KR101064603B1 - 리포터 시스템을 이용한 메틸트렌스퍼레이즈 저해 물질 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 VHL(von Hippel-Lindau)의 프로모터 및 리포터로서 초파리 루시퍼레이즈 유전자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 벡터를 이용하여 DNA 메틸트렌스퍼레이즈(methyltransferase) 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 즉, hypermethylation 되어 있는 tumor suppressor 프로모터의 CpG island를 demethylation 시켜 tumor suppressor의 발현을 증가시키는 methyltransferase 억제제 또는 항암물질을 발굴하기 위한 스크리닝 시스템을 제공한다.

나아가, 본 발명은 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제에 의한 뇌신경 질환 치료제, 혈액질환 치료제, 항종양제, 또는 후생학적(epigenetic) 조절제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

VHL, tumor suppressor, hypermethylation, DNA　methyltransferase, 리포터, 루시퍼레이즈, epigenetics

Description

리포터 시스템을 이용한 메틸트렌스퍼레이즈 저해 물질 스크리닝 방법 {Method of Screening for Reagents Inhibiting Methyltransferase Using Reporter System}

본 발명은 HIF1(hypoxia inducible factor 1)의 분해를 촉진하는 VHL(von Hippel-Lindau)의 프로모터의 활성을 리포터 유전자로서 초파리 루시퍼레이즈 유전자를 이용하여 측정함으로써 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 상기 시스템을 이용하여 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제에 의한 뇌신경 질환 치료제, 혈액질환 치료제, 항종양제, 또는 에피제네틱 조절제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

DNA methylation은 DNA 염기서열의 CpG dinucleotide의 시토신 잔기에 methyl기를 전달하는 효소인 DNA　methyltransferase에 의해 시토신에 화학변화를 일으키는 형태이다. 배아 줄기 세포 (embryonic stem cells)에는 상기 CpG island가 methylation 되어 있지 않은 반면, 성인의 CpG island는 그 C 잔기에 methylation 되어 있어 이는 후생학적(epigenetics) 요인에 근거하는 것으로 여겨 진다.

대체로, 유전자의 발현을 조절하는 부위인 유전자의 5’-부위에 CpG islands가 많이 존재하고 있으며 그 중 60-90%의 CpG island가 methylation되어 있다. 일반적으로 암과 같은 질병 관련 유전자의 프로모터의 CpG islands에 비정상적인 과다 메틸화 (hypermethylation)가 나타나 있으며 이것이 유전자의 유전적 전사 발현 침묵 (heritable transcriptional silencing) 현상을 유도한다 (M. Esteller, Cancer epigenetics: DNA methylation and chromatin alterations in human cancer. Adv Exp Med Biol 532 (2003) 39-49).

DNA methylation은 전사 관련 단백질이 methylation된 유전자에 결합하는 것을 방해하거나 methylated DNA가 methyl-CpG-binding domain proteins (MBDs)에 결합하고, MBD는 다시 히스톤을 변형시키는 histone deacetylases, chromatin remodelling proteins 등 다른 단백질들을 유인하고, 그 결과 단단하고 불활성의 침묵 크로마틴 (silent chromatin)이 형성된다. 이러한 DNA methylation과 chromatin 구조의 상관 관계는 매우 중요한데 특히 methyl-CpG-binding protein 2 (MeCP2)은 Rett syndrome과, methyl-CpG binding domain protein 2 (MBD2)는 암의 hypermethylated genes의 전사적 침묵(transcriptional silencing)과 관계가 있다 (X. Zhao, C. Pak, R.D. Smrt, and P. Jin, Epigenetics and Neural developmental disorders: Washington DC, September 18 and 19, 2006. Epigenetics 2 (2007) 126-34).

DNA　methyltransferase는 S-adenosyl methionine (SAM)을 methyl donor로 사용하여 DNA의 시토신 잔기에 methyl기를 전달하는 효소이다. 인간의 DNA methylation은 종의 효소 DNA methyltransferase 1, 3a, 및 3b (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b)에 의해 조절되는데, DNMT3a 및 DNMT3b는 발생 초기의 DNA methylation 패턴과 관련 있어 de novo methyltransferases라고 불린다. DNMT1은 DNA replication 동안 DNA methylation patterns을 복사하는 것으로 알려진 유지 methyltransferase 이다. DNMT3L은 다른 DNMT3s와 homologous하지만 효소 촉매 활성이 없다. DNMT3L은 DNA에 결합하여 de novo methyltransferases의 활성화를 촉진시킨다. DNMT2(TRDMT1)는 DNA methyltransferases에 공통으로 있는 10 sequence motifs를 가진 DNA methyltransferase homolog이지만 DNA를 methylate하지 못하고 aspartic acid transfer RNA의 anticodon loop에 있는 cytosine-38을 methylate 시킨다 (D. Vallbohmer, J. Brabender, D. Yang, P.M. Schneider, R. Metzger, K.D. Danenberg, A.H. Holscher, and P.V. Danenberg, DNA methyltransferases messenger RNA expression and aberrant methylation of CpG islands in non-small-cell lung cancer: association and prognostic value. Clin Lung Cancer 8 (2006) 39-44).

