서 실시예 2, I부의 단계 4 내지 8에 기술된 바와 같이 RNA를 용리시켰다. RNA를 Gene Spec II를 사용하여 정량화하였다. 상기 연구의 결과를 표 3 및 4에 나타내며, 이는 10mg 및 20mg 절 조직을 포함하는 더 무거운 중량의 샘플에 비해 균질화 완충액 600ml중에 균질화된 2.5mg의 초기 절 조직 중량에서 우수한 정확도를 나타낸다. 상기 결과는 더 낮은 절 중량에서 RNA 복구의 정확도가 더욱 개선될 수 있다는 것을 지시한다. 또한, 더욱 묽은 균질화물이 상기 칼럼을 통해 더욱 빨리 여과될 것이 예상되며, 이에는 필터 막힘의 잠재적인 문제가 더욱 적다.

실시예 4: 림프절 샘플로부터의 RNA의 타크만 시험

역전사

20ug 전체 RNA로부터 42℃에서 60분 동안 50mM Tris-Cl pH 8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 10mM DTT, 2000U 슈퍼스크립트(Superscript), 400U Rnasin, 2ug 올리고 dT 프라이머, 0.08mg/ml BSA 및 0.2mM의 각각 dACT, dCTP, dGTP 및 TTP를 함유하는 250ul 반응물중에서 cDNA를 합성하였다. 생성된 cDNA를 물 중에서 1:8로 희석하였다.

PCR 증폭

각각의 희석된 cDNA 2ul를 50ml의 웰당 전체 부피로 어플라이드 바이오시스템즈 7900에서 증폭시켰다. 증폭은 하기 절차로 수행되었다: 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분 동안, 이후 95℃에서 15초, 60℃에서 1분 동안(B726에 대해 58℃) 및 68℃에서 1분 동안의 40사이클. 반응 혼합물 성분 및 최종 농도는 다음과 같다: 1X 타크만 완충액 A(ABI), 3.5mM MgCl₂, 0.2mM의 dGTP, dCTP 및 cATP, 0.4mM dUTP(ABI), 0.01u/ul AmpErase UNG(ABI), 0.0375U/ul AmpliTaq Gold(ABI), 8% 글리세롤(시그마), 0.01% 트윈(Tween) 20(코닥), 0.3uM 각각의 프라이머(인비트로겐(Invitrogen)), RNA분해효소/DNA분해효소 없는 물(시그마) 및 40nM 5'-FAM, 3'TAMRA 올리고누클레오타이드 프로브(신세젠(Synthegen)). 내부 대조 염료(ROX)에 대한 신호의 역치는 각 프라이머/프로브에 대해 PCR 생성물의 증가로 인한 형광 강도의 증가의 대수적 선형 범위 내로 설정되도록 할당되었다. 결과적인 Ct값은 모든 시험된 샘플에 대한 유전자의 상대 발현을 결정하기 위해 사용되었다.

사용된 프라이머:

맘마글로빈

프라이머 1, 서열 번호 3 - CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA

프라이머 2, 서열 번호 4 - TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA

프로브, 서열 번호 7 - FAM-TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG-TAMRA

B305D

프라이머 1, 서열 번호 11 - TCTGATAAAGGCCGTACAATG

프라이머 2, 서열 번호 12 - TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC

프로브, 서열 번호 24 - FAM ATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACACC

PBGD

프라이머 1, 서열 번호 25 - CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA

프라이머 2, 서열 번호 26 - CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA

프로브, 서열 번호 23 - FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT-TAMRA

PIP

프라이머 1, 서열 번호 27 - GCTTGGTGGTTAAAACTTACC

프라이머 2, 서열 번호 28 - TGAACAGTTCTGTTGGTGTA

프로브, 서열 번호 29 - FAM-CTGCCTGCCTATGTGACGACAATCCGG-TAMRA

GABA

프라이머 1, 서열 번호 30 - CAATTTTGGTGGAGAACCCG

프라이머 2, 서열 번호 31 - GCTGTCGGAGGTATATGGTG

프로브, 서열 번호 32 - FAM-CATTTCAGAGAGTAACATGGACTACACA-TAMRA

B726

프라이머 1, 서열 번호 33 - GCAAGTGCCAATGATCAGAGG

프라이머 2, 서열 번호 34 - ATATAGACTCAGGTATACACACT

프로브, 서열 번호 35 - FAM TCCCATCAGAATCCAAACAAGAGGAAG

결과:

첨부된 표는 11개의 조직학-음성 및 24개의 조직학-양성 림프절에 대해 수득된 Ct 값을 포함한다. 조직학-음성 샘플에서 관찰된 최저 Ct로부터 2.5사이클을 빼서 각 마커에 대한 포지티비티(positivity)의 컷오프를 결정하였다. 상기 기준을 바탕으로, 개별 마커에 대한 검출률을 결정하였다. 최적의 보상은 B305D A/C와 조합된 맘마글로빈에서 나타나며, 상기 조합물은 23/24 조직학-양성 샘플을 검출한다. 맘마글로빈, B305D 및 GABA의 조합물은 모든 24개의 샘플을 검출하였다. 표 5를 참조한다.

실시예 5: 다중 표지

역전사

고정된 올리고 dT 프라이머를 사용하여 100㎕ 반응물에서 42℃에서 60분 동안 20㎍의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 희석된 cDNA 20ng 각각을 50㎖의 웰당 총 부피로 어플라이드 바이오시스템즈 7900에서 증폭하였다. 하기 프로토콜에 따라 증폭을 수행하였다: 94℃에서 2분; 이어 94℃에서 15초, 62℃에서 15초의 50회 주기 및 72℃에서 45초. 반응 혼합물 성분 및 최종 농도는 다음과 같다:1×PCR 완충액(아비); 2.5mM 최종 MgCl₂, 0.05mM의 dGTP, dCTP, cATP 및 TTP; 과량(5 내지 20배)의 2종의 항-타크 항체(TP4-9 및 TP1-12)를 함유하는 타크 중합효소 0.05U/㎕; 각각의 프라이머(인비트로겐) 0.2μM; RNase/DNase가 없는 물(시그마); 및 SYBR 그린 저장액(시그마)의 1:12,000 희석액. 증폭 프라이머 서열은 림프절 타크만 시험에서 사용된 것과 동일하다. 275 형광 단위의 일반적인 역치값을 사용하여 Ct 값을 측정하였다. 이어, Ct 값을 정량적 유전자 발현으로 전환하고, 배경 발현으로부터 전이성 림프절을 구별하는데 필요한 최소 수준의 유전자 발현에 근접한 것으로 추축되는 컷오프에 대해 플롯하였다.

