KR20120097793A - 블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핫스타트 ｐｃｒ용 조성물 - Google Patents

블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핫스타트 ｐｃｒ용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핫스타트 PCR용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 PCR용 조성물에 3' 말단의 수산기가 블로킹되고 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물은 프라이머의 멜팅 온도 이하에서 블로킹 올리고뉴클레오티드가 해리되어 버리므로 낮은 온도에서의 프라이머-다이머 형성이나 비특이적인 반응에 의한 PCR 증폭 산물의 끌림 현상 등을 억제시켜 보다 정확한 PCR 결과물을 얻을 수 있다다.

Description

블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핫스타트 ＰＣＲ용 조성물{Composition for Hot-start PCR Comprising Blocking Oligonucleotide}
본 발명은 블로킹 올리고뉴클레오티드(Blocking Oligonucleotide, 이하 "블로킹 올리고"라 칭하는 경우가 있음)를 포함하는 핫스타트 PCR용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 통상의 PCR 조성물에 3' 말단이 블로킹되고 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 소정 농도의 블로킹 올리고뉴클레오티드를 추가로 함유하는 핫스타트 PCR용 조성물에 관한 것이다.
PCR 반응에 있어서 특이성(specificity)은 표적 유전자 서열에 결합하는 프라이머의 높은 스트린전시(stringency)에 의해 결정된다. 그러나, PCR 수행시 유전자 증폭을 위해 필요한 모든 성분들은 유전자의 초기 변성 전에 실온에서 혼합되므로, 이 조건에서 낮은 스트린전시의 프라이밍(priming)이 발생하게 된다. 낮은 온도에서도 중합효소의 활성이 유지되므로 프라이밍이 발생할 경우 이에 따른 증폭산물이 생성되기 때문에, 이러한 낮은 스트린전시의 프라이밍은 표적 DNA 서열의 복잡성, 낮은 반응 온도 등과 더불어 비특이적인 증폭을 증가시키는 주요한 요인이 되며, 비특이적 증폭은 반복되는 PCR에 있어서 프라이머 및 제한된 농도의 다른 필요 성분들을 소비해 버리기 때문에 결과적으로 경쟁적인 저해제로서 작용하게 된다. 비특이적 증폭은 특히 낮은 사본수(copy number)의 표적 DNA 검출, 낮은 농도의 DNA 시료의 증폭 및 여러 가지 프라이머를 동시에 사용하는 멀티플렉스(multiplux) PCR을 수행하는데 있어서 커다란 문제점으로 지적되고 있다.
일반적인 PCR에서 나타나는 이러한 문제점을 해결하기 위한 노력의 결과로 "핫스타트 PCR"이 개발되었다. 핫스타트 PCR은 보다 정확한 PCR 산물을 수득하기 위한 방법의 하나로서, 높은 온도 조건에서 반응물들을 혼합함으로써 실온에서 발생하는 낮은 스트린전시의 프라이밍 및 그로 인한 비특이적인 프라이머의 올리고머화를 방지하여 PCR의 특이성을 증가시키는 효과적인 방법이다.
핫스타트 PCR을 실시하는 가장 단순한 방법은 뜨거운 반응 튜브를 열고 결여된 성분들을 첨가하는 것이지만, 이 방법은 반응 혼합물을 오염에 노출시키고, 에어로졸을 형성하며, 증발을 일으키는 등의 단점을 가지고 있다. 다른 핫스타트 PCR 방법으로는 필수성분, 예를 들면 프라이머와 주형 사이에 물리적 차단막을 생성하는 방법이 있다. 이러한 차단막 중에서 전기물리적 차단막으로는 통상적으로 파라핀 왁스가 사용되어 왔다. 즉, 파라핀 왁스를 반응 혼합물 위에 덮고, 왁스가 굳으면 그 위에 시약(출발시약)을 가한 다음, 미네랄 오일을 가하고 유전자 증폭장치의 온도를 70℃ 내지 90℃로 상승시키면, 왁스가 용해되면서 반응 혼합물과 출발시약 간의 혼합이 이루어져 PCR 반응이 진행된다. 이와 같이, 높은 온도에서만 왁스 용해와 필수성분들의 혼합이 정확하게 일어나기 때문에, 높은 스트린전시의 프라이밍만이 잘 일어나고, 여러 가지 유전자 시료의 증폭을 동시에 수행할 수 있으며, 왁스와 오일층으로 인해 오랜 기간 반응 혼합물의 저장이 용이하다는 등의 장점이 있다. 그러나, 상기 방법은 다루기가 번거롭고 시간이 오래 걸린다는 문제점이 있다(비특허문헌 1).
또한, 증발 차단막으로 사용되는 미네랄 오일이 PCR 시료를 오염시켜 비-DNA-함유 밴드로 나타나게 되어 정량적인 PCR 데이터 해석을 어렵게 하기 때문에, 파라핀 비드(bead)만을 핫스타트 PCR에 이용하는 개선책이 대두되었다. 파라핀 비드는 55℃ 이하에서 고체층을 형성하므로, 실온에서는 프라이머와 주형 DNA의 혼합이 이루어지지 않고, 반응온도가 파라핀의 융점 이상이 되었을 때에만 프라이머와 주형 DNA의 혼합이 이루어지므로 PCR 반응의 특이성을 증가시킬 수 있다. 또한, 파라핀은 미세원심분리 튜브의 바닥에 존재하여 시료의 수거가 쉽고 가격이 저렴하기 때문에, 파라핀 비드의 사용은 핫스타트 PCR을 개선시키기 위한 방법으로 선호되어 왔다(비특허문헌 2).
다른 핫스타트 PCR 방법으로는 파라핀 왁스 대신 앰플리그리즈(AmpliGrease)와 같은 석유 젤리를 사용하는 방법이 있다. 이 방법도 왁스와 오일을 사용하는 방법과 유사한 방법으로서, 반응 혼합물을 하부 혼합물(bottom mix)과 상부 혼합물(top mix)의 두 층으로 분리하고, 그 사이에 석유 젤리를 첨가하여 두 혼합물이 실온에서 혼합되는 것을 방지하는 것인데, 석유 젤리는 왁스보다 낮은 온도 조건(융점 약 50℃)에서 녹기 시작하여 용액을 형성하고, 냉각에 의해 다시 굳어지지 않는다는 점이 종래의 왁스를 사용하는 방법과 다른 점이다(비특허문헌 3). 그러나, 이 방법은 시료의 양이 많을 경우 상부와 하부 혼합물 사이의 밀도 차이로 인해 혼합이 제대로 일어나지 않아 반응효율이 저하되기 때문에, 적은 부피의 시료에만 적용될 수 있다는 한계점을 갖고 있다.
이외에도, 트레할로스(trehalose) 용액으로 건조시킨 반응 혼합물을 왁스로 코팅하여 제조한 반응 비드를 이용하거나(비특허문헌 4), PCR 촉진제로 사용되는 여러 유기용매(PEG, DMSO, Glycerol 등)를 적정 농도로 첨가함으로써 핫스타트 PCR의 효율을 높이는 방법들이 제시되어 있다(비특허문헌 5).
현재 가장 널리 이용되는 핫스타트 방법에는 DNA 중합효소에 대한 항체를 이용하여 DNA 중합효소의 활성을 조절하여 핫스타트 PCR 반응을 유도하는 방법이 있다. 즉, 낮은 온도(20℃ 내지 40℃)에서는 항-DNA 중합효소 항체가 DNA 중합효소와 결합하여 DNA 중합효소의 기능을 불활성화시키고, 높은 온도(70℃ 내지 80℃)에서는 항-DNA 중합효소 항체가 파괴되어 활성화된 DNA 중합효소가 중합 반응에 참가함으로써, 프라이머-다이머 또는 비특이적 산물의 생성이 감소하여 PCR의 수율이나 민감성을 증가시킬 수 있다(비특허문헌 6). 상기 프라이머 다이머 및 비특이적인 반응 등은 대체로 PCR 반응물을 혼합할 때부터 DNA 변성 단계까지 지속적으로 일어나며, 또한 PCR 반응 중 DNA 변성 단계에서 프라이머 어닐링 단계, 프라이머 어닐링 단계에서 DNA 중합효소 활성 단계까지 전반적으로 발생될 수 있다.
