KR20070031925A - 유방암 경과의 진단 또는 예측 - Google Patents

유방암 경과의 진단 또는 예측 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자로부터 유래한 세포 또는 조직 샘플에서 조직 특이적 유전자 및 비-조직 특이적 유전자를 포함하는 마커(Marker) 유전자 조합의 발현을 측정함으로써 유방암의 존재를 진단하거나 이의 경과를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 당해 유전자는 맘마글로빈 및 CK19이다. 키트, 핵산 프라이머 및 프로브 및 대조군을 제공한다.
유방암, 맘마글로빈, CK19, 조직 특이적 유전자, 핵산 프라이머, 프로브, 마커, 림프절, PCR

Description

유방암 경과의 진단 또는 예측{Diagnosing or predicting the course of breast cancer}
본 발명은 특히 유방암의 분자 진단 분야에 관한 것이다.
림프절 병발은 많은 고형 종양의 가장 강력한 예후 인자이며, 림프절 미세전이의 검출은 병리학자 및 외과의의 최대의 관심사이다. 현재 림프절 측정은 H&E-염색 조직 절편의 현미경 조사를 포함하며, 이는 다음의 세가지 주요한 제한으로 곤란을 겪는다: (a) 단일 종양 세포 또는 세포의 작은 병소를 놓치기 쉽고; (b) 결과를 신속하게 얻을 수 없는데, 이는 전초림프절(SLN) 과정의 임의의 양성 결과가 액와 임프절의 제거를 위한 2차 수술을 필요로 함을 의미하고; (c) 단 한 개 또는 두 개의 조직 단편만을 조사하며, 따라서 막대한 수의 대부분의 각 림프절이 조사되지 않은 채로 남겨진다. 연속 절편화는 샘플링 오류의 문제를 극복하는 데 도움을 줄 수 있으며, 면역조직화학(IHC)은 개별 종양 세포를 확인하는 데 도움을 줄 수 있다. 그러나 이들 방법의 조합은 일상적인 분석에 소요되는 비용 및 시간이 너무 많으며 SLN 조사와 같은 특수한 경우에만 제한된다.
외과 수술 결정은 흔히 림프절의 수술중 동결 절편 분석에 의거하지만, 이들 방법의 감수성은, 표준 H&E 병리학에 비하여 50 내지 70%의 범위이며, 허용할 수 없을 만큼 높은 2차 수술률을 초래하여, 상대적으로 저조하다. 림프절 발병을 갖지 않은 0기 및 I기 유방암 환자의 5년 생존률은 각각 92% 및 87%이다. 반면, 림프절 발병을 가진 후기 유방암 환자의 5년 생존률은 현저히 감소한다. 예를 들면, II기 유방암의 생존률은 단 75%, III기는 46%, IV기는 13%이다. 림프절 음성 유방암 환자가 향상된 생존률을 갖는다 하더라도, 조직학적 림프절 음성 환자의 20 내지 30%는 질병 재발을 겪는다. 이는 대부분 림프절 샘플링에 관련된 문제 및 개별 종양 세포 또는 소(小) 종양 병소의 검출에 대한 저조한 감수성을 포함하는 미세전이의 검출에 있어서의 현재의 기법의 제한에 기인하는 듯하다.
유방암 결절에서의 보다 정확하고 민감한 전이 검출이 필요한 것 외에, 특히 수술중 셋팅에서 외과적 절제연(surgical margin)의 보다 정확한 검출이 필요하다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 이러한 셋팅에 유용할 수 있는 분자생물학 분야의 강력한 도구이다. 당해 기법은 소량의 핵산 단편을 의미 있는 방식으로 분석가능한 양으로 복제/증폭시킨다. 실시간 정량적 RT-PCR(Q-RT-PCR)의 개발에서 더 나아가, 당해 기법은 자동화에 보다 신뢰할 만하고 호의적이 될 것이다. Q-RT-PCR은 오염이 덜 되며 유전자 발현의 정량화를 제공한다. 이러한 정량화는 수술중 림프절 검정에서 미세전이의 검출에 적용할 수 있다. 분자 진단에서 PCR은 이의 이점에도 불구하고, 통상적인 임상 진단 셋팅, 특히 수술중 셋팅에 적용하기 어렵게 만드는 여러 제한을 갖는다.
이러한 제한 중 하나는 PCR 진단을 수행하는데 통상적으로 소요되는 시간이다. 통상적인 PCR 반응은 분이 아닌 시간이 소요된다. PCR 반응을 수행하는 데 소요되는 시간을 감소시키는 것은 당해 기법이 수술시 유용하려면 필수적이다. 추가로, Q-RT-PCR이 정량적 결과를 제공할 수 있음에도 불구하고, 오늘날까지 이러한 기법에 기초한 음성 결과로부터 양성을 구별해내기 위한 컷-오프 수치가 공지되어 있지 않으며, 핵산 단편이 최상으로 검출되며 미세전이의 존재와 상관 관계가 있는지도 불확실하다. 기타 핵산 단편의 증폭 및 검출 방법 역시 존재하며 각각 유사한 문제를 겪고 있다.
기존의 난제를 극복하는 수술중 분자 림프절 검정이 의료계에서 널리 받아들여지게 될 것이다.
사이토케라틴 19(케라틴 19, CK19 및 KRT19로도 알려져 있음)가 상피세포의 검출에 유용한 유전자로 인식되어 왔다. 수개의 신체 구획(혈액, 골수 및 림프절을 포함하는)에서 이들 세포의 검출은 유방암을 포함한 여러 암의 전이와 관련되어 있다. CK19 mRNA의 검출은 흔히 4개의 의사유전자(pseudogene)(6번 염색체 상에 하나, 4번 염색체 상에 하나, 그리고 12번 염색체 상에 2개)의 존재에 의해 복잡해진다. 이들 의사유전자의 서열은 스플라이싱된 mRNA 및 DNA의 구별을 가능케 하는 인트론 영역을 갖지 않으며 전체 CK19 mRNA 서열과 90% 이하의 상동성을 갖는다. CK19 mRNA와 CK19 DNA를 구별하고, 또한 4개의 의사유전자로부터의 CK19 mRNA를 구별하는 프라이머 및 프로브의 설계가 난제인 것으로 입증되어 왔다. DNA로부터 CK19 mRNA를 구별하는 프라이머가 공개된 반면, 다른 그룹은 이들 프라이머가 DNA 와 교차 반응함을 밝혔다. DNA와의 교차-반응의 문제를 피하기 위해, 많은 그룹이 (1) DNA 분해 단계(DNase를 사용한)를 포함하거나 (2) 오염된 DNA의 99% 초과를 제거하는, Trizol과 같은 방법론을 토대로 하는 RNA 정제 방법을 사용한다.
DNA 분해 단계를 필요로 하거나 Trizol-계 RNA 정제를 사용할 것을 필요로 하는 것은 통상적으로 바람직하지 않다. 당해 방법 둘 다 RNA 제조에 필요한 시간 및 복잡도를 증가시킨다. 따라서, 이들 방법은 수술중 적용의 경우에서와 같이, 높은 사용 편이성 및 신속성의 조합을 필요로 하는 적용에는 적합하지 않다. 이와 같은 경우, mRNA와 DNA를 구별할 수 있는 CK19 증폭 방법을 사용하는 것이 필수적이다.
발명의 개요
본 발명은 유방암의 존재 진단 또는 이의 경과 예측을 위한 검정이다. 한 양태에서, 당해 검정은 미세전이를 진단한다. 다른 양태에서, 미세전이의 검출은 SLN에서, 특히 수술 중에 이루어진다. 외과의는 공지된 방법에 따라 수술 중 SLN을 확인한다. 하기한 바와 같이 SLN을 제거하고 준비한다. 이어서 핵산(예를 들면, DNA 및 RNA)을 SLN으로부터 신속하게 추출한다. 이어서, 존재하는 경우 미세전이를 나타내는 마커를 증폭 및 검출한다. 이어서 외과의는 마커와 같은 검출 결과에 의거한 조치를 취한다.
본 발명의 다른 측면에서, 마커는 특정 조직 및 조직 특이적이지 않은 하나 이상의 마커에 대해 특이적인 핵산 단편이다.
본 발명의 다른 측면에서, 마커는 악성 종양을 나타내는 핵산 단편이다.
본 발명의 다른 측면에서, 마커는 유방암 진단의 경우에 맘마글로빈(서열 번호 1) 및 CK19(서열 번호 2) 또는 PIP(서열 번호 3), B305D(특히, 이소형(isoform) C. 서열 번호 4), B726(서열 번호 5), GABA(서열 번호 6) 또는 PDEF(서열 번호 7)의 핵산 단편이다. 각각 문헌[Watson et al. (1996) Cancer Res. 56: 860-865, Hoffman-Fazel et al. (2003) Anticancer Res. 23:917-920, Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:16899-16903, Zehentner et al. (2002) Clin. Chem. 48:1225-1231 (B305D 및 B726), Mehta et al. (1999) Brain Res. Brain Res. Rev. 29: 196-217, Feldman et al. (2003) Cancer Res. 63:4626-4631, 및 Grandchamp et al. (1987) Eur. J. Biochem. 162:105-110]을 참조한다.
본 발명은 맘마글로빈 RNA를 최적으로 증폭하고 증폭 생성물을 검출하는 특이적 프라이머/프로브 세트를 정의한다.
본 발명의 다른 측면에서, CK19 mRNA의 특이적 검출을 위한 최적의 프라이머 및 프로브가 개시되어 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 미세전이는 SLN으로부터 RNA를 수득하는 단계; 목적하는 2개 이상의 유전자에 특이적인 정량적 RT-PCR 방법을 수행하는 단계 및 마커의 존재가 소정의 컷-오프를 초과하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법으로 검출한다. 컷-오프 수치는 절대적 수치 또는 대조 유전자의 발현에 상대적인 수치일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 검정은 구성적으로 발현되는 내부 대조 유전자 및 당해 검정의 모든 RNA-관련 영역의 반응 질 및 타당성에 대한 대조군을 제공하기 위해 사용되는 마커 둘 다를 암호화하는 DNA를 포함한다. 한 측면에서, 내부 대조군 유전자는 포르포빌리노겐 탈아미노효소(PBGD, 서열 번호 8)이다.
본 발명의 추가의 양태에서, 키트는 당해 검정 수행용 시약을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 개별 마커의 감수성을 95% 특이성으로 나타낸 막대 그래프이다.
암 진단 및 예측 방법이 존재한다. 이들 방법은 세포 또는 림프절과 같은 조직으로부터 핵산을 추출하는 방법 및 유방암을 나타내는 핵산 단편(이러한 단편이 본원에서 "마커"로 지칭된다)을 증폭 및 검출하는 방법을 사용한다.
검정을 수술중 수행하는 경우, 특정 유전자의 발현을 나타내는 마커의 신속한 증폭 및 검출이 필수적이다. 즉, 이러한 방법이 수술중 검정에 적합한 기간 내에(즉, 약 35분 미만으로) 수행될 수 있다면, 임의의 신뢰할 만하고, 감도가 높고 특이적인 방법을 사용할 수 있다. 이에는 PCR 방법, 회전환형(Rolling Circle) 증폭 방법(RCA), 리가아제 연쇄 반응 방법(LCR), 가닥 치환 증폭 방법(SDA), 핵산 서열-기초 증폭 방법(NASBA) 등이 포함된다. 포함되는 신속한 분자 진단은 가장 바람직하게는 QRT-PCR을 포함하는 정량적 PCR 방법이다.
사용되는 증폭 방법에 관계 없이, 검정 수행에 사용되는 조직을 적절히 샘플링하는 것이 중요하다. SLN의 경우, 이는 적당한 절제 및 SLN의 처리 및 이로부터의 RNA의 추출을 포함한다. 일단 수득하면, 존재하는 임의의 암성 세포를 검출하도록 결절을 적합하게 처리하는 것이 중요하다.
조직 샘플로부터 핵산을 추출하는 각종 기법이 사용가능하다. 각각의 경우 표준 실행은 시간 소모적이며 이러한 목적을 위해 설계된 시판되는 키트를 사용하는 경우 심지어 어려울 수 있다. 통상적으로 시판되는 핵산 추출 키트는 핵산을 추출하는 데 15분 이상 소요된다. 본 발명의 방법에서는, 핵산을 8분 미만 및 바람직하게는 6분 미만으로 추출한다. 이들 신속 추출 방법은 미국 특허 출원 번호 제10/427,217의 주제이다.
