JP5903718B2 - Ｈｉｖ−１感染の処置のための方法及び医薬的組成物 - Google Patents

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Description

発明の属する技術分野：
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染を処置又は防止するための方法及び組成物（例えば医薬的組成物など）を提供する。特に、本発明は、ＨＩＶ−１感染の処置又は防止における使用のためのｐａｎｎｅｘｉｎ１、ＡＴＰ、又はＰ２Ｙ２受容体からなる群より選択されるプリン作動性シグナル伝達経路の成分の遮断薬剤に関する。
発明の背景：
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）による免疫系への損傷に起因する数々の症状を指す。免疫系の有効性を低下させることにより、ＡＩＤＳは、感染した個人を、日和見感染及びそうでなければ稀な腫瘍に感受性にする。３３００万を超える人々が世界中で糖尿病を伴い生きている。今までに２５００万の致死的症例があった。３〜４００万の人々が新たに感染しており、２００万を超える人々が１年当たりで死亡する（３３０，０００の子供を含む）。ＡＩＤＳのための高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）によって、疾患の進行を遅らせることができるが、感染のためのワクチン又は治療法は現在ない。ワクチンを開発するための繰り返された最近の失敗のため、より基本的な研究が、効果的な処置を開発することができる前に、ＨＩＶ感染により起こされる病態を理解するために要求されうるというコンセンサスが増大している。
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）を伴う感染は、ウイルス複製及びＣＤ４＋Ｔ細胞の漸進的な喪失により特徴付けられ、それらは、日和見感染、新生物、及び最終的には死亡に至る、進行性の免疫不全に関連付けられる。ウイルス伝播及びＣＤ４＋Ｔ細胞死を誘発する機構は、ＨＩＶ感染個人において観察されるアポトーシスの規模が疾患の様々な段階と相関するにもかかわらず、依然として十分には理解されていない。いくつかの非排他的な仮説が、ＨＩＶ疾患におけるこのＴ細胞枯渇を説明するために示唆されている。感染細胞（「直接殺傷」）及び免疫学的に関連する非感染細胞（「バイスタンダー殺傷」）のアポトーシス破壊は、Ｔ細胞消滅に関与し、ウイルス拡散に寄与する。ウイルスタンパク質（Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｖｐｒ）及び宿主因子（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞の表面上でのＦａｓ／Ａｐｏ−１／ＣＤ９５の過剰発現、ＴＲＡＩＬの過剰発現、ＣＤ８＋細胞の間での減少したＢＣＬ−２発現、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインプロファイルの不均衡、酸化ストレス）の全てがＨＩＶ−１感染の免疫病理学に関与する。
ウイルス粒子又はＨＩＶ−１感染細胞の膜中に存在するＨＩＶ−１エンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質複合体（ｇｐ１０／ｇｐ４１）は、Ｅｎｖ受容体及び共受容体（ＣＤ４及びＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５）を含む標的細胞膜との並置及びその後の融合を誘発する。このプロセスは、Ｅｎｖ暴露膜及びＣＤ４プラスＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５発現膜の間での、接触部位での接着接合の形成を含む。この二膜構造（ウイルス学的シナプス（ＶＳ）又は感染性シナプス（ＩＳ）とも呼ばれる）が、Ｔ細胞／Ｔ細胞及びＴ細胞／樹状細胞の相互作用の間に観測される免疫学的シナプスと類似しており、ナノチューブの産生、ならびに、Ｅｎｖ、共受容体（ＣＤ４、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）、インテグリン（例えば、ＬＦＡ１、α４β７）、テトラスパニン（例えば、ＣＤ８１）、接着タンパク質（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３）、及びシグナル伝達経路（例えば、ＴＡＬＩＮ）又は細胞骨格（例えば、チューブリン及びアクチン）に関連付けられる細胞内タンパク質の超分子複合体における動員を要求する。大半の（全てではない）ＨＩＶ伝達が、このウイルス学的シナプスを横切るこの細胞間の相互作用を介して生じる。Ｅｎｖの融合活性はＨＩＶ−１複製を支持するが、それは、また、バイスタンダー細胞死を刺激しうる。ｇｐ４１の融合ドメインにおける変異は、アポトーシスを誘導することに失敗した融合欠損Ｅｎｖをもたらした。また、ｇｐ４１のループ領域が変異されたＥｎｖタンパク質は、バイスタンダー細胞への脂質移動（半融合）を触媒する能力を保存したが、しかし、細胞間融合において欠損となった。この変異体は依然としてバイスタンダー細胞においてアポトーシスを誘導することができたが、ｇｐ４１媒介性の半融合がバイスタンダー細胞におけるアポトーシスの誘導のために要求され、十分であることを示唆している。２つの相互作用する細胞の間での融合が融合孔の形成を許す場合、多核巨細胞が産生され（シンシチウムとも呼ばれる）、最終的には、シンシチウムはアポトーシスを通じて屈する。細胞死誘導のこの様式は、同様に、ＨＩＶ−１誘導性の免疫病理に関与する。なぜなら、シンシチウムは、エイズ患者からのリンパ組織中で見出すことができるからである。さらに、シンシチウム、いわゆる「多核巨細胞」の存在は、ＨＩＶ−１誘導性脳炎（「ニューロＡＩＤＳ」）について特徴的である。
従って、ウイルス学的シナプスの形成及び維持に関与する分子を同定する誘因がある。そのようなシナプスに関与する分子機構の知識を改善することにより、これは、新規治療標的を同定し、ＨＩＶ−１感染の処置を改善させうる新たなアプローチを開発するために役立ちうる。
発明の概要
本発明は、ＨＩＶ−１感染の処置又は防止における使用のためのｐａｎｎｅｘｉｎ１、ＡＴＰ、又はＰ２Ｙ２受容体からなる群より選択されるプリン作動性シグナル伝達経路の成分の遮断薬剤に関する。
発明の詳細な説明
細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、原形質膜のプリン作動性受容体を活性化し、複数の細胞機能を調節することができる。本発明において、本発明者らは、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質と特定の宿主細胞受容体の間での相互作用時に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１チャネルを通じて、ＡＴＰがＨＩＶ−１標的細胞から放出されることを観察した。細胞外ＡＴＰは、次に、プリン作動性受容体、特にＰ２Ｙ２受容体に作用し、Ｐｙｋ２キナーゼ活性化及び一過性の原形質膜の脱分極を含むシグナル伝達経路を刺激し、それは、順に、Ｅｎｖ発現膜とＣＤ４プラス適切なケモカイン共受容体を含む膜の間での融合を刺激する。このカスケード（ｐａｎｎｅｘｉｎ−１→ＡＴＰ→Ｐ２Ｙ２→Ｐｙｋ２）のタンパク質構成要素の各々の阻害は、従来の抗レトロウイルス薬剤に耐性であるＨＩＶ−１変異体の複製を阻害することができる。全体では、本発明者らの結果は、新たな治療的アプローチの開発のための十分な機会を提供する、ＨＩＶ−１感染の初期段階に関与する新規シグナル伝達経路を描写する。
治療的方法及び使用：
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染を処置又は防止するための方法及び組成物（例えば医薬的組成物など）を提供する。
第１の局面に従って、本発明は、ＨＩＶ−１感染の処置又は防止における使用のためのｐａｎｎｅｘｉｎ１、ＡＴＰ、又はＰ２Ｙ２受容体からなる群より選択されるプリン作動性シグナル伝達経路の成分の遮断薬剤に関する。
本明細書において使用される通り、用語「プリン作動性シグナル伝達経路」は、プリン（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ）の細胞外放出及び／又は細胞挙動において変化をもたらすことに関与する細胞及び核機構への、プリン（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ）により誘導される細胞シグナルの生成、増幅、伝達、及びその後の阻害に関与する細胞内及び細胞外成分ならびに事象を含む。本発明に従ったプリン作動性シグナル伝達経路の成分は、ＡＴＰ、プリン作動性受容体、ｐａｎｎｅｘｉｎ１、及びＰＹＫ２を含む。
本発明に従って、プリン作動性シグナル伝達経路の成分の遮断薬剤は、Ｐ２Ｙ２受容体アンタゴニスト、ｐａｎｎｅｘｉｎ１アンタゴニスト、及びＡＴＰ分解薬剤からなる群より選択されうる。
本明細書において使用される通り、用語「プリン作動性受容体」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｐ１及びＰ２受容体を指す。「Ｐ１受容体」は、「アデノシン受容体」とも名付けられており、プリン作動性受容体のクラス、内因性リガンドとしてアデノシンを伴うＧタンパク質共役受容体である（「Ｐ２受容体」はＰ２Ｘ及びＰ２Ｙ受容体を含む）。「Ｐ２Ｙ受容体」は、プリン作動性受容体のファミリー、ヌクレオチド（例えばＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、及びＵＤＰ−グルコースなど）により刺激されるＧタンパク質共役受容体である。今日まで、１２のＰ２Ｙ受容体がヒトにおいてクローン化されている：Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ５、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ８、Ｐ２Ｙ９、Ｐ２Ｙ１０、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２Ｙ１３、及びＰ２Ｙ１４（Abbracchio MP, Burnstock G, Boeynaems JM, Barnard EA, Boyer JL, Kennedy C, Knight GE, Fumagalli M, Gachet C, Jacobson KA, Weisman GA (2006). "International Union of Pharmacology LVIII: update on the P2Y G protein-coupled nucleotide receptors: from molecular mechanisms and pathophysiology to therapy". Pharmacol. Rev. 58 (3): 281-341）。