많은 종양 억제 유전자 (tumor suppressor genes)들이 carcinogenesis 동안 DNA methylation 되어 전사되지 않는데 DNMTs의 작용을 저해하여 재발현시키는 시도를 진행하고 있다. Nucleoside analog인 5-aza-2'-deoxycytidine (decitabine)은 효소의 β-elimination step을 저해하여 DNA에 covalent complex를 형성함으로써 DNMTs 작용을 저해하여 효소의 분해를 유도한다. Decitabine이 활성이 있기 위 해서는 세포의 genome에 끼어 들어가야 하는데 이것이 돌연변이를 유도하여 decitabine은 bone marrow에 독성이 있어 치료범위가 좁다.

RNA　수준에서 mRNAs를 분해하여 DNMTs를 표적으로 하는 치료제가 개발 중인데 DNA methylation에 의해 발현되지 않는 tumor suppressor 유전자를 발현시키도록 하기 위해 DNMT1을 표적으로 하는 것이 충분한지는 불확실하다.

불규칙적인 DNA methylation은 여러 질병과 관련과 관련이 있다. DNA methyltransferase 3b에 돌연변이가 있으면 ICF증을 나타내며(immunodeficiency, centromere instability and facial anomalies), DNA methyltransferases 다량 발현시 여러 종류의 암이 발생한다. 암의 p53 유전자의 25% 돌연변이는 CpG 부위에 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 부위의 methylation은 tumor suppressor 유전자들을 불활성화 시키거나 침묵하게 만들어 암이 발생하게 된다 (M. Esteller, P. G. Corn, S. B. Baylin, and J. G. Herman, A Gene Hypermethylation Profile of Human Cancer. Cancer Research 61, 3225-3229, 2001). 노화 기간에도 비정상적인 DNA methylation이 나타나며 다양한 세포 내 기능에 영향을 미친다 (M.A. Casillas, Jr., N. Lopatina, L.G. Andrews, and T.O. Tollefsbol, Transcriptional control of the DNA methyltransferases is altered in aging and neoplastically-transformed human fibroblasts. Mol Cell Biochem 252 (2003) 33-43). 후생적 비조절은 암 발생에 중요한 역할을 하는데 유전적 변이보다는 후생적 변이(epigenetic alterations)가 약물학적으로 가역적이므로 혈액학 또는 종양 분야에서 더욱 많은 관심을 보이고 있다 (K. Ghoshal, and S. Bai, DNA methyltransferases as targets for cancer therapy. Drugs Today (Barc) 43 (2007) 395-422). 후생적으로 활성이 있는 신약으로 histone deacetylase inhibitors (HDACi) and DNA methyltransferase (DNMT) inhibitors가 임상 실험에 들어가 있다.

최근 DNA methyltransferases 의 저분자 화합물 개발이 큰 주목을 받고 있다. DNA methyltransferases 저해제는 암을 비롯한 유전적 질병, stem cell, 후생적 조절 장애로 인한 질병, 노화 등을 대상으로 하는 다양한 질병의 치료제로 활용 가능하며 특히 맞춤의료에 유용한 약물로 사료된다.

암의 발생요인은 다양하나, 크게 내적 요인과 외적 요인으로 구분하는데, 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 정상세포가 어떠한 기전을 거쳐 암세포로 형질전환 되는지에 대해서는 정확하게 규명되어 있지는 않으나, 적어도 80~90%가 환경요인 등 외적 인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적인 요인 중의 하나인 유전 인자로서는 암 발생에 관련된 유전자들인 종양형성유전자 (oncogenes)와 종양억제유전자(tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 요인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다.

HIF는 hypoxia에 대한 암세포의 적응을 조절하는 가장 중요한 분자로서 알려져 있고, HIF-1a 단백질의 양과 암환자의 예후는 밀접한 관계가 있으며, animal xenograft 모델에서 HIF를 저해할 경우, angiogenesis 감소, tumor growth 감소, 및 therapy에 대한 반응성 증가하는 현상이 보고되었다. 이에, 본 발명자들은 HIF1 의 발현을 저해하여 항암 효과를 나타내는 새로운 기전의 항암제를 스크리닝하는 방법에 관하여 연구하던 중, VHL의 프로모터의 demethylation을 통해 VHL의 발현을 증가시킴으로써 HIF1의 발현을 억제하는 리포터 시스템을 개발하여 본 발명에 이르게 되었다.

