CN103088014A - 一种聚合酶链反应试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种聚合酶链反应试剂及其制备方法，该PCR试剂的组分包括引物、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和去离子水等成分，可包含或不包含DNA聚合酶，任选地，其所述的试剂还可以包含荧光探针，该方法将上述组分混匀后，分装至单个PCR反应管中，将分装管开盖静置于合适的无菌环境中，干燥，去除水份，获得所述的PCR试剂。该方法操作简单，对生产条件要求低，制备的PCR试剂对运输及储存条件的要求低，可在低于4℃的条件下保存4～6个月。该方法能够为PCR反应提供一种操作简单、配制快速、检测结果稳定可靠的PCR试剂，从而实现快速检测的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子生物学试剂及其制备方法，特别是涉及一种聚合酶链反应试剂及其制备方法。
技术背景
聚合酶链反应(PCR)是一种简单、专一、快速、灵敏地扩增特定DNA的方法，其反应液由十几种试剂组成。在PCR技术建立之初，各种PCR试剂成分均被制备为几至几十倍浓度的储存液，使用时按照需要进行配制。这种试剂盒可随意改变反应液组成成分的配比，适合用于探索PCR反应液的最佳配比。但其缺点也很明显：操作繁琐、污染几率大、实验误差大等。为了克服这些缺点，有研究者(中国专利授权号CN100393883C)制备了将PCR主要反应成分预混的通用全预混PCR反应混合液，但是这种PCR预混试剂需要在-20℃条件下才能长期保存，对运输和储存的要求均高，另外液体组分在储存过程中容易挥发，使聚合酶链反应的稳定性降低。针对这些问题，有研究者(中国专利授权号CN1110572C)进一步将PCR全预混反应液制备成冷冻干燥制剂，这种方法虽然延长了保存期，但却增加了冷冻干燥制备步骤，对生产的要求较高并可能造成酶在冷干过程中的损失。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的聚合酶链反应(PCR)试剂及其制备方法，该方法操作简单，对生产条件要求低。利用该方法制备的PCR反应试剂对运输及储存条件的要求低，能在低于4℃的温度下储存较长时间。该方法能够为PCR反应提供一种操作简单、配制快速、检测结果稳定可靠的PCR试剂，从而实现快速检测的目的。
本发明提供一种聚合酶链反应试剂，其组分是：PCR引物、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和去离子水，任选地含有DNA聚合酶，其特征在于，该反应试剂通过下述方法获得：将上述组分以合理浓度混匀后，按照2ul～100ul/反应分装至反应管中，分装体积中预留出模板DNA体积，优选的模板DNA体积为0.2-10ul，更优选的模板DNA体积为2-5ul，最优选的模板DNA体积为2ul、0.5ul、5ul，得到分装管；将分装管开盖静置于合适的无菌条件下在15℃～50℃的温度条件下进行干燥，干燥处理的时间为2小时～72小时。
本发明还提供一种聚合酶链反应试剂的制备方法，其组分包括：PCR引物、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和去离子水，任选地含有DNA聚合酶，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将上述组分以合理浓度混匀后，按照2ul～100ul/反应分装至反应管中；分装体积中预留出模板DNA体积，优选的模板DNA体积为0.2-10ul，更优选的模板DNA体积为2-5ul，最优选的模板DNA体积为2ul、0.5ul、5ul；
(2)将步骤(1)中制备得到的试剂开盖静置于合适的无菌条件下，在15℃～50℃的温度条件下进行干燥，干燥处理的时间为2小时～72小时；
(3)任选地，将步骤(2)获得的干燥试剂密封后，置于4℃或低于4℃的温度条件下储存。
本发明中所述的合适的无菌条件为GMP十万级洁净环境中或者与之相当的环境，所述的合理浓度是指各组分混匀后，加入去离子水至分装体积后，各组分的浓度，为分装后的浓度。在后续PCR反应前，加入去离子水和模板后(任选地加入其它成分后)，各组分的浓度为为PCR反应时的合适浓度。
本发明中所述的GMP十万级洁净环境，具体参数要求如1表中所示；100000级区域一般控制温度为18～28℃，相对湿度为50～65％，生产工艺对温度和湿度有特殊要求时，应根据工艺要求确定。其他指标参见《药品生产质量管理规范(2010修订)》和《GB 50457-2008医药工业洁净厂房设计规范》中的要求。
