WO2021172653A1 - 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a single nucleic acid for real-time detection of a genetic variation of a single target gene and a detection method using the same. More specifically, it has a structure of XYZ and is a nucleotide sequence capable of complementary binding to some or all of the nucleotide sequence of a single target gene containing genetic variations such as single nucleotide polymorphisms, point mutations, or miRNA isoforms. It relates to a method for detecting a genetic variation of a single target gene in real time using a constructed mononucleic acid, and a kit therefor.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • PCR polymerase chain reaction
  • multiplex PCR multiplex polymerase chain reaction
  • the polymerase chain reaction can bind to template DNA, and has the advantage of being able to accurately amplify only a desired region of a gene to be detected by arbitrarily designing a primer or probe in which a fluorescent material and a quencher are bonded.
  • a primer or probe in which a fluorescent material and a quencher are bonded.
  • only one gene of interest can be amplified in a single reaction, when there are a plurality of genes of interest to be amplified, it is inconvenient to repeatedly perform the same operation.
  • the multiple polymerase chain reaction has an advantage in that multiple gene regions can be analyzed simultaneously by performing multiple polymerase chain reactions in one tube.
  • there is a limit to the number of gene regions that can be amplified at once because cross-reactions between primers or primers occur when several primers or probes are used simultaneously in one tube.
  • it requires a lot of effort and time to find the reaction conditions, and there are disadvantages in that good results cannot be obtained in sensitivity and specificity (Hardenbol P. et al. , Nat. Biotechnol. , 21(6):673-678). , 2003).
  • SNPlex SNPlex
  • Goldengate assay SNPlex
  • MIPs molecular inversion probes
  • the SNPlex performs a purification process using exonuclease after OLA (oligonucleotide ligation assay), polymerase chain reaction amplification with a common primer sequence at both ends of the probe, and finally the probe It is a method of analyzing in a DNA chip using the ZipCode nucleotide sequence included in the probe (Tobler et al. , J. Biomol. Tech. , 16(4):398-406, 2005).
  • Goldengate assay is performed by performing an allele-specific primer extension reaction with an upstream probe on genomic DNA immobilized on a solid surface, then performing a DNA ligation reaction with a downstream probe and washing process. This is a method of removing probes that have not undergone DNA ligation reaction, amplifying them with a common primer nucleotide sequence included in the probe such as SNPlex, and analyzing the amplified polymerase chain reaction result on an Illumina BeadChip (Shen R). et al. , Mutat. Res. , 573(1-2):70-82, 2005).
  • MIPs Molecular inversion probes
  • Point mutations are generally known to occur during DNA replication.
  • DNA replication occurs when one double-stranded DNA molecule produces two single-stranded DNA, each strand being used as a template for the creation of a complementary strand.
  • a single point mutation can change the entire DNA sequence, and changing one purine or pyrimidine can change the amino acid encoded by the nucleotide.
  • Point mutations can arise from spontaneous mutations during DNA replication and the mutation rate can be increased by such causes.
  • Functional classification for point mutations is based on nonsense mutations, such as stop-gain and start-loss, when the production of proteins is abnormally shortened or added, and when encoding other amino acids, such as for missense mutations (valine in the BRAF gene). valine) to glutamic acid, which leads to the activation of RAF protein, which causes unrestricted proliferation signals in cancer cells), which encodes the same amino acid as in silent mutants and is known to ordinary researchers. is a matter
  • Point mutations are also known to cause certain diseases. Point mutations in multiple tumor suppressor proteins cause cancer, and neurofibromatosis is caused by point mutations in the Neurofibromin 1 or Neurofibromin 2 genes.
  • Sickle-cell anemia is caused by a point mutation in the ⁇ -globin chain of hemoglobin, in which the hydrophilic amino acid glutamic acid at position 6 is replaced by the hydrophobic amino acid valine. It has also been found in Tay-Sachs disease and color blindness.
  • the present inventors have long developed a method for diagnosing cancer simply and accurately by increasing low sensitivity and specificity in real-time detection of genetic modifications such as SNPs, point mutations, and miRNA isoforms.
  • the present inventors have found that when using the mononucleic acid of the present inventors, high sensitivity and high specificity are shown, which is very useful for diagnosing various diseases caused by genetic modification such as cancer, including cancer, and completed the present invention.
  • One object of the present invention is to i) have the structure of XYZ, ii) complementary binding to some or all of the nucleotide sequence of a single target gene including genetic variation, iii) the same or at least two at both ends or inside
  • Y is RNA composed of one or two base sequences located in a single target gene.
  • Another object of the present invention is that when the genetic variation of a single target gene is a single nucleotide polymorphism (SNP), the single nucleic acid is (a) the X is a DNA consisting of 4 to 20 base sequences, , (b) wherein Z is to provide a single nucleic acid for detecting genetic variation of a single target gene, characterized in that DNA consisting of 4 to 20 nucleotide sequences.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Another object of the present invention is when the genetic mutation of a single target gene is single nucleotide polymorphism (SNP) or point mutation or miRNA isoform (c) wherein X is 10
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • c point mutation or miRNA isoform
  • Another object of the present invention is to provide a kit for real-time detection of a genetic variation of a single target gene, including the single nucleic acid.
  • Another object of the present invention is to obtain a target nucleic acid comprising a genetic mutation to be detected from a) a biological sample; b) preparing a single nucleic acid for detecting the genetic variation of the single target gene; c) elongation reaction after mixing with the target nucleic acid obtained in step a), the mononucleic acid prepared in step b), a primer set having a nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid obtained in step a), and a cleavage reagent amplifying a target nucleic acid-mononucleic acid complex comprising a genetic variation through and d) measuring the amount of a single nucleic acid fragment isolated from the target nucleic acid-mononucleic acid complex containing the genetic variation amplified in step c); will do
  • the present invention provides a mononucleic acid (promer) for detecting a genetic variation of a single target gene.
  • the mononucleic acid is i) has the structure of XYZ, ii) complementary binding to some or all of the nucleotide sequence of a single target gene including genetic variation, iii) the same or at least two at both ends or inside Two different detectable markers are attached, and the Y is RNA composed of one or two base sequences located in a single target gene and is cleaved by a cleavage reagent when hybridizing with a single target gene.
  • the single nucleic acid is (a) the X is a DNA consisting of 4 to 20 nucleotide sequences and (b) wherein Z is DNA consisting of 4 to 20 nucleotide sequences, or genetic mutation of a single target gene is single nucleotide polymorphism (SNP) point mutation or miRNA
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • X is DNA composed of 10 to 30 nucleotide sequences
  • Z is DNA composed of 1 to 5 nucleotide sequences.
  • the X and Z are also single.
  • Y is cleaved by a cleavage reagent after hybridization with the Z is separated from a single target gene, but the X is not separated, and it is characterized in that it operates simultaneously as a primer and a probe.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the present invention provides a kit for real-time detection of a genetic variation of a single target gene, including the single nucleic acid.
  • the present invention comprises the steps of: a) obtaining a target nucleic acid comprising a genetic mutation to be detected from a biological sample; b) preparing a single nucleic acid for detecting the genetic variation of the single target gene; c) elongation reaction after mixing with the target nucleic acid obtained in step a), the mononucleic acid prepared in step b), a primer set having a nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid obtained in step a), and a cleavage reagent amplifying a target nucleic acid-mononucleic acid complex comprising a genetic variation through and d) measuring the amount of a single nucleic acid fragment isolated from the target nucleic acid-mononucleic acid complex containing the genetic variation amplified in step c); do.
  • the method for detecting the genetic variation of a single target gene using a single nucleic acid according to the present invention in real time is compared with the conventional SNP and point mutation analysis method using qPCR, a probe at a separate location for real-time confirmation ) is not required, which has the advantage of more accurately measuring genetic variations such as SNPs and point mutations. That is, the mononucleic acid according to the present invention is cleaved only by a cleavage reagent, so that it can be measured more accurately compared to the conventional method for detecting a genetic mutation using a probe.
  • mutations can be directly identified without the need for a separate mutation confirmation process such as melting temperature analysis.
  • the single nucleic acid (promer) of the present invention and the real-time detection method of a genetic variation of a single target gene using the same can quickly and accurately distinguish various point mutations occurring in KRAS, EGFR, etc. It can be usefully used for prognostic diagnosis.
  • E2/ is a road confirming the expression of ApoE gene using a single nucleic acid according to an embodiment of the present invention, in detail, the phenotype E2/ This is the PCR result confirming that E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, and E3/E4 can be distinguished.
  • Figure 2 is a road confirming the expression of the G13D mutant gene of the KRAS gene using G13D mononucleic acid type 1 according to an embodiment of the present invention, in detail, the concentration of genomic DNA (gDNA) of the G13D mutant cell line HCT-15 cell line; This is the PCR result confirming the expression of the G13D mutant gene according to the gDNA concentration after dilution with G13D single nucleic acid type 1 (SEQ ID NO: 7).
  • gDNA genomic DNA
  • 3 is a road confirming the expression of wild-type KRAS gene using KRAS wild-type mononucleic acid according to an embodiment of the present invention. It is a PCR result confirming the expression of the wild-type KRAS gene according to the KRAS wild-type single nucleic acid type 1 (SEQ ID NO: 8).
  • HCT The -15 cell line is a heterozygous type gene, and it is confirmed that it is a cell line that simultaneously possesses the G13D mutation and the KRAS wild type gene.
  • genomic DNA (gDNA) of the HCT-15 cell line was diluted to 10 to 0.01% relative to the genomic DNA (gDNA) concentration of the NCI-H1975 cell line, mixed with the genomic DNA (gDNA) of these cell lines, and confirmed using G13D mononucleic acid type 1 (SEQ ID NO: 7).
  • phenotype E2 of 6 types of ApoE gene using ApoE mononucleic acid type 2 SEQ ID NOs: 11 to 14
  • This is the PCR result confirming that /E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, and E3/E4 can be distinguished.
  • genomic DNA (gDNA) of the G12V mutant cell line SW620 cell line is diluted by concentration It is the PCR result of confirming the expression of the G12V mutant gene according to the later gDNA concentration using G12V single nucleic acid type 2 (SEQ ID NO: 15).
  • T790M mutant gene 10 is a road confirming the expression of the T790M mutant gene in exon 20 of the EGFR gene using mononucleic acid type 2 according to an embodiment of the present invention.
  • gDNA of the T790M mutant cell line H1975 cell line and the wild-type cell line A549 cell line After dilution for each concentration, the results of PCR confirming the expression of the T790M mutant gene according to the gDNA concentration using T790M single nucleic acid type 2 (SEQ ID NO: 24).
  • let-7a cDNA obtained by synthesizing let-7a miRNA through RT-PCR After dilution by concentration, it is a PCR result confirming the expression of let-7a miRNA gene according to the cDNA concentration using let-7a single nucleic acid type 2 (SEQ ID NO: 21).
  • let-7d miRNA gene is a road confirming the expression of let-7d miRNA gene using single nucleic acid type 2 according to an embodiment of the present invention, in detail, let-7d cDNA obtained by synthesizing let-7d miRNA through RT-PCR After dilution by concentration, the expression of let-7d miRNA gene according to cDNA concentration was confirmed using let-7d single nucleic acid type 2 (SEQ ID NO: 24).
  • FIG. 13 is a road confirming the let-7 miRNA gene-specific detection ability using single nucleic acid type 2 according to an embodiment of the present invention, in detail, the concentration of let-7a cDNA in the presence of let-7d cDNA (1pM concentration) After dilution, the let-7a miRNA gene expression according to the cDNA concentration, that is, the specific detection of the let-7a miRNA gene in the presence of let-7d cDNA, was determined using let-7a single nucleic acid type 2 (SEQ ID NO: 21). This is the confirmed PCR result.
  • FIG. 14 is a road confirming the expression of miRNA 34a gene using single nucleic acid type 2 according to an embodiment of the present invention, in detail, after diluting miRNA 34a cDNA obtained by synthesizing miRNA 34a through RT-PCR by concentration This is the PCR result confirming the expression of miRNA 34a gene according to the cDNA concentration using miRNA 34a single nucleic acid type 2 (SEQ ID NO: 27).
  • 15 is a road confirming the expression of miRNA 34b gene using single nucleic acid type 2 according to an embodiment of the present invention, in detail, after diluting miRNA 34b cDNA obtained by synthesizing miRNA 34b through RT-PCR by concentration This is the PCR result confirming the expression of miRNA 34b gene according to the cDNA concentration using miRNA 34b single nucleic acid type 2 (SEQ ID NO: 30).
  • 16 is a road confirming the expression of miRNA 34c gene using single nucleic acid type 2 according to an embodiment of the present invention, in detail, after diluting miRNA 34c cDNA obtained by synthesizing miRNA 34c through RT-PCR by concentration This is the PCR result confirming the expression of miRNA 34c gene according to the cDNA concentration using miRNA 34c single nucleic acid type 2 (SEQ ID NO: 33).
  • 17 is a road confirming the miRNA 34 gene-specific detection ability using single nucleic acid type 2 according to an embodiment of the present invention, in detail, after diluting miRNA 34c cDNA by concentration in the presence of miRNA 34a cDNA (100pM concentration) This is the PCR result confirming the expression of the miRNA 34c gene according to the cDNA concentration, that is, the specific detection of the miRNA 34c gene in the presence of the miRNA 34a cDNA, using miRNA 34c single nucleic acid type 2 (SEQ ID NO: 33).
  • 18 is a road confirming the miRNA 34 gene-specific detection ability using single nucleic acid type 2 according to an embodiment of the present invention, in detail, after diluting miRNA 34c cDNA by concentration in the presence of miRNA 34b cDNA (100pM concentration) This is the PCR result confirming whether the miRNA 34c gene expression according to the cDNA concentration, ie, specific detection of the miRNA 34c gene in the presence of miRNA 34b cDNA, was confirmed using miRNA 34c single nucleic acid type 2 (SEQ ID NO: 33).
  • G12D-R1DrMR2 single nucleic acid type 2
  • the expression of the G12D mutant gene according to the gDNA concentration was evaluated for G12D mononucleic acid type 2 ( It is the PCR result confirmed using SEQ ID NO: 36).
  • G12D-R1rDMR2 DNA oligo-RNA-DNA-mutant-DNA oligo type KRAS gene G12D single nucleic acid type 2 (G12D-R1rDMR2) according to an embodiment of the present invention confirming whether the G12D mutant gene expression of the KRAS gene.