用語「Ｐ２Ｙ２受容体アンタゴニスト」は、任意の化学的又は生物学的実体を含み、被験体への投与時に、被験体におけるＰ２Ｙ２受容体の活性化に関連付けられる生物学的活性（そうでなければ、その天然リガンド（例えば、ＡＴＰ）のＰ２Ｙ２受容体への結合に起因する下流の生物学的効果のいずれかを含む）の阻害又は下方制御をもたらす。そのようなＰ２Ｙ２受容体アンタゴニストは、Ｐ２Ｙ２受容体活性化又はＰ２Ｙ２受容体活性化の下流の生物学的効果のいずれかを遮断することができる任意の薬剤を含む。例えば、そのようなＰ２Ｙ２受容体アンタゴニストは、Ｐ２Ｙ２受容体の結合部位又はその部分を占有することにより作用することができ、それにより、受容体をその天然リガンド（例えば、ＡＴＰ）に接近不可能にし、その正常な生物学的活性を防止又は低下する。Ｐ２Ｙ２受容体に向けた化合物のアンタゴニスト活性は、当技術分野において周知の種々の方法を使用して決定されうる。例えば、薬剤は、Ｐ２Ｙ２受容体とＰ２Ｙ２受容体の天然リガンド（例えば、ＡＴＰ）との相互作用を遮断するそれらの能力についてテストされうる。例えば、アッセイは、細胞の表面上に発現されるＰ２Ｙ２受容体を用いて実施される。Ｐ２Ｙ２受容体に対する化合物のアンタゴニスト活性を決定するための典型的なアッセイが、P. Hillmann, G.-Y. Ko, A. Spinrath, A. Raulf, I. von Kugelgen, S.C. Wolff, R.A. Nicholas, E. Kostenis, H.-D. Holtje and C.E. Muller, J. Med.Chem.52 (2009), p. 27620に記載されている。簡単には、ＮＧ１０８−１５細胞（マウス神経芽細胞腫×ラットグリオーマハイブリッド細胞株）におけるＵＴＰ誘導性細胞内カルシウム放出を阻害するテスト化合物の効力は、カルシウムキレートフルオロフォアOregon Green（登録商標）を使用した蛍光方法により決定されうる。
本明細書において使用される通り、用語「ｐａｎｎｅｘｉｎ１」又は「Ｐａｎｘ１」は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、機械受容イオンチャネルｐａｎｎｅｘｉｎ１を指す。
用語「ｐａｎｎｅｘｉｎ １アンタゴニスト」は、任意の化学的又は生物学的実体を含み、被験体への投与時に、被験体におけるｐａｎｎｅｘｉｎ １の活性化に関連付けられる生物学的活性（下流の生物学的効果のいずれかを含む）の阻害又は下方制御をもたらす。そのようなｐａｎｎｅｘｉｎ１アンタゴニストは、ｐａｎｎｅｘｉｎ１によるＡＴＰの放出又は前記放出に起因する下流の生物学的効果のいずれかを遮断することができる任意の薬剤を含む。例えば、そのようなｐａｎｎｅｘｉｎ１アンタゴニストは、チャネル又はその部分を占有することにより作用することができ、それにより、ＡＴＰの放出を回避し、その正常な生物学的活性が防止又は低下される。ｐａｎｎｅｘｉｎ１に向けた化合物のアンタゴニスト活性は、当技術分野において周知の種々の方法を使用して決定されうる。例えば、薬剤は、チャネルによるＡＴＰの放出を遮断するそれらの能力についてテストされうる。典型的には、アッセイは、細胞の表面上に発現されるｐａｎｎｅｘｉｎ１を用いて実施される。
一実施態様において、本発明の遮断薬剤は、低分子量アンタゴニスト（例えば、有機小分子）でありうる。用語「有機小分子」は、医薬品において一般的に使用されるそれらの有機分子と同程度の大きさの分子を指す。この用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除く。好ましい有機小分子は、サイズにおいて、約５０００Daまで、より好ましくは２０００Daまで、最も好ましくは約１０００Daまでの範囲である。
Ｐ２Ｙ２受容体アンタゴニストである例示的な有機小分子は、しかし、限定されないが、Sauer R et al.（Sauer R, El-Tayeb A, Kaulich M, Muller CE.Synthesis of uracil nucleotide analogs with a modified, acyclic ribose moiety as P2Y(2) receptor antagonists Bioorg Med Chem. 2009 Jul 15;17(14): 5071-9. Epub 2009 May 30）において記載されるウラシルヌクレオチド類似体又はWeyler S. et al.（Weyler S, Baqi Y, Hillmann P, Kaulich M, Hunder AM, Muller IA, Muller CE.Combinatorial synthesis of anilinoanthraquinone derivatives and evaluation as non-nucleotide-derived P2Y2 receptor antagonists. Bioorg Med Chem Lett. 2008 Jan 1; 18(1): 223-7.Epub 2007 Oct 30.）において記載される４−フェニルアミノ−置換１−アミノ−２−スルホアントラキノンを含み、それらは、本開示中への参照により本明細書により組み入れられる。典型的なＰ２Ｙ２受容体アンタゴニストは、二リン酸５−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）ペンチルホスホン酸無水物、４−フェニル−アミノ−４−（２−メトキシフェニル）−２−スルホアントラキノン（ＰＳＢ−７１６）である。
ｐａｎｎｅｘｉｎ１アンタゴニストである例示的な有機小分子は、しかし、限定されないが、４−（ジプロピルスルファモイル）安息香酸（プロベネシドとしても公知である）、ベンゾイルベンゾイル−ＡＴＰ、ブリリアントブルーＧ、及びカルベノキソロンを含む。
別の実施態様において、本発明の遮断薬剤は、抗体（抗体フラグメントを含む用語）にありうる。特に、遮断薬剤は、前記抗体が前記受容体又はチャネルの活性化を損なうような方法で、Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１に向けられる抗体にありうる。
抗体は、例えば、とりわけ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、及びマウスより選択される宿主動物へ適切な抗原又はエピトープを投与することにより、公知の方法に従って産生することができる。当技術分野において公知の種々のアジュバントを使用し、抗体産生を増強することができる。本発明を実行する際に有用な抗体は、ポリクローナルであることができるが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して、調製及び単離することができる。産生及び単離のための技術は、しかし、限定されないが、ハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を含む。あるいは、一本鎖抗体の産生について記載された技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）を、抗Ｐ２Ｙ２受容体、又は抗ｐａｎｎｅｘｉｎ１単鎖抗体を産生するために適応することができる。本発明の遮断薬剤は、また、抗Ｐ２Ｙ２受容体、又は抗ｐａｎｎｅｘｉｎ１抗体フラグメント（しかし、限定されないが、インタクトな抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント、及び、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成することができるＦａｂフラグメントを含む）を含む。あるいは、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築し、受容体又はチャネルへの所望の特異性を有するフラグメントの迅速な同定を許すことができる。
ヒト化抗体及びそれらからの抗体フラグメントは、また、公知の技術に従って調製することができる。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む非ヒト（例えば、齧歯類）キメラ抗体の形態である。大半の部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、それにおいてレシピエントの超可変領域（ＣＤＲ）からの残基が、非ヒト種（ドナー抗体）（例えば所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類など）の超可変領域からの残基により置換される。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体において又はドナー抗体において見出されない残基を含みうる。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するために作製される。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、それにおいて、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合により、また、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。ヒト化抗体を作製するための方法が、例えば、Winter（米国特許第５，２２５，５３９号）及びBoss（Celltech、米国特許第４，８１６，３９７号）により記載されている。
次に、上に記載する通りに抗体を産生した後、当業者は、Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１を遮断するものを簡単に選択することができる。
別の実施態様において、本発明の遮断薬剤はアプタマーである。アプタマーは、分子認識に関して、抗体の代替物を表す分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性を伴う標的分子の実質的に任意のクラスを認識する能力を伴うオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーの指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）を通じて単離されうる。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成により入手可能である。このライブラリーにおいて、各々のメンバーは、固有配列の線形オリゴマー（最終的には化学的に修飾される）である。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド方法によるコンビナトリアルライブラリーより選択されるプラットフォームタンパク質（例えば大腸菌チオレドキシンＡなど）により表示される立体構造的に制約された抗体可変領域からなる。
次に、上に記載する通りにＰ２Ｙ２受容体、ｐａｎｎｅｘｉｎ１に対して向けられるアプタマーを産生した後、当業者は前記の受容体又はチャネルを遮断するものを簡単に選択することができる。
ｐａｎｎｅｘｉｎ１に対して向けられるアプタマーである例示的なペプチドは、しかし、限定されないが、ｐａｎｎｅｘｉｎ１模倣遮断ペプチド：ＷＲＱＡＡＦＶＤＳＹ（配列番号１）を含む。
別の実施態様において、本発明に従った遮断薬剤は、遺伝子発現の阻害剤である。
「遺伝子発現の阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害する又は有意に低下させる生物学的効果を有する天然又は合成化合物を指す。結果的に、遺伝子発現の前記阻害剤は、Ｐ２Ｙ２受容体遺伝子発現の阻害剤又はｐａｎｎｅｘｉｎ１遺伝子発現の阻害剤でありうる。