表1
本发明中所述的反应管可以是单管、8连管或反应板(96孔、384孔等)，例如ABI、Axygen等公司的产品。
该制备方法中，其干燥处理的时间优选为2小时～72小时。优选的干燥条件是：温度37℃，湿度20％-30％，更优选的干燥条件是：在37℃的温度条件下，干燥7小时。
所述的dNTPs可以是dATP、dTTP、dGTP、dCTP、dUTP等。所述的Mg2+优选为MgCl2。所述的去离子水可以是PCR级去离子水。所述的PCR反应缓冲液可以是商购的，例如下列公司提供的缓冲液：美国应用生物系统公司(ABI，如GeneAmp 10X PCR Buffer)、罗氏诊断产品(上海)有限公司(Roche，如Fast start TaqDNA polymerase PCRbuffer)、上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen，如PCROptimized Buffer I)、SIGMA-ALDRICH公司(如10X PCR Buffer)等，优选地，缓冲溶液中包含Tris-HCl、KCl，更优选地，所述的反应缓冲液中还含有明胶。所述的DNA聚合酶，优选为HotStart DNA聚合酶。
上述聚合酶链反应试剂或其制备方法中，任选地，所述反应试剂中还可以含有荧光探针。
该PCR反应试剂中所述的引物可以是根据目标检测基因设计合成的寡核苷酸或其衍生物等，优选具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列的引物，或者具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6序列的引物。所述的寡核苷酸衍生物为假异胞嘧啶核碱基衍生物等。如果有，所述的荧光探针可以根据目标检测基因设计合成，可以是荧光修饰的寡核苷酸或其衍生物等，优选具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：7序列的荧光探针。所述的荧光修饰的寡核苷酸衍生物为荧光素FAM、VIC、HEX、TET、JOE等修饰的寡核苷酸等。
上述聚合酶链反应试剂或其制备方法，其中所述组分的浓度分别为：引物10～1000nM，优选50～800nM，进一步优选100～500nM，特别优选300～500nM；dNTPs 100～500uM，优选150～300uM，进一步优选200～250uM；Mg2+1～10mM，优选1.5～8mM，进一步优选2～6mM，特别优选2.5～4mM；KCl 20～100mM，优选30～70mM，进一步优选50～55mM，最优选的KCl浓度为50mM；如果有，所述的荧光探针浓度为100～500nM，优选150～400nM，进一步优选200～300nM；如果有，所述的DNA聚合酶的量为0.1～5U。如果有，明胶的浓度为0.001％，缓冲液的pH范围是8.1～8.8，优选的pH值为8.3。
本发明还提供一种聚合酶链反应试剂的使用方法，包括以下步骤：将本发明制备好的干燥试剂取出，在反应管中加入无菌去离子水至分装体积，如果需要，加入DNA聚合酶，充分溶解、混匀后加入预留体积的模板DNA；然后进行PCR反应，通常反应体系的总体积为分装体积与模板DNA体积之和。在需要补加其它试剂的情况下，反应体系的总体积为分装体积、模板体积和补加试剂的体积之和。
本发明中所述的突变含量是以样本中突变基因的量为例，高含量为大于1000拷贝、中等含量为100-1000拷贝、低含量为1-100拷贝。
应用本发明制备方法制备的PCR反应试剂可于不超过4℃条件下长期储存，最长储存时间可达6个月，使用时只需加入无菌去离子水复原后即可进行PCR反应。
使用经本发明制备方法制备的试剂进行PCR反应时，只需向干燥混合物中加入无菌去离子水至一定体积，充分混匀后使各成分溶解复原，然后再加入待测样品DNA就可以进行PCR反应。在4℃条件和一定的储存期内，用干燥试剂所得检测结果与-20℃冻存的PCR反应混合液所得结果完全相同。
实验证明，经干燥处理得到的PCR反应成分混合物可在4℃条件下存放6个月而不失去活性，在更低的温度下则可以存放的更久。这不仅为PCR反应的实际操作带来极大的便利，而且将有力地推动PCR诊断试剂盒迅速的普及与推广。
附图说明
图1-A显示了分别应用4℃保存2个月的实施例1制备的PCR试剂与-20℃保存2个月的冻存试剂检测K-ras基因突变时，其准确性与重复性的比较结果。其中1为冻存试剂，2、3和4分别为重复的干燥试剂。
图1-B 显示了应用-20℃保存2个月的冻存试剂检测K-ras基因突变时，其灵敏性实验结果。其中1、2、3、4、5分别为突变型质粒占野生型质粒的100％、15％、10％、7.5％、5％的样品。
