CN111197086A - 一种基于三代测序的fmr1的检测引物、体系及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法，包括使用自主设计的引物进行扩增，加入扩增增强剂，选用特定的扩增条件等等。本发明降低了FMR1扩增的难度，可同时检测基因型，三代测序检测全长，CGG重复的检出更精确。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法。
背景技术
脆性X综合征(FXS)发生的分子机制为FMR1基因DNA层面CGG重复。该重复会引起FMR1表达缺乏，该基因编码RNA结合蛋白脆性X蛋白(FMRP)，是负责智力迟滞的相关蛋白。该蛋白的缺乏会导致最常见的遗传性智力低下疾病-脆性X综合征。按正常人群中女性FMR1前突变携带率为1/130-1/256推算，中国目前有五百万至一千万女性潜在携带者。携带者有50％的几率将FMR1突变基因遗传给子女，子女存在着FMR1全突变而罹患脆性X综合征的风险。其风险率与母亲FMR1前突变CGG重复次数有关。重复次数越多其风险越高，按CGG的重复次数对个体进行分类，正常(5-54CGG重复)、前突变(55-200重复)或完全突变(>200重复)，患病风险将从40％逐渐增加到100％。其中FMR1完全突变的男孩100％患病，女孩30％-40％患病。现在患者中发现的最多重复CGG序列>230异常甲基化，导致FMR1基因转录沉默。其发病率仅次于先天愚型(21三体-唐氏综合征)。患儿表现为重度智力残疾，同时还伴有行为发育异常或容易患孤独症。
值得关注的是自发现脆性X综合征近50年来，现代医学一直无法进行有效而准确的产前筛查，导致大量的脆性X综合征患儿降生。给社会及数量众多的患儿家庭带来了无法逆转的痛苦和沉重的负担。目前的医学水平对此疾病尚无有效的治疗方法，产前诊断和选择性流产是唯一的预防手段。脆性X-FMR1基因现有的检测技术为Amplide X检测技术。该方法无法检测基因型。传统的检测FMR1基因突变的方法有Southern杂交法和普通PCR法。Southern杂交法费时、费力、DNA需要量大、灵敏度低(5-10％)，无法确定CGG重复数；普通PCR方法成本低，但高GC的片段干扰了了FMR1的扩增。因为大量的CGG重复用二代测序拼接有困难，因此只能用三代或一代进行测序来进行检测。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明人在进行了大量的深入研究之后，提供了一种基于三代测序的FMR1的检测引物、体系及方法。本发明提供的方法包括FMR1的引物设计，PCR扩增与三代测序结果分析。本发明通过设计高特异性的扩增引物，增加多种扩增增强剂，摸索扩增条件，调整扩增体系，采用三代的分析流程分析FMR1的CGG重复次数。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种基于三代测序的FMR1的检测引物，包括：
上游引物FMR1-F3：5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3'，
下游引物FMR1-R3：5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3'。
本发明还提供了一种基于三代测序的FMR1的检测体系，包括上述引物。
优选地，上述检测体系还包括PCR扩增增强剂；更优选地，所述PCR扩增增强剂包括甘油及DMSO。
优选地，所述PCR扩增增强剂中，甘油的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，更优选5％，DMSO的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，更优选2.5％。
本发明还提供了一种基于三代测序的FMR1的检测方法，包括如下具体步骤：
(1)根据人FMR1的DNA序列，跨CGG重复区设计PCR引物；
(2)使用步骤(1)中的引物，加入DNA模板、dNTP、PCR扩增增强剂，配制PCR反应mix，扩增FMR1的CGG高重复区；
(3)使用步骤(2)得到的PCR扩增产物，毛细管电泳质检条带大小；
(4)使用步骤(2)中的PCR扩增产物，加Barcoded，进行三代建库及测序；
(5)使用步骤(4)产出的数据，分析出CGG的重复次数。
优选地，步骤(1)中，所述引物包括：
上游引物FMR1-F3：5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3'，
下游引物FMR1-R3：5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3'。
优选地，步骤(2)中，所述PCR扩增增强剂包括甘油及DMSO。
更优选地，所述PCR扩增增强剂中，甘油的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，DMSO的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，更优选2.5％。
优选地，步骤(2)中，在预冷的冰板上配制PCR反应mix，即，所述冰板的温度为0-10℃；更优选地，为0℃。
优选地，步骤(2)中，10μL PCR反应体系中，所述DNA模板的加入量为10ng-50ng；更优选地，为20ng。
优选地，步骤(2)中，扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变性10sec，56-68℃退火30sec，68℃延伸1min50sec，32个循环；68℃延伸5min；4℃保存。
更优选地，步骤(2)中，64℃退火30sec。
本发明以上FMR1扩增步骤中，步骤(1)和(2)对于本发明获得高质量的实验结果是至关重要的。本发明中由于FMR1中高GC区域难以扩增，因此优选采用64℃退火，加入扩增增强剂(包含2.5％DMSO与5％甘油)。且FMR1基因多为杂合子，扩增产物多为CGG重复少的小片段，因此采用提高模板量降低循环数的方式。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：一步PCR即可获取到FMR1的产物。操作简单方便，耗时短。三代测序直接检测扩增产物全长，可检测样本是否为杂合。
