KR20070109247A - 비특이적인 ｐｃｒ 산물의 감소용 조성물 및 이를 이용한핵산의 증폭 방법 - Google Patents

비특이적인 ｐｃｒ 산물의 감소용 조성물 및 이를 이용한핵산의 증폭 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20070109247A
KR20070109247A KR1020060041972A KR20060041972A KR20070109247A KR 20070109247 A KR20070109247 A KR 20070109247A KR 1020060041972 A KR1020060041972 A KR 1020060041972A KR 20060041972 A KR20060041972 A KR 20060041972A KR 20070109247 A KR20070109247 A KR 20070109247A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pcr
polymerase
composition
nucleic acid
chain reaction
Prior art date
Application number
KR1020060041972A
Other languages
English (en)
Inventor
이영선
한정임
김영아
임희균
박진성
조윤경
김진태
Original Assignee
삼성전자주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성전자주식회사 filed Critical 삼성전자주식회사
Priority to KR1020060041972A priority Critical patent/KR20070109247A/ko
Publication of KR20070109247A publication Critical patent/KR20070109247A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2549/00—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity
    • C12Q2549/10—Reactions characterised by the features used to influence the efficiency or specificity the purpose being that of reducing false positive or false negative signals
    • C12Q2549/101—Hot start
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/101—Taqman
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/173—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties staining/intercalating agent, e.g. ethidium bromide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질, 중합효소 안정화 물질 및 항-중합효소 항체를 포함하는 중합효소 연쇄반응(PCR)용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 증폭 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 핵산의 비특이적　증폭 산물이 주위 환경에　상관없이　형성되지　않고,　Taq DNA 중합효소 활성이　높아져　빠른　Ct 값을　확보함으로써　정량의　정확성, 재현성과　효율을　향상시킨다.

Description

비특이적인 ＰＣＲ 산물의 감소용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 증폭 방법{A composition for reducing nonspecific PCR products and nucleic acid amplification method using the same}
도 1은 기본적인 PCR 혼합물에 포름아미드 및 글리세롤을 첨가한 경우에 PCR의 비특이적인 반응 산물의 현저한 감소를 보여주는 그래프이다.
도 2는 TMC1000에서 재현성 실험을 한 결과이다.
도 3은 비특이적인 반응물 형성에 대한 저장 기간의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 -80℃에서 저장 기간에 따른 Ct 값의 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 비특이적인 PCR 산물의 감소용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 핵산의 증폭 방법에 관한 것이다.
중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction(PCR))은 전체 유전자 중 염기서열을 알고 있는 특정한 하나의 유전자 절편을 DNA 중합효소에 의해 증폭하여 유전자를 검사하고 분리하는 분자생물학의 기본 기법이며, 당 분야에 공지되어 있 다. PCR 증폭의 각 사이클에서, 이중쇄 표적 서열은 변성되고, 프라이머는 변성된 표적의 각 쇄에 어닐링된 후, DNA 중합효소의 작용에 의해 연장된다. 증폭의 특이성은 프라이머 혼성화의 특이성에 의해 결정된다. 프라이머는 표적 핵산 서열의 각 쇄의 3' 말단에 존재하는 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적이도록 선택된다. 전형적인 PCR에서 사용되는 승온하에서, 프라이머는 오직 의도하는 표적 서열에만 혼성화된다. 그러나, 증폭 반응 혼합물은 통상적으로 프라이머 혼성화의 특이성을 보장하기 위해 요구되는 온도보다 충분히 낮은 온도인 상온에서 조합된다. 그러한 덜 스트린전트(stringent) 조건하에서, 프라이머는 부분적으로만 상보적인 핵산 서열(또는 심지어 다른 프라이머)에 비특이적으로 결합하여 원하지 않는 연장 생성물의 합성을 개시할 수 있는데, 이는 표적 서열을 따라 증폭될 수 있다. 비특이적 프라이머 연장 생성물의 증폭은 목적한 표적 서열의 증폭과 경쟁하여 목적 서열의 증폭 효율을 현저히 감소시킬 수 있다. 비특이적 증폭은 반응의 개시 전에 비표적 서열에 결합한 프라이머로부터 연장 생성물의 생성을 감소시킴으로써 줄일 수 있다.