  • the G12D mononucleic acid type 2 SEQ ID NO: 37 ) is the PCR result confirmed using
  • Figure 21 is a DNA oligo-DNA-mutant-RNA-DNA-DNA oligo type KRAS gene G12D single nucleic acid type 2 (G12D-R1DMrDR2) according to an embodiment of the present invention using the G12D mutant gene expression of the KRAS gene After diluting the gDNA of the G12D mutant cell line Aspc-1 cell line and the KRAS wild-type cell line HT-29 cell line by concentration, respectively, the expression of the G12D mutant gene according to the gDNA concentration was evaluated for G12D mononucleic acid type 2 (sequence It is the PCR result confirmed using number 38).
  • the present invention relates to a single nucleic acid for real-time detection of a genetic variation of a single target gene and a detection method using the same. More specifically, it has a structure of XYZ and is capable of complementary binding to some or all of the nucleotide sequence of a single target gene containing genetic variations such as single nucleotide polymorphism (SNP), point mutation, or miRNA isoform.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the present invention relates to a method and kit for detecting a genetic variation of a single target gene in real time using a single nucleic acid composed of a nucleotide sequence.
  • the present invention provides a mononucleic acid for detecting a genetic variation of a single target gene.
  • the mononucleic acid has the structure of i) XYZ, ii) complementary binding to some or all of the nucleotide sequence of a single target gene including genetic variation, iii) the same or at least in both ends or inside It is characterized in that two different detectable markers are attached.
  • the position of the detectable marker to be attached is not limited to a specific site, and any position at which the detectable marker is separated when the Y site is cut by a cleavage reagent may be used.
  • the single nucleic acid is characterized in that the complex is formed and amplified by complementary binding to a part or all of the nucleotide sequence of a single target gene including a genetic mutation for the purpose of real-time detection.
  • the single nucleic acid refers to a nucleic acid that detects the presence of a single nucleotide polymorphism (SNP), a point mutation, or a miRNA isoform when detecting a genetic mutation.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the single nucleic acid for detecting the presence of single nucleotide polymorphism (SNP) can be expressed as “type 1 mononucleic acid” or “single nucleic acid type 1”, single nucleotide polymorphism (SNP) or point mutation or miRNA variant
  • a mononucleic acid that detects the presence of a body can be expressed as “type 2 mononucleic acid” or “mononucleic acid type 2”.
  • the type 1 mononucleic acid can operate as a probe unlike the type 2 mononucleic acid, and the type 2 mononucleic acid can be used simultaneously as a primer and a probe, unlike the type 1 mononucleic acid.
  • the X and Z can also be separated from the single target gene and operate as a probe, and the type 2 mononucleic acid is a single target gene
  • the Y is cleaved by a cleavage reagent after hybridization with the Z is separated from a single target gene, but the X is not separated, and it is characterized in that it operates simultaneously as a primer and a probe.
  • the mononucleic acid of the present invention has a structure of X-Y-Z, and each of X, Y, and Z may have a variable number of nucleotides.
  • the Y is RNA composed of one or two nucleotide sequences located in a single target gene, and is a site cleaved by a cleavage reagent.
  • the cleavage reagent is preferably cleaved through an enzyme enzyme such as DNase, RNase, helicase, exonuclease and endonuclease, but other known cleavage reagents may be used.
  • an enzyme enzyme such as DNase, RNase, helicase, exonuclease and endonuclease, but other known cleavage reagents may be used.
  • X is 4 to 20, preferably 4 to 19, more preferably 4 to 18, even more preferably 5 to 18 when detecting the presence of single nucleotide polymorphism (SNP) , even more preferably 6 to 18, still more preferably 6 to 17, even more preferably 6 to 16, most preferably 6 to 15 nucleotide sequences. Accordingly, X belongs to type 1 mononucleic acid.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • X is a single nucleotide polymorphism (SNP) or point mutation (point mutation) or when detecting the presence of a miRNA isoform (isoform) 10 to 30, preferably 11 to 30, more preferably 12 to 30, even more preferably 13 to 30, still more preferably 14 to 30, still more preferably 15 to 30, even more preferably 15 to 30, more more preferably 15 to 29, even more preferably 15 to 28, still more preferably 15 to 27, even more preferably 15 to 26, even more preferably 15 to 25, more more preferably 15 to 24, even more preferably 15 to 23, still more preferably 15 to 22, even more preferably 15 to 21, most preferably 15 to 20 It is made up of DNA. Accordingly, X belongs to type 2 mononucleic acid.
  • Z is 4 to 20, preferably 4 to 19, more preferably 4 to 18, even more preferably 5 to 18 when detecting the presence of a single nucleotide polymorphism (SNP) , even more preferably 6 to 18, still more preferably 6 to 17, even more preferably 6 to 16, most preferably 6 to 15 nucleotide sequences. Accordingly, Z belongs to type 1 mononucleic acid.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the Z is 1 to 5, preferably 2 to 5, more preferably 2 to 4, even more preferably when detecting the presence of a point mutation or miRNA isoform is DNA consisting of 2-3 pieces. Accordingly, Z belongs to type 2 mononucleic acid.
  • the detection of the genetic variation is to detect the presence of a single nucleotide polymorphism (SNP), a point mutation, or a miRNA isoform, and the bases constituting X and Z as the above-described single nucleic acid.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the detection of each of these genetic mutations can be specifically and sensitively detected.
  • the phenotypes E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/ of six ApoE genes using ApoE mononucleic acids SEQ ID NOs: 3 to 6) It was confirmed through real-time PCR that E4 differentiation is clearly possible ( FIG. 1 ).
  • the expression of the G12V mutant gene according to the gDNA concentration was determined using G12V single nucleic acid (SEQ ID NO: 15). It was confirmed by real-time PCR (FIG. 7).
  • the expression of the G12C mutant gene according to the gDNA concentration is determined by real-time PCR using G12C single nucleic acid (SEQ ID NO: 16) was confirmed through (FIG. 8).
  • the expression of the G12S mutant gene according to the gDNA concentration is determined through real-time PCR using G12S single nucleic acid (SEQ ID NO: 17). was confirmed (FIG. 9).
  • the expression of the T790M mutant gene according to the gDNA concentration was determined whether the expression of the T790M single nucleic acid (sequence No. 19) was confirmed through real-time PCR (FIG. 10).
  • let-7a miRNA gene expression according to cDNA concentration was confirmed through real-time PCR using let-7a single nucleic acid (SEQ ID NO: 21). (Fig. 11).
  • let-7d miRNA gene expression according to cDNA concentration was confirmed through real-time PCR using let-7d single nucleic acid (SEQ ID NO: 24). (Fig. 12).
  • let-7a cDNA from 100fM to 1fM concentration in the experimental group was confirmed to be detectable (FIG. 13).
  • the expression of the miRNA 34a gene according to the cDNA concentration was confirmed through real-time PCR using the miRNA 34a single nucleic acid (SEQ ID NO: 27) (FIG. 14) .
  • the expression of the miRNA 34b gene according to the cDNA concentration was confirmed through real-time PCR using the miRNA 34b single nucleic acid (SEQ ID NO: 30) (FIG. 15) .
  • the expression of the miRNA 34c gene according to the cDNA concentration was confirmed through real-time PCR using the miRNA 34c single nucleic acid (SEQ ID NO: 33) (FIG. 16) .
  • miRNA 34c cDNA is diluted by concentration in miRNA 34a cDNA or miRNA 34b cDNA, and then, miRNA 34c gene expression is determined by real-time PCR using miRNA 34c single nucleic acid (SEQ ID NO: 33) at microconcentrations. was also confirmed ( FIGS. 17 and 18 ).
  • the detectable marker may be a fluorescent material that binds to a single nucleic acid by covalent or non-covalent bonding, or a fluorescent pair composed of a fluorescent material and a quencher.
  • the fluorescent material is not necessarily limited thereto, but for example, Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, Rhodamine, TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, It may be any one selected from the group consisting of Quasar 670 and biotin.
  • the matting material is not necessarily limited thereto, for example, DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY It may be any one selected from the group consisting of -2 and MGBNFQ.
  • the positions of the fluorescent material and the quencher material may be in the form of X or Z, or may be located at the Y site, but is not limited thereto.
  • the fluorescent material may be located at X and the quencher may be located at Y or Z.
  • the mononucleic acid of the present invention comprises: i) an RT primer for synthesizing cDNA from RNA among nucleic acids; ii) a forward primer for amplifying cDNA synthesized from a nucleic acid (DNA or RNA); iii) a reverse primer for amplifying cDNA synthesized from a nucleic acid (DNA or RNA); iv) forward and reverse primers for amplifying cDNA synthesized from nucleic acids (DNA or RNA); Or v) it can be used as a probe for checking the nucleic acid (DNA or RNA) to be detected in real time.
  • RT primers for synthesizing and amplifying RNA (including miRNA, etc.) of the mononucleic acid of the present invention into cDNA or forward primers and probes;
  • the RT primer is not required to form a loop or to form poly A during cDNA synthesis.
  • the present invention provides a kit for real-time detection of a genetic variation of a single target gene, including the mononucleic acid.
  • the kit preferably further comprises an enzyme capable of cleaving the Y site of the mononucleic acid in addition to the mononucleic acid of the present invention. do.
  • any enzyme capable of cleaving the Y site of the mononucleic acid may be used as long as it can specifically cut the Y site of the mononucleic acid.
  • a DNA nuclease DNase
  • DNase II DNase I
  • S1 DNase II
  • S1 S1 nuclease
  • nuclease P1 nuclease
  • AP AP nuclease
  • UvrABSC nucleic acid UvrABSC nucleic acid
  • RNA hydrolase ribonuclease, RNase
  • RNase ribonuclease
  • RNase specifically RNase II, RNase III, RNase IV, RNaseH, or RNase T2.
  • the kit is necessary for the amplification reaction of DNA in addition to the mononucleic acid of the present invention and an enzyme capable of cleaving the Y site of the mononucleic acid. Reagents may be further included.
  • Reagents necessary for the amplification reaction include, for example, an appropriate amount of a DNA polymerase (eg, a thermostable DNA polymerase obtained from Thermusaquatiucs (Taq), Thermusthermophilus (Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcusliteralis or Phyrococcusfuriosis (Pfu)).
  • a DNA polymerase eg, a thermostable DNA polymerase obtained from Thermusaquatiucs (Taq), Thermusthermophilus (Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcusliteralis or Phyrococcusfuriosis (Pfu)
  • DNA polymerase cofactor Mg 2+
  • buffer solution dNTPs (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) and water (dH 2 O).
  • the buffer solution is not limited thereto, but an appropriate amount of Triton X-100 (Triton X-100), dimethylsufoxide (DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, formamide and bovine serum albumin (BSA) etc.
  • the present invention provides a method comprising the steps of: a) obtaining a target nucleic acid comprising a genetic mutation to be detected from a biological sample; b) preparing the above-described mononucleic acid; c) elongation reaction after mixing with the target nucleic acid obtained in step a), the mononucleic acid prepared in step b), a primer set having a nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid obtained in step a), and a cleavage reagent amplifying a target nucleic acid-mononucleic acid complex comprising a genetic variation through and d) measuring the amount of a single nucleic acid fragment isolated from the target nucleic acid-mononucleic acid complex containing the genetic variation amplified in step c); do.
  • the target nucleic acid containing the genetic mutation may be RNA or DNA to be detected from a sample, or cDNA obtained by amplifying the RNA with a reverse transcription polymerase.
  • the sample may be a biological sample or RNA, DNA, or fragments thereof isolated from the biological sample.
  • the sample may be any one or more selected from the group consisting of blood, saliva, urine, feces, tissue, cell, and biopsy samples, or may be RNA, DNA, or fragments thereof isolated from stored biological samples. However, it is not necessarily limited thereto.
  • the stored biological sample is stored for 1 week or more, 1 year or more, for example, 1 to 10 years by a storage method conventionally known in the art, or stored frozen, or tissue stored at room temperature in formalin-fixed tissue may be derived from
  • extraction of RNA or DNA from a sample may use various methods known in the art.
  • the mononucleic acid is as described above, and specifically i) has a structure of XYZ, ii) complementarily binds to some or all of the nucleotide sequence of a single target gene including genetic variation, iii) It is characterized in that the same or at least two different detectable markers are attached to both ends or inside.
  • the detectable marker may be a fluorescent material that binds to a single nucleic acid by a covalent bond or a non-covalent bond, or a fluorescent pair consisting of a fluorescent material and a quencher material.
  • the fluorescent material is not necessarily limited thereto, but for example, Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, Rhodamine, TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, It may be any one selected from the group consisting of Quasar 670 and biotin.
  • the matting material is not necessarily limited thereto, for example, DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY It may be any one selected from the group consisting of -2 and MGBNFQ.
  • the amplification of the target nucleic acid-mononucleic acid complex comprising the genetic mutation is the obtained target nucleic acid, the prepared mononucleic acid, a primer set having a nucleotide sequence complementary to the obtained target nucleic acid, and cleavage After mixing with a reagent, it can be made through an elongation reaction.
  • the cleavage reagent is preferably cleaved through an enzyme, but other known cleavage reagents may be used.
  • enzymes such as DNase, RNase, helicase, exonuclease and endonuclease
  • "enzyme-mediated cleavage” is called use the term
  • nick generation and cleavage of the hybridized probe is more preferably performed by ribonuclease, which is an endonuclease or an exonuclease.
  • the ribonuclease is a double-stranded ribonuclease that generates and cleaves a nick in ribonucleic acid from a double-stranded DNA-RNA hybridizing strand.
  • the cleavage reagent is not limited thereto, but may be an RNA hydrolase (ribonuclease, RNase) of RNaseH, RNase II, RNase III, RNase IV, or RNase T2.
  • RNA hydrolase ribonuclease, RNase
  • the amount of the mononucleic acid fragment can be measured using various detection methods.
  • the fragment of the mononucleic acid isolated according to the present invention is preferably measured in real time or after the reaction is finished, and can be made by changing the fluorescence intensity or measuring chemiluminescence.
  • the change in fluorescence intensity or the measurement of chemiluminescence may be performed using any measuring device capable of detecting a fluorescent marker known in the art, for example, a triad multimode detector (TRIAD Multimode Detector), Victor fluorescence) or a Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer, LightCycler96, Applied Biosystems 7500, or Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler, but is not limited thereto.
  • a triad multimode detector TRIAD Multimode Detector
  • Victor fluorescence or a Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer
  • LightCycler96 Applied Biosystems 7500
  • Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler but is not limited thereto.
  • the method of measuring and detecting the amount of the cleaved mononucleic acid fragment according to the present invention may vary depending on the type of the mononucleic acid or the label or detectable marker introduced into the reaction solution.