图1-C显示了应用4℃保存2个月的实施例1制备的PCR试剂检测K-ras基因突变时，其灵敏性实验结果。其中1、2、3、4、5分别为突变型质粒占野生型质粒的100％、15％、10％、7.5％、5％的样品。
图2-A显示了分别应用4℃保存4个月的实施例1制备的PCR试剂与-20℃保存4个月的冻存试剂检测K-ras基因突变时，其准确性与重复性的比较结果。其中1为冻存试剂，2、3和4分别为重复的干燥试剂。
图2-B显示了应用-20℃保存4个月的冻存试剂检测K-ras基因突变时，其灵敏性实验结果。其中1、2、3、4、5分别为突变型质粒占野生型质粒的100％、15％、10％、7.5％、5％的样品。
图2-C显示了应用4℃保存4个月的实施例1制备的PCR试剂检测K-ras基因突变时，其灵敏性实验结果。其中1、2、3、4、5分别为突变型质粒占野生型质粒的100％、15％、10％、7.5％、5％的样品。
图3-A显示了分别应用本发明的4℃保存6个月的实施例1制备的PCR试剂与-20℃保存6个月的冻存试剂检测K-ras基因突变，其准确性与重复性的比较结果，其中1为冻存试剂，2、3和4分别为重复的干燥试剂。
图3-B显示了应用-20℃保存6个月的冻存试剂检测K-ras基因突变时，其灵敏性实验结果。其中1、2、3、4、5分别为突变型质粒占野生型质粒的100％、15％、10％、7.5％、5％的样品。
图3-C显示了应用4℃保存6个月的实施例1制备的PCR试剂检测K-ras基因突变时，其灵敏性实验结果。其中1、2、3、4、5分别为突变型质粒占野生型质粒的100％、15％、10％、7.5％、5％的样品。
图4-A、图4-B、图4-C 针对高突变含量、中等突变含量、低突变含量的35G＞A基因突变石蜡样本进行检测时，应用实施例1制备的PCR试剂与冻存试剂检测结果的比较。其中1为冻存试剂，2为本发明制备方法制备的PCR反应试剂。
图5针对38G＞A石蜡样本，应用实施例2制备的PCR试剂的检测结果。其中1为高突变含量样本，2为中等突变含量样本，3为低突变含量样本。
图6针对非小细胞肺癌EGFR基因L858R(2573T＞G)基因突变的石蜡样本，应用实施例3制备的PCR试剂的检测结果。其中1为高突变含量样本，2为中等突变含量样本，3为低突变含量样本。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
应用实施例1制备的PCR反应试剂(包含DNA聚合酶)对K-ras基因12编码子35G＞A(GGT→GAT)基因突变进行检测。
K-ras基因属于GTase超家族，定位于人类染色体12p12.1，编码一种具有GTP酶活性的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，定位于细胞膜内侧，是表皮生长因子受体(EGFR)功能信号的下游分子，在膜受体到腺苷环化酶信号传导中起重要作用。RAS蛋白通常在有活性的RAS-GTP和无活性的RAS-GDP两种结合状态间转化。K-ras基因突变是结直肠癌发生发展中的一种早期事件，在结直肠癌遗传学改变中最为重要。这种突变可导致GTP无法水解，RAS蛋白不依赖EGFR/HER受体激活而持续处于活化状态，从而使下游信号组成型激活，持续活化的生长信号会影响细胞的生长、增殖和分化，促进细胞的恶性转化。
1.模板DNA的制备
质粒DNA的提取使用QIA Spin Miniprep kit(Qiagen)，要求A260/280在1.7～2.0之间；石蜡样本DNA的提取使用DEXPAT kit(Takara)；具体操作步骤均参照厂家说明书。应用野生型质粒将突变质粒稀释为突变质粒占100％、30％、15％、10％、7.5％、5％、2.5％、0％的溶液；根据阿伏迦德罗常数和质粒分子量将一定质量浓度的质粒溶液调整为一定拷贝数浓度的质粒溶液。质粒构建为将野生型或突变型K-ras基因序列插入至pMD19载体中，由宝生物工程(大连)有限公司提供。
2.荧光探针及引物的设计合成
检测用荧光探针及引物均由Primer Express 2.0(ABI)软件设计完成，并由宝生物工程(大连)有限公司合成。具体序列信息参见表1。
表1
| 名称 | 5’-3’ |
| 正向引物 | GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATA(SEQ ID NO：1) |
| 反向引物 | TGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCAAG(SEQ ID NO：2) |