온전한 RNA의 성공적인 분리는 일반적으로 네 단계를 포함한다: 세포 또는 조직의 효과적인 파쇄, 핵단백질 복합체의 변성, 내인성 리보뉴클레아제(RNAase)의 불활성화 및 오염된 DNA 및 단백질의 제거. 구아니디늄 티오시아네이트(GTC) 및 B-머캅토에탄올의 세포 추출물에 존재하는 리보뉴클레아제를 불활성화시키기는 파쇄 및 방어 특성은 이들이 바람직한 제1 단계용 시약이 되게 한다. 도데실황산나트륨(SDS)와 같은 계면활성제와 함께 사용하는 경우, 핵단백질 복합체의 파쇄는 RNA가 용액으로 방출되고 단백질 없이 분리되게 한다. 고농도의 GTC의 존재 하에서의 세포 추출물의 희석은 세포성 단백질의 선택적 침전의 발생을 유발하는 반면, RNA는 용액 중에 잔존하도록 한다. 원심분리는 침전된 단백질 및 세포성 DNA의 용해물을 정화하며, 바람직하게는 칼럼을 통해 수행한다. 이러한 칼럼은 또한 DNA를 전단하며 샘플의 점성을 감소시킨다. RNA 정제는 바람직하게는 실리카 또는 기타 물질을 함유하는 회전 칼럼에서 수행한다. 세포 및 조직의 수동 파쇄는 미국 특허 제4,715,545호에 기술된 바와 같은 일회용 조직 분쇄기를 사용할 수 있다. 균질화 시간은 1분 내지 2분 내이며, 보다 바람직하게는 30초 내지 45초이다.
이어서 샘플을 분쇄(shredding) 칼럼(예를 들면, QIAshredder, 제조사[QIAGEN Inc., 캘리포니아주 발렌시아 소재] 또는 적합한 대용품) 또는 제조사[Omni International(버지니아주 워렌튼 소재)]에서 시판하는 PCR 조직 균질화 키트와 같은 RNA 처리 기구로 처리하여 이의 점성을 감소시킬 수 있다. RNA를 상기한 바와 같은 회전 칼럼을 통해 침전시키며 원심분리 시간은 30초 이하이다. 제조사[Qiagen, Inc.]로부터 입수가능한 것과 같은 상용 RNA 추출 키트를 사용하는 경우, 칼럼 건조 및 RNA 용출 단계를 제외한 모든 단계에 원심분리 대신 여과를 사용한다. 통상적으로, 샘플을 칼럼에 적용하기 전에 동일한 용적의 70% 에탄올로 희석한다. 여과에 의한 세척 후, 당해 칼럼을 원심분리하여 건조하고, RNA를 RNAase-부존재 수(水) 중에서 용출시킨다. RNA를 에탄올을 사용하여 용액에서 선택적으로 침전시키고 기질(바람직하게는, 실리카-함유 막 또는 필터)에 결합시킨다. 기질에 대한 RNA의 결합은 카오트로픽(chaotropic) 염에 의한 물 분자의 붕괴에 기인하여 신속하게 발생하며, 따라서 실리카으로의 핵산의 흡수를 용이하게 한다. 결합된 총 RNA를 오염된 염, 단백질 및 세포 불순물로부터 단순한 세척 단계로 추가로 정제한다. 최종적으로, 총 RNA를 뉴클레아제-부존재 수를 첨가하여 막으로부터 용출시킨다. 이러한 신속한 프로토콜의 총 시간은 8분 미만, 바람직하게는 6분 미만이다.
요약하면, 신속 RNA 추출 방법에는 다음의 단계가 포함되며, 원심분리를 사용하는 경우에, 원심분리는 단계 g, h 또는 I 이후에 수행할 수 있으며, 진공/여과는 바람직하게는 추출 단계에서 적용한다:
(a) 생물학적 시스템으로부터 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계,
(b) 임의로, 당해 샘플로부터 목적하는 RNA가 없는 세포를 제거하여 작업 샘플을 제조하는 단계,
(c) 목적하는 RNA를 포함하는 세포를 용해하고 이들의 균질화물을 제조하는 단계,
(d) 임의로, 균질화물을 희석하는 단계,
(e) 습윤성 균질화 작업 샘플을, RNA에 결합하는 물질을 포함하거나 이에 부착하는 기질과 접촉시키는 단계,
(f) 당해 샘플을 기질과 결합시키는 단계,
(g) 오염원 및 간섭물(interferent)을 제거하는 단계,
(h) 기질을 건조시키는 단계, 및
(i) 기질로부터 RNA를 용출시키는 단계
이러한 신속 추출 과정에 관계된 시약은 용해/결합 완충액(바람직하게는, 4.5M 구아니디늄-HCl, 100mM NaPO4), 세척 완충액 I(바람직하게는, 5M 구아니딘-HCl 중 37% 에탄올, 20mM 트리스-HCl), 세척 완충액 II(바람직하게는, 20mM NaCl 중 80% 에탄올, 2mM 트리스-HCl), 용출 완충액 및 뉴클레아제-부존재 멸균 이중 증류수이다.
결절 내에서의 암 세포의 분포는 일률적이지 않기 때문에, 결절의 여러 절편을 샘플링하는 것이 바람직하다. 임의로는, 하나 이상의 결절을 또한 병리학에 의거하여 조사할 수 있다. 분자 수준의 검사 및 병리학에 따른 동일한 결절 샘플의 조사 둘 다를 수행하는 한 방법은 당해 결절을 병리학용으로 사용되는 하나의 외부 및 내부 절편, 및 분자 검사용으로 사용되는 하나의 외부 및 내부 절편을 갖는 4개 이상의 절편으로 절편화한다. 조직 내의 전이 및 미세전이의 분포가 결절 또는 기타 조직에서 일률적이지 않기 때문에, 전이를 놓치지 않도록 충분히 큰 샘플을 수득해야 한다. 본 방법에서 이러한 샘플링 문제에 대한 한 가지 접근 방법은 큰 조직 샘플을 균질화하고, 이어서 연속한 분자 검사에 사용할 잘 혼합된 균질 샘플의 희석을 수행하는 것이다.
통상적인 PCR 반응은 표적 핵산 종을 선택적으로 증폭하는 다수의 증폭 단계, 또는 주기를 포함한다. 통상적인 PCR 반응에는 세 단계가 포함된다: 표적 핵산을 변성시키는 변성 단계; PCR 프라이머 세트(정방향 및 역방향 프라이머)를 상보적 DNA 쇄에 어닐링(annealing)시키는 어닐링 단계; 및 내열성 DNA 중합효소가 프라이머를 연장하는 연장 단계. 이러한 단계를 수회 반복함으로써, DNA 단편을 증폭하여 표적 DNA 서열에 상응하는 앰플리콘(amplicon)을 제조한다. 통상적인 PCR 반응은 변성, 어닐링 및 연장의 20회 이상의 주기를 포함한다. 많은 경우, 어닐링 및 연장 단계를 동시에 수행할 수 있으며, 이러한 경우, 순환은 단 두 단계만을 포함한다.
RT-PCR을 사용하는 본 발명의 방법에서, RT-PCR 증폭 반응은 수술중 진단에 적합한 시간 내에 수행하며, 이들 단계 각각의 기간은 분보다는 초 범위일 수 있다. 구체적으로, 초당 약 5℃ 이상의 열경사율을 발생시킬 수 있는 특정한 신규한 열순환기(thermal cycler)로, 30분 이하의 RT-PCR 증폭을 사용한다. 보다 바람직하게는, 증폭은 25분 미만으로 수행한다. 이를 고려하여, PCR 순환의 각 단계에 제공된 다음의 시간은 경사 시간을 포함하지 않는다. 변성 단계는 10초 이하의 시간 동안 수행할 수 있다. 사실, 일부 열순환기는 변성 단계의 최적 지속 기간일 수 있는 "0초"의 설정을 가진다. 즉, 열순환기가 변성 온도에 이르는데 충분하다. 어닐링 및 연장 단계는 각각 10초 미만이 가장 바람직하며, 동일한 온도에서 수행하는 경우, 복합 어닐링/연장 단계는 10초 미만일 수 있다. 그러나 일부 동종 프로브 검출 방법은 신속 검정 수행을 최대화시키기 위해 개별적인 연장 단계를 필요로 할 수 있다. 총 증폭 시간 및 비특이적 부가 반응의 형성 둘 다를 최소화하기 위한 어닐링 온도는 통상 50℃ 이상이다. 보다 바람직한 어닐링 온도는 55℃ 이상이다.
실험자의 개재 없는, 단일 연합 RT-PCR 반응이 여러 이유로 바람직하다: (1) 실함자 오류 위험의 감소, (2) 표적 또는 생성물 오염 위험 감소 및 (3) 검정 속도 증가. 당해 반응은 1개 또는 2개의 중합효소로 이루어질 수 있다. 2개의 중합효소의 경우, 이들 효소 중 하나는 통상적으로 RNA-계 DNA 중합효소(역전사효소)이며, 다른 하나는 내열성 DNA-계 DNA 중합효소이다. 검정 성능을 최대화하기 위해, 이들 중합 기능 둘 다에 대해 "고온 출발" 기법의 형태를 사용하는 것이 바람직하다. 미국 특허 제5,411,876호 및 제5,985,619호는 상이한 "고온 출발" 접근 방법의 예를 제공한다. 바람직한 방법은 효율적인 DNA 중합에 필요한 하나 이상의 성분을 격리하는 하나 이상의 열활성화 방법의 사용을 포함한다. 미국 특허 제5,550,044호 및 제5,413,924호는 이러한 방법에 사용하기 위한 시약의 제조 방법을 기술한다. 미국 특허 제6,403,341호는 PCR 시약 성분 중 하나의 화학적 대체를 포함하는 격리 방법을 기술한다. 가장 바람직한 양태에서, RNA- 및 DNA-의존성 중합효소 활성 둘 다 단일 효소에 존재한다. 효율적인 증폭에 필요한 기타 성분은 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 이가 염 및 완충 성분을 포함한다. 일부 예에서, 비특이적 핵산 및 효소 안정화제가 유용할 수 있다.
임의의 주어진 증폭-기초 분자 진단의 특이성은 프라이머 세트의 정체에 크게 의존한다(단, 전적으로는 아님). 프라이머 세트는 표적 DNA 서열에 어닐링하여 표적 서열의 증폭을 가능케 하고, 이에 따라 표적 서열-특이적 앰플리콘을 제조하는 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 쌍이다. 당해 프라이머는 관심의 질병 상태의 마커를 증폭시킬 수 있어야 한다. 본 발명의 경우, 이들 마커는 유방암에 관한 것이다.
유방암의 경우, 본 발명의 방법은 유방 조직 또는 유방암 조직에 특이적인 조직 마커의 증폭 및 비-조직 특이적 마커의 증폭을 포함한다. 비-조직 특이적 마커는 바람직하게는 상피 세포-특이적이다. 적합한 상피세포-특이적 마커에는 루미칸, 셀레노단백질 P, 결합조직 성장 인자, 케라틴 19(CK19), EPCAM, E-카드헤린 및 콜라겐, IV형, α-2가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 2개 이상의 마커의 조합을 사용하여, 존재하는 경우 유방 및/또는 림프절에서의 암 세포의 임상적으로 유의하고 신뢰할만한 검출을 가능케 한다. 바람직하게는, 마커는 동시에 단일 반응 용기에서 증폭 및 검출한다(즉, 이들을 복합으로 처리한다). 가장 바람직하게는, 프라이머/프로브 세트는 이들 마커에 특이적인 핵산 단편에 상보적이다.
당해 마커에는 맘마글로빈(서열 번호 1) 및 사이토케라틴 19(CK19, 서열 번호 2) 또는 맘마글로빈 대신, 또는 이에 추가하여, 다음의 것(바람직하게는 하나)이 포함된다: B305D(서열 번호 4), 프롤락틴 유도 단백질(PIP, 서열 번호 3), B726(서열 번호 5), GABA-π(서열 번호 6) 또는 전립선 유래 Ets-전사 인자(PDEF, 서열 번호 7). 조직 특이적 마커 및 암 특이적 마커의 조합은 각각 90% 및 95% 초과의 감수성 및 특이성을 제공한다. 놀랍게도, 비-조직 특이적 마커(CK19, 서열 번호 2) 및 암 특이적 마커(맘마글로빈, 서열 번호 1)의 조합은 각각 91% 및 97%의 더욱 높은 감수성 및 특이성을 제공한다. 일부 마커는 다른 것보다 한 조직 또는 암에 보다 특이적인 특정한 이소형을 갖는 각종 이소형으로 존재한다. B305D의 경우, 가장 바람직한 이소형은 B305D 이소형 C(서열 번호 4)이다. 또한 맘마글로빈과 CK19 마커의 조합이 가장 바람직한 마커이다.