즉, 본 발명에서는 VHL의 프로모터 중 demethylation이 유도되는 CpG island의 특정 site를 포함하는 부위를 클로닝하여 VHL의 demethylation을 통해 VHL의 발현을 증가시키는 약물을 탐색하는 스크리닝 시스템을 제조함으로써, 프로모터의 demethylation을 통해 항암 효과를 나타내는 항종양제 또는 DNA　hypermethylation에 기인하는 질병의 치료 및 연구를 위한 DNA methyltransferases 저해 물질개발에 활용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, VHL 프로모터 활성 및 이에 융합된 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하고, 이를 이용하여 DNA hypermethylation으로 억제된 프로모터 활성을 확인 시스템을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 재조합 발현 벡터를 통하여 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제를 스크리닝하는 방법, DNA hypermethylation에 의해 발현이 억제된 암, 노화, 질병 관련 및 후생학적 유전자들의 발현을 유도하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 VHL(von Hippel-Lindau) 프로모터 및 상기 프로모터에 융합된 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

즉, 본 발명에 의하면, 형광 단백질 유전자, 바람직하게는 초파리 루시퍼레이즈 리포터 시스템을 이용한 VHL 프로모터 활성을 확인하고, 이를 통하여 hypermethylation에 의해 발현이 억제된 여타 유전자들의 발현을 유도하는 물질을 스크리닝 하는 시스템을 제공한다.

구체적으로, 항암효과가 있는 VHL promoter의 CpG island의 특정 site가 특정 약물(LW6)에 의해 demethylation 되는 현상을 발견하고 (특허 출원 10-2008-0112141), 상기 VHL 프로모터 중 활성이 높은 도메인과 루시퍼레이즈 유전자를 사 용하여 리포터 시스템으로 구축하였다.

[LW6]는 대한민국 특허등록 제10-0787131호에 개시된 실시예 18 화합물로, 화학식은 다음과 같다.

본 발명에 따른 VHL 프로모터는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의, 바람직하게는 서열번호 5의 프로모터일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 형광 단백질이 초파리 루시퍼레이즈, 증강된 녹색형광 단백질 (EGFP, enhanced green fluorescent protein), 또는 청색형광 단백질(CFP, cyan fluorescent protein)인, 바람직하게는 초파리 루시퍼레이즈인 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 도 2에 개시된 개열지도를 갖는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터, 바람직하게는 도 2에 개시된 개열지도를 갖는 발현벡터, 및 레닐라-루시퍼레이즈를 함께 포함하는 pRL-SV40 플라스미드 벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 세포주는 HEC293, HeLa, HCT-116, Caki 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 인간 대장암 HCT-116 세포주가 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법은 본 발명에 의한 형질전환 세포주를 플레이트에 배양하는 단계; 상기 플레이트의 각 플레이트에 검색하고자 하는 시료를 첨가하고 산소결핍(hypoxia) 상태에서 배양하는 단계; 및 이로부터 발현된 형광 단백질의 형광 및 레닐라 루시퍼레이즈의 형광을 측정하는 단계를 포함하는 DNA　메틸트렌스퍼레이즈 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 형광 단백질은 초파리 루시퍼레이즈, 증강된 녹색형광 단백질 (EGFP, enhanced green fluorescent protein), 또는 청색형광 단백질(CFP, cyan fluorescent protein)인, 바람직하게는 초파리 루시퍼레이즈인 DNA　메틸트렌스퍼레이즈 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 나아가 줄기세포 또는 체세포의 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제가 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제에 기인한 뇌신경 질환 치료제, 혈액질환 치료제, 항종양제, 또는 후생학적(epigenetic) 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서 후생학적 조절제는 바람직하게는 후생유전 질환 치료제이다.

본 발명은 나아가, 상기 스크리닝 방법에 의해 검색된 DNA 메틸트렌스퍼레이 즈 억제제를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 검색된 상기 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제가 뇌신경 질환 치료제, 혈액질환 치료제, 항종양제, 또는 후생학적(epigenetic) 조절제인 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제를 제공한다.

본 발명은 p16 프로모터 또는 p53의 프로모터 및 상기 프로모터에 융합된 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 형광 단백질은 초파리 루시퍼레이즈, 증강된 녹색형광 단백질 (EGFP, enhanced green fluorescent protein), 또는 청색형광 단백질(CFP, cyan fluorescent protein), 바람직하게는 초파리 루시퍼레이즈일 수 있다.

본 발명은 나아가, 상기 재조합 발현벡터 및 레닐라-루시퍼레이즈를 함께 포함하는 pRL-SV40 플라스미드 벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다.