| 荧光探针 | FAM-CCTACGCCATCAGCTCCAA-MGB(SEQ ID NO：3) |
3.检测试剂的制备
将除模板DNA以外的各种PCR反应成分混匀，然后用去离子水补足至需分装的体积，混合均匀后各组分的浓度分别为：KCl 50mM、MgCl23mM、Tris-HCl 10mM(pH8.3)、明胶0.001％、dNTPs 0.2mM、表1的正向引物0.4uM、反向引物0.4uM、突变检测探针0.2uM、HotStart DNA聚合酶0.5U，按照18ul/反应分装至0.2ml PCR反应管中；将分装好的试剂等分为两份，一份移至GMP十万级洁净环境中，温度37℃，湿度20-30％，开盖放置7小时，然后于4℃条件下储存备用(即干燥试剂)，另一份直接转入-20℃条件下冻存，作为对照试剂使用(即冻存试剂)。
4.PCR反应
针对实施例1制备的干燥试剂：在反应管中加入18ul无菌去离子水，充分溶解、混匀后加入2ul实施例1中制备的质粒DNA或石蜡样本DNA；
针对实施例1制备的冻存试剂：将-20℃冻存的试剂取出融解混匀后，直接加入2ul实施例1中制备的模板DNA即可；
K-ras基因突变检测在ABI7500上进行，反应程序为95℃ 10min变性后，按照95℃15s，62℃ 1min的条件进行40个循环。
5.检测结果与判断
图1、图2和图3分别为2个月、4个月、6个月时，实施例1的4℃保存干燥试剂与-20℃保存冻存试剂的K-ras基因突变检测的结果。其中A图为准确性与重复性的检测结果，B图为-20℃保存冻存试剂灵敏性的检测结果，C图为4℃保存干燥试剂灵敏性的检测结果。从图1、图2和图3中可知，在保存时间为2个月、4个月、6个月时，4℃保存干燥试剂与-20℃保存冻存试剂的检测性能完全一致。
图4为应用实施例1制备的干燥试剂或冻存试剂针对不同突变含量石蜡样本DNA的检测结果，其中样本1为高突变含量石蜡样本、样本2为高中等突变含量石蜡样本、样本3为低突变含量石蜡样本，可以看到干燥试剂与冻存试剂的检测结果完全一致。其中突变含量以样本中突变基因的量为例，高含量为大于1000拷贝、中等含量为100-1000拷贝、低含量为1-100拷贝。
6.结论
结果表明，实施例1中PCR反应混合液(包含DNA聚合酶)经干燥处理后得到的混合物在4℃条件下储存6个月，能够正常扩增，且与-20℃冻存对照试剂检测结果完全一致。
实施例2
应用干燥处理PCR试剂(不包含DNA聚合酶)对临床结直肠癌石蜡样本K-ras基因13编码子38G＞A(GGC→GAC)基因突变的检测
1.石蜡样本DNA的提取
结直肠癌石蜡样本DNA的提取使用DEXPAT kit(Takara)；具体操作步骤均参照厂家说明书。
2.荧光探针及引物的设计合成
检测用荧光探针及引物均由Primer Express 2.0(ABI)软件设计完成，并由宝生物工程(大连)有限公司合成。具体序列信息参见表2。
表2
| 名称 | 5’-3’ |
| 正向引物 | GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATA(SEQ ID NO：1) |
| 反向引物 | TGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCAAG(SEQ ID NO：2) |
| 荧光探针 | FAM-CCTACGTCACCAGCTCCAA-MGB(SEQ ID NO：4) |
3.检测试剂的制备
将除模板DNA以外的各种PCR反应成分混匀，然后用去离子水补足至分装体积，混合均匀后各组分的浓度分别为：KCl 50mM、Mgcl22.5mM、Tris-HCl 10mM(pH8.3)、dNTPs 0.2mM、表2中的正向引物0.3uM、反向引物0.3uM、突变检测探针0.1uM，按照4.5ul/反应分装至0.2ml PCR反应管中；再移至30℃环境中放置4小时，然后于2℃条件下储存备用。
4.PCR反应
将实施例2制备好的干燥试剂取出，在反应管中加入4.5ul无菌去离子水，充分溶解、混匀后加入0.2U HotStart DNA聚合酶和0.5ul实施例2制备的石蜡样本DNA；
K-ras基因突变检测在ABI7500上进行，反应程序为95℃ 10min变性后，按照95℃15s，62℃1min的条件进行40个循环。
5.检测结果与判断
图5为应用实施例2制备的PCR干燥试剂针对不同突变含量结直肠癌石蜡样本的检测结果，其中样本1为高突变含量石蜡样本、样本2为高中等突变含量石蜡样本、样本3为低突变含量石蜡样本，可以看到实施例2所制备的干燥试剂可针对各种突变含量的结直肠癌石蜡样本进行有效检测。其中突变含量以样本中突变基因的量为例，高含量为大于1000拷贝、中等含量为100-1000拷贝、低含量为1-100拷贝。