本発明における使用のための遺伝子発現の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンストラクトに基づきうる。アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含む）は、それに結合し、このように、タンパク質翻訳を防止する又はｍＲＮＡ分解を増加させ、このように、細胞においてタンパク質（例えば、Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１）のレベル、このように、活性を減少させることにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接的に遮断するように作用しうる。例えば、少なくとも約１５塩基の、及び、標的タンパク質（例えば、Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１）をコードするｍＲＮＡ転写物配列の固有領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、従来のリン酸ジエステル技術により合成し、例えば、静脈内注射又は注入により投与することができる。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法が、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；及び第５，９８１，７３２号を参照のこと）。
小さな阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、また、本発明における使用のための遺伝子発現の阻害剤として機能することができる。遺伝子発現は、被験体又は細胞を、小さな二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、あるいは小さな二本鎖ＲＮＡの産生を起こすベクター又はコンストラクトと接触させることにより低下させることができ、遺伝子発現が特異的に阻害されるようにする（即ち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法が、配列が公知である遺伝子について、当技術分野において周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999)；Elbashir, S. M. et al. (2001)；Hannon, GJ. (2002)；McManus, MT. et al. (2002)；Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号及び第６，５０６，５５９号；ならびに国際特許公開ＷＯ ０１／３６６４６、ＷＯ ９９／３２６１９、及びＷＯ ０１／６８８３６を参照のこと）。
ｐａｎｎｅｘｉｎ１及びＰＹＫ２に対する例示的なｓｉＲＮＡを、実施例において記載する。
リボザイムは、また、本発明における使用のための遺伝子発現の阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することが可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレアーゼ切断を含む。ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的及び効率的に触媒する、操作されたヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、それにより、本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、リボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることにより最初に同定され、それらは、典型的には、以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含む。一度、同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適にすることができる、予測される構造的特性（例えば二次構造など）について評価することができる。候補標的の適切性は、また、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのそれらの接近可能性をテストすることにより評価することができる。
遺伝子発現の阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの両方を、公知の方法により調製することができる。これらは、化学合成のための技術（例えば、固相ホスホラマダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍａｄｉｔｅ）化学合成による、など）を含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ又はインビボでの転写により生成することができる。そのようなＤＮＡ配列は、適したＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなど）を組み入れる多種多様なベクター中に組み入れることができる。本発明のオリゴヌクレオチドへの種々の修飾を、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として導入することができる。可能な修飾は、しかし、限定されないが、分子の５’及び／又は３’末端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、あるいは、オリゴヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合よりはむしろ、ホスホロチオエート又は２’−Ｏ−メチルの使用を含む。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、インビボで単独で又はベクターとの関連において送達されうる。その最も広い意味において、「ベクター」は、細胞、及び、好ましくは標的タンパク質（例えば、Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１）を発現する細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸の移動を促進することが可能な任意の媒体である。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在においてもたらされうる分解の範囲と比べて、低下した分解を伴う細胞に核酸を輸送する。一般的に、本発明において有用なベクターは、しかし、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み入れにより操作されているウイルス又は細菌の供給源に由来する他の媒体を含む。ウイルスベクターはベクターの好ましい型であり、しかし、限定されないが、以下のウイルスからの核酸配列を含む：レトロウイルス（例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスなど）；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス（例えばレトロウイルスなど）。名付けられていないが、しかし、当技術分野において公知である他のベクターを容易に用いることができる。
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子を用いて置換されている非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスはレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）を含み、そのライフサイクルは、ＤＮＡへのゲノムウイルスＲＮＡの逆転写を含み、宿主細胞ＤＮＡ中へのその後のプロウイルス組込みを伴う。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療治験について承認されている。最も有用であるのは、複製欠損している（即ち、所望のタンパク質の合成に向けることが可能であるが、しかし、感染性粒子を製造することが不可能である）それらのレトロウイルスである。そのような遺伝的に変化させたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率な形質導入のための一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的プロトコール（プラスミド中への外因性遺伝物質の組み入れ、プラスミドを用いたパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、及びウイルス粒子を用いた標的細胞の感染の工程を含む）が、Kriegler, 1990において及びMurry, 1991において提供される。
特定の適用のための好ましいウイルスは、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスであり、それらは、遺伝子治療におけるヒト使用について既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスを操作し、複製欠損にすることができ、広範囲の細胞型及び種に感染することが可能である。それは、さらに、利点、例えば熱及び脂質溶媒安定性；多様な系統の細胞（造血細胞を含む）における高い形質導入頻度；及び重複感染阻害の欠如などを有し、このように、複数の系列の形質導入を許す。報告によると、アデノ随伴ウイルスは部位特異的な様式においてヒト細胞ＤＮＡ中に組み込むことができ、それにより、レトロウイルス感染に特徴的な挿入変異誘発の可能性及び挿入遺伝子発現の変動性を最小限にする。また、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在において１００を上回る継代にわたり組織培養中で続けられており、アデノ随伴ウイルスゲノム組込みが比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスは、また、染色体外の様式で機能することができる。
他のベクターはプラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは当技術分野において広範囲に記載されており、当業者に周知である。例えば、Sambrook et al., 1989を参照のこと。過去数年において、プラスミドベクターが、抗原をコードする遺伝子をインビボで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。それらは、このために特に有利である。なぜなら、それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全上の懸念を有さないからである。これらのプラスミドは、しかし、宿主細胞と適合するプロモーターを有し、プラスミド内に動作可能にコードされる遺伝子からペプチドを発現することができる。一部の一般に使用されるプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。他のプラスミドが当業者に周知である。加えて、プラスミドは、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去及び付加するための制限酵素及び連結反応を使用して注文設計されうる。プラスミドは、種々の非経口、粘膜、及び局所経路により送達されうる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路により注射することができる。それは、また、鼻腔内噴霧又は液滴、直腸坐剤により及び経口により投与されうる。それは、また、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面中に投与されうる。プラスミドは、水溶液中で、金粒子上で乾燥させて、又は、別のＤＮＡ送達系（しかし、限定されないが、リポソーム、デンドリマー、渦巻形、及びマイクロカプセル化を含む）との関連において与えてもよい。
