DE102015201100B4 - Antivirale Mittel - Google Patents

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Abstract

Verwendung einer Verbindung, die den proteolytischen Abbau des retroviralen Proteins p6 hemmt, zur Prophylaxe oder Behandlung einer retroviralen Infektion und/oder deren Folgekrankheiten.

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer Verbindung, die den proteolytischen Abbau des retroviralen Proteins p6 hemmt, zur Prophylaxe oder Behandlung einer retroviralen Infektion und/oder deren Folgekrankheiten, die Verwendung besagter Verbindungen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung der besagten Erkrankungen, besagte pharmazeutische Zusammensetzungen, Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die den proteolytischen Abbau des retroviralen Proteins p6 hemmen sowie Verfahren zur Prophylaxe oder Therapie einer retroviralen Infektion und/oder deren Folgekrankheiten.
  • Infektionen mit Retroviren und die daraus entstehenden primären und sekundären, meist chronischen Erkrankungen bilden einen bedeutsamen und oftmals bedrohlichen Teil viraler Infektionserkrankungen. Prominentes Beispiel ist die Infektion mit humanen Immundefizienzviren Typ 1 und Typ 2 (HIV-1/HIV-2) und dem dadurch verursachten Ausbruch des erworbenen Immunmangelsyndroms (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) beim Patienten.
  • Lentiviren bilden eine Untergruppe der Retroviren. Diese integrieren ihre Erbinformation in das Genom einer Wirtszelle, um sich mit deren Hilfe zu vermehren. Im Virus liegt das Genom in Form einer einsträngigen RNA vor. Damit dieses sich in das Genom der Wirtszelle integrieren kann, muss es zuvor mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben werden. Bisherige Behandlungsansätze bei retroviralen Erkrankungen waren daher stets auf eine Interaktion mit der Reversen Transkriptase (RT) oder den für die Vermehrung zuständigen Enzyme wie der Protease (PR) oder Integrase (IN) fokussiert.
  • Seit Anfang der 1980er Jahre hat die AIDS-Pandemie Millionen von HIV-infizierten Menschen mit einer multisystemischen und bisher unheilbaren Krankheit konfrontiert. Ursprünglich war der Verlauf dieser Erkrankung in den allermeisten Fällen tödlich. Heutzutage steht eine medizinische Behandlungsmöglichkeit zur Verfügung, die Hochaktive antiretrovirale Therapie (HAART; offenbart in WO 00/33654 ). Diese ermöglicht bei lebenslanger Anwendung das Überleben der Patienten, so dass eine HIV-Infektion bzw. AIDS zu einer chronischen Erkrankung geworden ist. Versagt diese Therapie, ist der Verlauf jedoch weiterhin tödlich. Die HAART ist jedoch teuer und mit gravierenden Nebenwirkungen verbunden. Darüber hinaus ist diese Therapie dadurch limitiert, dass HIV-1 eine enorme, im Vergleich mit der Replikation humaner DNA bis 106-mal höhere Evolutionsrate aufweist, bedingt durch Fehler der Reversen Transkriptase (z.B. Basenpaaraustausch) und einer extrem hohen Reproduktion (bis zu 109 Nachkommenviren pro Tag). Der dadurch bedingte Polymorphismus führt zwangsläufig und in relativ kurzer Zeit zum Auftreten von mutanten HIV-1-Formen, die gegenüber einzelnen und sogar kombinierten anti-HIV-Therapeutika wie der HAART resistent sind. Aufgrund dieses hohen Resistenzrisikos und der mitunter schwerwiegenden Nebenwirkungen bis hin zur Medikamentenunverträglichkeit besteht daher ein Bedarf, neue Wirkstoffe zur HIV-Therapie zu entwickeln. Daher ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, derartige neue Wirkstoffe bereitzustellen. Besonders vorteilhaft wäre es, wenn neue zelluläre Angriffspunkte („Targets“) identifiziert werden könnten.
  • Überraschenderweise wurde gefunden, dass diese Aufgabe gelöst wird durch Verbindungen, die den Abbau des Gag-Proteins p6 hemmen. Diese erweisen sich für die Behandlung und Prophylaxe retroviraler Infektionserkrankungen (wie z.B. einer HIV-1 Infektion) als hervorragend geeignet. Mit der vorliegenden Erfindung wird ein neuartiges Wirkprinzip offenbart und ein vielversprechender Behandlungsansatz zur Verfügung gestellt. In den nebengeordneten Ansprüchen und Unteransprüchen werden weitere vorteilhafte Gegenstände und Ausführungsformen der Erfindung zur Lösung der oben genannten Aufgabe genannt.
  • Der Humane Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) gehört zur Familie der Retroviren (Gattung: Lentiviridae). Das HIV-1-Genom hat eine Länge von ca. 9 kbp und besitzt drei offene Leserahmen, Gag (group-specific antigens), Pol (PR, RT, Integrase (IN)) und Env (Glykoproteine gp41 und gp120, envelope glycoproteins). Zusätzlich zu diesen bei allen Retroviren kanonisch vorkommenden kodiert HIV-1 für sechs weitere regulatorische Proteine. Tat und Rev sind für die Virusreplikation essentiell. Die akzessorischen Proteine Nef, Vpr, Vif und Vpu sind zwar für die Replikation in Zellkultur nicht zwingend notwendig, spielen aber in vivo eine wichtige Rolle.
  • Die Hauptkomponenten der HIV-Strukturproteine (Matrix (MA), Capsid (CA) und Nukleocapsid (NC)) werden in Form von drei Polyproteinen translatiert: Gag und Gag-Pol enthalten die inneren Matrix- und Capsid-Proteine und viralen Enzyme, wohingegen Env die viralen Hüllproteine umfasst. Bei HIV-1 wird das Gag-Polyprotein Pr55 mittels Proteolyse posttranslational in MA, CA, NC und das COOHterminale p6-Protein prozessiert. Nicht-infektiöse Viruspartikel werden von der Plasmamembran abgeschnürt, was als Virus-Budding bezeichnet wird. Unmittelbar nach oder schon während des Buddings beginnt nach Aktivierung der viralen Protease die proteolytische Prozessierung der Gag und Gag-Pol-Polyproteine. Die proteolytische Reifung von Gag geht mit der Ausbildung eines für das reife Virus typischen kegelförmigen Capsids einher.
  • Hinsichtlich seiner biologischen Funktion ist das reife p6-Protein das bisher am wenigsten erforschte Gag-Protein. Seine Funktion und mögliche physiologische Interaktionen mit der Wirtszelle sind noch weitgehend unverstanden. Als Bestandteil des Pr55 Gag-Proteins kommt p6 jedoch eine wichtige Rolle bei der Virusassemblierung und dem Budding zu. Der finale Abtrennungsschritt naszierender Virionen wird durch zwei late (L)-Domänen vermittelt. Die Inkorporierung des akzessorischen HIV-1 Proteins Vpr in nascente Virionen wird über das LxxLF-Motiv von p6 erleichtert. P6 ist ein Phosphoprotein, das meist ubiquitinyliert an den Lysinen 27 und 33 sowie zusätzlich SUMOyliert (,small Ubiquitin-related modifier‘) an Lysin 27 vorliegt.
  • Die bislang bekannten Funktionen von p6 betreffen jedoch nur p6 als C-terminale Domäne des Pr55 Gag-Polyproteins. Die Funktion des prozessierten abgespaltenen p6 bleibt jedoch unklar. Untersuchungen an freiem p6 in der Wirtszelle sind dadurch erschwert, dass p6 sehr schnell abgebaut wird. Es konnte nachgewiesen werden, dass freies p6 für kurze Zeit existiert haben muss, da p6 zuzuordnende Epitope auf MHC-I-Molekülen nachgewiesen werden konnten. Die Halbwertszeit von des freien p6 beträgt weniger als 10 Minuten.
  • Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der zellulären Protease Insulin abbauendes Enzym (IDE) (1) (z.B. UniProt - Datenbank: P14735) dosisabhängig zu einer Hemmung des proteolytischen Abbaus von p6 führte. Diese inhibitorische Wirkung konnte für eine Reihe von Substanzen oder Substanzgruppen gezeigt werden:
    1. a) den kompetitiven IDE-Inhibitor Insulin;
    2. b) das Polypeptid-Antibiotikum Bacitracin, das eine schwache Affinität zu IDE aufweist;
    3. c) ATP;
    4. d) NEM (N-Ethylmaleimid) als Beispiel für eine Sulfhydryl-modifizierende Verbindung; sowie
    5. e) 6bK (2), ein sehr spezifischer IDE-Inhibitor mit einer IC50 von 50nM
  • Zur Abgrenzung zu dem Abbau durch weitere Proteasen wurden weitere Experimente durchgeführt. Ein Abbau durch die retrovirale Protease konnte aufgrund der Aminosäuresequenz von (viralem) p6 (= vp6) (z.B. NCBI Reference Sequence: NP_579883.1) ausgeschlossen werden. Sequenzidentisches synthetisches p6 (sp6; (3)) wird jedoch in zellulären Extrakten abgebaut. Es zeigte sich, dass für den proteolytischen Abbau die Anwesenheit bivalenter Kationen notwendig ist, denn die IDE ist eine Metalloprotease und benötigt Zn2+ als Cofaktor. Bei der Zugabe von Chelatoren zeigte sich, dass 1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrakis (BAPTA), das eine hohe Affinität zu Ca2+ und Mg2+ aufweist, nicht in der Lage war, den Abbau von sp6 zu hemmen, wohingegen N,N,N',N'-tetrakis(2-pyridylmethyl)ethane-1,2-diamine (TPEN), das hoch spezifisch Übergangsmetalle chelatiert, dies vermochte. Dadurch kamen nur noch die zytosolisch vorkommenden Aminopeptidasen Leucin-Aminopeptidase (LAP) und Puromycin-sensitive Aminopeptidase (PuSA) sowie die Endo-Peptidasen Thimetoligopeptidase (TOP), Neurolysin, Nardilysin (NRD) und Endothelin-umwandelndes Enzym 1b (ECE-1b) als weitere p6 abbauende Proteasen neben IDE in Frage. LAP und TOP erkennen nur kürzere Peptide als p6. Für NRD gibt es keine Target-Sequenz auf p6. ECE-1b konnte ausgeschlossen werden, da diese für Phosphoramidon sensitiv ist, was aber sp6 in vitro nicht stabilisieren konnte. Durch Zugabe der PuSA-Inhibitoren Phebestin oder PAQ-22 konnte der proteolytische Abbau von p6 nicht gehemmt werden.
  • Somit zeigte sich, dass IDE die einzige zelluläre Protease ist, die p6 abbauen kann. Es handelt sich daher um einen hochspezifischen neuartigen Mechanismus.
  • IDE (Insulin-abbauendes Enzym; synonym: insulin-degrading enzyme, Insulysin, Insulinase, Insulin-Protease) wurde zum ersten Mal 1949 beschrieben und kommt sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten vor (1). Das Molekulargewicht beträgt ca. 110 kDa. Sie besteht aus zwei großen Untereinheiten mit jeweils ca. 55 kDa, die über eine 28 Aminosäuren-langen Linker verbunden sind. Phylogenetisch gehört IDE zu der M16-Familie der Metalloproteasen. Sie benötigt Zn2+ in ihrem aktiven Zentrum. Im Unterschied zu anderen Metalloproteasen verfügt sie über das invertierte Zink-Bindungsmotiv HxxEH und ist sensitiv für Thiol-alkylieriende Verbindungen. Sie kommt vor allem im Zytosol vor, aber auch in den Mitochondrien und Peroxysomen. Der Sekretionsmechanismus ist jedoch bisher wenig verstanden. Bisher bekannte natürliche Substrate sind Insulin, Glucagon, Somatostatin, Beta-Amyloid (Aß), Amylin, Atriales natriuretisches Peptid (ANP, synonym: ANF), β-Endorphin, TGF-α, jeweils mit einer unterschiedlichen Affinität. Gemäß ihrer Substrate kommt der IDE u.a. eine regulatorische Wirkung bei der Kontrolle des Blutzuckerspiegels, der Ausbildung bzw. Progression von Morbus Alzheimer, der Blutdruckregulation, der Immunregulation, der Langzeitregulation der Nahrungsaufnahme, Osteoporose, gastroduodenalen Ulcusblutungen und der Hormonbildung in der Hypophyse zu. Wahrscheinlich aufgrund seiner Funktion im Kohlenhydratstoffwechsel ist es während der Evolution stark konserviert worden. IDE-Knock-Out-Mäuse sind vital, weisen aber höhere Insulinspiegel im Blut und Aß-Spiegel im Gehirn auf (4,5).
  • Eine Besonderheit der IDE ist, dass ihre Substrate kein gemeinsames Erkennungsmotiv aufweisen, an denen sie gespalten werden. Als Tendenz lässt sich eine leichte Präferenz von hydrophoben und basischen Aminosäureresten herauslesen. Ein Substrat kann auch mehrere Aminosäuresequenzen aufweisen, an denen es von der IDE gespalten wird. Bei der IDE sind dies ca. 10 Positionen. Die drei wichtigsten Spaltstellen bei p6 sind 15F/R16, 25S/Q26 und 41L/R42.
  • Mit p6 wurde ein bislang unbekanntes Substrat der IDE identifiziert, dem eine zentrale Rolle bei der Entstehung und Manifestierung retroviraler Infektionserkrankungen zukommt. Eine Hemmung der IDE zu therapeutischen Zwecken wäre daher geeignet, den proteolytischen Abbau von p6 im Zytosol zu unterbinden.
  • IDE konnte in allen Zelltypen nachgewiesen werden, die als Wirtszelle für Retroviren, insbesondere HIV dienen können.
  • Die Gabe von spezifischen siRNAs (small interfering RNAs), die an die entsprechende mRNA-Sequenz der IDE binden und somit einen sog. Knock-Down induzieren, verhindert den Abbau von sp6 als auch von viralem p6 (vp6) in vitro.
  • Enzymkinetische Untersuchungen zeigten, dass die IDE p6 ca. 100 mal spezifischer abbaut als Insulin (Der Km-Wert für Insulin beträgt 22-180 nM, der für p6 1,1 nM). Dies würde ein therapeutisches Fenster eröffnen, in dem bereits eine leichte Inhibition der IDE einen großen Effekt auf die p6-Konzentration in der Wirtszelle hat, während andere natürliche Substrate, wie z.B. Insulin, und der damit zusammenhängende Stoffwechsel nicht oder nur in geringem Masse beeinflusst wären.
  • Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass eine zunehmende Stabilität von p6 die Replikationskapazität von HIV-1 in T-Zellen abhängig von der Inhibitorkonzentration der IDE herabsetzt. Die Aktivität der IDE schafft somit einen Replikationsvorteil für HIV, eine Hemmung von IDE löst somit einen anti-retroviralen Effekt aus. Aus dem Stand der Technik war bisher kein Zusammenhang zwischen p6 und der Replikationskapazität von HIV-1 bekannt.
  • Dieser Effekt wurde bei Replikationsstudien an Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC)-Kulturen verschiedener menschlicher Spender entdeckt. Für vergleichende Studien wurden Mutanten von p6 erzeugt, in denen die natürliche Aminosäuresequenz PTAPPE, die von der IDE gespalten wird, in multipler (zwei-, drei- oder viermal hintereinander) Form in die Sequenz von p6 eingefügt. Es zeigte sich, dass mit der Anzahl der PTAPPA-Motive die Replikationsfähigkeit von HIV signifikant abnahm. Die Integration von PTAPPA-Motiven führte dosisabhängig zu einer Reduktion der HIV-Replikationsfähigkeit von bis zu 70%. Die Stabilisierung von p6 ist offensichtlich in der Lage, die Replikation von HIV massiv zu hemmen. Es wurden Substanzen getestet, die die IDE und damit den p6-Abbau hemmen.
  • Insulin ist das bekannteste physiologisch vorkommende Substrat der IDE. Hierbei wirkt Insulin als kompetitiver Inhibitor, da er mit p6 um die IDE konkurriert. Eine kontinuierliche Behandlung mit 50 µg/ml Insulin, welches bei jedem Mediumwechsel alle drei Tage hinzugefügt wurde, war in der Lage, die HIV-Replikationsfähigkeit in primären PBMC-Kulturen um bis zu 50% senken. Des Weiteren kann exogen hinzugefügtes Insulin die Infektiösität von HIV-1 dosisabhängig um den Faktor 2 senken.
  • Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der spezifische IDE-Inhibitor 6bK dosisabhängig (1nM-10µM) den proteolytischen Abbau von p6 hemmen kann und daraus resultierend dosisabhängig die HIV-1 Replikationskapazität in PBMCs sowie die Infektiösität von HI-Viren verringert werden konnte.
  • Aus diesen Experimenten ergab sich, dass die Hemmung des proteolytischen Abbaus von p6 durch eine Hemmung der IDE erreicht werden kann. Wird dieser Schritt inhibiert, wird die Vermehrung der Viren effektiv gehemmt (siehe Ausführungsbeispiele 14-20) und die Infektiösität der HI-Viren signifikant gehemmt. Somit kann die Virusinfektion therapiert oder zumindest die Virenlast stark eingeschränkt werden, so dass das körpereigene Immunsystem deutlich besser in der Lage ist, die virale Infektion zu kontrollieren und zu bekämpfen.
  • Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Verbindungen, die den proteolytischen Abbau des retroviralen Proteins p6, insbesondere HIV-1 Gag Proteins p6 hemmen, in der Medizin und der Tiermedizin, insbesondere zur Prophylaxe oder Behandlung einer retroviralen Infektion und/oder deren Folgekrankheiten, vorzugsweise von Primaten, besonders bevorzugt von Menschen.
  • Des Weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Kombination der vorgenannten Verbindungen mit Standard HAART, um das Auftreten von medikamenten-resistenten Viren zu reduzieren und die Therapie-Effizienz zu erhöhen. Diese erfindungsgemäße Verwendung der vorgenannten Verbindungen eignet sich zur Behandlung von retroviralen Infektionen und/oder ihrer Folgekrankheiten sowie zur Prophylaxe der Manifestation retroviraler Erkrankungen.
  • Des Weiteren offenbart die vorliegende Anmeldung die Verwendung eines IDE-Inhibitors zur Behandlung von retroviralen Infektionen und/oder ihrer Folgekrankheiten sowie zur Prophylaxe der Manifestation retroviraler Erkrankungen.
  • Geeignete Substanzen oder Substanzgruppen im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind alle Substrate der IDE, insbesondere physiologisch vorkommenden Substrate wie Insulin, Glucagon, Somatostatin, β-Amyloid, Amylin, Atriales natriuretisches Peptid, β-Endorphin, TGF-α sowie Kombinationen davon. Diese wirken kompetitiv. Eine mögliche therapeutische Konzentration sollte sich umgekehrt proportional zu ihrer jeweiligen Affinität zur IDE bemessen. Mit einem genügend großen Angebot an kompetitivem Substrat wird p6 nicht von der IDE degradiert und die Replikationsfähigkeit wie auch die Infektiösität der Retroviren signifikant gesenkt.
  • Weitere als IDE-Inhibitoren geeignete Substanzen sind Polypeptid-Antibiotika wie Bacitracin, Tyrothricin, Polymyxin B und Colistin, die aufgrund ihrer Molekülstruktur eine Affinität zu IDE aufweisen.
  • Wie zuvor beschrieben braucht IDE Zn2+ essentiell als Cofaktor. Entzieht man dem Zytosol die Zn2+ oder senkt deren Konzentration, wird damit auch die IDE gehemmt bzw. in ihrem Turn Over wesentlich herabgesetzt. Zudem konkurrieren eine beachtliche Anzahl weiterer Enzyme mit der IDE um die Zn2+. Zu diesem Zwecke geeignet sind physiologisch verträgliche Zink-Chelatoren.
  • Beispiele dafür sind Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1,3-Diaminopropan-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (DTPA), N,N,N',N'-Tetrakis(2-pyrdiylmethyl)ethylendiamin (TPEN), 1,10-Phenanthrolin, Clioquinol, Diethyldithiocarbamat (DEDTC), 2,3-Dimercapto-1-propansulfonsäure (DMPS), Ethylendiamin-N,N'-Diacetyl-N,N'-di-B-Propionsäure (EDPA), 1,2-Dimethyl-3-hydroxy-4-pyridinon (DMHP), 1,2-Diethyl-3-hydroxy-4-pyridinon (DEHP), Ethylmaltol (EM), 4-(6-Methoxy-8-quinaldinyl-aminosulfonyl)benzoesäure Kaliumsalz, (TFLZn), Dithiozon, N-(6-Methoxy-8-quinolyl)-para-toluolsulfonamid (TSQ), Carnosin, Deferasirox, trans-1,2-Cyclohexan-diamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (CyDTA), Dihydroxyethylglycin (DHEG), 1,3-Diamino-2-hydroxypropan-N,N,N',N'-tetraessigsäure (DTPA-OH), Ethylendiamin-N,N'-diessigsäure (EDDA), Ethylendiamin-N,N'-dipropionsäure (EDDP), Ethylendiamin-N,N'-bis(methylphosphonsäure) (EDDPO), N-Hydroxy-ethylendiamin-N,N',N'-triessigsäure (EDTA-OH), Ethylendiamintetra(methylenphosphonsäure) (EDTPO), N,N'-bis(2-Hydroxybenzyl)ethylendiamin-N,N'-diessigsäure (HBED), Hexamethylen-1,6-diamintetraessigsäure (HDTA), Hydroxyethyliminodiessigsäure (HIDA), Iminodiessigsäure (IDA), Methyl-EDTA, Nitrilotriessigsäure (NTA), Nitrilotripropionsäure (NTP), Nitrilotrimethylenphosphonsäure (NTPO), 7,19,30-Trioxa-1 ,4, 10, 13, 16, 22, 27, 33-octaazabicyclo[11, 11, 11]pentatriacontane (O-Bistren), Triethylentetraaminhexaessigsäure (TTHA), Ethylenglykol-bis(2-Aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), Dimercaptobernsteinsäure (DMSA), Deferoxamin, Dimercaprol, Zinkcitrat, Kombination von Wismut und Citrat, Penicilamin, Succimer, Etidronat, Ethylendiamin-di(O-hydroxyphenylessigsäure) (EDDHA), trans-1,2-Cyclohexandiamintetraessigsäure (CDTA), N-(2-Hydroxyethyl)ethylendinitrilotriessig-säure (HEDTA), N-(2-Hydroxyethyl)iminodiessigsäure (HEIDA), Calprotectin, Zinkfinger, Lactoferrin, Ovotransferrin, Conalbumin, N4pY sowie Kombinationen davon. Physiologisch verträgliche Zink-Chelatoren werden bevorzugt.
  • Eine weitere geeignete Verbindung im Sinne der Erfindung als IDE-Inhibitor ist ATP.
  • Sulfhydryl-modifizierende Substanzen sind ebenfalls geeignet im Sinne der Erfindung als IDE-Inhibitoren. Wie zuvor ausgeführt braucht die IDE Zn2+ als Cofaktor. Bei allen bekannten Zn2+-abhängigen Enzymen interagiert dabei Zn2+ mit einem Cystein-Rest des jeweiligen Enzyms in einer katalytischen Domäne des Enzyms. Durch Modifikation der Sulfhydrylgruppe des Cystein-Rests wird diese Interaktion unterbunden („cysteine switch“), wodurch eine Aktivierung des Zn2+-abhängigen Enzyms unterbleibt. Geeignete Substanzen hierzu sind beispielsweise NEM (N-Ethylmaleimid), APMA (4-Aminophenyl-Quecksilberacetat), HgCl2, EMCA (N-ε-Maleimidcapronsäure), MMTS (Methylmethanthiosulfonat), MTSES (Methanthiosulfonat-Ethylsulfonat), MTSEA (Methanthiosulfonat-Ethylammonium), Thimerosal (Thiomersal, Natrium-2-(ethylmercurithio)benzoat), lodessigsäure, Monobromobiman.
  • Wie zuvor beschrieben kann die IDE auch auf genetischer Ebene, zum Beispiel durch spezifische siRNAs inhibiert werden, die an die Nukleotidsequenz ihrer mRNA bindet und damit ihre Translation zu IDE verhindert. Ein Beispiel für die Sequenz einer solchen siRNA ist: ACACUGAGGUUGCAUAUUUUU (Sense-Sequenz). Die Techniken, weitere geeignete siRNAs herzustellen und mit der mRNA der IDE interagieren zu lassen, sind dem Fachmann bekannt (6).
  • Vor kurzem wurde eine Substanz 6bK beschrieben, die ein hochselektiver membrangängiger Inhibitor der IDE ist ( WO 2013/006451 A2 ; Maianti et al. 2014, Nature 511, 94-98). Die IC50 beträgt 50 nM. Aus einer Substanzbibliothek von 20-gliedrigen Makrozyklen wurde 6bK als die am geeignetste identifiziert. Es wird eine Verwendung in der Therapie von Typ-2-Diabetes diskutiert. 6bK ist frei kommerziell erhältlich (Phoenix Pharmaceuticals INC., Cat. No: 001-17 (2014)).
  • Der WO 2013/006451 A2 ist zu entnehmen, dass grundsätzlich alle Verbindungen der nachfolgenden allgemeinen Formel (I) aufgrund ihrer gemeinsamen Strukturmerkmale als 20-gliedrigen Makrozyklen geeignet sind, die IDE in signifikanter Weise zu hemmen.
    Figure DE102015201100B4_0001
    worin R1 für -H, -CH3, -CH2-CH2-C(=O)-NH2, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH3 +, -CH2-CH2-CH2-NH-C(=NH)-NH2, -(CH2)n-cyclohexyl, -(CH2)n-cyclopentyl, -(CH2)n-cyclobutyl,-(CH2)n-cyclopropyl, -(CH2)n-phenyl steht;
    R2 für -H oder -(CH2)n-CH3 steht;
    R3 für -C(=O)-NH2 oder -CH2-C(=O)-NH2 steht;
    und n jeweils unabhängig voneinander entweder 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
  • Daher bezieht sich die vorliegende Anmeldung ebenfalls auf die Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur Hemmung der IDE und damit zur Hemmung des proteolytischen Abbaus von p6 durch die IDE.
  • Bevorzugt ist, wenn
    R1 für-H, -CH3, -CH2-CH2-C(=O)-NH2, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH3 +, -CH2-CH2-CH2-NH-C(=NH)-NH2, -(CH2)n-cyclohexyl oder -(CH2)n-cyclopropyl steht,
    R2 für -H, -CH3 oder C2H5 steht; und
    R3 für -C(=O)-NH2 steht.
  • Besonders bevorzugt ist, wenn R1 für -CH2-CH2-CH2-CH2-NH3 +, R2 für -H und R3 für - C(=O)-NH2 steht. Diese Substanz ist als 6bK bezeichnet (allgemeine Formel (II)).
    Figure DE102015201100B4_0002
  • Daher bezieht sich die vorliegende Anmeldung insbesondere auf die Verwendung der Verbindung gemäß Formel II (6bK) als IDE-Inhibitor und als Inhibitor des Abbaus von p6 durch die IDE zu Prophylaxe oder Behandlung retroviraler Infektionen und deren Folgeerkrankungen.
  • Gleichermaßen bezieht sich die vorliegende Anmeldung auf die erfindungsgemäße Verwendung aller pharmazeutisch verträglichen Salze, Solvate, Hydrate, Stereoisomere, Polymorphe, Tautomere, isotopisch angereicherte Formen oder Prodrugs von Verbindungen der allgemeinen Formel I, vorzugsweise von 6bK sowie deren Derivate und Analoge.
  • Offenbart wird ferner die Verwendung der erfindungsgemäß vorgenannten Verbindungen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung von retroviralen Infektionen und/oder ihrer Folgekrankheiten sowie zur Prophylaxe der Manifestation retroviraler Erkrankungen.
  • Besagte retrovirale Infektion und/oder ihrer Folgekrankheiten betreffen insbesondere solche Viren, die p6 exprimieren wie z.B. der Gattung der Lentiviren umfassend HIV-1-Infektion, HIV-2-Infektion, AIDS, AIDS-Folgekrankheiten, assoziiert mit einer HAART-Behandlung auftretende Krankheit oder Schädigung, FIV (Felines Immundefizienzvirus)-Infektion, SIV (Simianes Immundefizienzvirus)-Infektion, BIV (Bovines Immundefizienzvirus)-Infektion, Jembrana-Disease-Virus-Infektion, MW (Maedi-Visna-Virus)-Infektion, CAEV (Caprines Arthritis-Enzephalitis-Virus)-Infektion und EIAV (Virus der equinen infektiösen Anämie)-Infektion sowie der Gattungen der Alpharetroviren, Betaretroviren, Gammaretroviren, Deltaretroviren, Epsilonretroviren und Foamyviren.
  • Im Sinne der vorliegenden Anmeldung soll der Begriff HIV oder HIV-1-Virus alle bekannten Gruppen und Subtypen umfassen, insbesondere Gruppe M mit den Subtypen A (A1 - A4), B, C, D, E, F (F1 - F2), G, H, I, J, K und den CRFs (circulating recombinant forms), sowie die Gruppen N, O und P.
  • Beispielhaft genannt für Alpharetroviren seien das Rous-Sarkom-Virus, Aviäre Leukosevirus und Aviäre Myeloblastose-Virus.
  • Beispielhaft genannt für Betaretroviren seien das Maus-Mammatumorvirus, enzootische nasale Tumorvirus (ENTV-1, ENTV-2) und die simianen Retroviren Typus 1- 3 (SRV-1, SRV-2, SRV-3).
  • Beispielhaft genannt für Gammaretroviren seien das feline Leukosevirus (FeLV), murine Leukämievirus (MLV), feline Sarkom-Virus (FeSV), gibbon ape leukemia virus, guinea pig type-C oncovirus, porcine type-C oncovirus, Koala-Retrovirus, Finkel-Biskis-Jinkins murine Sarkom-Virus, Gardner-Amstein feline Sarkom-Virus, Hardy-Zuckerman feline Sarkom-Virus, Harvey murine Sarkom-Virus, Kirsten murine Sarkom-Virus, Moloney murine Sarkom-Virus, Snyder-Theilen feline Sarkom-Virus, Woolly monkey Sarkom-Virus, Vipern-Retrovirus, chick syncytial virus, Retikuloendotheliose-Virus und Trager duck spleen Nekrose-Virus.
  • Beispielhaft genannt für Deltaretroviren seien das bovine Leukämie-Virus, humane T-lymphotrope Virus Typ 1 und 2 (HTLV-1, HTLV-2) und die simianen Viren STLV-1 und STLV-2.
  • Beispielhaft genannt für Epsilonretroviren seien das Walleye dermal sarcoma virus (WDSV) und walleye epidermal hyperplasia virus1 und 2 (WEHV1, WEHV2).
  • Beispielhaft genannt für Foamyretroviren seien das Schimpansen-Spumavirus, simiane Spumavirus und humane Spumavirus.
  • Es konnten immer wieder Spezies-übergreifende Übertragungen von Viren nachgewiesen werden, so dass die genannten gegebenenfalls veterinärmedizinisch oder für die Grundlagenforschung relevanten Viren eines Tages für den Menschen und damit bedeutsam werden könnten.
  • Erdindungsgemäß bedeutet der Begriff „p6“ bevorzugt das virale oder synthetische Polypeptid p6 (insbesondere aus HIV-1 (z.B. NCBI Reference Sequence: NP_579883.1), HIV-2 (z.B. UniProt Datenbank: P04584) und SIV (z.B. UniProt Datenbank: P05892) sowie deren strukturelle und funktionelle Analoge oder Derivate. In einer erweiterten Auslegung der Erfindung umfasst der Begriff „p6“ auch zu p6 funktionsanaloge retrovirale Proteine wie z.B. p9 (EIAV; (7)) oder p8 (HTLV; (8)). Funktionsanalog bedeutet erfindungsgemäß insbesondere, dass der Abbau des retroviralen Proteins für den Infektions- und Krankheitsverlauf wesentlich ist und durch die Hemmung des Abbaus mittels der erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen und Wirkstoffe ein therapeutischer Ansatz gegeben ist. Vorzugsweise betreffen die Erfindungsgegenstände der vorliegenden Anmeldung die Inhibition von p6 in Wirbeltieren, insbesondere in Primaten und ganz besonders im Menschen.
  • AIDS ist bekanntlich eine Folge einer HIV-1- oder HIV-2-Infektion beim Menschen, solange ein Ausbruch nicht durch eine HAART-Therapie (s.o.) unterdrückt wird.
  • Ist AIDS bereits ausgebrochen, kann dies neben der charakteristischen Immunschwäche eine Reihe von AIDS-Folgekrankheiten zur Folge haben. Durch eine erfindungsgemäße therapeutische Behandlung einer HIV-Infektion und/oder von AIDS können also auch diese Erkrankungen geeignet behandelt werden. Bekannte AIDS-Folgekrankheiten sind HIV-induzierte Demenz, insbesondere verursacht durch von HIV-Infektionen von Neuronen, Glia-Zellen und Endothelzellen in zerebralen Kapillaren; HIV-induzierte Nephropathie (HIVAN); AIDS-assoziierte Lipodystrophie; AIDS-assoziierter pulmonärer Bluthochdruck; bakterielle, virale oder fungale opportunistische Infektionen wie Candidose der tiefen Atemwege, Chronische intestinale Isosporiasis, Chronische intestinale Kryptosporidiose, CMV (Cytomegalie-Virus)-Infektion, Koccidioidomykose, Herpes-Simplex-Infektion in Lunge, Bronchien oder Ösophagus, Histoplasmose, Kryptokokkose, Ösophageale Candidose, Pneumocystis carinii (jiroveci)-Pneumonie, Progressive multifokale Leukenzephalopathie (PML), rezidivierende Pneumonien, rezidivierende Salmonellensepsis, Toxoplasmose des zentralen Nervensystems, Tuberkulose, Nocardiose, Penicillinose, Aspergillose; Aphasie; Hemianopsie; Tumore wie Analkarzinom/Analkrebs, Burkitt-Lymphom, Zervixkarzinom, Kaposi-Sarkom, Primäre ZNS-Lymphome; Enzephalopathie und Wasting-Syndrom.
