CN105925563A - 制备固定相核酸试剂的方法 - Google Patents
制备固定相核酸试剂的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105925563A CN105925563A CN201610318577.6A CN201610318577A CN105925563A CN 105925563 A CN105925563 A CN 105925563A CN 201610318577 A CN201610318577 A CN 201610318577A CN 105925563 A CN105925563 A CN 105925563A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid reagent
- phase
- reagent
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 62
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 title abstract 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012254 powdered material Substances 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 abstract description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 abstract 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 abstract 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 abstract 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000521257 Hydrops Species 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种制备固定相核酸试剂的方法，所述方法包括步骤：I.提供包含核酸的储备液原料或干粉状原料，其中当提供干粉状原料时，先将所述干粉状原料溶解处理，以获得适于核酸检测的储备液；II.将所述储备液用核酸干燥保护液稀释并分装至包含固定相的容器内；III.脱干所述容器，以获得固定在所述容器内的核酸试剂。所述方法便于核酸试剂的储存、运输和使用，使用时只需按照试验所需浓度将复溶溶剂和/或各种试剂加入包含固定相的容器内即可。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种固定相核酸试剂的方法，以及包括该固定相核酸试剂的试剂盒。
背景技术
干粉试剂是将各组分溶于液体中进行分装干燥存放，使用前加入指定量的缓冲液复溶的一类试剂。这类试剂由于能够在-20摄氏度下存放5年以上、在室温下存放12个月以上、并且运输和使用方便而被广泛使用。聚合酶链式反应(PCR)当中，引物、探针或/和模板都可以采用干粉试剂的形式。
核酸干粉试剂通常是定量封装的，使用时通常先加入TE缓冲液或水复溶即可。它是由浓度较高的储备液(如100pmol/ul～500pmol/ul)为原料，取一定量的储备液用TE缓冲液或超纯水稀释成工作液(如1pmol/ul～50pmol/ul)，剩余的储备液分装保存于-20℃的冰箱中。然而，由于核酸的特殊性，在液相中，其储存有效期较短，一般为几周至十几个月不等，与核酸浓度、长度和反复冻融有关。因而，无论在科学研究领域，还是应用中，得到稳定可靠的核酸原料都是必需的且是实验结果可靠的基础。
为此，提供一种使用起来方便且存放时间长的核酸试剂是本领域所需的。
发明内容
本发明的的目的在于克服上述缺点，提供一种成本低、效率高且简单方便的干粉状核酸的固定制备技术。
本发明的目的和优点一部分将在下面的描述中列出，另一部分对于本领域普通技术人员来说容易基于下面的描述而想到。
本发明的一个目的是提供一种制备固定相核酸试剂的方法，所述方法包括步骤：I.提供包含核酸的储备液原料或干粉状原料，其中当提供干粉状原料时，先将所述干粉状原料溶解处理，以获得适于核酸检测的储备液；II.将所述储备液用核酸干燥保护液稀释并分装至包含固定相的容器内；III.脱干所述容器，以获得固定在所述容器内的核酸试剂。
优选地，所述核酸试剂为引物、探针或/和模板。
优选地，当所述核酸试剂为引物时，所述步骤I与步骤II之间进一步包括对所述引物的修饰处理步骤，所述修饰处理包括但不限于在所述引物的3’端和/或5’端分别修饰荧光标记基团和荧光淬灭基团。
优选地，所述步骤I中干粉状原料采用TE缓冲液或超纯水进行溶解，获得储备液。
优选地，所述步骤I所提供或获得的储备液中核酸试剂的浓度为100pmol/ul～500pmol/ul。
优选地，所述步骤II中的核酸干燥保护液为易挥发且与所述核酸试剂兼容的溶剂，包括但不限于无水乙醇、乙腈、乙醚，其中最优选为无水乙醇，优选无水乙醇的浓度为30％～80％，其余体积用超纯水补足。
优选地，所述步骤II中储备液稀释至核酸试剂浓度为10pmol/ul～50pmol/ul。
优选地，所述步骤II中包含固定相的容器为多孔板或PCR反应管。
优选地，所述步骤III的脱干在15摄氏度至80摄氏度下进行，优选在25摄氏度至50摄氏度下进行，更优选在室温下进行。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒包含任一种上述方法所制备的固定相核酸试剂。
本发明具有以下优点：
1、将干粉状核酸试剂(通常经过商业途径购得)制备成固定相核酸试剂，或者将储备液进行固定处理，便于核酸试剂的储存、运输和使用，使用时只需按照试验所需浓度将复溶溶剂和/或各种试剂加入包含固定相的容器内即可。
2、本申请优选采用易挥发且环境友好的无水乙醇来稀释储备液，与采用TE或超纯水来稀释相比，脱干所需时间大大缩短，并且不产生有害废物。值得一提的是，传统认为在核酸检测当中，乙醇由于是PCR反应的抑制剂，而不希望存在，但本发明人经试验证实，采用乙醇作为干燥保护液，由于在脱干过程中乙醇几乎完全挥发并带走大量水分，不仅干燥效率高，也不会对后续试验产生可察觉的影响。
3、本申请所采用的脱干条件无需特定设备，且室温下即可完成，便于工业化生产和工艺设定。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.PCR反应中引物的脱干：
PCR的具体步骤条件可参考《分子克隆实验指南(第三版)》(第8章“聚合酶链式反应体外扩增DNA”，597-701页，科学出版社，2002年8月)的记载。
1.1.引物获得：