本発明の目的のために、用語「ＡＴＰ分解薬剤」は、細胞外ＡＴＰを分解する能力を有する化合物（天然又は非天然）を意味することが意図される。典型的には、本発明に従ったＡＴＰ分解薬剤は、酵素、例えばヌクレオチド三リン酸分解酵素（アピラーゼ）などである。別の実施態様において、ＡＴＰ分解薬剤は、細胞膜に存在するＡＴＰアーゼ（例えばＣＤ３９など）を刺激する薬剤である。特に、前記薬剤は、上に記載する通りに得られうる有機小分子、抗体、又はアプタマーにありうる。
本発明の遮断薬剤の特性は、ＨＩＶ−１感染の予防及び処置においてそれらを特に有用にする。
したがって、本発明の別の目的は、上に記載する通りに、遮断薬剤を用いて、それを必要とする被験体に投与することを含む、ＨＩＶ−１感染を処置又は防止するための方法に関する。
本明細書において使用される通り、用語「被験体」は、哺乳動物（例えば齧歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類など）を表示する。好ましくは、本発明に従った被験体はヒトである。
本発明の遮断薬剤は、医薬的組成物の形態で投与してもよい（以下に定義される通り）。
好ましくは、前記のアンタゴニスト又は阻害剤は、治療的に効果的な量で投与される。
「治療的に効果的な量」により、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比でＨＩＶ感染を処置及び／又は防止するための十分な量の遮断薬剤を意味する。
本発明の化合物及び組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決められることが理解されるであろう。任意の特定の被験体についての特定の治療的に効果的な用量レベルは、以下を含む種々の因子に依存する：処置されている障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、被験体の年齢、体重、一般健康、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排泄速度；処置期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせで又はそれと同時に使用される薬物；及び医学的技術分野において周知の因子。例えば、所望の治療的効果を達成するために要求されるものよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることは、当技術分野の範囲内で周知である。しかし、産物の１日投与量は、０．０１〜１，０００mg／成人／日の広範囲にわたり変動しうる。好ましくは、組成物は、処置される被験体への投与量の症候性調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含む。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの活性成分を、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含む。効果的な量の薬物は、普通は、０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重／日、特に約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重／日の投与量レベルで供給される。
医薬的組成物：
本発明の遮断薬剤は、医薬的に許容可能な賦形剤、及び、場合により、徐放性マトリックス（例えば生物分解性ポリマーなど）と組み合わせて、治療用組成物を形成しうる。
用語「医薬的に」又は「医薬的に許容可能な」は、哺乳動物、特にヒトに投与した場合（適切な場合）、有害の、アレルギー性の、又は他の厄介な反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、非毒性の固体、半固体、もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、又は任意の型の補助製剤を指す。
本発明の医薬的組成物において、活性成分は、単独で又は別の活性成分との組み合わせにおいて、動物及びヒトに、従来の医薬的支持体との混合物としての単位投与形態で投与することができる。適した単位投与形態は、経口経路形態（例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒剤及び経口懸濁剤又は溶液など）、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、髄腔内及び鼻腔内投与形態ならびに直腸投与形態を含む。
好ましくは、医薬的組成物は、注入することが可能な製剤用の医薬的に許容可能である賦形剤を含む。これらは、特に等張性の無菌生理食塩溶液（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど、あるいはそのような塩の混合物）、又は乾燥した、特に凍結乾燥組成物でありうるが、それらは、滅菌水又は生理学的食塩水の添加時に、場合に依存して、注射用溶液の構成を許す。
注射可能な使用のために適した医薬的形態は、無菌水溶液又は分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌の注射可能な溶液又は分散剤の即時調製用の無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで液体でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば細菌及び真菌など）の混入作用に対して保存されなければならない。
遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての本発明の化合物を含む溶液は、界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロースなど）と適切に混合し、水中で調製することができる。分散剤は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中ならびに油中で調製することができる。保存及び使用の普通の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含む。
本発明の遮断薬剤は、中性又は塩の形態で組成物に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、それらは、無機酸、例えば、塩酸又はリン酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、また、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄など、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来しうる。
担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適した混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒質でありうる。適当な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、要求される粒子サイズの維持により（分散剤の場合において）、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬剤及び抗真菌薬剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によりもたらすことができる。多くの場合において、等張薬剤（例えば、糖又は塩化ナトリウム）を含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）中での使用によりもたらすことができる。
無菌の注射可能な溶液は、上に列挙する種々の他の成分を伴う適切な溶媒中に、要求される量で活性ポリペプチドを取り込ませることにより調製し、要求される場合、ろ過滅菌が続く。一般的に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、基礎分散媒質及び上に列挙するものからの要求される他の成分を含む無菌賦形剤中に取り込ませることにより調製する。無菌の注射可能な溶液の調製用の無菌粉末の場合において、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それによって、活性成分＋先に無菌ろ過されたその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。
製剤化時に、溶液は、投与製剤と適合する様式で、治療的に効果的な量で投与されうる。製剤は、種々の投与形態（例えば上に記載する注射可能な溶液の型など）で簡単に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。
水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要な場合、適切に緩衝化し、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適する。これに関連して、用いることができる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１投与量を、１mlの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００mlの皮下注入液に加える又は提案された注入部位に注射しうる。投与量におけるいくらかの変動が、処置されている被験体の状態に依存して必ず生じる。投与に責任のある人は、任意の事象において、個々の被験体のために適切な用量を決定するであろう。
本発明の遮断薬剤を、治療用混合物内で製剤化し、約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０、又はさらには約１０ミリグラム／用量かそこらを含みうる。複数用量を投与することもできる。
非経口投与（例えば静脈内又は筋肉内注射など）のために製剤化される本発明の化合物に加えて、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与のための錠剤又は他の固体；リポソーム製剤；徐放カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態を含む。
特に、本発明の遮断薬剤を、粘膜を通じたＨＩＶ−１の伝達を効果的に防止するために、特にＨＩＶ−１の性的又は膣伝達を防止するために、殺菌剤を適用するために使用することができる医薬的組成物に製剤化してもよい。このように、組成物は、性交又は関連する密接な接触が起こる部位（例えば性器、膣、外陰部、子宮頸部、直腸、口、手、下腹部、大腿上方、特に膣、外陰部、子宮頸部、及び肛門直腸粘膜）に適用される形態である。
適切な局所組成物として、例えば、ゲル、ゼリー、クリーム、ペースト、乳剤、分散剤、軟膏剤、フィルム、スポンジ、発泡剤、エアゾール剤、粉末剤、膣リングもしくは他の膣内薬物送達系、子宮頸部キャップ、インプラント、パッチ、坐剤もしくは直腸用ペッサリー、又は膣適用、膣もしくは直腸もしくはバッカル錠、うがい薬が引用されうる。