사용된 프라이머:

맘마글로빈

프라이머 1, 서열 번호 3 - CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA

프라이머 2, 서열 번호 4 - TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA

B305D

프라이머 1, 서열 번호 11 - TCTGATAAAGGCCGTACAATG

프라이머 2, 서열 번호 12 - TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC

표 6 내지 표 8에서 도시된 이 데이터는 거의 대다수의 유방암 샘플을 포함하는 것을 수득하기 위해 유전자인 맘마글로빈 및 B305 신호를 조합하는 능력을 나타낸다.

실시예 5: 정제된 RNA로부터의 신속한 RT-PCR

맘마글로빈 시험관내 전사체 RNA(100,000 복제)를 백혈구 RNA 20ng내에서 희석하고, 50mM 비신/KOH, pH 8.2, 115mM 아세트산칼륨, 8% v/v 글리세롤, BSA 0.2㎎/㎖, 150mM 트레할로즈, 0.2% v/v 트윈 20, 0.2mM 트리스-Cl(pH 8.5), 3.5mM MnSO₄, 0.3mM dATP, 0.3mM dCTP, 0.3mM dGTP, 0.3mM TTP, Tth 100U/㎖, 항체 TP6-25.3 20㎍/㎖, 0.45μM 맘마글로빈 스코피온 및 0.5μM 맘마글로빈 프라이머를 포함하는 반응물중에서 세페이드 스마트 사이클러 II에서 1-단계 RP-PCR 증폭에 수행하였다.

PCR 조건은 하기와 같다(별표는 형광이 측정된 주기의 부분을 나타낸다.):

조건 A: 95℃에서 3초, 60℃에서 7분, 70℃에서 2분, 이어 95℃에서 3초, 54℃에서 6초의 40회 주기^*및 68℃에서 6초 - 총 시간: 34분

조건 B: 95℃에서 3초, 60℃에서 3분, 이어 95℃에서 3초, 54℃에서 6초의 40회 주기^*및 68℃에서 6초 - 총 시간: 29분

조건 C: 95℃에서 3초, 60℃에서 3분, 이어 95℃에서 3초, 58℃에서 6초의 40회 주기^*및 68℃에서 6초 - 총 시간: 26분

이 분석의 결과는 하기 표에 나타나 있다:

상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 역전사 단계의 시간을 9분에서 3분으로 줄여도 분석 성능에 대한 어떠한 인식가능한 영향을 미치지 않는다. 어닐링 온도를 58℃로 증가시켜도 증폭의 최소 효과만을 나타내며, 총 RT-PCR 시간을 26분으로 감소시킨다. 또한, 주기 시간의 감소는 보다 높은 최적 분석 온도를 갖는 프러이머 및 프로브의 구성에 의해 달성될 수 있다.

실시예 6: 림프절 전이의 검출(예시적임)을 위한 신속한 다중 RT-PCR 분석

이 실시예에서, 정제된 림프절 RNA(양성 결과를 수득하는데 필요한 주기의수를 감소시키는데 사용되는 반응물 100㎕ 당 총 RNA 100ng 이상)를 세페이드 스마트 사이클러 II에서 1-단계 RP-PCR 증폭에 수행하였다. 반응물은 50mM 비신/KOH, pH 8.2, 115mM 아세트산칼륨, 8% v/v 글리세롤, BSA 0.2㎎/㎖, 150mM 트레할로즈, 0.2% v/v 트윈 20, 0.2mM 트리스-Cl(pH 8), 3.5mM MnSO₄또는 Mn(아세테이트), 0.3mM dATP, 0.3mM dCTP, 0.3mM dGTP, 0.3mM TTP, Tth 100U/㎖, 항체 TP6-25.3 20㎍/㎖, 0.4 내지 0.8μM 각각의 스코피온 및 프라이머를 포함한다. 비특이적 프라이밍 사건(priming event)을 최소화하고, 이들이 다중 증폭/검출과 상용성이 되도록 스코피온 및 프라이머 서열을 디자인하였으며, 하기의 신속한 RT-PCR 프로파일을 갖는다:

95℃에서 3초, 60℃에서 3분, 이어 95℃에서 1초, 65℃에서 6초의 32회 주기^*및 72℃에서 3초 - 총 증폭 시간: 16분

완료하는데 4분 이하의 시간을 사용하여 총 분석 시간이 20분 이하가 되는 상술한 신속한 샘플 제조 방법을 사용한다.

림프절로의 유방암의 전이를 검출하기 위해, 유전자인 맘마글로빈, B305D 및 PBGD를 증폭한다. 맘마글로빈 및/또는 B305D 신호는 전이를 나타내지만, PBGD는 하우스키핑 유전자로서 사용한다. 이 실시예에서, 암-양성 림프절에 대한 Ct 값은 맘마글로빈의 경우에 12 내지 30의 범위이고, B305D의 경우에 12 내지 28의 범위이며, 이 Ct 범위에서의 이들 유전자의 검출은 암-양성 림프절을 나타낸다. 이 실시예에서, 대조군 유전자인 PBGD에 대한 Ct 값은 암-음성 결과가 유효한 것으로 간주되기 위해서 24 내지 30회 주기의 범위내에 있어야 한다.