또한, 인간 혈소판 동종항원 타이핑(human platelet alloantigen typing)에 새로운 DNA 중합효소(AmpliTaqGold, Perkin-Elmer, USA)를 적용한 예가 있는데, 이 중합효소는 열에 의해서만 활성화가 되므로 핫스타트 PCR이 가능하며, 실제로 비특이적 증폭을 방지할 수 있는 것으로 보고되어 있다(비특허문헌 7).
또한, 피로포스페이트와 피로포스파타제를 이용하여 낮은 온도에서 Mg2 +의 반응을 억제함으로써 핫스타트 PCR 반응을 유도하는 방법이 있다. 피로포스파타제와 피로포스페이트의 핫스타트 PCR 작용 기작을 살펴보면, PCR 반응 동안 피로포스페이트는 반응 성분 중 Mg2 + 이온을 차단시키는데, 이 Mg2+ 이온은 DNA 중합효소가 활성을 나타낼 때 요구되는 성분으로서, 결국 DNA 중합효소의 활성은 점차 떨어지게 된다. 이때, 피로포스페이트와 Mg2 + 이온은 높은 친화력을 갖고 있으므로, 피로포스페이트를 PCR 혼합물에 첨가시킬 경우, PCR 반응의 수행을 위하여 요구되는 Mg2 + 이온은 피로포스페이트에 의해 포집되고, PCR 반응은 중단되어 더 이상 DNA 중합효소에 의한 반응이 진행되어지지 않게 되며, 결과적으로 낮은 스트린전시의 프라이밍이 발생하더라도 이로 인한 비특이적 증폭 산물이 생성되지 않게 된다. 첨가된 피로포스페이트에 의한 반응 억제는 PCR 혼합물에 일정량의 피로포스파타제를 첨가함으로써 해결될 수 있는데, 이 효소는 피로포스페이트와 Mg2 + 간의 결합을 서서히 해리시키는 역할을 한다. 이때, 피로포스파타제는 피로포스페이트와 Mg2 + 간의 결합을 제거하여 유리 Mg2+ 이온을 생성해 냄으로써, 피로포스페이트에 의해 억제되었던 PCR 반응이 다시 진행될 수 있다. 피로포스파타제는 특정 온도(70℃ 이상)에서도 열에 안정하기 때문에, 피로포스파타제와 DNA 중합효소는 동일한 온도 조건하에서 효소활성을 나타냄으로써, 피로포스파타제에 의해 유리되어 떨어져 나온 Mg2 + 이온은 DNA 중합효소에 의해 적절하게 PCR 반응에 이용되어 비특이적 증폭 산물의 생성을 억제하며 간편하게 원하는 산물만을 증폭해 낼 수 있다(특허문헌 1).
또한, DNA 중합효소에 결합하는 DNA 압타머를 이용하는 방법이 개발되었다(특허문헌 2). 작용 기작을 살펴보면, DNA 압타머를 DNA 중합효소의 기질로 사용하여 DNA 중합효소와 결합하게 된다. 결합한 DNA 중합효소는 중합 반응을 중지하여 DNA 압타머가 변성되기 전의 온도에서는 중합 반응이 일어나지 않는다. 반응 온도가 올라가게 되면 DNA 압타머는 변성되고, 이에 따라 DNA 중합효소는 활성화되어 중합 반응을 시작하게 된다. 그러나, 상기 방법은 즉각적으로 PCR 반응을 진행할 수 있는 장점이 있으나, 압타머의 길이가 길어서 비특이적인 반응을 일으킬 수 있다.
아울러, 특정 온도 이하에서 DNA 중합효소에 결합함으로써 DNA 중합효소의 활성을 방지하는 역할을 수행하는, 부분적으로 이중결합을 형성하는 핵산 서열로 이루어지는 DNA 중합효소 억제제를 이용한 PCR 방법에 관해서도 알려져 있다(특허문헌 3).
전술한 바와 같이, 핫스타트 PCR에 대한 많은 연구가 수행되어 왔고, 그 필요성을 인식하고 있음에도 불구하고, 경제성이나 사용상의 여러 가지 제한적 요인으로 인해 다양하게 실험에 응용되지 않고 있으며, 또한 DNA 중합효소, 항체 및 피로포스파타제 등은 모두 단백질이므로 안정성과 수급면에서 많은 비용과 시간을 필요로 한다는 문제점이 있었다. 또한, 상기와 같은 종래 방법들은 프라이머-다이머의 형성 등을 통해 프라이머가 연장되는 것을 방지하는 데에는 근본적인 한계가 있기 때문에, 이러한 프라이머의 연장으로 인해 비특이적인 증폭산물이 생성되는 것을 방지하는데도 다소 미흡한 측면이 있었다.
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DAquila et al., Nucleic Acids Res., 19:3749, 1991 Wainwright, L.A. et al., Biotechniques, 14:34-36, 1993 Horton, R.M. et al., Biotechniques, 16;42-43, 1994 Kaijalainen, S. et al., Nucleic Acids Res., 21:2959-2960, 1993 Pomp, D. et al., Biotechniques, 10:58-59, 1991 Sharkey D.J. et al., Bio/Technology, 12:506-509, 1994 Chen, D.F. et al., Vox Sang 72:192-196, 1997
본 발명은 상기와 같은 종래기술상의 문제점을 개선하기 위해 도출된 것으로서, 통상의 PCR용 조성물에 3' 말단이 블로킹되고 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 소정 농도의 블로킹 올리고뉴클레오티드를 추가로 첨가함으로써 낮은 온도에서의 프라이머-다이머 형성이나 비특이적인 반응에 의한 PCR 증폭 산물의 끌림 현상(Smeared band) 등을 억제시켜 보다 정확한 PCR 결과물을 얻을 수 있는 핫스타트 PCR용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핫스타트 PCR용 조성물을 제공한다.
본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물은 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 PCR용 조성물에 3' 말단의 수산기가 블로킹되고 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 PCR용 조성물은 필요에 따라 프라이머, 프로브, 주형 핵산, 형광염료, 역전사효소 등을 추가로 포함해도 된다. 본 발명에 있어서, 상기 "주형 핵산"은 DNA, RNA, DNA와 RNA의 하이브리드(hybrid) 등을 제한없이 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머보다 염기서열의 수가 작은 것을 특징으로 한다. 이와 같이 블로킹 올리고뉴클레오티드의 염기서열이 프라이머의 염기서열보다 작을 경우 프라이머-주형 표적 DNA 결합의 멜팅 온도(melting temperature)와 비교하여 프라이머(또는 주형 핵산)-블로킹 올리고뉴클레오티드 결합의 멜팅 온도가 더 낮게 된다. 따라서, 낮은 온도에서는 프라이머와 블로킹 올리고뉴클레오티드와가 이중나선으로 결합하고 있지만, 다소 낮은 변성 온도를 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드는 프라이머의 어닐링 온도 이전에 해리하게 되어 더 이상 이중나선을 형성하지 못하게 되므로 PCR 반응에 전혀 영향을 주지 않게 되므로, 핫스타트 PCR에 유용하게 사용될 수 있다. 이와 같은 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 방법은 프로브에도 동일한 방식으로 적용될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티디는 프라이머보다 1℃ 이상, 바람직하게는 2℃ 이상 낮은 멜팅 온도를 갖는 것이 바람직하며, 적어도 25℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상의 멜팅 온도를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 3' 말단의 수산기가 상기 수산기 이외의 치환기로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다. DNA 중합 반응은 3' 말단의 수산기와 5' 말단의 포스페이트기가 결합되는 방식으로 진행되므로, 이와 같이 3' 말단의 수산기가 이와는 다른 치환기로 치환되면 더 이상의 DNA 중합 반응이 진행하지 않게 된다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 치환기로는 각각 화학식 1 내지 화학식 6으로 표시되는 C3-Space, C6-space, C12-space, C18-Space, 아민, 포스페이트와, DIG(Digosigenin), 티올 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
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또한, 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 첫 번째 염기는 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하는 프라이머의 3' 말단의 첫 번째 염기와 상보적인 결합을 형성하거나, 상기 프라이머의 3' 말단의 두 번째 이후의 염기와 상보적인 결합을 형성함으로써, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 하나 이상의 염기가 비결합된(unpaired) 상태로 남아 있지 않도록 하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 염기는 모두 상기 프라이머의 3' 말단의 염기와 상보적인 결합을 형성하고 있는 것이 바람직하다. 만일, 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 하나 이상의 염기가 비결합된 상태로 남아 있게 되면, 프라이머의 3' 말단으로부터 시작하여 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 첫 번째 염기까지 DNA 중합 반응이 일어나게 되어, 결과적으로 프라이머의 길이가 추가로 더 늘어날 수 있게 된다. 반응액 내에 이와 같이 길이가 늘어난 프라이머가 존재할 경우에는 종래 문제가 되고 있는 프라이머-다이머 형성에 의한 비특이적인 증폭 결과물이 더욱 많아질 수 있기 때문에 바람직하지 않다.