特に、本発明の遮断薬剤は、以下：
− 局所的に効果的な量の本発明の化合物；
− ゲル形成化合物；
− バッファー；
− 医薬的に許容可能な希釈剤、好ましくは、水；
− 場合により、湿潤剤；及び
− 場合により、保存剤
を含むゲル製剤として製剤化されうる。
典型的なゲル製剤は、ゲル化薬剤としての天然又は合成ポリマー、及び疎水性又は親水性液体を使用して調製することができる。ゲル製剤において一般に用いられるゲル形成化合物の例は、セルロース誘導体、グリコサミノグリカン、ガム、デンプン（ａアミロース又はアミロペクチン）、及びキトサンを含む多糖類；カルボキシビニル誘導体、ビニルポリマー（例えばポリエチレンなど）、ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｈｔｙｅｌｅｎｅ）グリコール（例えば、ポリエチレングリコール４５００）、Plastibase（登録商標）（可塑化された炭化水素ゲル）、ポリアクリル酸（Carbopols（登録商標）ファミリー、例えば、Carbopol（登録商標）９４０）、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、及びポリビニルアルコール；アクリルアミド又はポリメタクリルアミドポリマー（粘土、例えばベントナイト、Veegum（登録商標）（R. T Vanderbilt）、及びLaponite（登録商標）（Laporte Industries）などを含む）；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン又はポリエチレンオキサイドコポリマー、例えばポロキサマーなど、例えば、ポロキサマー４０７、ポロキサミン；タンパク質、コロイド状シリカ、石鹸、シリコーン、例えばジメチルポリシロキサン又はジメチコン、炭化水素化塩基（パラフィン（ｐａｒａｆｉｎｅ）及びワセリンの混合物）などを含む。有用なセルロース誘導体は、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースを含む。有用なグリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン−４−硫酸、ヘパラン硫酸、及びヘパリンを含む。有用なガムは、天然及び人工ガム、トラガントガム、カラギーナン、ペクチン、寒天、アルギン酸、デキストランを含む。グリコサミノグリカンを使用し、任意の他のゲル形成ポリマー（例えばコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチンなど）との組み合わせで創傷治癒を増強してもよい。好ましいゲル化薬剤は、ヒドロキシエチルセルロースであり、それは、加えて、生体接着特性を有する。
ゲル形成化合物の濃度は、条件（例えば液体／ゲル転移温度、ゲルについて求められる物理的特性、及び製剤の製作において使用されるｐＨなど）で変動しうる。
本発明において用いられるゲル形成化合物は、典型的には、粘性水溶液を形成することが可能な水溶性ポリマー、又は、また、粘性溶液を形成することができる、及び、皮膚との接触時にゲル化する非水溶性の水膨潤性ポリマー（例えば、コラーゲン）である。本発明における使用のために適するゲル化剤は、特に膣において見出される通常の酸性ｐＨ値を上回る、広いｐＨ範囲にわたり安定であるべきである。
緩衝剤を本発明のゲル製剤において使用し、その健康な酸性範囲（即ち、約５未満、より好ましくは約３．２から約４．５の範囲のｐＨ）内で、正常な量の射精の存在においてでさえ膣のｐＨを維持する。膣内環境及び環境における通常の酸性範囲は、ＨＩＶ−１ウイルスの活性を減弱させる際に補助となる。緩衝剤の例は、限定されることなく、乳酸、リン酸、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、無水二塩基性リン酸ナトリウム、酒石酸、トリエタノールアミン、クエン酸、酸性酒石酸カリウム、安息香酸、アルギン酸、ソルビン酸、フマル酸、アスコルビン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エデト酸、エチレンジアミン四酢酸、酢酸、リンゴ酸などを含み、好ましくは水酸化ナトリウム及び乳酸であり、後者は、加えて、保存剤であり、特定の抗菌活性を有する。
酸を、遊離酸、水和物、又は医薬的に許容可能な塩として加えてもよい。遊離酸は、インサイチュ（即ち、膣内）で対応する塩に変換することができる。一般的に、いくつかの緩衝剤が本発明のゲル中に含まれ、増加した緩衝能力を提供することが好ましい。さらにより好ましくは、緩衝剤は、ヒト女性の身体において自然に生じる酸と水素受容物質の組み合わせを含み、それは、膣の表面に適用された場合、その上のｐＨレベルを、健康な膣のおよそのｐＨレベルに維持する。前記酸は、酢酸、乳酸、リン酸、及び硫酸、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択されうる。前記群中の前記メンバーの各々に共通する特徴の１つは、各々の酸が女性の身体において自然に生じることである。別の共通の特徴は、各々が、水素イオンを一時的に供与し、陽イオンを受容し、塩を形成することにより、緩衝系の形成に容易に寄与することである。
前記の水素受容物質は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、及び炭酸カルシウム、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。前記群中の前記メンバーの各々に共通する特徴の１つは、各々の物質が女性の身体において自然に見出されることである。別の共通の特徴は、各々が、水素イオンを一時的に受容し、陽イオンを供与し、塩を形成することにより、緩衝系の形成に容易に寄与することである。そのような塩は、前記の水素受容物質からの前記陽イオンとの組み合わせにおいて、酢酸塩、乳酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩からなる群より選択されうる。
本発明のゲルは、また、湿潤剤を含みうる、好ましくは、含む。適した湿潤剤は、例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール、トリアセチンなどを含む。グリセロールは、好ましい湿潤剤であり、膣環境からゲル中への水分吸収のその能力、又は他の液体に起因するバッファー活性化成分である。そのような液体摂取は、膣内に置かれた場合、ゲル上で乾燥フィルムの形成を防止すると考えられており、ゲル製剤の適用を増強するための、又は、そうでなければ、その機能を増強するための追加の溶媒を提供する。
本発明のゲルは、また、保存剤を含みうる、好ましくは、含むが、それは、他の特性の間で、ゲル製剤の有効期間を延長する。適した保存剤は、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンジルアルコニウム、硝酸フェニル水銀、クロルヘキシジン、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、プロピレングリコールなどを含む。好ましい保存剤はメチルパラベン及びプロピルパラベンであり、その両方がゲルの抗菌能力にも寄与する。
本発明のゲルは、従来のゲル調製技術を使用して調製される。しかし、緩衝剤が最終産物において可溶化されていることを確実にし、ゲルにおける空気の封入を避ける、又は、少なくとも最小限に保つことが望ましい。ゲルにおける空気の封入を低下させるために、低い親水性の薬剤を少しずつ増加させて加えることが一般的に好ましい。あるいは、本発明のゲルは、また、容易に分散可能な固体形態で調製することができ（例えば、粉末、錠剤など）、それらは、望ましい場合、腟の外部又は内部の水性液体の作用により、所望のゲルの一貫性に変換することができる。当業者が理解する通り、本発明のゲルを調製するための方法は、結果として得られるゲルが、本明細書に記載する所望の有益な特性を有する限り、バッチ半連続又は連続操作のために改変することができる。
ゲル製剤は、他の活性成分（例えば殺菌剤、抗菌剤、殺精子剤、又は他の適切な薬物など）と組み合わせることができる。望ましい場合、風味剤、香り、香料、及び着色剤は、それらがゲルにより与えられる保護に干渉しない限り、ゲル中に組み入れることができる。実際に、本発明の組成物中へのそのような風味剤、香り、香料、及び着色剤の組み入れは、ゲルが性的活動の間に使用される確率を増加させることにより、さらなる保護を提供しうる。
本発明の局所製剤（例えば本明細書に記載するゲル製剤など）は、異なる型の粘膜（例えば外陰、膣、子宮頸部、肛門直腸、口、又は皮膚など）を被膜するために使用され、ＨＩＶ−１の侵入を防止する。
本発明の局所製剤（例えば本明細書に記載するゲル製剤など）は、例えば、手、坐剤、又は従来のタンポンもしくはシリンジ技術により膣中に適用することができる。膣内にゲルを投与又は送達する方法は、効果的な量のゲルが膣中に送達される限り、決定的ではない。本発明の局所製剤（例えば本明細書に記載するゲル製剤など）は、また肛門性交の間での保護のために使用することができ、同様の技術を使用して適用することができる。
膣の異性間性交渉のために、本発明の局所製剤（例えば本明細書に記載するゲル製剤など）は、性交より前に膣に適用してもよい。肛門性交（異性間又は同性間）のために、本発明の局所製剤（例えば本明細書に記載するゲル製剤など）は、性交より前に直腸中に挿入してもよい。膣又は肛門のいずれかの性交のために、本発明の局所製剤（例えば本明細書に記載するゲル製剤など）は、また、潤滑剤として作用しうる。追加の保護のために、本発明の局所製剤（例えば本明細書に記載するゲル製剤など）は、性交又は他の性的活動の前にその適用されること、及び、適切な場合、コンドームを使用することが一般的に好ましい。さらなる保護のために、本発明の局所製剤（例えば本明細書に記載するゲル製剤など）は、性的活動の完了後に可能な限り早く適用することができる。性的活動後だけの適用はあまり推奨されないが、それは、依然として、適用が任意の理由のために性的活動より前に実施されなかった場合（例えば、レイプの場合において）、その後が望ましいであろう。
本発明の局所製剤（例えば本明細書に記載するゲル製剤など）は、これらのゲルの適用のパートナーの知識を要求することを伴う又は伴わず、女性（ならびにそのパートナー）の保護のために高度に適する。また、具体的にＨＩＶフリーであるとのパートナーの主張への依存は、必要ないであろう（コンドーム又は保護用の他のバリアデバイスを使用するための合意も）。
膣内リング（ＩＶＲ）は、本発明の遮断薬剤の膣内投与のための適した薬物送達系でもある。ＩＶＲは、送達デバイスを形成する生体適合性エラストマー系（それは優先的にリングの形態を取る）全体に分散する化合物を含む。これらのエラストマーは、好ましくは、疎水性材料、例えばシリコーン（ジメチルポリシロキサンを含むオルガノポリシロキサン）、ポリエチレン−ｃｏ−ポリ（酢酸ビニル）、スチレン−ブタジエン−スチレンブロックコポリマー、ポリフォスファゼン、ポリ（イソプレン）、ポリ（イソブチレン）、ポリブタジエン、ポリウレタン、ニトリルゴム、ネオプレンゴム、又はそれらの混合物などを含む。前記ＩＶＲは持続放出殺菌剤として製剤化することができ、化合物及びＨＩＶ−１及び細胞の間の延長した安定な接触時間をもたらす。ＩＶＲ製剤は文献ＷＯ０２０７６４２６において既に記載されており、その全てが本明細書において参照により組み入れられる。