림프절로의 흑색종의 전이를 검출하기 위해, (1) 흑색종을 포함하는 것으로 의심되는 림프절을 처리하고, (2) 유전자인 MART1, 티로시나제 및 PBGD를 증폭한다는 것을 제외하고는 상기와 동일한 조건을 사용한다. MART1 및/또는 티로시나제 신호는 림프절로의 흑색종의 전이를 나타내지만, PBGD는 하우스키핑 유전자로서 사용한다. 이 실시예에서, 암-양성 림프절에 대한 Ct 값은 티로시나제의 경우에 18 내지 30의 범위이고, MART1의 경우에 12 내지 27의 범위이며, 이 범위에서의 이들 유전자의 검출은 암-양성 림프절을 나타낸다. 이 실시예에서, 대조군 유전자인 PBGD에 대한 Ct 값은 암-음성 결과가 유효한 것으로 간주되기 위해서 24 내지 30회 주기의 범위내에 있어야 한다.

본 발명에 따르면, 수술중 림프절 미세전이를 신속하게 효율적으로 확인할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> veridex, LLC <120> INOPERATIVE LYMPH NODE ASSAY <130> CDS 5009 <160> 35 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 1 atgactgcct tgcctcctca gta 23 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 2 ggctgttgct tggacttctc taaaga 26 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 3 caaacggatg aaactctgag caatgttga 29 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 4 tctgtgagcc aaaggtcttg caga 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 5 ggccaacaaa gctcaggaca aca 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 6 gcagtgactt cgtcatttgg acgta 25 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Probe <400> 7 tgtttatgca attaatatat gacagcagtc tttgtg 36 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 8 ctgaggcacc tggaaggagg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 9 catcttcatg ctgggcaggg 20 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 10 ctgaggcacc tggaaggagg ctgcagtgt 29 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 11 tctgataaag gccgtacaat g 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 12 tcacgacttg ctgtttttgc tc 22 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Probe <400> 13 atcaaaaaac aagcatggcc tacacc 26 <210> 14 <211> 1155 <212> DNA <213> Human <400> 14 atggtggttg aggttgattc catgccggct gcctcttctg tgaagaagcc atttggtctc 60 aggagcaaga tgggcaagtg gtgctgccgt tgcttcccct gctgcaggga gagcggcaag 120 agcaacgtgg gcacttctgg agaccacgac gactctgcta tgaagacact caggagcaag 180 atgggcaagt ggtgccgcca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagtggcaa gagcaacgtg 240 ggcgcttctg gagaccacga cgactctgct atgaagacac tcaggaacaa gatgggcaag 300 tggtgctgcc actgcttccc ctgctgcagg gggagcagca agagcaaggt gggcgcttgg 360 ggagactacg atgacagtgc cttcatggag cccaggtacc acgtccgtgg agaagatctg 420 gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg 480 ctcagggaca ctgacgtgaa caagcaggac aagcaaaaga ggactgctct acatctggcc 540 tctgccaatg ggaattcaga agtagtaaaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaat 600 gtccttgaca acaaaaagag gacagctctg ataaaggccg tacaatgcca ggaagatgaa 660 tgtgcgttaa tgttgctgga acatggcact gatccaaata ttccagatga gtatggaaat 720 accactctgc actacgctat ctataatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta 780 tatggtgctg atatcgaatc aaaaaacaag catggcctca caccactgtt acttggtgta 840 catgagcaaa aacagcaagt cgtgaaattt ttaattaaga aaaaagcgaa tttaaatgca 900 ctggatagat atggaaggac tgctctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata 960 gtcagccttc tacttgagca aaatattgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg 1020 gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gccagttact ttctgactac 1080 aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaaa tgtctcaaga 1140 accagaaata aataa 1155 <210> 15 <211> 3865 <212> DNA <213> Human <400> 15 tccgagctga ttacagacac caaggaagat gctgtaaaga gtcagcagcc acagccctgg 60 ctagctggcc ctgtgggcat ttattagtaa agttttaatg acaaaagctt tgagtcaaca 120 cacccgtggg taattaacct ggtcatcccc accctggaga gccatcctgc ccatgggtga 180 tcaaagaagg aacatctgca ggaacacctg atgaggctgc acccttggcg gaaagaacac 240 ctgacacagc tgaaagcttg gtggaaaaaa cacctgatga ggctgcaccc ttggtggaaa 300 gaacacctga cacggctgaa agcttggtgg aaaaaacacc tgatgaggct gcatccttgg 360 tggagggaac atctgacaaa attcaatgtt tggagaaagc gacatctgga aagttcgaac 420 agtcagcaga agaaacacct agggaaatta cgagtcctgc aaaagaaaca tctgagaaat 480 ttacgtggcc agcaaaagga agacctagga agatcgcatg ggagaaaaaa gaagacacac 540 ctagggaaat tatgagtccc gcaaaagaaa catctgagaa atttacgtgg gcagcaaaag 600 gaagacctag gaagatcgca tgggagaaaa aagaaacacc tgtaaagact ggatgcgtgg 660 caagagtaac atctaataaa actaaagttt tggaaaaagg aagatctaag atgattgcat 720 gtcctacaaa agaatcatct acaaaagcaa gtgccaatga tcagaggttc ccatcagaat 780 ccaaacaaga ggaagatgaa gaatattctt gtgattctcg gagtctcttt gagagttctg 840 caaagattca agtgtgtata cctgagtcta tatatcaaaa agtaatggag ataaatagag 900 aagtagaaga gcctcctaag aagccatctg ccttcaagcc tgccattgaa atgcaaaact 960 ctgttccaaa taaagccttt gaattgaaga atgaacaaac attgagagca gatccgatgt 1020 tcccaccaga atccaaacaa aaggactatg aagaaaattc ttgggattct gagagtctct 1080 gtgagactgt