상기 스크리닝 방법은 본 발명에 의한 형질전환 세포주를 플레이트에 배양하는 단계; 상기 플레이트에 검색하고자 하는 시료를 첨가하고 산소결핍(hypoxia) 상태에서 배양하는 단계; 및 이로부터 발현된 형광 단백질의 형광 및 레닐라 루시퍼레이즈의 형광을 측정하는 단계를 포함하는 DNA　메틸트렌스퍼레이즈 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 나아가, 본 발명에 의한 스크리닝 방법에 의해 검색된 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 의해 검색된 상기 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제 가 뇌신경 질환 치료제, 혈액질환 치료제, 항종양제, 또는 후생학적(epigenetic) 조절제인 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 뇌신경 질환 치료제는 Rett syndrome 치료제, Angelman syndrome 치료제 등을; 혈액질환 치료제는 골수이형성증 (myelodysplastic syndrome), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 만성 골수단핵구성 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia) 등을; 후생학적 조절제, 바람직하게는 후생유전질환 치료제는, ATR-X (Alpha-thalassemia X-linked mental retardation syndrome) 치료제, 유약증후군 (Fragile X syndrome) 치료제, ICF 증후군(immunodeficiency, centromere instability and facial anomalies) 치료제 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 항종양제는, 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 (CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등 종양의 치료제를 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 대장암 세포주 HCT-116에서 인간 제노믹 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 하여 VHL 프로모터의 다양한 부위를 증폭할 수 있 는 프라이머 (서열번호 6-15, 표 1) 사용하여 중합효소반응(PCR)을 실시하였다. 상기의 중합효소반응으로 얻어진 5종의 VHL 프로모터 DNA를 루시퍼레이즈를 발현할 수 있는 플라스미드 벡터인 pGL2-basic vector(Promega 사)에 삽입시켜 VHL 프로모터의 활성 정도에 따라서만 루시퍼레이즈가 발현되는 플라스미드 벡터(pGL2-basic-VHL promoter)인 pGL2-basic W1, pGL2-basic W2, pGL2-basic W3, pGL2-basic W4, pGL2-basic W5를 제조하였다 (도 2). 이렇게 제조된 플라스미드 벡터 pGL2-basic-VHL promoter domain은 추후 형광 세기를 표준화하기 위하여 레닐라-루시퍼레이즈를 함유하는 플라스미드 벡터인 pRL-SV40(Promega 사)와 함께 대장암 세포주인 HCT-116(ATCC Cat. No. CCL2)에 도입된다. 상기의 레닐라-루시퍼레이즈 함유 벡터는 이렇게 플라스미드 벡터가 도입된 세포주에 VHL 프로모터를 활성화시키는 것으로 예상되는 물질을 처리하고 일정시간 경과 후 루시퍼레이즈의 세기를 측정할 때 표준 형광 물질로서 이용된다.

본 발명에서는, 상기의 5종의 VHL 프로모터가 클론된 5종의 시스템에 demethylation을 통해 VHL 발현을 증가시키는 LW6 물질을 농도별로 처리하여 VHL 도메인의 프로모터 활성 정도를 비교하였다. 이후 활성 증가가 높은 W5 도메인을 포함하는 발현 벡터에 있어서, methylation된 프로모터의 활성을 증가시키는 것으로 알려진 VHL 프로모터의 CpG island를 demethylation 시키는 LW6 약물, methyltransferase 저해제인 5-azacytidine을 양성 대조군으로 하여 DNA alkylating 약물인 cisplatin을 음성 대조군으로 사용하여 농도별로 세포에 처리 후 루시퍼레이즈의 세기를 측정하였다.

구체적으로, 상기의 플라스미드를 도입한 HCT-116 세포주를 12시간동안 안정화 시킨후, 4시간 동안 산소결핍(hypoxia) 상태에서 배양한 후 12시간 동안 상기 LW6, 양성 대조군, 음성 대조군 물질 각각을 배양액에 첨가하여 세포를 배양하였다. 12시간 경과후 세포를 세포 용해 용액으로 용해한 후, 상기 세포 용해액에서 루시퍼레이즈의 형광 세기를 루미노미터를 이용하여 측정하였다. 측정된 루시퍼레이즈의 형광 세기는 세포에 공도입된 레닐라 루시퍼레이즈의 형광의 세기로 표준화하여 정량화하였다.

본 발명에 의한 VHL 프로모터 활성 스크리닝 시스템은 신약 개발에 있어, 고속처리 검색법(High-throughput Screening, HTS)에 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 VHL 프로모터 활성 스크리닝 시스템을 이용하면, 암, 노화 또는 질병과 관련 있는 프로모터의 hypermethylation 되어 있는 CpG island를 활성화 시키거나/시키고, tumor suppressor의 발현을 증가시키는 약물을 용이하게 탐색할 수 있다. 본 발명에 의한 재조합 발현 벡터 또는 이를 포함하는 세포주 등의 스크리닝 시스템은 과다메틸화(hypermethylation)에 의해 유전자 발현이 억제되어 질병을 일으키는 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제 스크리닝 뿐만 아니라, DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제에 기인하는 뇌신경 질환, 혈액질환, 종양 등의 치료제, 후생학적(epigenetic) 조절제 등의 스크리닝에도 유용하게 활용될 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명한다. 본 발명은 후술하는 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 의한 효과는 본 발명의 실시예에 기재된 것에 의해 한정되지 않는다.