6.结论
结果表明，PCR反应混合液(不包含DNA聚合酶)经干燥处理后制备而成的PCR检测试剂，能够有效检测结直肠癌石蜡样本中K-ras基因的基因突变情况，可应用于临床K-ras基因的突变检测。
实施例3
应用干燥处理PCR试剂(包含DNA聚合酶)对临床非小细胞肺癌石蜡样本EGFR基因L858R(2573T＞G)基因突变的检测
1.石蜡样本DNA的提取
非小细胞肺癌石蜡样本DNA的提取使用DEXPAT kit(Takara)；具体操作步骤均参照厂家说明书。
2.荧光探针及引物的设计合成
检测用荧光探针及引物均由Primer Express 2.0(ABI)软件设计完成，并由宝生物工程(大连)有限公司合成。具体序列信息参见表3。
表3
| 名称 | 5’-3’ |
| 正向引物 | AACACCGCAGCATGTCAAGA(SEQ ID NO：5) |
| 反向引物 | TTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTCC(SEQ ID NO：6) |
| 荧光探针 | FAM-ATTTTGGGCGGGCCAC-MGB(SEQ ID NO：7) |
3.检测试剂的制备
将除模板DNA以外的各种PCR反应成分混匀，然后用去离子水补足反应体积，混合均匀后各组分的浓度分别为：KCl 50mM、MgCl2 4mM、Tris-Hcl 10mM(pH8.3)、明胶0.001％、dNTPs 0.2mM、表3中的正向引物0.5uM、反向引物0.5uM、突变检测探针0.25uM、HotStart DNA聚合酶1.25U，按照45ul/反应分装至0.2ml PCR反应管中；再移至GMP十万级洁净环境中，温度42℃，湿度20％-30％，开盖放置15小时，然后于0℃条件下储存备用。
4.PCR反应
将实施例3制备好的干燥试剂取出，在反应管中加入45ul无菌去离子水，充分溶解、混匀后加入5ul实施例3制备的石蜡样本DNA；
EGFR基因突变检测在ABI7500上进行，反应程序为95℃10min变性后，按照95℃15s，62℃1min的条件进行40个循环。
5.检测结果与判断
图6为应用实施例3制备的PCR干燥试剂针对不同突变含量非小细胞肺癌石蜡样本的检测结果，其中样本1为高突变含量石蜡样本、样本2为高中等突变含量石蜡样本、样本3为低突变含量石蜡样本，可以看到实施例3所制备的干燥试剂可针对各种突变含量的非小细胞肺癌石蜡样本进行有效检测。其中突变含量以样本中突变基因的量为例，高含量为大于1000拷贝、中等含量为100-1000拷贝、低含量为1-100拷贝。
6.结论
结果表明，PCR反应混合液(包含DNA聚合酶)经干燥处理后制备而成的PCR检测试剂，能够有效检测非小细胞肺癌石蜡样本中EGFR基因的基因突变情况，可应用于临床EGFR基因的突变检测。
说明，对于实施例1、2、3，其中实施例1、2、3的反应体系分别为20ul、5ul、50ul，制备干燥试剂时需分装的体积分别为18ul、4.5ul、45ul，相应所缺少的2ul、0.5ul、5ul为需要加入的模板体积，每个实施例中根据反应体系的大小制备干燥试剂所需的温度及时间各不相同；所示浓度均为反应体系中的终浓度，每种成分需要加入的体积依照各自的原液浓度而定，用去离子水补足至需分装的体积(即18ul、4.5ul、45ul)。
Claims (11)
1.一种聚合酶链反应试剂，其组分是：PCR引物、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和去离子水，任选地含有DNA聚合酶，
其特征在于，该反应试剂通过下述方法获得：将上述组分以合理浓度混匀后，按照2ul～100ul/反应分装至反应管中，分装体积中预留出模板DNA体积，得到分装管，优选的模板DNA体积为0.2-10ul，更优选的模板DNA体积为2-5ul，最优选的模板DNA体积为2ul、0.5ul、5ul；将分装管开盖静置于合适的无菌条件下在15℃～50℃的温度条件下进行干燥，干燥处理的时间为2小时～72小时。
2.一种聚合酶链反应试剂的制备方法，其组分包括：PCR引物、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲液和去离子水，任选地含有DNA聚合酶，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将上述组分以合理浓度混匀后，按照2ul～100ul/反应分装至反应管中；分装体积中预留出模板DNA体积，优选的模板DNA体积为0.2-10ul，更优选的模板DNA体积为2-5ul，最优选的模板DNA体积为2ul、0.5ul、5ul；