또한, 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 이와 상보적인 서열을 갖는 프라이머쌍에 대하여 전방(forward) 프라이머, 후방(reverse) 프라이머 중 어느 하나에 특이적으로 결합하거나, 상기 전방 및 후방 프라이머 모두에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 반응용 완충용액은 10 mM TrisHCl, 40 mM KCl, pH 9.0을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 4종의 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP를 나타낸다. DNA 중합효소는 공지된 임의의 DNA 중합효소를 제한없이 사용할 수 있으며, 이 중에서도 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소 및 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소를 단독으로 사용하거나, 또는 상기 DNA 중합효소들을 조합하여 사용할 수 있다. 상기 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소의 예로는 Taq DNA 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소의 예로는 Pfu DNA 중합효소 또는 TLA DNA 중합효소, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소의 예로는 Top DNA 중합효소를 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. DNA 중합효소는 PCR 조성물에 0.1 내지 10 U(unit), 바람직하게는 0.5 내지 2 U, 가장 바람직하게는 1 U의 농도로 포함시켜 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물은 실험상의 편의, PCR 반응 산물에 의한 오염방지, DNA 중합효소와 dNTP의 안정화 및 반응성의 향상을 위하여 핵산에 대해 비반응성인 염료 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 비반응성 염료 물질은 PCR 반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어야 하며, 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 크실렌 시아놀(xylene cyanole), 브로모크레졸 레드(bromocresol red), 크레졸 레드(cresol red) 등의 수용성 염료를 들 수 있다. 상기 비반응성 염료 물질은 전체 조성물에 대해 0.0001 내지 0.01 중량%의 함량으로 포함될 수 있으며, 0.001 내지 0.005 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하고, 0.001 내지 0.003 중량%의 함량으로 포함되는 것이 보다 바람직하다. 만일, 상기 비반응성 염료 물질이 0.0001 중량% 미만의 함량으로 첨가되는 경우에는 PCR 반응후의 분석을 위한 아가로스젤 전기영동시 염료의 농도가 낮아 시료의 이동을 육안으로 관측하기 어렵다는 문제점이 있고, 비반응성 염료 물질이 0.01 중량% 초과의 함량으로 첨가되는 경우에는 PCR 반응시 고농도의 수용성 염료가 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 아가로오스 겔로의 침강이 이루어진 후 전기영동시 시료의 이동을 방해할 수 있다는 문제점이 있다.
또한, 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물은 필요에 따라 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소를 포함할 수도 있다. 이와 같이, 역전사효소를 포함하는 역전사 PCR의 경우에는, 증폭되는 RNA의 센스 프라이머에 대한 블로킹 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물에 첨가하는 것이 바람직하다.
DNA 중합효소는 5' 말단이 단일선으로 되어 있는 부분적인 이중나선 구조의 3' 말단 부분에 결합하여 중합 반응을 일으키는 효소이다. 본 발명에서는 이러한 DMA 중합효소의 특성을 고려하여 블로킹 올리고를 설계하였다. 본 발명에서는 블로킹올리고의 5' 말단이 프라이머의 3' 말단에 상보적으로 결합하도록 설계함으로써, 프라이머가 더 이상 비특이적으로 반응하는 것과, 프라이머가 다른 핵산에 혼성화되어 염기가 늘어나는 것을 방지하게 된다. 또한, 블로킹 올리고의 3' 말단은 프라이머의 5' 말단보다 길이를 작게 하여 DNA 중합효소가 잘 부착되도록 하는 것과 동시에, 블로킹 올리고가 신장되는 것을 방지하기 위하여 3' 수산기를 다른 치환기로 블로킹하였다. 그리하여 블로킹 올리고뉴클레오티드를 반응물에 첨가해 주는 것만으로도 DNA 중합효소가 프라이머와 블로킹 올리고와의 이중나선에 부착되어 더 이상 비특이적인 반응을 수행할 수 없게 됨으로서 상온에서 프라이머의 확장 반응을 저지할 수 있게 된다.
또한, 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물에 사용되는 블로킹 올리고뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브와 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 프라이머/프로브보다 짧은 길이를 갖고 있어 낮은 온도에서는 프라이머/프로브와 이중나선을 이루고 있어서 DNA 중합효소가 기질로서 인식하여 결합을 하게 되지만, 3' 말단이 블로킹되어 있기 때문에 DNA 중합은 일어나지 않게 된다. 그러므로, 통상의 PCR 반응에서 문제가 될 수 있는 프라이머의 비특이적인 중합을 억제함으로써 비특이적인 PCR 생성물이 생기는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물을 이용하면, 종래 사용되는 것과 같은 항체를 이용하거나, 화학적 수식을 이용하거나, 피로포스페이트을 이용한 핫스타트 PCR 방법과는 달리, 프라이머와 표적 주형 DNA 이중나선의 멜팅 온도 이하에서 바로 중합효소가 떨어져 나가서 활성화가 되므로 활성화시키기 위한 인큐베이션시간을 소모하지 않고 바로 PCR 반응을 시킬 수 있다는 장점이 있다.
상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 작용 기작을 살펴보면, PCR 반응에 있어서 정방향, 역방향 프리이머는 필수 요소로 작용한다. 블로킹 올리고뉴클레오티드는 정방향, 역방향 프리이머보다 1개 내지 그보다 적은 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드이므로 프라이머에 대한 특이성이 높다. 따라서, 정방향/역방향 프라이머와 블로킹 올리고뉴클레오티드를 혼합하게 되면 블로킹 올리고뉴클레오티드는 상기 정방향/역방향 프라이머와 결합하여 정방향/역방향 프라이머가 작용하지 못하도록 함으로써 프라이머 다이머 형성 및 비특이적인 반응에 참여할 수 없도록 사전에 방지할 수 있다. 적정 온도, 즉 블로킹 올리고머의 멜팅 온도에 도달하면 프라이머와 블로킹 올리고뉴클레오티드의 결합이 끊어져서 표적으로 하는 주형 핵산에 프라이머가 결합하도록 함으로써 정확하고도 효과적으로 PCR 반응이 이루어지도록 할 수 있다. 즉, 블로킹 뉴클레오티드는 프라이머/프로브보다 상대적으로 짧은 길이로 제작되기 때문에, 프라이머가 주형 핵산에 결합하는 적정 온도에 도달하면 블로킹 뉴클레오티드는 프라이머/프로브로부터 해리되기 때문에 프라이머가 주형에 결합할 때 영향을 미치지 않게 된다(도 1 참조).