  • Die Medikamente, die zur HAART-Therapie bisher verwendet werden, haben sich als erfolgreich in der Unterdrückung des Ausbruches von AIDS erwiesen. Sie weisen jedoch eine Reihe schwerwiegender Nebenwirkungen auf, die aufgrund eines Mangels an Alternativen in Kauf genommen werden müssen. So kann assoziiert mit einer HAART-Behandlung u.a. gehäuft zum Auftreten von Krankheiten oder Schädigungen kommen, die ohne eine HAART-Behandlung so nicht beobachtet wurden. Zu dieser Gruppe von Erkrankungen zählt insbesondere Typ-2-Diabetes. Weitere wichtige Krankheiten und Schädigungen aus dieser Gruppe sind beispielsweise Polyneuropathie, Laktatazidose, Pankreatitis, Myelotoxizität, Kardiomyopathie, Lipodystrophie und Steatose. Durch eine Kombinationstherapie mit aus der HAART-Therapie bekannten Verbindungen und einer der zuvor genannten erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen können durch die dadurch erzeugte erhebliche Verminderung der Virenlast diese Krankheiten daher auch therapiert werden. Eine solche Verwendung ist ebenfalls zur Prophylaxe dieser HAART-Folgekrankheiten geeignet. Bei einer Monotherapie mit einer erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindung könnten diese HAART-Folgekrankheiten voraussichtlich völlig vermieden werden.
  • Somit bezieht sich die vorliegende Anmeldung daher auch auf den Einsatz einer erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindung zusammen mit mindestens einem weiteren Wirkstoff, wobei der besagte weitere Wirkstoff aus einer Gruppe umfassend Reverse Transkriptase-Inhibitoren, Integrase-Inhibitoren, HIV-Protease-Inhibitoren, Proteasom-Inhibitoren, Deubiquitinylase (DUB)-Inhibitoren, Entry-Inhibitoren, HIV-Vakzine, Virostatika und Immunstimulanzien ausgewählt wird.
  • Zu einer solchen Kombinationstherapie geeignete Reverse Transkriptase-Inhibitoren sind Nukleosidische Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) und Nicht-Nukleosidische Reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI). Beispiele für NRTI sind, ohne abschließend zu sein, Abacavir, Didanosin, Emtricitabin, Lamivudin, Stavudin, Tenofovir, Zidovudin, Zalcitabin, Entecavir, Adefovir, Elvucitabin, Fosalvudin(-tidoxil), Fozivudintidoxil, Lagiciclovir, Alamifovir, Clevudin, Pradefovir, Telbivudin. Beispiele für NNRTI sind, ohne abschließend zu sein, Efavirenz, Etravirin, Nevirapin, Rilpivirin, Delavirdin, Emivirin, Lersivirin.
  • Für die erfindungsgemäß einsetzbaren Kombinationen sind Integrase-Inhibitoren wie beispielsweise Raltegravir, Elvitegravir, Dolutegravir, MK-2048 geeignet (9-11).
  • Beispiele für die erfindungsgemäß einsetzbaren Kombinationen sind geeignete HIV-Protease-Inhibitoren wie Saquinavir, Indinavir, Ritonavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir, Atazanavir, Fosamprenavir, Tipranavir, Darunavir, Brecanavir, Mozenavir, Tipranavir.
  • Beispiele für die erfindungsgemäß einsetzbaren Kombinationen sind geeignete Entry-Inhibitoren wie Enfuvirtid und Malaviroc.
  • Ein Beispiel für die erfindungsgemäß einsetzbaren Kombinationen sind geeignete Proteasom-Inhibitoren wie Bortezomib (Velcade®).
  • Beispiele für die erfindungsgemäß einsetzbaren Kombinationen sind geeignete DUB-Inhibitoren wie PR-619 und P22077 (12).
  • Allgemeine Virostatika, die für die erfindungsgemäß einsetzbaren Kombinationen geeignet sind, können aus der Gruppe umfassend Ancriviroc, Aplaviroc, Cenicriviroc, Enfuvirtid, Maraviroc, Vicriviroc, Amantadin, Rimantadin, Pleconaril, Idoxuridin, Aciclovir, Brivudin, Famciclovir, Penciclovir, Sorivudin, Valaciclovir, Cidofovir, Ganciclovir, Valganciclovir, Sofosbusvir, Foscarnet, Ribavirin, Taribavirin, Filibuvir, Nesbuvir, Tegobuvir, Fosdevirin, Favipiravir, Merimepodib, Asunaprevir, Balapiravir, Boceprivir, Ciluprevir, Danoprevir, Daclatasvir, Narlaprevir, Telaprevir, Simeprevir, Vanipevir, Rupintrivir, Fomivirsen, Amenamevir, Alisporivir, Bevirimat, Letermovir, Laninamavir, Oseltamivir, Peramivir, Zanamivir ausgewählt werden.
  • Allgemeine Immunstimulanzien, die für die erfindungsgemäß einsetzbaren Kombinationen geeignet sind, können aus der Gruppe umfassend Interferone (α-, β-, γ-, τ-Interferon) Interleukine, CSF, PDGF, EGF, IGF, THF, Levamisol, Dimepranol, Inosin ausgewählt werden.
  • Des Weiteren sind erfindungsgemäß Kombinationen der erfindungsgemäß einsetzbaren Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen mit Wirkstoffverstärkern wie Cobicistat möglich.
  • Die Begriffe „Medizin“ und „medizinisch“ umfassen sowohl die Human- als auch die Veterinärmedizin, vorzugsweise die Humanmedizin.
  • Der Begriff „Organismus“ bezieht sich auf ein Lebewesen, insbesondere Mensch oder Tier, das mit einem selbstregulierenden immunologischen System ausgestattet ist, vorzugsweise Wirbeltiere, insbesondere Primaten, ganz besonders Menschen.
  • Der Begriff „Wirtsorganismus“ wird im Sinne der Anmeldung für diejenigen Organismen verwendet, die von Viren, hier insbesondere Retroviren, nach einer Infektion mit ihnen zur Vermehrung genutzt werden.
  • Der Begriff „Wirkstoff“ bezeichnet in dieser Anmeldung die erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen mit pharmazeutischer Wirkung wie erfindungsgemäß definiert. Gegebenenfalls kann dieser Begriff weitere, aus dem Stand der Technik bekannte pharmazeutische Wirkstoffe für den kombinatorischen Einsatz umfassen.
  • Der Begriff „pharmazeutische Zusammensetzung“ bedeutet erfindungsgemäß mindestens einen erfindungsgemäß einsetzbaren Wirkstoff in einer pharmakologisch geeigneten Dosierung und Darreichungsform zusammen mit mindestens einem geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Hilfs- oder Trägerstoff, sowie alle Stoffe, die direkt oder indirekt als eine Kombination, Anhäufung, Komplexbildung oder Kristall aus den zuvor genannten Inhaltsstoffen entstehen, oder als Folge sonstiger Reaktionen oder Interaktionen, sowie optional mindestens einen weiteren, aus dem Stand der Technik bekannten pharmazeutischen Wirkstoff.
  • Der Ausdruck „Hilfsstoff“ wird in dieser Anmeldung verwendet, um jeden Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung neben dem erfindungsgemäß einsetzbaren Wirkstoff selbst zu beschreiben. Die Wahl eines geeigneten Hilfsstoffs hängt von Faktoren wie der Darreichungsform und der Dosierung ab sowie der Beeinflussung der Löslichkeit und Stabilität der Zusammensetzung durch den Hilfsstoff selbst.
  • Der Begriff „Wirkung“ beschreibt die spezifische, dem jeweiligen Wirkstoff innewohnende Wirkweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
  • Die Begriffe „Effekt“, „therapeutischer Effekt“, „Wirkung“, „therapeutische Wirkung“ in Hinblick auf mindestens einen erfindungsgemäß einsetzbaren Wirkstoff beziehen sich auf die kausal eintretenden vorteilhaften Folgen an einem Organismus, dem der mindestens eine besagte Wirkstoff verabreicht worden ist.
  • „Therapeutisch wirksame Menge“ meint im Sinne der Anmeldung, dass eine zur Erreichung des erwünschten therapeutischen Zweckes ausreichend große Menge des mindestens einen erfindungsgemäß einsetzbaren Wirkstoffs einem Lebewesen oder einem Patienten, der eine derartige Behandlung benötigt, verabreicht wird.
  • Die Begriffe „gemeinsame Verabreichung“, „kombinierte Verabreichung“ oder „zeitgleiche Verabreichung“ von mindestens einem erfindungsgemäß einsetzbaren pharmazeutischen Wirkstoff und/oder mindestens einem pharmazeutischen Wirkstoff aus dem Stand der Technik umfasst die Verabreichung der besagten Wirkstoffe zum selben Zeitpunkt oder zu sachlich bedingten nahe beieinanderliegenden Zeitpunkten sowie zeitlich versetzte Verabreichungen der besagten Wirkstoffe innerhalb eines zusammenhängenden Experimentes. Die Reihenfolge der Verabreichung der besagten Wirkstoffe wird durch diese Begriffe nicht beschränkt. Der Fachmann wird keine Schwierigkeiten haben, sich aus seinem Fach- und Erfahrungswissen die beschriebenen Verabreichungen in ihrer zeitlichen und örtlichen Abfolge aus der Beschreibung zu erschließen.
  • Der Begriff „Lebewesen“ bezieht sich auf jedes Tier, insbesondere Wirbeltier, besonders Primaten, besonders bevorzugt den Menschen. Ein „Patient“ im Sinne der Anmeldung ist ein Lebewesen, das an einer definierbaren und diagnostizierbaren Krankheit oder Disposition leidet und dem zum Zwecke der Prophylaxe oder Therapie ein geeigneter Wirkstoff appliziert wird.
  • Die Begriffe „Prophylaxe“, „Behandlung“ und „Therapie“ umfassen die Verabreichung mindestens eines erfindungsgemäß einsetzbaren Wirkstoffs, alleine oder in Kombination mit mindestens einem weiteren bereits bekannten pharmazeutischen Wirkstoff an ein Lebewesen, um die Ausbildung einer bestimmten Krankheit zu verhindern, zu inhibieren, die Symptome zu lindern oder einen Heilungsprozess der betreffenden Erkrankung zu initiieren.
  • Die erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen können als pharmazeutisch verträgliche Salze organischer und anorganischer Säuren vorliegen. Beispiele für geeignete Säuren sind Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Salizylsäure, p-Aminosalizylsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Sulfonsäure(n), Phosphonsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Ameisensäure, Propionsäure, Gluconsäure, Digluconsäure, Milchsäure, Weinsäure, Hydroxymaleinsäure, Brenztraubensäure, Phenylessigsäure, Benzoesäure, p-Aminobenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure, Dinitrobenzoesäure, Chlorbenzoesäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, salpetrige Säure, Hydroxyethansulphonsäure, Ethylensulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthylsulfonsäure, Sulfanilsäure, Camphersulfonsäure, Alginsäure, Caprylsäure, Hippursäure, Pektinsäure, Phthalsäure, Chinasäure, Mandelsäure, o-Methylmandelsäure, Hyrogenbenzolsulfonsäure, Pikrinsäure, Adipinsäure, Cyclopentanpropionsäure, D-o-Toluylweinsäure, Tartronsäure, Benzolsulfonsäure, α-Toluylsäure, (o, m, p)-Toluylsäure, Naphthylaminsulfonsäure, Zimtsäure, Acrylsäure, Trifluoressigsäure, Isobuttersäure, Phenylbuttersäure, Heptansäure, Xylosulfonsäure, Asparaginsäure, Borsäure, Buttersäure, Camphersäure, Laurylsäure, Laurylsulfonsäure, Glucoheptonsäure, Glycerophosphorsäure, Hexansäure, lodwasserstoffsäure, 2-Hydroxy-ethansulfonsäure, Lactobionsäure, Nikotinsäure, Ölsäure, Palmitinsäure, Embonsäure, Perschwefelsäure, Pivalinsäure, Stearinsäure, Thiocyansäure, Undecansäure, Valeriansäure sowie weitere mineralische Säuren oder Carbonsäuren, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Die Salze entstehen, indem die freie Base mit einer ausreichenden Menge der jeweiligen Säure in Kontakt gebracht wird, um das Salz auf herkömmliche Weise herzustellen.
  • Pharmazeutisch verträgliche Salze sind im vorliegenden Zusammenhang als ein Wirkstoff zu verstehen, der eine der erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen in der Form eines ihrer Salze enthält, insbesondere dann, wenn diese Salzform dem Wirkstoff im Vergleich zu der freien Form des Wirkstoffs oder irgendeiner anderen Salzform des Wirkstoffs besondere oder verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften verleiht. Die pharmazeutisch verträgliche Salzform des Wirkstoffs kann auch diesem Wirkstoff erst eine gewünschte pharmakokinetische Eigenschaft verleihen, über die er früher nicht verfügt hat, und kann sogar die Pharmakodynamik dieses Wirkstoffs in Bezug auf seine therapeutische Wirksamkeit im Körper positiv beeinflussen.
  • Die erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen können auch als Hydrate oder Solvate vorliegen. Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen bezeichnet, welche durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.
  • Die erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen können aufgrund ihrer Molekülstruktur chiral sein und können dementsprechend in verschiedenen enantiomeren Formen auftreten. Sie können daher in racemischer oder in optisch aktiver Form vorliegen. Da sich die pharmazeutische Wirksamkeit der Racemate bzw. der Stereoisomeren der erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen unterscheiden kann, kann es wünschenswert sein, die isolierten Enantiomere zu verwenden. In diesen Fällen kann das Endprodukt oder aber bereits die Zwischenprodukte in enantiomere Verbindungen, durch dem Fachmann bekannte chemische oder physikalische Maßnahmen, aufgetrennt oder bereits als solche bei der Synthese eingesetzt werden.
  • Im Falle eines Racemats werden aus dem Gemisch durch Umsetzung mit einem optisch aktiven Trennmittel Diastereomere gebildet. Als Trennmittel eignen sich z.B. optisch aktiven Säuren, wie die R- und S-Formen von Weinsäure, Diacetylweinsäure, Dibenzoylweinsäure, Mandelsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, geeignete N-geschützte Aminosäuren (z.B. N-Benzoylprolin oder N-Benzolsulfonylprolin) oder die verschiedenen optisch aktiven Camphersulfonsäuren. Vorteilhaft ist auch eine chromatographische Enantiomerentrennung mit Hilfe eines optisch aktiven Trennmittels (z.B. Dinitrobenzoylphenylglycin, Cellulosetriacetat oder andere Derivate von Kohlenhydraten oder auf Kieselgel fixierte chiral derivatisierte Methacrylat-Polymere). Als Laufmittel eignen sich hierfür wässrige oder alkoholische Lösungsmittelgemische wie z.B. Hexan/Isopropanol/Acetonitril z.B. im Verhältnis 82:15:3.
  • Pharmazeutische Formulierungen der erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen lassen sich zur Verabreichung über einen beliebigen geeigneten Weg, beispielsweise auf oralem (einschließlich bukkalem bzw. sublingualem), rektalem, vaginalem, nasalem, topischem (einschließlich bukkalem, sublingualem, konjunktivalem oder transdermalem) oder parenteralem (einschließlich subkutanem, intramuskulärem, intravenösem. intraarteriellem oder intradermalem) Wege, applizieren.
  • Formulierungen können mit allen im pharmazeutischen Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, indem beispielsweise der Wirkstoff mit dem bzw. den Trägerstoff(en) oder Hilfsstoff(en) zusammengebracht wird. Bevorzugt sein können sogenannte Retardformulierungen, d.h., solche mit einer zeitlich verzögerten Wirkstofffreisetzung. Geeignete Formulierungen und Trägerstoffe hierfür sind dem Fachmann bekannt (13).
  • Die erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen können mit allen herkömmlich bekannten Trägerstoffen gemischt werden, bei festen Darreichungsformen z.B. pflanzliche und tierische Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragacanth, CelluloseDerivaten, Polyethylenglykolen, Silikonen, Bentoniten, Kieselsäure, Talcum, Zinkoxid oder Gemische der vorgenannten Substanzen. Bei flüssigen Darreichungsformen und Emulsionen sind als Trägerstoffe z.B. Lösungsmittel, Solubulisierungsmittel, Emulgatoren wie z.B. Wasser, Ethanol, Isopropanol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylglykol, Baumwollsaatöl, Erdnussöl, Olivenöl, Rizinusöl, Sesamöl, Glycerol-Fettsäureester, Polyethylglykole, Fettsäureester von Sorbitan oder Gemische der vorgenannten Substanzen geeignet. Erfindungsgemäße Suspensionen können herkömmliche bekannte Trägerstoffe wie Verdünnungsmittel (z.B. Wasser, Ethanol oder Propylenglykol), ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylen und Polyoxyethylensorbitanester, mikrokristalline Zellulose, Bentonite, Agar-Agar, Tragacanth oder Gemische der vorgenannten Substanzen enthalten.
  • An die orale Verabreichung angepasste pharmazeutische Formulierungen können als separate Einheiten, wie z.B. Kapseln, Dragees, Pillen oder Tabletten; Puder, Pulver oder Granulate; Säfte, Sirups, Tropfen, Tees, Lösungen oder Suspensionen in wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeiten; essbare Schäume oder Schaumspeisen; oder Öl-in-Wasser-Flüssigemulsionen oder Wasser-in-ÖI-Flüssigemulsionen dargereicht werden.