당해 반응은 또한 특정 신호의 임의의 검출 방법을 포함해야 한다. 이는 바람직하게는 목적하는 표적 서열의 중합으로부터 유래한 DNA 서열의 영역을 검출하는 시약을 사용함으로써 달성한다. 바람직한 검출용 시약은 목적하는 특정 핵산 서열에 결합할 시, 측정가능한 신호 차이를 제공한다. 종종, 이들 방법은 목적하는 서열에 결합할 시, 증가한 형광을 제공하는 핵산 프로브를 포함한다. 본 발명의 방법의 PCR 반응의 진행은 통상적으로 각각의 PCR 프라이머 세트에 대한 앰플리콘 생산의 상대적 비율을 분석함으로써 관찰한다. 앰플리콘 생산 모니터는 이중나선 DNA에 결합하는 형광 프라이머, 형광성 프로브 및 형광 염료, 분자 부표, 스콜피온(Scorpion) 등(이에 제한되지는 않음)을 포함하는 다수의 검출 시약 및 방법에 의해 달성할 수 있다.
통상적인 PCR 반응 모니터찰 방법은 특정한 내열성 DNA 중합효소(예: Taq 또는 Tfl DNA 중합효소)의 5' 뉴클레아제 활성을 이용하여 PCR 과정 중 올리고머 프로브를 절단하는 형광성 가수분해 프로브 검정을 사용한다. 연장 조건 하에 증폭시킨 표적 서열에 어닐링하는 올리고머를 선별한다. 프로브는 통상적으로 이의 5' 말단에 형광 리포터를, 그리고 3' 말단에는 당해 리포터의 형광 소거제(quencher)를 갖는다. 올리고머가 손상되지 않은 채로 유지되는 한, 리포터로부터의 형광 신호는 소거된다. 그러나, 올리고머가 연장 과정 중 분해될 시, 형광 리포터는 더 이상 소거제의 부근에 있지 않는다. 주어진 앰플리콘에 대한 유리 형광 리포터의 상대적 축적을 대조군 샘플 및/또는 대조군 유전자{예를 들면, 제한 없이, β-액틴 및 PBGD(포르포빌리노겐 탈아미노효소)}에 대한 동일한 앰플리콘의 축적에 비교하여 RNA 집단에서 주어진 RNA의 주어진 cDNA 생성물의 상대적 풍부성을 측정할 수 있다. 형광성 가수분해 프로브 검정용 생성물 및 시약은 시중에서(예를 들면, 제조사[Applied Biosystems]로부터) 용이하게 입수가능하다.
기타 검출 시약은 통상적으로 "스콜피온"으로 지칭되며 미국 특허 제6,326,145호 및 제5,525,494에 기술되어 있다. 이들 시약은 꼬리형 프라이머(tailed primer) 및 통합된 신호전달 시스템을 포함하는 하나 이상의 분자를 포함한다. 당해 프라이머는 주형 결합 영역 및 링커와 표적 결합 영역을 포함하는 꼬리를 갖는다. 꼬리에 있는 표적 결합 영역은 프라이머의 신장 생성물의 상보적 서열에 하이브리드화한다. 이러한 표적 특이적 하이브리드화 현상은 신호 전달 시스템에 결부되며, 여기서, 하이브리드화는 검출가능한 변화를 초래한다. PCR 반응에서, 표적 결합 영역 및 꼬리 영역은 꼬리 영역이 단일 나선으로 유지되도록, 즉, 복제되지 않도록 유리하게 배열한다. 따라서, 꼬리 영역은 PCR 증폭 생성물에서 증폭가능하지 않다. 링커는 프라이머 주형 상에서의 중합효소 매개 연쇄 신장을 막는 차단 잔기를 포함한다.
제조사[Cepheid of Sunnyvale, 캘리포니아 소재]에서 시판되는 Smart Cycler 열순환기, 및 제조사[Applied Biosystems]에서 시판되는 ABI Prism 7700 서열 검출 시스템을 포함하는, PCR 및 QRT-PCR 중 앰플리콘 축적 제어 및 모니터용 장치 및 소프트웨어 또한 용이하게 입수가능하다.
바람직한 RT-PCR 반응에서, 특정한 역전사효소 및 PCR 반응 성분의 양은 임의의 열순환기의 보다 빠른 경사 시간 이익을 얻기 위해 비정형화되어 있다. 특히, 프라이머 농도는 매우 높다.
역전사효소 반응을 위한 통상적인 유전자-특이적 프라이머 농도는 약 20nM 미만이다. 약 1분 내지 2분의 신속 역전사효소 반응을 성취하기 위해, 역전사효소 프라이머 농도를 20nM 초과, 바람직하게는 약 50nM 이상, 및 통상적으로 약 100nM로 상승시킨다. 표준 PCR 프라이머 농도는 100nM 내지 300nM의 범위이다. Tm 변이를 보상하기 위해 보다 높은 농도를 표준 PCR 반응에 사용할 수 있다. 그러나, Tm 보상이 필요하지 않은 경우 본원의 목적을 위한 기준 프라이머 농도는 부수적이다. Tm 보상이 필요하거나 요구되는 경우, 비례적으로 보다 높은 농도의 프라이머를 경험적으로 결정하고 사용한다. 신속 PCR 반응을 달성하기 위한 PCR 프라이머 농도는 통상적으로 250nM 초과, 바람직하게는 약 300nM 초과 및 통상적으로 약 500nM 초과이다.
맘마글로빈 및 CK19 둘 다에 대한 바람직한 프라이머/프로브 세트를 제공한다. 이러한 프라이머/프로브 조합에 대한 필요조건은, 임상적으로 유의한 양의 CK19 mRNA는 확인가능한 반면, 다량의 게놈 DNA는 검출하지 않는 것이다. 이들 프라이머 및 프로브는 CK19 mRNA의 특이적 검출을 위한 임의의 적용에 유용하다. 예상치 않게, 이러한 프라이머/프로브 조합의 하위세트가 시험한 기타 조합보다 현저히 우수함이 입증되었다. 사이토케라틴 19는 약 86 내지 91%의 동일성으로 정렬된 4개의 의사유전자를 갖는다. 이들 의사유전자는 4번, 6번 및 12번 염색체상에 위치한다. 검정 디자인은 CK19 DNA가 효율적으로 증폭 및 검출되지 않도록 엑손-인트론 접합을 포함하게 제한되었다.
맘마글로빈의 경우, 다음이 최적의 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
MG 정방향 프라이머(서열 번호 9) AGTTGCTGATGGTCCTCATGC
MG 역방향 프라이머(서열 번호 10) ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA
MG 프로브(서열 번호 11) Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT
CK19의 경우, 다음이 최적의 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
CK19 정방향 프라이머(서열 번호 12) CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT
CK19 역방향 프라이머(서열 번호 13) TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
CK19 프로브(서열 번호 14) Q570-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT- BHQ2-TT
이들 프라이머/프로브 세트를 사용하는 경우, 다음의 프라이머/프로브 세트가 PBGD를 증폭 및 검출하기 위한 대조군으로서 최적이다.
PBGD 정방향 프라이머(서열 번호 15) GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCA
PBGD 역방향 프라이머(서열 번호 16) TTGCGGGTACCCACGCGAA
PBGD 프로브(서열 번호 17) Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2
추가의 프라이머, 프로브 및 이의 조합이 본원의 실시예에 제공되어 있다.
상업적으로 사용되는 진단 또한 바람직하게는 음성 결과에 대한 특정 증폭 반응의 작동을 확인하는 하나 이상의 내부 양성 대조군을 사용한다. RT-PCR 반응에서 제어되어야 하는 위(僞) 음성 결과의 잠재적 원인에는 부적합한 RNA 양, RNA 분해, RT 및/또는 PCR의 억제 및 실험자 오류가 포함된다. 유전자 발현 검정의 경우, 목적하는 조직에서 구성적(constitutive)으로 발현되는 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. PBGD(서열 번호 7)은 여러 요인 때문에 내부 대조군으로 통상적으로 사용되는 유전자이다: 이는 사람에서는 어떠한 공지된 의사유전자도 포함하지 않으며, 사람 조직에서 구성적으로 발현되며, 상대적으로 낮은 수준으로 발현되고, 따라서 목적하는 표적 서열의 증폭 억제를 덜 유발하는 경향이 있다. 대조군으로서의 PBGD의 사용은 위음성 결과의 모든 잠재적 근원으로부터 야기한 오류성 결과의 보고를 최소화하거나 제거한다.
QRT-PCR에 대해 기술된 방법의 상용화에서, 특이적 핵산 검출용의 특정한 키트가 특히 유용하다. 한 양태에서, 당해 키트는 마커 증폭 및 검출용 시약을 포함한다. 임의로, 당해 키트는 림프절 조직으로부터 핵산을 추출하기 위한 샘플 준비 시약 또는 물품(예를 들면, 관)을 포함한다. 당해 키트는 또한 샘플 오염의 위험을 최소화하기 위한 물품{(예를 들면, 일회용 스칼펠(scalpel) 및 림프절 절개 및 준비용 면}을 포함할 수 있다.
바람직한 키트에는, 역전사효소, 역전사효소 프라이머, 상응 PCR 프라이머 세트(바람직하게는 마커 및 대조군용), 내열성 DNA 중합효소(예를 들면, Taq 중합효소), 및 적합한 검출 시약(예를 들면, 제한 없이, 스콜피온 프로브, 형광 가수분해 프로브 검정용 프로브, 분자 부표 프로브, 단일 염료 프라이머 또는 브롬화에티듐과 같은 이중나선 DNA에 특이적인 형광 염료)와 같은 상기한, 일관(one-tube) QRT-PCR 과정에 필요한 시약이 포함된다. 당해 프라이머는 바람직하게는 상기한 고농도를 산출하는 양으로 사용한다. 내열성 DNA 중합효소는 통상적으로 각종 제조업체로부터 입수 가능하다. 당해 키트 중 부가적인 물질에는 적합한 반응 관 또는 바이얼(vial), 방벽 조성물, 임의로는 마그네슘을 포함하는 전형적인 밀랍 비드(bead); 필수 완충액 및 dNTP와 같은 시약을 포함하는 역전사효소 및 PCR 단계용 반응 혼합물(통상적으로 10X); 뉴클레아제- 또는 RNase-부존재 수; RNase 억제제; 역전사효소 및/또는 QRT-PCR 반응의 PCR 단계에 사용할 수 있는 대조 핵산(들) 및/또는 임의의 부가 완충액, 화합물, 조-인자, 이온 구성성분, 단백질 및 효소, 중합체 등이 포함될 수 있다. 임의로는, 당해 키트는 핵산 추출물 시약 및 물질을 포함한다.
다음의 비제한적 실시예는 본 발명을 보다 깊이 기술하는 데 도움을 준다. 본원에 인용된 모든 문헌은 이에 의하여 본원에 참조로 포함되어 있다.
실시간 PCR
본 발명의 실시예는 실시간 PCR의 사용을 토대로 한다. 실시간 PCR에서, 중합효소 연쇄반응의 생성물은 종료점 측정보다는 PCR의 지수 기 동안 실시간으로 모니터한다. 따라서, DNA 및 RNA의 정량화가 훨씬 더 정확하며 재현가능하다. 형광 수치는 매회 동안 기록하며 증폭 반응 순간에 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 더 많은 주형이 반응 초기에 존재할수록, 형광 신호가 배경 이상으로 통계적으로 유의적인 것(이는(Ct) 수치의 정의이다)으로 최초로 기록되는 순간에 도달하는 데 더 적은 수의 주기가 소요된다. 역치 주기(Ct)의 개념은 형광성에 기초한 RT-PCR을 사용하는 정확하고 재현가능한 정량화를 허용한다. PCR 생성물의 균질한 검출은 바람직하게는 (a) 이중 가닥 DNA 결합 염료(예를 들면, SYBR Green), (b) 형광 발광성 프로브(예를 들면, TaqManR 프로브, 분자 부표), 및 (c) 직접 표지된 프라이머(예를 들면, Amplifluor 프라이머)를 토대로 하여 수행한다. 적합한 방법이 미국 특허 출원 번호 제10/427,243호에 또한 기술되어 있다.