본 발명의 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용하는 핫스타트 PCR 방법은 다음과 같은 경우에 유용하게 적용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Ⅰ. 모노플렉스 PCR 반응에 있어서 비특이적인 반응에 의한 PCR 증폭 산물의 끌림 현상이 있을 때.
Ⅱ. PCR 반응에서 비특이적인 반응에 의해 다중 증폭 산물이 발생될 때.
Ⅲ. 프라이머 다이머에 의해 PCR 반응 효율이 저하될 때.
Ⅳ. 증폭률이 낮은 특정 표적에 대한 PCR 반응 효율을 높이고자 할 때.
Ⅴ. 하나 이상의 증폭 산물(Multiplex PCR)을 확인하고자 할 때.
Ⅵ. 검역 및 질병 진단 등의 분야에서 특정 표적에 대한 PCR 반응 효율을 높이고 싶을 때.
Ⅶ. 특이성을 요하는 실시간 PCR 반응을 수행할 때.
Ⅷ. 특이적으로 Tm 값이 다른 프라이머를 사용할 때.
Ⅸ. One-Step RT-PCR 반응에서 비특이적인 증폭 산물이 발생될 때.
또한, 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물은 종래에 보고된 여러 가지 PCR 조성물과 비교하여 다음과 같은 이점들이 있다.
1) 일반적인 PCR 방법에 따라 반응을 진행시킬 수 있으므로, 고온에서의 장시간의 전처리가 요구되지 않는다.
2) 종래 PCR용 조성물보다 경제적이다.
3) 낮은 스트린전시의 프라이밍에 의한 증폭산물의 생성을 방지하므로, 다양한 시료를 동시에 사용하는 멀티플렉스 PCR 반응에도 적용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 핫스타트 PCR용 조성물을 이용한 핫스타트 PCR 방법을 제공한다.
상기 핫스타트 PCR 방법은 통상의 핫스타트 PCR용 조성물에 전술한 바와 같은 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 후 핫스타트 PCR 반응을 수행하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물은 통상의 PCR 이외에도 멀티플렉스 PCR, 실시간 PCR, 실시간 정량 PCR, 실시간 RT(real time)/PCR, 실시간 정량 RT/PCR과 같은 임의의 핵산 증폭 방법이 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "멀티플렉스 PCR"은 하나의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 혼합물에서 하나 이상의 다중 DNA 표적을 동시에 증폭하는 것을 의미한다.
일반적으로 2개 이상의 표적 서열을 동시에 증폭하는 멀티플렉스 PCR 조건을 설계하는 것은 상당히 어려운데, 그 이유는 상기 2개 이상의 표적 부위 모두에 대해 비특이적 부산물 없이 증폭될 수 있도록 최적의 PCR 반응을 디자인하는 것이 요구되기 때문이다. 이때, 완벽한 주형 DNA-프라이머 매치가 일어나도록 하기 위해서는 충분히 높은 온도에서 어닐링이 이뤄지도록 할 필요가 있고, 또한 두 쌍 이상의 프라이머 상호간에 어닐링이 되지 않도록 디자인하는 것이 필요하다. 또한, 멀티플렉스 PCR의 경우는 핫스타트 기능이 없을 시 비특이적인 반응 및 프라이머 다이머에 의해 PCR 효율이 떨어지며, 비특이적 증폭 산물에 의해 정확한 결과를 얻기가 어려워 핫스타트 방법을 많이 응용되고 있으나 그것도 어느 정도 한계가 있다. 본 발명의 핫스타트 PCR 방법은 각 표적별 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드가 첨가하여 증폭의 특이성을 개선시킴으로써 멀티플렉스 DNA 증폭의 최적화에 이상적이다.
본 발명의 한 구현예에서, 표적 뉴클레오티드 서열 각각으로부터 증폭된 산물들은 추후 분석을 위해 크기가 다르게 디자인이 되었으며, 이에 따라 멀티플렉스 표적 뉴클레오티드 서열의 증폭 산물은 크기 분별을 통해 용이하게 분석될 수 있다. 크기 분별 비교는 공지된 다양한 방법, 즉 폴리아크릴아미드 겔 매트릭스 또는 아가로스 겔 매트릭스를 통한 전기연동을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써, 종래 멀티플렉스 PCR 방법의 비-특이성 문제뿐만 아니라 백그라운드 문제를 제거할 수 있다.
또한, 멀티플렉스 PCR의 이점은 수많은 질병을 동일한 반응에서 동시에 분석할 수 있다는데 있다. 이론적으로 동시에 분석할 있는 분석물의 수는 제한이 없으나, 실제로는 약 20개 정도가 상한이며, 이는 분석을 위해 요구되는 크기 차이 및 증폭된 산물을 분석할 수 있는 방법 등에 의존하기 때문이다. 본 발명의 방법은 유전적 및 전염성 질병의 진단, 성 결정, 유전적 연관 분석 및 범죄 과학 연구 등에 적용될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 핫스타트 PCR용 조성물은 항체를 이용하거나, 화학적 수식을 이용하거나, 피로포스페이트를 이용하는 종래 핫스타트 PCR 방법과 달리 프라이머의 멜팅 온도 이하에서 블로킹 올리고뉴클레오티드가 해리되어 버리므로 낮은 온도에서의 프라이머-다이머 형성이나 비특이적인 반응에 의한 PCR 증폭 산물의 끌림 현상 등을 억제시켜 보다 정확한 PCR 결과물을 얻을 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 비특이적인 반응 억제 효과를 보여주는 도식도이다.
도 2는 블로킹 올리고뉴클레오티드의 길이에 따른 비특이적인 반응 억제 효과를 확인한 것으로서, A 및 H는 양성대조군으로 핫스타트 기능이 있는 제품을 사용하여 핫스타트 기능에 의한 비특이적인 반응 억제를 확인한 것이고, B는 음성대조군으로 핫스타트 기능이 없는 제품에 의한 비특이적인 반응 결과를 확인한 것이며, C 내지 G 및 I 내지 M은 각각 18℃, 26℃, 34℃, 37.4℃, 40.9℃, 46.1℃, 48.6℃, 50.5℃, 51.9℃ 및 53.9℃의 Tm 온도를 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 경우를 나타낸 것이고, 레인 1 내지 레인 3은 각기 다른 3가지 표적 염기를 증폭한 결과를 나타낸 것이며, 레인 M은 DNA 사이즈를 구별할 수 있는 100 bp DNA Ladder를 나타낸 것이다.
도 3은 블로킹 올리고뉴클레오티드에 대한 사용 농도에 따른 비특이적인 반응 억제 효과를 확인한 것으로서, A는 음성대조군으로 핫스타트 기능이 없는 제품을 이용한 결과이고, B는 양성대조군으로 핫스타트 기능이 있는 제품을 이용한 결과이며, C 내지 H는 5 pmole, 10 pmole, 15 pmole, 20 pmole, 25 pmole 및 30 pmole의 인스턴트 올리고뉴클레오티드를 첨가한 경우를 나타낸 것이고, 레인 1 내지 레인 3은 도 2에 사용된 3가지 표적 염기를 증폭한 결과를 나타낸 것이며, 레인 M은 DNA 사이즈를 구별할 수 있는 100 bp DNA Ladder를 나타낸 것이다.
도 4는 정방향 또는 역방향 프라이머 중 어느 하나 이상을 블로킹하는 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 비특이적 반응 억제 효과를 확인한 것으로서, A는 음성대조군으로 핫스타트 기능이 없는 제품을 이용한 결과이고, B는 양성대조군으로 핫스타트 기능이 있는 제품을 이용한 결과이며, C 및 D는 정방향 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 결과이고, E 및 F는 역방향 프라이머의 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 결과이며, G는 정방향, 역방향 프라이머와 각각 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 결과이고, 레인 1 내지 레인 3은 도 2에 사용된 3가지 표적 염기를 증폭한 결과이며, 레인 M은 DNA 사이즈를 구별할 수 있는 100 bp DNA Ladder를 나타낸 것이다.