  • So lässt sich beispielsweise bei der oralen Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel die Wirkstoffkomponente mit einem oralen, nicht-toxischen und pharmazeutisch verträglichen inerten Trägerstoff, wie z.B. Ethanol, Glycerin, Wasser u.a. kombinieren. Pulver werden hergestellt, indem die Verbindung auf eine geeignete feine Größe zerkleinert und mit einem in ähnlicher Weise zerkleinerten pharmazeutischen Trägerstoff, wie z.B. einem essbaren Kohlenhydrat wie beispielsweise Stärke oder Mannit vermischt wird. Ein Geschmacksstoff, Konservierungsmittel, Dispersionsmittel und Farbstoff können ebenfalls vorhanden sein.
  • Kapseln werden hergestellt, indem ein Pulvergemisch wie oben beschrieben hergestellt und geformte Gelatinehüllen damit gefüllt werden. Gleit- und Schmiermittel wie z.B. hochdisperse Kieselsäure, Talkum, Magnesiumstearat, Calciumstearat oder Polyethylenglykol in Festform können dem Pulvergemisch vor dem Füllvorgang zugesetzt werden. Ein Sprengmittel oder Lösungsvermittler, wie z.B. Agar-Agar, Calciumcarbonat oder Natriumcarbonat, kann ebenfalls zugesetzt werden, um die Verfügbarkeit des Medikaments nach Einnahme der Kapsel zu verbessern.
  • Außerdem können, falls gewünscht oder notwendig, geeignete Binde-, Schmier-Gleit- und Sprengmittel sowie Farbstoffe ebenfalls in das Gemisch eingearbeitet werden.
  • Als Bindemittel werden Substanzen bezeichnet, die Pulver binden oder miteinander verkleben und sie so durch Granulabildung kohäsiv werden lassen. Sie dienen als „Klebstoff“ der Formulierung. Bindemittel erhöhen die Kohäsionsstärke der vorliegenden Verdünnungs- oder Stellmittel.
  • Zu den geeigneten Bindemitteln gehören Stärke aus Weizen, Mais, Reis oder Kartoffel, Gelatine, natürliche Zucker, wie z.B. Glucose, Sucrose oder Beta-Lactose, Süßstoffe aus Mais, natürliche und synthetische Gummi, wie z.B. Akazia, Traganth oder Ammoniumcalciumalginat, Natriumalginat, Carboxymethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose, Hydroxypropylcarboxymethylzellulose, Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Magnesiumaluminiumsilicat, Wachse, u.a. Der Anteil des Bindemittels in dem Gemisch kann üblicherweise 1-30 Gewichts-% (% w/w), bevorzugt 2-20% w/w, weiter bevorzugt 3-10% w/w und am meisten bevorzugt 3-6% w/w betragen.
  • Der Begriff Schmiermittel bezieht sich auf Substanzen, die der Dosierungsform beigefügt werden, um Tabletten, Granulate etc. nach ihrer Verpressung leichter aus der Pressform oder der Austrittsdüse lösen zu können, indem sie die Reibung oder den Abrieb verringern. Schmiermittel werden gewöhnlich kurz vor der Verpressung zugegeben, da sie auf der Oberfläche der Granula sowie zwischen ihnen und den Bauteilen der Tablettenpresse vorhanden sein sollen. Die Menge des Schmiermittels kann zwischen 0,05 und 15 % w/w der Zusammensetzung variieren, bevorzugt zwischen 0,2 und 5 % w/w, weiter bevorzugt zwischen 0,3 und 3 % w/w, und am meisten bevorzugt zwischen 0,3 und 1,5 % w/w.
  • Zu den in diesen Darreichungsformen verwendeten Schmiermitteln gehören Natriumoleat, Metallstearate wie Natriumstearat, Calciumstearat, Kaliumstearat und Magnesiumstearat, Stearinsäure, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid, Borsäure, Wachse mit einem hohen Schmelzpunkt, Polyethylenglykole u.a. Gleitmittel sind Materialien, die ein Zusammenbacken unterbinden und die Fließeigenschaften der Granulationen verbessern, so dass der Fluss glatt und gleichmäßig erfolgt.
  • Geeignete Gleitmittel umfassen Silikondioxid und Talkum. Die Menge des Gleitmittels in der Zusammensetzung kann zwischen 0,01 und 10 % w/w variieren, bevorzugt zwischen 0,1 und 7 % w/w, weiter bevorzugt zwischen 0,2 und 5 % w/w und am meisten bevorzugt zwischen 0,5 und 2 % w/w.
  • Der Begriff Sprengmittel beziehen sich auf Materialien, die der Zusammensetzung zugegeben werden, damit dieses leichter auseinandergebrochen werden können.
  • Zu den Sprengmitteln gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Stärke, in kaltem Wasser lösliche Stärken wie Carboxymethylstärke, Zellulosederivate wie Methylzellulose und Natriumcarboxymethylcellulose, mikrokristalline Zellulosen und kreuzvernetzte mikrokristalline Zellulosen wie Croscarmellose-Natrium, natürliche und synthetische Gummi wie Guar, Agar, Karaya, Johannisbrotkernmehl, Tragacanth, Tonerden wie Bentonit, Xanthangummi, Alginate wie Alginsäure und Natriumalginat, aufschäumende Gemische u.a. Die Menge der Sprengmittel in der Zusammensetzung kann zwischen 1 und 40 % w/w variieren, bevorzugter zwischen 3 und 20 % w/w und am meisten bevorzugt zwischen 5 und 10 % w/w.
  • Farbstoffe sind Hilfsmittel, die der Zusammensetzung bzw. der Darreichungsform eine Färbung verleihen. Diese Hilfsmittel können Lebensmittelfarbstoffe sein. Diese können auch auf einem geeigneten Adsorptionsmittel wie Tonerde oder Aluminiumoxid adsorbiert sein. Die Menge der Farbstoffe kann zwischen 0,01 und 10 % w/w der Zusammensetzung variieren, bevorzugt zwischen 0,05 und 6% w/w, weiter bevorzugt zwischen 0,1 und 4% w/w und am meisten bevorzugt zwischen 0,1 und 1 % w/w.
  • Geeignete Farbstoffe sind Kurkumin, Riboflavin, Riboflavin-5'-phosphat, Tartrazin, Alkannin, Chinolingelb WS, Echtgelb AB, Riboflavin-5'-Natriumphosphat,Gelb 2G, Gelborange S, Orange GGN, Echtes Karmin, Citrus red # 2, Azorubin, Amaranth, Cochenillerot A, Ponceau SX-rot, Ponceau 6R, Erythrosin, Rot 2G, Allurarot AC, Indanthron, Patentblau V, Indigotin I, Brilliantblau FCF, Chlorophylle und Chlorophylline, kupferhaltige Komplexe der Chlorophylle und Chlorophylline, Grün S, Fast Green FCF, Einfaches Zuckerkulör, Sulfitlaugen-Zuckerkulör, Ammoniak-Zuckerkulör, Ammonsulfit-Zuckerkulör, Brilliantschwarz BN, Ruß, Pflanzenkohle, Braun FK, Braun HT, Alpha-Carotin, Beta-Carotin, Gamma-Carotin, Annatto, Bixin, Norbixin, Paprikaextrakt, Capsanthin, Capsorubin, Lycopin, Beta-apo-8'-Carotinal, Beta-apo-8'-Carotinsäureethylester, Flavoxanthin, Lutein, Cryptoxanthin, Rubixanthin, Violaxanthin, Rhodoxanthin, Canthaxanthin, Zeaxanthin, Citranaxanthin, Astaxanthin, Betanin, Anthocyane, Safran, Calciumcarbonat, Titandioxid, Eisenoxide, Eisenhydroxide, Aluminium, Silber, Gold, Litholrubin BK, Tannin, Orcein, Eisengluconat, Eisenlactat.
  • Die Tabletten werden formuliert, indem beispielsweise ein Pulvergemisch hergestellt, granuliert oder trockenverpresst wird, ein Schmiermittel und ein Sprengmittel zugegeben werden und das Ganze zu Tabletten verpresst wird. Ein Pulvergemisch wird hergestellt, indem die in geeigneter Weise zerkleinerte Verbindung mit einem Verdünnungsmittel oder einer Base, wie oben beschrieben, und gegebenenfalls mit einem Bindemittel, wie z.B. Carboxymethylzellulose, einem Alginat, Gelatine oder Polyvinylpyrrolidon, einem Lösungsverlangsamer, wie z.B. Paraffin, einem Resorptionsbeschleuniger, wie z.B. einem quaternären Salz und/oder einem Absorptionsmittel, wie z.B. Bentonit, Kaolin oder Dicalciumphosphat, vermischt wird. Das Pulvergemisch lässt sich granulieren, indem es mit einem Bindemittel, wie z.B. Sirup, Stärkepaste, Acacia-Schleim oder Lösungen aus Zellulose- oder Polymermaterialen benetzt und durch ein Sieb gepresst wird. Als Alternative zur Granulierung kann man das Pulvergemisch durch eine Tablettiermaschine laufen lassen, wobei ungleichmäßig geformte Klumpen entstehen, die in Granulate aufgebrochen werden. Die Granulate können mittels Zugabe von Stearinsäure, einem Stearatsalz, Talkum oder Mineralöl gefettet werden, um ein Kleben an den Tablettengussformen zu verhindern. Das gefettete Gemisch wird dann zu Tabletten verpresst. Die erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen können auch mit einem freifließenden inerten Trägerstoff kombiniert und dann ohne Durchführung der Granulierungs- oder Trockenverpressungsschritte direkt zu Tabletten verpresst werden.
  • Flüssige Darreichungsformen umfassen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele sind Wasser und Wasser-Propylen-Glykol-Lösungen für parenterale Injektionen oder der Zusatz von Süßmitteln und Trübungsmitteln für orale Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Flüssige Darreichungsformen können auch Lösungen für intranasale Verabreichung umfassen.
  • Des Weiteren werden Pufferlösungen als pharmazeutische Zusammensetzungen bevorzugt. Die Begriffe Puffer, Puffersystem und Pufferlösung beziehen sich auf die Fähigkeit eines Systems, insbesondere einer wässrigen Lösung, einer pH-Veränderung durch Zugabe von Säure oder Base oder durch Verdünnung mit einem Lösungsmittel zu widerstehen. Bevorzugte Puffersysteme können aus der Gruppe bestehend aus Format, Lactat, Benzoesäure, Oxalat, Fumarat, Anilin, Acetat-Puffer, Zitrat-Puffer, Glutamat-Puffer, Phosphat-Puffer, Succinat, Pyridin, Phthalat, Histidin, MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure; Maleinsäure, Cacodylat (Dimethylarsenat), Carbonsäure, ADA (N-(2-Acetamido)iminodiessigsäure, PIPES (4-piperazin-bisethansulfonsäure); BIS-TRIS-Propan (1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]-propan), Ethylendiamin, ACES 2-[(2-Amino-2-oxoethyl)amino]ethansulfosäure, Imidazol, MOPS (3-(N-Morphin)-propansulfonsäure, Diethylmalonsäure, TES (2-[Tris(hydroxymethyl)methyl]aminoethansulfonsäure und HEPES (N-2-Hydroxylethylpiperazin-N'-2-ethansulfosäure-Puffer) sowie weitere Puffer mit einem pKa zwischen 3,8 und 7,7 ausgewählt werden.
  • Bevorzugt werden Carbonsäurepuffer wie Acetat- und Dicarbonsäurepuffer wie Fumarat, Tartrat und Phthalat sowie Tricarbonsäurepuffer wie Citrat. Eine weitere Gruppe bevorzugter Puffer sind anorganische Puffer wie Sulfat-, Borat-, Carbonat-, Oxalat-, Calciumhydroxid- und Phosphat-Puffer. Noch eine weitere Gruppe bevorzugter Puffer sind Stickstoff-haltige Puffer wie Imidazol, Diethylendiamin und Piperazin. Des Weiteren werden Sulfonsäure-Puffer wie TES, HEPES, ACES, PIPES, [(2-Hydroxy-1,1bis(hydroxymethyl)ethyl)amino]-1-propansulfonsäure (TAPS), 4-(2- Hydroxyethyl)piperazin-1-propansulfonsäure (EPPS), 4-Morpholinepropansulfonsäure (MOPS) und N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure (BES). Eine weitere Gruppe bevorzugter Puffer sind Glycin, Glycylglycin, Glycylglycylglycin, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin und N-[2-Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]glycin (Tricin). Bevorzugt werden auch Aminosäurepuffer wie Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat, Glutamat, Asparagin, Glutamin, Cystein, Methionin, Prolin, 4-Hydroxyprolin, N.N.N-Trimethyllysin, 3-Methylhistidin, 5-Hydroxylysin, o-Phosphoserin, γ-carboxyglutamat, ε-N-Acetyllysin, ω-N-Methylarginin, Citrullin, Ornithin und deren Derivate.
  • Konservierungsmittel für flüssige Darreichungsformen können bei Bedarf eingesetzt und dabei ausgewählt werden aus Kaliumsorbat, Methyl-Ethylparaben, Natriumbenzoat und ähnlichen dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Substanzen oder Gemischen hiervon.
  • Eine besonders bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung ist ein Lyophilisat (eine gefriergetrocknete Zubereitung), das zur Verabreichung per Inhalation oder intravenöser Injektion geeignet ist. Zu deren Herstellung wird eine erfindungsgemäß einsetzbare Verbindung in einer 4 - 5% Mannitol-Lösung solubilisiert und diese Lösung dann lyophilisiert. Die Mannitol-Lösung kann auch in einer geeigneten PufferLösung wie zuvor beschrieben zubereitet werden. Weitere Beispiele geeigneter Kryo- /Lyoprotektantien (auch als Stellmittel oder Stabilisatoren) sind Thiol-freies Albumin, Immunglobulin, Polyalkylenoxid (d.h. PEG, Polypropylenglykole), Trehalose, Glucose, Sucrose, Sorbitol, Dextran, Maltose, Raffinose, Stachyose und andere Saccharide. Mannitol wird bevorzugt. Sie können in üblichen Mengen bei den dem Fachmann bekannten Lyophilisierungsverfahren eingesetzt werden.
  • Zur Herstellung einer Darreichungsform als Zäpfchen mit den erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen werden Wachse mit einem niedrigen Schmelzpunkt sowie ein Gemisch aus Fettsäureglyceriden wie Kakaobutter zuerst zum Schmelzen gebracht, dann der Wirkstoff durch Rühren oder andere Mischmethoden homogen darin dispergiert. Die geschmolzene homogene Mischung wird dann in geeignete Gussformen überführt, abkühlen gelassen und somit verfestigt.
  • Für topische Applikationen der erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen sind Cremes, Emulsionen, Lotionen, Gele, Pasten, Salben und Suspensionen geeignet.
  • Als oberflächenaktive Solubilisatoren (Lösungsvermittler) eignen sich beispielsweise Diethylenglykolmonoethylether, Polyethylpropylenglykol-Copolymere, Cyclodextrine, Glycerylmonostearate wie z.B. Solutol HS 15 (Macrogol-15-hydroxystearat von BASF, PEG-660-15-hydroxystearat), Sorbitanester, Polyoxyethylensorbitansäureester, Polyvinylalkohol, Natriumlaurylsulfat, (anionische) Glycerylmonooleat, etc.
  • Als Emulgatoren kommen beispielsweise die folgenden anionischen und nichtionischen Emulgatoren in Frage: anionische Emulgatorwachse, Cetylalkohol, Cetylstearylalkohol, Stearinsäure, Ölsäure, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Anlagerungsprodukte von 2 bis 60 Mol Ethylenoxid an Rizinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl, Wollwachsöl (Lanolin), Sorbitanester, Polyoxyethylenalkylester, Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäureester oder Polyvinylalkohol. Bevorzugt sind Glycerinmonooleat, Stearinsäure und Phospholipide wie z.B. Lezithin.
  • Als Triglyceride kommen mittelkettige und hochmolekulare Triglyceride in Frage. Mittelkettige Triglyceride sind Glycerinester der Fettsäuren mit nur 6-12 C-Atomen, wie z.B. Capryl-Caprinsäuretriglycerid. Hochmolekulare Triglyceride sind Glycerinfettsäureester mit langkettigen Fettsäuren. Sie sind z.B. aus verschiedenen natürlichen Fetten hergestellte Triglyceridgemische. Bevorzugt werden mittelkettige Triglyceride eingesetzt, insbesondere Capryl-Caprinsäuretriglycerid.
  • Zu den geeigneten Eindringungsverstärker (penetration enhancers) zählen z.B. Isopropylmyristat, Ölsäure, Natriumlaurylsulfat, DMSO und 1,2-Propandiol. Bevorzugt ist 1,2-Propandiol.
  • Typische Beispiele für Konservierungsmittel, die für eine topische Applikation geeignet sind, sind Benzylbenzoate, Benzoesaure, Benzylalkohol, Benzalkoniumchlorid, N-Cetyl-N,N,-Trimethylammoniumbromid (Cetrimid, Fa. Merck), Chlorhexidin, Chlorbutanol, Chlorcresol, Imidurea, die Parabene, wie Methyl, Ethyl-, Propyl- oder Butylparaben, Natriummethylparaben, Natriumpropylparaben, Kaliumsorbat, Natriumbenzoat, Natriumpropionat, Phenol, Phenoxyethanol, Phenylethylalkohol, Phenylmercuriacetat , Phenylmercuriborat, Phenylmercurinitrate, Sorbinsäure oder Thiomersal (Natriumethylmercurithiosalicylat). Bevorzugt sind Methylparaben, Propylparaben sowie Natriummethylparaben und Natriumpropylparaben.