실시예 1 - SLN 중 유방암 세포의 2개 유전자의 확인
액와 림프절(ALN) 전이의 존재는 유방암 환자에게 있어서 가장 중요한 예후 인자이다. SLN 상태는 모든 ALN 병발의 강한 전조가 된다. SLN 양성 환자는 지금까지 2차 수술 중 ALN 절개를 수행 받아 왔다. 수술중 SLN 분석 방법은 2차 수술의 비용 및 복잡성 감소를 위해 수행되어 왔지만, 이들 방법은 저조하고 가변적인 감수성 및 표준화의 부족으로 문제를 겪는다. 다음의 예는 임상적으로 관련된 SLN 전이의 수술중 진단을 개선하기 위한 토대로서의 RT-PCR의 실현 가능성을 나타낸다.
방법: 맘마글로빈을 포함하는 8개의 분자 마커가 유방 및 기타 조직의 게놈-광범위 유전자 발현 분석으로 확인되었다. 254명의 유방암 환자로부터의 SLN의 일련의 교대적인 절편을 RNA 추출을 위해 영구 절편 H&E 또는 급속 동결로 분석하였다. 미지의 SLN cDNA를 정량적 RT-PCR로 분석하였다. PCR 신호를 환자 기초의 H&E 결과와 비교하였다. 다변수 수신동작특성(ROC) 분석을 사용할 시, H&E 결과에 최적으로 상관이 있는 PCR 컷-오프를 선택하였다.
환자 샘플: 동부 캐롤리나 대학에서 유방암 환자의 림프절에서 맘마글로빈의 임상 말기 PCR 연구로부터 SLN RNA 샘플을 수득하였다. 림프절 RNA는 원 림프절의 절반으로부터 유래하였다. 샘플의 질은 Agilent, 분광학 및 하우스킵핑(housekeeping) 유전자 PCR 분석으로 평가하였다. 질이 불량하다고 판단되고 유방에 대해 PCR 음성으로 간주된 샘플이 있는 환자는 당해 연구에서 제외시켰다. 254명의 환자의 모든 SLN을 당해 연구에 포함시켰다.
마커 유효성 입증: 맘마글로빈을 포함하는 7개의 마커를 문헌 및 내부 생물정보학 방법으로 확인한 후, 1차 유방 조직 샘플을 토대로 유효성을 입증하였다. PBGD 및 β-액틴을 하우스킵핑 유전자로 사용하였다. 림프절 cDNA를 ABI Prism 7900HT 서열 검출 시스템에 TaqManR 화학을 사용하는 정량적 PCR로 분석하였다. 데이타는 Ct 단위로 기록하였다. Ct는 평균화된 리포터 방출의 통계적으로 유의적인 증가가 관찰되는 순환으로 정의된다. 맘마글로빈 프라이머(서열 번호 18 및 서열 번호 19)는 제조사[Invitrogen Corp.(캘리포니아주 칼스바드 소재)]에서, 맘마글로빈 TaqManR 프로브(서열 번호 20)는 제조사[Epoch Biosciences(캘리포니아주 샌디에고 소재)]에서 합성되었다. CK19 프라이머(서열 번호 21 및 서열 번호 22) 및 TaqManR 프로브(서열 번호 23). B726 프라이머(서열 번호 24 및 서열 번호 25) 및 TaqManR 프로브(서열 번호 26). B305D 프라이머(서열 번호 27 및 서열 번호 28)은 제조사[Invitrogen Corp.]에서, 프로브(서열 번호 29)는 제조사[Applied Biosystems, Inc.]에서 합성되었다. PIP 프라이머(서열 번호 30 및 서열 번호 31) 및 TaqManR 프로브(서열 번호 32). PDEF 프라이머(서열 번호 33 및 서열 번호 34) 및 TaqManR 프로브(서열 번호 35). GABA 프라이머(서열 번호 36 및 서열 번호 37) 및 TaqManR 프로브(서열 번호 38). PBGD 프라이머(서열 번호 39 및 서열 번호 40)은 제조사[QIAGEN Operon(캘리포니아주 알라메다 소재)], 프로브(서열 번호 41)은 제조사[Synthegen, LLC(텍사스주 하우스톤 소재)]에서 합성되었다. 모든 TaqManR 프로브에 대하여, 염료 및 소거제 쌍으로 카복시플루오레세인(FAM) 및 카복시테트 라메틸로다민(TAMRA)을 사용하였다.
서열 번호 18: CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA
서열 번호 19: TCTGTGAGCC AAAGGTCTTG CAGA
서열 번호 20: 6-FAM - tgtttatgca attaatatat gacagcagtc tttgtg- TAMRA
서열 번호 21: AGATGAGCAGGTCCGAGGTTA
서열 번호 22: CCTGATTCTGCCGCTCACTATCA
서열 번호 23: FAM-ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGCA-TAMRA
서열 번호 24: GCAAGTGCCAATGATCAGAGG
서열 번호 25: ATATAGACTCAGGTATACACACT
서열 번호 26: FAM TCCCATCAGAATCCAAACAAGAGGAAG
서열 번호 27: TCTGATAAAG GCCGTACAAT G
서열 번호 28: TCACGACTTG CTGTTTTTGC TC
서열 번호 29: 6-FAM-ATCAAAAAACA AGCATGGCCTCA CACC-TAMRA
서열 번호 30: GCTTGGTGGTTAAAACTTACC
서열 번호 31: TGAACAGTTCTGTTGGTGTA
서열 번호 32: FAM-CTGCCTGCCTATGTGACGACAATCCGG-TAMRA
서열 번호 33: GCCGCTTCATTAGGTGGCTCAA
서열 번호 34: AGCGGCTCAGCTTGTCGTAGTT
서열 번호 35: AAGGAGAAGGGCATCTTCAAAATTGAGGACTCAGC
서열 번호 36: CAATTTTGGTGGAGAACCCG
서열 번호 37: GCTGTCGGAGGTATATGGTG
서열 번호 38: FAM CATTTCAGAGAGTAACATGGACTACACA TAMRA
서열 번호 39: CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA
서열 번호 40: CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA
서열 번호 41: FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT-TAMRA
데이타 분석: PCR 검사의 종결시에 샘플을 확인하였다. H&E, IHC, 재발 및 부가적 병리학적 데이타는 이 때 입수가능하게 되었다. Ct 컷-오프는 다변수 수신동작특징(ROC) 분석 및 가시적 관찰을 사용하여 양성 림프절 상태의 측정을 위하여 정립되었다. 모든 위-음성 및 위-양성 결과에 대하여 상위한 분석(병리학 보고에 의거한)은 수행하였다. 추정의 양성 샘플(부적합한 결절 샘플링으로 인하여 표준 병리학에서 놓친 실제 양성을 나타낼 가망이 있는 샘플)을 다음의 기준을 토대로 하여 확인하였다: 4개 이상의 분자 마커가 양성을 나타내며, 당해 마커 중 하나 이상이 강한 양성을 나타냄 (5회 이상의 주기에서 Ct가 단일 마커 검정 컷-오프 이하임).
당해 결과를 도 1 및 표 1 내지 2에 나타내었다. 도 1에서, VBM1은 CK19이다.
Figure 112006089921896-PCT00001
Figure 112006089921896-PCT00002
표 2에서, 감수성은 90%이며, 특이성은 93%, PPV는 84% 및 NPV는 96%이다.
Figure 112006089921896-PCT00003
+ PCR 양성(Ct ≤ 컷오프)
++ 강한 PCR 양성 (5회 초과 주기에서 컷오프 이하)
추정상 4개 이상의 마커에서 PCR 양성
양성 1개 이상의 마커에서 강한 PCR 양성
Figure 112006089921896-PCT00004
표 4에서, 감수성은 91%, 특이성은 97%, PPV는 93% 및 NPV는 96%이다.
결과: 2-유전자 검정(맘마글로빈 및 CK19)은 90% 감수성 및 93% 특이성을 갖는 임상적으로 작용가능한 전이(IHC의 부재 하에 H&E-양성인)를 검출하였다. 제3의 유전자의 첨가는 모든 성능에 최소 영향을 주었다.
보다 우수한 감수성 및 특이성을 달성하기 위한 유전자 특성화 노력 수행의 일환으로, PDEF 및 CK19 검정을 이들 림프절 샘플에 대하여 실행하였다. 마커들의 CK19 + MG 조합은 아래의 표 5에 나타낸 바와 같이 당해 검정의 감수성을 더욱 증가시켰다.
Figure 112006089921896-PCT00005
Figure 112006089921896-PCT00006
이들 데이타는 CK19가 당해 검정의 감수성을 증가시켰을 뿐 아니라; 보완 마커인 맘마글로빈을 갖는 제1의 마커였음을 나타내었다. 이러한 마커 조합은 검정 성능을 개선한다.
결론: 당해 연구는 2-유전자(하나는 유방암 특이적이며 다른 하나는 비-조직 특이적이다) 분자 표시(signature) 분석이 유방암 SLN에서 임상적으로 관련된 전이를 검출함을 입증하는, SLN 전이의 표준 H&E 검출과 밀접한 상관 관계가 있는 맘마글로빈/CK19 발현을 사용하여 임상적으로 작용가능한 유방암 전이를 검출하기 위한 수술중 검정의 토대로서의 RT-PCR의 유용성을 입증한다. 따라서, 당해 검사는 SLN 생검법을 수행하는 환자에 대한 2차 수술을 상당히 감소시킬 잠재성을 갖는다.
실시예 2- 맘마글로빈 , CK19 및 PBGD mRNA 의 특이적 검출용 최적 프라이머 및 프로브
맘마글로빈 프라이머 및 프로브
Tth 폴리머라제의 신속한 검정에 적합한 가닥 치환 및 뉴클레아제 활성을 제공하는 능력을 측정하였고, 프라이머 및 프로브를 적합한 검정 조건으로 최적화하였다. 프라이머/프로브의 제1 세트는 엑손 2 및 3에 특이적이었다. Sybr Green 유무하에 실험을 수행하여 성공적인 증폭과 검출을 구별하였다. 이가 양이온 농도의 최적화 및 망간(MnSO4)에 대한 마그네슘(MgCl2)의 첨가를 수행하여 RT 및 증폭을 개선하였다. 이들 실험 중 하나는 또한 MnCl2와 MnSO4의 현저한 차이를 나타내지 않았다. 이들 실험은 2가지의 이가 양이온 - RT에는 망간(MnSO4) 및 PCR에는 마그네슘(MgCl2)을 각각 2.5mM 및 3.5mM로 사용하는 최적 검정을 유도하였다.
제1 디자인은 105bp 앰플리콘을 산출하였으며 동일한 영역에 재설계되어 96bp의 보다 작은 앰플리콘을 산출하였다. 제1 및 제2 디자인은 매우 잘 작동하였지만, 매우 높은 신호 및 Fam 채널로부터 Cy3 채널로의 스필오버(spillover)를 나타내었다.
엑손 2와 3을 가로지르는 디자인이 AT 풍부 영역에 있었고 온도 순환 중 유연성을 제한함으로써 다양한 노력을 기울이던 중 문제를 나타낼 수 있었기 때문에, 검정을 엑손 1과 2를 가로지르는 맘마글로빈으로 재설계하였다. 두개의 프로브를 동일한 영역에 설계하였다. 프로브 둘 다 Fam, Cy3 및 Cy5 채널에서 검사하였다. 신규한 디자인을 Sybr Green 유무하에 유효성을 입증하여 RT 중 당해 프로브의 존재로 인한 억제가 없었음을 확증하였다.
맘마글로빈 설계력
서열 번호 18: CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA 엑손 2-3
서열 번호 19: TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA 105 bp
서열 번호 20: TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT 생성물
서열 번호 42: CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA 엑손 2-3
서열 번호 43: GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT 96 bp
서열 번호 44: TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG 생성물
서열 번호 9: AGTTGCTGATGGTCCTCATGC 엑손 1-2
서열 번호 10: ATCACATTCTCCAATAAGGGGC 82 bp
서열 번호 45: GCACTGCTACGCAGGCTCTGGC 생성물
서열 번호 11: CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA 생성물
프로브 설계 둘 다를 사용하여 수집한 데이타를 토대로 하여, 서열 번호 48을 엑손 1-2 영역에 대한 최종 디자인으로 낙점하였다.