ttcacagaag gatgtgtgtt tacccaaggc tacacatcaa aaagaaatag 1140 ataaaataaa tggaaaatta gaagagtctc ctaataaaga tggtcttctg aaggctacct 1200 gcggaatgaa agtttctatt ccaactaaag ccttagaatt gaaggacatg caaactttca 1260 aagcagagcc tccggggaag ccatctgcct tcgagcctgc cactgaaatg caaaagtctg 1320 tcccaaataa agccttggaa ttgaaaaatg aacaaacatt gagagcagat gagatactcc 1380 catcagaatc caaacaaaag gactatgaag aaagttcttg ggattctgag agtctctgtg 1440 agactgtttc acagaaggat gtgtgtttac ccaaggctrc rcatcaaaaa gaaatagata 1500 aaataaatgg aaaattagaa gggtctcctg ttaaagatgg tcttctgaag gctaactgcg 1560 gaatgaaagt ttctattcca actaaagcct tagaattgat ggacatgcaa actttcaaag 1620 cagagcctcc cgagaagcca tctgccttcg agcctgccat tgaaatgcaa aagtctgttc 1680 caaataaagc cttggaattg aagaatgaac aaacattgag agcagatgag atactcccat 1740 cagaatccaa acaaaaggac tatgaagaaa gttcttggga ttctgagagt ctctgtgaga 1800 ctgtttcaca gaaggatgtg tgtttaccca aggctrcrca tcaaaaagaa atagataaaa 1860 taaatggaaa attagaagag tctcctgata atgatggttt tctgaaggct ccctgcagaa 1920 tgaaagtttc tattccaact aaagccttag aattgatgga catgcaaact ttcaaagcag 1980 agcctcccga gaagccatct gccttcgagc ctgccattga aatgcaaaag tctgttccaa 2040 ataaagcctt ggaattgaag aatgaacaaa cattgagagc agatcagatg ttcccttcag 2100 aatcaaaaca aaagaasgtt gaagaaaatt cttgggattc tgagagtctc cgtgagactg 2160 tttcacagaa ggatgtgtgt gtacccaagg ctacacatca aaaagaaatg gataaaataa 2220 gtggaaaatt agaagattca actagcctat caaaaatctt ggatacagtt cattcttgtg 2280 aaagagcaag ggaacttcaa aaagatcact gtgaacaacg tacaggaaaa atggaacaaa 2340 tgaaaaagaa gttttgtgta ctgaaaaaga aactgtcaga agcaaaagaa ataaaatcac 2400 agttagagaa ccaaaaagtt aaatgggaac aagagctctg cagtgtgaga ttgactttaa 2460 accaagaaga agagaagaga agaaatgccg atatattaaa tgaaaaaatt agggaagaat 2520 taggaagaat cgaagagcag cataggaaag agttagaagt gaaacaacaa cttgaacagg 2580 ctctcagaat acaagatata gaattgaaga gtgtagaaag taatttgaat caggtttctc 2640 acactcatga aaatgaaaat tatctcttac atgaaaattg catgttgaaa aaggaaattg 2700 ccatgctaaa actggaaata gccacactga aacaccaata ccaggaaaag gaaaataaat 2760 actttgagga cattaagatt ttaaaagaaa agaatgctga acttcagatg accctaaaac 2820 tgaaagagga atcattaact aaaagggcat ctcaatatag tgggcagctt aaagttctga 2880 tagctgagaa cacaatgctc acttctaaat tgaaggaaaa acaagacaaa gaaatactag 2940 aggcagaaat tgaatcacac catcctagac tggcttctgc tgtacaagac catgatcaaa 3000 ttgtgacatc aagaaaaagt caagaacctg ctttccacat tgcaggagat gcttgtttgc 3060 aaagaaaaat gaatgttgat gtgagtagta cgatatataa caatgaggtg ctccatcaac 3120 cactttctga agctcaaagg aaatccaaaa gcctaaaaat taatctcaat tatgcmggag 3180 atgctctaag agaaaataca ttggtttcag aacatgcaca aagagaccaa cgtgaaacac 3240 agtgtcaaat gaaggaagct gaacacatgt atcaaaacga acaagataat gtgaacaaac 3300 acactgaaca gcaggagtct ctagatcaga aattatttca actacaaagc aaaaatatgt 3360 ggcttcaaca gcaattagtt catgcacata agaaagctga caacaaaagc aagataacaa 3420 ttgatattca ttttcttgag aggaaaatgc aacatcatct cctaaaagag aaaaatgagg 3480 agatatttaa ttacaataac catttaaaaa accgtatata tcaatatgaa aaagagaaag 3540 cagaaacaga aaactcatga gagacaagca gtaagaaact tcttttggag aaacaacaga 3600 ccagatcttt actcacaact catgctagga ggccagtcct agcatcacct tatgttgaaa 3660 atcttaccaa tagtctgtgt caacagaata cttattttag aagaaaaatt catgatttct 3720 tcctgaagcc tacagacata aaataacagt gtgaagaatt acttgttcac gaattgcata 3780 aagctgcaca ggattcccat ctaccctgat gatgcagcag acatcattca atccaaccag 3840 aatctcgctc tgtcactcag gctgg 3865 <210> 16 <211> 3282 <212> DNA <213> Human <400> 16 gggacagggc tgaggatgag gagaaccctg gggacccaga agaccgtgcc ttgcccggaa 60 gtcctgcctg taggcctgaa ggacttgccc taacagagcc tcaacaacta cctggtgatt 120 cctacttcag ccccttggtg tgagcagctt ctcaacatga actacagcct ccacttggcc 180 ttcgtgtgtc tgagtctctt cactgagagg atgtgcatcc aggggagtca gttcaacgtc 240 gaggtcggca gaagtgacaa gctttccctg cctggctttg agaacctcac agcaggatat 300 aacaaatttc tcaggcccaa ttttggtgga gaacccgtac agatagcgct gactctggac 360 attgcaagta tctctagcat ttcagagagt aacatggact acacagccac catatacctc 420 cgacagcgct ggatggacca gcggctggtg tttgaaggca acaagagctt cactctggat 480 gcccgcctcg tggagttcct ctgggtgcca gatacttaca ttgtggagtc caagaagtcc 540 ttcctccatg aagtcactgt gggaaacagg ctcatccgcc tcttctccaa tggcacggtc 600 ctgtatgccc tcagaatcac gacaactgtt gcatgtaaca tggatctgtc taaatacccc 660 atggacacac agacatgcaa gttgcagctg gaaagctggg gctatgatgg aaatgatgtg 720 gagttcacct ggctgagagg gaacgactct gtgcgtggac tggaacacct gcggcttgct 780 cagtacacca tagagcggta tttcacctta gtcaccagat cgcagcagga gacaggaaat 840 tacactagat tggtcttaca gtttgagctt cggaggaatg ttctgtattt cattttggaa 900 acctacgttc cttccacttt cctggtggtg ttgtcctggg tttcattttg gatctctctc 960 gattcagtcc ctgcaagaac ctgcattgga gtgacgaccg tgttatcaat gaccacactg 1020 atgatcgggt