  • Bei einigen topischen Applikationen ist es vorteilhaft, Antioxidantien zuzusetzen. Geeignete Beispiele hierfür sind Natriummetabisulfit, alpha-Tocopherol, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Natriumascorbat, Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Fumarsäure oder Propylgallat. Bevorzugtes Antioxidantium ist Natriummetabisulfit.
  • Als pH-regulierendes Mittel bei topischen Darreichungsformen kommen z.B. Natriumhydroxid, Salzsäure, Puffersubstanzen, wie z.B. Natriumdihydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat in Frage.
  • Creme-Zubereitungen können ferner weitere Hilfs- und Zusatzstoffe enthalten, wie z.B. Fettungsmittel, Lösungsmittel, Konsistenzgeber oder Hydrotrope, zur Verbesserung des Fließverhaltens. Dabei können von den vorgehend angegebenen Additiven bzw. Zusatzstoffen jeweils einzelne oder auch mehrere Stoffe derselben Gruppe im Gemisch anwesend sein.
  • Als Fettungsmittel eignen sich z.B. Ölsäuredecylester, hydriertes Ricinusöl, leichtes Mineralöl, Mineralöl, Polyethylenglykol, Natriumlaurylsulfat.
  • Als Lösungsmittel kommen Maiskeimöl, Baumwollsaatöl, Erdnussöl, Sesamöl, Sojabohnenöl, Ethyloleat, Glycerin, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol in Frage.
  • Als Konsistenzgeber eignen sich beispielsweise Cetylalkohol, Cetylesterwachs, hydriertes Ricinusöl, mikrokristalline Wachse, nichtionische Emulgatorwachse, Bienenwachs, Paraffin oder Stearylalkohol.
  • Geeignete Hydrotope sind Alkohole, wie beispielsweise Ethanol, Isopropylalkohol oder Polyole, wie z.B. Glycerin.
  • Die anmeldungsgemäßen Zubereitungen weisen weiterhin Zusatzstoffe auf. Diese werden vorzugsweise ausgewählt aus Aromen/Geschmacksstoffen, insbesondere ätherischen Ölen, Vitaminen, sowie galenischen Hilfsstoffen, ausgewählt aus Zuckern, Zuckeraustauschstoffen, Zuckerersatzstoffen, Säuerungsmitteln, Lösungsvermittlern wie z. B. Wasser, Glykol, Glycerin, Verdickern, Süßungsmitteln, Farbstoffen oder Konservierungsmitteln oder Kombinationen hiervon, auch in Abhängigkeit von der galenischen Darreichungsform.
  • Zu den geeigneten Aromen und Geschmacksstoffen gehören vor allem ätherische Öle, die als Aroma- bzw. als Geschmacksstoffe verwendbar sind. Dabei handelt es sich um im Allgemeinen flüchtige Extrakte aus Pflanzen, Pflanzenteilen mit dem dafür charakteristischen Geruch, die vor allem durch Wasserdampfdestillation aus Pflanzen oder Pflanzenteilen gewonnen werden können.
  • Beispielhaft können hier genannt werden: ätherische Öle bzw. Aromastoffe aus Salbei, Nelken, Kamille, Anis, Sternanis, Thymian, Teebaum, Pfefferminze, Minzöl, (Menthol, Cineol), Eukalyptusöl, Mango, Feigen, Lavendelöl, Kamillenblüten, Kiefernnadel, Zypresse, Orangen, Rosenholz, Pflaumen-, Johannisbeer-, Kirscharoma, Birkenblätter, Zimt, Limetten, Orangen, Grapefruit, Mandarine, Wacholder, Baldrian, Zitronenmelisse, Zitronengras, Palmarosa, Cranberry, Granatapfel, Rosmarin, Ingwer, Ananas, Guave, Echinacea, Efeublätterextrakt, Heidelbeere, Kaki, Melonen u. ä. oder Mischungen hiervon wie Mischungen aus Menthol, Pfefferminz- und Sternanisöl oder Menthol und Kirscharoma.
  • Diese Aroma- bzw. Geschmacksstoffe können in Mengen von 0,0001 bis 10 % w/w (insbesondere als Mischung), vor allem 0,001 bis 6 % w/w, bevorzugt 0,001 bis 4 % w/w, besonders bevorzugt 0,01 bis 1 % w/w, bezogen auf die Gesamtzubereitung vorliegen. Anwendungsbedingt oder einzelfallabhängig kann es von Vorteil sein, hiervon abweichende Mengen einzusetzen.
  • Erfindungsgegenstände sind auch die erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen, gegebenenfalls in der zuvor genannten Wirkstoffkombination zur Verwendung zur Herstellung einer Formulierung zur oralen Verabreichung, einer Formulierung als Lyophilisat, einer flüssigen Formulierung oder einer topischen Formulierung.
  • Erfindungsgegenstand ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung einer retroviralen Infektion, ihrer Folgekrankheiten und/oder der Manifestation retroviraler Erkrankungen, die mindestens eine erfindungsgemäß einsetzbare Verbindung oder gegebenenfalls eine der zuvor genannten Wirkstoffkombinationen zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff, Hilfsstoff, Verdünnungsmittel, Kryoprotektivum und/oder Lyoprotektivum enthält.
  • Bevorzugt ist, wenn die besagte pharmazeutische Zusammensetzung zur oralen, parenteralen, topischen und/oder inhalativen Verabreichung geeignet ist.
  • Die zuvor beschriebenen Formulierungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen können neben den erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen auch mindestens einen weiteren Wirkstoff enthalten. Geeignet als Kombinationswirkstoff sind die oben genannten Wirkstoffe zur Kombinationstherapie.
  • Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung retroviraler Infektionen, der Manifestation retroviraler Infektionen und/oder deren Folgekrankheiten bei einem Mensch oder einem Wirbeltier, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Dosis einer erfindungsgemäß einsetzbaren Verbindung oder Wirkstoffkombination oder deren Salze, Solvate und/oder Hydrate beinhaltet, die geeignet ist, bei besagter retroviraler Infektion und/oder ihren Folgekrankheiten wirksam zu sein, vorzugsweise am Menschen.
  • Bevorzugt ist, wenn die retrovirale Infektion und/oder ihre Folgekrankheit in einem der zuvor beschriebenen Erfindungsgegenstände eine HIV-1-Infektion, HIV-2-Infektion, AIDS, AIDS-Folgekrankheiten, FIV-Infektion oder SIV-Infektion ist.
  • Ebenfalls bevorzugt ist, wenn in einem der zuvor beschriebenen Erfindungsgegenstände der mindestens eine erfindungsgemäß einsetzbare Wirkstoff zusätzlich mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge mindestens eines weiteren Wirkstoffes verabreicht wird, wobei der besagte weitere Wirkstoff aus einer Gruppe bestehend aus Proteasom-Inhibitoren, Reverse Transkriptase-Inhibitoren, Integrase-Inhibitoren, Protease-Inhibitoren, DUB-Inhibitoren, Entry-Inhibitoren, HIV-Vakzine, Virostatika und Immunstimulanzien ausgewählt wird und die Wirkstoffkombination geeignet ist, bei besagter retroviraler Infektion und/oder ihrer Folgekrankheiten wirksam zu sein.
  • Bei diesem kombinierten Behandlungsverfahren kann die Wirkstoffkombination entweder getrennt oder in einer gemeinsamen Formulierung oder Zusammensetzung verabreicht werden.
  • Ein weiterer Erfindungsgegenstand besteht in einem Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die den proteolytischen Abbau des retroviralen Proteins p6 hemmt, das die folgenden Schritte umfasst:
    1. a) Bereitstellen einer Probe enthaltend IDE (Insulin degradierendes Enzym);
    2. b) Bereitstellen einer Testsubstanz und eines unmittelbaren oder mittelbaren IDE-Substrates;
    3. c) Zusammenbringen der Komponenten aus Schritt a) und b) unter geeigneten Reaktionsbedingungen;
    4. d) gegebenenfalls Abstoppen der Reaktion aus c) ; und
    5. e) qualitativer oder quantitativer Nachweis eines oder mehrerer der unmittelbaren oder mittelbaren Reaktionsprodukte oder -edukte aus Schritt c) oder d) durch geeignete Analyseverfahren.
  • Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand besteht in einem Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die ein Inhibitor der biologischen Aktivität des Insulin degradierenden Enzyms (IDE) ist, das die folgenden Schritte umfasst:
    1. a) Bereitstellen einer Probe enthaltend retrovirales Protein p6;
    2. b) Bereitstellen einer Testsubstanz ;
    3. c) Zusammenbringen der Komponenten aus Schritt a) und b) unter geeigneten Reaktionsbedingungen;
    4. d) gegebenenfalls Abstoppen der Reaktion aus Schritt c); und
    5. e) qualitativer oder quantitativer Nachweis eines oder mehrerer der unmittelbaren oder mittelbaren Reaktionsprodukte oder -edukte aus Schritt c) oder d) durch geeignete Analyseverfahren.
  • Des Weiteren offenbart die vorliegende Anmeldung ein Screening-Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die zur Inhibition der enzymatischen Aktivität von IDE geeignet sind, das die folgenden Schritte umfasst:
    1. a) Bereitstellen einer Mehrzahl an humanen Zellextrakten aus primären und permanenten Zellen, die IDE in natürlich vorkommenden Konzentrationen enthalten;
    2. b) Jeweils Zugabe einer standardisierten Menge an synthetischem p6;
    3. c) Zugabe der zu testenden Substanz zu jedem der Zellextrakte in einer jeweils anderen Konzentration, wobei die besagten Konzentrationen eine für die zu testende Substanz angemessene Verdünnungsreihe bilden;
    4. d) Entnahme jeweils einer Probe zu einem standardisierten Zeitpunkt;
    5. e) Elektrophoretische Auftrennung der Proben;
    6. f) Identifikation der zu nicht degradiertem synthetischem p6 zugehörigen Banden;
    7. g) Quantifizierung der Proteinmenge in jeder der identifizierten Banden mittels Densitometrie;
    8. h) Mindestens zweifache Wiederholung der Schritte a) bis g)
    9. i) Normierung der pro Messreihe erhaltenen Densitometrie-Werte auf den Wert bei der geringsten Konzentration der Testsubstanz als 100%;
    10. j) Auswertung der Ergebnisse durch Auftragung der Konzentrationen der Verdünnungsreihe der Testsubstanz gegen den normierten Prozentsatz der Densitometrie-Werte als Maß der Inhibition; und
    11. k) Bewertung anhand eines standardisierten Grenzwertes der Inhibition, ob die Testsubstanz als Inhibitor der IDE eingestuft werden kann.
  • Geeignete Zellkulturmodelle für die Herstellung der besagten Zellextrakte sind alle permanenten sowie primären humanen Zelllinien. Die Zellextrakte können auch aus frisch präparierten humanen primären und permanenten Zellen gewonnen werden.
  • Geeignete Techniken zur elektrophoretischen Auftrennung umfassen Gelelektrophorese, 2-D-Gelelektrophorese, Agarose-Gelelektrophorese, Serumelektrophorese, Gradientenelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (CTAB-PAGE, Nativ-Page, QPNC-PAGE, SDS-PAGE), Affinitätselektrophorese, Dichtegradientenelektrophorese, Elektroosmose, diskontinuierliche Elektrophorese, Free-Flow-Elektrophorese, Immunelektrophorese, Kapillarelektrochromatographie, Lipidelektrophorese, Pulsed-Field-Elektrophorese, Überwanderungselektrophorese, Zonenelektrophorese.
  • Densitometrische Vorrichtungen zur Quantifizierung der Proteinmenge in einer Bande arbeiten alle nach demselben Grundprinzip. Das Densitometer misst die Lichtabsorption der jeweiligen Bande bei Einstrahlung einer bestimmten Wellenlänge mit definierter Intensität. Alle im Stand der Technik bekannten Densitometer sind für eine Verwendung gemäß der Anmeldung geeignet.
  • Um eine verlässliche Dosis-Wirkungskurve der vermuteten Inhibition der IDE zu erhalten, sollte die Messung mindestens dreimal wiederholt. Bevorzugt ist n = 4, weiter bevorzugt n = 5, am meisten bevorzugt n = 6.
  • Einen Grenzwert festzulegen, ab dem eine Verbindung als Inhibitor der IDE eingestuft werden kann, liegt in der Kenntnis des Fachmanns und hängt von der spezifischen Fragestellung und dem angestrebten Verwendungszweck der zu testenden Verbindung ab. Dieser Grenzwert kann im Sinne der Erfindung zwischen 10 und 90% liegen, bevorzugt zwischen 20 und 80%, weiter bevorzugt zwischen 30 und 70%, noch weiter bevorzugt zwischen 40 und 70%, am meisten bevorzugt zwischen 50 und 70%.
  • Dieses Verfahren kann in analoger Weise zum Screening angewandt werden zur Identifikation von Verbindungen, die zur Inhibition des Abbaus des HIV-1 Gag Proteins p6 geeignet sind, wobei es die folgenden Schritte umfasst:
    1. a) Bereitstellen einer Mehrzahl an humanen Zellextrakten aus primären und permanenten Zellen, die IDE in natürlich vorkommenden Konzentrationen enthalten;
    2. b) Jeweils Zugabe einer standardisierten Menge an synthetischem p6;
    3. c) Zugabe der zu testenden Substanz zu jedem der Zellextrakte in einer jeweils anderen Konzentration, wobei die besagten Konzentrationen eine für die zu testende Substanz angemessene Verdünnungsreihe bilden;
    4. d) Entnahme jeweils einer Probe zu einem standardisierten Zeitpunkt;
    5. e) Elektrophoretische Auftrennung der Proben;
    6. f) Identifikation der zu nicht degradiertem synthetischem p6 zugehörigen Banden;
    7. g) Quantifizierung der Proteinmenge in jeder der identifizierten Banden mittels Densitometrie;
    8. h) Mindestens zweifache Wiederholung der Schritte a) bis g)
    9. i) Normierung der pro Messreihe erhaltenen Densitometrie-Werte auf den Wert bei der geringsten Konzentration der Testsubstanz als 100%;
    10. j) Auswertung der Ergebnisse durch Auftragung der Konzentrationen der Verdünnungsreihe der Testsubstanz gegen den normierten Prozentsatz der Densitometrie-Werte als Maß der Inhibition; und
    11. k) Bewertung anhand eines standardisierten Grenzwertes der Inhibition, ob die Testsubstanz als Inhibitor des Abbaus von p6 eingestuft werden kann.
  • Verkürzt lassen sich die erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt beschreiben:
    • Screening-Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die zur Inhibition der enzymatischen Aktivität von IDE geeignet sind, das die folgenden Schritte umfasst:
      1. a) Bereitstellen humaner Zellextrakte aus primären oder permanenten Zelllinien, welche zelluläre Proteasen in natürlich vorkommenden Konzentrationen enthalten;
      2. b) Zugabe einer standardisierten Menge eines möglichen IDE-Inhibitors und einer standardisierten Menge eines IDE-Substrates ;
      3. c) Inkubation für bestimmte Zeitintervalle bei 37°C; und
      4. d) Nachweis der verbleibenden Menge des IDE-Substrates durch Western Blot Analysen.
      sowie
    • Screening-Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, die zur Inhibition des Abbaus des retroviralen Proteins p6 oder eines funktionsanalogen retroviralen Proteins geeignet sind, das die folgenden Schritte umfasst:
      1. a) Bereitstellen humaner Zellextrakte aus primären oder permanenten Zelllinien, welche zelluläre Proteasen in natürlich vorkommenden Konzentrationen enthalten;
      2. b) Zugabe einer standardisierten Menge einer zu testenden Substanz und von synthetischem oder viralem p6;
      3. c) Inkubation für bestimmte Zeitintervalle bei 37°C; und
      4. d) Nachweis der verbleibenden Menge an p6 oder eines funktionsanalogen retroviralen Proteins durch Western Blot Analysen.
  • Die zuvor genannten Verfahren können erfindungsgemäß zur Identifizierung von Substanzen verwendet werden, die geeignet sind, die Replikation von Retroviren zu inhibieren.
  • Ausführungsbeispiele:
  • Beispiel 1: Versuch der p6-Expression von einem CMV-getriebenen Transgen mit AU1 oder YFP-Tag
  • Nachdem reifes p6 fast ausschließlich nur in reifen HIV-Partikeln und nicht in der Wirtszelle gefunden werden konnte (1A, rechte Seite, schwarzer Rahmen), wurde versucht p6, nach Transfektion verschiedener Zelltypen mit CMV-p6-Expressionssystemen, in der Zelle nachzuweisen (2A). Nach Transfektion von z.B. HeLa-Zellen wurde nur das p6-YFP-Fusionsprotein, nicht aber das freie Protein (p6-AU1; schwarzer Kasten) mittels Western Blots mit einem anti-p6-Antikörper nachgewiesen (2B). Als Kontrolle wurde im gleichen Expressionssystem AU1-getaggtes (Der AU1-Tag ist eine kurze Peptidabfolge (DTYRYI) und kann spezifisch durch einen Antikörper detektiert werden) HIV-1 Vpu exprimiert und konnte mit einem anti-Vpu Antikörper nachgewiesen werden. Als Fusionsprotein ist p6 nachweisbar, als freies Protein nicht fassbar.