附图说明
图1：FMR1扩增(不加增强剂)毛细管电泳质检带型图(模板量：10ng，循环数：35cycle)。
图2：FMR1扩增(不加增强剂)毛细管电泳质检峰图(模板量：10ng，循环数：35cycle)。
图3：FMR1扩增(加增强剂)毛细管电泳质检带型图(1、不加增强剂，2、2.5％DMSO，3、5％甘油，4、2.5％DMSO+5％甘油)(模板量：10ng，循环数：35cycle)。
图4：FMR1扩增(加增强剂)毛细管电泳质检带型图(2.5％DMSO+5％甘油，模板量：20ng，循环数：32cycle)。
图5：FMR1扩增(加增强剂)毛细管电泳质检峰图(2.5％DMSO+5％甘油，模板量：20ng，循环数：32cycle)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
在一个具体的实施方式中，本发明所述方法的具体步骤为：
(1)引物设计：在NCBI网站上(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)下载人FMR1的DNA序列，跨CGG重复区设计PCR引物，引物序列见表1。
表1.本发明设计的FMR1扩增引物序列表
| 引物名 | 序列 |
| FMR1-F3 | 5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3' |
| FMR1-R3 | 5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3' |
(2)PCR体系配制(10μL)：使用步骤(1)中的引物，在预冷的冰板上配制PCR反应mix，加入20ngDNA模板，加入dNTP，加入PCR扩增增强剂(2.5％DMSO与5％甘油)，扩增FMR1的CGG高重复区，扩增体系见表2。
表2.本发明FMR1扩增反应体系
| 试剂 | 用量 |
| 2*FXB | 5μl |
| 2mMdNTPs | 2μl |
| FMR1-F3 | 0.3μl |
| FMR1-R3 | 0.3μl |
| DNA模板(10ng) | 1μl |
| KOD | 0.2μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 0.45μl |
| 5％甘油 | 0.5μl |
| 2.5％DMSO | 0.25μl |
| 总计 | 10μl |
以下各实施例中，2*FX B、2mMdNTPs、KOD采用TOYOBO(货号KFX-101)，ddH2O采用Invitrogen(货号10977015)，5％甘油采用Invitrogen(货号15514029)，2.5％DMSO采用Sigma(货号D8418)。
(3)PCR扩增条件：98℃，3min，(98℃，10sec，64℃，30sec，68℃，1min50sec，32cycle)，68℃，5min，4℃，forever。以下各实施例中，PCR仪器均采用life SimpliAmp热循环仪。
(4)毛细管电泳质检：使用步骤(3)得到的PCR扩增产物，毛细管电泳质检条带大小。以下各实施例中，质检仪器均采用Agilent 2100。
(5)三代测序建库：使用步骤(3)中得到的PCR扩增产物，加Barcoded，建库及测序。
(6)数据分析：使用步骤(5)产出的数据，分析出CGG的重复次数。该步骤中，可以使用现有的分析方法，也可以根据实际需求自行设计相应的方法流程，在此不做具体限定。
同样，可以理解的是，以上对仪器、试剂的说明仅为示例性说明，本申请并不限于此。如未特殊说明，均可采用现有技术手段实现。
实施例1
本实施例一种基于三代测序的FMR1的检测方法(不加增强剂)的步骤如下：
(1)引物设计：在NCBI网站上(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)下载人FMR1的DNA序列，跨CGG重复区设计PCR引物，引物序列见表1。
(2)PCR体系配制(10μL)：然后使用步骤(1)中的引物，在预冷的冰板上配制PCR反应mix，加入10ngDNA模板，加入dNTP，扩增FMR1的CGG高重复区，扩增体系(不加增强剂)见表3。
表3.本发明实施例1的扩增反应体系
| 试剂 | 用量 |
| 2*FXB | 5μl |
| 2mMdNTPs | 2μl |
| FMR1-F3 | 0.3μl |
| FMR1-R3 | 0.3μl |
| DNA模板(10ng) | 1μl |
| KOD | 0.2μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 1.2μl |
| 总计 | 10μl |
(3)PCR扩增条件：98℃，3min，(98℃，10sec，64℃，30sec，68℃，1min50sec，35cycle)，68℃，5min，4℃，forever。
(4)毛细管电泳质检：使用步骤(3)得到的PCR产物，毛细管电泳质检条带大小(图1与图2)。
结果及分析：
毛细管电泳质检PCR产物发现1168bp与1507bp的两个条带，这表明该样品为FMR1遗传病杂合，病人为女性，重复次数为113+n(n为1168bp中CGG的重复次数)，CGG高重复的片段1507bp比例过少，这是应该是由PCR扩增的偏好性导致的。
实施例2
本实施例一种基于三代测序的FMR1的检测方法(1、不加增强剂，2、2.5％DMSO，3、5％甘油，4、2.5％DMSO+5％甘油)的步骤如下：
(1)引物设计：在NCBI网站上(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)下载人FMR1的DNA序列，跨CGG重复区设计PCR引物，引物序列见表1。
(2)PCR体系配制(10μL)：使用步骤(1)中的引物，在预冷的冰板上配制PCR反应mix，加入10ngDNA模板，加入dNTP，加入增强剂，扩增FMR1的CGG高重复区，扩增体系(体系1、不加增强剂，体系2、2.5％DMSO，体系3、5％甘油，体系4、2.5％DMSO+5％甘油)见表4。