도 5는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 제작할 때 사용되는 여러 변형 종류에 따른 비특이적 반응 억제 효과를 확인한 것으로서, A는 양성대조군으로 핫스타트 기능이 있는 제품을 사용한 결과이고, B 내지 G는 아민, 포스페이트, C3-space, C6-space, C12-space, C18-space로 변형시킨 경우를 나타내는 것이며, 레인 1 내지 레인 3은 도 2에 사용된 3가지 표적 염기를 증폭한 결과를 나타낸 것이고, 레인 M은 DNA 사이즈를 구별할 수 있는 100 bp DNA Ladder를 나타낸 것이다.
도 6은 비특이적 반응을 유도하는 가혹 조건인 37℃에서 1시간 반응시킨 경우(A)와 반응시키지 않은 경우(B)에 있어서 핫스타트 기능이 없는 제품에 블로킹 올리고뉴클레오티드 유무에 따른 비특이적 반응 억제 효과를 나타낸 것으로서, 레인 1 내지 레인 3은 각기 다른 3가지 표적 염기를 증폭한 결과를 나타낸 것이고, 레인 M은 DNA 사이즈를 구별할 수 있는 100 bp DNA Ladder를 나타낸 것이다.
도 7은 블로킹 올리고뉴클레오티드 첨가에 따른 멀티플렉스 PCR 반응 결과를 확인한 것으로서, 핫스타트 기능이 있는 제품에 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가함으로써 PCR 반응 억제 유무를 확인한 것과 핫스타트 기능이 없는 제품에 블로킹 올리고뉴클레오티드 첨가함으로써 멀티플렉스 PCR 반응이 이루어진 경우를 나타낸 것이며, 레인 1과 레인 2는 각각 블로킹 올리고뉴클레오티드가 첨가되지 않은 경우와 첨가된 경우를 나타낸다.
도 8은 One-Step RT/PCR 반응에서 블로킹 올리고뉴클레오티드 첨가에 따른 비특이적인 반응 억제 효과를 나타낸 것으로서, 레인 1은 핫스타트 기능이 있는 RT/PCR 제품을 사용한 결과이고, 레인 2는 핫스타트 기능이 없는 RT/PCR 제품을 사용한 결과이며, 레인 3은 핫스타트 기능이 없는 제품에 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 결과이고, 레인 M은 DNA 사이즈를 구별할 수 있는 100 bp DNA Ladder를 나타낸 것이다.
도 9의 A는 실시간 PCR 반응에서 블로킹 올리고뉴클레오티드 첨가에 따른 프라이머 다이머 및 비특이적인 반응 억제 효과를 나타낸 것으로서, Taq DNA 중합효소가 포함된 PCR Premix 용액에 형광물질(Sybrgreen I)과 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 경우(실험군) 및 Taq DNA 중합효소가 포함된 PCR 프리믹스 용액에 형광물질만을 첨가한 경우(대조군)에 있어서, 실시간 PCR 반응을 통한 형광측정 곡선 결과를 보여주는 그래프이며, 가로축은 PCR 반응 주기를 나타낸 것이고 세로축은 반응 주기에 따른 측정 형광값을 나타낸 것이며, 선 Ⅰ은 대조군에 대한 형광검출 곡선 결과를 나타낸 것이고, 선 Ⅱ는 실험군에 대한 형광검출 곡선 결과를 나타낸 것이다. 도 9의 B는 형광측정 곡선을 이용하여 멜팅 커브를 작성한 결과를 보여주는 그래프로서, 가로축은 온도 변화를 나타낸 것이고 세로축은 온도 증가에 따른 측정 형광값을 나타낸 것이며, 선 Ⅰ은 대조군의 멜팅 커브 작성 결과를 나타낸 것이고, 선 Ⅱ는 실험군에 대한 멜팅 커브 작성 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 블로킹 올리고뉴클레오티드의 Tm 값에 따른 비특이적 증폭 산물 형성 억제 효과
PCR 반응의 필요 요소인 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드의 길이에 따른 비특이적인 증폭 산물의 억제 효과를 확인하기 위하여, 다양한 길이의 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 후 PCR 반응 산물을 비교하였다. 이를 위하여, 표 1과 같이 프라이머를 디자인하여 합성하였으며, PCR 프리믹스(PreMix)((주)바이오니아, 대한민국)에 인간 게놈 DNA (10 ng), 각 프라이머(10 pmole), 표적 프라이머보다 2℃ 내지 15℃ 낮은 Tm 값을 갖는 다양한 길이를 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드(각각 10 pmole)를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 20초, 55℃에서 40초, 72℃에서 60초의 과정을 1회로 하여 총 30회를 수행하였고, 예비 변성과 최종 신장은 각각 94℃에서 5분, 72℃에서 5분씩 수행하였다. PCR 반응에서 수득된 생성물을 아가로오스 겔에 DNA 분자량 마커와 함께 전기영동시킨 후, 에티듐브로마이드로 염색하였고, 폴라로이드 카메라로 PCR 반응에 의해 증폭된 DNA 밴드를 촬영하였다. 양성대조군으로 핫스타트 기능이 있는 핫스타트 PCR 프리믹스(AccuPower Hotstart PCR Premix), (주)바이오니아)를, 음성대조군으로 핫스타트 기능이 없는 PCR 프리믹스(AccuPower PCR Premix PCR)를 사용하였으며, PCR 프리믹스에 각 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서, 레인 1, 2 및 3은 각각 표 1의 P55/P63(447 bp), P55/P73(1,082 bp) 및 P55/P83(1,29 6bp)의 염기서열은 갖는 프라이머쌍을 사용한 결과이다. 또한, A는 양성대조군으로 핫스타트 기능을 갖는 핫스타트 PCR 프리믹스를 사용한 결과이고, B는 음성대조군으로 핫스타트 기능이 없는 PCR 프리믹스를 사용한 결과이며, C, D, E, F, G, I, J, K, L 및 M은 상기 음성대조군에 각각 길이가 짧은 순서로(즉, 서열번호 5 내지 서열번호 14의 순서로) 순차적으로 인스턴트 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 PCR 반응을 수행한 결과이다. 레인 M은 DNA 사이즈를 구별할 수 있는 100 bp DNA Ladder((주)바이오니아)를 나타낸 것이다.
영역 크기 Tm 값 서열 서열번호
P55 23mer 55℃ CTC TTC CTA CAG TAC TCC CCT GC 1
P63 24mer 63.3℃ GGC CAC TGA CAA CCA CCC TTA ACC 2
P73 23mer 60.3℃ CAA GTG GCT CCT GAC CTG GAG TC 3
P83 25mer 60.1℃ GTC CTG CTT GCT TAC CTC GCT TAG T 4
P55
블로킹 올리고
3' 아민 변형		 5mer 18℃ GCA GG 5
7mer 26℃ GCA GGG G 6
10mer 34℃ GCA GGG GAG T 7
15mer 37.4℃ GCA GGG GAG TAC TGT 8
17mer 40.9℃ GCA GGG GAG TAC TGT AG 9
18mer 46.1℃ GCA GGG GAG TAC TGT AGG 10
19mer 48.6℃ GCA GGG GAG TAC TGT AGG A 11
20mer 50.5℃ GCA GGG GAG TAC TGT AGG AA 12
21mer 51.9℃ GCA GGG GAG TAC TGT AGG AAG 13
22mer 53.9℃ GCA GGG GAG TAC TGT AGG AAG A 14
그 결과, PCR 반응 수행시 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드가 첨가되면, DNA 중합효소의 활성을 차단시키고, 유전자 증폭을 위하여 필요한 성분들이 실온에서 혼합되어 발생하는 낮은 스트린전시의 프라이밍과 이로 인한 비특이적 증폭 산물의 생성을 감소시키는데 효과적임을 확인하였다(도 2).