引物委托给专业的合成公司合成，一次合成1OD以上。合成公司提供的引物为干粉，且可提供修饰引物。引物3’端和/或5’端分别修饰荧光标记基团和荧光淬灭基团。荧光基团包括但不限于FAM、HEX、VIC、JOE、Taxas Red、ROX、CY3、CY5、delight 680等；荧光淬灭基团包括但不限于BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcyl、TAMRA等。
引物用时需溶解至100pmol/ul～500pmol/ul。按照PCR要求量10pmol/反应～50pmol/反应加入到PCR反应管中。
1.2.配液：
用pH8.0的TE或超纯水溶解引物至500pmol/ul，取所需引物与无水乙醇、超纯水混合，混合后引物浓度为10pmol/～50pmol/ul，乙醇为80％。
1.3.分装：
用0.1ul/反应～3ul/反应分装引物至PCR反应管，本次分装三个浓度，分别为10pmol/ul、25pmol/ul、50pmol/ul，分装体积为1ul。
1.4.脱干：
室温放置10分钟～30分钟，至液体挥发、引物脱干。
1.5.结果：
取其中脱干的反应管，取同体积水复溶，用微量分光光度计测试其浓度是否与分装前一致，具体数据如下：
试验证实，各样品检测数值均与分装前接近，在误差范围内。用上述引物进行PCR试验，证明脱干的PCR反应管含有实验所需引物。
实施例2.PCR反应中核酸片段的脱干：
PCR的具体步骤条件可参考《分子克隆实验指南(第三版)》(第8章“聚合酶链式反应体外扩增DNA”，597-701页，科学出版社，2002年8月)的记载。
1.1.核酸片段的获得：
核酸片段委托给专业的合成公司合成，一次合成1OD以上。合成公司提供的核酸片段为干粉，用时需复溶至需要浓度的10倍～30倍。按照PCR要求量加入到PCR反应管中，作为PCR反应的模板。
1.2.配液：
用pH8.0的TE或超纯水溶解核酸片段至500pmol/ul，取所需引物与无水乙醇、超纯水混合，混合后核酸片段浓度为3拷贝/ul、30拷贝/ul、300拷贝/ul、3000拷贝/ul、3×104拷贝/ul、3×105拷贝/ul、3×106拷贝/ul、3×107拷贝/ul、3×108拷贝/ul，乙醇为80％。
1.3.分装：
用0.1ul/反应～3ul/反应分装引物至PCR反应管，本次分装体积为1ul。
1.4.脱干：
室温放置10分钟～30分钟，至液体挥发、核酸片段脱干。
1.5.结果：
取其中脱干的反应管，加入PCR反应液、以核酸片段序列设计的PCR引物和探针，配成标准的荧光定量PCR反应，反应参数为：
95℃，10分钟；(95℃，25秒钟；60℃，25秒钟；72℃，45秒钟)，40个循环。
具体Ct数据如下：
试验证实，各样品检测数值均与分装前接近，在误差范围内。且脱干的PCR反应管含有实验所需模板，该反应管可作为PCR反应的阳性对照、阴性对照、定量标准品，并能长期放置在室温，便于储存和运输。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，本发明要求保护的范围由权利要求书以及其等同替换方式所限定，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种制备固定相核酸试剂的方法，所述方法包括步骤：
I.提供包含核酸的储备液原料或干粉状原料，其中当提供干粉状原料时，先将所述干粉状原料溶解处理，以获得适于核酸检测的储备液；
II.将所述储备液用核酸干燥保护液稀释并分装至包含固定相的容器内；
III.脱干所述容器，以获得固定在所述容器内的核酸试剂。
2.根据权利要求1所述的制备固定相核酸试剂的方法，其中所述核酸试剂为引物、探针或/和模板。
3.根据权利要求2所述的制备固定相核酸试剂的方法，其中当所述核酸试剂为引物时，所述步骤I与步骤II之间进一步包括对所述引物的修饰处理步骤，优选所述修饰处理步骤为在所述引物的3’端和/或5’端分别修饰荧光标记基团和荧光淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的制备固定相核酸试剂的方法，其中所述步骤I中干粉状原料采用TE缓冲液或超纯水进行溶解，获得储备液。
5.根据权利要求1所述的制备固定相核酸试剂的方法，其中所述步骤I所提供或获得的储备液中核酸试剂的浓度为100pmol/ul～500pmol/ul。
6.根据权利要求1-5之一所述的制备固定相核酸试剂的方法，其中所述步骤II中的核酸干燥保护液为易挥发且与所述核酸试剂兼容的溶剂，优选为无水乙醇、乙腈或乙醚，更优选为无水乙醇，所述无水乙醇的浓度优选为30％～80％，其余体积用超纯水补足。
7.根据权利要求1所述的制备固定相核酸试剂的方法，其中所述步骤II中储备液稀释至核酸试剂浓度为10pmol/ul～50pmol/ul。
8.根据权利要求1所述的制备固定相核酸试剂的方法，其中所述步骤II中包含固定相的容器为多孔板或PCR反应管。
9.根据权利要求1所述的制备固定相核酸试剂的方法，其中所述步骤III的脱干在15摄氏度至80摄氏度下进行，优选在25摄氏度至50摄氏度下进行，更优选在室温下进行。
10.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-9之一所述方法制备的固定相核酸试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610318577.6A CN105925563A (zh) | 2016-05-13 | 2016-05-13 | 制备固定相核酸试剂的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610318577.6A CN105925563A (zh) | 2016-05-13 | 2016-05-13 | 制备固定相核酸试剂的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105925563A true CN105925563A (zh) | 2016-09-07 |
Family
ID=56835699
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610318577.6A Pending CN105925563A (zh) | 2016-05-13 | 2016-05-13 | 制备固定相核酸试剂的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105925563A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1981055A (zh) * | 2004-07-02 | 2007-06-13 | 英国国防部 | 使对于核酸扩增有用的试剂稳定的方法 |