싱글렉스 ( Singlex ) 검사로부터의 맘마글로빈 최종 디자인
신규한 디자인의 유효성을 입증하는 다음의 실험에서, 맘마글로빈을 프라이머 및 프로브로 다음의 서열을 사용하는 Fam 채널에 투입하였다.
서열 번호 9: AGTTGCTGATGGTCCTCATGC
서열 번호 10: ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA
서열 번호 11: Fam -CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA- BHQ1
일단 가수분해 프로브 검정이 Tth 중합효소에 적합하다고 결정되면, 당해 검정을 B305D 및 CK19에 대해서도 검사하였다.
제1 올리고뉴클레오타이드 세트
시험한 초기 디자인은 디자인에 접합-특이적 PCR 프라이머를 포함하였는데, 이는 이것이 CK19와 이의 의사유전자를 구별하는 데 최선인 것으로 보였기 때문이다. 당해 디자인에 대하여 검사한 당해 프라이머 및 이중-표지된 가수분해 프로브 서열이 아래에 나타내어져 있다:
정방향 프라이머 서열 번호 21: AGATGAGCAGGTCCGAGGTTA
역방향 프라이머 서열 번호 46: GCAGCTTTCATGCTCAGCTGT
프로브(5'FAM/3'BHQ) 서열 번호 23: ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGCA
아래의 표 7에 나타낸 바와 같이, 당해 디자인은 게놈 DNA와 강력하게 교차 반응하는 것으로 입증되었다.
Figure 112006089921896-PCT00007
표적 농도의 차이를 설명하기 위해 조정하는 경우, DNA 및 RNA를 사용하여 관찰한 프로브 Ct는 본질적으로 동일하였다. 게다가, 가수분해 프로브로부터의 종료시 형광 또한 본질적으로 동일하였다. 이들을 함께 고려하면, 이들 결과는 DNA에 대한 프라이머 및 프로브 특이성에 비하여 저조한 RNA에 대한 프라이머 및 프로브 특이성을 입증한다. 개별 반응으로부터의 SYBR Green 신호는 증폭이 RNA 표적에 비하여 DNA 표적에 실질적으로 우세함을 제시하며, 이는 일단계 RT-PCR 중 RNA의 DNA로의 전환에서 다수의 의사유전자 서열의 증폭 또는 비효율에 기인할 가능성이 있다.
제2 올리고뉴클레오타이드 세트
검사한 다음 디자인은 개별 엑손 내에 접합-특이적 프로브 및 프라이머를 포함한다. 당해 디자인에 대하여 검사한 프라이머 및 이중-표지된 가수분해 프로브 서열이 아래에 나타내어져 있다.
정방향 프라이머(서열 번호 47) CACCCTTCAGGGTCTTGAGA
역방향 프라이머(서열 번호 48) TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
프로브(서열 번호 49) (5'FAM/3'BHQ) GCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGA
이러한 경우, DNA에 대하여 조정한 Ct는 RNA에 대한 것보다 2.5회 높았으며, 이는 DNA에 대한 특이성에 비한 RNA에 대한 특이성의 어느 정도의 수준을 입증한다. RNA와 DNA 사이의 Ct 차이가 SYBR Green에 대한 것보다 프로브에 대하여 높다는(2.5회 대 0.2회) 사실은 특이성 개선이 프라이머 및 프로브 둘 다에 기인함을 제시한다. 기존의 디자인에 비하여, 프라이머 특이성의 개선(SYBR Green Ct)은 3.1회(0.2회 대 -2.9회)이다. 프로브 특이성 개선은 형광이 DNA에 비하여 RNA에 대하여 2배 증가한 것으로 지지된다(표 8). 이러한 특이성 증가는 바람직한 반면, DNA 신호로부터 RNA 신호를 확신을 가지고 구별하기에는 적합하지 않을 수 있다.
Figure 112006089921896-PCT00008
제3 올리고뉴클레오타이드 세트
RNA에 대한 특이성을 더욱 개선하기 위해 부가의 프라이머 및 프로브를 설계하였다. 부가의 디자인은 당해 프라이머 및 프로브의 위치 및 길이에 미미한 변형을 가하여 동일한 영역에서 제조하였다. 검사한 프라이머 및 이중-표지된 가수분해 프로브 서열이 아래의 표 9에 나타내어져 있다.
정방향 프라이머
(서열 번호 47) CACCCTTCAGGGTCTTGAGA
(서열 번호 50) CACCCTTCAGGGTCTTGAGAT
(서열 번호 12) CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT
(서열 번호 51) ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTG
(서열 번호 52) ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTGA
역방향 프라이머
(서열 번호 13) TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
(서열 번호 53) CTCCGTTTCTGCCAGTGTGT
프로브 (5'FAM/3'BHQ)
(서열 번호 49) GCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGA
(서열 번호 14) ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT
Figure 112006089921896-PCT00009
상기한 조건과 비교하여, (조건 A), 여러 조건이 조정된 RNA/DNA 프로브 Ct 차 또는 RNA/DNA 프로브 형광 비의 개선을 입증하였다. 최적 조건은 L, N 및 O였다. 이들 조건 모두 3.6회 이상의 Ct 차이 및 8 이상의 형광 비를 입증하였다. 세개의 조건 모두 신호 구별이 양성을 정의하는 데 사용되는 형광 컷-오프의 최소 조작을 통한 DNA 검출의 모든 제거에 충분함을 입증한다. 조건 B, D, G, I 및 K, 모두 2.2회 이상의 Ct차이 및 3.4 이상의 형광 비를 가지며, 이는 이들 조합을 RNA와 DNA를 분해하기 위해 사용하는 것에 대한 합리적인 가능성을 제시한다. 검사하지 않았지만, 조건 P, Q 및 R(역방향 프라이머 서열 번호 13을 사용하는 것을 제외하고, 각각 L, N 및 O와 유사함) 또한 최적 성능을 유도할 것으로 예상된다.
조건 L 및 P를 검사하여 당해 검정 형광 컷-오프를 변경함으로써 RNA에 대한 특이성을 보다 증가시키는 능력을 입증하였다. 당해 실시예에 대하여 검사한 프라이머 및 이중-표지된 가수분해 프로브 서열이 아래에 나타내어져 있다.
정방향 프라이머
(서열 번호 12) CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT
역방향 프라이머
(서열 번호 13) TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
(서열 번호 53) CTCCGTTTCTGCCAGTGTGT
프로브 (5'Q570/3'BHQ2)
(서열 번호 14) ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT
표 10에 나타낸 바와 같이, 컷-오프를 최대 형광의 대략 1.5%의 현재 세트-포인트(set-point)로부터 최대 형광의 6-7% 수준으로 증가시키자, 40회 주기까지 DNA에 대해서는 Ct가 관찰되지 않은 반면, RNA에 대한 Ct는 약 2회 주기만에 증가하였다. 컷-오프에 대한 이러한 종류의 미미한 변형이 최소한, 조건 L, N, O, P, Q 및 R에 대한 최적 성능을 유도하는 것으로 예측된다.
Figure 112006089921896-PCT00010
PBGD 프라이머/프로브
서열 번호 15 GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCA 엑손 1-2
서열 번호 54 ACCCACGCGAATCACTCTCA 83bp
서열 번호 17 AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA 생성물
서열 번호 55 CAAGCGGAGCCATGTCTGG 엑손 1-2
서열 번호 54 ACCCACGCGAATCACTCTCA 93bp
서열 번호 17 AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA 생성물
디자인 둘 다 동등하게 잘 수행되었지만, 보다 긴 생성물을 최종 디자인으로 선택하였다. PBGD를 Cy5 채널에 투입하였다. 이는 내부 대조군의 임의의 양성 결과가 반드시 다른 채널로부터의 스필오버로 기인하여 유발되지 않도록 하기 위해 수행하였다.
싱글렉스 검사로부터의 PBGD 최종 디자인
서열 번호 55 CAAGCGGAGCCATGTCTGG
서열 번호 54 ACCCACGCGAATCACTCTCA
서열 번호 17 Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2
다중(multiplex) 검사
싱글렉스 검사에 이어, 위에서 선택한 디자인을 Sybr Green의 유무하에 Fam의 맘마글로빈, Cy3의 CK19 및 Cy5 채널의 PBGD를 사용하여 다중으로 검사하였다. 다중검사에서는 어떠한 주형 반응도 훨씬 낮은 Ct를 산출하지 않는 것으로 관찰되었다. 상이한 프라이머-프로브 조합을 사용한 추가의 실험에 따르면, PBGD 하부와 CK19 상부 프라이머 사이에 3' 이량체화가 있는 것으로 보였다. 다중 혼합에서 이들 2개의 프라이머 중 하나가 없는 경우, 어떠한 주형 반응도 훨씬 높은 Ct에서 나타나지 않았다.
프라이머 상호작용을 최소화하기 위해, 다음의 프라이머를 최종 다중 검정에 선택하였다.
MG 정방향 프라이머(서열 번호 9) AGTTGCTGATGGTCCTCATGC
MG 역방향 프라이머(서열 번호 10) ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA
MG 프로브(서열 번호 11) Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT
CK19 정방향 프라이머(서열 번호 12) CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT
CK19 역방향 프라이머(서열 번호 13) TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
CK19 프로브(서열 번호 14) Q570-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ2-TT
PBGD 정방향 프라이머(서열 번호 15) GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCA
PBGD 역방향 프라이머(서열 번호 16) TTGCGGGTACCCACGCGAA
PBGD 프로브(서열 번호 17) Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2
CK19에 대한 최종 프라이머 선택 중, 프라이머, 프로브 및 순환 조건의 비교를 수행하였다. 이들 실험은 CK19와 이의 의사유전자 사이의 형광 수준의 10배 판별 때문에 의사유전자가 Cy3 채널에서 검출되지 않을 것임을 나타내었다. 다음의 실현가능성 연구에서, 게놈 DNA를 사용하여 의사유전자의 증폭을 조사하기 위한 개별 실험을 설계하였다. 모든 경우, 의사유전자는 증폭되며, 게놈 DNA는 증폭되지 않음이 명백하였으며, 이는 증폭 생성물이 모든 경우에 올바른 길이를 가졌으며 인트론의 증폭을 나타내지 않았기 때문이다. 당해 실험은 증폭과 검출을 차별화하기 위해 Sybr Green의 유무하에 실행하였다. 상이한 농도의 게놈 DNA를 주형 대조군 없이 주형으로 사용하였다. 반응은 오직 PCR 및 RT-PCR만을 사용하여 실행하였다. Cy3 채널에서의 가수분해 프로브 화학법은 의사유전자를 채택하지 않았다.
그러나, SYBR 데이타로부터, 의사유전자는 증폭은 되지만, Cy3 채널에서 가수분해 프로브 화학법을 사용하여서는 심지어 106 복사체의 농도로도 검출되지 않음이 명백하다. 모든 생성물을 겔 상에서 진행시켜 결과를 확인하였다. 주형을 사용한 모든 경우, 올바른 크기(81bp)의 밴드가 어떠한 Ct도 검출되지 않은 SYBR 부재하의 반응을 포함한 반응에서 나타났다. 이러한 확증은 Cy3 채널에서의 신호의 부재가 증폭이 되지 않기 때문이 아니라, 가수분해 프로브 화학법으로 인한 판별 때문임을 확실히 하기 위해 필요하다.
Figure 112006089921896-PCT00011
실시예 3 - 표준 방법으로 정제한 샘플의 신속 검정 검사
샘플
표준 트리졸(Trizol) 방법으로 유방 림프절에서 RNA를 분리하였다. RNA를 260nm의 흡광도로 정량화하였다. 모든 RNA를 200ng/㎕로 희석하였다. RNA 질은 하우스킵핑 유전자 PBGD 및 β-액틴을 사용하여 이단계 RT-PCR로 측정하였다. 둘 다의 하우스킵핑 유전자가 검사한 모든 샘플에 걸쳐 3회 주기의 평균 신호 내의 신호를 제공하는 경우 샘플이 적합한 질이라고 간주하였다. 검사한 최종 세트의 샘플은 251명의 환자로부터의 487개의 림프절 샘플을 나타내었다.
일단계 RT- PCR 검사
상기한 RNA 샘플을 맘마글로빈(MG), 케라틴 19(CK19) 및 PBGD에 대한 프라이머 및 프로브를 포함하는 신속, 실시간, 일단계 RT-PCR를 사용하여 증폭하였다. 사용한 프라이머 및 프로브 서열은 다음과 같았다.