  • Beispiel 2: p6 muss eine sehr kurze Halbwertszeit haben, da seine Expression nur durch die Bestimmung der MHC-I Antigenpräsentation von p6-abstammenden Epitopen nachgewiesen werden kann.
  • In vorangegangenen WB-Analysen war es bislang nicht möglich, freies p6 intrazellulär nachzuweisen. Um zu untersuchen, ob p6 überhaupt in der Zelle exprimiert wird, wurde die MHC-I Antigenpräsentation von p6-abgeleiteten Epitopen ermittelt, welches erfindungsgemäß eine sehr sensitive Methode darstellt, um die Existenz von Proteinen nachzuweisen, welche eine sehr kurze Halbwertszeit haben. Da es keine Antikörper gibt, die an humane MHC-I Moleküle gebundene p6-Epitope detektieren können, wurde das Modell-Epitop SIINFEKL (SL) in frame an das C-terminale Ende von p6 eingebracht (3A). Als Kontrolle wurde der gleiche Vektor ohne SL verwendet. Wenn SL an der Zelloberfläche erscheint, muss p6 als Protein in der Zelle existent und am Ribosom translatiert worden sein.
  • Für die Messung der MHC-I Antigenpräsentation wurden HeLa-Zellen, die den murinen SL-bindenden MHC-I Allotyp H2-Kb (HeLa-Kb) konstitutiv exprimieren, mit Expressionsplasmiden transfiziert, welche für p6 bzw. p6-SL Proteine kodieren. 24 h nach Transfektion wurde die Beladung von H2-Kb-SL-Komplexen an der Zelloberfläche durchflusszytometrisch untersucht. Hierfür wurde der monoklonale Antikörper (mAK) 25D1.16 verwendet, welcher spezifisch SL im Komplex mit H2-Kb erkennt.
  • Dabei ist erfindungsgemäß nach Expression von p6-SL eine 35-fach erhöhte MHC-I Antigenpräsentation von p6-abgeleiteten Epitopen zu erkennen (3B). Diese Ergebnisse zeigen, dass p6 in der Zelle gebildet worden sein musste, vermutlich sehr schnell abgebaut wird und nur sein C-terminales Epitop im Komplex mit MHC-I nachweisbar war.
  • Beispiel 3: Aufbau eines in vitro Degradationsassays zum Nachweis der Proteolyse von p6
  • Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass p6 innerhalb der Zelle einer schnellen Degradation mittels einer zellulären Protease unterliegt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde ein in vitro Degradationsassay etabliert, welcher es erlaubt, den proteolytischen Abbau von p6 in vitro zu untersuchen. Das Screening-Verfahren wurde anhand des p6-Gag Proteins etabliert und umfasst folgende Schritte (schematische Darstellung: 4):
    1. 1. Bereitstellen humaner Zellextrakte aus primären oder permanenten Zelllinien, welche zelluläre Proteasen in natürlich vorkommenden Konzentrationen enthalten.
    2. 2. Jeweils Zugabe einer standardisierten Menge an synthetischem oder viralem p6. vp6 wird erhalten nach Transfektion von 293T-Zellen mit dem subgenomischen env-deletierten HIV-1-Expressionskonstrukten. Die in den Überstand freigesetzten virus-ähnlichen Partikel (VLPs) werden mittels Zentrifugation durch ein 20% Sucrose-Kissen aufgereinigt und mit 0,5% TX-100 lysiert.
    3. 3. Inkubation für bestimmte Zeitintervalle bei 37°C.
    4. 4. Nachweis der verbleibenden Menge von p6 durch Western Blot-Analysen.
  • Beispiel 4: Das HIV-1 p6-Gag wird durch eine zelluläre Protease degradiert, die Halbwertszeit beträgt ca. 10 min.
  • Um zu untersuchen, ob p6 mittels einer zellulären Protease abgebaut wird, wurden erfindungsgemäß 100 ng sp6 mit 5 µg nativem oder Hitze-inaktiviertem (95°C, 5 min) S10 Extrakt im Rahmen des o.g. in vitro Degradationsassays behandelt. Nach 30 min Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von SDS-Probenpuffer und Denaturieren bei 95°C für 5 min abgestoppt. Der Nachweis von sp6 erfolgte mittels WB unter Verwendung eines p6-spezifischen Antiserums. Dabei zeigte sich, dass p6 in Anwesenheit von S10 Extrakt nicht nachzuweisen war ( 5A, Spur 3). Eine Hitzeinaktivierung des S10 Extrakts hingegen verhinderte den Abbau von sp6 (5A, Spur 4). Ebenfalls unterliegt p6, welches nur in Puffer inkubiert wurde, keiner Degradation (5A, Spur 2). Daher muss der Verlust von p6 im S10 Extrakt auf eine enzymatische Reaktion zurückzuführen sein, wobei die Beteiligung einer Protease naheliegt. Daher eignet sich der Verdau von sp6 im S10 Extrakt erfindungsgemäß als in vitro Modell, um dessen Degradation und eine mögliche Inhibition des degradierenden Faktors zu untersuchen, bzw. Natur dieses Faktors zu bestimmen.
  • Um die Halbwertszeit von p6 unter diesen Bedingungen zu bestimmen, wurden wie unter Beispiel 3 beschrieben in vitro-Abbaukinetiken durchgeführt. Dazu wurde sp6 für unterschiedlich lange Inkubationszeit mit S10 Extrakt behandelt. Die Menge des verbleibenden sp6 wurde mittels Western Blot detektiert (5B). Hierbei war ein rascher Abbau von p6 zu erkennen mit einer für Proteolyse typischen sigmoiden Kinetik (5C). Die Auswertung von vier unabhängigen Experimenten ergab für p6 eine Halbwertszeit von ca. 10 min.
  • Um den in vitro Degradationsassay weiter zu optimieren, wurde getestet, ob ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiertes sp6, ähnlich dem unmarkierten sp6, diesem Abbau-Phänomen unterliegt.
  • Die erfindungsgemäße Verwendung eines fluoreszierenden Substrats im in vitro Degradationsassay hat folgende Vorteile:
    1. 1) eine schnellere und sensitivere Detektion, im Vergleich zur Western Blot Analyse
    2. 2) einen direkten Nachweis von p6, bei dem das Signal direkt proportional zur Menge an p6 ist, keine Abhängigkeit von Antigen-Antikörper-Reaktion zeigt und eventuelle störende Einflüsse von Proteinfaltung oder Modifikation eliminiert sind. Erfindungsgemäß wurde ein p6-Peptid synthetisiert, welches über ein zusätzliches N-terminales Cystein-gekoppeltes BODIPY FL-Fluorophor verfügt (sp6BY) (6A). Bei diesem Fluoreszenzfarbstoff handelt es sich um borhaltiges Fluorochrom, welches ein Surrogat für Fluorescein darstellt. Es zeichnet sich durch ein geringeres Molekulargewicht und eine geringere Größe aus, besitzt ein Anregungsmaximum von 503 nm und ein Emissionsmaximum von 512 nm.
  • Durch Analyse einer Verdünnungsreihe von sp6BY in einem PAA-Gel durch Fluoreszenzmessung konnte die untere Nachweisgrenze dieses Systems von etwa 0,03 bis 0,01 ng ermittelt werden (6C). Quantifizierung der Signalintensitäten ergab eine lineare Abhängigkeit des Fluoreszenzsignals von der Menge an eingesetztem Protein im Bereich von 0,03 ng bis 1 µg (6B). Erfindungsgemäß zeichnet sich diese Nachweismethode für sp6 durch eine höhere Sensitivität und einen größeren linearen Bereich aus.
  • Zusammengefasst stellt die Behandlung von sp6BY mit S10 Extrakt einen in vitro-Assay zur Charakterisierung von Inhibitoren der Degradation von p6 dar. Dieser zeichnet sich durch eine lineare Signalausbeute über einen großen Konzentrationsbereich von Substrat aus, und eliminiert die für die Western Blot Detektion mittels Chemilumineszenz typische Sättigung.
  • Beispiel 5: Depletion von Übergangsmetallionen inhibiert den Abbau von p6
  • Um zu untersuchen, ob bivalente Metallionen als Kofaktor für die p6-degradierenden Enzyme notwendig sind, wurde der Einfluss von zwei verschiedenen Chelatoren bezüglich des Abbaus von p6 mittels des in vitro Degradationsassays untersucht. Dazu wurde zum einen N,N'-Ethylenebis[bis(2-pyridyl)amin] (TPEN) verwendet, welches selektiv Übergangsmetallionen komplexiert, aber nur eine geringe Affinität für Calcium- und Magnesiumionen hat. Zum anderen kam 1,2-bis (2-Aminophenoxy)-Ethan-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (BAPTA/AM) zur Anwendung, welches einen Chelator mit Präferenz für Ca2+ und Mg2+ darstellt, wohingegen Übergangsmetallionen nicht beeinflusst werden. Die Auswirkungen beider Chelatoren auf den Abbau von p6 wurden in aufsteigenden Konzentrationen getestet (7A). Die Auswertung von vier unabhängigen Experimenten zeigte für TPEN eine dosisabhängige Hemmung der Degradation von sp6 mit einer linearen Dosis-Wirkungskurve (7B). BAPTA/AM übte hingegen keinen Einfluss auf den Abbau von sp6 aus (7B). Erfindungsgemäß kann daraus geschlossen werden, dass für die verantwortliche Metalloprotease Übergangsmetallionen als Kofaktor essentiell sind, Mg2+ und Ca2+ jedoch nicht benötigt werden.
  • Die unter der Verwendung von BAPTA/AM und TPEN erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sich bei der p6-abbauenden Aktivität um eine Metalloprotease handelt. Zudem verhindert die Depletion von Übergangsmetallionen durch entsprechende Chelatoren, wie z.B. TPEN, die Degradation von sp6.
  • Beispiel 6: Insulin und Bacitracin hemmen die Degradation von p6 in vitro
  • Die unter Beispiel 5 vorgebrachten Daten implizieren, dass eine zytosolische Metalloprotease für die in vitro-Degradation von p6 verantwortlich ist. Das Insulindegradierende Enzym (IDE) stellt eine solche Metalloprotease dar. IDE ist hauptverantwortlich für die in vitro-Degradation von Insulin in Zell- und Gewebeextrakten und spaltet zudem in vitro diverse Peptidhormone.
  • Um die Beteiligung von IDE an der Degradation von p6 zu untersuchen, wurde der Einfluss des IDE-Substrats Insulin auf die in vitro-Degradation von sp6BY getestet. Insulin ist hierbei kompetitiv zu anderen IDE-Substraten um die Bindung an die IDE und verhindert dadurch deren proteolytische Spaltung. Die erfindungsgemäße Verwendung von verschiedenen Konzentrationen an Insulin resultierte in einer dosisabhängigen Hemmung des Abbaus von sp6BY, wie mittels in vitro Degradationsassays gezeigt werden konnte. Eine komplette Inhibition konnte bei Insulinkonzentrationen von 30 µg/ml beobachtet werden (8A). Der ermittelte IC50-Wert aus vier unabhängigen Experimenten liegt bei ca. 2 µg/ml bzw. 350 nM Insulin, was etwa einem 4fachen molaren Überschuss von Insulin im Vergleich zu sp6 entspricht (8B).
  • Darüber hinaus wurde der Einfluss des Antibiotikums Bacitracin auf den Abbau von sp6 analysiert. Hierbei handelt es sich um ein Gemisch ähnlicher zyklischer Polypeptide, dessen Hauptbestandteil Bacitracin A darstellt. Neben seiner antimikrobiellen Wirkung ist bekannt, dass Bacitracin als niederaffiner IDE-Inhibitor wirken kann. Die Untersuchung der Wirkung von Bacitracin auf den in vitro-Abbau von sp6BY aus sechs unabhängigen Experimenten ergab, dass Konzentrationen über 0,3 mg/ml zu einer kompletten Stabilisierung von sp6 führen. Bei niedrigeren Konzentrationen war eine dosisabhängige Inhibition zu erkennen (8C). Es konnte ein IC50-Wert von etwa 0,03 mg/ml bzw. 21 µM Bacitracin bestimmt werden (8D). Zusammengefasst konnte erfindungsgemäß gezeigt werden, dass die beiden Inhibitoren der IDE, Insulin und Bacitracin, in der Lage sind, den Abbau von p6 in vitro zu blockieren. Dies deutet darauf hin, dass p6 durch die zelluläre Protease IDE degradiert wird.
  • Beispiel 7: Adenosintriphosphat und N-Ethylmaleinimid hemmen die Degradation von p6 in vitro
  • Es ist bereits bekannt, dass Adenosintriphosphat (ATP) die IDE-Aktivität beeinflussen kann. So führt die Anwesenheit von ATP bei kleinen IDE-Substraten, wie z.B. Nonapeptiden, zu einer Steigerung der Katalyse. Im Gegensatz dazu wurde bei größeren Substraten, wie z.B. Insulin, eine Hemmung des Abbaus nachgewiesen. Um herauszufinden, welchen Einfluss die Zugabe von ATP auf den Abbau von p6 hat, wurde S10 Extrakt mit verschiedenen Konzentrationen an exogen zugegebenem ATP versetzt und anschließend mit sp6BY inkubiert. Die Auswertung der in vitro Degradationsassays ergab, dass ATP die Degradation von p6 deutlich hemmt (9A). Der errechnete IC50-Wert liegt bei etwa 2,5 mM (9B). Außerdem wurde die Sensitivität des p6-Abbaus auf N-Ethylmaleinimid (NEM) getestet. Es ist bekannt, dass Substanzen, welche Cysteine alkylieren, eine starke inhibitorische Wirkung auf die Aktivität von IDE ausüben. Um zu überprüfen, ob NEM die Degradation von p6 verhindert, wurde S10 Extrakt mit verschiedenen Konzentrationen von NEM behandelt. Die Auswertung der in vitro Degradationsassays ergab, dass der Abbau von p6 effizient durch NEM gehemmt wird (9C). Selbst bei der niedrigsten verwendeten Konzentration von 200 µM NEM war eine komplette Stabilisierung von p6 zu erkennen (9D). Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, dass ATP und NEM, ähnlich dem natürlichen Substrat Insulin, die in vitro-Degradation von p6 verhindern. Die unter Verwendung von ATP und NEM erhaltenen Daten ergeben zusammen mit den Daten unter Ausführungsbeispiel 6, dass IDE für den in vitro-Abbau von p6 verantwortlich ist und p6 ein neu identifiziertes IDE-Substrat darstellt.
  • Beispiel 8: Rekombinante IDE spaltet synthetisches und virales p6
  • Als nächster Schritt wurde untersucht, ob IDE ausreichend ist, um p6 abzubauen, oder ob weitere zelluläre Proteasen beteiligt sind, welche p6 in Abhängigkeit von IDE oder gemeinsam mit IDE spalten. Hierzu wurde erfindungsgemäß aufgereinigte rekombinante IDE (rIDE) mit sp6BY koinkubiert und mittels in vitro Degradationsassays untersucht. Die Bestimmung der p6-Mengen nach Koinkubation ergab, dass rIDE alleine in der Lage ist, sp6BY zu degradieren (10A). Zudem konnte der Metallionen-Chelator TPEN sowie die IDE-Inhibitoren NEM und Insulin die Degradation von sp6BY verhindern. Daher kann der Abbau von sp6 spezifisch und ausschließlich auf die IDE-Aktivität zurückgeführt werden und die Beteiligung anderer zellulärer Proteasen an der Degradation von p6 ausgeschlossen werden. Um zu untersuchen, ob auch natives virales p6 (vp6) in vitro mittels IDE abgebaut wird, wurden Lysate von aufgereinigten HIV-1-Virionen mit rIDE koinkubiert. Hierzu wurden 293T-Zellen transient mit dem subgenomischen HIV-1-Expressionskonstrukt pNLenv1 transfiziert, welches für alle viralen HIV-1 Proteine mit Ausnahme von Env kodiert. Die freigesetzten Virus-ähnlichen Partikel (virus-like particles, VLPs) wurden mittels Zentrifugation über ein 20% Sucrose-Kissen aufgereinigt, mittels Lysepuffer (0,5% Triton®X-100; 150 mM NaCl; 50 mM Tris pH 7,4) aufgeschlossen und mit rIDE inkubiert.
  • Die Auswertung mittels Western Blot zeigt, dass rIDE vp6 spezifisch degradiert ( 10B). Da alle anderen Gag-Proteine, sowie alle Gag-Intermediate, welche p6 enthalten, diesem Degradations-Phänomen nicht unterliegen, lässt sich feststellen, dass ausschließlich reifes vp6 mittels IDE degradiert wird.
  • Diese Ergebnisse bestätigen IDE als p6-degradierendes Enzym und zeigen, dass IDE vp6 aus Viruspartikeln im Kontext einer Neuinfektion selektiv degradiert. Damit ist IDE ein neuartiger Wirtszellfaktor, welcher spezifisch das HIV-1 p6 Gag-Protein im Prozess des Viruseintritts degradieren kann.