실시예 2. 블로킹 올리고뉴클레오티드의 농도에 따른 비특이적 증폭 산물 형성 억제 효과
블로킹 올리고뉴클레오티드의 적정 사용 농도를 확인하기 위하여, 실시예 1의 주형 특이적 프라이머와, 서열번호 12로 기재되는 20mer 길이의 P55 블로킹 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 상기 주형 특이적 프라이머를 20 pmole 농도로 사용하고, 블로킹 올리고뉴클레오티드를 5 pmole 내지 30 pmole의 농도로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방식으로 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 레인 1, 2 및 3은 각각 표 1의 P55/P63(447 bp), P55/P73(1,082 bp) 및 P55/P83(1,29 6bp)의 염기서열은 갖는 프라이머쌍을 사용한 결과이다. 또한, A는 음성대조군으로 핫스타트 기능이 없는 PCR 프리믹스를 사용한 결과이고, B는 양성대조군으로 핫스타트 기능을 갖는 핫스타트 PCR 프리믹스를 사용한 결과이며, C, D, E 및 F는 상기 음성대조군에 상기 블로킹 올리규뉴클레오티드를 낮은 농도에서 높은 농도 순으로 첨가하여 PCR 반응을 수행한 결과이다.
그 결과, PCR 반응 수행에 있어서, 음성대조군과 같이 핫스타트 기능이 없는 PCR 반응을 수행할 때에는 비특이적인 반응 및 그에 따른 PCR 증폭 산물의 끌림 현상(Smeared band)이 나타나는 반면, 양성대조군과 같이 핫스타트 기능이 있는 PCR 반응을 수행할 때에는 좀 더 정확하고 깨끗한 PCR 증폭 산물이 생성됨을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 음성대조군에 다양한 농도의 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가할 경우에도 핫스타트 PCR 반응과 동일한 효과를 얻을 수 있으며, 주형 DNA 표적 프라이머와 동일하거나 낮은 농도로 사용할 때 중합효소의 활성을 차단시키고 프라이머 다이머 및 비특이적 반응 효과를 억제하는데 효과적임을 확인하였다(도 3).
실시예 3. 정방향 및/또는 역방향 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 비특이적 증폭 산물 형성 억제 효과
PCR 반응은 원칙적으로 정방향 및 역방향 프라이머 중 어느 하나 이상의 프라이머가 없으면 일어날 수 없다. 따라서, 표적 프라이머의 정방향 또는 역방향 프라이머 중 어느 하나 이상을 블로킹하는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 후 비특이적 반응에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위하여, 음성대조군으로 핫스타트 기능이 없는 PCR 반응과(A), 양성대조군으로 핫스타트 기능이 있는 PCR 반응(B), 상기 음성대조군에 정방향 블로킹 올리고뉴클레오티드 첨가한 것(C 및 D), 역방향 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 것(E 및 F), 또는 정방향과 역방향 블로킹 올리고뉴클레오티드 모두를 첨가한 것)G)에 대하여 실시예 2와 동일한 방식으로 PCR 반응을 수행하였다. 이때, 프라이머와 블로킹 올리고뉴클레오티드는 10 pmole의 농도로 동일하게 사용하였다.
그 결과, 핫스타트 기능이 없는 음성대조군에서는 비특이적인 증폭 산물이 확인된 반면(A), 핫스타트 기능이 있는 양성대조군에서는 비특이적 증폭 산물을 확인할 수 없었다(B). 또한, 정방향(C 및 D) 또는 역방향(E 및 F) 중 하나의 인스턴트 블로킹 뉴클레오티드를 첨가하거나, 양쪽 모두의 인스턴트 블로킹 뉴클레오티드(G)를 첨가한 경우에도 비특이적 증폭 반응을 억제하여, 상기 비특이적인 증폭 산물로 인해 생성되는 DNA 밴드 끌림 현상이 발생되지 않는다는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 4. 여러 종류의 변형 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 비특이적 반응 억제 효과
블로킹 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 여러 종류의 치환기를 적용한 후 블로킹 올리고뉴클레오티드의 핫스타트 효과를 확인하였다. 사용된 치환기는 하기 표 2에 나타내었으며, PCR 반응은 실시예 2와 동일한 방식에 따라 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서, 레인 1, 2 및 3은 각각 표 1의 P55/P63(447 bp), P55/P73(1,082 bp) 및 P55/P83(1,29 6bp)의 염기서열은 갖는 프라이머쌍을 사용한 결과이다. 또한, A는 양성대조군으로 핫스타트 기능을 갖는 핫스타트 PCR 프리믹스를 사용한 결과이고, B, C, D, E, F 및 G는 음성대조군으로 핫스타트 기능이 없는 PCR 프리믹스에 표 2의 순서 대로 각 인스턴트 블로킹올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응을 수행한 결과이다. 레인 M은 DNA 사이즈를 구별할 수 있는 100 bp DNA Ladder를 나타낸 것이다.
번호 변형의 종류 구조식
1 3' 아민
Figure pat00007
2 3' 포스페이트
Figure pat00008
3 3' C3-Space
Figure pat00009
4 3' C6-Space
Figure pat00010
5 3' C12-Space
Figure pat00011
6 3' C18-Space
Figure pat00012
그 결과, 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드의 3' 쪽에 DNA 중합효소를 블로킹시킬 수 있는 어떤 종류의 화학물질이 오더라도 비특이적인 증폭 반응을 억제할 수 있음을 확인하였다(도 5).
실시예 5. 비특이적 반응을 일으킬 수 있는 가혹 조건에서 블로킹 올리고뉴클레오티드의 비특이적 반응 억제 효과
블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 핫스타트 PCR 반응의 결과(Ⅱ)와 대조군으로 상기 블로킹 올리고뉴클레오티드가 포함되지 않은 일반적인 PCR 반응의 결과(Ⅰ)를 비교하였다. 이를 위하여, 실시예 2에서 제조한 블로킹 올리고뉴클레오티드 포함된 핫스타트 PCR 반응 혼합물에 대하여, 일부는 실시예 2와 동일한 조건으로 PCR 반응을 수행하였고, 일부는 PCR 반응을 수행하기 전에 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 실시예 2와 동일한 조건으로 PCR 반응을 수행하였다. 사용된 주형 특이적 올리고뉴클레오티드의 염기서열쌍은 표 3과 같다.