MG 정방향 프라이머(서열 번호 9) AGTTGCTGATGGTCCTCATGC
MG 역방향 프라이머(서열 번호 10) ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA
MG 프로브(서열 번호 11 ) Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQI-TT
CK19 정방향 프라이머(서열 번호 12) CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT
CK19 역방향 프라이머(서열 번호 13) TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
CK19 프로브(서열 번호 14) Q570-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ2-TT
PBGD 정방향 프라이머(서열 번호 15) GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCA
PBGD 역방향 프라이머(서열 번호 16) TTGCGGGTACCCACGCGAA
PBGD 프로브(서열 번호 17) Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2
RT- PCR 증폭 조건
각 샘플로부터의 RNA 1㎕(200ng)을 다음의 성분을 함유하는 반응물 25㎕에서 증폭시켰다: pH 8.2의 50mM 비신(Bicin)/KOH, 3.5mM MgCl2, 2.5mM 황산망간, 115mM 아세트산칼륨, 12mM 염화칼륨, 6mM 염화나트륨, 0.8mM 인산나트륨, 10% v/v 글리세롤, 0.2mg/㎖ BSA, 150mM 트레할로스, 0.2% v/v 트윈 20, 0.016% v/v 트리톤 X-100, pH 8의 50mM 트리스-Cl, 0.2mM dATP, 0.2mM dCTP, 0.2mM dGTP, 0.2mM TTP, 0.08% v/v 프로클린(Proclin) 300, 5단위 Tth 중합효소{재조합 DNA 중합효소/터모스 터모필리스(Thermos thermophilis)로부터 클로닝한 역전사효소}, 항체 TP6-25.3 400ng, MG 및 CK19에 대한 각 프라이머 450nM , PBGD에 대한 각 프라이머 300nM 및 각 프로브 200nM. RT-PCR 조건은 다음의 프로필을 사용하여 Cepheid Smart Cycler II에서 수행하였다.
95℃에서 3초 항온처리
63℃에서 150초 항온처리
다음의 온도에서 4초 항온처리: 63.2℃, 63.4℃, 64.0℃, 64.5℃, 65.0℃, 65.5℃, 66.0℃, 66.5℃, 67.0℃, 67.5℃, 68.0℃, 68.5℃, 69.0℃, 69.5℃
70℃에서 90초 항온처리
이어서 95℃에서 1초 항온처리 및 60.0℃에서 6초 항온처리의 40회 주기.
다음의 양성 Ct에 대한 역치 형광 수치(채널 1은 30, 채널 2는 20, 그리고 채널 3은 20)를 사용하여 Smart Cycler II의 채널 1(Fam), 2(Q570) 및 4(Q670)에서 60.0° 동안 형광 신호를 모니터하였다. 세 채널 모두에 대하여 각 샘플에 대한 Ct 수치를 측정한 후, 최적 컷-오프를 측정하여 IHC의 부재하에 검정 신호와 H&E-양성을 상호 연관시켰다. 5개의 샘플이 PBGD 신호로 측정에 따라 허용불가능한 RNA 질을 갖는 것으로 결정되었으며 시험 결과가 없는 것으로 간주되었다. 다음의 표 12는 타당한 결과가 도출된 246명의 환자의 결과를 요약한다.
Figure 112006089921896-PCT00012
실시예 4 - 신속 샘플 프렙 (prep) 방법으로 정제한 샘플의 신속 검정 검사
샘플
Omni 균질기 및 균질화용 일회용 프로브를 사용하여 유방 림프절로부터 RNA를 분리한 후, 다음의 프로토콜을 사용하여 RNeasy(제조사[Qiagen]) 키트 시약으로 RNA를 정제하였다.
균질화
사전에 기록되지 않은 경우, 샘플 중량은 밀리그램 단위로 측정한다. 사용하지 않은 납지를 저울에 두고, 이의 중량을 달고 샘플을 칭량한다.
주의: 30mg 미만의 결절은 BLN 검정을 사용하는 검사에 충분한 조직을 제공하지 않는다.
새로운 스칼펠을 사용하여 동일한 결절로부터의 모든 조직을 대략 1mm 직경의 조각으로 저민다. 과정 중 조직이 오염되지 않도록 주의한다.
균질화관(8 또는 15mL 폴리프로필렌 배양관, 4mL 이하의 용적의 균질화 완충액에 대해서는 8mL 관을 사용하고, 이 외에는 15mL 관을 사용)에 표 13에 사용된 바와 같이 균질화 완충액을 첨가하여 필요 용적을 측정한다.
Figure 112006089921896-PCT00013
주의: 550mg 초과 중량의 조직은 권장 시스템을 사용하여 균질화하기에 적합하지 않다. 조직을 균질화 전에 등분하고 각각의 부분을 균질화, 정제하고 개별 표본으로 검정하는 것이 좋다.
1. 깨끗한 겸자를 사용하여 조직을 균질화 완충액으로 전달함.
2. 신규한 균질화 프로브를 수동 균질화기 상에 놓음.
3. 각 결절을 완전히 균질화함.
4. 균질화물을 RNA 정제 섹션에 기술된 바와 같이 처리함.
5. 균질화 프로브를 배치함.
6. 임의의 잔여 균질화물은 -65℃ 이하에서 저장함.
RNA 정제
주의: 복합 균질화물은 당해 과정을 사용하여 동시에 처리하였다.
1. 4.5mL 관에서 균질화물 400㎕와 70% 에탄올 400㎕을 10초간 와동시켜 혼합한다.
2. 각 샘플에 대하여, Vacuum Manifold 상에 VacValve, 및 각 밸브에 일회용 VacConnector를 부착한다.
3. 회전 칼럼을 VacConnector 상에 마개를 개방시킨 채로 부착한다.
4. 단계 1의 균질화물/에탄올 혼합물을 당해 칼럼에 분취한다. 균질화물/에탄올 혼합물의 용적은 원 조직 양에 의거하며, 표 14에 나타내어져 있다.
5. VacValve를 작동 위치로 돌리고 샘플이 여과될 때까지(약 30초) 진공상태(800 내지 1000mbar)를 적용한다.
6. 진공상태 적용을 중단하고; 당해 칼럼에 700㎕의 세척 완충액 1을 가한다. 진공상태 적용을 시작하고 당해 용액을 칼럼을 통해 여과시킨다. 진공상태 적용을 중단한다.
7. 당해 칼럼에 700㎕의 세척 완충액 2를 가한다. 진공상태 적용을 시작하고 당해 용액을 칼럼을 통해 여과시킨다. 진공상태 적용을 중단한다.
8. Vacumm Manifold로부터 각 칼럼을 제거하고 2㎖ 수집관에 놓는다.
9. 회전 칼럼을 포함하는 관을 미세원심분리기에서 13,200RPM에서 30초 동안 원심분리한다.
10. 당해 수집관을 폐기한다. 칼럼을 제거하고 새로운 미사용 수집관에 놓는다.
11. RNAase-부존재 수 50㎕를 칼럼의 여과막에 직접 가한다.
12. 미세원심분리기에서 13,200RPM에서 30초 동안 원심분리한다.
13. 당해 칼럼을 폐기한다. 용출된 RNA 용액 약 50㎕를 수집관에 첨가한다. 반응물 25㎕ 당 당해 용액 5㎕를 사용한다.
검사한 최종 세트의 샘플은 전초림프절-양성 유방암 환자로부터의 30 H&E-양성 및 25 H&E-음성 액와 림프절을 나타내었다.
일단계 RT- PCR 검사
사용한 2가지의 샘플 제조 방법의 차이를 설명하기 위해 컷-오프를 표준화한 것을 제외하고, 당해 실시예에서 검사한 환자 샘플로부터 유래한 컷-오프를 사용하여, 실시예 3에 기술한 바와 같이 용출된 RNA 5㎕를 신속, 일단계 RT-PCR 반응물 25㎕에서 작동시켰다. 3개 샘플이 PBGD 신호로 측정한 바에 따라 허용불가능한 RNA 질을 가진 것으로 결정되었으며 검사 결과가 없는 것으로 간주되었다. 다음의 표 15는 타당한 결과가 도출되지 않은 52개의 절의 결과를 요약한다.
Figure 112006089921896-PCT00015
현 반응 조건에는 다음이 포함된다.
유방 림프절 검정 성분
Figure 112006089921896-PCT00016
<110> Veridex, LLC <120> Diagnosing or predicting the course of breast cancer <130> VDX 5005 <150> US 60/577,155 <151> 2004-06-04 <160> 55 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 503 <212> DNA <213> Human <400> 1 gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60 atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 120 ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact 180 gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 240 gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgaggtgttt 300 atgcaattaa tatatgacag cagtctttgt gatttatttt aactttctgc aagacctttg 360 gctcacagaa ctgcagggta tggtgagaaa ccaactacgg attgctgcaa accacacctt 420 ctctttctta tgtcttttta ctacaaacta caagacaatt gttgaaacct gctatacatg 480 tttattttaa taaattgatg gca 503 <210> 2 <211> 1513 <212> DNA <213> Human <400> 2 cgcccctgac accattcctc ccttcccccc tccaccggcc gcgggcataa aaggcgccag 60 gtgagggcct cgccgctcct cccgcgaatc gcagcttctg agaccagggt tgctccgtcc 120 gtgctccgcc tcgccatgac ttcctacagc tatcgccagt cgtcggccac gtcgtccttc 180 ggaggcctgg gcggcggctc cgtgcgtttt gggccggggg tcgcctttcg cgcgcccagc 240 attcacgggg gctccggcgg ccgcggcgta tccgtgtcct ccgcccgctt tgtgtcctcg 300 tcctcctcgg gggcctacgg cggcggctac ggcggcgtcc tgaccgcgtc cgacgggctg 360 ctggcgggca acgagaagct aaccatgcag aacctcaacg accgcctggc ctcctacctg 420 gacaaggtgc gcgccctgga ggcggccaac ggcgagctag aggtgaagat ccgcgactgg 480 taccagaagc aggggcctgg gccctcccgc gactacagcc actactacac gaccatccag 540 gacctgcggg acaagattct tggtgccacc attgagaact ccaggattgt cctgcagatc 600 gacaatgccc gtctggctgc agatgacttc cgaaccaagt ttgagacgga acaggctctg 660 cgcatgagcg tggaggccga catcaacggc ctgcgcaggg tgctggatga gctgaccctg 720 gccaggaccg acctggagat gcagatcgaa ggcctgaagg aagagctggc ctacctgaag 780 aagaaccatg aggaggaaat cagtacgctg aggggccaag tgggaggcca ggtcagtgtg 840 gaggtggatt ccgctccggg caccgatctc gccaagatcc tgagtgacat gcgaagccaa 900 tatgaggtca tggccgagca gaaccggaag gatgctgaag cctggttcac cagccggact 960 gaagaattga accgggaggt cgctggccac acggagcagc tccagatgag caggtccgag 1020 gttactgacc tgcggcgcac ccttcagggt cttgagattg agctgcagtc acagctgagc 1080 atgaaagctg ccttggaaga cacactggca gaaacggagg cgcgctttgg agcccagctg 1140 gcgcatatcc aggcgctgat cagcggtatt gaagcccagc tgggcgatgt gcgagctgat 1200 agtgagcggc agaatcagga gtaccagcgg ctcatggaca tcaagtcgcg gctggagcag 1260 gagattgcca cctaccgcag cctgctcgag ggacaggaag atcactacaa caatttgtct 1320 gcctccaagg tcctctgagg cagcaggctc tggggcttct gctgtccttt ggagggtgtc 1380 ttctgggtag agggatggga aggaagggac ccttaccccc ggctcttctc ctgacctgcc 1440 aataaaaatt tatggtccaa gggaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaa 1513 <210> 3 <211> 503 <212> DNA <213> Human <400> 3 ggggacttct tctctgggac acattgcctt ctgttttctc cagcatgcgc ttgctccagc 60 tcctgttcag ggccagccct gccaccctgc tcctggttct ctgcctgcag ttgggggcca 120 acaaagctca ggacaacact cggaagatca taataaagaa ttttgacatt cccaagtcag 180 tacgtccaaa tgacgaagtc actgcagtgc ttgcagttca aacagaattg aaagaatgca 240 tggtggttaa aacttacctc attagcagca tccctctaca aggtgcattt aactataagt 300 atactgcctg cctatgtgac gacaatccaa aaaccttcta ctgggacttt tacaccaaca 360 gaactgtgca aattgcagcc gtcgttgatg ttattcggga attaggcatc tgccctgatg 420 atgctgctgt aatccccatc aaaaacaatc ggttttatac tattgaaatc ctaaaggtag 480 aataatggaa gccctgtctg tttgccacac ccaggtgatt tcctctaaag aaacttggct 540 ggaatttctg ctgtggtcta taaaataaac ttcttaacat gcttctcctg aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 620 <210> 4 <211> 1155 <212> DNA <213> Human <400> 4 atggtggttg aggttgattc catgccggct gcctcttctg tgaagaagcc atttggtctc 60 aggagcaaga tgggcaagtg gtgctgccgt tgcttcccct gctgcaggga gagcggcaag 120 agcaacgtgg gcacttctgg agaccacgac gactctgcta tgaagacact caggagcaag 180 atgggcaagt ggtgccgcca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagtggcaa gagcaacgtg 240 ggcgcttctg gagaccacga cgactctgct atgaagacac tcaggaacaa gatgggcaag 300 tggtgctgcc actgcttccc ctgctgcagg gggagcagca agagcaaggt gggcgcttgg 360 ggagactacg atgacagtgc cttcatggag cccaggtacc acgtccgtgg agaagatctg 420 gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg 480 ctcagggaca ctgacgtgaa caagcaggac aagcaaaaga ggactgctct acatctggcc 540 tctgccaatg ggaattcaga agtagtaaaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaat 600 gtccttgaca acaaaaagag gacagctctg ataaaggccg tacaatgcca ggaagatgaa 660 tgtgcgttaa tgttgctgga acatggcact gatccaaata ttccagatga gtatggaaat 720 accactctgc actacgctat ctataatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta 780 tatggtgctg atatcgaatc aaaaaacaag catggcctca caccactgtt acttggtgta 840 catgagcaaa aacagcaagt cgtgaaattt ttaattaaga aaaaagcgaa tttaaatgca 900 ctggatagat atggaaggac tgctctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata 960 gtcagccttc tacttgagca aaatattgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg 1020 gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gccagttact ttctgactac 1080 aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaaa tgtctcaaga 1140 accagaaata aataa 1155 <210> 5 <211> 3865 <212> DNA <213> Human <400> 5 tccgagctga ttacagacac caaggaagat gctgtaaaga gtcagcagcc acagccctgg 60 ctagctggcc ctgtgggcat ttattagtaa agttttaatg acaaaagctt tgagtcaaca 120 cacccgtggg taattaacct ggtcatcccc accctggaga gccatcctgc ccatgggtga 180 tcaaagaagg aacatctgca ggaacacctg atgaggctgc acccttggcg gaaagaacac 240 ctgacacagc tgaaagcttg gtggaaaaaa cacctgatga ggctgcaccc ttggtggaaa 300 gaacacctga cacggctgaa agcttggtgg aaaaaacacc tgatgaggct gcatccttgg 360 tggagggaac atctgacaaa attcaatgtt tggagaaagc gacatctgga aagttcgaac 420 agtcagcaga agaaacacct agggaaatta cgagtcctgc aaaagaaaca tctgagaaat 480 ttacgtggcc agcaaaagga agacctagga agatcgcatg ggagaaaaaa gaagacacac 540 ctagggaaat tatgagtccc gcaaaagaaa catctgagaa atttacgtgg gcagcaaaag 600 gaagacctag gaagatcgca tgggagaaaa aagaaacacc tgtaaagact ggatgcgtgg 660 caagagtaac atctaataaa actaaagttt tggaaaaagg aagatctaag atgattgcat 720 gtcctacaaa agaatcatct acaaaagcaa gtgccaatga tcagaggttc ccatcagaat 780 