  • Beispiel 9: IDE-Depletion mittels siRNA erhöht die Stabilität von sp6 und vp6
  • Um noch detaillierter den Nachweis zu führen, dass p6 ein Substrat von IDE ist, wurde IDE in HeLa-Zellen selektiv durch die Transfektion von IDE-spezifischer small interfering RNA (siRNA) depletiert. Nach IDE knock down wurden Zellextrakte mit gleicher Proteinkonzentration hergestellt und die p6-Degradation mittels in vitro Degradationsassays analysiert.
  • Dabei zeigte sich, dass die erfindungsgemäße Depletion von IDE durch siRNA in vitro einen signifikant geringeren Abbau von sp6BY bewirkt, verglichen mit dem Lysat aus nicht transfizierten oder mit der Kontroll-siRNA behandelten Zellen (11A). Die Halbwertszeit von sp6BY in den Kontrolllysaten beträgt etwa 10 min, während diese im IDE-depletierten Lysat bei ca. 90 min liegt (11B). Die Werte ergeben sich aus vier unabhängigen Versuchen.
  • Ähnliche Versuche wurden auch mit vp6 durchgeführt und dabei zeigte sich, dass die Depletion von IDE die spezifische in vitro-Degradation von reifem vp6 verhindert ( 11C). Zusammengefasst bestätigen diese Ergebnisse, dass p6 erfindungsgemäß ein neuartiges Substrat für IDE ist.
  • Beispiel 10: p6 ist ein besseres IDE-Substrat als Insulin
  • Die Halbwertszeit von p6 beträgt in vitro etwa 10 min (vgl. Ausführungsbeispiel 4). Es wurde nun untersucht, ob der Umsatz von p6 durch IDE mit dem von dem physiologischen Substrat Insulin vergleichbar ist. Zur Messung des Umsatzes von Insulin wurde eine mit dem Fluorochrom FITC markierte Insulinvariante (Insulin-FITC) verwendet. Erfindungsgemäß wurden aufsteigende Mengen rIDE zusammen mit 10 ng sp6BY oder 10 ng Insulin-FITC koinkubiert. Anschließend wurde die verbleibende Menge des jeweiligen Substrats densitometrisch bestimmt. Dabei wurde festgestellt, dass bereits 10 ng rIDE in der Lage sind, 10 ng sp6 vollständig zu degradieren (12A). Im Gegensatz dazu sind selbst 100 ng rIDE nicht ausreichend, um in der gleichen Reaktionszeit 10 ng Insulin vollständig umzusetzen (12B). Dieses Ergebnis konnte durch die Quantifizierung der nach der Spaltung verbleibenden Substratmengen an sp6 oder Insulin-FITC bestätigt werden ( 12C).
  • Weiterhin wurden der Km und der vmax-Wert von IDE mit dem entsprechenden Wert für sp6 verglichen. Erfindungsgemäß wurde aus drei unabhängigen Experimenten für sp6 ein Km-Wert von 1,1 +/- 0,1 mM und ein vmax-Wert von 0,86 +/- 0,02 [mol(p6)/(mol(IDE)*s] bestimmt (13). Der Km-Wert für Insulin beträgt 22-180 nM. Daraus ergibt sich, dass p6 ein 100-fach besseres Substrat für die IDE darstellt als Insulin. Aus der Evolution von HIV-1, welches nachweislich vor 80 Jahren von Primaten auf den Menschen die Spezies-Barriere übersprungen hat, ist somit ein wesentlich besseres Substrat für IDE hervorgegangen, verglichen mit seinem natürlichen Substrat Insulin.
  • Beispiel 11: IDE spaltet p6 in drei distinkten Regionen
  • IDE kann ihre Substrate mehrfach an verschiedenen Stellen spalten, was zu einem komplexen Gemisch an Spaltprodukten führt. Um zu bestimmen an welchen Positionen p6 von IDE gespalten wird, wurden die Fragmente, welche erfindungsgemäß durch in vitro-Verdau von p6 entstanden sind, mittels Massenspektrometrie untersucht. Hierfür wurde entweder 100 ng sp6BY für 30 min oder 100 ng sp6 für die Dauer von 1, 5, 10, 30 und 60 min mit 10 ng rIDE verdaut und die Reaktionen durch Zugabe von Trifluoressigsäure (0,3 % (w/v) Endkonzentration) abgestoppt.
  • Nach 1 min Verdau konnten zunächst die Fragmente R16-S25 und R42-Q52 detektiert werden (14A). Daraus ergibt sich, dass die zuerst auftretenden Fragmente 15F|R16, 25S|Q26 und 41L|R42 sind (14B). Über die Inkubationsdauer von 5 bis 60 min ergaben sich Fragmente, welche sich von einem N-terminalen Peptid 1L-S25 durch Spaltung zwischen den Positionen E12 bis F17 ableiten lassen. In diesem Bereich wurden vier Spaltstellen detektiert (12E|ES|F|R|F17). Ebenso waren C-terminale Fragmente zu erkennen, welche sich aus der Spaltung eines Peptids S26-Q52 im Bereich L38 bis F45 erklären lassen. Für diesen Bereich konnten fünf Spaltungen gezeigt werden (38L|AS|L|R|SL|F45). Im Gegensatz dazu wurde kein Fragment gefunden, welches den Bereich Q25-S26 überspannt, aber zusätzlich an anderer Stelle geschnitten worden ist. Somit scheint es sich bei der Spaltung 25S|Q26 um den initialen Schnitt zu handeln, welchem alle weiteren Spaltungen folgen.
  • Ferner ergaben unabhängige Verdau-Studien von sp6 und sp6BY reproduzierbare Schnittmuster. Allein der Schnitt 42R|S43 ist nur beim nicht-markierten p6 zu finden. Die Spaltstelle 2Q|S3 ist hingegen ausschließlich bei sp6BY zu beobachten und stellt somit wahrscheinlich ein durch die N-terminale Markierung induziertes Artefakt dar (14C; Dargestellt ist die Aminosäuresequenz von p6. Die Größe der Pfeile spiegelt die Zeitpunkte wider, zu denen die jeweiligen Schnitte zuerst detektiert wurden. Eine Schnittstelle, welche nur bei sp6BY gefunden wurde und daher wahrscheinlich ein durch die N-terminale Markierung induziertes Artefakt darstellt, ist mit Klammern kenntlich gemacht).
  • Zusammengefasst zeigt diese Analyse erfindungsgemäß, dass IDE p6 an bis zu zehn definierten Positionen schneidet. Ein erster einzelner Schnitt erfolgt vermutlich zentral in p6 zwischen 25S|Q26, wohingegen die restlichen Spaltungen sich mit vier bzw. fünf Schnittstellen auf die Bereiche E12-E17 bzw. L38-F45 verteilen.
  • Beispiel 12: Die Insertion multipler PTAPPA-Motive in die Proteinsequenz von sp6 führt zu dessen Stabilisierung im in vitro Degradationsassay
  • Anhand der Kenntnis der Schnittstellen von IDE innerhalb des p6-Proteins war es nun möglich, innerhalb dieser Schnittstellen Mutationen einzuführen, mit dem Ziel eine Stabilisierung von p6 zu erreichen. Hierfür wurden erfindungsgemäß multiple PTAPPA-Motive in die p6-Sequenz des infektiösen Virusstammes NL4-3 eingefügt. sp6 wt stellt die Wildtyp (wt)-Variante mit der Original-NL4-3-p6-Sequenz dar, bei sp6 2x und 3xPTAPPA ist jeweils die PTAPPE-Sequenz des wt durch zwei oder drei PTAPPA-Motive ersetzt (15A). Neben der Tatsache, dass sich in diesem Bereich Schnittstellen der IDE befinden, führt die Insertion dieser Aminosäuren zusätzlich zu einer Vergrößerung des p6-Proteins, was dessen Eintritt in die IDE-Katalysekammer und die dort stattfindende N-terminale Verankerung des Substrats stört und so den Abbau von p6 verhindern könnte. Zur Analyse der Stabilität der beschriebenen sp6-Varianten wurden in vitro-Degradationsassays durchgeführt.
  • Dabei zeigte sich, dass sich die Halbwertszeit der verschiedenen sp6-Varianten durch das Einbringen von PTAPPA-Motiven dosisabhängig erhöht (15 B + 16; 16: Auswertung von drei unabhängigen Experimenten). Während sp6 wt nach 15-minütiger Inkubation mit Zellextrakt nicht mehr nachweisbar war, war sp6 2xPTAPPA über einen Zeitraum von 30 Minuten und sp6 3xPTAPPA sogar über den gesamten analysierten Zeitraum stabil (15B).
  • Zusammenfassend wurde durch die erfindungsgemäße Insertion von PTAPPA-Motiven in die p6-Sequenz eine dosisabhängige Stabilisierung des p6-Proteins erreicht.
  • Beispiel 13: Die Insertion multipler PTAPPA-Motive stabilisiert virales p6
  • Um den festgestellten Stabilisierungseffekt multipler PTAPPA-Sequenzen auch in reifem vp6 zu untersuchen und ob die Mutationen in das HIV-1NL4-3 Genom inseriert, wurden vp6 wt, sowie die 2xPTAPPA und 3xPTAPPA p6-Variante mittels in vitro Degradationsassay untersucht.
  • Dabei konnte gezeigt werden, dass erfindungsgemäß auch bei vp6, wie bei sp6 (siehe Ausführungsbeispiel 12), die Stabilität des p6 Proteins dosisabhängig durch die Insertion von PTAPPA-Motiven erhöht werden kann (17 A + B; 17B: Auswertung von drei unabhängigen Experimenten). Somit kann festgehalten werden, dass die Insertion multipler PTAPPA-Sequenzen auch im viralen Kontext die Stabilität von p6 dosisabhängig erhöht.
  • Beispiel 14: Das Einbringen von PTAPPA-Motiven in das p6-Protein von HIV-1 Gag hemmt dosisabhängig die HIV-1 Replikation in primären T-Zellen.
  • Nachdem gezeigt werden konnte, dass das Einbringen von PTAPPA-Motiven in das p6-Protein von HIV-1 Gag den Abbau von p6 durch IDE dosisabhängig hemmen kann, wurde der Effekt eines stabilen p6-Proteins auf die Infektionsausbreitung untersucht. Erfindungsgemäß wurden dazu isolierte primäre humane PBMC-Kulturen mit HIV-1NL4-3 (X4-troph; Virionen binden an CD4 und den CXCR4 Co-Rezeptor an der Oberfläche von T-Zellen) wt oder HIV-1NL4-3 (X4-troph), bei dem zwei, drei oder vier PTAPPA-Motive in das p6-Protein eingebracht wurden, infiziert. Einen Tag nach der Infektion wurden die Zellen in PBS gewaschen und mit frischem Medium versetzt. Alle 2-3 Tage wurden Proben von Zellkultur-Überständen abgenommen, eingefroren und später zur Bestimmung der Reversen Transkriptase (RT)-Aktivität eingesetzt. Gleichzeitig wurden 80% des Zellkultur-Mediums erneuert. Die RT-Aktivität (ccpm) wurde in den zellfreien Zellkultur-Überständen bestimmt und gegen die Zeit aufgetragen (18A).
  • Dabei zeigt sich eine dosisabhängige Inhibierung der HIV-1 Replikation. Das Einbringen von zwei PTAPPA-Motiven reduziert die HIV-1 Replikation um ca. 40%, das Einbringen von drei oder vier PTAPPA-Motiven bedingt dosisabhängig einen weiteren deutlichen Rückgang der HIV-1 Replikationskapazität in primären PBMCs um bis zu 80 % (18A).
  • Um die statistische Relevanz dieses Phänomens zu untermauern, wurde mittels der Replikationsprofile von HIV-1 nach Infektion von PBMCs aus sechs verschiedenen Spendern die area under the curve (AUC) bestimmt, welche die Replikationskapazität von HIV-1 repräsentiert (18B; schwarzer Pfeil). Die Auswertung von 6 Replikationsprofilen zeigt eine signifikante Reduktion um 20% in der Replikationskapazität von HIV-1 nach der Infektion mit X4-trophen Viren, welche 2xPTAPPA in p6 enthalten, eine Reduktion um ca. 60% nach Einbringen von 3 PTAPPA-Motiven und sogar eine Reduktion um 80% nach Einbringen von 4 PTAPPA-Motiven (19; Die Replikationskapazität des wt wurde auf 100% gesetzt).
  • Zusammengefasst lässt sich feststellen, dass das erfindungsgemäße Einbringen von PTAPPA-Motiven in das HIV-1 p6-Protein und dessen dadurch bedingte Stabilisierung dosisabhängig zu einer deutlichen Hemmung der HIV-1 Replikation in primären T-Zellen führt.
  • Beispiel 15: Die Zugabe von Insulin hemmt die Replikation von HIV-1 wt in primären T-Zellen, hat jedoch keinen Einfluss auf die Replikation von HIV-1-Mutanten mit stabilem p6
  • Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Zugabe von Insulin in p6 Abbau-Untersuchungen kompetitiv die Aktivität von IDE hemmt und dadurch das p6-Potein stabilisiert (Ausführungsbeispiel 6), wurde der Effekt von Insulin auf die Infektionsausbreitung von HIV-1 untersucht. Dazu wurden isolierte primäre PBMC-Kulturen mit HIV-1NL4-3 (X4-troph) infiziert. Einen Tag nach der Infektion wurden die Zellen in PBS gewaschen, mit frischem Medium versetzt, welches Insulin in einer Konzentration von 50 µg/ml enthält. Die Behandlung mit Insulin erfolgte über den gesamten Zeitraum nach Infektion (Zeitpunkte der Zugabe markiert durch schwarze Pfeile). Alle 2-3 Tage wurden Proben von Zellkultur-Überständen abgenommen, eingefroren und später zur Bestimmung der RT-Aktivität eingesetzt. Gleichzeitig wurden 80% des Zellkultur-Mediums erneuert und mit frischen Insulin versetzt. Die RT-Aktivität (ccpm) wurde in den zellfreien Zellkultur-Überständen bestimmt und gegen die Zeit aufgetragen (20).
  • Erfindungsgemäß zeigt sich dabei eine Inhibierung der HIV-1 Replikation nach Zugabe von Insulin (20). Die Auswertung der HIV-1 Replikationskapazität nach Infektion von PBMCs aus 6 verschiedenen Spendern, zeigt bei einer permanenten Behandlung der Zellen mit 50 µg/ml Insulin eine signifikante Reduktion um ca.50% (21A; Die Replikationskapazität des wt ohne Insulinbehandlung wurde auf 100% gesetzt).
  • Diese Beobachtung unterstreicht, dass die Stabilisierung des p6-Proteins nach Zugabe von Insulin, bedingt durch die kompetitive Hemmung der IDE, einen hemmenden Effekt auf die HIV-1 Replikation in T-Zellen ausübt.
  • Um näher einzugrenzen, dass die Stabilität von p6 tatsächlich mit der Replikationskapazität von HIV-1 korreliert, wurde primäre PBMCs mit HIV-1NL4-3 (X4-troph), bei PTAPPA-Motive in das p6-Protein eingebracht wurden infiziert und analog zu HIV-1NL4-3 wt (X4-troph) wie vorher beschrieben permanent mit 50 µg/ml Insulin behandelt und analoge Replikationsstudien durchgeführt. Die 3xPTAPPA-Mutante, die nicht mehr von IDE abgebaut wird (siehe Ausführungsbeispiel 12 und 13), sollte nach Behandlung mit Insulin keine verminderte Replikationskapazität ausweisen, da hier p6 bereits stabilisiert vorliegt.
  • Tatsächlich zeigte die Auswertung der HIV-1 Replikationskapazität nach Infektion von PBMCs aus 6 verschiedenen Spendern, dass die permanente Behandlung der Zellen mit 50 µg/ml Insulin keinen Einfluss auf die Replikationskapazität der 3xPTAPPA-Mutante hatte (21B; Die Replikationskapazität der 3xPTAPPA-Mutante ohne Insulinbehandlung wurde auf 100% gesetzt).
  • Das Ergebnis zeigt, dass erfindungsgemäß die Stabilität von p6 spezifisch die Sensitivität der HIV-1 Replikation auf die Behandlung mit Insulin reguliert.
  • Beispiel 16: Das Einbringen von PTAPPA Motiven führt dosisabhängig zu einer verminderten Infektiösität von HIV-1
  • Nachdem gezeigt werden konnte, dass das Einbringen von PTAPPA-Motiven in das p6-Protein von HIV-1 Gag den Abbau von p6 durch IDE und dadurch bedingt die Replikationskapazität von HIV-1 dosis-abhängig hemmen kann, wurde der Einfluss eines stabilen p6 auf die spezifische Infektiösität von HIV-1 untersucht. Zur Durchführung dieser Experimente wurden HeLa TZM-bl Zellen verwendet, welche stabil CD4, CCR5 und CXCR4 sowie das lacZ-Reportergen unter Kontrolle des HIV-1 long terminal repeat (LTR)-Promotors exprimieren. Diese wurden zunächst mit HIV-1NL4-3 (X4 troph) wt sowie HIV-1NL4-3 (X4 troph), bei dem zwei bzw. drei PTAPPA-Motive in das p6-Protein eingebracht wurden, infiziert. Einen Tag nach Infektion wurde das Medium gewechselt. Nach weiteren 48 h wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, anschließend erfolgte die Lyse der Zellen unter Verwendung eines Gal-Screen-System und die Messung der β-Galaktosidase-Aktivität.