본 발명은 DNA methyltransferase 저해제로 특허 출원한 물질 LW6가 VHL의 프로모터에 있는 CpG island를 demethylation 시키는 것을 bisulfite 실험으로 확인하였고, (도 1) 그 결과를 활용하여 스크리닝 시스템을 구축하고자 한다.

실시예 1. VHL 프로모터 클로닝 및 이를 포함하는 재조합 발편 벡터(루시퍼레이즈 리포터 시스템)의 구축

VHL 프로모터는 인간 대장암 세포주 (Hct-116)에서 분리한 genomic DNA를 주형으로 하여 서열번호 6 내지 서열번호 15의 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 중합효소반응(PCR)을 실시하였고, 그 결과 VHL 프로모터 부분인 W1(-467~+195, 서열번호 1), W2(-467~+69, 서열번호 2), W3(-467~-83, 서열번호 3), W4(-232~+195, 서열번호 4) 및 W5(-83~+195, 서열번호 5)의 DNA를 얻었다 (도1). PCR 에 사용된 올리고 염기서열은 표 1에 명기되어 있다.

[표1]VHL 도메인 클로닝을 위한 올리고 염기서열

W1	서열번호 6	W1-F	ATAGCTAGCAGAGGCCAAGGCAGGAGGAT
	서열번호 7	W1-R	GGGAAGCTTGACTCTTCCGGGCCGGACTC
W2	서열번호 8	W2-F	ATAGCTAGCAGAGGCCAAGGCAGGAGGAT
	서열번호 9	W2-R	GGGAAGCTTATTCCCTCCGCGATCCAGAC
W3	서열번호10	W3-F	ATAGCTAGCAGAGGCCAAGGCAGGAGGAT
	서열번호11	W3-R	ATAAAGCTTCGGAGGCTGTGCGCGTGC
W4	서열번호12	W4-F	ATAGCTAGCCTGTCTCCAAAAAAAAAAA
	서열번호13	W4-R	GGGAAGCTTGACTCTTCCGGGCCGGACTC
W5	서열번호14	W5-F	ATAGCTAGCGGCCGGCTATTTCCGCGAGC
	서열번호15	W5-R	GGGAAGCTTGACTCTTCCGGGCCGGACTC

리포터 시스템 구축을 위한 벡터로는 pGL2-basic vector(Promega 사)를 사용하였는데, 상기 벡터는 프로모터와 인헨서(enhancer)가 없는 것이 특징으로 본 발명의 VHL 프로모터의 활성만을 확인하기에 적합하다. 우선, 상기 벡터 내의 초파리 루시퍼레이즈 유전자의 상향류(upstream)에 얻은 PCR 를 삽입하였는데, pGL2-basic vector에 클로닝이 가능하도록 서열번호 6, 8, 10, 12, 및 14의 VHL 프로모터에는 Nhe I 제한효소 절단 부위가 포함되도록 디자인 하였고, 서열번호 7, 9, 11, 13, 및 15의 프로모터에는 HindⅢ 제한효소 절단 부위가 포함되도록 하였다. 중합효소반응으로 얻은 VHL 프로모터 DNA를 pGL2-basic vector에 삽입하기 위하여 우선, pGL2-basic vector를 NheⅠ과 HindⅢ로 3시간 동안 처리 후 30분간 CIP (Calf intestine phosphatase) 반응을 하여 DNA 단편 5'에 있는 인산기를 제거하였다. 또한, 상기의 중합효소반응으로 얻은 VHL 프로모터 W1, W2, W3, W4 및 W5 각 DNA 단편을 NheⅠ과 HindⅢ로 자른 후 준비된 상기 벡터와 함께 T4 DNA 라이게이즈로 16℃에서 16시간동안 라이게이션하고 라이게이션 결과물을 대장균 컴피턴트 세포(E.coli competent cell)인 DH5α 세포에 도입하였다.

상기의 라이게이션 결과물이 도입된 DH5α를 배양한 후, 자란 콜로니에서 플 라스미드 DNA를 분리하고 NheⅠ과 HindⅢ 제한효소로 잘라 DNA 단편 사이즈를 확인하고, 이와 더불어 VHL 프로모터 도메인 W1, W2, W3, W4 및 W5가 클로닝 되었음을 재확인하고자 DNA 염기서열분석(DNA sequencing)을 실시하였다.