(2)将步骤(1)中制备得到的试剂开盖静置于合适的无菌条件下，在15℃～50℃的温度条件下进行干燥，干燥处理的时间为2小时～72小时；
(3)任选地，将步骤(2)获得的干燥试剂密封后，置于4℃或低于4℃的温度条件下储存。
3.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的合适的无菌条件为GMP十万级洁净环境中或者与之等同的环境，所述的合理浓度是分装浓度，该浓度在经过干燥处理的分装管加入合适体积的去离子水和模板后各组分的浓度达到PCR反应时的合适浓度。
4.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的反应试剂中还含有荧光探针，任选地，反应缓冲液中还含有明胶。
5.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的DNA聚合酶是HotStart DNA聚合酶，Mg2+来自MgCl2，PCR反应缓冲液中包含Tris-HCl、KCl。
6.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述组分的浓度分别为：引物10～1000nM，优选50～800nM，进一步优选100～500nM，特别优选300～500nM；dNTPs 100～500uM，优选150～300uM，进一步优选200～250uM；Mg2+1～10mM，优选1.5～8mM，进一步优选2～6mM，特别优选2.5～4mM；PCR反应缓冲液中Tris-HCl 10～25mM；KCl 20～100mM，优选30～70mM，进一步优选50～55mM，最优选的KCl浓度为50mM；如果有，所述的荧光探针浓度为100～500nM，优选150～400nM，进一步优选200～300nM；如果有，所述的DNA聚合酶的量为0.1～5U；如果有，明胶的浓度为0.001％；缓冲液的pH范围是8.1～8.8，优选的pH值为8.3。
7.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的引物是根据目标检测基因设计合成的寡核苷酸或其衍生物，如果有，所述的荧光探针是根据目标检测基因设计合成的荧光修饰的寡核苷酸或其衍生物。
8.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或者SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，如果有的话，其中所述荧光探针的序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7所示。
9.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其中所述的干燥条件为：温度37℃，湿度20％～30％，其中干燥处理的时间为2小时～72小时。
10.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂或权利要求2的制备方法，其干燥条件为：在37℃的温度条件下，干燥7小时。
11.权利要求1所述的聚合酶链反应试剂的使用方法，包括以下步骤：将权利要求1的聚合酶链反应试剂取出，在反应管中加入无菌去离子水至分装体积，如果需要，加入DNA聚合酶，充分溶解、混匀后加入预留体积的模板DNA，反应体系的总体积为分装体积与模板DNA体积之和；然后进行PCR反应。
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|---|---|---|---|---|
| CN105925563A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-09-07 | 李丙亮 | 制备固定相核酸试剂的方法 |
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| CN101842492A (zh) * | 2007-10-29 | 2010-09-22 | 株式会社百奥尼 | 具有长期稳定性的用于热启动pcr的干燥组合物 |
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2011
- 2011-11-08 CN CN2011103491853A patent/CN103088014A/zh active Pending
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