CN103757103A - 检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法和引物 - Google Patents

检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法和引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法和引物，包括扩增ASXL1基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物以及一对测序引物。将Touch-downPCR扩增和Sanger测序相结合，可用于准确地和特异性地检测急性髓性白血病患者体内ASXL1基因c.1934dupG位点的突变情况。

Description

检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法和引物
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法和引物。
背景技术
急性髓性白血病(AML）是由于髓系造血干／祖细胞发生累积的获得性基因改变,导致细胞增殖、分化和凋亡途径发生变化的一种恶性血液疾病。
ASXL1基因编码染色体连接蛋白polycomb家族的一个成员，并且与后天的基因表达调控相关。ASXL1基因所编码的蛋白包含了与植物同源的区域和细胞核受体盒区域，并且能够作为配体依赖的视黄酸受体共活化物发挥作用。已证实该蛋白能够通过由NCOA1基因编码的具有组蛋白乙酰转移酶活性的蛋白或由LSD1基因编码的组蛋白去甲基化酶发挥直接作用。与TET2基因突变不同的是，ASXL1突变与其它继发的遗传性异常互相排斥。就ASX1突变而言，骨髓增生异常综合征（MDS）和骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者的突变发生率为10%，AML患者的突变发生率为17%，而慢性骨髓单核细胞性白血病（CMML）患者的突变发生率大于40%。ASXL1突变在MDS患者中是频繁发生的分子畸变，预示患者预后不良。对AML患者进行ASXL1突变筛查可能有助于进行临床危险分级和制定治疗方案。
在MPN中，ASXL1基因的绝大多数突变发生在第12外显子，其他外显子的突变较少见。最常见的ASXL1基因突变是c.1934dupG位点突变，在所有ASXL1基因突变当中，它所占的比例为50％以上，该突变为一个鸟嘌呤核苷酸（c.1934dupG）的重复，它会导致移码（Gly646TrpfsX12）。
目前检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法有限制性片段长度多态性（SSCP）,基因测序，荧光定量PCR等，SSCP技术相对简单，但酶切位点易受基因变异影响，影响结果判断，由于方法本身的技术限制，检测灵敏度低。由于检测单碱基突变，采用荧光定量PCR的SYBR Green染料法检测基因突变存在引物特异性差的问题，检测结果假阳性率很高。要达到高特异性的要求，荧光定量PCR（探针法）的检测方法就需要设计一对引物和两条MGB探针，其中一条探针检测ASXL1基因野生型位点，另一条探针检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点，而且还需要使用与之相配套的实时荧光定量PCR仪，检测成本比较高，给临床应用带来了不便。
考虑到灵敏度、提高检测特异性和节约成本等因素，本发明设计了扩增ASXL1基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物，并利用这对扩增引物对送检样本进行Touch-downPCR扩增，让PCR扩增产物纯化后变性，随后利用一对测序引物直接进行Sanger测序，就可以准确和特异性地检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点。其中，Touch-down PCR(也被称作降落PCR)是指每一个（或n个）循环退火温度逐步降低0.5至1℃，直到达到一个较低的退火温度，然后在该温度下继续循环10至20次左右。Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样品DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。特别地，本领域技术人员不能保证每次提取出的样品DNA模板纯度非常高，而且即便所提取出的样品DNA模板纯度足够高，但是该DNA模板可能存在多个与目的基因同源性较高的序列，因此采用Touch-down PCR就可确保正、反向引物最大限度地与目的基因序列结合，从而提高扩增反应的特异性。
发明内容
本发明提供用于检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的引物，所述引物包括：扩增ASXL1基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物，其碱基序列为：
ASXL1-exon12-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为：
ASXL1-exon12-S-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-S-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：ASXL1-exon12-F:ASXL1-exon12-R-R=1:1。
进一步地，其特征在于，所述一对测序引物的使用浓度比为：ASXL1-exon12-S-F:ASXL1-exon12-S-R=1:1。
进一步地，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
本发明还提供一种检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用一对扩增引物ASXL1-exon12-F和ASXL1-exon12-R对(1)中的DNA进行扩增，获得ASXL1基因c.1934dupG突变位点的扩增产物；
(3)利用一对测序引物ASXL1-exon12-S-F和ASXL1-exon12-S-R对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与ASXL1基因野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，
ASXL1-exon12-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT
ASXL1-exon12-S-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-S-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
进一步地，步骤(2)的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
本发明还提供一种检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、无水乙醇、检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述检测体系PCR反应液包括2×PCR Buffer、dNTPs、KOD FX DNAPolymerase、ddH2O以及一对扩增引物ASXL1-exon12-F和ASXL1-exon12-R，所述测序体系包括测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1以及一对测序引物ASXL1-exon12-S-F和ASXL1-exon12-S-R，其中
ASXL1-exon12-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT
ASXL1-exon12-S-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-S-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
进一步地，所述试剂盒还包括ASXL1基因野生型参考序列ASXL1-ref。
进一步地，所述测序纯化液包括碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
本发明的有益效果：利用扩增ASXL1基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物，构建了稳定的Touch-down PCR扩增体系。Touch-down PCR扩增富集正、反向引物与模板正确配对的特异性扩增产物，提高扩增特异性。此外，通过调整正、反向扩增引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，并通过Sanger测序检测目的基因突变多态性，具有灵敏度高、操作简单和成本低等优点。
附图说明
图1样品1的Sanger正向测序结果图。
图2样品2的Sanger正向测序结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