상기의 과정으로 최종적으로 제조 및 서열이 확인된 VHL 프로모터 및 초파리 루시퍼레이즈 유전자를 포함하는 pGL2-VHL 프로모터 벡터의 모식도는 도2와 같다. 도 2 중 VHL promoter domain으로 각각 W1, W2, W3, W4 또는 W5를 클로닝하였다.

실시예 2. 루시퍼레이즈 활성 분석에 의한 VHL 프로모터 활성화 비교

실시예 1에 의하여 제조된 pGL2-W1, pGL2-basic W2, pGL2-basic W3, pGL2-basic W4, pGL2-basic W5 프로모터 벡터를 세포에 도입한 후, DNA methyltransferase를 저해하는 물질 LW6에 의한 VHL 프로모터 도메인의 활성화 정도를 측정 비교하였다. 사용된 LW6 농도는 각각 10, 30, 50 μM이다.

제조된 pGL2-VHL-초파리 루시퍼레이즈 플라스미드 벡터(pGL2-W1, pGL2-basic W2, pGL2-basic W3, pGL2-basic W4, pGL2-basic W5 프로모터 벡터)와 레닐라-루시퍼레이즈를 함유하는 플라스미드 벡터인 pRL-SV40 (Promega 사)를 동시에 HCT-116 세포주(ATCC Cat. No. CCL2)에 도입시켰다. 도입 후 12 시간 동안 세포를 안정화하고 각각의 약물에 대하여 10μM, 30 μM 및 50μM의 농도로 처리하여 12 시간 동안 산소결핍(hypoxia) 상태에서 배양하였다. 그 후 HCT-116 세포를 세포 분해 용액(40mM Tricine pH 7.8, 50mM NaCl, 2mM EDTA, 1mM MgSO4, 5mM DTT, 1% Triton X-100)으로 처리 및 세척하였다. 이에 대한 초파리 루시퍼레이즈 및 레닐라-루시 퍼레이즈 활성에 의한 빛의 강도는 루미노미터 (luminometer, Berthold, Bad Wildbad, Germany)로 10초간 측정하여 종합하였다. 초파리 루시퍼레이즈 활성은 레닐라-루시퍼레이즈 활성값을 표준화하여 정량적으로 분석하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 약물을 전혀 처리하지 않은 세포와 비교하여 W4와 W5 도메인을 포함하는 시스템에서만 LW6 농도 의존적으로 루시퍼레이즈 활성이 증가된 것을 확인하였다. 특히 도1에서 보는 바와 같이 CpG island가 많고 LW6에 의해 demethylation된 부위가 많은 W5 도메인이 스크리닝 시스템에 보다 적절한 것으로 나타났다.

실시예 3. W5 도메인을 이용한 methyltransferase 저해제 검색 가능성 확인 및 스크리닝 시스템 구축

실시예 1에 의하여 제조된 pGL2-W1, pGL2-basic W2, pGL2-basic W3, pGL2-basic W4, pGL2-basic W5 프로모터 벡터 중 LW6에 의해 루시퍼레이즈의 활성화가 높은 VHL 프로모터 도메인 W5을 포함하는 벡터를 사용하여 여러 약물에 의한 demethylation에 의한 정도를 측정 비교하여 스크리닝 시스템을 구축하였다. 알려진 Methyltransferase 저해제인 5-aza-cytidine을 양성 대조군으로, DNA 알키화제인 cisplatin을 음성대조군으로 하여 VHL W5 도메인의 프로모터 활성을 측정 및 비교하고자 하였으며, 새로이 검색될 물질은 VHL 프로모터 활성을 증가시키는 것으로 확인된 LW6을 사용하였다.

실시예 1에서 제조된 pGL2-VHL-W5 플라스미드 벡터와 레닐라-루시퍼레이즈를 함유하는 플라스미드 벡터인 pRL-SV40 (Promega 사)를 동시에 HCT-116 세포주(ATCC Cat. No. CCL2)에 도입했다. 도입 후 12 시간 동안 세포를 안정화하고, hypoxia 상태에서 4시간 배양 후 LW6 30μM, 50 μM, 100 μM, 양성대조군으로 methyltransferase 저해제인 5-aza-cytidine 10 μM, 30 μM, 50 μM, 음성대조군으로 DNA 알킬화제인 cisplatin 1 μM, 5 μM, 10 μM을 각각 처리하여 12 시간 동안 hypoxia 상태에서 배양하였다. hypoxia 상태에서 약물 처리를 완료한 HCT-116 세포를 세포 분해 용액(40 mM Tricine pH 7.8, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM MgSO4, 5 mM DTT, 1% Triton X-100)으로 처리 및 세척하였다. 초파리 루시퍼레이즈 및 레닐라 루시퍼레이즈 활성에 의한 빛의 강도는 루미노미터 (luminometer, Berthold, Bad Wildbad, Germany)로 10초간 측정하여 종합하였다. 초파리 루시퍼레이즈 활성은 레닐라 활성값을 표준화하여 정량적으로 분석하였다. N은 normoxia, H는 hypoxia를 나타낸다.