投与の部位での局所的な医薬的組成物の滞留時間を増加させるために、異なる薬物送達系において生体接着剤、特に生体接着ポリマーを含むことが有利でありうる。生体接着剤は、生きた生物学的表面（例えば粘膜又は皮膚組織など）に付着する物質として定義されうる。用語、生体接着剤は、当業者に周知である。このように、本発明は、また、医薬的に許容可能な担体及び活性成分としての殺菌的に効果的な量の本発明の遮断薬剤を含む医薬的組成物に関し、医薬的組成物は、適用部位への生体接着剤であることを特徴とする。好ましくは、適用部位は、膣、外陰部、子宮頸部、直腸、口、又は皮膚であり、最も好ましくは、膣及び外陰部である。
本発明の医薬的組成物において使用されうる生体接着剤の例は、ポリアクリル酸誘導体、例えばカーボポール又はポリカルボフィル、例えば、カーボポール９３４Ｐ、カーボポール９４０、ポリカルボフィルＡＡ１；セルロースエーテル誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キトサンなど；天然高分子、例えばアルギン酸、トラガント、イヌリンなど；アルファ化デンプン；多糖類ガム、例えばキサンタンガムなどを含む。
あるいは、本発明の製剤は、インプラント、パッチ、パッド、注射剤、又は、子宮頸部、膣、及び直腸組織への化合物の経皮及び皮下送達を達成するための他の調製物の形態でありうる。
ゲルの仕様内に既に示される通り、本発明の遮断薬剤は、全ての適した製剤中で、単独で、又は他の活性成分（例えば抗ウイルス剤、抗生物質、免疫調節剤、又はワクチンなど）との組み合わせにおいて使用されうる。それらは、また、単独で、又はウイルス感染の防止のための他の予防薬剤との組み合わせにおいて使用されうる。本発明の遮断薬剤は、延長した期間にわたりウイルス感染に対して個人を保護するためのワクチン及び方法において使用されうる。化合物は、単独で、又は本発明の他の化合物と一緒に、又は他の抗ウイルス薬剤と一緒に、ワクチン中の逆転写酵素阻害剤の従来の利用と一致した様式において、そのようなワクチンにおいて用いてもよい。このように、本発明の遮断薬剤は、ワクチンにおいて従来用いられる医薬的に許容可能なアジュバントと組み合わせ、予防的に効果的な量で投与してもよく、延長した期間にわたりＨＩＶ−１感染に対して個体を保護する。
本発明の遮断薬剤との組み合わせにおいて使用されうる抗ウイルス化合物は、公知の抗レトロウイルス化合物、例えばペンタミジン、チモペンチン、カスタノスペルミン、デキストラン（デキストラン硫酸）、ホスカルネット−ナトリウム（３ナトリウムホスホノホルメート）など；ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ジドブジン（３’−アジド−３’−デオキシチミジン、ＡＺＴ）、ジダノシン（２’，３’−ジデオキシイノシン；ｄｄＩ）、ザルシタビン（ジデオキシシチジン、ｄｄＣ）又はラミブジン（２’−３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン、３ＴＣ）、スタブジン（２’，３’−ジデヒドロ−３’−デオキシチミジン、ｄ４Ｔ）、アバカビルなど；非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えばネビラピン（１１−シクロプロピル−５，１１−ジヒドロ−４−メチル−６Ｈ−ジピリド−［３，２−ｂ：２’，３’−ｅ］［１，４］ジアゼピン−６−オン）、エファビレンツ、デラビルジンなど；ホスホン酸逆転写酵素阻害剤、例えば、テノホビルなど；ＴＩＢＯの化合物（テトラヒドロ−イミダゾ［４，５，１−ｊｋ］［１，４］−ベンゾジアゼピン−２（１Ｈ）−オン及びチオン）型、例えば、（Ｓ）−８−クロロ−４，５，６，７−テトラヒドロ−５−メチル−６−（３−メチル−２−ブテニル）−イミダゾ［４，５，１−ｊｋ］［１，４］ベンゾ−ジアゼピン−２（１Ｈ）−チオン；［アルファ］−ＡＰＡの化合物（［アルファ］−アニリノフェニルアセトアミド）型、例えば、［アルファ］−［（２−ニトロフェニル）アミノ］−２，６−ジクロロベンゼン−アセトアミドなど；トランス活性化タンパク質の阻害剤、例えばＴＡＴ−阻害剤、例えば、ＲＯ−５−３３３５、又はＲＥＶ阻害剤など；プロテアーゼ阻害剤、例えば、インジナビル、リトナビル、サキナビル、ロピナビル（ＡＢＴ−３７８）、ネルフィナビル、アンプレナビル、ＴＭＣ−１２６、ＢＭＳ−２３２６３２、ＶＸ−１７５など；融合阻害剤、例えば、Ｔ−２０、Ｔ−１２４９など；ＣＸＣＲ４受容体アンタゴニスト、例えば、ＡＭＤ−３１００など；ウイルスインテグラーゼの阻害剤；リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、例えば、ヒドロキシ尿素などでありうる。
組み合わせは、組み合わせの成分がＨＩＶ−１複製の異なる又は同じ部位、好ましくは、異なる部位に作用する場合、ＨＩＶ−１複製を阻害する際に相乗効果も発揮しうる。そのような組み合わせの使用は、その薬剤が単一の活性成分として投与された場合と比較して、所望の予防効果のために要求されうる所与の従来の抗レトロウイルス薬剤の投与量を低下させうる。これらの組み合わせは、任意の関連する毒性を最小限にしながら、単一の薬剤に対する耐性の可能性を低下させる。これらの組み合わせは、また、関連する毒性を増加させることなく、従来の薬剤の効力を増加させうる。
このように、本発明の遮断薬剤は、また、当技術分野で公知の殺菌剤との組み合わせにおいて投与してもよく、結果的に予防効果を増強する。それらは、ＨＩＶ−１と、伝達が起こる部位（例えば、外陰部、膣）の間にバリアを作製することにより感染を遮断することができる；それらは、ウイルスを殺す又は固定化することができる；それらは、一度、それが伝達の部位を覆う細胞（例えば、膣壁を覆う細胞）に感染すると、ウイルスが複製することを防止することができる。
殺菌剤の例は抗体でありうる：ＨＩＶ−１に対抗する単離抗体は、文献において入手可能である。それらを、本発明の遮断薬剤と適切に組み合わせて、ＨＩＶ−１感染を防止しうる。
ｐＨ調整剤（特に膣用）も適しうる。自然の膣環境は、ＨＩＶ−１が生存するためには酸性過ぎるが、しかし、精液はその酸性度を減少させ、ＨＩＶ−１が生存することを許す。ｐＨ調整剤は、膣の自然な酸性度を調節し、それをＨＩＶについて住みにくくする。前記の調整剤は、過酸化水素を産生するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌の使用を包含し、それにより膣環境の健康及び酸性に保つのを助ける。酸性ポリマーBufferGel（ReProtect, LLC）は、また、殺精子活性を有するｐＨ調整剤の別の例である。
洗剤及び界面活性剤も適しうる。これらの化合物は、ウイルスの外殻を破壊することができ、従って、殺菌剤として有用である。それらは、ＨＩＶ−１感染を防止するための化合物と組み合わせることができる。そのような洗剤及び界面活性剤の例は、ノノキシノール９及びオクトキシノール９であるが、しかし、シャンプー、歯磨き及び洗浄溶液、コンタクトレンズ溶液中で一般に使用される全ての洗剤及び界面活性剤が等しく適しうる。
病原体についてのコーティング（例えばＨＩＶ−１に結合する合成ポリマーを含むPro-2000 Gelなど）は、標的細胞へのウイルスの結合を破壊する。
伝達の部位のためのコーティング（例えばゲルなど）も適しうる。これらの産物は、伝達の部位（例えば、膣及び外陰部上皮）をカバーすることにより、ＨＩＶが細胞に入ることを防止しうる。例（上に記載するゲル調製物を含む）は、硫酸化及びスルホン化ポリマー、例えばＰＣ−５１５（カラギーナン）、デキストリン２硫酸塩、分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）などを包含し、それらは標的細胞に結合し、それらがウイルスに接近可能ではなくなり、また、細胞に結合するシアノビリン−Ｎは、ＨＩＶとの細胞融合を禁止する。
本発明の組成物において、上に列挙する殺菌剤の１つ又は複数又は全てを、本発明の遮断薬剤と組み合わせてもよい。このように、本発明は、また、本発明の遮断薬剤を含み、さらに、１つ又は複数の成分を含む医薬的組成物に関し、それにおいて、成分は、抗生物質ペプチド、抗体、ｐＨ調整剤、洗剤又は界面活性剤、病原体についてのコーティング、投与部位についてのコーティングより選択される。
殺菌剤の組み合わせの１つの特定の例は、本発明の遮断薬剤と、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）及び／又はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）との組み合わせである。ＣＡＰ及びその誘導体は、追加の殺菌剤の効果を示す賦形剤である。ＣＡＰ製剤は、Neurath et al.による文献、ＥＰ１０３０５４７、米国特許第６，１６５，４９３号に既に記載されており、その全てが本明細書において参照により組み入れられる。
本発明は、また、殺精子化合物をさらに含む、以上に概説される医薬的組成物に関する。前記組成物は、同時に、受胎及びＨＩＶ−１感染を防止することができる。適した殺精子剤は、例えば、ノノキシノール−９、オクトキシノール−９、メンフェゴール、塩化ベンザルコニウム、Ｎ−ドカサノール（ｄｏｃａｓａｎｏｌ）である。
ＨＩＶ−１感染の予防の当業者は、本明細書に提示されるテスト結果から、殺菌的に効果的な量を決定することができ、適用又は単位用量、特に即放性製剤の適用又は単位用量当たり約１ng〜約１０mg、特に約１０ng〜約１mg、特に約１００ng〜約１００[mu]g、好ましくは約５００ng〜約５０μgの活性成分の範囲でありうる。
単位投与形態として要求される用量を適用することが適切であろう。単位用量の容積、特に即放性製剤の単位用量は、単位投与形態であるか否かを問わず、局所製剤の場合において、局所製剤の約１０μml〜約２５mlまで、特に局所製剤の約１ml〜約１０mlまでの範囲でありうる。例えばゲル又はクリームの場合において、便利な単位用量は、約１mlと約５mlの間の範囲でありうる。例えば、局所製剤、特に即放のための局所製剤（例えば、ゲル、クリームなど）の場合において、本明細書において言及する通り、活性成分は、約１nM〜約１０mMまで、特に約１０nM〜約１mMまで、特に約１００nM〜約１００μMまで、好ましくは約１μM〜約１００μMまでの範囲の濃度で存在しうる。
前記の効果的な量は、使用されている特定の化合物に、処置される被験体の応答に依存して、及び／又は、本発明の化合物を処方する医師の評価に依存して低減又は増加されうることが明らかである。
本発明のスクリーニング方法：
本発明の別の目的は、ＨＩＶ−１感染の処置及び／又は防止のための薬物をスクリーニングするための方法に関する。
特定の実施態様において、本発明のスクリーニング方法は、以下：
ａ）候補化合物を提供すること
ｂ）前記の候補化合物がＰ２Ｙ２アンタゴニスト又はｐａｎｎｅｘｉｎ１アンタゴニストであるか否かを決定すること
からなる工程を含む。
例えば、スクリーニング方法は、Ｐ２Ｙ２もしくはｐａｎｎｅｘｉｎ１への、又は、前記タンパク質を持つ細胞もしくは膜への候補化合物の結合、あるいは、候補化合物に直接的又は間接的に関連付けられた標識を利用して、その融合タンパク質を測定しうる。あるいは、スクリーニング方法は、また、標識した競合相手（例えば、アゴニスト、基質・・・）を伴うタンパク質への候補化合物の結合の競合を、測定すること、又は、定性的もしくは定量的に検出することを含みうる。
特定の実施態様において、本発明のスクリーニング方法は、以下：
ａ）Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１を発現する複数の細胞を提供すること
ｂ）前記細胞を候補化合物とインキュベートすること；