  • the mononucleic acid of the present invention facilitates the discrimination of genetic mutations in the Y region by amplifying the Y region after cleavage, it is possible to identify the mutation through a subsequent nucleic acid amplification reaction. That is, when hybridization is formed between the Y site and the genetic variation site of the target nucleic acid in the mononucleic acid of the present invention, the Y site is cleaved only when precisely complementary binding to the genetic variation site, followed by amplification. Therefore, it is possible to clearly determine whether there is a genetic mutation.
  • the Y site and the genetic variation site of the target nucleic acid in the mononucleic acid of the present invention form a hybridization
  • the Y site does not form a complementary bond
  • the Y site is not cleaved, so the amplification reaction does not occur, which is the target nucleic acid. It means that there is no genetic variation to be measured in the nucleic acid.
  • the Y site in the mononucleic acid of the present invention is hybridized with the non-mutant case of the site where the genetic variation of the target nucleic acid occurs, if the Y site does not bind complementary, the Y site is not cleaved. No amplification reaction occurs, which means that there is a genetic variation in the target nucleic acid.
  • the detection of the genetic variation means detecting the presence of a single nucleotide polymorphism (SNP), a point mutation, or a miRNA isoform.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the gDNA of the G12D mutant cell line Aspc-1 cell line and the KRAS wild-type cell line HT-29 cell line was diluted by concentration, respectively, and the expression of the G12D mutant gene according to the gDNA concentration was determined by DNA oligo (DNAoligo).
  • DNAoligo DNA oligo
  • -DNA-RNA-mutant-DNA oligo-type KRAS gene G12D single nucleic acid G12D-R1DrMR2; SEQ ID NO: 36
  • the expression of the G12D mutant gene according to the gDNA concentration was determined by DNA oligo-RNA- It was confirmed by real-time PCR using a single nucleic acid (G12D-R1rDMR2; SEQ ID NO: 37) of the KRAS gene G12D of the DNA-mutant-DNA oligo type (FIG. 20).
  • the expression of the G12D mutant gene according to the gDNA concentration was determined by DNA oligo-DNA- It was confirmed by real-time PCR using the mutant-RNA-DNA-DNA oligo-type single nucleic acid of the KRAS gene G12D (G12D-R1DMrDR2; SEQ ID NO: 38) (FIG. 21).
  • nucleic acid amplification reaction that is, a nucleic acid amplification reaction, which can be easily used in the present invention is known to those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. That is, the amplification of the target nucleic acid is a polymerase chain reaction (PCR), rolling circle amplification (RCA), strand displacement amplification (SDA), or nucleic acid sequence-based amplification (nucleic acid sequence). sequence based amplification (NASBA), but is not limited to the above methods.
  • the nucleic acid amplification product is DNA or RNA.
  • a target nucleic acid, a mononucleic acid, a constituent of a nucleic acid amplification reaction, and a cleaving enzyme are included in the reaction mixture to simultaneously enable amplification of the target nucleic acid and detection by cleavage of the mononucleic acid described above.
  • amplification reaction it is necessary to individually optimize buffer conditions, primers, reaction temperature, and mononucleic acid cleavage conditions.
  • the detection method of the present invention is used in conjunction with a nucleic acid amplification reaction, the sensitivity and speed of detecting a target nucleic acid will be remarkably improved.
  • the single nucleic acid for real-time detection of a genetic mutation of a single target gene of the present invention can quickly and accurately detect and accurately detect and detect cancer-related point mutation genes such as KRAS and EGFR
  • the single nucleic acid is a cancer diagnostic kit
  • the present invention may be applied to a composition for diagnosing cancer, and may be usefully used to provide information on whether cancer occurs by performing a real-time cancer diagnosis.
  • Example 1 ApoE analysis using type 1 mononucleic acid
  • Type 1 mononucleic acid was used to analyze the six phenotypes E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, and E3/E4 of the apolipoprotein E (ApoE) gene.
  • the ApoE gene located on human chromosome 19, is a gene associated with cardiovascular and Alzheimer's disease.
  • the ApoE gene is a single nucleotide polymorphism (SNP) of DNA of codon 112 (cys/arg) and codon 158 (cys/arg) [genomic DNA positions 586 (T/C), 724 (T/C)] It has three allele isoforms, ApoE ⁇ 2, ApoE ⁇ 3, and ApoE ⁇ 4, and the combination of these alleles results in six phenotypes (E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/ E3, E2/E4, E3/E4).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • type 1 mononucleic acid and primers according to the present invention were prepared as shown in Table 1 below (IDT (Integrated DNA Technologies, USA)) Manufactured by request.
  • IDTT Integrated DNA Technologies, USA
  • type 1 mononucleic acid as a probe having an X-Y-Z structure, 6-FAM, HEX, TexasRed, and Cy5 were attached to the 5'-end, respectively, and IABkFQ was attached to each 3'-end.
  • ribonucleotides (RNA) are indicated by a subscript "r" in front of the sequence to distinguish them from deoxyribonucleotides (DNA).
  • ApoE-specific primer set and four ApoE mononucleic acids Primer name or probe name order SEQ ID NO: ApoE_F primer 5'-GAAGGCCTACAAATCGGAACT-3' One ApoE_R primer 5'-GCCACCTGCTCCTTCAC-3' 2 ApoE mononucleic acid 1 56-FAM/-GAGGACGTGrUGCGGCC-/3IABkFQ 3 ApoE mononucleic acid 2 5-HEX/-GAGGACGTGrCGCGGCC-/3IABkFQ 4 ApoE mononucleic acid 3 5-TexRd/-CTGCAGAAGrUGCCTGGCA-/3IABkFQ 5 ApoE mononucleic acid 4 5-Cy5/-GCAGAAGrCGCCTGGCA-/3IABkFQ 6
  • human cell lines PC3 (E2/E2), A549 (E3/E3), and U937 (E4/E4) were purchased from the Korea Cell Line Bank, and genomic DNA was obtained therefrom.
  • the homozygous phenotypes were PC3 (E2/E2), A549 (E3/E3), and U937 (E4/E4), and the heterozygous phenotype was PC3+A549 (a mixture of each genomic DNA).
  • E2/E3), PC3+U937 (E2/E4), and A549+U937 (E3/E4) were used in the analysis at a high concentration of 32 ng (about 10 4 copies) per reaction.
  • the PCR reaction conditions were 5 minutes at 95°C, 15 seconds at 95°C, and 45 cycles at 65°C for 70 seconds. The results for this are shown in FIG. 1 .
  • Example 2-1 Real-time KRAS gene using a single nucleic acid according to the present invention G13D mutation analysis
  • the G13D mutant mononucleic acid of the KRAS gene (type 1), the KRAS wild type mononucleic acid (1) type), forward and reverse primers of the G13D mutation of the KRAS gene were prepared as shown in Table 2 below.
  • HEX and FAM were attached to the 5'-end
  • IABkFQ was attached to the 3'-end.
  • ribonucleotides (RNA) are indicated by a subscript "r" in front of the sequence to distinguish them from deoxyribonucleotides (DNA).
  • G13D mutation and wild-type mononucleic acid of KRAS gene and G13D mutation-specific primer set Primer name or probe name order SEQ ID NO: G13D mononucleic acid HEX/-AGCTGGTGrACGTAGGC-/3IABkFQ 7 wild-type mononucleic acid FAM/-AGCTGGTGrGCGTAGGC-/3IABkFQ 8 G13D_F Primer 5'-CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACT-3' 9 G13D_R Primer 5'-TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAG-3' 10
  • the KRAS gene to be measured was detected from total genomic DNA extracted from the HCT-15 cell line and the NCI-H1975 cell line cultured for a certain period of time.
  • Total genomic DNA was extracted from 5 ⁇ 10 6 cells of each cell line using the PureLink Genomic DNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat No. K1820-00), and quantified using NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific).
  • the quantified total genomic DNA was diluted to 15ng/ ⁇ l, and serial dilution was performed by 1/10 to use 2 ⁇ l of genomic DNA at a concentration of 15ng/ ⁇ l to 1.5pg/ ⁇ l.
  • the HCT-15 cell line is a G13D mutant cell line, and NCI-H1975 is known as a KRAS wild-type cell line.
  • reaction conditions were initial denaturation at 95° C. for 10 minutes, followed by 40 cycles of 10 seconds at 95° C. and 60 seconds at 64° C., and the result was obtained by measuring the signal (HEX) in real time for each cycle.
  • the results are shown in FIG. 2 .
  • Example 2-2 Real-time analysis of wild-type KRAS gene using a single nucleic acid according to the present invention
  • the KRAS wild-type gene was measured. The results at this time are shown in FIG. 3 .
  • the HCT-15 cell line is a heterozygous type gene, and contains the G13D mutation (refer to the results of Fig. 2) and the KRAS wild type gene at the same time. could get
  • Example 2-3 Analysis of G13D mutation mixed with wild-type KRAS gene in real time using a single nucleic acid according to the present invention
  • the KRAS gene to be measured was detected from total genomic DNA extracted from the HCT-15 cell line and the NCI-H1975 cell line cultured for a certain period of time.
  • Total genomic DNA was extracted from 5X10 6 cells of each cell line using the PureLink Genomic DNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat No. K1820-00), and quantified using NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific).
  • the quantified NCI-H1975 DNA was diluted to 30 ng/ul
  • HCT-15 DNA was diluted to 30 ng/ul
  • serial dilution was performed by 1/10 to obtain a concentration of 3ng/ ⁇ l to 3pg/ ⁇ l of NCI.
  • -H1975 genomic DNA and HCT-15 genomic DNA were obtained.
  • the HCT-15 cell line is a G13D mutant cell line, and NCI-H1975 is known as a KRAS wild-type cell line.
  • type 2 mononucleic acid In order to determine whether SNP for the alleles of codon 112 and codon 158 of the ApoE gene, type 2 mononucleic acid according to the present invention was used. As shown in Table 3 below, type 2 mononucleic acids were prepared by requesting IDT (Integrated DNA Technologies, USA).
  • RNA ribonucleotides
  • r deoxyribonucleotides
  • ApoE mononucleic acids type 2 single nucleic acid name order SEQ ID NO: ApoE mononucleic acid 1 56-FAM/-CGGTCATGGAGGACGTGrUGC-/3IABkFQ 11 ApoE mononucleic acid 2 5TexRd-XN/-GCGGATATGGAGGACGTrGCG-/3IABkFQ 12 ApoE mononucleic acid 3 56-FAM/-CTGGTACACTGCCAGGCArCTT-/3IABkFQ 13 ApoE mononucleic acid 4 5HEX/-CTGGTACACTGCCAGGCrGATTC-/3IABkFQ 14
  • human cell lines PC3 (E2/E2), A549 (E3/E3), and U937 (E4/E4) were purchased from the Korea Cell Line Bank, and genomic DNA was obtained therefrom.
  • the homozygous phenotypes were PC3 (E2/E2), A549 (E3/E3), and U937 (E4/E4), and the heterozygous phenotype was PC3+A549 (a mixture of each genomic DNA).
  • E2/E3), PC3+U937 (E2/E4), and A549+U937 (E3/E4) were used in the analysis at a high concentration of 32 ng (about 10 4 copies) per reaction.
  • Example 4-1 Real-time G12V, G12C, G12S mutation analysis using type 2 mononucleic acid according to the present invention
  • the mutant status of three types of 12 codon mutations (G12V, G12C, G12S) of the KRAS gene was measured using a type 2 mononucleic acid.
  • a single nucleic acid and a Uni-reverse primer according to the present invention were prepared as shown in Table 4 by the IDT.
  • HEX, FAM, and Cy5 were attached to the 5'-end, and IABkFQ was attached to the 3'-end.
  • ribonucleotides (RNA) are indicated by a subscript "r" in front of the sequence to distinguish them from deoxyribonucleotides (DNA).
  • the prepared G12V mononucleic acid of SEQ ID NO: 15 and the primer of SEQ ID NO: 18 were prepared using 0.5 ⁇ l of 10 ⁇ M concentration, and Colo201 (KRAS wild-type cell line) in 3.6 ⁇ l of 5 ⁇ AptaTaq DNA Master (manufactured by Roche) and 0.2 ⁇ l of heat-resistant RNase H ) 30ng and 3ng, 300pg, 30pg, and 3pg of total genomic DNA extracted from the SW620 (G12V mutant) cell line were added, respectively, adjusted to a total volume of 20 ⁇ l with tertiary distilled water, and then polymerase chain reaction (PCR) was performed. G12V mutations were determined.
  • reaction conditions were initial denaturation at 95°C for 10 minutes, followed by 4 cycles of 15 seconds at 95°C and 30 seconds at 66°C to perform the first PCR reaction, followed by 15 seconds at 85°C and 40 seconds at 64°C.
  • a second PCR reaction was performed by performing 40 cycles, and the result was derived by measuring the signal (HEX) in real time for each cycle. The results are shown in FIG. 7 .
  • the prepared G12C mononucleic acid of SEQ ID NO: 16 and the primer of SEQ ID NO: 18 were prepared using 0.5 ⁇ l of 10 ⁇ M concentration, 2.8 ⁇ l of 5X AptaTaq DNA Master (manufactured by Roche), 1.2 ⁇ l of 5X Apta Fast buffer 1.2 ⁇ l, and 1U/ ⁇ l of heat resistance
  • 0.5 ⁇ l of RNase H and 0.5 ⁇ l of 25 mM MgCl2 70 ng of Colo201 (KRAS wild-type cell line) and 7 ng, 700 pg, 70 pg, and 7 pg of total genomic DNA extracted from MIA-Paca2 (G12C mutant) cell lines were added, respectively, and the total volume was 20 with tertiary distilled water.
  • the prepared G12S mononucleic acid of SEQ ID NO: 17 and the primer of SEQ ID NO: 18 were prepared using 0.5 ⁇ l of 10 ⁇ M concentration, 3.6 ⁇ l of 5X AptaTaq DNA Master (manufactured by Roche) and 0.2 ⁇ l of 10ng/ ⁇ l heat-resistant RNase H, Colo201 (KRAS wild-type cell line) 30ng and 3ng, 300pg, 30pg, and 7pg of total genomic DNA extracted from A549 (G12S mutant) cell lines were added, respectively, adjusted to a total volume of 20 ⁇ l with tertiary distilled water, and then polymerase chain reaction (polymerase chain reaction) was performed. reaction) to measure the G12S mutation.
  • reaction conditions were initial denaturation at 95° C. for 10 minutes, followed by 40 cycles of 10 seconds at 95° C. and 60 seconds at 64° C., and the results were obtained by measuring the signal (FAM) in real time for each cycle.
  • FAM signal
  • the single nucleic acid according to the present invention was able to analyze the mutant gene with excellent specificity and sensitivity even when less than 0.01% of the mutation (point mutation) gene was included.