그 결과, 도4 에서 보는 바와 같이, LW6를 처리한 군에서는 농도 의존적으로 루시퍼레이즈의 활성을 나타내었다. 양성 대조군인 5-azacytidine을 처리한 군에서도 농도에 의존적으로 루시퍼레이즈의 활성을 보였다. 이는 chrmosomal DNA의 demethylation에 증가에 따라 luciferase 활성이 증가된 것에 따른 것으로 보인다. 한편, 음성 대조군인 cisplatin은 약물 농도 변화에 전혀 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 의한 스크리닝 시스템은 유전자의 과다메틸화를 억제하는 약물을 탐색하는 시스템으로 활용될 수 있으며 특히, 일반적인 methytransferase inhibitor, 항암제, epigenetic 조절 약물의 개발에 활용될 수 있을 것으로 추정한다.

도 1은 pGL2-basic vector에서 루시퍼레이즈 유전자의 상향류(Upstream)에 위치한 VHL 프로모터 도메인의 구조 (W1,W2, W3, W4 및 W5 도메인을 나타내는 그림이다. 막대선은 프로모터 상에 있는 CpG island를 나타내며 *는 약물 LW6에 의해 demethylation된 C를 표시하였다.

도 2는 본 발명의 VHL 프로모터 도메인의 hypermethylation 억제에 의한 루시퍼레이즈 활성 증가를 비교한 루시퍼레이즈 리포터 시스템(pGL-basic-VHL 도메인 vector)을 나타내는 도이다. VHL promoter domain으로 각각 W1, W2, W3, W4, 및 W5가 도입된다.

도3은 VHL 프로모터 W1, W2, W3, W4 및 W5 도메인을 도입한 후 이용한 LW6 약물의 DNA　hypermethylation　억제 활성을 비교한 그림이다. 프로모터 내 hypermethylation 되어 있는 CpG island의 demethylation 정도에 따라 루시퍼레이스 활성화가 나타난다. 대조군으로는 약물 처리하지 않은 DMSO를, 실험군으로는 LW6 약물 10μM, 30μM, 50μ을 사용하였다.

도 4은 LW6, 5-azacytidine, cisplatin 약물을 대상으로 VHL 프로모터 W5 도메인을 이용한 hypermethylation을 억제하는 물질의 발굴용 스크리닝 시스템 (pGL-basic-VHL W5)의 유용성을 확인한 도이다.