cccgcacttc tcttcccaac accaactgct tcatcaaggc catcgatgtg 1080 tacctgggga tctgctttag ctttgtgttt ggggccttgc tagaatatgc agttgctcac 1140 tacagttcct tacagcagat ggcagccaaa gataggggga caacaaagga agtagaagaa 1200 gtcagtatta ctaatatcat caacagctcc atctccagct ttaaacggaa gatcagcttt 1260 gccagcattg aaatttccag cgacaacgtt gactacagtg acttgacaat gaaaaccagc 1320 gacaagttca agtttgtctt ccgagaaaag atgggcagga ttgttgatta tttcacaatt 1380 caaaacccca gtaatgttga tcactattcc aaactactgt ttcctttgat ttttatgcta 1440 gccaatgtat tttactgggc atactacatg tatttttgag tcaatgttaa atttcttgca 1500 tgccataggt cttcaacagg acaagataat gatgtaaatg gtattttagg ccaagtgtgc 1560 acccacatcc aatggtgcta caagtgactg aaataatatt tgagtctttc tgctcaaaga 1620 atgaagctcc aaccattgtt ctaagctgtg tagaagtcct agcattatag gatcttgtaa 1680 tagaaacatc agtccattcc tctttcatct taatcaagga cattcccatg gagcccaaga 1740 ttacaaatgt actcagggct gtttattcgg tggctccctg gtttgcattt acctcatata 1800 aagaatggga aggagaccat tgggtaaccc tcaagtgtca gaagttgttt ctaaagtaac 1860 tatacatgtt ttttactaaa tctctgcagt gcttataaaa tacattgttg cctatttagg 1920 gagtaacatt ttctagtttt tgtttctggt taaaatgaaa tatgggctta tgtcaattca 1980 ttggaagtca atgcactaac tcaataccaa gatgagtttt taaataatga atattattta 2040 ataccacaac agaattatcc ccaatttcca ataagtccta tcattgaaaa ttcaaatata 2100 agtgaagaaa aaattagtag atcaacaatc taaacaaatc cctcggttct aagatacaat 2160 ggattcccca tactggaagg actctgaggc tttattcccc cactatgcat atcttatcat 2220 tttattatta tacacacatc catcctaaac tatactaaag cccttttccc atgcatggat 2280 ggaaatggaa gatttttttg taacttgttc tagaagtctt aatatgggct gttgccatga 2340 aggcttgcag aattgagtcc attttctagc tgcctttatt cacatagtga tggggtacta 2400 aaagtactgg gttgactcag agagtcgctg tcattctgtc attgctgcta ctctaacact 2460 gagcaacact ctcccagtgg cagatcccct gtatcattcc aagaggagca ttcatccctt 2520 tgctctaatg atcaggaatg atgcttatta gaaaacaaac tgcttgaccc aggaacaagt 2580 ggcttagctt aagtaaactt ggctttgctc agatccctga tccttccagc tggtctgctc 2640 tgagtggctt atcccgcatg agcaggagcg tgctggccct gagtactgaa ctttctgagt 2700 aacaatgaga cacgttacag aacctatgtt caggttgcgg gtgagctgcc ctctccaaat 2760 ccagccagag atgcacattc ctcggccagt ctcagccaac agtaccaaaa gtgatttttg 2820 agtgtgccag ggtaaaggct tccagttcag cctcagttat tttagacaat ctcgccatct 2880 ttaatttctt agcttcctgt tctaataaat gcacggcttt acctttcctg tcagaaataa 2940 accaaggctc taaaagatga tttcccttct gtaactccct agagccacag gttctcattc 3000 cttttcccat tatacttctc acaattcagt ttctatgagt ttgatcacct gattttttta 3060 acaaaatatt tctaacggga atgggtggga gtgctggtga aaagagatga aatgtggttg 3120 tatgagccaa tcatatttgt gattttttaa aaaaagttta aaaggaaata tctgttctga 3180 aaccccactt aagcattgtt tttatataaa aacaatgata aagatgtgaa ctgtgaaata 3240 aatataccat attagctacc caccaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3282 <210> 17 <211> 503 <212> DNA <213> Human <400> 17 gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60 atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 120 ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact 180 gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 240 gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgaggtgttt 300 atgcaattaa tatatgacag cagtctttgt gatttatttt aactttctgc aagacctttg 360 gctcacagaa ctgcagggta tggtgagaaa ccaactacgg attgctgcaa accacacctt 420 ctctttctta tgtcttttta ctacaaacta caagacaatt gttgaaacct gctatacatg 480 tttattttaa taaattgatg gca 503 <210> 18 <211> 503 <212> DNA <213> Human <400> 18 gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60 atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 120 ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact 180 gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 240 gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgaggtgttt 300 atgcaattaa tatatgacag cagtctttgt gatttatttt aactttctgc aagacctttg 360 gctcacagaa ctgcagggta tggtgagaaa ccaactacgg attgctgcaa accacacctt 420 ctctttctta tgtcttttta ctacaaacta caagacaatt gttgaaacct gctatacatg 480 tttattttaa taaattgatg gca 503 <210> 19 <211> 1793 <212> DNA <213> Human <400> 19 cgcgtccgcc ccgcgagcac agagcctcgc ctttgccgat ccgccgcccg tccacacccg 60 ccgccagctc accatggatg atgatatcgc cgcgctcgtc gtcgacaacg gctccggcat 120 gtgcaaggcc ggcttcgcgg gcgacgatgc cccccgggcc gtcttcccct ccatcgtggg 180 gcgccccagg caccagggcg tgatggtggg catgggtcag aaggattcct atgtgggcga 240 cgaggcccag agcaagagag gcatcctcac cctgaagtac cccatcgagc acggcatcgt 300 caccaactgg gacgacatgg agaaaatctg gcaccacacc ttctacaatg agctgcgtgt 360 ggctcccgag gagcaccccg tgctgctgac cgaggccccc ctgaacccca aggccaaccg 420 cgagaagatg acccagatca tgtttgagac cttcaacacc ccagccatgt acgttgctat 480 ccaggctgtg ctatccctgt acgcctctgg ccgtaccact