  • Example 5 EGFR mutation analysis method using type 2 mononucleic acid
  • Epidermal growth factor receptor (EGFR) is overexpressed in non-small cell lung cancer and is a target of EGFR tyrosine kinase (TKI).
  • TKI EGFR tyrosine kinase
  • Type 2 mononucleic acid and primers according to the present invention were prepared by requesting IDT (Integrated DNA Technologies, USA) as shown in Table 6 below.
  • IDT Integrated DNA Technologies, USA
  • FAM was attached to the 5'-end
  • IABkFQ was attached to the 3'-end.
  • ribonucleotides (RNA) are indicated by a subscript “r” in front of the sequence to distinguish them from deoxyribonucleotides (DNA).
  • genomic DNA was obtained from T790M mutant cell line H1975 and wild-type cell line A549. H1975 and A549 genomic DNA was used after quantification at 30 ng (about 1 ⁇ 10 4 copies) and diluted 10-fold.
  • the genomic DNA, 0.5 unit of heat-resistant RNase H, and 3.6 ⁇ l of 5 ⁇ AptaTaq DNA Master (Roche) were added to a total volume of nuclease-free water. was adjusted to be 20 ⁇ l, and then polymerase chain reaction (PCR) was performed. At this time, the PCR reaction conditions were 45 cycles of 10 minutes at 95°C, 15 seconds at 95°C, and 60 seconds at 64°C. The results for this are shown in FIG. 10 .
  • each mutant type can be distinguished by 0.1% or less when compared with the wild type.
  • Example 6 Analysis of let-7 miRNA and miRNA 34 isoforms using type 2 mononucleic acid
  • Example 6-1 Real-time let-7 miRNA analysis using type 2 mononucleic acid according to the present invention
  • Let-7 miRNA is known to have the most isoform among miRNAs. It is known that it is a fairly difficult analysis to distinguish these isoforms of let-7, and it is known that it is particularly difficult to distinguish a specificity of less than 1% in general.
  • the type 2 mononucleic acid according to the present invention, primer, RT-primer was prepared by requesting IDT (Integrated DNA Technologies, USA) as shown in Table 7 below.
  • the let-7 miRNA was prepared by requesting the IDT.
  • RNA ribonucleotides
  • the synthesized cDNA was diluted from 100fM to 1aM concentration.
  • Example 6-2 Real-time let-7 miRNA specificity detection using type 2 mononucleic acid according to the present invention
  • Example 6-3 Real-time analysis of miRNA 34a, miRNA 34b and miRNA 34c using type 2 mononucleic acid according to the present invention
  • RNA ribonucleotides
  • r ribonucleotides
  • Each miRNA was reacted for 60 minutes using Invitrogen's poly-(A) tailing kit and Roche's Nxtscript RT kit (total 20 ⁇ l) at 40° C. in the presence of 1 ⁇ l of a 10 ⁇ M RT primer concentration to synthesize cDNA. to dilute the concentration of the seven cDNA from 1pM to 1aM concentration (about 10 6-10 0 copy) by 1/10 was carried out the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • each synthetic cDNA, heat-resistant RNase H, AptaTaq DNA Master (Roche), single nucleic acid, and primers were added, and the total volume was adjusted to 20 ⁇ l with tertiary distilled water, reaction conditions, 95°C for 5 minutes, 95°C 45 cycles were performed for 10 seconds at 65° C. for 1 minute.
  • miRNA 34a As a result, it was confirmed that in all of miRNA 34a, miRNA 34b and miRNA 34c, it was possible to measure from 1pM to 10aM (about 10 6 to 10 1 copies) with normal PCR efficiency.
  • Example 6-4 Real-time miRNA 34a, miRNA 34b and miRNA 34c specificity detection using type 2 mononucleic acid according to the present invention
  • Example 6-3 it was confirmed that the miRNA 34a, miRNA 34b, and miRNA 34c single nucleic acids can distinguish each isoform, and in this example, when the miRNA to be amplified is mixed with other heterologous miRNAs It was confirmed to what extent the desired variant can be distinguished.
  • 10 8 (100pM) miRNA 34a or miRNA 34b isoform was mixed with miRNA 34c diluted by 1/10 from 10 7 to 10 4 or 10 3 (10pM to 10fM or 10pM to 1fM) concentration, and miR-34c mononucleic acid and Specificity detection using primers was performed by polymerase chain reaction (PCR).
  • each synthetic cDNA, heat-resistant RNase H, AptaTaq DNA Master (manufactured by Roche), single nucleic acid, and primers were added, and the total volume was adjusted to 20 ⁇ l with tertiary distilled water under reaction conditions, 95°C for 5 minutes, 95°C. 45 cycles were performed in 10 seconds at 65° C. for 1 minute.
  • miRNA 34c maintained specificity up to 0.001% of the heterozygote, and it was possible to distinguish.
  • R1DrMR2 was used to examine three types of G12D, specifically, the mutant detection ability according to the position of the ribonucleotide (RNA) of the single nucleic acid according to the present invention.
  • R1rDMR2, and R1DMrDR2 types were prepared by requesting IDT (Integrated DNA Technologies, USA) as shown in Table 9 below.
  • FAM was attached to the 5'-end of each mononucleic acid
  • 3IABkFQ was attached to the 3'-end.
  • ribonucleotides (RNA) are indicated by a subscript "r" in front of the sequence to distinguish them from deoxyribonucleotides (DNA).
  • G12D Mononucleic acid for three types of KRAS gene G12D (R1DrMR2, R1rDMR2, R1DMrDR2) mononucleic acid order SEQ ID NO: G12D-R1DrMR2 FAM/-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGrATG-/3IABkFQ 36 G12D-R1rDMR2 FAM/-CTTGTGGTAGTTGGAGCTrGAT-/3IABkFQ 37 G12D-R1DMrDR2 FAM/-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGArTGG-/3IABkFQ 38
  • R1 and R2 DNA oligo, D: DNA, r: RNA, M: mutation
  • Example 7-1 G12D mutant gene and KRAS wild-type gene analysis according to G12D mononucleic acid type (G12D-R1DrMR2, G12D-R1rDMR2, G12D-R1DMrDR2)
  • 0.5 ⁇ l of mononucleic acid SEQ ID NOs: 36 to 38 and primer SEQ ID NO: 18 at a concentration of 10 ⁇ M were prepared, 0.5U RNase H, AptaTaq Master (manufactured by Roche) 3.6 ⁇ l, Aspc-1 (G12D mutant) and HT-29 (KRAS) After adding 30 ng of total genomic DNA extracted from wild-type), the total volume was adjusted to 20 ⁇ l with tertiary distilled water, and then polymerase chain reaction (PCR) was performed. At this time, the reaction conditions were initial denaturation at 95° C. for 10 minutes, followed by 45 cycles of 10 seconds at 95° C. and 60 seconds at 64° C., and the result was obtained by measuring the signal (FAM) in real time for each cycle. The results thereof are shown in FIGS. 19 to 21 .
  • the specificity for the KRAS wild-type gene showed different results, but it was confirmed that all three structures were capable of distinguishing point mutations.

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Abstract

본 발명은 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일염기다형성(SNP), 점 돌연변이 또는 miRNA 이형체(isoform)와 같은 유전적 변이가 포함된 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 단일핵산을 사용하여 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 절단시약에 의해서만 절단되는 단일핵산(promer)을 이용한 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법은 종래 프로브를 이용한 유전적 변이 검출 방법에 비해 보다 정확하게 측정할 수 있는 이점이 있다. 또한, 암과 관련된 KRAS, EGFR 유전자 등에서 발생하는 다양한 점 돌연변이를 정확하게 구분할 수 있어 암을 비롯한 다양한 질병의 진단 및 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법
본 발명은 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일염기다형성, 점 돌연변이 또는 miRNA 이형체(isoform)와 같은 유전적 변이가 포함된 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 단일핵산을 사용하여 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
유전자 변형에 있어 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)에 의한 변형은 가장 일반적인 형태이며, 다양한 질병을 유발시키는 원인으로 작용한다(Barreiro LB, et al., Methods Mol. Biol., 578:255-276, 2009; Beaudet L. et al., Genome Res., 11(4):600-608, 2001). 이에 유전자 변형에 의한 여러 질병들을 조기에 진단하기 위해 SNP 검출을 통한 진단 방법은 매우 효율적이며 빠른 진단이 가능하다. 따라서 SNP를 정확하게 검출하기 위한 많은 방법들이 제시되어 왔으며, 현재에도 이와 관련된 많은 연구가 진행되고 있다(Ermini ML. et al., Biosen. & Bioele., 61:28-37, 2014; K. Chang et al., Biosen. & Bioele., 66:297-307, 2015).
구체적으로, 다수의 유전자 분석을 위한 가장 보편적으로 사용하는 방법으로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하는 방법, 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, Multiplex PCR) 방법이 있다.
상기 중합효소 연쇄반응은 템플레이트(template) DNA와 결합할 수 있으며, 형광물질과 소광물질이 결합된 프라이머 또는 프로브를 임의로 설계함으로써 검출하고자 하는 유전자의 원하는 부위만을 정확하게 증폭할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 한 번의 반응으로 하나의 관심 유전자만을 증폭시킬 수 있어 증폭하고자 하는 관심 유전자가 다수일 경우에는 동일한 작업을 반복해서 수행하여야 하는 번거로움이 있다.
상기 다중 중합효소 연쇄반응은 여러 개의 중합효소 연쇄반응을 한 튜브에서 수행함으로써 다수의 유전자 영역을 동시에 분석할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 여러 개의 프라이머 또는 프로브를 한 튜브에서 동시에 사용함에 따라 프라이머 또는 프라이머들 간의 교차반응이 발생하게 되기 때문에 한 번에 증폭할 수 있는 유전자 영역의 수에는 한계가 있다. 또한, 반응 조건을 찾기 위한 많은 노력과 시간을 필요로 하고 민감도 및 특이도에서 좋은 결과를 얻을 수 없다는 단점이 있다(Hardenbol P. et al., Nat. Biotechnol., 21(6):673-678, 2003).
최근에는 다중 중합효소 연쇄반응을 사용하지 않고 공통 프라이머를 사용하여 다수의 유전자 영역을 동시에 증폭하여 대량 분석을 가능하게 하는 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 대표적인 기술로는 동시에 여러 유전자 영역의 단일염기다형성(SNP)을 분석할 수 있는 SNPlex, Goldengate assay, molecular inversion probes(MIPs) 등이 있다.
상기 SNPlex는 OLA(oligonucleotide ligation assay) 이후에 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 이용한 정제 과정을 수행하고 프로브(probe)의 양쪽 끝에 있는 공통 프라이머 염기서열로 중합효소 연쇄반응 증폭을 한 다음, 마지막으로 프로브(probe)에 포함되어 있는 집코드(ZipCode) 염기서열을 이용해 DNA 칩에서 분석하는 방법이다(Tobler et al., J. Biomol. Tech., 16(4):398-406, 2005).
Goldengate assay는 고체 표면에 고정화된 게놈 DNA(genomic DNA)에 업스트림(upstream) 프로브로 대립 유전자 특이적 프라이머 연장 반응을 수행한 후에 다운스트림(downstream) 프로브와 DNA 연결 반응을 수행하고, 세척 과정을 거쳐 DNA 연결 반응이 되지 않은 프로브들을 제거한 다음, SNPlex와 같이 프로브에 포함되어 있는 공통 프라이머 염기서열로 증폭시키고, 증폭된 중합효소 연쇄반응 결과물을 일루미나 비드칩(Illumina BeadChip)에서 분석하는 방법이다(Shen R. et al., Mutat. Res., 573(1-2):70-82, 2005).
Molecular inversion probes(MIPs)는 패드록 프로브(padlock probe)를 사용하여 갭-결찰(gap-ligation)을 한 이후에 DNA 연결이 되지 않은 프로브들과 게놈 DNA를 엑소뉴클레아제(exonucelase)를 이용하여 제거하고, 우라실-N-글리코실라아제(uracil-N-glycosylase)를 이용해 패드록 프로브를 선형화시킨 이후에 프로브에 포함된 공통 프라이머 염기서열을 이용해서 중합효소 연쇄반응을 수행하고, GenFlex Tag Array(Affymetrix)에 혼성화시켜 단일염기다형성을 분석하는 방법이다(Hardenbol P. et al., Nat. Biotechnol., 21(6):673-678, 2003).
그러나, 이러한 방법들은 첫 번째 튜브에서 반응시킨 생성물의 일부를 두 번째 튜브로 옮겨 반응을 수행해야 하거나, 여러 종류의 효소를 이용하여야 하기 때문에 서로 다른 샘플들 간의 오염이 발생될 수 있으며, 실험 방법이 복잡한 문제점이 있다. 또한, 형광표지가 부착된 프로브의 개수만큼의 단일염기다형성만이 검출 가능하므로 분석하고자 하는 단일염기다형성의 개수가 증가할수록 분석 비용이 높아지는 문제가 있다.
점 돌연변이(point mutation)는 일반적으로 DNA 복제 중에 발생하는 것으로 알려져 있다. DNA 복제는 하나의 이중 가닥 DNA 분자가 두 개의 단일 가닥 DNA를 생성할 때 발생하며, 각 가닥은 상보적 가닥 생성을 위한 템플레이트로 사용된다. 단일 점 돌연변이는 전체 DNA 서열을 변화시킬수 있으며 하나의 퓨린(purine) 또는 피리미딘(pyrimidine)을 변경하면 뉴클레오티드가 코딩하는 아미노산이 변경될 수 있다.
점 돌연변이는 DNA를 복제하는 동안 자발적 돌연변이에서 발생할 수 있으며 돌연변이율은 그러한 원인에 의해 증가될 수 있다.
1959년 에른스트 프리즈 (Ernst Freese)는 "전이 (transitions)" 또는 "전환 (transversions)" 이라는 용어를 만들어 서로 다른 유형의 점 돌연변이를 분류하였다. 전이는 퓨린 염기를 다른 퓨린으로 대체하거나 피리미딘을 다른 피리미딘으로 대체하는 것이다. 전환은 퓨린을 피리미딘으로 또는 그 반대로 대체하는 것이다. 전이 (Alpha) 및 전환 (Beta)에 대한 돌연변이율에는 차이가 있으며 통상 전이 돌연변이는 전환보다 약 10 배 더 흔한 것으로 알려져 있다.