핫 스타트(hot-start) 프로토콜이라 일컬어지는 한 방법에서는, 필요한 혼성화 특이성을 제공하기에 충분하도록 온도가 상승할 때까지 하나 또는 그 이상의 중요한 시약을 반응 혼합물에 첨가하지 않는다. 이 방법에서 반응 혼합물은 반응 조건이 특이적 프라이머 혼성화를 보장하지 않는 동안에는 프라이머 연장을 지속할 수 없다. 핫 스타트 방법은 초기 고온 인큐베이션 단계 후에 반응 튜브를 열고 제외된 시약을 첨가함으로써 수동식으로 수행할 수 있다. 그러나, 수동식 핫 스타트 방법은 노동 집약적이고 반응 혼합물이 오염될 위험성을 증가시킨다. 반응 성분들 을 분리하거나 유리시키기 위해 왁스와 같은 열에 불안정한 물질을 사용하는 핫 스타트 방법은 미국특허 제5,411,876호에 기재되어 있다. 이러한 방법들에서, 고온의 반응 전 인큐베이션은 열에 불안정한 물질을 녹여 시약이 섞이도록 한다.
반응 개시 전 비-표적 서열에 결합된 프라이머로부터 연장 생성물의 형성을 감소시키는 다른 방법은, 열-가역적인 방법으로 DNA 중합효소에 비공유적으로 결합하는 화합물을 사용하는 것이다. 미국특허 제5,338,671호는 DNA 중합효소 활성을 저해하기 위해 열안정성 DNA 중합효소에 특이적인 항체를 사용하는 것이 기재되어 있다. 이 항체는 반응 혼합물을 혼합하기 전에 상온하의 완충액 내에서 DNA 중합효소와 함께 인큐베이션하여, 항체-DNA 중합효소 복합체를 형성한다. 항체에 의한 DNA 중합효소 활성의 저해는 고온에서 반응 전 인큐베이션에 의해 불활성화된다.
핵산의 비특이적 증폭 산물의 형성을 억제하는 방법으로, 또한 수소 결합을 파괴하는 화학 물질을 사용할 수 있는데, 이는 핵산의 AT, GC의 수소 결합 등에 작용하여 DNA 이중 가닥 결합을 약하게 하고, 이차 구조를 제거하여 비특이적인 반응을 최소화한다. 그러나, 수소 결합 파괴 물질 및 중합효소 항체를 같이 사용할 경우, 수소 결합 파괴 물질은 DNA 구조를 약화시켜 비특이적 반응을 저해시키는 장점이 있지만, Taq DNA 중합효소와 항체의 활성화 부위의 결합까지도 약화시키는 단점이 있다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 핵산의 비특이적인 증폭 산물을 감소시키는 방법을 연구하던 중, 수소 결합 파괴 물질과 핫 스타트 방법인 Taq DNA 중합효소 항체를 병행하여 사용시 나타나는 문제점을 극복하는 방안 을 발명하게 되었다. 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질 및 중합효소 안정화 물질을 포함하는 PCR 혼합물 중에서 PCR을 수행하면, PCR의 비특이적 반응이 최소화되는 것을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 PCR의 특이성을 증가시켜 비특이적인 PCR 산물을 감소시키는, 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질, 중합효소 안정화 물질 및 항-중합효소 항체를 포함하는 중합효소 연쇄반응(PCR)용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)용 조성물을 포함하는 PCR 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질, 중합효소 안정화 물질 및 항-중합효소 항체를 포함하는 PCR 혼합물 중에서 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함하는 핵산의 증폭 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질, 중합효소 안정화 물질 및 항-중합효소 항체를 포함하는 중합효소 연쇄반응(PCR)용 조성물을 제공한다.