ggcatcgtga tggactccgg 540 tgacggggtc acccacactg tgcccatcta cgaggggtat gccctccccc atgccatcct 600 gcgtctggac ctggctggcc gggacctgac tgactacctc atgaagatcc tcaccgagcg 660 cggctacagc ttcaccacca cggccgagcg ggaaatcgtg cgtgacatta aggagaagct 720 gtgctacgtc gccctggact tcgagcaaga gatggccacg gctgcttcca gctcctccct 780 ggagaagagc tacgagctgc ctgacggcca ggtcatcacc attggcaatg agcggttccg 840 ctgccctgag gcactcttcc agccttcctt cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga 900 aactaccttc aactccatca tgaagtgtga cgtggacatc cgcaaagacc tgtacgccaa 960 cacagtgctg tctggcggca ccaccatgta ccctggcatt gccgacagga tgcagaagga 1020 gatcactgcc ctggcaccca gcacaatgaa gatcaagatc attgctcctc ctgagcgcaa 1080 gtactccgtg tggatcggcg gctccatcct ggcctcgctg tccaccttcc agcagatgtg 1140 gatcagcaag caggagtatg acgagtccgg cccctccatc gtccaccgca aatgcttcta 1200 ggcggactat gacttagttg cgttacaccc tttcttgaca aaacctaact tgcgcagaaa 1260 acaagatgag attggcatgg ctttatttgt tttttttgtt ttgttttggt tttttttttt 1320 tttttggctt gactcaggat ttaaaaactg gaacggtgaa ggtgacagca gtcggttgga 1380 gcgagcatcc cccaaagttc acaatgtggc cgaggacttt gattgcacat tgttgttttt 1440 ttaatagtca ttccaaatat gagatgcatt gttacaggaa gtcccttgcc atcctaaaag 1500 ccaccccact tctctctaag gagaatggcc cagtcctctc ccaagtccac acaggggagg 1560 tgatagcatt gctttcgtgt aaattatgta atgcaaaatt tttttaatct tcgccttaat 1620 acttttttat tttgttttat tttgaatgat gagccttcgt gccccccctt cccccttttt 1680 gtcccccaac ttgagatgta tgaaggcttt tggtctccct gggagtgggt ggaggcagcc 1740 agggcttacc tgtacactga cttgagacca gttgaataaa agtgcacacc tta 1793 <210> 20 <211> 1377 <212> DNA <213> Human <400> 20 cacacagcct actttccaag cggagccatg tctggtaacg gcaatgcggc tgcaacggcg 60 gaagaaaaca gcccaaagat gagagtgatt cgcgtgggta cccgcaagag ccagcttgct 120 cgcatacaga cggacagtgt ggtggcaaca ttgaaagcct cgtaccctgg cctgcagttt 180 gaaatcattg ctatgtccac cacaggggac aagattcttg atactgcact ctctaagatt 240 ggagagaaaa gcctgtttac caaggagctt gaacatgccc tggagaagaa tgaagtggac 300 ctggttgttc actccttgaa ggacctgccc actgtgcttc ctcctggctt caccatcgga 360 gccatctgca agcgggaaaa ccctcatgat gctgttgtct ttcacccaaa atttgttggg 420 aagaccctag aaaccctgcc agagaagagt gtggtgggaa ccagctccct gcgaagagca 480 gcccagctgc agagaaagtt cccgcatctg gagttcagga gtattcgggg aaacctcaac 540 acccggcttc ggaagctgga cgagcagcag gagttcagtg ccatcatcct agcaacagct 600 ggcctgcagc gcatgggctg gcacaaccgg gtggggcaga tcctgcaccc tgagaaatgc 660 atgtatgctg tgggccaggg ggccttgggc gtggaagtgc gagccaagga ccaggacatc 720 ttggatctgg tgggtgtgct gcacgatccc gagactctgc ttcgctgcat cgctgaaagg 780 gccttcctga ggcacctgga aggaggctgc agtgtgccag tagccgtgca tacagctatg 840 aaggatgggc aactgtacct gactggagga gtctggagtc tagacggctc agatagcata 900 caagagacca tgcaggctac catccatgtc cctgcccagc atgaagatgg ccctgaggat 960 gacccacagt tggtaggcat cactgctcgt aacattccac gagggcccca gttggctgcc 1020 cagaacttgg gcatcagcct ggccaacttg ttgctgagca aaggagccaa aaacatcctg 1080 gatgttgcac ggcagcttaa cgatgcccat taactggttt gtggggcaca gatgcctggg 1140 ttgctgctgt ccagtgccta catcccgggc ctcagtgccc cattctcact gctatctggg 1200 gagtgattac cccgggagac tgaactgcag ggttcaagcc ttccagggat ttgcctcacc 1260 ttggggcctt gatgactgcc ttgcctcctc agtatgtggg ggcttcatct ctttagagaa 1320 gtccaagcaa cagcctttga atgtaaccaa tcctactaat aaaccagttc tgaaggt 1377 <210> 21 <211> 1524 <212> DNA <213> Human <400> 21 agcagacaga ggactctcat taaggaaggt gtcctgtgcc ctgaccctac aagatgccaa 60 gagaagatgc tcacttcatc tatggttacc ccaagaaggg gcacggccac tcttacacca 120 cggctgaaga ggccgctggg atcggcatcc tgacagtgat cctgggagtc ttactgctca 180 tcggctgttg gtattgtaga agacgaaatg gatacagagc cttgatggat aaaagtcttc 240 atgttggcac tcaatgtgcc ttaacaagaa gatgcccaca agaagggttt gatcatcggg 300 acagcaaagt gtctcttcaa gagaaaaact gtgaacctgt ggttcccaat gctccacctg 360 cttatgagaa actctctgca gaacagtcac caccacctta ttcaccttaa gagccagcga 420 gacacctgag acatgctgaa attatttctc tcacactttt gcttgaattt aatacagaca 480 tctaatgttc tcctttggaa tggtgtagga aaaatgcaag ccatctctaa taataagtca 540 gtgttaaaat tttagtaggt ccgctagcag tactaatcat gtgaggaaat gatgagaaat 600 attaaattgg gaaaactcca tcaataaatg ttgcaatgca tgatactatc tgtgccagag 660 gtaatgttag taaatccatg gtgttatttt ctgagagaca gaattcaagt gggtattctg 720 gggccatcca atttctcttt acttgaaatt tggctaataa caaactagtc aggttttcga 780 accttgaccg acatgaactg tacacagaat tgttccagta ctatggagtg ctcacaaagg 840 atacttttac aggttaagac aaagggttga ctggcctatt tatctgatca agaacatgtc 900 agcaatgtct ctttgtgctc taaaattcta ttatactaca ataatatatt gtaaagatcc 960 tatagctctt tttttttgag atggagtttc gcttttgttg cccaggctgg agtgcaatgg 1020 cgcgatcttg gctcaccata acctccgcct cccaggttca agcaattctc ctgccttagc 1080 ctcctgagta gctgggatta caggcgtgcg