점 돌연변이에 대한 기능적 분류는 넌센스 돌연변이와 같이 stop-gain 및 start-loss처럼 단백질의 생성이 비정상적으로 단축되거나 추가되는 경우, 미스 센스 돌연변이의 경우와 같이 다른 아미노산을 코딩하는 경우(BRAF 유전자에서 발린(valine)을 글루탐산(glutamic acid)으로 변화시키는 경우, 이것은 암 세포에서 무제한 증식 신호를 일으키는 RAF 단백질의 활성화로 이어진다.), 침묵 돌연변이와 같이 동일한 아미노산을 코딩하는 경우가 있으며 통상적인 연구자에게 공지되어 있는 사항이다.
이러한 점 돌연변이는 특정 질병의 원인으로도 알려져 있다. 다중 종양 억제 단백질에서의 점 돌연변이는 암을 유발하며, 신경섬유종(Neurofibromatosis)은 Neurofibromin 1 또는 Neurofibromin 2 유전자의 점 돌연변이에 의해 발생한다. 낫 세포 빈혈(Sickle-cell anemia)은 헤모글로빈의 β-글로빈 사슬에서 점 돌연변이에 의해 야기되어, 6번째 위치에서 친수성 아미노산 글루탐산이 소수성 아미노산 발린으로 대체된다. 이 외에도 테이-삭스 병(Tay-Sachs disease)이나 색맹에서도 발견되고 있다.
이러한 점 돌연변이의 분석은 특히 암을 진단하고 치료제의 선택에 중요한 요소로 작용하고 있다. 동반진단의 경우 암 돌연변이에 따른 최적화된 항암제의 선택 또는 특정 항암제를 배제하는데 중요한 판단 근거로 활용되고 있으며, 최근 특정 돌연변이를 타겟으로 한 항암제의 개발은 지속적으로 증가하고 있다.
이러한 돌연변이의 분석 방법은 PCR, NGS, ddPCR 등을 통해 이루어지고 있으며 액체생검에 대한 중요도와 관심은 계속 증가하고 있어 보다 정밀한 측정 방법이 요구되고 있다. 그러나 현재 알려져 있는 방법은 충분한 분석능을 보유하고 있지 않거나 분석능을 충족하는 경우에는 고가의 별도의 장비와 복잡한 분석과정을 요구하고 있어 보다 간단하게 분석이 가능한 방법의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 SNP, 점 돌연변이(point mutation), miRNA의 이형체(isoform) 등 유전자 변형을 실시간으로 검출하는데 있어서 낮은 민감도와 특이도를 증가시켜 암을 간단하고 정확하게 진단할 수 있는 방법을 오랫동안 연구하여 오던 중, 본 발명자들의 단일핵산을 활용할 경우 높은 민감도 및 높은 특이성을 나타내어 암을 비롯하여 암과 같은 유전자 변형에 의한 다양한 질환 진단에 매우 유용함을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 i) X-Y-Z의 구조를 가지며, ii) 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, iii) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 상기 Y는 단일 표적 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA인 것을 특징으로 하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)인 경우에 상기 단일핵산은 (a) 상기 X는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (b) 상기 Z는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 또는 점돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)인 경우 (c) 상기 X는 10 내지 30개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (d) 상기 Z는 1 내지 5개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일핵산을 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계; b) 상기 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제조하는 단계; c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 단일핵산, 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 증폭된 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산(promer)을 제공한다.
상세하게는, 상기 단일핵산은 i) X-Y-Z의 구조를 가지며, ii) 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, iii) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 상기 Y는 단일 표적 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA로서 단일 표적 유전자와 혼성화시 절단 시약에 의해 절단된다.
이때, 상기 단일핵산은 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)인 경우에 상기 단일핵산(promer)은 (a) 상기 X는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (b) 상기 Z는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 하거나, 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 점돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)인 경우 (c) 상기 X는 10 내지 30개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, (d) 상기 Z는 1 내지 5개의 염기서열로 구성되는 DNA인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단일핵산은 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)인 경우에 단일 표적 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 X 및 Z도 단일 표적 유전자로부터 분리되어 프로브로 작동하는 것을 특징으로 하거나, 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 점돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)인 경우 단일 표적 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 Z는 단일 표적 유전자로부터 분리되지만 상기 X는 분리되지 않고 프라이머와 프로브로 동시 작동하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 단일핵산을 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계; b) 상기 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제조하는 단계; c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 단일핵산, 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 증폭된 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법은 종래 qPCR을 이용한 SNP 및 점 돌연변이(point mutation) 분석 방법과 비교하여 실시간 확인을 위한 별도의 위치의 프로브(probe)가 필요치 않아 SNP 및 점 돌연변이와 같은 유전적 변이를 보다 정확하게 측정할 수 있는 이점이 있다. 즉, 본 발명에 따른 단일핵산은 절단시약에 의해서만 절단되어 종래 프로브를 이용한 유전적 변이 검출 방법에 비해 보다 정확하게 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 단일핵산을 이용하여 SNP 및 점 돌연변이와 같은 유전적 변이 분석시, 용융온도(melting temperature) 분석과 같은 별도의 돌연변이 확인 과정 필요없이 바로 돌연변이의 구분이 가능하다.
따라서, 본 발명의 단일핵산(promer) 및 이를 이용한 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출 방법은 KRAS, EGFR 등에서 발생하는 다양한 점 돌연변이를 신속 정확하게 구분할 수 있어 암을 비롯한 다양한 질병의 진단, 치료제 선택 및 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산을 이용하여 ApoE 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 ApoE 단일핵산 1형(서열번호 3 내지 6)를 이용하여 ApoE 유전자 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4 구분이 가능함을 확인한 PCR 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 G13D 단일핵산 1형을 이용하여 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G13D 돌연변이 세포주인 HCT-15 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G13D 돌연변이 유전자 발현 여부를 G13D 단일핵산 1형(서열번호 7)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 KRAS 야생형 단일핵산을 이용하여 야생형 KRAS 유전자의 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 KRAS 야생형 세포주인 NCI-H1975 세포주의 gDNA를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 야생형 KRAS 유전자 발현 여부를 KRAS 야생형 단일핵산 1형(서열번호 8)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRAS 야생형 단일핵산 1형을 이용하여 야생형 KRAS 유전자의 발현 여부를 확인한 도이다. 상세하게는, HCT-15 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 야생형 KRAS 유전자 발현 여부를 KRAS 야생형 단일핵산 1형(서열번호 8)을 이용하여 확인한 PCR 결과로, HCT-15 세포주는 이형접합형(heterozygous type)의 유전자로 G13D 돌연변이와 KRAS 야생형의 유전자를 동시에 보유하고 있는 세포주임을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRAS 야생형 단일핵산 1형을 이용하여 야생형 KRAS 유전자와 혼합된 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 HCT-15 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 NCI-H1975 세포주의 게놈 DNA(gDNA) 농도 대비 10 내지 0.01%로 희석하고 이들 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 혼합한 후 G13D 단일핵산 1형(서열번호 7)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형를 이용하여 ApoE 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 ApoE 단일핵산 2형(서열번호 11 내지 14)을 이용하여 ApoE 유전자 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4 구분이 가능함을 확인한 PCR 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 KRAS 유전자의 G12V 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12V 돌연변이 세포주인 SW620 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12V 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12V 단일핵산 2형 (서열번호 15)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 KRAS 유전자의 G12C 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12C 돌연변이 세포주인 MIA-Paca2 세포주의 gDNA를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12C 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12C 단일핵산 2형(서열번호 16)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 KRAS 유전자의 G12S 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12S 돌연변이 세포주인 A549 세포주의 gDNA를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12S 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12S 단일핵산 2형(서열번호 17)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 EGFR 유전자 엑손 20의 T790M 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 T790M 돌연변이 세포주인 H1975 세포주와 야생형 세포주인 A549 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 T790M 돌연변이 유전자 발현 여부를 T790M 단일핵산 2형 (서열번호 24)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 let-7a miRNA 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 RT-PCR을 통해 let-7a miRNA로부터 합성하여 얻은 let-7a cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 let-7a miRNA 유전자 발현 여부를 let-7a 단일핵산 2형(서열번호 21)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 let-7d miRNA 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 RT-PCR을 통해 let-7d miRNA로부터 합성하여 얻은 let-7d cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 let-7d miRNA 유전자 발현 여부를 let-7d 단일핵산 2형(서열번호 24)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 let-7 miRNA 유전자 특이적 검출능을 확인한 도로, 상세하게는 let-7d cDNA(1pM 농도) 존재하에 let-7a cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 let-7a miRNA 유전자 발현 여부, 즉 let-7d cDNA 존재하에서의 let-7a miRNA 유전자에 대한 특이적 검출 여부를 let-7a 단일핵산 2형(서열번호 21)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 miRNA 34a 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 RT-PCR을 통해 miRNA 34a로부터 합성하여 얻은 miRNA 34a cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34a 유전자 발현 여부를 miRNA 34a 단일핵산 2형(서열번호 27)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 miRNA 34b 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 RT-PCR을 통해 miRNA 34b로부터 합성하여 얻은 miRNA 34b cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34b 유전자 발현 여부를 miRNA 34b 단일핵산 2형(서열번호 30)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 miRNA 34c 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 RT-PCR을 통해 miRNA 34c로부터 합성하여 얻은 miRNA 34c cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34c 유전자 발현 여부를 miRNA 34c 단일핵산 2형(서열번호 33)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 miRNA 34 유전자 특이적 검출능을 확인한 도로, 상세하게는 miRNA 34a cDNA(100pM 농도) 존재하에 miRNA 34c cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34c 유전자 발현 여부, 즉 miRNA 34a cDNA 존재하에서의 miRNA 34c 유전자에 대한 특이적 검출 여부를 miRNA 34c 단일핵산 2형(서열번호 33)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일핵산 2형을 이용하여 miRNA 34 유전자 특이적 검출능을 확인한 도로, 상세하게는 miRNA 34b cDNA(100pM 농도) 존재하에 miRNA 34c cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34c 유전자 발현 여부, 즉 miRNA 34b cDNA 존재하에서의 miRNA 34c 유전자에 대한 특이적 검출 여부를 miRNA 34c 단일핵산 2형(서열번호 33)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA올리고(DNAoligo)-DNA-RNA-돌연변이-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산 2형(G12D-R1DrMR2)을 이용하여 KRAS 유전자의 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12D 단일핵산 2형(서열번호 36)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 DNA올리고-RNA-DNA-돌연변이-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산 2형(G12D-R1rDMR2)을 이용하여 KRAS 유전자의 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12D 단일핵산 2형(서열번호 37)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 DNA올리고-DNA-돌연변이-RNA-DNA-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산 2형(G12D-R1DMrDR2)을 이용하여 KRAS 유전자의 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 확인한 도로, 상세하게는 G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12D 단일핵산 2형(서열번호 38)을 이용하여 확인한 PCR 결과이다.
본 발명은 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일염기다형성(SNP), 점 돌연변이 또는 miRNA 이형체(isoform)와 같은 유전적 변이가 포함된 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 단일핵산을 사용하여 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산은 i) X-Y-Z의 구조를 가지며, ii) 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, iii) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.
이때 부착되는 탐지 가능한 마커의 위치는 특정 부위에 국한하지 않으며, 절단 시약에 의해 Y 부위 절단 시 탐지 가능한 마커가 분리되는 위치라면 어느 곳이든 가능하다.
또한, 상기 단일핵산은 실시간 검출을 목적으로 하는 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합하여 복합체를 형성, 증폭시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산은 유전적 변이 검출 시 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP), 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 핵산을 의미한다. 여기서, 단일염기다형성(SNP)의 존재를 탐지하는 단일핵산은 “1형 단일핵산” 또는 “단일핵산 1형”으로 표현할 수 있으며, 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 또는 점 돌연변이 또는 miRNA 이형체의 존재를 탐지하는 단일핵산은 “2형 단일핵산” 또는 “단일핵산 2형”으로 표현할 수 있다. 상기 1형 단일핵산은 2형 단일핵산과 달리 프로브(probe)로 작동 가능하며, 2형 단일핵산은 1형 단일핵산과 달리 프라이머(primer)와 프로브(probe)로 동시에 사용 가능하다.
구체적으로, 1형 단일핵산이 단일 표적 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 X 및 Z도 단일 표적 유전자로부터 분리되어 프로브로 작동 가능하며, 2형 단일핵산이 단일 표적 유전자와 혼성화된 후 절단 시약에 의해 상기 Y가 절단되는 경우 상기 Z는 단일 표적 유전자로부터 분리되지만 상기 X는 분리되지 않고 프라이머와 프로브로 동시 작동하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 각각의 X, Y, 및 Z는 다양한 개수의 뉴클레오티드(nucleotide)를 가질 수 있다.
상기 Y는 단일 표적 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA이며, 절단 시약에 의해 절단되는 부위이다.
여기서, 절단 시약은 DNase, RNase, 헬리카제(helicase), 엑소뉴클리아제 및 엔도뉴클리아제 같은 효소효소를 매개로 한 절단이 이루어지는 것이 바람직하나, 기타 공지된 절단시약이 사용되어도 무방하다.
상기 X는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)의 존재를 탐지하는 경우 4 내지 20개, 바람직하게는 4 내지 19개, 보다 바람직하게는 4 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 5 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 17개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 16개, 가장 바람직하게는 6 내지 15개의 염기서열로 구성되는 DNA이다. 이에 따른 X는 1형 단일핵산에 속한다.
또한, 상기 X는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 또는 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 경우 10개 내지 30개, 바람직하게는 11개 내지 30개, 보다 바람직하게는 12 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 13 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 14 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 29개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 28개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 27개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 26개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 25개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 24개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 23개, 보다 더 바람직하게는 15 내지 22개, 보다 더 바람직하게는 15내지 21개, 가장 바람직하게는 15 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이다. 이에 따른 X는 2형 단일핵산에 속한다.
상기 Z는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)의 존재를 탐지하는 경우 4 내지 20개, 바람직하게는 4 내지 19개, 보다 바람직하게는 4 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 5 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 18개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 17개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 16개, 가장 바람직하게는 6 내지 15개의 염기서열로 구성되는 DNA이다. 이에 따른 Z는 1형 단일핵산에 속한다.
또한, 상기 Z는 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 경우 1 내지 5개, 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 바람직하게는 2 내지 4개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 3개로 구성되는 DNA이다. 이에 따른 Z는 2형 단일핵산에 속한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전적 변이 검출은 단일염기다형성(SNP), 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 것으로, 상술한 단일핵산으로서 X 및 Z를 구성하는 염기 개수에 따라 이들 각각의 유전적 변이 검출을 특이적이며 민감하게 탐지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, ApoE 단일핵산(서열번호 3 내지 6)을 이용하여 ApoE 유전자 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4 구분이 명확하게 가능함을 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 1).
본 발명의 일 실시예에 있어서, KRAS 유전자 G12V 돌연변이 세포주인 SW620 세포주의 게놈 DNA(gDNA)를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12V 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12V 단일핵산(서열번호 15)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 7).