PCR 중에서도 qPCR(quantitative PCR)은 실시간 유전자를 증폭하는 방법으로 다양한 화학(chemistry)이 이용되고 있다. 특히 SYBR GreenI은 dsDNA에 특이적으로 붙는 형광염료로서, 이를 이용한 qPCR시에는 원하는 PCR 산물만을 증폭해야 하는 문제점이 있다. 만일 비특이적 반응 산물이 형성된다면, 비특이적 반응 산물에 붙은 형광도 함께 측정이 되므로, 형광 측정값인 Ct 값을 신뢰할 수 없게 된다. 그러므로 비특이적 반응 산물의 형성 억제가 중요한 문제이다.
본 발명의 조성물은 수소 결합을 파괴하는 화학 물질로부터 공격받기 쉬운 Taq DNA 중합효소와 중합효소 항체(이하, 항체로 명명함)의 결합 부위를 보호하는 동시에 DNA 구조를 약화시켜 핵산의 비특이적 증폭 반응을 최소화시킨다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 조성물은 필수적으로 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질, 중합효소 안정화 물질 및 항-중합효소 항체를 포함한다. 물론, 본 발명의 조성물은 PCR에 필요한 기본적인 성분, 예를 들면, Taq DNA 중합효소, dNTP, 프라이머, MgCl2 등을 포함할 수 있다. 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질만 포함하는 조성물은 DNA 구조를 약화시켜 비특이적 증폭 반응은 저해하지만, Taq DNA 중합효소와 항체의 활성화 부위의 결합까지도 약화시켜 비특이적 증폭 반응의 저해 효과를 감소시키는 단점이 있다. 예를 들면, Clontech 사의 Taq 스타트 항체의 경우, 포름아미드나 DMSO를 사용시 Taq DNA 중합효소와 항체의 결합 부위의 결합을 방해하여 핫 스타트(Hot start) PCR의 효과를 감소시킨다.
따라서, 이러한 단점을 극복하기 위해, 중합효소 안정화 물질도 같이 첨가함으로써, Taq DNA 중합효소와 항체의 결합 부위를 보호하거나 또는 글리세롤과 같은 중합효소 안정화 물질로 인한 점성이 높아져 포름아미드 등이 항체 결합 부위를 공격하는 속도를 늦추어 Taq 스타트 항체의 작동을 유지함으로써 비특이적 증폭 반응을 감소시키는 것이다.
본 발명의 조성물은 DNA 결합 염료를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 DNA 결합 염료는 SYBR GreenI, SYBR Gold 등과 같은 SYBR
Figure 112006032723894-PAT00001
염료, LC Green, SYPRO Orange, PicoGreen, 에티디움 브로마이드(EtBr), 4-[(3-메틸-6-(벤조티아졸-2-일)-2,3-디히드로-(벤조-1,3-티아졸)-2-메틸리덴)]-1-메틸-피리디늄 요오디드(BEBO), 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), Hoechst 33258, Hoechst 33342 등과 같은 Hoechst 염료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물에서, 상기 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질은 포름아미드, 디메틸술폭시드(DMSO), 베타인(Betaine), 테트라메틸 암모늄클로라이드(TMAC) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질 중 포름아미드의 농도는 400-600mM 인 것이 바람직하다. 상기 물질의 농도가 상기 범위를 벗어나면 비특이적인 증폭 산물의 생성 저해 효과가 감소하기 때문이다. 또한 너무 높은 농도를 사용할 경우, 효소 구조에 영향을 주어 효소 활성이 약해지거나 심한 경우 반응성을 잃게 된다.