ccactatgcc tgactaattt tgtagtttta 1140 gtagagacgg ggtttctcca tgttggtcag gctggtctca aactcctgac ctcaggtgat 1200 ctgcccgcct cagcctccca aagtgctgga attacaggcg tgagccacca cgcctggctg 1260 gatcctatat cttaggtaag acatataacg cagtctaatt acatttcact tcaaggctca 1320 atgctattct aactaatgac aagtattttc tactaaacca gaaattggta gaaggattta 1380 aataagtaaa agctactatg tactgcctta gtgctgatgc ctgtgtactg ccttaaatgt 1440 acctatggca atttagctct cttgggttcc caaatccctc tcacaagaat gtgcagaaga 1500 aatcataaag gatcagagat tctg 1524 <210> 22 <211> 2384 <212> DNA <213> Human <400> 22 tattgagttc ttcaaacatt gtagcctctt tatggtctct gagaaataac taccttaaac 60 ccataatctt taatacttcc taaactttct taataagaga agctctattc ctgacactac 120 ctctcatttg caaggtcaaa tcatcattag ttttgtagtc tattaactgg gtttgcttag 180 gtcaggcatt attattacta accttattgt taatattcta accataagaa ttaaactatt 240 aatggtgaat agagtttttc actttaacat aggcctatcc cactggtggg atacgagcca 300 attcgaaaga aaagtcagtc atgtgctttt cagaggatga aagcttaaga taaagactaa 360 aagtgtttga tgctggaggt gggagtggta ttatataggt ctcagccaag acatgtgata 420 atcactgtag tagtagctgg aaagagaaat ctgtgactcc aattagccag ttcctgcaga 480 ccttgtgagg actagaggaa gaatgctcct ggctgttttg tactgcctgc tgtggagttt 540 ccagacctcc gctggccatt tccctagagc ctgtgtctcc tctaagaacc tgatggagaa 600 ggaatgctgt ccaccgtgga gcggggacag gagtccctgt ggccagcttt caggcagagg 660 ttcctgtcag aatatccttc tgtccaatgc accacttggg cctcaatttc ccttcacagg 720 ggtggatgac cgggagtcgt ggccttccgt cttttataat aggacctgcc agtgctctgg 780 caacttcatg ggattcaact gtggaaactg caagtttggc ttttggggac caaactgcac 840 agagagacga ctcttggtga gaagaaacat cttcgatttg agtgccccag agaaggacaa 900 attttttgcc tacctcactt tagcaaagca taccatcagc tcagactatg tcatccccat 960 agggacctat ggccaaatga aaaatggatc aacacccatg tttaacgaca tcaatattta 1020 tgacctcttt gtctggatgc attattatgt gtcaatggat gcactgcttg ggggatctga 1080 aatctggaga gacattgatt ttgcccatga agcaccagct tttctgcctt ggcatagact 1140 cttcttgttg cggtgggaac aagaaatcca gaagctgaca ggagatgaaa acttcactat 1200 tccatattgg gactggcggg atgcagaaaa gtgtgacatt tgcacagatg agtacatggg 1260 aggtcagcac cccacaaatc ctaacttact cagcccagca tcattcttct cctcttggca 1320 gattgtctgt agccgattgg aggagtacaa cagccatcag tctttatgca atggaacgcc 1380 cgagggacct ttacggcgta atcctggaaa ccatgacaaa tccagaaccc caaggctccc 1440 ctcttcagct gatgtagaat tttgcctgag tttgacccaa tatgaatctg gttccatgga 1500 taaagctgcc aatttcagct ttagaaatac actggaagga tttgctagtc cacttactgg 1560 gatagcggat gcctctcaaa gcagcatgca caatgccttg cacatctata tgaatggaac 1620 aatgtcccag gtacagggat ctgccaacga tcctatcttc cttcttcacc atgcatttgt 1680 tgacagtatt tttgagcagt ggctccgaag gcaccgtcct cttcaagaag tttatccaga 1740 agccaatgca cccattggac ataaccggga atcctacatg gttcctttta taccactgta 1800 cagaaatggt gatttcttta tttcatccaa agatctgggc tatgactata gctatctaca 1860 agattcagac ccagactctt ttcaagacta cattaagtcc tatttggaac aagcgagtcg 1920 gatctggtca tggctccttg gggcggcgat ggtaggggcc gtcctcactg ccctgctggc 1980 agggcttgtg agcttgctgt gtcgtcacaa gagaaagcag cttcctgaag aaaagcagcc 2040 actcctcatg gagaaagagg attaccacag cttgtatcag agccatttat aaaaggctta 2100 ggcaatagag tagggccaaa aagcctgacc tcactctaac tcaaagtaat gtccaggttc 2160 ccagagaata tctgctggta tttttctgta aagaccattt gcaaaattgt aacctaatac 2220 aaagtgtagc cttcttccaa ctcaggtaga acacacctgt ctttgtcttg ctgttttcac 2280 tcagcccttt taacattttc ccctaagccc atatgtctaa ggaaaggatg ctatttggta 2340 atgaggaact gttatttgta tgtgaattaa agtgctctta tttt 2384 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Probe <400> 23 cctgaggcac ctggaaggag gctgcagtgt 30 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Probe <400> 24 atcaaaaaac aagcatggcc tcacacc 27 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 25 ctgcttcgct gcatcgctga aa 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 26 cagactcctc cagtcaggta ca 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 27 gcttggtggt taaaacttac c 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 28 tgaacagttc tgttggtgta 20 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Probe <400> 29 ctgcctgcct atgtgacgac aatccgg 27 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 30 caattttggt ggagaacccg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 31 gctgtcggag gtatatggtg 20 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Probe <400> 32 catttcagag agtaacatgg actacaca 28 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 33 gcaagtgcca atgatcagag g 21 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Primer <400> 34 atatagactc aggtatacac act 23 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence is a Probe <400> 35 tcccatcaga atccaaacaa gaggaag 27