ccaaacaaga ggaagatgaa gaatattctt gtgattctcg gagtctcttt gagagttctg 840 caaagattca agtgtgtata cctgagtcta tatatcaaaa agtaatggag ataaatagag 900 aagtagaaga gcctcctaag aagccatctg ccttcaagcc tgccattgaa atgcaaaact 960 ctgttccaaa taaagccttt gaattgaaga atgaacaaac attgagagca gatccgatgt 1020 tcccaccaga atccaaacaa aaggactatg aagaaaattc ttgggattct gagagtctct 1080 gtgagactgt ttcacagaag gatgtgtgtt tacccaaggc tacacatcaa aaagaaatag 1140 ataaaataaa tggaaaatta gaagagtctc ctaataaaga tggtcttctg aaggctacct 1200 gcggaatgaa agtttctatt ccaactaaag ccttagaatt gaaggacatg caaactttca 1260 aagcagagcc tccggggaag ccatctgcct tcgagcctgc cactgaaatg caaaagtctg 1320 tcccaaataa agccttggaa ttgaaaaatg aacaaacatt gagagcagat gagatactcc 1380 catcagaatc caaacaaaag gactatgaag aaagttcttg ggattctgag agtctctgtg 1440 agactgtttc acagaaggat gtgtgtttac ccaaggctrc rcatcaaaaa gaaatagata 1500 aaataaatgg aaaattagaa gggtctcctg ttaaagatgg tcttctgaag gctaactgcg 1560 gaatgaaagt ttctattcca actaaagcct tagaattgat ggacatgcaa actttcaaag 1620 cagagcctcc cgagaagcca tctgccttcg agcctgccat tgaaatgcaa aagtctgttc 1680 caaataaagc cttggaattg aagaatgaac aaacattgag agcagatgag atactcccat 1740 cagaatccaa acaaaaggac tatgaagaaa gttcttggga ttctgagagt ctctgtgaga 1800 ctgtttcaca gaaggatgtg tgtttaccca aggctrcrca tcaaaaagaa atagataaaa 1860 taaatggaaa attagaagag tctcctgata atgatggttt tctgaaggct ccctgcagaa 1920 tgaaagtttc tattccaact aaagccttag aattgatgga catgcaaact ttcaaagcag 1980 agcctcccga gaagccatct gccttcgagc ctgccattga aatgcaaaag tctgttccaa 2040 ataaagcctt ggaattgaag aatgaacaaa cattgagagc agatcagatg ttcccttcag 2100 aatcaaaaca aaagaasgtt gaagaaaatt cttgggattc tgagagtctc cgtgagactg 2160 tttcacagaa ggatgtgtgt gtacccaagg ctacacatca aaaagaaatg gataaaataa 2220 gtggaaaatt agaagattca actagcctat caaaaatctt ggatacagtt cattcttgtg 2280 aaagagcaag ggaacttcaa aaagatcact gtgaacaacg tacaggaaaa atggaacaaa 2340 tgaaaaagaa gttttgtgta ctgaaaaaga aactgtcaga agcaaaagaa ataaaatcac 2400 agttagagaa ccaaaaagtt aaatgggaac aagagctctg cagtgtgaga ttgactttaa 2460 accaagaaga agagaagaga agaaatgccg atatattaaa tgaaaaaatt agggaagaat 2520 taggaagaat cgaagagcag cataggaaag agttagaagt gaaacaacaa cttgaacagg 2580 ctctcagaat acaagatata gaattgaaga gtgtagaaag taatttgaat caggtttctc 2640 acactcatga aaatgaaaat tatctcttac atgaaaattg catgttgaaa aaggaaattg 2700 ccatgctaaa actggaaata gccacactga aacaccaata ccaggaaaag gaaaataaat 2760 actttgagga cattaagatt ttaaaagaaa agaatgctga acttcagatg accctaaaac 2820 tgaaagagga atcattaact aaaagggcat ctcaatatag tgggcagctt aaagttctga 2880 tagctgagaa cacaatgctc acttctaaat tgaaggaaaa acaagacaaa gaaatactag 2940 aggcagaaat tgaatcacac catcctagac tggcttctgc tgtacaagac catgatcaaa 3000 ttgtgacatc aagaaaaagt caagaacctg ctttccacat tgcaggagat gcttgtttgc 3060 aaagaaaaat gaatgttgat gtgagtagta cgatatataa caatgaggtg ctccatcaac 3120 cactttctga agctcaaagg aaatccaaaa gcctaaaaat taatctcaat tatgcmggag 3180 atgctctaag agaaaataca ttggtttcag aacatgcaca aagagaccaa cgtgaaacac 3240 agtgtcaaat gaaggaagct gaacacatgt atcaaaacga acaagataat gtgaacaaac 3300 acactgaaca gcaggagtct ctagatcaga aattatttca actacaaagc aaaaatatgt 3360 ggcttcaaca gcaattagtt catgcacata agaaagctga caacaaaagc aagataacaa 3420 ttgatattca ttttcttgag aggaaaatgc aacatcatct cctaaaagag aaaaatgagg 3480 agatatttaa ttacaataac catttaaaaa accgtatata tcaatatgaa aaagagaaag 3540 cagaaacaga aaactcatga gagacaagca gtaagaaact tcttttggag aaacaacaga 3600 ccagatcttt actcacaact catgctagga ggccagtcct agcatcacct tatgttgaaa 3660 atcttaccaa tagtctgtgt caacagaata cttattttag aagaaaaatt catgatttct 3720 tcctgaagcc tacagacata aaataacagt gtgaagaatt acttgttcac gaattgcata 3780 aagctgcaca ggattcccat ctaccctgat gatgcagcag acatcattca atccaaccag 3840 aatctcgctc tgtcactcag gctgg 3865 <210> 6 <211> 3282 <212> DNA <213> Human <400> 6 gggacagggc tgaggatgag gagaaccctg gggacccaga agaccgtgcc ttgcccggaa 60 gtcctgcctg taggcctgaa ggacttgccc taacagagcc tcaacaacta cctggtgatt 120 cctacttcag ccccttggtg tgagcagctt ctcaacatga actacagcct ccacttggcc 180 ttcgtgtgtc tgagtctctt cactgagagg atgtgcatcc aggggagtca gttcaacgtc 240 gaggtcggca gaagtgacaa gctttccctg cctggctttg agaacctcac agcaggatat 300 aacaaatttc tcaggcccaa ttttggtgga gaacccgtac agatagcgct gactctggac 360 attgcaagta tctctagcat ttcagagagt aacatggact acacagccac catatacctc 420 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agccgctcca tccgccagta ttacaagaag ggcatcatcc ggaagccaga 1380 catctcccag cgcctcgtct accagttcgt gcaccccatc tgagtgcctg gcccagggcc 1440 tgaaacccgc cctcaggggc ctctctcctg cctgccctgc ctcagccagg ccctgagatg 1500 ggggaaaacg ggcagtctgc tctgctgctc tgaccttcca gagcccaagg tcagggaggg 1560 gcaaccaact gccccagggg gatatgggtc ctctggggcc ttcgggacca tggggcaggg 1620 gtgcttcctc ctcaggccca gctgctcccc tggaggacag agggagacag ggctgctccc 1680 caacacctgc ctctgacccc agcatttcca gagcagagcc tacagaaggg cagtgactcg 1740 acaaaggcca caggcagtcc aggcctctct ctgctccatc cccctgcctc ccattctgca 1800 ccacacctgg catggtgcag ggagacatct gcacccctga gttgggcagc caggagtgcc 1860 cccgggaatg gataataaag atactagaga actg 1894 <210> 8 <211> 1377 <212> DNA <213> Human <400> 8 cacacagcct actttccaag cggagccatg tctggtaacg gcaatgcggc tgcaacggcg 60 gaagaaaaca gcccaaagat gagagtgatt cgcgtgggta cccgcaagag ccagcttgct 120 cgcatacaga cggacagtgt ggtggcaaca ttgaaagcct cgtaccctgg cctgcagttt 180 gaaatcattg ctatgtccac cacaggggac aagattcttg atactgcact ctctaagatt 240 ggagagaaaa gcctgtttac caaggagctt gaacatgccc tggagaagaa tgaagtggac 300 ctggttgttc actccttgaa ggacctgccc actgtgcttc ctcctggctt caccatcgga 360 gccatctgca agcgggaaaa ccctcatgat gctgttgtct ttcacccaaa atttgttggg 420 aagaccctag aaaccctgcc agagaagagt gtggtgggaa ccagctccct gcgaagagca 480 gcccagctgc agagaaagtt cccgcatctg gagttcagga gtattcgggg aaacctcaac 540 acccggcttc ggaagctgga cgagcagcag gagttcagtg ccatcatcct agcaacagct 600 ggcctgcagc gcatgggctg gcacaaccgg gtggggcaga tcctgcaccc tgagaaatgc 660 atgtatgctg tgggccaggg ggccttgggc gtggaagtgc gagccaagga ccaggacatc 720 ttggatctgg tgggtgtgct gcacgatccc gagactctgc ttcgctgcat cgctgaaagg 780 gccttcctga ggcacctgga aggaggctgc agtgtgccag tagccgtgca tacagctatg 840 aaggatgggc aactgtacct gactggagga gtctggagtc tagacggctc agatagcata 900 caagagacca tgcaggctac catccatgtc cctgcccagc atgaagatgg ccctgaggat 960 gacccacagt tggtaggcat cactgctcgt aacattccac gagggcccca gttggctgcc 1020 cagaacttgg gcatcagcct ggccaacttg ttgctgagca aaggagccaa aaacatcctg 1080 gatgttgcac ggcagcttaa cgatgcccat taactggttt gtggggcaca gatgcctggg 1140 ttgctgctgt ccagtgccta catcccgggc ctcagtgccc cattctcact gctatctggg 1200 gagtgattac cccgggagac tgaactgcag ggttcaagcc ttccagggat ttgcctcacc 1260 ttggggcctt gatgactgcc ttgcctcctc agtatgtggg ggcttcatct ctttagagaa 1320 gtccaagcaa cagcctttga atgtaaccaa tcctactaat aaaccagttc tgaaggt 1377 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Primer <400> 9 AGTTGCTGAT GGTCCTCATG C 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Primer <400> 10 ATCACATTCT CCAATAAGGG GCA 23 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Probe <400> 11 CCCTCTCCCA GCACTGCTAC GCATT 25 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Primer <400> 12 CACCCTTCAG GGTCTTGAGA TT 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 13 TCCGTTTCTG CCAGTGTGTC 20 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Probe <400> 14 ACAGCTGAGC ATGAAAGCTG CCTTTT 26 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Primer <400> 15 GCCTACTTTC CAAGCGGAGC CA 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Primer <400> 16 TTGCGGGTAC CCACGCGA A 21 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Probe <400> 17 AACGGCAATG CGGCTGCAAC GGCGGAA 27 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Primer <400> 18 CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA 29 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Primer <400> 19 TCTGTGAGCC AAAGGTCTTG CAGA 24 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Probe <400> 20 TGTTTATGCA ATTAATATAT GACAGCAGTC TTTGTG 36 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Primer <400> 21 AGATGAGCAG GTCCGAGGTT A 21 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Primer <400> 22 CCTGATTCTG CCGCTCACTA TCA 23 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Probe <400> 23 ACCCTTCAGG GTCTTGAGAT TGAGCTGCA 29 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Primer <400> 24 GCAAGTGCCA ATGATCAGAG G 21 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Primer <400> 25 ATATAGACTC AGGTATACAC ACT 23 <210> 226 <211> 27 <212> DNA <213> Probe <400> 26 TCCCATCAGA ATCCAAACAA GAGGAAG 27 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Primer <400> 27 TCTGATAAAG GCCGTACAAT G 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Primer <400> 28 TCACGACTTG CTGTTTTTGC TC 22 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Probe <400> 29 ATCAAAAAAC AAGCATGGCC TCACACC 27 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Primer <400> 30 GCTTGGTGGT TAAAACT TACC 24 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 31 TGAACAGTTC TGTTGGTGTA 20 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Probe <400> 32 CTGCCTGCCT ATGTGACGAC AATCCGG 27 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Primer <400> 33 GCCGCTTCAT TAGGTGGCTC AA 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Primer <400> 34 AGCGGCTCAG CTTGTCGTAG TT 22 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Probe <400> 35 AAGGAGAAGG GCATCTTCAA AATTGAGGAC TCAGC 35 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 36 CAATTTTGGT GGAGAACCCG 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 37 GCTGTCGGAG GTATATGGTG 20 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> Probe <400> 38 CATTTCAGAG AGTAACATGG ACTACACA28 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Primer <400> 39 CTGCTTCGCT GCATCGCTGA AA 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Primer <400> 40 CAGACTCCTC CAGTCAGGTA CA 22 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Probe <400> 41 CCTGAGGCAC CTGGAAGGAG GCTGCAGTGT 30 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Primer <400> 42 CGGATGAAAC TCTGAGCAAT GTTGA 25 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Primer <400> 43 GAGCCAAAGG TCTTGCAGAA AGT 23 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Probe <400> 44 TGTTTATGCA ATTAATATAT GACAGCAGTC TTTGTG 36 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Probe <400> 45 GCACTGCTAC GCAGGCTCTG GC 22 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Primer <400> 46 GCAGCTTTCA TGCTCAGCTG T 21 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 47 CACCCTTCAG GGTCTTGAGA 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 48 TCCGTTTCTG CCAGTGTGTC 20 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Probe <400> 49 GCTGAGCATG AAAGCTGCCT TGGA 24 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Primer <400> 50 CACCCTTCAG GGTCTTGAGA T 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Primer <400> 51 ACCCTTCAGG GTCTTGAGAT TG 21 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Primer <400> 52 ACCCTTCAGG GTCTTGAGAT TGA 23 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 53 CTCCGTTTCT GCCAGTGTGT 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 54 ACCCACGCGA ATCACTCTCA 20 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Primer <400> 55 CAAGCGGAGC CATGTCTGG 19