본 발명의 일 실시예에 있어서, KRAS 유전자 G12C 돌연변이 세포주인 MIA-Paca2 세포주의 gDNA를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12C 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12C 단일핵산(서열번호 16)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 8).
본 발명의 일 실시예에 있어서, KRAS 유전자 G12S 돌연변이 세포주인 A549 세포주의 gDNA를 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12S 돌연변이 유전자 발현 여부를 G12S 단일핵산(서열번호 17)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 9).
본 발명의 일 실시예에 있어서, EGFR 유전자 엑손 20의 T790M 돌연변이 세포주인 H1975 세포주와 야생형 세포주인 A549 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 T790M 돌연변이 유전자 발현 여부를 T790M 단일핵산(서열번호 19)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 10).
본 발명의 일 실시예에 있어서, let-7a cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 let-7a miRNA 유전자 발현 여부를 let-7a 단일핵산(서열번호 21)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 11).
본 발명의 일 실시예에 있어서, let-7d cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 let-7d miRNA 유전자 발현 여부를 let-7d 단일핵산(서열번호 24)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 12).
본 발명의 일 실시예에 있어서, 1pM 농도의 let-7d cDNA 2㎕에 1/10씩 100fM에서 1aM 농도까지 희석한 let-7a cDNA 2㎕씩 첨가한 실험군에서 100fM에서 1fM 농도까지 let-7a cDNA를 탐지할 수 있음을 확인하였다 (도 13).
본 발명의 일 실시예에 있어서, miRNA 34a cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34a 유전자 발현 여부를 miRNA 34a 단일핵산(서열번호 27)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 14).
본 발명의 일 실시예에 있어서, miRNA 34b cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34b 유전자 발현 여부를 miRNA 34b 단일핵산(서열번호 30)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 15).
본 발명의 일 실시예에 있어서, miRNA 34c cDNA를 농도별로 희석한 후 cDNA 농도에 따른 miRNA 34c 유전자 발현 여부를 miRNA 34c 단일핵산(서열번호 33)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 16).
본 발명의 일 실시예에 있어서, miRNA 34a cDNA 또는 miRNA 34b cDNA에 miRNA 34c cDNA가 농도별로 희석한 후 miRNA 34c 단일핵산(서열번호 33)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 miRNA 34c 유전자 발현 여부를 미세농도에서도 확인할 수 있었다 (도 17 및 18).
본 발명에 있어서, 상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 탐지 가능한 마커로 형광쌍을 사용하는 경우, 형광물질과 소광물질의 위치는 X 또는 Z에 위치한 형태이거나 Y 부위에 위치할 수 있으며, 그 어느 것에 한정되는 것은 아니다. 하나의 예로서, 형광물질은 X에 위치하고 소광물질은 Y 또는 Z에 위치할 수 있다.
본 발명의 단일핵산은 단일 표적 유전자의 유전적 변이로서 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 검출하는데 있어서, i) 핵산 중 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 RT 프라이머; ii) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머; iii) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 역방향 프라이머; iv) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머; 또는 v) 검출하고자 하는 핵산(DNA 또는 RNA)을 실시간으로 확인하기 위한 프로브로 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 단일핵산을 RNA(miRNA 등 포함)를 cDNA로 합성 및 증폭하기 위한 RT 프라이머; 또는 정방향 프라이머와 프로브; 또는 역방향 프라이머와 프로브로 사용하는 경우에, cDNA 합성시 RT 프라이머를 루프형태로 제작하거나 폴리 A를 형성하는 과정이 필요하지 않고 검출하고자 하는 RNA와 혼성화되어 cDNA를 합성하고 탐지하고자 하는 RNA(miRNA 등 포함)를 증폭 및 실시간 검출할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일핵산을 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 단일핵산을 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 검출하기 위한 키트로 사용하는 경우, 상기 키트는 본 발명의 단일핵산 이외에 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소는 단일핵산의 Y 부위를 특이적으로 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 예를 들어 Y 부위가 DNA인 경우 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소 등을 사용하는 것이 바람직하며, Y 부위가 RNA인 경우 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2 등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 단일핵산을 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 검출하기 위한 키트로 사용하는 경우, 상기 키트는 본 발명의 단일핵산 및 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소 이외에 DNA의 증폭반응에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 증폭반응에 필요한 시약은 예를 들어, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermusaquatiucs(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcusliteralis 또는 Phyrococcusfuriosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg2+), 완충용액, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH2O)을 들 수 있다. 또한, 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등이 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계; b) 상술한 단일핵산을 제조하는 단계; c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 단일핵산, 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및 d) 상기 단계 c)에서 증폭된 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단일 표적 유전자의 유전적 변이를 실시간으로 검출하는 방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산은 시료로부터 검출하고자 하는 RNA 또는 DNA이거나, 상기 RNA를 역전사 중합효소로 증폭하여 얻은 cDNA일 수 있다.
상기 시료는 생물학적 시료이거나, 생물학적 시료로부터 분리된 RNA, DNA 또는 이들의 단편일 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 혈액, 타액, 뇨, 분변, 조직, 세포 및 생검 표본으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 또는 보관된 생물학적 시료로부터 분리된 RNA, DNA 또는 이들의 단편일 수 있다. 그러나, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.
상기 보관된 생물학적 시료는 당업계에 통상적으로 알려진 보관방법으로 1주일 이상, 1년 이상, 예를 들면 1년 내지 10년 동안 보관되거나, 냉동 보관, 또는 포르말린으로 고정된 조직을 상온에서 보관한 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 시료로부터 RNA 또는 DNA의 추출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다.
b) 상기 단일핵산을 제조하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 단일핵산은 전술한 바와 같으며, 상세하게는 i) X-Y-Z의 구조를 가지며, ii) 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고, iii) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
c) 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체의 증폭은 상기 수득한 표적 핵산, 상기 제조한 단일핵산, 상기 수득한 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 절단시약은 효소를 매개로 한 절단이 이루어지는 것이 바람직하나, 기타 공지된 절단시약이 사용되어도 무방하다. 이때, DNase, RNase, 헬리카제(helicase), 엑소뉴클리아제 및 엔도뉴클리아제 같은 효소들에 의해 촉매되는 RNA 또는 DNA의 절단을 표시하기 위하여, "효소매개 절단(enzyme-mediated cleavage)"이라는 용어를 사용한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 혼성화된 프로브의 닉(nick) 생성 및 절단은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제인 리보뉴클리아제에 의해서 수행되는 것이 보다 바람직하다. 리보뉴클리아제는 이중 가닥 DNA-RNA 혼성화 가닥으로부터 리보 핵산(ribonucleic acid)에서 닉을 생성하고 절단시키는 이중 가닥 리보뉴클리아제인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 절단시약은 이에 제한되지는 않으나, RNaseH, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ 또는 RNase T2의 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase)일 수 있다.
d) 상기 증폭된 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 단일핵산 단편의 양 측정은 다양한 검출방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따라 분리된 단일핵산의 단편은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정되는 것이 바람직하며, 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정으로 이루어질 수 있다.
상기 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정은 당업계에 공지된 형광 표지자 검출이 가능한 모든 측정 장치를 이용할 수 있으며, 예를 들어 트라이애드 멀티모드 디텍터(TRIAD Multimode Detector), 활락/빅터 형광(Wallac/Victor fluorescence) 또는 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer), LightCycler96, Applied Biosystems 7500, 또는 Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler 등을 이용하여 이루어질 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 따라 절단된 단일핵산 단편의 양 측정과 검출방법은 단일핵산 또는 반응액 내로 유입된 표지 또는 탐지 가능한 마커의 종류에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 단일핵산은 Y 부위가 절단된 후 증폭하는 단계에 의해 Y 부위의 유전적 변이 구별을 용이하게 하므로, 이후의 핵산 증폭 반응을 통해 돌연변이 확인을 가능하게 한다. 즉, 본 발명의 단일핵산에서 Y 부위와 표적 핵산의 유전적 변이 부위에 혼성화를 형성하도록 하였을 경우, Y 부위가 유전적 변이 부위와 정확하게 상보적인 결합을 한 경우에만 절단되고 이후에 증폭 반응이 수행되기 때문에 유전적 변이 여부를 명확하게 확인할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단일핵산에서 Y 부위와 표적 핵산의 유전적 변이 부위가 혼성화를 형성하도록 하였음에도 Y 부위가 상보적인 결합을 하지 않은 경우라면 Y 부위가 절단되지 않으므로 증폭 반응이 일어나지 않으며, 이는 표적 핵산에 측정하고자 하는 유전적 변이가 없음을 의미하게 된다. 이와 반대로, 본 발명의 단일핵산에서 Y 부위를 표적 핵산의 유전적 변이가 발생하는 부위의 비 돌연변이인 경우와 혼성화를 형성하도록 하였음에도 Y 부위가 상보적인 결합을 하지 않은 경우라면 Y 부위가 절단되지 않으므로 증폭 반응이 일어나지 않으며, 이는 표적 핵산에 유전적 변이가 있음을 의미하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 유전적 변이 검출은 단일염기다형성(SNP), 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 것을 의미한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 DNA올리고(DNAoligo)-DNA-RNA-돌연변이-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산(G12D-R1DrMR2; 서열번호 36)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 19).
본 발명의 일실시예에 있어서, G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 DNA올리고-RNA-DNA-돌연변이-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산(G12D-R1rDMR2; 서열번호 37)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 20).
본 발명의 일실시예에 있어서, G12D 돌연변이 세포주인 Aspc-1 세포주와 KRAS 야생형 세포주인 HT-29 세포주의 gDNA를 각각 농도별로 희석한 후 gDNA 농도에 따른 G12D 돌연변이 유전자 발현 여부를 DNA올리고-DNA-돌연변이-RNA-DNA-DNA올리고 유형의 KRAS 유전자 G12D의 단일핵산(G12D-R1DMrDR2; 서열번호 38)을 이용하여 실시간 PCR을 통해 확인하였다 (도 21).
본 발명에 쉽게 이용할 수 있는 신장반응, 즉 핵산 증폭반응은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 즉, 상기 표적 핵산의 증폭은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA), 핵산가닥 전치 증폭(strand displacement amplification; SDA) 또는 핵산서열기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)을 포함하지만 상기 방법에 국한되지 아니한다. 상기 핵산 증폭 산물은 DNA 또는 RNA이다.
일반적으로, 표적 핵산의 증폭 및 상기에서 기술한 단일핵산의 절단에 의한 탐지를 동시에 가능하도록, 반응 혼합액에 표적 핵산, 단일핵산, 핵산 증폭 반응의 구성물 및 절단 효소가 포함된다. 각 증폭반응은 완충액 조건, 프라이머, 반응온도 및 단일핵산 절단 조건 등을 각각 개별적으로 최적화시키는 것이 필요하다. 핵산 증폭반응과 연계하여 본 발명의 검출방법을 사용하면 표적 핵산을 탐지하는 민감도와 속도가 현저하게 개선될 것이다.
한편, 본 발명의 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 단일핵산이 암과 관련된 KRAS, EGFR 등의 점 돌연변이의 유전자를 신속 정확하게 검출 및 탐지할 수 있음을 확인한 바, 상기 단일핵산은 암 진단용 키트 또는 암 진단용 조성물에 적용가능하며, 실시간 암 진단을 수행하여 암 발생 여부에 대한 정보를 제공하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 1형 단일핵산을 이용한 ApoE 분석
1형 단일핵산을 아포리포단백질 E(Apolipoprotein E, ApoE) 유전자의 6종의 표현형 E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4를 분석하는데 이용하였다.
인간 염색체 19번에 위치한 ApoE 유전자는 심혈관계 및 알츠하이머 질병과 관련된 유전자이다. ApoE 유전자는 코돈(codon) 112(cys/arg), 코돈 158(cys/arg)의 DNA의 단일염기다형성(SNP)[게놈 DNA 위치 586(T/C), 724(T/C)번째]에 의해 세 가지의 대립 유전자 이형체(isoform)인 ApoEε2, ApoEε3, ApoEε4를 가지게 되며, 이 대립 유전자의 조합에 의해 6종의 표현형(E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, E3/E4)을 갖게 된다. 상기 ApoE 유전자의 각 6종의 표현형을 구분하기 위하여, 5'-말단을 각각의 형광 염료(dye)가 부착된 4종의 개선된 형태의 1형 단일핵산을 이용하여 4-plex로 분석이 가능하도록 하였다. 기존의 분석법에서는 통상적으로 4-plex에 의한 분석법의 민감도 및 특이도를 충족시키기 쉽지 않았으나, 본 발명에서는 이에 대하여 충족할 만한 결과를 보여주었다.
상세하게는 ApoE 유전자의 코돈 112 및 코돈 158의 대립 유전자형에 대한 SNP 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 1형 단일핵산과 프라이머(primer)를 하기 표 1과 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다. 여기서 1형 단일핵산의 경우 X-Y-Z의 구조를 가지는 프로브로서 5'-말단에는 각각 6-FAM, HEX, TexasRed, Cy5를, 그리고 각 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
ApoE 특이적 프라이머 세트 및 4종의 ApoE 단일핵산
프라이머명 또는 프로브명 서열 서열번호
ApoE_F 프라이머 5'-GAAGGCCTACAAATCGGAACT-3' 1
ApoE_R 프라이머 5'-GCCACCTGCTCCTTCAC-3' 2
ApoE 단일핵산 1 56-FAM/-GAGGACGTGrUGCGGCC-/3IABkFQ 3
ApoE 단일핵산 2 5-HEX/-GAGGACGTGrCGCGGCC-/3IABkFQ 4
ApoE 단일핵산 3 5-TexRd/-CTGCAGAAGrUGCCTGGCA-/3IABkFQ 5
ApoE 단일핵산 4 5-Cy5/-GCAGAAGrCGCCTGGCA-/3IABkFQ 6
분석을 위하여 한국세포주은행으로부터 인간 세포주 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 분양받았고, 이로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 수득하였다. 6종의 표현형에 대한 분석을 위하여, 동형 표현형은 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 사용하였고, 이형 표현형은 각 게놈 DNA의 혼합형인 PC3+A549(E2/E3), PC3+U937(E2/E4), A549+U937(E3/E4)을 고농도로 반응당 32ng (약 104 카피(copy))으로 포함되도록 하여 분석에 사용하였다.