본 발명의 조성물에서, 상기 중합효소 안정화 물질은 글리세롤, 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스, 스타키오스, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 중합효소 안정화 물질 중 글리세롤의 농도는 2.5-20 부피% 인 것이 바람직하다. 상기 중합효소 안정화 물질의 농도가 상기 범위를 벗어나면 비특이적인 증폭 산물의 생성 저해 효과가 감소하기 때문이다. 또한 너무 높은 농도를 사용할 경우, 점성이 증가하여 효소의 활동에 영향을 주어 활성을 저해하는 작용을 한다.
본 발명의 조성물에서, 상기 중합효소 연쇄반응은 핫 스타트(Hot start) PCR이다. 핫 스타트 PCR은 실온에서의 비특이적 효소 반응을 억제하고, DNA가 변성되기 시작하는 단계의 높은 온도에서 PCR을 시작하는 것으로서, 핵산의 비특이적인 증폭 산물의 형성을 막기 위해 일반적으로 수행하는 방법이다. 핫 스타트 PCR은 다양한 물리적, 화학적, 또는 생화학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 하나의 물리적인 방법에서는, 필요한 혼성화 특이성을 제공하기에 충분하도록 온도가 상승할 때까지 하나 또는 그 이상의 중요한 시약을 반응 혼합물에 첨가하지 않는다. 또 다른 방법은 중합효소의 활성화 부위에 비공유적으로 결합하여 저온에서 중합효소 활성을 막는 항체, 펩티드 또는 화학 물질을 이용하는 것이다. 고온에서 항체와 중합효소 사이의 비공유 결합은 파괴되며, 중합효소 활성은 PCR 반응의 나머지 기간 동안 회복된다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질, 중합효소 안정화 물질 및 항-중합효소 항체를 포함하는 중합효소 연쇄반응(PCR)용 조성물을 포함하는 PCR 키트를 제공한다. 상기 PCR 키트는 본 발명의 조성물 외에, 하나 이상의 부가적인 PCR 시약, 예를 들면, Taq DNA 중합효소, dNTP, 프라이머, MgCl2 등 및 프로토콜을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질, 중합효소 안정화 물질 및 항-중합효소 항체를 포함하는 PCR 혼합물 중에서 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함하는 핵산의 증폭 방법을 제공한다. 핵산 을 증폭하는 방법은 일반적으로 PCR에 의해 수행되며, PCR을 수행하는 과정에서 비특이적인 증폭 산물이 생성되는데, PCR 혼합물 중에 본 발명의 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질, 중합효소 안정화 물질 및 항-중합효소 항체를 첨가하여 PCR을 수행하면 비특이적인 증폭 산물의 형성이 현저하게 감소하게 된다. PCR을 수행하는 일반적인 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 방법에서, DNA 결합 염료를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 DNA 결합 염료는 SYBR GreenI, SYBR Gold 등과 같은 SYBR
Figure 112006032723894-PAT00002
염료, LC Green, SYPRO Orange, PicoGreen, 에티디움 브로마이드(EtBr), 4-[(3-메틸-6-(벤조티아졸-2-일)-2,3-디히드로-(벤조-1,3-티아졸)-2-메틸리덴)]-1-메틸-피리디늄 요오디드(BEBO), 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), Hoechst 33258, Hoechst 33342 등과 같은 Hoechst 염료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 상기 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질은 포름아미드, 디메틸술폭시드(DMSO), 베타인(Betaine), 테트라메틸 암모늄클로라이드(TMAC) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질 중 포름아미드의 농도는 400-600mM 인 것이 바람직하다. 상기 물질의 농도가 상기 범위를 벗어나면 비특이적인 증폭 산물의 생성 저해 효과가 감소하기 때문이다. 또한 너무 높은 농도를 사용할 경우, 효소 구조에 영향을 주어 효소 활성이 약해지거나 심한 경우 반응성을 잃게 된다.