Claims (39)

  1. 환자로부터 유래한 세포 또는 조직 샘플에서 하나 이상의 조직 특이적 유전자 및 하나 이상의 비-조직 특이적 유전자를 포함하는 마커(Marker) 유전자 조합의 발현을 측정하는 단계를 포함하여 유방암의 존재를 진단하거나 이의 경과를 예측하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조직 특이적 유전자를 맘마글로빈(서열 번호 1), PIP(서열 번호 3), B305D(서열 번호 4), B726(서열 번호 5), GABA(서열 번호 6) 및 PDEF(서열 번호 7)로 이루어진 그룹 중에서 선택하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 조직 특이적 유전자가 맘마글로빈(서열 번호 1)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 비-조직 특이적 유전자가 특히 상피 세포와 관련된 단백질을 암호화하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 유전자를 CK19(서열 번호 2), 루미칸, 셀레노단백질 P, 결합조직 성장 인자, EPCAM, E-카드헤린 및 콜라겐, IV형, α-2로 이루어진 그룹 중에서 선택하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 유전자가 CK19(서열 번호 2)인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 유전자가 맘마글로빈(서열 번호 1) 및 CK19(서열 번호 2)인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 샘플에서 구성적(constitutive)으로 발현되는 유전자의 발현을 측정하는 대조 반응을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 유전자가 PBGD(서열 번호 8)인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 전이 위험이 있는 환자를 확인하는 데 사용하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 전이를 검출하는 데 사용하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 유방암 전이를 검출하는 데 사용하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 모든 단계를 외과수술 진행 과정 동안 수행하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 환자로부터 림프절 조직 샘플을 수득하는 단계; 핵산 증폭 및 검출로 샘플을 분석하는 단계; 및 하나 이상의 마커의 존재가 컷-오프 수치를 초과하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 수술중 분자 진단 검정을 수행하여 발현을 측정하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 핵산 증폭 및 검출을 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 수행하는 방법.
  16. 제3항에 있어서, 맘마글로빈 발현을
    AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(서열 번호 9),
    ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(서열 번호 10),
    Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQI-TT(서열 번호 11),
    CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(서열 번호 18),
    TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA(서열 번호 19),
    TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT(서열 번호 20), 및
    CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(서열 번호 42),
    GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT(서열 번호 43),
    TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG(서열 번호 44)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 사용하여 검출하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 프라이머/프로브 세트가
    AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(서열 번호 9),
    ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(서열 번호 10),
    Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQI-TT(서열 번호 11)인 방법.
  18. 제6항에 있어서, CK19 발현을
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 49);
    (서열 번호 51), (서열 번호 13), (서열 번호 49);
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 49);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 49);
    (서열 번호 47), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 52), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 13), (서열 번호 14); 및
    (서열 번호 52), (서열 번호 13), (서열 번호 14)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 프라이머 및 프로브를 사용하여 검출하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 프라이머 및 프로브를
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 52), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 13), (서열 번호 14); 및
    (서열 번호 52), (서열 번호 13), (서열 번호 14)로 이루어진 그룹 중에서 선택하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 프라이머 및 프로브를
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 52), (서열 번호 53), (서열 번호 14); 및
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14)로 이루어진 그룹 중에서 선택하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 프라이머 및 프로브가 (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14)인 방법.
  22. 제9항에 있어서, 프라이머 및 프로브가 (서열 번호 15), (서열 번호 16) 및 (서열 번호 17)인 방법.
  23. AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(서열 번호 9),
    ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(서열 번호 10),
    Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQI-TT(서열 번호 11),
    CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(서열 번호 18),
    TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA(서열 번호 19),
    TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT(서열 번호 20), 및
    CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(서열 번호 42),
    GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT(서열 번호 43), 및
    TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG(서열 번호 44)로 이루어진 그룹 중에서 선택한 핵산 프라이머/프로브 세트를 포함하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 프라이머/프로브 세트가
    AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(서열 번호 9),
    ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(서열 번호 10), 및
    Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQI-TT(서열 번호 11)인 조성물.
  25. (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 49);
    (서열 번호 51), (서열 번호 13), (서열 번호 49);
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 49);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 49);
    (서열 번호 47), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 52), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 13), (서열 번호 14); 및
    (서열 번호 52), (서열 번호 13), (서열 번호 14)로 이루어진 그룹 중에서 선택한 핵산 프라이머/프로브 세트를 포함하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 프라이머 및 프로브를
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 52), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 13), (서열 번호 14); 및
    (서열 번호 52), (서열 번호 13), (서열 번호 14)로 이루어진 그룹 중에서 선택한 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 프라이머 및 프로브를
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 52), (서열 번호 53), (서열 번호 14); 및
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14)로 이루어진 그룹 중에서 선택한 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 프라이머 및 프로브가 (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14)인 조성물.
  29. 핵산 프라이머/프로브 세트 (서열 번호 15), (서열 번호 16) 및 (서열 번호 17)을 포함하는 조성물.
  30. 핵산 증폭 및 검출 시약을 포함하는, 제1항에 따르는 수술중 림프절 검정 수행용 키트.
  31. 제30항에 있어서, 시약이 서열 번호 1 내지 서열 번호 8로 이루어진 그룹 중에서 선택된 마커 그룹의 존재 검출용 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 키트.
  32. 제31항에 있어서, 프라이머/프로브 세트를
    AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(서열 번호 9),
    ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(서열 번호 10),
    Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQI-TT(서열 번호 11),
    CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(서열 번호 18),
    TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA(서열 번호 19),
    TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT(서열 번호 20), 및
    CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA(서열 번호 42),
    GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT(서열 번호 43), 및
    TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG(서열 번호 44)로 이루어진 그룹 중에서 선택한 키트.
  33. 제32항에 있어서, 프라이머/프로브 세트가
    AGTTGCTGATGGTCCTCATGC(서열 번호 9),
    ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA(서열 번호 10),
    Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQI-TT(서열 번호 11)인 방법.
  34. 제30항에 있어서, 프라이머/프로브 세트를
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 49);
    (서열 번호 51), (서열 번호 13), (서열 번호 49);
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 49);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 49);
    (서열 번호 47), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 52), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 13), (서열 번호 14); 및
    (서열 번호 52), (서열 번호 13), (서열 번호 14)로 이루어진 그룹 중에서 선택한 키트.
  35. 제34항에 있어서, 프라이머 및 프로브를
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 52), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 13), (서열 번호 14); 및
    (서열 번호 52), (서열 번호 13), (서열 번호 14)로 이루어진 그룹 중에서 선택한 키트.
  36. 제35항에 있어서, 프라이머 및 프로브를
    (서열 번호 12), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 51), (서열 번호 53), (서열 번호 14);
    (서열 번호 52), (서열 번호 53), (서열 번호 14); 및
    (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14)로 이루어진 그룹 중에서 선택한 키트.
  37. 제30항에 있어서, 프라이머 및 프로브가 (서열 번호 12), (서열 번호 13), (서열 번호 14)인 키트.
  38. 제30항에 있어서, 프라이머 및 프로브가 (서열 번호 15), (서열 번호 16) 및 (서열 번호 17)인 키트.
  39. 제30항에 있어서, RT-PCR 시약을 포함하는 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20150091925A (ko) * 2014-02-04 2015-08-12 경상대학교산학협력단 맘마글로빈을 포함하는 암전이 억제용 조성물
KR20170114479A (ko) * 2016-04-05 2017-10-16 건국대학교 산학협력단 Krt19의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물

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