| CN101235350A (zh) * | 2007-03-06 | 2008-08-06 | 上海市环境科学研究院 | 一种土壤dna样品制备试剂盒及其制备方法 |
| CN103088014A (zh) * | 2011-11-08 | 2013-05-08 | 北京金菩嘉医疗科技有限公司 | 一种聚合酶链反应试剂及其制备方法 |
| CN105255855A (zh) * | 2014-07-10 | 2016-01-20 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | 在固体表面保存核酸的方法及其保存液 |
-
2016
- 2016-05-13 CN CN201610318577.6A patent/CN105925563A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1981055A (zh) * | 2004-07-02 | 2007-06-13 | 英国国防部 | 使对于核酸扩增有用的试剂稳定的方法 |
| CN101235350A (zh) * | 2007-03-06 | 2008-08-06 | 上海市环境科学研究院 | 一种土壤dna样品制备试剂盒及其制备方法 |
| CN103088014A (zh) * | 2011-11-08 | 2013-05-08 | 北京金菩嘉医疗科技有限公司 | 一种聚合酶链反应试剂及其制备方法 |
| CN105255855A (zh) * | 2014-07-10 | 2016-01-20 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | 在固体表面保存核酸的方法及其保存液 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Low et al. | Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids | |
| Shen et al. | Messenger RNA modifications in plants | |
| Staff et al. | Preservation of nucleic acids and tissue morphology in paraffin-embedded clinical samples: comparison of five molecular fixatives | |
| CN101647427B (zh) | 马属动物精液保存稀释液及其生产方法和使用方法 | |
| Keita et al. | Molecular evidence for the presence of Rickettsia felis in the feces of wild-living African apes | |
| CN103789202A (zh) | 常温保存核酸的采集容器 | |
| CN106755593B (zh) | 一种hpv分型检测的核酸组合及其应用和试剂盒 | |
| EP2243832A3 (en) | Sample preparation method incorporating an alkaline shock | |
| Wei et al. | Spatially Resolved, Error‐Robust Multiplexed MicroRNA Profiling in Single Living Cells | |
| CN105441444A (zh) | 杨梅est-ssr分子标记及其应用 | |
| Kolanowska et al. | MicroRNA analysis using next-generation sequencing | |
| CN105925563A (zh) | 制备固定相核酸试剂的方法 | |
| Tozaki et al. | Low‐copy transgene detection using nested digital polymerase chain reaction for gene‐doping control | |
| Rio | Denaturation and electrophoresis of RNA with glyoxal | |
| CN105671033A (zh) | 直用型高保真pcr扩增混合试剂 | |
| Srisiri et al. | Optimisation of DNA recovery and analysis of urine samples stored on FTA® card | |
| CN104073551A (zh) | 一种基于毛细管电泳和ssr标记的甘蔗种子真实性检测方法 | |
| CN114480369B (zh) | 磁珠保存液、制备方法及磁珠产品 | |
| Huang et al. | Detection of long noncoding RNA expression by real-time PCR | |
| CN103571825B (zh) | 用于生物样本处理之组合物及使用其之核酸扩增方法 | |
| JP2013005796A (ja) | 乾燥試薬、乾燥試薬キット、試薬器、乾燥試薬の製造方法 | |
| CN104099419B (zh) | 一种核酸显色剂及其应用 | |
| Wolff et al. | Native electrospray ionization mass spectrometry of RNA-ligand complexes | |
| CN104087665B (zh) | 一种检测黄曲霉及烟曲霉的通用引物及实时荧光tHDA试剂盒 | |
| CN106086166A (zh) | 检测石蜡切片dna质量的试剂及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160928 Address after: 201201 Shanghai Zhangjiang hi tech Industrial District Ruiqinglu No. 528 building 14 B No. 1 layer Applicant after: Ke Yi bio tech ltd, Shanghai Address before: 201203 No. 555, Lane 73, best street, college town, Shanghai, Pudong New Area, 101 Applicant before: Li Bingliang |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160907 |