ｃ）前記の候補化合物がＰ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１であるか否かを決定すること；及び
ｄ）Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１を阻害する候補化合物をポジティブに選択すること
からなる工程を含む。
一般的に、そのようなスクリーニング方法は、Ｐ２Ｙ２又はｐａｎｎｅｘｉｎ１、そのオルソログ及びその誘導体を発現する適切な細胞を提供することを含む。特に、前記タンパク質をコードする核酸を用いて、細胞をトランスフェクトし、それによりタンパク質を発現させてもよい。そのようなトランスフェクションは、当技術分野において周知の方法により達成されうる。
特定の実施態様において、細胞は、上皮細胞及び白血球（例えばリンパ球など）からなる群より選択される。あるいは、細胞は、Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１をコードする核酸がトランスフェクトされたアフリカツメガエル卵母細胞より選択されうる。本発明のスクリーニング方法は、そのような細胞をスクリーニングされる化合物と接触させること、及び、そのような化合物がＰ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１を遮断するか否かを決定することにより、本発明の遮断薬剤を決定するために用いてもよい。化合物がＰ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１を遮断するか否かの決定は、当業者に周知の方法により評価することができる。例えば、方法は、化合物がプリン（例えば、ＡＴＰ）によりＰ２Ｙ２受容体の活性を阻害するか否かを決定すること、あるいは、化合物がｐａｎｎｅｘｉｎ１−１活性又はｐａｎｎｅｘｉｎ１によるＡＴＰの放出を阻害するか否かを決定することにありうる。
本発明の一実施態様に従い、候補化合物は、以前に合成された化合物のライブラリー、又は構造がデータベースにおいて決定される化合物のライブラリー、又はデノボで合成された化合物又は天然化合物のライブラリーより選択されうる。候補化合物は、（ａ）タンパク質又はペプチド、（ｂ）核酸、及び（ｃ）有機又は化学的化合物（天然又は非天然）の群より選択されうる。例証的には、事前に選択された候補核酸のライブラリーは、文書ＵＳ ５，４７５，０９６及びＵＳ ５，２７０，１６３に記載される通りに、ＳＥＬＥＸ方法を実施することにより得られうる。さらに例証的には、候補化合物は、Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１に対して向けられた抗体の群より選択されうる。
以前に記載されたインビトロスクリーニングの終了時にポジティブに選択された候補化合物を、その抗ＨＩＶ−１生物学的特性をアッセイする観点から、さらなる選択工程に供してもよい。この目的のために、上に記載する通りに、一般的なインビトロスクリーニング方法を用いてポジティブに選択された候補化合物は、ＨＩＶ−１により誘導さるウイルス学的シナプスを阻害するそれらの能力についてさらに選択されうる。
このように、本発明の別の目的は、感染細胞間のウイルス学的シナプスの形成を阻害する化合物のスクリーニングのための方法からなり、それにおいて、前記方法は、以下：
ｉ）上に記載する通りに、インビトロスクリーニング方法を実施することにより、Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１を遮断する化合物についてスクリーニングすること、及び
ｉｉ）感染細胞間でのウイルス学的シナプスの形成を阻害するそれらの能力について、工程ｉ）の終了時にポジティブに選択された化合物をスクリーニングすること
の工程を含む。
上の方法の特定の好ましい実施態様において、前記のスクリーニング方法の工程ｉｉ）は、以下：
（１）培養した哺乳動物細胞をＨＩＶ−１ウイルスと感染させること、
（２）工程ｉ）で得られた感染細胞を、工程ｉ）の終了時にポジティブに選択された化合物と接触させること、
（３）細胞間融合の量を決定すること、
（４）工程（３）で決定された量を、工程（２）を前記のポジティブに選択された化合物の非存在において実施された場合に決定される量と比較すること
の工程を含む。
上に記載した通りの方法に従い、工程（１）を、考慮下の実施態様に依存して、工程（２）より前又は後のいずれかに実施してもよい。
工程（１）を実施するために、哺乳動物細胞は、初代培養細胞ならびに細胞株を包含する。初代培養細胞は、哺乳動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの初代培養、哺乳動物の血液リンパ球からの初代培養、及び哺乳動物の単球又は哺乳動物のマクロファージからの初代培養を含む。一部の実施態様において、初代培養細胞は、上に記載する方法の工程（１）におけるそれらの使用前に事前に活性化される。哺乳動物細胞は、また、種々の哺乳動物細胞株、好ましくは、それらの膜表面にＣＤ４受容体を発現している哺乳動物細胞株に由来する哺乳動物細胞を包含する。好ましい哺乳動物細胞はヒト細胞からなる。例証的には、工程（１）は、ＣＤ４受容体を発現するＨｅＬａ細胞を感染させることにより、例えば、周知のＨＩＶ ＨＸＢ２Ｒ分子クローンを用いた細胞トランスフェクションにより実施されうる。
工程（２）は、上に記載する通り、テストされる候補化合物の量を培養培地に加えることにより実施されうるが、それにおいて（ｉ）既にＨＩＶに感染した、又は（ｉｉ）まだＨＩＶに感染していない細胞が培養される。通常、複数の培養サンプルを調製し、別々の培養サンプル中でテストされる候補化合物の増加量を加えるようにする。一般的に、候補化合物を伴わない少なくとも１つの培養サンプルも、さらなる比較のためのネガティブコントロールとして調製される。場合により、Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１の既に公知の遮断薬剤を伴う少なくとも１つの培養サンプルも、方法の標準化のためのポジティブコントロールとして調製される。
工程（３）は、上に記載する通り、実施例において記載する通り、融合アッセイを用いた細胞間融合の定量化により実施されうる。
従って、工程（４）は、テストされる候補化合物とインキュベートされた細胞培養について得られた融合アッセイデータを、前記の候補化合物又はＰ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１の公知の遮断薬剤を伴わないネガティブコントロール細胞培養について得られた融合アッセイデータと比較することにより実施されうる。例証的には、候補化合物の効率は、（ｉ）それとインキュベートされた細胞培養において測定された細胞間融合の量を、（ｉｉ）Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１の公知の遮断薬剤とインキュベートされた細胞培養において測定された細胞間融合の量と比較することにより評価されうる。さらに例証的には、候補化合物の効率は、細胞間融合の量が、Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１の公知の遮断薬剤について見出された細胞間融合の量に近い、細胞培養に加えられた候補化合物の量について決定することにより評価されうる。
本発明の診断的方法：
ＨＩＶ−１疾患における宿主の遺伝的変動を評価し、ＨＩＶ−１と接触する高い又は低いリスクを伴う集団を同定し、ＨＩＶ−１感染患者におけるＨＩＶ−１関連疾患の進行を予測する方法に関し、それは、以下について前記被験体からの生物学的サンプルを分析する工程：
（ｉ）Ｐ２Ｙ２受容体又はｐａｎｎｅｘｉｎ１１における変異の存在を検出すること、及び／又は
（ｉｉ）前記タンパク質をコードする遺伝子の発現を分析すること
を含む。
本明細書において使用される通り、用語「生物学的サンプル」は、被験体からの任意のサンプル（例えば血液又は血清など）を指す。
本明細書において使用される通り、「ＨＩＶ−１関連疾患」は、ＨＩＶ−１感染に起因する任意の疾患（例えば日和見感染及び癌など）を指す。
遺伝子において変異を検出するための典型的な技術は、制限断片長多型、ハイブリダイゼーション技術、ＤＮＡシークエンシング、エキソヌクレアーゼ耐性、マイクロシークエンシング、ｄｄＮＴＰｓを使用した固相伸長、ｄｄＮＴＰｓを使用した溶液中での伸長、オリゴヌクレオチドアッセイ、単一ヌクレオチド多型を検出するための方法、例えば動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、ライゲーション連鎖反応、ミニシークエンシング、ＤＮＡ「チップ」、ＰＣＲと又は分子指標と混合させた単一又は二重標識プローブを用いた対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、及び他を含みうる。
遺伝子の発現を分析することは、転写核酸又は翻訳タンパク質の発現を検出するための多種多様の周知の方法のいずれかにより評価されうる。
好ましい実施態様において、遺伝子の発現は、前記遺伝子のｍＲＮＡ転写物又はｍＲＮＡ前駆体（例えば新生ＲＮＡなど）の発現を分析することにより評価される。前記分析は、被験体からの生物学的サンプル中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを調製すること、及び、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと参照ポリヌクレオチドをハイブリダイズすることにより評価することができる。調製したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡは、しかし、限定されないが、サザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析（例えば定量的ＰＣＲ（TaqMan）など）、及びプローブアッセイ（例えばGeneChip（商標）ＤＮＡアレイ（AFF YMETRIX）など）を含むハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅アッセイにおいて使用することができる。
有利には、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの発現レベルの分析は、核酸増幅のプロセス（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号に記載される実験的な実施態様）、リガーゼ連鎖反応（BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991）、自己持続的な配列複製（GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.57, p: 1874-1878, 1990）、転写増幅系（KWOH et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）又は任意の他の核酸増幅方法を含み、当業者に周知の技術を使用した増幅分子の検出が続く。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に低い数で存在する場合、核酸分子の検出のために特に有用である。本明細書において使用される通り、増幅プライマーは、遺伝子の５’又は３’領域（それぞれプラス鎖及びマイナス鎖、又はその逆）にアニールし、間に短い領域を含むことができる核酸分子のペアであるとして定義される。一般的に、増幅プライマーは、約１０〜３０ヌクレオチド長であり、約５０〜２００ヌクレオチド長の領域に隣接する。適切な条件下で、及び、適切な試薬を用いて、そのようなプライマーは、プライマーにより隣接されるヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を許す。