상기 표 1의 ApoE 단일핵산 1, 2, 3, 4 각각의 0.2μM, 0.15μM, 0.15μM, 및 0.075μM과, ApoE 정방향 및 역방향 프라이머 각각의 0.35μM의 최종농도 존재하에서, 상기 정량한 게놈 DNA, 0.5U RNase-H, AptaTaq DNA Master(Roche) 4㎕, GC rich solution(Roche) 3㎕, nuclease-free water로 총 부피(total volume)가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 15초, 65℃에서 70초로 45 사이클(cycle)을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 한 개의 반응 웰(well)에서 ApoE 각 대립 유전자의 조합 6종에 대한 분석이 가능한 것을 확인하였다. 이 결과에서 선천적 돌연변이(mutation)와 같이 전체 또는 절반만 돌연변이(mutation)된 경우 개선된 프로브(probe) 형태를 사용할 경우 구분능이 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 1형 단일핵산을 이용한 KRAS 돌연변이 분석
실시예 2-1: 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 실시간 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 분석
본 발명에 따른 1형 단일핵산을 이용하여 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이(mutant) 여부를 측정하고자, IDT에 의뢰하여 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 단일핵산(1형), KRAS 야생형(wild type) 단일핵산(1형), KRAS 유전자의 G13D 돌연변이의 정방향 및 역방향 프라이머를 하기 표 2와 같이 제조하였다. 이때, 제조된 단일핵산의 경우 5'-말단에는 HEX, FAM을, 그리고 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오타이드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 및 야생형 단일핵산과 G13D 돌연변이 특이적 프라이머 세트
프라이머명 또는 프로브명 서열 서열번호
G13D 단일핵산 HEX/-AGCTGGTGrACGTAGGC-/3IABkFQ 7
야생형 단일핵산 FAM/-AGCTGGTGrGCGTAGGC-/3IABkFQ 8
G13D_F 프라이머 5'-CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACT-3' 9
G13D_R 프라이머 5'-TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAG-3' 10
측정하고자 하는 KRAS 유전자는 일정 기간 동안 배양한 HCT-15 세포주와 NCI-H1975 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA(total genomic DNA)에서 검출하였다. 총 게놈 DNA는 PureLink Genomic DNA Mini Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat No. K1820-00)를 사용하여 각 세포주의 5×106 세포에서 추출하였으며, NanoDrop One(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 정량하였다. 정량한 총 게놈 DNA는 15ng/㎕로 희석하고, 1/10씩 계단 희석(serial dilution)을 진행하여 15ng/㎕~1.5pg/㎕ 농도의 게놈 DNA 2㎕씩 사용하였다. HCT-15 세포주는 G13D 돌연변이 세포주이며, NCI-H1975는 KRAS 야생형 세포주로 알려져 있다.
이후, 상기 제조한 서열번호 7의 10uM 농도의 G13D 단일핵산 0.3㎕를 준비하고, 서열번호 9 및 10의 10uM 농도의 프라이머들은 각각 0.5㎕씩 준비하였다. 여기에 0.5U RNase-H, AptaTaq DNA Master(Roche) 4㎕, NCI-H1975 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 30ng에 HCT-15 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 30ng, 3ng, 300pg, 30pg을 각각 첨가한 후 3차 증류수로 총 부피가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reation)을 수행하여 G13D 돌연변이(mutant)를 측정하였다. 이때, 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 10초, 64℃에서 60초를 40 사이클 수행하였고, 사이클마다 실시간으로 시그널(HEX)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
실시예 2-2: 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 실시간 KRAS 유전자의 야생형 분석
상기 실시예 2-1과 같은 조건으로 서열번호 8의 KRAS 유전자 야생형 단일핵산과 서열번호 9 및 10의 프라이머를 NCI-H1975 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 30ng, 3ng, 300pg, 30pg과 HCT-15 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 30ng, 3ng, 300pg, 30pg을 각각 첨가한 후 KRAS 야생형 유전자를 측정하였다. 이때의 결과는 도 3에 나타내었다. HCT-15 세포주는 이형접합형(heterozygous type)의 유전자로 G13D 돌연변이(도 2의 결과 참조)와 KRAS 야생형의 유전자를 동시에 보유하고 있는 세포주로 야생형을 절반만 가지고 있을 경우에도 도 4와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 2-3: 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 실시간 KRAS 유전자의 야생형과 혼합된 G13D 돌연변이 분석
측정하고자 하는 KRAS 유전자는 일정 기간 동안 배양한 HCT-15 세포주와 NCI-H1975 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA(total genomic DNA)에서 검출하였다. 총 게놈 DNA는 PureLink Genomic DNA Mini Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat No. K1820-00)를 사용하여 각 세포주의 5X106 세포에서 추출하였으며, NanoDrop One(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 정량하였다. 정량한 NCI-H1975 DNA는 30ng/ul로 희석하고, HCT-15 DNA는 30ng/ul로 희석한 후, 1/10씩 계단 희석(serial dilution)을 진행하여 3ng/㎕~3pg/㎕ 농도의 NCI-H1975 게놈 DNA 및 HCT-15 게놈 DNA를 수득하였다. 그 후 각각의 게놈 DNA 2㎕씩 혼합하여 HCT-15의 농도가 NCI-H1975 농도 대비 10~0.01%로 만들어 실험에 사용하였다. HCT-15 세포주는 G13D 돌연변이 세포주이며, NCI-H1975는 KRAS 야생형 세포주로 알려져 있다.
이후, 상기 제조한 서열번호 7의 10uM 농도의 G13D 단일핵산 0.3㎕를 사용하고, 서열번호 9 및 10의 10uM 농도의 프라이머들은 각각 0.5㎕씩 준비하였다. 여기에 0.5U RNase-H, AptaTaq DNA Master(Roche) 4㎕, 10~0.01%로 희석한 DNA를 각각 첨가한 후 3차 증류수로 총 부피(total volume)가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reation)을 수행하여 G13D 돌연변이(mutant)를 측정하였다. 이때 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 10초, 64℃에서 60초를 40 사이클 수행하였고 사이클마다 실시간으로 시그널(HEX)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 2 내지 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, G13D 단일핵산(1형)을 이용하여 G13D 돌연변이 검출 반응시 NCI-H1975 야생형 게놈 DNA와의 교차반응이 일어나지 않아 특이성은 우수하나, HCT-15 게놈 DNA 600pg 이하에서는 부정확하게 검출되었는바, 야생형과 점 돌연변이(point mutation) 유전자가 포함된 분석의 경우 점 돌연변이(point mutation) 유전자가 10% 미만으로 포함된 분석은 어려움이 있음이 확인되었다.
실시예 3: 2형 단일핵산을 이용한 ApoE 분석
ApoE 유전자의 코돈(codon) 112 및 코돈 158의 대립 유전자형에 대한 SNP 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 사용하였다. 하기 표 3과 같이, IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 2형 단일핵산을 제조하였다.
여기서, 2형 단일핵산의 경우 X-Y-Z의 구조를 가지는 프라이머 및 프로브로서, 5'-말단에는 각각 FAM, HEX, TexasRed를, 그리고 각 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
4종의 ApoE 단일핵산(2형)
단일핵산명 서열 서열번호
ApoE 단일핵산 1 56-FAM/-CGGTCATGGAGGACGTGrUGC-/3IABkFQ 11
ApoE 단일핵산 2 5TexRd-XN/-GCGGATATGGAGGACGTrGCG-/3IABkFQ 12
ApoE 단일핵산 3 56-FAM/-CTGGTACACTGCCAGGCArCTT-/3IABkFQ 13
ApoE 단일핵산 4 5HEX/-CTGGTACACTGCCAGGCrGATTC-/3IABkFQ 14
분석을 위하여 한국세포주은행으로부터 인간 세포주 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 분양받았고, 이로부터 게놈 DNA를 수득하였다. 6종의 표현형에 대한 분석을 위하여, 동형 표현형은 PC3(E2/E2), A549(E3/E3), U937(E4/E4)을 사용하였고, 이형 표현형은 각 게놈 DNA의 혼합형인 PC3+A549(E2/E3), PC3+U937(E2/E4), A549+U937(E3/E4)을 고농도로 반응당 32ng(약 104 카피)으로 포함되도록 하여 분석에 사용하였다.
상기 표 3의 ApoE 단일핵산 1, 2, 3, 4 각각의 0.375μM, 0.1μM, 0.25μM, 및 0.25μM의 최종농도 존재하에서, 상기 게놈 DNA와 0.1ng의 내열성 RNase H, 그리고 AptaTaq DNA Master w/o MgCl2(Roche) 4㎕, GC rich solution(Roche) 4㎕, 2.75mM MgCl2, 62.5nM Low ROX에 nuclease-free water로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 64℃에서 55초로 40 사이클을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 ApoE 각 대립 유전자의 조합 6종에 대한 분석에서, 코돈 112의 586T 변이와 코돈 158의 724T 변이의 경우 형광 염료 차이에 의한 분석이 아닌 동일 형광 염료에 의한 종료점(end point) 형광 값의 차이로 구분이 가능한 제한점이 있었다. 이러한 제한점에 의해 각 DNA 샘플의 농도에 따라 결과 판독에 문제를 줄 여지가 있다. 이는, 선천적인 돌연변이인 ApoE의 경우, 실시예 １에서 보여준 바와 같이 2형 단일핵산을 이용하는 것보다 1형 단일핵산을 이용하는 것이 분석을 위해 더 용이함을 보여준다.
실시예 4: 2형 단일핵산을 이용한 KRAS 돌연변이 분석
실시예 4-1: 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 실시간 G12V, G12C, G12S 돌연변이 분석
2형 단일핵산을 이용하여 KRAS 유전자의 12 코돈 돌연변이 3종(G12V, G12C, G12S)의 돌연변이(mutant) 여부를 측정하였다. IDT에 의뢰하여 본 발명에 따른 단일핵산과 Uni-역방향 프라이머(Uni-reverse primer)를 하기 표 4와 같이 제조하였다. 단일핵산의 경우 5'-말단에는 HEX, FAM, Cy5를, 그리고 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오타이드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
KRAS 돌연변이 분석에 이용한 단일핵산 및 프라이머
단일핵산명 또는 프라이머명 서열 서열번호
G12V 단일핵산 HEX/-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGrUTG-/3IABkFQ 15
G12C 단일핵산 Cy5/-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTrUGT-/3IABkFQ 16
G12S 단일핵산 FAM/-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTrAGT-/3IABkFQ 17
Uni-역방향 프라이머 5'-CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG-3' 18
상기 합성한 단일핵산을 이용하여 KRAS 점 돌연변이(point mutation) 검출능을 확인하기 위해 각각 야생형 세포주 및 돌연변이 세포주를 배양하고 총 게놈 DNA는 PureLink Genomic DNA Mini Kit(Thermo Fisher Scientific, Cat No. K1820-00)를 사용하여 각 세포주의 5×106 세포에서 추출하였다. 한편, NanoDrop One(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 정량한 후 템플레이트(template)로 사용하였다. 사용한 세포주는 하기 표 5와 같다.
KRAS 유전자의 12코돈 돌연변이 3종(G12V, G12C, G12S)의 돌연변이 세포주
돌연변이 세포주 세포주명 타입
G12V 돌연변이 세포주 SW620 동형접합형(homozygous)
G12C 돌연변이 세포주 MIA-Paca2 동형접합형
G12S 돌연변이 세포주 A549 동형접합형
이후, 상기 제조한 서열번호 15의 G12V 단일핵산과 서열번호 18의 프라이머는 10uM 농도 0.5㎕를 사용하고, 5× AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 3.6㎕와 내열성 RNase H 0.2㎕에 Colo201 (KRAS 야생형 세포주) 30ng과 SW620(G12V 돌연변이) 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 3ng, 300pg, 30pg, 3pg을 각각 첨가한 후 3차 증류수로 총 부피가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 G12V 돌연변이를 측정하였다. 이때, 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 15초, 66℃에서 30초를 4 사이클 수행하여 1차 PCR 반응을 수행한 후, 85℃에서 15초, 64℃에서 40초를 40 사이클 수행하여 2차 PCR 반응을 수행하였고, 각 사이클마다 실시간으로 시그널(HEX)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.
또한, 상기 제조한 서열번호 16의 G12C 단일핵산과 서열번호 18의 프라이머는 10uM 농도 0.5㎕를 사용하고, 5X AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 2.8㎕와 5X Apta Fast buffer 1.2㎕, 1U/㎕의 내열성 RNase H 0.4㎕, 25mM MgCl2 0.5㎕에 Colo201(KRAS 야생형 세포주) 70ng과 MIA-Paca2(G12C 돌연변이) 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 7ng, 700pg, 70pg, 7pg을 각각 첨가하고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응을 수행하여 G12C 돌연변이를 측정하였다. 이때 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 10초, 64℃에서 60초를 40 사이클 수행하였고, 각 사이클마다 실시간으로 시그널(Cy5)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.
또한, 상기 제조한 서열번호 17의 G12S 단일핵산과 서열번호 18의 프라이머는 10uM 농도 0.5㎕를 사용하고, 5X AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 3.6㎕와 10ng/㎕의 내열성 RNase H 0.2㎕에, Colo201(KRAS 야생형 세포주) 30ng과 A549(G12S 돌연변이) 세포주에서 추출한 총 게놈 DNA 3ng, 300pg, 30pg, 7pg을 각각 첨가하고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reation)을 수행하여 G12S 돌연변이를 측정하였다. 이때 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 10초, 64℃에서 60초를 40 사이클 수행하였고, 각 사이클마다 실시간으로 시그널(FAM)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
상기 도 7 내지 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 단일핵산은 돌연변이(point mutation) 유전자가 0.01% 미만으로 포함된 경우에도 우수한 특이성 및 민감도로 돌연변이 유전자를 분석할 수 있었다.
실시예 5: 2형 단일핵산을 이용한 EGFR 돌연변이 분석 방법
EGFR(Epidermal growth factor receptor)은 비소세포폐암에서 과발현되어 EGFR 타이로신 키나아제(tyrosine kinase; TKI)의 표적이 된다. 이 EGFR 유전자의 엑손(Exon) 18, 19, 20, 21에 해당하는 타이로신 키나아제 도메인(tyrosine kinase domain)에 발생되는 돌연변이를 분석함으로써 비소세포암 환자의 치료제에 대한 약제 반응성을 예측할 수 있기 때문에, 돌연변이 분석이 환자의 약제 처방과 치료에 도움이 된다. 이 중 가장 사용 빈도가 높은 T790M(C2369T) 돌연변이에 대하여 돌연변이 여부를 분석하였다.