이름 프라이머 서열 서열번호
ABCA3(463) 전방 프라이머 GCC CAT CTT ACA TCC TCT CTC 15
후방 프라이머 CCA GCA CCT AAT CAC AGT CAG 16
F-블로킹 올리고 GAG AGA GGA TGT AAG 17
ABCB1(413) 전방 프라이머 TTC AGA ATG GCA GAG TCA AGG 18
후방 프라이머 TTA GCA AGG CAG TCA GTT ACA G 19
F-블로킹 올리고 CCT TGA CTC TGC CAT 20
SLC29A2(357) 전방 프라이머 TTC ATC ATC ATC AGG AGC AGA G 21
후방 프라이머 TCC TTC CAA GAG CCT CAA TTA G 22
F-블로킹 올리고 CTC TGC TCC TGA TGA T 23
그 결과, 인스턴트 핫스타트 PCR 반응 혼합물을 사용한 PCR 반응에서는 대조군과 비교하여 비특이적 PCR 증폭 산물이 없는 깨끗한 증폭 산물이 생성되었다(도 6의 A). 또한, 대조군과 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 인스턴트 핫스타트 PCR 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 PCR 반응을 수행한 결과, 대조군은 37℃에서 1시간 동안 반응시키는 것과 무관하게 비특이적 증폭 산물이 확인되었으나, 블로킹 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 반응에서는 가혹 온도 조건(37℃, 1시간 반응)과 무관하게 증폭 효율이 감소함은 물론, 비특이적인 증폭 산물로 인해 생성되는 DNA 밴드의 끌림 현상도 발생하지 않았다(도 6의 B). 상기 결과로부터, 블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 인스턴트 핫스타트 PCR 반응을 수행할 경우, 정상적인 온도 조건에서는 물론, 비특이적 증폭 산물이 빈번히 생성되는 가혹한 조건하에서도 효과적으로 비특이적인 증폭 산물의 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 핫스타트 PCR 방법을 멀티플렉스 PCR 에 응용
본 발명의 핫스타트용 조성물을 멀티플렉스 PCR에 적용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 6가지 표적 염기서열에 대한 6가지 프라이머쌍과, 상기 프라이머들에 대한 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 후, 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 과정에 미치는 영향을 분석하였다. 본 실시예에서 사용된 프라이머 및 블로킹 올리고뉴클레오티드의 염기서열은 표 4에 나타내었다. 핫스타트 기능이 없는 PCR 프리믹스에 블로킹 올리고뉴클레오티드를 넣은 인스턴트 핫스타트 PCR 반응을 수행하였으며, 대조군으로는 핫스타트 PCR 프리믹스를 사용하였다. 주형으로는 휴먼 게놈 DNA 100 ng 과 10 ng을 사용하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서, 레인 1은 블로킹 올리고뉴클레오티드를 넣지 않고 수행한 결과를 나타낸 것이고, 레인 2는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 주형 표적 프라이머와 동일한 농도인 10 pmole을 넣고 PCR 반응을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
이름 프라이머 서열 서열번호
ABCA3(463) 전방 프라이머 GCC CAT CTT ACA TCC TCT CTC 24
후방 프라이머 CCA GCA CCT AAT CAC AGT CAG 25
F-블로킹 올리고 GAG AGA GGA TGT AAG 26
SLC29A2(357) 전방 프라이머 TTC ATC ATC ATC AGG AGC AGA G 27
후방 프라이머 TCC TTC CAA GAG CCT CAA TTA G 28
F-블로킹 올리고 CTC TGC TCC TGA TGA T 29
ABCC10(288) 전방 프라이머 CCC ATA GGC TCA ACA CGA TCC 30
후방 프라이머 TGG GGA AGT GTG GAG AGG TAG 31
F-블로킹 올리고 GAT CGT GTT GAG CCT AT 32
ABCG1(258) 전방 프라이머 GAC CGA CGA CAC AGA GAC TC 33
후방 프라이머 CTA AGG AGC GAC TGG ACT GAG 34
F-블로킹 올리고 GAG TCT CTG TGT CG 35
ABCC5(205) 전방 프라이머 GGA CAG GTG GTG GAG TTT GAC 36
후방 프라이머 AAA GGC AAG GTT TCG GTA GGA G 37
F-블로킹 올리고 GTC AAA CTC CAC CAC 38
ATP7B(161) 전방 프라이머 TCT GAC CTT CAC CTT GGA TGG 39
후방 프라이머 GGA CAC AAT TAC TGA CGG ACA G 40
F-블로킹 올리고 CCA TCC AAG GTG AAG 41
그 결과, 핫스타트 PCR 프리믹스의 PCR 반응에서는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가하더라도 PCR 반응이 저해되지 않음을 확인하였다. 또한, 핫스타트 기능이 없는 PCR 프리믹스의 경우 일부 표적 염기서열이 증폭되지 않거나 미약하게 증폭되는 것과 대조적으로, 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 경우에는 모든 표적 염기서열이 증폭되고 또는 백그라운드 문제도 제거함으로써 멀티플렉스 PCR 반응을 실현할 수 있음을 확인하였다(도 7).
실시예 7. One - step RT / PCR 반응에서 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 비특이적 반응 억제 효과
One-step RT/PCR 반응에서 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 비특이적 반응 억제 효과를 확인하였다. 이를 위하여, 주형 RNA로는 인간의 총 RNA 100 ng을 사용하였고, 표적 유전자는 GM-CSF(Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor)를 사용하였다. 표적 프라이머와 블로킹 올리고뉴클레오티드는 표 5에 나타낸 것을 사용하였다. 대조군으로는 핫스타트 기능이 있는 AccuPower Hotstast RT/PCR 프리믹스((주) 바이오니아)와 핫스타트 기능이 없는 AccuPower RT/PCR 프리믹스((주) 바이오니아)를 사용하였으며, 상기 핫스타트 기능이 없는 AccuPower RT/PCR 프리믹스에 정방향 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가한 후 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서, 레인 M은 DNA 사이즈 마커이고, 레인 1은 AccuPower Hotstart RT/PCR 프리믹스를 사용한 결과이며, 레인 2는 AccuPower RT/PCR 프리믹스를 사용한 결과이고, 레인 3은 AccuPower RT/PCR 프리믹스 제품에 인스턴트 올리고뉴클레오티드를 첨가한 결과를 나타낸 것이다.
이름 프라이머 길이 Tm(℃) 서열 서열번호
CM-CSF 502 전방 프라이머 20mer 55 TGT TCG TGC ACA TTT CGT GA 42
후방 프라이머 20mer 54 GCT TCT GAT AGG TCC TGG GC 43
F-블로킹 올리고 17mer 40.8 GCT TCT GAT AGG TCC TG 44
CM-CSF 501 전방 프라이머 20mer 54 GCC CAG GAC CTA TCA GAA GC 45
후방 프라이머 20mer 54 ACA CCC TCT GGG TCT CAG GT 46
F-블로킹 올리고 17mer 48.7 TCA CGA AAT GTG CAC GA 47
그 결과, 핫스타트 기능이 없는 AccuPower RT/PCR 프리믹스에 블로킹 올리고뉴클레오티드를 첨가해 줌으로써 핫스타트 기능과 유사하게 비특이적인 반응이 억제된다는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 8. 실시간 PCR 반응에서 블로킹 올리고뉴클레오티드에 의한 프라이머 다이머 억제 효과
실시간 PCR 검출법에서 블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PCR 조성물에 의한 핫스타트 효과를 확인하기 위하여, 2x PCR Premix 용액(10 mM TrisHCl pH 9.0, 50 mM KCl, 2.0 mM MgCl2, 각각 250 μM의 4종류의 dNTP, 1U Taq. DNA 중합효소, 0.01% Tween 20 및 안정화제를 포함)에 20 ㎕ 반응당 0.3X가 되도록 형광물질(Greenstar™, 바이오니아사)을 첨가하고, 정방향 프라이머와 동일한 농도인 20 pmole의 블로킹 올리고뉴클레오티드가 첨가되어 있는 조성물을 제조하였다. 대조군으로는 상기 2x PCR Premix 용액에 20 ㎕ 반응당 0.25x가 되도록 상기 형광물질을 첨가하였다. 상기 형광물질은 주형 DNA 증폭시 생성하는 이중가닥의 DNA 사이에 끼어들어(intercalation) 발생하는 형광량을 측정함으로써 특이적 염기서열의 형광 프로브 없이도 간편하게 분석할 수 있는 형광물질이다. 주형 DNA로는 인간 세포에서 추출한 총 RNA를 AccuPower CycleScript RT PreMix((주) 바이오니아)에 100 ng이 되도록 첨가하여 42℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 95℃에서 5분 동안 역전사효소를 불활성화시킨 cDNA 5 ㎕를 사용하였고, 표 6에 기재되는 프라이머 및 블로킹 올리고뉴클레오티드를 20 ㎕ 반응당 각각 20 pmole의 농도로 사용하였다.