用于检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的引物，所述引物包括：扩增ASXL1基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物，其碱基序列为：
ASXL1-exon12-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为：
ASXL1-exon12-S-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-S-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
一种检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的试剂盒，包括：样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液；测序体系反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；扩增ASXL1基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物ASXL1-exon12-F(10μm)和ASXL1-exon12-R(10μm)。
测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75%乙醇、HIDI（高度去离子甲酰胺）、测序引物：ASXL1-exon12-S-F(3.2μm)、ASXL1-exon12-S-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1（购买自美国Applied Biosystems公司），其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。
检测体系PCR反应液试剂配制如下：
Figure BDA0000444460810000051
其中，正、反向扩增引物的碱基序列为：
引物名称 引物序列
ASXL1-exon12-F CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-R TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT
阳性对照品：含有ASXL1基因序列的溶液。
阴性对照品：无ASXL1基因序列的溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。
优选地，该试剂盒还包括ASXL1基因野生型参考序列ASXL1-ref。
ASXL1-ref：选自ASXL1（GeneBank No.：NG_027868.1），其碱基序列如下所示：
cccagtcagttaaaactattttctaattctttttttgcagattcaactttcacgtatcaaaccaccctgggtggttaaaggtcagcccacttaccagatatgcccccggatcatccccaccacggagtcctcctgccggggttggactggcgccaggaccctcgcagacattaaagcccgtgctctgcaggtccgaggggcgagaggtcaccactgccatagagaggcggccaccactgccatcggaggggggg
Figure BDA0000444460810000052
ccgggtggaggtggcggcggggccaccgatgagggaggtggcagaggcagcagcagtggtgatggtggtgaggcctgtggccaccctgagcccaggggaggcccgagcacccctggaaagtgtacgtcagatctacagcgaacacaactactgccgccttatcctctaaatggggagcatacccaggccggaactgccatgtccagagctaggagagaggacctgccttctctgagaaa。
ASXL1基因c.1934dupG位点突变（一个鸟嘌呤核苷酸的重复）发生于ASXL1-ref序列中的方框区域，会使得方框内的gtggc变成ggtggc，并导致移码（Gly646TrpfsX12）。
实施例2
血液DNA抽提试剂盒（天根生物）的操作流程：
（1）抽提血液中的基因组DNA
1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀；
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
6）向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
7）向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
8）向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液；
9）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中，获得血液基因组DNA溶液。
（2）试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X=18μl反应液×（n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）
n为检测样本数。
（3）加样：将2ul步骤（1）中获得的血液基因组DNA溶液加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照实验而言，直接加2ul阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加2ul阴性对照品；对空白对照实验而言，加2ul生理盐水或不加任何物质。
（4）Touch-down PCR扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti（美国AppliedBiosystems公司）等。反应条件如下：
Figure BDA0000444460810000061
（5）Sanger测序：
取9μl PCR扩增产物与2μl测序纯化液。按照以下程序进行纯化，从而获得纯化产物：
Figure BDA0000444460810000072
将1μl纯化产物分别与测序引物ASXL1-exon12-S-F(3.2μm)和ASXL1-exon12-S-R(3.2μm)按照如下体系进行混合：
Figure BDA0000444460810000073
测序反应程序：
Figure BDA0000444460810000074
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70%乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序：
Figure BDA0000444460810000081
变性程序结束后，上测序仪（ABI3730）测序。
（7）结果判断：将测序结果与ASXL1基因野生型参考序列ASXL1-ref（GeneBank No.:NG_027868.1）进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
采用实施例1中的试剂盒检测临床样本。
取送检急性髓性白血病（AML）患者抗凝血样本10例，按实施例2所述方法提取基因组DNA、配制试剂并检测。
将2ul按照实施例2中所述方法提取出的每份样本基因组DNA溶液加入检测体系PCR反应液中。同时做阳性，阴性，空白对照，每份样本重复两次，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间为160分钟。
每份样本基因组DNA的扩增产物经两次Sanger测序后，比对ASXL1基因c.1934dupG位点突变的情况，对于结果不统一的样本将进行第三次测序。最后，根据测序结果对于预后进行判断。同时进行荧光定量PCR（探针法）进行检测，以便与Sanger测序法进行比较。
检测结果如下表：
从上表可以看出，10例样本ASXL1基因c.1934dupG位点突变的本发明检测结果行荧光定量PCR（探针法）检测结果一致，说明本发明检测方法准确性高。同时由于不使用荧光定量PCR（探针法）中使用的两条探针，也就无需使用与之相配套的高成本的实时荧光定量PCR仪，因而降低了检测成本。另外，在进行Sanger测序前，对样品基因组DNA进行Touch-downPCR扩增，让退火温度由最高时的64℃逐渐降低至58℃，可提高检测结果的特异性。
实施例4
取临床样品2份，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
将2ul按照实施例2中所述方法提取出的每份样本基因组DNA溶液加入检测体系PCR反应液中。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。
样品1的检测结果图如图1所示，为野生型，预后良好，建议维持当前治疗方案。样品2的检测结果图如图2所示，为c.1934dupG位点突变导致移码，Gly646Trp，该突变预后不良，建议尽快行异基因移植。
  SEQUENCE LISTING
 