본 발명의 방법에서, 상기 중합효소 안정화 물질은 글리세롤, 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스, 스타키오스, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 중합효소 안정화 물질 중 글리세롤의 농도는 2.5-20 부피% 인 것이 바람직하다. 상기 중합효소 안정화 물질의 농도가 상기 범위를 벗어나면 비특이적인 증폭 산물의 생성 저해 효과가 감소하기 때문이다. 또한 너무 높은 농도를 사용할 경우, 점성이 증가하여 효소의 활동에 영향을 주어 활성을 저해하는 작용을 한다.
본 발명의 방법에서, 상기 중합효소 연쇄반응은 핫 스타트(Hot start) PCR에 의해 수행될 수 있다. 핫 스타트 PCR을 수행함으로써, 핵산의 비특이적인 증폭 산물의 형성은 현저하게 감소하기 때문이다. 핫 스타트 PCR은 다양한 물리적, 화학적, 또는 생화학적 방법에 의해 수행될 수 있으며, 당업자에게 공지되어 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명의 PCR 조성물의 비특이적 증폭 산물에 대한 효과
본 발명의 PCR 조성물의 비특이적 증폭 산물에 대한 효과를 알아보았다. PCR 기기는 TMC1000(Samsung)과 LightcyclerII (Roche) 기기를 사용하여 실험하였다. TMC1000은 실리콘 기재 칩 상에서 qPCR을 하는 장비이다. 주형 DNA는 105 카피의 HBV 플라스미드 DNA (ATCC 45020D)를 이용하고, PCR 프라이머는　정방향 프라이머(5'-AGTGTGGATTCGCACTCCT-3'; 서열번호 1(Tm 54℃, GC 53%)), 역방향 프라이머(5'-GAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTG-3'; 서열번호 2(Tm 56℃, GC 52%)를 사용하였다.
기본적인 PCR 혼합물은 1× ABI 완충액(SYBR GreenI 포함), 5.0mM MgCl2, 200μM dNTP, 각각 1μM 프라이머, 0.2 ng/㎕ BSA, 10pg/㎕ tRNA, 0.1U/㎕ Taq DNA 중합효소, 0.01U/㎕ 우라실-N-글리코실라아제 및 0.14μM Taq DNA 중합효소 항체로 이루어지며, 총 부피 5㎕로 하였다. 실제 TMC1000에서 PCR에 사용된 부피는 1㎕로 사용하였다. 상기 기본적인 PCR 혼합물에 포름아미드를 500mM 첨가한 혼합물, 글리세롤을 5.0% 첨가한 혼합물 및 포름아미드 500mM 및 글리세롤 5.0% 양자를 첨가한 혼합물을 제조하였다.
PCR 조건은 91℃ 1초, 62℃ 15초를 40 사이클 동안 수행한 후, 융점 곡선(melting curve) 분석을 통해 비특이적 반응물을 확인하였고, 이 반응물을 다시 회수하여 Bioanalyzer (Agilent)를 이용하여 정량화하였다.
도 1은 기본적인 PCR 혼합물에 포름아미드 및 글리세롤을 첨가한 경우에 PCR의 비특이적인 반응 산물의 현저한 감소를 보여주는 그래프이다. 도 1의 좌측 패널은 비특이적 반응 산물의 농도를 나타내며, 우측 패널은 Ct 값을 나타내며, "1"로 표시된 것은 포름아미드 및 글리세롤이 첨가되지 않고, 항체만 사용한 기본적인 PCR 혼합물의 경우이며, "2"로 표시된 것은 기본적인 PCR 혼합물에 포름아미드만 첨가한 경우이며, "3"으로 표시된 것은 기본적인 PCR 혼합물에 글리세롤만 첨가한 경우이며, "4"로 표시된 것은 기본적인 PCR 혼합물에 포름아미드 및 글리세롤을 첨가한 경우이다. 형광 측정값인　Ct는　역치 사이클(threshold cycle)로　실시간으로　증폭되는　형광 양을　측정하여　나타나는　것으로, 같은　시료로　실험시　Ct 값이　빠를 수록　PCR의　효율이　높고, 1 사이클의　차이는　2배의　DNA 농도가　차이남을　알려주는　단위이다. 도 1에서 보여주는 바와 같이, 항체만 사용한 기본적인 PCR 혼합물의 경우에는 비특이적 반응 산물의 농도가 높으며, Ct 값이 늦다는 것을 알 수 있다. 기본적인 PCR 혼합물에 포름아미드 또는 글리세롤을 첨가한 경우에는 비특이적인 반응 산물이 기본적인 PCR 혼합물에 비해 감소되기는 하였으나, 여전히 비특이적 반응 산물이 형성되는 것을 알 수 있다. 그러나, 기본적인 PCR 혼합물에 포름아미드 및 글리세롤 양자를 첨가한 경우에는 비특이적 반응 산물도 없고, 빠른 Ct 값을 보여준다는 것을 알 수 있다.