이름 프라이머 길이 Tm(℃) 서열 서열번호
GM501 qPCR 전방 프라이머 20mer 55.2 GAC GTC CGC ATC TTG AAT TG 48
후방 프라이머 20mer 55.2 TTC CCA CGA TTA GGA GCA CA 49
F-블로킹 올리고 17mer 45.8 CAA TTC AAG ATG CGG AC 50
실시간 PCR 반응은 Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block((주) 바이오니아)을 이용하여 수행하였고, 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 사전 변성 단계를 진행한 후, 95℃에서 10초 동안의 변성 단계, 60℃에서 15초 동안의 어닐링 단계 및 신장 단계의 동시 반응을 1 반응 주기로 하여 총 45회 반응 주기를 진행하였다. 이후, 분리 단계(dissociation step)를 진행하여 증폭 산물에 대한 멜팅 커브를 작성함으로써 PCR 증폭 산물에 대한 PCR 반응성 및 특이성을 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과, 선 Ⅰ과 선 Ⅱ에 대한 역치 사이클수(threshold cycle)(Ct)는 선 Ⅰ 23.89 C(t), 선 Ⅱ 29.5C(t)인 것으로 나타났다(도 9). 선 Ⅱ 보다 선 Ⅰ에서 C(t)가 당겨진 것은 멜팅 커브에서 나타난 바와 같이 블로킹 올리고뉴클레오티드가 포함된 선 Ⅱ에서는 정확한 증폭 산물만이 생성되었다는 하나의 형광피크만이 나타난 반면, 블로킹 올리고뉴클레오티드가 포함되지 않은 선 Ⅰ은 두개의 증폭 산물이 생성되었다는 두개의 형광 피크가 나타났기 때문이다. 이는 목적하는 PCR 증폭 산물 이외에 그보다 작은 크기의 프라이머 다이머 증폭 산물 또는 비특이적인 증폭 산물이 생성되었음을 의미한다. 또한, 정확한 PCR 증폭 산물에 대한 멜팅 온도(Tm)는 실험군(선 Ⅱ) 및 대조군(선 Ⅰ)에서 공히 85.5℃로 확인되었고, 프라이머 다이머 또는 비특이적인 증폭 산물에 대한 멜팅 온도(Tm)는 이보다 낮은 75.5℃로 확인되었다.
상기 결과로부터, 대조군의 경우에는 증폭 산물 이외에도 프라이머 다이머가 생성되어 낮은 특이성을 보이는 것과 대조적으로, 본 발명에 사용되는 인스턴트 핫스타트 PCR 방법은 실시간 PCR 반응에서도 낮은 온도 및 PCR 반응 중에 나타나는 비특이적인 반응을 억제시킨 PCR 반응을 효과적으로 복구시켜 핫스타트 방법의 장점인 비특이적 PCR 증폭 산물의 생성을 억제시키고, 정확한 결과를 확인할 수 있음을 확인하였다.
<110> BIONEER CORPORATION <120> Composition for Hot-Start PCR Comprising Blocking Oligonucleotide <130> 2011-dpa-0014 <160> 47 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 primer <400> 1 ctcttcctac agtactcccc tgc 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P63 primer <400> 2 ggccactgac aaccaccctt aacc 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P73 primer <400> 3 caagtggctc ctgacctgga gtc 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P83 primer <400> 4 gtcctgcttg cttacctcgc ttagt 25 <210> 5 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 blicking oligonucleotide with 3' amine modification having 5mer length <400> 5 gcagg 5 <210> 6 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 blicking oligonucleotide with 3' amine modification having 7mer length <400> 6 gcagggg 7 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 blicking oligonucleotide with 3' amine modification having 10mer length <400> 7 gcaggggagt 10 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 blicking oligonucleotide with 3' amine modification having 15mer length <400> 8 gcaggggagt actgt 15 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 blicking oligonucleotide with 3' amine modification having 17mer length <400> 9 gcaggggagt actgtag 17 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 blicking oligonucleotide with 3' amine modification having 18mer length <400> 10 gcaggggagt actgtagg 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 blicking oligonucleotide with 3' amine modification having 19mer length <400> 11 gcaggggagt actgtagga 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 blicking oligonucleotide with 3' amine modification having 20mer length <400> 12 gcaggggagt actgtaggaa 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 blicking oligonucleotide with 3' amine modification having 21mer length <400> 13 gcaggggagt actgtaggaa g 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P55 blicking oligonucleotide with 3' amine modification having 22mer length <400> 14 gcaggggagt actgtaggaa ga 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ABCA3(463) <400> 15 gcccatctta catcctctct c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ABCA3(463) <400> 16 ccagcaccta atcacagtca g 21 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer blocking oligonucleotide for ABCA3(463) <400> 17 gagagaggat gtaag 15 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ABCB1(413) <400> 18 ttcagaatgg cagagtcaag g 21 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ABCB1(413) <400> 19 ttagcaaggc agtcagttac ag 22 <210> 20 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for SLC29A2(357) <400> 27 ttcatcatca tcaggagcag ag 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for SLC29A2(357) <400> 28 tccttccaag agcctcaatt ag 22 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer blocking oligonucleotide for SLC29A2(357) <400> 29 ctctgctcct gatgat 16 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ABCC10(288) <400> 30 cccataggct caacacgatc c 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ABCC10(288) <400> 31 tggggaagtg tggagaggta g 21 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer blocking oligonucleotide for ABCC10(288) <400> 32 gatcgtgttg agcctat 17 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ABCG1(258) <400> 33 gaccgacgac acagagactc 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ABCG1(258) <400> 34 ctaaggagcg actggactga g 21 <210> 35 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer blocking oligonucleotide for ABCG1(258) <400> 35 gagtctctgt gtcg 14 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ABCC5(205) <400> 36 ggacaggtgg tggagtttga c 21 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ABCC5(205) <400> 37 aaaggcaagg tttcggtagg ag 22 <210> 38 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer blocking oligonucleotide for ABCC5(205) <400> 38 gtcaaactcc accac 15 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ATP7B(161) <400> 39 tctgaccttc accttggatg g 21 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ATP7B(161) <400> 40 ggacacaatt actgacggac ag 22 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 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Claims (15)

  1. 반응용 완충용액, MgCl2, 4종의 dNTP 및 DNA 중합효소를 포함하는 PCR용 조성물에 3' 말단의 수산기가 블로킹되고 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 블로킹 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머보다 염기서열의 수가 작은 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머보다 낮은 멜팅 온도를 갖는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 상보적인 염기서열을 갖는 프라이머보다 1℃ 이상 낮은 멜팅 온도를 갖는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 25℃ 이상의 멜팅 온도를 갖는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 3' 말단의 수산기가 상기 수산기 이외의 치환기로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 치환기는 각각 화학식 1 내지 화학식 6으로 표시되는 C3-Space, C6-space, C12-space, C18-Space, 아민, 포스페이트와, DIG 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00013

    [화학식 2]
    Figure pat00014

    [화학식 3]
    Figure pat00015

    [화학식 4]
    Figure pat00016

    [화학식 5]
    Figure pat00017

    [화학식 6]
    Figure pat00018
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 염기는 모두 상기 프라이머의 3' 말단의 염기와 상보적인 결합을 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 블로킹 올리고뉴클레오티드는 전방 프라이머 및 후방 프라이머로 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 DNA 중합효소는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성를 갖는 중합효소 및 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서,
    주형 핵산에 대해 비반응성인 염료 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 비반응성 염료 물질은 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드 및 크레졸 레드로 이루어진 군으로부터 선택되는 핫스타트 PCR용 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서,
    역전사효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핫스타트 PCR용 건조 조성물.
  14. 청구항 1에 따른 핫스타트 PCR용 조성물을 이용한 핫스타트 PCR 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 PCR은 멀티플렉스 PCR, 실시간 PCR, 실시간 정량 PCR, 실시간 RT(real time)/PCR 및 실시간 정량 RT/PCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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