본 발명에 따른 2형 단일핵산 및 프라이머(primer)를 하기 표 6과 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다. 여기서, T790M 단일핵산의 경우 5'-말단에는 FAM을, 그리고 3'-말단에는 IABkFQ를 부착하였다. 한편, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
EGFR 돌연변이 분석에 이용한 단일핵산 및 프라이머
단일핵산 또는 프라이머명 서열 서열번호
T790M 단일핵산 56-FAM/-CCGTGCAGCTCATCArUGC-/3IABkFQ 19
T790M 프라이머 5'-CCTTGTGTTAAAGGACATAGTCCAG-3' 20
분석을 위하여 T790M 돌연변이 세포주인 H1975와 야생형 세포주인 A549로부터 게놈 DNA를 수득하였다. H1975 및 A549 게놈 DNA는 30ng(약 1×104 카피)로 정량 후 10배씩 희석하여 사용하였다.
상기 표 6의 T790M 단일핵산 0.25μM, T790M 프라이머를 0.25μM의 최종농도 존재하에서, 상기 게놈 DNA, 0.5unit의 내열성 RNase H, 5× AptaTaq DNA Master(Roche) 3.6㎕에 nuclease-free water로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 64℃에서 60초로 45 사이클을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.
그 결과, 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 EGFR 돌연변이 분석에서, 각각의 돌연변이형을 야생형과 비교하였을 때, 0.1% 이하까지 구분이 가능함을 확인하였다. 이는 전술한 바와 같이, 암(cancer)의 점 돌연변이(point mutation)와 같은 후성적인 돌연변이의 경우에는 2형 단일핵산을 이용하여 탐지하는 것이 유리함을 확인하였다.
실시예 6: 2형 단일핵산을 이용한 let-7 miRNA 및 miRNA 34 이형체 분석
실시예 6-1: 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 실시간 let-7 miRNA 분석
let-7 miRNA는 miRNA 중에서 가장 많은 이형체(isoform)가 존재하는 것으로 알려져 있다. 이러한 let-7의 이형체를 구별하는 것은 상당히 어려운 분석으로 알려져 있으며 통상 1% 미만의 특이도의 구별은 특히 어려운 것으로 알려져 있다. 본 실험은 그 중에서도 let-7a(5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU)와 let-7d(5'-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU)의 유전자 발현 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 2형 단일핵산과 프라이머(primer), RT-프라이머를 하기 표 7과 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다. 또한, 정확한 정량을 위하여 상기 let-7의 miRNA를 IDT에 의뢰하여 제조하였다. 여기서, 단일핵산의 경우 5'-말단에는 FAM(fluorescein succinimidyl ester)을, 그리고 3'-말단에는 3IABkFG를 부착하였다. 한편, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
let-7 miRNA 이형체 구별에 이용한 단일핵산 및 프라이머
단일핵산 또는 프라이머명 서열 서열번호
let-7a 단일핵산 FAM/-GCTGCTTGAGGTAGTAGGTTGrUAT-/3IABkFQ 21
let-7a R 프라이머 5'-GCCGCTGAGGTAGTAGGT-3' 22
let-7a RT 프라이머 5'-GCTAACGTCTGTACTTCGTCA(TTT)nAACT-3' 23
let-7d 단일핵산 FAM/-GCTGCTAGAGGTAGTAGGTTGrCAT-/3IABkFQ 24
let-7d R 프라이머 5'-GCCGCTGAGGTAGTAGGT-3' 25
let-7d RT 프라이머 5'-GCTAACGTCTGTACTTCGTCA(TTT)nAACT-3' 26
합성한 각각의 20pM 농도의 miRNA 1㎕와 Ambion사의 poly-(A) tailing kit와 Roche사의 Nxtscript RT kit (총 20㎕)를 이용하여 45℃에서 상기 표 7의 각각의 RT 프라이머 10μM 농도의 1㎕ 존재하에 30분간 반응하여 cDNA를 합성하였다.
상기 합성한 cDNA를 100fM에서 1aM농도까지 희석하였다.
상기 표 7의 단일핵산 및 프라이머가 각각 10μM 농도의 0.5㎕ 존재하에서, 상기 합성한 후 희석한 각각의 cDNA 2㎕, 1U 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche사 제조) 4㎕를 넣고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 63~64℃에서 60초, 95℃에서 10초였으며 45 사이클을 수행하였다. 이에 관한 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.
그 결과, miRNA 1aM 농도의 희석한 cDNA 2㎕(약 1 카피)만을 사용하여 각각의 miRNA 분석이 가능한 것을 확인하였다.
실시예 6-2: 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 실시간 let-7 miRNA 특이도 검출
상기 표 7의 단일핵산 및 프라이머가 각각 10μM 농도 0.5㎕ 존재하에, 1pM 농도의 let-7d cDNA 2㎕에 1/10씩 100fM에서 1aM 농도까지 희석한 let-7a cDNA 2㎕ 첨가하고, 1U 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche사 제조) 4㎕를 넣고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 63~64℃에서 60초, 95℃에서 10초였으며 45 사이클을 수행하였다. 이에 관한 결과를 도 13에 나타내었다.
그 결과, 1pM 농도의 let-7d cDNA 2㎕에 1/10씩 100fM에서 1aM 농도까지 희석한 let-7a cDNA 2㎕씩 첨가한 실험군에서 100fM에서 1fM 농도까지는 안정적으로 분석할 수 있음을 확인하였다. 이는 이형체(isoform)의 miRNA를 0.1%까지 특이도를 유지하면서 분석 가능함을 보여준다.
실시예 6-3: 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 실시간 miRNA 34a, miRNA 34b 및 miRNA 34c 분석
miRNA 34는 3종류의 이형체(isoform)가 존재하는데 이들 이형체를 구별하는 것이 상당히 어려운 것으로 알려져 있다. 본 실시예에서는 miRNA 34a, miRNA 34b, 및 miRNA 34c의 유전자 발현 여부를 측정하기 위해 표 8과 같이 IDT에 의뢰하여 단일핵산과 프라이머, RT-프라이머를 합성 및 제조하였다. 단일핵산의 경우 5'-말단에는 FAM(fluorescein succinimidyl ester) 및 HEX(hexachloro-fluorescein)을, 그리고 3'-말단에는 3IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와 구별하기 위해 첨자 "r"로 표시하였다.
miRNA 34a, miRNA 34b, 및 miRNA 34c 분석에 이용한 단일핵산 및 프라이머
단일핵산 또는 프라이머명 서열 서열번호
miRNA 34a 단일핵산 56FAM/-TTGGCAGTGTCTTAGCTGrGTT-/3IABkFQ 27
miRNA 34a 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTAC-3' 28
miRNA 34a RT 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTAC-3' 29
miRNA 34b 단일핵산 5HEX/-GTCTAGGCAGTGTCATTAGCTGrATT-/3IABkFQ 30
miRNA 34b 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTC-3' 31
miRNA 34b RT 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTC-3' 32
miRNA 34c 단일핵산 56FAM/-CCAGGCAGTGTAGTTAGCTGrATT-/3IABkFQ 33
miRNA 34c 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTGC-3' 34
miRNA 34c RT 프라이머 5'-GTCTCGACGTTCTTTTTTTTTTTTGC-3' 35
각각의 miRNA는 Invitrogen사의 poly-(A) tailing kit와 Roche사의 Nxtscript RT kit (총 20㎕)를 이용하여 40℃에서 RT 프라이머 10μM 농도의 1㎕ 존재하에서, 60분간 반응하여 cDNA를 합성하였고, 합성한 cDNA를 1pM에서 1aM농도 (약 106~100 카피)까지 7개 농도를 1/10씩 희석하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. PCR은 각각의 합성 cDNA, 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche사), 단일핵산, 프라이머를 넣고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정한 후 반응 조건, 95℃에서 5분, 95℃에서 10초, 65℃에서 1분으로 45 사이클을 수행하였다.
그 결과, miRNA 34a, miRNA 34b 및 miRNA 34c 모두에서 1pM부터 10aM농도 (약 106~101 카피)까지 정상적인 PCR 효율로 측정이 가능한 것을 확인하였다.
이에 관한 결과는 도 14 내지 도 16에 나타내었다.
실시예 6-4: 본 발명에 따른 2형 단일핵산을 이용한 실시간 miRNA 34a, miRNA 34b 및 miRNA 34c 특이도 검출
상기 실시예 6-3에서 miRNA 34a, miRNA 34b 및 miRNA 34c 단일핵산이 각각의 이형체(isoform)를 구분할 수 있는 것을 확인하였고, 본 실시예에서는 증폭하고자 하는 miRNA가 다른 이형체 miRNA과 섞여 있을 때 어느 정도의 비율까지 원하는 이형체를 구분할 수 있는지를 확인하였다. 108 (100pM) miRNA 34a 혹은 miRNA 34b 이형체에 107 부터 104 또는 103 (10pM~10fM 또는 10pM~1fM) 농도까지 1/10씩 희석한 miRNA 34c를 혼합하였고, miR-34c 단일핵산과 프라이머를 이용하여 특이도 검출을 중합효소 연쇄반응 (PCR)로 진행하였다.
PCR은 각각의 합성 cDNA, 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche사 제조), 단일핵산, 프라이머를 넣고 3차 증류수로 총 부피가 20㎕로 되도록 조정하여 반응 조건, 95℃에서 5분, 95℃에서 10초, 65℃에서 1분으로 45 사이클을 수행하였다.
이에 관한 결과는 도 17 및 도 18에 나타내었다.
그 결과, miRNA 34c가 이형체를 최대 0.001%까지 특이도를 유지하며, 구분이 가능함을 확인하였다.
실시예 7: 단일핵산 구조에 따른 분석 방법
본 발명에 따른 단일핵산(2형)의 돌연변이 검출시 특이성을 높이고자, G12D의 3가지 유형, 구체적으로 단일핵산의 리보뉴클레오타이드(RNA)의 위치에 따라 돌연변이(mutant) 검출능을 알아보기 위해 R1DrMR2, R1rDMR2, R1DMrDR2 유형을 하기 표 9와 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다. 각각 단일핵산의 5'-말단에는 FAM을, 그리고 3'-말단에는 3IABkFQ를 부착하였다. 또한, 리보뉴클레오타이드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
KRAS 유전자 G12D의 3가지 유형(R1DrMR2, R1rDMR2, R1DMrDR2)에 대한 단일핵산
단일핵산 서열 서열번호
G12D-R1DrMR2 FAM/-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGrATG-/3IABkFQ 36
G12D-R1rDMR2 FAM/-CTTGTGGTAGTTGGAGCTrGAT-/3IABkFQ 37
G12D-R1DMrDR2 FAM/-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGArTGG-/3IABkFQ 38
* R1 및 R2: DNA올리고(DNAoligo), D: DNA, r: RNA, M: 돌연변이(mutation)
실시예 7-1: G12D 단일핵산 유형(G12D-R1DrMR2, G12D-R1rDMR2, G12D-R1DMrDR2)에 따른 G12D 돌연변이 유전자와 KRAS 야생형 유전자 분석
단일핵산 서열번호 36 내지 38과 프라이머 서열번호 18을 10μM 농도의 0.5㎕씩 준비하고, 0.5U RNase H, AptaTaq Master(Roche 제조) 3.6㎕, Aspc-1(G12D 돌연변이형)와 HT-29(KRAS 야생형)에서 추출한 총 게놈 DNA 30ng을 첨가한 후 3차 증류수로 총 부피가 20㎕가 되도록 조정한 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이때, 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성 후 95℃에서 10초, 64℃에서 60초를 45 사이클 반응하고, 사이클마다 실시간으로 시그널(FAM)을 측정하여 결과를 도출하였다. 그에 대한 결과를 도 19 내지 도 21에 나타내었다.
단일핵산의 세가지 구조에 따라 KRAS 야생형 유전자에 대한 특이성에서 다른 결과를 보이나, 세가지 구조 모두 점 돌연변이(point mutation)의 구분이 가능함을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출용 단일핵산으로서,
    상기 단일핵산은 i) X-Y-Z의 구조를 가지며,
    ii) 유전적 변이를 포함한 단일 표적 유전자의 염기서열 일부 또는 전체에 상보적 결합을 하고,
    iii) 양 말단 또는 내부에 동일하거나 적어도 2개의 상이한 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며,
    iv) 상기 Y는 단일 표적 유전자에 위치하는 1개 또는 2개의 염기서열로 구성된 RNA로서 단일 표적 유전자와 혼성화시 절단 효소에 의해 절단되며,
    상기 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)인 경우에, 상기 X는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, 상기 Z는 4 내지 20개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, 상기 단일 표적 유전자와 단일핵산이 혼성화된 후 절단 시약에 의해 Y가 절단될 때 X 및 Z도 단일 표적 유전자로부터 분리되는 것을 특징으로 하며,
    상기 단일 표적 유전자의 유전적 변이가 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 또는 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)인 경우에, 상기 X는 10 내지 30개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, 상기 Z는 1 내지 5개의 염기서열로 구성되는 DNA이며, 상기 단일 표적 유전자와 단일핵산이 혼성화된 후 절단 시약에 의해 Y가 절단될 때 Z는 단일 표적 유전자로부터 분리되지만 X는 분리되지 않고 프라이머 및 프로브로 작동하는 것을 특징으로 하는, 단일핵산.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전적 변이 검출은 단일염기다형성(SNP), 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 것인, 단일핵산.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍인 것인, 단일핵산.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단일핵산은 단일 표적 유전자의 유전적 변이로서 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 검출하는데 있어서, i) 핵산 중 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 RT 프라이머; ii) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머; iii) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 역방향 프라이머; iv) 핵산(DNA 또는 RNA)으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머; 또는 v) 검출하고자 하는 핵산(DNA 또는 RNA)을 실시간으로 확인하기 위한 프로브로 사용되는 것인, 단일핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일핵산을 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 실시간 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 효소를 더 포함하는 키트로,
    상기 효소는 RNaseH, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ 또는 RNase T2의 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase)인, 키트.
  7. a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산을 수득하는 단계;
    b) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일핵산(promer)을 제조하는 단계;
    c) 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산, 상기 단계 b)에서 제조한 단일핵산, 상기 단계 a)에서 수득한 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 및 절단시약과 혼합한 후 신장반응을 통해 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체를 증폭시키는 단계; 및
    d) 상기 단계 c)에서 증폭된 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산-단일핵산 복합체로부터 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 단계 a)의 유전적 변이를 포함하는 표적 핵산은 시료로부터 검출하고자 하는 RNA 또는 DNA이거나, 상기 RNA를 역전사 중합효소로 증폭하여 얻은 cDNA인 것인, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 단계 c)의 절단시약은 RNaseH, RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ 또는 RNase T2의 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase)인, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 유전적 변이 검출은 단일염기다형성(SNP), 점 돌연변이(point mutation) 또는 miRNA 이형체(isoform)의 존재를 탐지하는 것인, 단일 표적 유전자의 유전적 변이 검출 방법.
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