실제 TMC1000에서 QC용으로 많이 사용하는 DNA 카피인 106 카피를 사용하여 재현성 실험을 실시하였다. 도 2는 TMC1000에서 재현성 실험을 한 결과이다. 도 2에서 (-)로 표시된 선은 포름아미드 및 글리세롤이 첨가되지 않고, 항체만 사용한 기본적인 PCR 혼합물의 경우이며, (+)로 표시된 선은 기본적인 PCR 혼합물에 포름아미드 및 글리세롤을 첨가한 경우이다. 도 2에서 보여주는 바와 같이, 포름아미드와 글리세롤을 첨가한 경우에 Bioanalyzer 결과, 비특이적 반응물의 형성도 없고, Ct 또한 21에서 17로 빨라지는 경향을 확인하였다. DNA 농도를 변경한 재현성 실험에서도 비특이적 반응물의 형성이 없고, 빠른 Ct 값을 나타내는 경향을 확인할 수 있었다.
따라서, 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질 및 중합효소 안정화 물질을 포함하는 PCR 혼합물 중에서 PCR을 수행하면 PCR의 비특이적인 반응 산물이 현저하게 감소된다는 것을 알 수 있다.
실시예 2: PCR 혼합물의 저장 효과
일반적으로 PCR의 비특이적 반응물은 주위환경, 예를 들면, 온도, 실험자, 실험 시간에 영향을 받는데, 상기 환경에 따라 비특이적 반응물의 형성이 달라지는지를 알아보았다. PCR 혼합물을 TMC1000 기기에서 평가하기 위해 전용 칩에 용액을 주입 직후(0 시간) 및 37℃에서 2시간 보관 후 PCR을 실시하였다. PCR은 항체만 사용한 기본적인 PCR 혼합물 및 기본적인 PCR 혼합물에 포름아미드 500mM 및 글리세롤 5.0% 양자를 첨가한 혼합물을 이용하여 수행하였다. 도 3은 비특이적인 반응물 형성에 대한 저장 기간의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 레인 1 내지 3은 0 시간 저장하고, 포름아미드 및 글리세롤을 첨가한 것이며, 레인 4 내지 6은 0 시간 저장하고, 기본적인 PCR 혼합물에 항체만 첨가한 것이며, 레인 7 내지 9는 37℃에서 2시간 저장하고, 포름아미드 및 글리세롤을 첨가한 것이며, 레인 10 내지 12는 37℃에서 2시간 저장하고, 기본적인 PCR 혼합물에 항체만 첨가한 것이다. 도 3에서 보여주는 바와 같이, 항체만을 가지고 있는 용액은 비특이적 반응물이 저장 기간에 상관없이 형성되었고, 본 발명의 경우인 항체에 포름아미드와 글리세롤을 첨가한 경우에는 저장 기간에 상관없이 비특이적 반응물이 형성되지 않았다. 또한 Ct 값도 재현성 있게 동일하게 유지되었다.