  • Das Ergebnis auf 4 unabhängigen Experimenten zeigt erfindungsgemäß einen dosisabhängigen Rückgang der spezifischen Infektiösität von HIV-1 in Abhängigkeit der Anzahl der eingebrachten PTAPPA-Motive (22) um bis zu 50%. Die verminderte Infektiösität von HIV-1 korreliert mit der stabilisierenden Wirkung der PTAPPA-Motive auf p6.
  • Beispiel 17: Die Zugabe von Insulin hemmt die Infektiösität von HIV-1 wt, hat jedoch keinen Einfluss auf die Infektiösität von HIV-1-Mutanten mit stabilem p6
  • Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Zugabe von Insulin kompetitiv die Aktivität von IDE hemmt und dadurch das p6-Protein stabilisiert (Ausführungsbeispiel 6), wurde der Effekt von Insulin auf die Infektiösität von HIV-1NL4-3 (X4 troph) wt und nach Insertion von 3x PTAPPA-Motiven untersucht. Dazu wurden HeLa TZM-bl Zellen mit HIV-1NL4-3 (X4 troph) wt sowie HIV-1NL4-3 (X4 troph) 3x PTAPPA infiziert. Einen Tag vor sowie einen Tag nach Infektion wurden die Zellen mit unterschiedlichen Mengen Insulin (0, 10 und 20 µg/ml) behandelt. Nach weiteren 48 h wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, anschließend erfolgte die Lyse der Zellen unter Verwendung eines Gal-Screen Systems und die Messung der β-Galaktosidase-Aktivität.
  • Erfindungsgemäß zeigt sich bei den mit HIV-1NL4-3 wt infizierten Zellen nach Behandlung mit 10 bzw. 20 µg/ml Insulin eine um ca. 40% verminderte β-Galaktosidase-Aktivität im Vergleich zu den nicht behandelten Zellen (23A; Zusammenfassung von 4 unabhängigen Experimenten). Diese Beobachtung verdeutlicht, dass die Stabilisierung des p6-Proteins nach Zugabe von Insulin, bedingt durch die kompetitive Hemmung der IDE, einen hemmenden Effekt auf die Infektiösität von HIV-1 ausübt.
  • Im Gegensatz dazu hat die Behandlung mit 10 bzw. 20 µg/ml Insulin keinen Einfluss auf die Infektiösität von HIV-1NL4-3 3x PTAPPA (23B; Zusammenfassung von 4 unabhängigen Experimenten), da das p6-Protein nach Insertion von drei PTAPPA-Motiven im Vergleich zum wt erfindungsgemäß bereits eine deutlich erhöhte Stabilität aufweist (siehe Ausführungsbeispiele 12 und 13).
  • Zusammengefasst lässt sich feststellen, dass die erfindungsgemäße Zugabe von Insulin die Infektiösität von HIV-1NL4-3 wt hemmt. Dieser Effekt ist abhängig von Stabilität des p6-Proteins, da nach Einbringen drei PTAPPA-Motiven und der damit verbundenen Stabilisierung von p6, die Behandlung mit Insulin die Infektiösität von HIV-1 nicht beeinflusst.
  • Beispiel 18: Der spezifische IDE-Inhibitor 6bK hemmt die Degradation von p6 in vitro
  • Es zeigte sich, dass das Makrolidmolekül 6bK (allgemeine Formel (II)) in vitro und in vivo in der Lage ist, IDE sehr spezifisch zu hemmen. Die angegebene IC50 lag dabei bei 50 nM. Um zu bestimmen, welchen Einfluss die Zugabe von 6bK auf den Abbau von p6 hat, wurde S10 Extrakt mit verschiedenen Konzentrationen an exogen zugegebenem ATP versetzt und anschließend mit sp6BY inkubiert. Die Auswertung von 3 Experimenten mittels in vitro Degradationsassays ergab, dass 6bK die Degradation von p6 deutlich hemmt (24A). Der errechnete IC50-Wert liegt bei etwa 1 µM (24B).
  • Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, dass der spezifische IDE-Inhibitor 6bK, die in vitro Degradation von p6 verhindert.
  • Beispiel 19: Die Zugabe von 6bK hemmt dosisabhängig die HIV-1 Replikation in primären T-Zellen
  • Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Zugabe von 6bK in p6 Abbau-Untersuchungen das p6-Potein stabilisiert (Ausführungsbeispiel 18), wurde der Effekt von 6bK auf die Infektionsausbreitung von HIV-1 untersucht. Dazu wurden isolierte primäre PBMC-Kulturen mit HIV-1NL4-3 (X4-troph) infiziert. Einen Tag nach der Infektion wurden die Zellen in PBS gewaschen, mit frischem Medium versetzt, welches 6bK in verschiedenen nicht zytotoxischen Konzentrationen (5 µM, 10 µM, 20µM) enthält. Die Behandlung mit 6bK erfolgte über den gesamten Zeitraum nach Infektion (Zeitpunkte der Zugabe markiert durch schwarze Pfeile). Alle 2-3 Tage wurden Proben von Zellkultur-Überständen abgenommen, eingefroren und später zur Bestimmung der RT-Aktivität eingesetzt. Gleichzeitig wurden 80% des Zellkultur-Mediums erneuert und mit frischen 6bK versetzt. Die RT-Aktivität (ccpm) wurde in den zellfreien Zellkultur-Überständen bestimmt und gegen die Zeit aufgetragen ( 25).
  • Erfindungsgemäß zeigt sich dabei eine dosisabhängige Inhibierung der HIV-1 Replikation nach Zugabe von 6bK (25). Die Auswertung der HIV-1 Replikationskapazität nach Infektion von PBMCs aus 3 verschiedenen Spendern, zeigt bei einer permanenten Behandlung der Zellen verschiedenen Konzentrationen von 6bK eine signifikante dosisabhängige Reduktion um bis zu 90% (26; Die Replikationskapazität des wt ohne Behandlung mit 6bK wurde auf 100% gesetzt). Diese Beobachtung unterstreicht, dass die Stabilisierung des p6-Proteins nach Zugabe von 6bK, bedingt durch die spezifische Hemmung der IDE, einen hemmenden Effekt auf die HIV-1 Replikation in T-Zellen ausübt.
  • Beispiel 20: Die Zugabe von 6bK hemmt dosisabhängig die Infektiösität von HIV-1
  • Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Behandlung mit dem spezifischen IDE-Inhibitor 6bK die Replikationskapazität von HIV-1 dosis-abhängig hemmen kann (Ausführungsbeispiel 19), wurde der Einfluss auf die spezifische Infektiösität von HIV-1 untersucht. Zur Durchführung dieser Experimente wurden HeLa TZM-bl Zellen verwendet, welche 24 h vor der Infektion mit verschiedenen, nicht toxischen Konzentrationen von 6bK (5 µM, 10 µM, 20 µM) behandelt wurden, mit HIV-1NL4-3 (X4 troph) wt infiziert. Einen Tag nach Infektion wurde das Medium gewechselt und frisches 6bK zugegeben. Nach weiteren 48 h wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, anschließend erfolgte die Lyse der Zellen unter Verwendung eines Gal-Screen-System und die Messung der β-Galaktosidase-Aktivität.
  • Das Ergebnis auf 3 unabhängigen Experimenten zeigt erfindungsgemäß einen dosisabhängigen Rückgang der spezifischen Infektiösität von HIV-1 nach Behandlung mit 6bK (27) um bis zu 80%. Die verminderte Infektiösität von HIV-1 korreliert somit mir der spezifischen Hemmung der IDE und der dadurch bedingten Stabilisierung des p6-Proteins.
  • Figurenliste
    • 1:
      • A: Nachweis von freiem p6 in der Zelle nach Infektion
      • B: p6-enthaltende Prozessierungsintermediate von HIV-1 Gag
    • 2:
      • A: Schematische Darstellung der verwendeten CMV-p6- Expressionssysteme
      • B: Expression von einem CMV-getriebenen Transgen
    • 3:
      • A: Verwendete CMV-p6 Expressionssysteme B: MHC-I Antigenpräsentation von HIV-1 p6-SL
    • 4: Schema für den Aufbau eines in vitro Degradationsassays für sp6 und vp6 Der S10-Extrakt ist überwiegend zytosolischer Zellextrakt. sp6 (synthetisches p6) wurde mittels Festphasenpeptidsynthese synthetisiert. vp6 (virales p6) entspricht VLPs, die nach Transfektion von 293T-Zellen mit subgenomischen env-deletierten HIV-1-Expressionskon-strukten erhalten wurden. Die Reinigung erfolgte mittels Zentrifugation durch ein 20% Sucrose-Kissen. Danach wurde mit 0.5% TX-100 lysiert.
    • 5: A + B + C: p6 wird durch eine zelluläre Protease abgebaut
    • 6:
      • A: NH2-Cys(BODIPY)-p6
      • B + C: p6 wird durch eine zelluläre Protease abgebaut
    • 7: A + B: Depletion von Übergangsmetallionen inhibiert den Abbau von p6 B:
      Figure DE102015201100B4_0003
      TPEN
      Figure DE102015201100B4_0004
      BAPTA/AM
    • 8: A + B: Insulin hemmt die Degradation von p6 in vitro C + D: Bacitracin hemmt die Degradation von p6 in vitro
    • 9: A + B: ATP hemmt die Degradation von p6 in vitro C + D: NEM hemmt die Degradation von p6 in vitro
    • 10: A + B: Rekombinante IDE degradiert spezifisch reifes vp6
    • 11 Einfluss der siRNA-vermittelten IDE-Depletion auf die Stabilität von sp6 und vp6 in vitro
    • 12: A + B + C: p6 ist ein besseres DIE Szbstrat als Insulin
    • 13: Ermittlung des Km-Wertes für p6
    • 14: Massenspektrometrische Untersuchungen der Spaltprodukte von p6 nach IDE-Degradation
    • 15: A + B: Die Insertion multipler PTAPPA-Motive in die Proteinsequenz von sp6 führt zu dessen Stabilisierung im in vitro Degradationsassay.
    • 16: Die Insertion multipler PTAPPA-Motive in die Proteinsequenz von sp6 führt zu dessen Stabilisierung im in vitro Degradationsassay. wt 2xPTAPPA
      Figure DE102015201100B4_0005
      3xPTAPPA
    • 17: Die Insertion multipler PTAPPA-Motive stabilisiert vp6 B: wt 2xPTAPPA 3xPTAPPA
    • 18: A + B: Das Einbringen von PTAPPA-Motiven in das p6-Protein von HIV-1 Gag hemmt dosisabhängig die HIV-1 Replikation in primären T-Zellen. — • — Nicht infiziert wtNL4-3
      Figure DE102015201100B4_0006
      2xPTAPPA
      Figure DE102015201100B4_0007
      3xPTAPPA
      Figure DE102015201100B4_0008
      4xPTAPPA
    • 19: Das Einbringen von PTAPPA-Motiven in das p6-Protein von HIV-1 Gag hemmt dosisabhängig die HIV-1 Replikation in primären T-Zellen.
    • 20: Die Zugabe von Insulin hemmt die HIV-1 Replikation in T-Zellen, abhängig von der p6-Stabilität. — • — Nicht infiziert WtNL4-3 wtNL4-3 + 50 µg/ml Insulin
    • 21: A + B: Die Zugabe von Insulin hemmt die HIV-1 Replikation in T-Zellen, abhängig von der p6-Stabilität.
    • 22: Das Einbringen von PTAPPA Motiven führt dosisabhängig zu einer verminderten Infektiösität von HIV-1. wt
      Figure DE102015201100B4_0009
      2x PTAPPA
      Figure DE102015201100B4_0010
      3x PTAPPA
    • 23: A + B: Die Zugabe von Insulin hemmt die Infektiösität von HIV-1 wt (A), jedoch nicht von der 3x PTAPPA-Mutante (B) 0 µg/ml Insulin 10 µg/ml Insulin
      Figure DE102015201100B4_0011
      20 µglml Insulin
    • 24: 6bK hemmt die Degradation von p6 in vitro
    • 25: Die Zugabe von 6bK hemmt dosisabhängig die HIV-1 Replikation in T-Zellen — • —nicht infiziert unbehandelt 5 µM 6bK 10µM 6bK 20µM 6bK
    • 26: Die Zugabe von 6bK hemmt -statistisch signifikant- dosisabhängig die HIV-1 Replikation in T-Zellen
    • 27: Die Zugabe von 6bK hemmt dosisabhängig die Infektiösität von HIV-1 wt unbehandelt 5 µM 6bK 10 µM 6bK
      Figure DE102015201100B4_0012
      20 µM 6bK
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    • 13. Kleinsorge, H (1995) Retardformulierungen in der medikamentösen Therapie. Leipzig, Barth 8°

Claims (15)

  1. Verwendung einer Verbindung, die den proteolytischen Abbau des retroviralen Proteins p6 hemmt, zur Prophylaxe oder Behandlung einer retroviralen Infektion und/oder deren Folgekrankheiten.
  2. Verwendung eines Inhibitors des Insulin degradierenden Enzyms (IDE) zur Prophylaxe oder Behandlung einer retroviralen Infektion und/oder deren Folgekrankheiten.
  3. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die besagte Verbindung eine Struktur gemäß Formel (I) aufweist,
    Figure DE102015201100B4_0013
    worin R1 für -H, -CH3, -CH2-CH2-C(=O)-NH2, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH3 +, -CH2-CH2-CH2-NH-C(=NH)-NH2, -(CH2)n-cyclohexyl, -(CH2)n-cyclopentyl, -(CH2)n-cyclobutyl, - (CH2)n-cyclopropyl, -(CH2)n-phenyl steht; R2 für -H oder -(CH2)n-CH3 steht; R3 für -C(=O)-NH2 oder -CH2-C(=O)-NH2 steht; und n jeweils unabhängig voneinander entweder 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
  4. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin besagte Verbindung aus der Gruppe bestehend aus Insulin, Glucagon, TGF-α, β-Endorphin, β-Amyloid, Amylin, Atriales natriuretisches Peptid, Somatostatin, Polypeptid-Antibiotika und IDEspezifischer siRNA ausgewählt ist.
  5. Verwendung einer Verbindung gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche in Gegenwart eines oder mehrerer Zink-Chelatoren, ATP und/oder Sulfhydryl-modifizierenden Reagentien.
  6. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei die retrovirale Infektion und/oder ihre Folgekrankheit eine HIV-1-Infektion, HIV-2-Infektion, AIDS, AIDS-Folgekrankheit, eine mit einer HAART-Behandlung assoziiert auftretende Krankheit oder Schädigung beim Menschen, oder eine FIV- oder SIV-Infektion beim Tier ist.
  7. Verwendung einer Verbindung wie in einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche definiert zusammen mit mindestens einem weiteren Wirkstoff, wobei der besagte weitere Wirkstoff aus der Gruppe bestehend aus Reverse Transkriptase-Inhibitoren, Integrase-Inhibitoren, HIV-Protease-Inhibitoren, Proteasom-Inhibitoren, DUB-Inhibitoren, Entry-Inhibitoren, HIV-Vakzine, Virostatika und Immunstimulanzien ausgewählt ist.
  8. Verwendung einer oder mehrerer Verbindungen wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 oder in Anspruch 7 definiert zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung einer retroviralen Infektion und/oder ihrer Folgekrankheiten.
  9. Verwendung gemäß Anspruch 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung zur oralen Verabreichung.
  10. Verwendung gemäß Anspruch 8 zur Herstellung eines Lyophilisats oder einer flüssigen Formulierung.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung einer retroviralen Infektion und/oder ihrer Folgekrankheiten, die eine Verbindung wie in Anspruch 1 bis 5 oder in Anspruch 7 definiert zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Hilfsstoff, Verdünnungsmittel, Kryoprotektivum und/oder Lyoprotektivum enthält.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, die zur oralen, parenteralen, topischen und/oder inhalativen Verabreichung geeignet ist.
  13. Verfahren zur Identifikation einer Verbindung wie in Anspruch 2 definiert, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Probe enthaltend IDE ; b) Bereitstellen einer Testsubstanz und eines unmittelbaren oder mittelbaren IDE-Substrates; c) Zusammenbringen der Komponenten aus Schritt a) und b) unter geeigneten Reaktionsbedingungen; d) gegebenenfalls Abstoppen der Reaktion aus c); und e) qualitativer oder quantitativer Nachweis eines oder mehrerer der unmittelbaren oder mittelbaren Reaktionsprodukte oder -edukte aus Schritt c) oder d) durch geeignete Analyseverfahren.
  14. Verfahren zur Identifikation einer Verbindung wie in Anspruch 1 definiert, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Probe enthaltend retrovirales Protein p6; b) Bereitsstellen einer Testsubstanz ; c) Zusammenbringen der Komponenten aus Schritt a) und b) unter geeigneten Reaktionsbedingungen; d) gegebenenfalls Abstoppen der Reaktion aus Schritt c); und e) qualitativer oder quantitaver Nachweis eines oder mehrerer der unmittelbaren oder mittelbaren Reaktionsprodukte oder -edukte aus Schritt c) oder d) durch geeignete Analyseverfahren.
  15. Verfahren zur Prophylaxe oder Therapie einer retroviralen Infektion und/oder deren Folgekrankheiten worin einem Individuum eine pharmazeutisch wirksame Dosis einer Verbindung wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 definiert verabreicht wird.
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