Claims

환자로부터 림프절 조직 샘플을 수득하는 단계, 상기 샘플을 핵산 증폭 및 검출에 의해 분석하는 단계, 및 하나 이상의 마커(marker)의 존재가 컷오프 값을 초과하는지를 측정하는 단계를 포함하는, 수술중 분자적 진단 분석을 실시하는 방법.
제 1 항에 있어서,

미세전이를 검출하는 데 사용하기 위한 방법.
제 1 항에 있어서,

유방암 전이를 검출하는 데 사용하기 위한 방법.
제 1 항에 있어서,

흑색종 전이를 검출하는 데 사용하기 위한 방법.
제 1 항에 있어서,

마커가 서열 번호 17, 및 서열 번호 14 내지 16 및 서열 번호 18로 이루어진 군중 하나 이상에 상응하는 유전자의 발현을 검출하는 방법.
제 1 항에 있어서,

모든 단계가 수술 절차 과정중에 실시하는 방법.
제 1 항에 있어서,

PCR에 의해 핵산 증폭과 검출을 실시하는 방법.
제 7 항에 있어서,

미세전이를 검출하는 데 사용하기 위한 방법.
제 7 항에 있어서,

유방암 전이를 검출하는 데 사용하기 위한 방법.
제 7 항에 있어서,

흑색종 전이를 검출하는 데 사용하기 위한 방법.
제 10 항에 있어서,

마커가 서열 번호 21 또는 서열 번호 22인 방법.
제 7 항에 있어서,

상기 PCR이 RT-PCR인 방법.
제 12 항에 있어서,

역전사 반응이 9분 미만 동안 수행되는 방법.
제 13 항에 있어서,

역전사 반응이 약 3분 동안 수행되는 방법.
제 12 항에 있어서,

상기 역전사 반응에 하나 이상의 내부 조절 시약을 첨가하는 방법.
제 1 항에 있어서,

(a) 관심 RNA를 함유하고 이들의 균질화물(homogenate)을 생성시키는 세포를 용해시키는 단계, (b) 선택적으로, 상기 균질화물을 희석시키는 단계, (c) 습윤 균질화된 작업 샘플을, RNA가 결합되는 물질을 함유하거나 이 물질이 고정된 기질과 접촉시키는 단계, (d) 샘플을 기질에 결합되게 하는 단계, (e) 오염물 및 간섭물(interferent)을 제거하는 단계, (f) 기질을 건조시키는 단계, 및 (g) 기질로부터 RNA를 용출시키는 단계에 의해, 림프절로부터 RNA를 추출하고, 추출 단계에서 여과시키는 방법.
핵산 증폭 및 검출 시약을 포함하는, 수술중 림프절 분석을 실시하기 위한 키트.
제 17 항에 있어서,

상기 시약이, 서열 번호 14 내지 18, 21 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 군의 존재를 검출하기 위한 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 키트.
제 18 항에 있어서,

프라이머가 서열 번호 1 내지 6, 8 내지 12, 25 내지 28, 30 및 33 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택된 키트.
제 17 항에 있어서,

RT-PCR 시약을 포함하는 키트.
환자로부터 림프절 조직 샘플을 수득하는 단계, 상기 샘플을 핵산 증폭 및 검출에 의해 분석하는 단계, 및 하나 이상의 마커의 존재가 컷오프 값을 초과하는지를 측정하는 단계를 포함하는 수술중 분자적 진단 분석을 실시하고, 상기 분석의 결과에 따라 환자를 치료하는 것을 포함하는 방법.