表4.本发明实施例2的扩增反应体系
(3)PCR扩增条件：98℃，3min，(98℃，10sec，64℃，30sec，68℃，1min50sec，35cycle)，68℃，5min，4℃，forever。
(4)毛细管电泳质检：使用步骤(3)得到的PCR扩增产物，毛细管电泳质检条带大小(图3)。
结果及分析：
毛细管电泳质检PCR产物发现增强剂5％甘油与2.5％DMSO+5％甘油能够较大的提升杂合子中FMR1大片段的产量，然而我们发现有一些非特异的扩增，且大片段的量仍然较少。
实施例3
本实施例一种基于三代测序的FMR1的检测方法(2.5％DMSO+5％甘油，20ng，32cycle)的步骤如下：
(1)引物设计：在NCBI网站上(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)下载人FMR1的DNA序列，跨CGG重复区设计PCR引物，引物序列见表1。
(2)PCR体系配制(10μL)：使用步骤(1)中的引物，在预冷的冰板上配制PCR反应mix，加入20ngDNA模板，加入dNTP，加入增强剂扩增FMR1的CGG高重复区，扩增体系见表5。
表5.本发明实施例3的扩增反应体系
| 试剂 | 用量 |
| 2*FXB | 5μl |
| 2mMdNTPs | 2μl |
| FMR1-F3 | 0.3μl |
| FMR1-R3 | 0.3μl |
| DNA模板(20ng) | 1μl |
| KOD | 0.2μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 0.45μl |
| 5％甘油 | 0.5μl |
| 2.5％DMSO | 0.25μl |
| 总计 | 10μl |
(3)PCR扩增条件：98℃，3min，(98℃，10sec，64℃，30sec，68℃，1min50sec，32cycle)，68℃，5min，4℃，forever。
(4)毛细管电泳质检：使用步骤(3)得到的PCR产物，毛细管电泳质检条带大小(图4与图5)。
结果及分析：
毛细管电泳质检PCR产物发现1181bp与1535bp两个条带，且无非特异性扩增。大片段的占比能够达到三代测序的要求。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种基于三代测序的FMR1的检测引物，包括：
上游引物FMR1-F3：5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3'，
下游引物FMR1-R3：5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3'。
2.一种基于三代测序的FMR1的检测体系，其特征在于，包括权利要求1所述的一种基于三代测序的FMR1的检测引物。
3.根据权利要求2所述的一种基于三代测序的FMR1的检测体系，其特征在于，还包括PCR扩增增强剂；优选地，所述PCR扩增增强剂包括甘油及DMSO。
4.根据权利要求3所述的一种基于三代测序的FMR1的检测体系，其特征在于，所述PCR扩增增强剂中，甘油的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，DMSO的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％。
5.一种基于三代测序的FMR1的检测方法，包括如下具体步骤：
(1)根据人FMR1的DNA序列，跨CGG重复区设计PCR引物；
(2)使用步骤(1)中的引物，加入DNA模板、dNTP、PCR扩增增强剂，配制PCR反应mix，扩增FMR1的CGG高重复区；
(3)使用步骤(2)得到的PCR扩增产物，毛细管电泳质检条带大小；
(4)使用步骤(2)中得到的PCR扩增产物，加Barcoded，进行三代建库及测序；
(5)使用步骤(4)产出的数据，分析出CGG的重复次数。
6.根据权利要求5所述的一种基于三代测序的FMR1的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物包括：
上游引物FMR1-F3：5'-gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcacCCGCGGAATCCCAGAGAGGCC-3'，
下游引物FMR1-R3：5'-tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtagGTCACTTAGCGCCGATTTCGGCC-3'。
7.根据权利要求5所述的一种基于三代测序的FMR1的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增增强剂包括甘油及DMSO，优选地，所述PCR扩增增强剂中，甘油的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％，DMSO的加入量为PCR扩增反应体系总体积的2.5％-5％。
8.根据权利要求5所述的一种基于三代测序的FMR1的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，在预冷的冰板上配制PCR反应mix，所述冰板的温度为0-10℃。
9.根据权利要求5所述的一种基于三代测序的FMR1的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，10μL PCR反应体系中，所述DNA模板的加入量为10ng-50ng。
10.根据权利要求5所述的一种基于三代测序的FMR1的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变性10sec，56-68℃退火30sec，68℃延伸1min50sec，32个循环；68℃延伸5min；4℃保存。
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