따라서, 본 발명의 PCR용 조성물을 이용하면 일정 기간 저장 후에 PCR을 수행하여도 비특이적인 산물은 형성되지 않는다는 것을 알 수 있다.
실시예 3: -80℃에서 장기간 저장 효과
본 발명의 PCR용 조성물인 항체에 포름아미드와 글리세롤을 첨가한 용액의 재현성을 확인하기 위해, -80℃에 상기 용액을 분주한 후 5일을 1주로 약 10주 동안 하루에 6개씩 반복하여 Ct 재현성 실험을 실시하였다. 도 4는 -80℃에서 저장 기간에 따른 Ct 값의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 4에서 보여주는 바와 같이, Ct 값은 17.11 (CV 0.44%)로 우수한 재현성을 나타내었고, Tm 또한 77.67℃(CV 0.47%)로 우수한 결과를 확인하였다.
따라서, -80℃에서 장기간 저장 후에도 본 발명의 조성물을 이용하면 비특이적인 산물은 형성되지 않는다는 것을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 핵산의 비특이적　증폭 산물이 주위 환경에　상관없이　형성되지　않고,　Taq DNA 중합효소 활성이　높아져　빠른　Ct 값을　확보함으로써　정량의　정확성, 재현성과　효율을　향상시킨다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> A composition for reducing nonspecific PCR products and nucleic acid amplification method using the same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 agtgtggatt cgcactcct 19 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gagttcttct tctaggggac ctg 23

Claims (17)

  1. 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질, 중합효소 안정화 물질 및 항-중합효소 항체를 포함하는 중합효소 연쇄반응(PCR)용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, DNA 결합 염료를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 DNA 결합 염료는 SYBR GreenI, SYBR Gold, LC Green, SYPRO Orange, PicoGreen, 에티디움 브로마이드(EtBr), 4-[(3-메틸-6-(벤조티아졸-2-일)-2,3-디히드로-(벤조-1,3-티아졸)-2-메틸리덴)]-1-메틸-피리디늄 요오디드(BEBO), 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), Hoechst 33258 및 Hoechst 33342 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질은 포름아미드, 디메틸술폭시드(DMSO), 베타인(Betaine) 및 테트라메틸 암모늄클로라이드(TMAC)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 포름아미드의 농도는 400-600mM 인 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응용 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 중합효소 안정화 물질은 글리세롤, 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스, 스타키오스, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 중합효소 안정화 물질의 농도는 2.5-20 부피% 인 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응용 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응은 핫 스타트(Hot start) PCR인 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄반응용 조성물.
  9. 제 1 항의 중합효소 연쇄반응(PCR)용 조성물을 포함하는 PCR 키트.
  10. 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질, 중합효소 안정화 물질 및 항-중합효소 항체를 포함하는 PCR 혼합물 중에서 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함하는 핵산의 증폭 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, DNA 결합 염료를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 DNA 결합 염료는 SYBR GreenI, SYBR Gold, LC Green, SYPRO Orange, PicoGreen, 에티디움 브로마이드(EtBr), 4-[(3-메틸-6-(벤조티아졸-2-일)-2,3-디히드로-(벤조-1,3-티아졸)-2-메틸리덴)]-1-메틸-피리디늄 요오디드(BEBO), 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI), Hoechst 33258 및 Hoechst 33342 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 핵산의 수소 결합을 파괴하는 물질은 포름아미드, 디메틸술폭시드(DMSO), 베타인(Betaine) 및 테트라메틸 암모늄클로라이드(TMAC)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 포름아미드의 농도는 400-600mM 인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 중합효소 안정화 물질은 글리세롤, 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스, 스타키오스, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 중합효소 안정화 물질의 농도는 2.5-20 부피% 인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응은 핫 스타트(Hot start) PCR인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020060041972A 2006-05-10 2006-05-10 비특이적인 ｐｃｒ 산물의 감소용 조성물 및 이를 이용한핵산의 증폭 방법 KR20070109247A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060041972A KR20070109247A (ko) 2006-05-10 2006-05-10 비특이적인 ｐｃｒ 산물의 감소용 조성물 및 이를 이용한핵산의 증폭 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060041972A KR20070109247A (ko) 2006-05-10 2006-05-10 비특이적인 ｐｃｒ 산물의 감소용 조성물 및 이를 이용한핵산의 증폭 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070109247A true KR20070109247A (ko) 2007-11-15