약물 처리하지 않은 DMSO, 양성 대조군 약물로는 5-azacytidine을, 음성대조군 약물로 cisplatin을 사용하였으며, hypermethylation을 억제하는 검색 후보 물질로는 LW6을 사용하였다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology <120> Method of Screening for Reagents Inhibiting Methyltransferase Using Reporter System <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agaggccaag gcaggaggat cacttgaacc caggagttcg agaccagcct aggcaacata 60 gcgagactcc gtttcaaaca acaaataaaa ataattagtc gggcatggtg gtgcgcgcct 120 acagtaccaa ctactcggga ggctgaggcg agacgatcgc ttgagccagg gaggtcaagg 180 ctgcagtgag ccaagctcgc gccactgcac tccagcccgg gcgacagagt gagaccctgt 240 ctccaaaaaa aaaaaaaaac accaaacctt agaggggtga aaaaaaattt tatagtggaa 300 atacagtaac gagttggcct agcctcgcct ccgttacaac agcctacggt gctggaggat 360 ccttctgcgc acgcgcacag cctccggccg gctatttccg cgagcgcgtt ccatcctcta 420 ccgagcgcgc gcgaagacta cggaggtcga ctcgggagcg cgcacgcagc tccgccccgc 480 gtccgacccg cggatcccgc ggcgtccggc ccgggtggtc tggatcgcgg agggaatgcc 540 ccggagggcg gagaactggg acgaggccga ggtaggcgcg gaggaggcag gcgtcgaaga 600 gtacggccct gaagaagacg gcggggagga gtcgggcgcc gaggagtccg gcccggaaga 660 gtc 663 <210> 2 <211> 537 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agaggccaag gcaggaggat cacttgaacc caggagttcg agaccagcct aggcaacata 60 gcgagactcc gtttcaaaca acaaataaaa ataattagtc gggcatggtg gtgcgcgcct 120 acagtaccaa ctactcggga ggctgaggcg agacgatcgc ttgagccagg gaggtcaagg 180 ctgcagtgag ccaagctcgc gccactgcac tccagcccgg gcgacagagt gagaccctgt 240 ctccaaaaaa aaaaaaaaac accaaacctt agaggggtga aaaaaaattt tatagtggaa 300 atacagtaac gagttggcct agcctcgcct ccgttacaac agcctacggt gctggaggat 360 ccttctgcgc acgcgcacag cctccggccg gctatttccg cgagcgcgtt ccatcctcta 420 ccgagcgcgc gcgaagacta cggaggtcga ctcgggagcg cgcacgcagc tccgccccgc 480 gtccgacccg cggatcccgc ggcgtccggc ccgggtggtc tggatcgcgg agggaat 537 <210> 3 <211> 386 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 agaggccaag gcaggaggat cacttgaacc caggagttcg agaccagcct aggcaacata 60 gcgagactcc gtttcaaaca acaaataaaa ataattagtc gggcatggtg gtgcgcgcct 120 acagtaccaa ctactcggga ggctgaggcg agacgatcgc ttgagccagg gaggtcaagg 180 ctgcagtgag ccaagctcgc gccactgcac tccagcccgg gcgacagagt gagaccctgt 240 ctccaaaaaa aaaaaaaaac accaaacctt agaggggtga aaaaaaattt tatagtggaa 300 atacagtaac gagttggcct agcctcgcct ccgttacaac agcctacggt gctggaggat 360 ccttctgcgc acgcgcacag cctccg 386 <210> 4 <211> 427 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctgtctccaa aaaaaaaaaa aaacaccaaa ccttagaggg gtgaaaaaaa attttatagt 60 ggaaatacag taacgagttg gcctagcctc gcctccgtta caacagccta cggtgctgga 120 ggatccttct gcgcacgcgc acagcctccg gccggctatt tccgcgagcg cgttccatcc 180 tctaccgagc gcgcgcgaag actacggagg tcgactcggg agcgcgcacg cagctccgcc 240 ccgcgtccga cccgcggatc ccgcggcgtc cggcccgggt ggtctggatc gcggagggaa 300 tgccccggag ggcggagaac tgggacgagg ccgaggtagg cgcggaggag gcaggcgtcg 360 aagagtacgg ccctgaagaa gacggcgggg aggagtcggg cgccgaggag tccggcccgg 420 aagagtc 427 <210> 5 <211> 278 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggccggctat ttccgcgagc gcgttccatc ctctaccgag cgcgcgcgaa gactacggag 60 gtcgactcgg gagcgcgcac gcagctccgc cccgcgtccg acccgcggat cccgcggcgt 120 ccggcccggg tggtctggat cgcggaggga atgccccgga gggcggagaa ctgggacgag 180 gccgaggtag gcgcggagga ggcaggcgtc gaagagtacg gccctgaaga agacggcggg 240 gaggagtcgg gcgccgagga gtccggcccg gaagagtc 278

Claims (12)

1. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 VHL(von Hippel-Lindau) 프로모터 및 상기 프로모터에 융합된 형광 단백질 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 형광 단백질은 초파리 루시퍼레이즈, 증강된 녹색형광 단백질 (EGFP, enhanced green fluorescent protein), 또는 청색형광 단백질(CFP, cyan fluorescent protein)인 재조합 발현 벡터.
3. 제1항에 있어서, 상기 VHL 프로모터는 서열번호 5의 프로모터인 재조합 발현 벡터.
4. 제1항에 있어서, 상기 형광 단백질은 초파리 루시퍼레이즈인 재조합 발현 벡터.
5. 제1항에 있어서, 도 2에 개시된 개열지도를 갖는 것인 재조합 발현 벡터.
6. 제1항의 재조합 발현벡터 및 레닐라-루시퍼레이즈를 포함하는 pRL-SV40 플라스미드 벡터로 형질전환된 세포주.
7. 제6항의 형질전환 세포주를 플레이트에 배양하는 단계;

   상기 플레이트의 각 플레이트에 검색하고자 하는 시료를 첨가하고 산소결핍(hypoxia) 상태에서 배양하는 단계; 및

   이로부터 발현된 형광 단백질의 형광 및 레닐라 루시퍼레이즈의 형광을 측정하는 단계를 포함하는 DNA　메틸트렌스퍼레이즈 억제제 스크리닝 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 형광 단백질은 초파리 루시퍼레이즈인 DNA　메틸트렌스퍼레이즈 억제제 스크리닝 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제는 줄기세포 또는 체세포의 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제인 스크리닝 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 DNA 메틸트렌스퍼레이즈 억제제는 뇌신경 질환 치료제, 혈액질환 치료제, 항종양제, 또는 후생학적(epigenetic) 조절제인 스크리닝 방법.
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