<110>  成都艾迪康医学检测实验室有限公司
 
<120>  检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法和引物
 
<130> 
 
<160>  5    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
cccagtcagt taaaactatt ttct                                            24
 
 
<210>  2
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
tttctcagag aaggcaggtc ctct                                            24
 
 
<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
cccagtcagt taaaactatt ttct                                            24
 
 
<210>  4
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
tttctcagag aaggcaggtc ctct                                            24
 
 
<210>  5
<211>  498
<212>  DNA
<213>  ASXL1
 
<400>  5
cccagtcagt taaaactatt ttctaattct ttttttgcag attcaacttt cacgtatcaa     60
 
accaccctgg gtggttaaag gtcagcccac ttaccagata tgcccccgga tcatccccac    120
 
cacggagtcc tcctgccggg gttggactgg cgccaggacc ctcgcagaca ttaaagcccg    180
 
tgctctgcag gtccgagggg cgagaggtca ccactgccat agagaggcgg ccaccactgc    240
 
catcggaggg gggggtggcc cgggtggagg tggcggcggg gccaccgatg agggaggtgg    300
 
cagaggcagc agcagtggtg atggtggtga ggcctgtggc caccctgagc ccaggggagg    360
 
cccgagcacc cctggaaagt gtacgtcaga tctacagcga acacaactac tgccgcctta    420
 
tcctctaaat ggggagcata cccaggccgg aactgccatg tccagagcta ggagagagga    480
 
cctgccttct ctgagaaa                                                  498
 
 

Claims (7)

1.用于检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的引物，其特征在于，所述引物包括：扩增ASXL1基因c.1934dupG突变位点的正、反向扩增引物，其碱基序列为：
ASXL1-exon12-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为：
ASXL1-exon12-S-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-S-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用浓度比为：ASXL1-exon12-F : ASXL1-exon12-R -R=1:1。
4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述一对测序引物的使用浓度比为：ASXL1-exon12-S-F : ASXL1-exon12-S-R =1:1。
5.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95 ℃ 预变性10min；第二阶段，变性温度94 ℃ 30sec，退火温度64 ℃ 90sec，延伸温度72 ℃ 30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5 ℃；第三阶段，变性温度94 ℃ 30sec，退火温度58 ℃ 30sec，延伸温度72 ℃ 30sec，循环24次；第四阶段，72 ℃ 10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4 ℃下保存。
6.一种检测ASXL1基因c.1934dupG突变位点的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用一对扩增引物ASXL1-exon12-F和ASXL1-exon12-R对(1)中的DNA进行扩增，获得ASXL1基因c.1934dupG突变位点的扩增产物；
(3)利用一对测序引物ASXL1-exon12-S-F和ASXL1-exon12-S-R对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与ASXL1基因野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，
ASXL1-exon12-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT
ASXL1-exon12-S-F：CCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCT
ASXL1-exon12-S-R：TTTCTCAGAGAAGGCAGGTCCTCT。
7. 如权利要求6所述的方法，步骤(2)的扩增反应条件为：第一阶段，95 ℃ 预变性10min；第二阶段，变性温度94 ℃ 30sec，退火温度64 ℃ 90sec，延伸温度72 ℃ 30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5 ℃；第三阶段，变性温度94 ℃ 30sec，退火温度58 ℃ 30sec，延伸温度72 ℃ 30sec，循环24次；第四阶段，72 ℃ 10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4 ℃下保存。
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BENOIITE PEREZ ET AL.: "Genetic typing of CBL, ASXL1, RUNX1, TET2 and JAK2 in juvenile myelomonocytic leukaemia reveals a genetic profile distinct from chronic myelomonocytic leukaemia", 《BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY》 *
中华人民共和国卫生部医政司: "《全国临床检验操作规程 》", 31 December 2006 *

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