Family

ID=39063784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060041972A KR20070109247A (ko) 2006-05-10 2006-05-10 비특이적인 ｐｃｒ 산물의 감소용 조성물 및 이를 이용한핵산의 증폭 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20070109247A (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978484A (zh) * 2017-03-16 2017-07-25 北京博奥晶典生物技术有限公司 通过pcr添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法
CN111197086A (zh) * 2020-03-18 2020-05-26 上海欧易生物医学科技有限公司 一种基于三代测序的fmr1的检测引物、体系及方法
WO2024063637A1 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Jabatan Perkhidmatan Veterinar Sabah Sybr green pcr reagents, method and kit

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978484A (zh) * 2017-03-16 2017-07-25 北京博奥晶典生物技术有限公司 通过pcr添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法
CN111197086A (zh) * 2020-03-18 2020-05-26 上海欧易生物医学科技有限公司 一种基于三代测序的fmr1的检测引物、体系及方法
WO2024063637A1 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Jabatan Perkhidmatan Veterinar Sabah Sybr green pcr reagents, method and kit

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10472659B2 (en) Isothermal nucleic acid amplification
ES2718482T3 (es) Kit para amplificación de recombinasa polimerasa
US9523121B2 (en) Methods and compositions for PCR using blocked and universal primers
US9034603B2 (en) Dried composition for hot-start PCR with long-term stability
US20180010105A1 (en) Novel reverse transcriptases for use in high temperature nucleic acid synthesis
CN101076608B (zh) 在pcr扩增中提高再现性和降低引物错导的试剂和方法
EP1866434B1 (en) Isothermal nucleic acid amplification
CN103172700B (zh) 经由镁螯合的pcr热启动
JP2009284896A (ja) 核酸増幅方法
CN101691593B (zh) 在经修饰的随机寡核苷酸的存在下的核酸扩增
HUE032212T2 (en) Polymer chain reaction detection system using oligonucleotides containing phosphorothioate group
KR20120097793A (ko) 블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핫스타트 ｐｃｒ용 조성물
US9353311B2 (en) Composite visible colorant and method for quantitative amplification
KR20120018734A (ko) 헤파티티스 ｂ 바이러스 검출용 키트 및 이를 이용한 헤파티티스 ｂ 바이러스의 검출 방법
KR20070109247A (ko) 비특이적인 ｐｃｒ 산물의 감소용 조성물 및 이를 이용한핵산의 증폭 방법
WO2021183941A1 (en) Looped primer and loop-de-loop method for detecting target nucleic acid
CN106068329B (zh) 一种通过实时聚合酶链反应检测突变基因的方法
US10619198B2 (en) PCR primer linked to complementary nucleotide sequence or complementary nucleotide sequence including mis-matched nucleotides and method for amplifying nucleic acid using the same
CN106868111A (zh) 利用通用TaqMan探针检测SNP的方法和试剂盒
JP2928992B2 (ja) Ｄｎａ及び／又はｒｎａを特異的に増幅し検出する方法
JP7306722B2 (ja) プライマー及びその使用
JP6300452B2 (ja) インターカレーティング色素及び界面活性剤を含むｄｎａ合成用組成物
US20240218438A1 (en) Improvements in or relating to digestion of reaction products
US20080131891A1 (en) Biochemical Reagents And Their Uses
WO2023039553A2 (en) Looped primer with various internal modifications and loop-de-loop method for target detection

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application