別の好ましい実施態様において、遺伝子の発現は、前記遺伝子から翻訳されたタンパク質の発現を分析することにより評価される。前記分析は、抗体（例えば、放射標識抗体、発色団標識抗体、フルオロフォア標識抗体、又は酵素標識抗体）、抗体誘導体（例えば、基質との又はタンパク質／リガンド対（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン）のタンパク質又はタンパク質のリガンドとの抗体複合体）、又は遺伝子から翻訳されたタンパク質に特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、単鎖抗体、単離された抗体超可変ドメインなど）を使用して評価することができる。
前記分析は、当業者からの周知の種々の技術（しかし、限定されないが、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット分析、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＲＩＡ）を含む）により評価することができる。
本発明の方法は、被験体からの生物学的サンプル中での遺伝子の発現レベルと、コントロールにおける前記遺伝子の正常な発現レベルを比較することを含みうる。正常な発現レベルと比較した、被験体の生物学的サンプル中での前記遺伝子の有意に弱いレベルの発現は、患者がＨＩＶ−１に罹患する、及び、ＨＩＶ−１感染を発生する素因が少ないことの指標である。反対の場合において、正常な発現レベルと比較した、被験体の生物学的サンプル中での前記遺伝子の発現のレベルにおける増加は、患者がＨＩＶ−１に罹患する、及び、ＨＩＶ−１感染を発生する素因があることの指標である。遺伝子の発現の「正常」レベルは、ＨＩＶ−１感染に感受性である被験体の生物学的サンプル中での前記遺伝子の発現レベルである。好ましくは、発現の前記正常レベルは、コントロールサンプル中で評価し、いくつかのコントロールサンプル中での前記遺伝子の平均発現レベルである。
本発明を、さらに、以下の図面及び実施例により例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして任意の方法で解釈すべきではない。
ｐａｎｎｅｘｉｎ−１ヘミチャネルを通じたＡＴＰ放出は、ＨＩＶ−１と標的細胞との相互作用を調節する。（ａ）ＨＩＶ−１感染の間（黒丸）又は感染の非存在における（白丸）ＡＴＰ放出を、３つの独立した実験において、異なる時点で、ＡＴＰ依存的生物発光により決定した。１つの代表的な実験を示す（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｂ）ＨＩＶ−１感染に対するアピラーゼの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、３時間の間に、異なる濃度のアピラーゼの存在において感染させた。次に、アピラーゼを含む培地を除去し、完全培地により置き換え、標的細胞の感染性を、感染後２４時間に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（黒丸）の間に放出されたＡＴＰも異なる時間点で評価した。ＡＴＰ放出を、Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（対、Ｅｎｖを発現しない細胞（白丸）と標的細胞との共培養）の間でのＡＴＰ放出の増加（倍）として表現した。エラーバーは、３つの独立した決定のＳＤを示す（平均値±ＳＤ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）ＨＩＶ−１エンベロープ媒介性アクチン重合に対するアピラーゼによるＡＴＰ枯渇の効果。２つの相互作用する細胞の間でのアクチン重合を、３つの独立した実験において蛍光顕微鏡法により決定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｅ）初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（緑）及び初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の局在化（共焦点顕微鏡法により可視化）。矢印は、一次感染と非感染リンパ芽球の間で観察された界面上での宿主細胞のｐａｎｎｅｘｉｎ−１蓄積を指摘する。代表的な顕微鏡写真を示す。ｘｚ及びｙｚ光学的断面の混合画像も示す。（ｆ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の蓄積を、初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（青）と初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１の検出により明らかにする。（ｅ、ｆ）中の画像は、３つの独立した実験における少なくとも４０の細胞を代表する。ウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の円形分布に注目すること。（ｇ）ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を標的とする低分子干渉ＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞中でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、３つの独立した実験において推定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｈ）ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、４８時間の間に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１について特異的なｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次に、ＨＩＶＮＬ４３を用いて感染させた（感染多重度＝１）。ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１枯渇の効果を、それぞれ３時間後（ＡＴＰ依存的生物発光による）及び２４時間後に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。結果は平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５である。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１ヘミチャネルを通じたＡＴＰ放出は、ＨＩＶ−１と標的細胞との相互作用を調節する。（ａ）ＨＩＶ−１感染の間（黒丸）又は感染の非存在における（白丸）ＡＴＰ放出を、３つの独立した実験において、異なる時点で、ＡＴＰ依存的生物発光により決定した。１つの代表的な実験を示す（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｂ）ＨＩＶ−１感染に対するアピラーゼの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、３時間の間に、異なる濃度のアピラーゼの存在において感染させた。次に、アピラーゼを含む培地を除去し、完全培地により置き換え、標的細胞の感染性を、感染後２４時間に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（黒丸）の間に放出されたＡＴＰも異なる時間点で評価した。ＡＴＰ放出を、Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（対、Ｅｎｖを発現しない細胞（白丸）と標的細胞との共培養）の間でのＡＴＰ放出の増加（倍）として表現した。エラーバーは、３つの独立した決定のＳＤを示す（平均値±ＳＤ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）ＨＩＶ−１エンベロープ媒介性アクチン重合に対するアピラーゼによるＡＴＰ枯渇の効果。２つの相互作用する細胞の間でのアクチン重合を、３つの独立した実験において蛍光顕微鏡法により決定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｅ）初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（緑）及び初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の局在化（共焦点顕微鏡法により可視化）。矢印は、一次感染と非感染リンパ芽球の間で観察された界面上での宿主細胞のｐａｎｎｅｘｉｎ−１蓄積を指摘する。代表的な顕微鏡写真を示す。ｘｚ及びｙｚ光学的断面の混合画像も示す。（ｆ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の蓄積を、初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（青）と初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１の検出により明らかにする。（ｅ、ｆ）中の画像は、３つの独立した実験における少なくとも４０の細胞を代表する。ウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の円形分布に注目すること。（ｇ）ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を標的とする低分子干渉ＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞中でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、３つの独立した実験において推定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｈ）ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、４８時間の間に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１について特異的なｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次に、ＨＩＶＮＬ４３を用いて感染させた（感染多重度＝１）。ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１枯渇の効果を、それぞれ３時間後（ＡＴＰ依存的生物発光による）及び２４時間後に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。結果は平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５である。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１ヘミチャネルを通じたＡＴＰ放出は、ＨＩＶ−１と標的細胞との相互作用を調節する。（ａ）ＨＩＶ−１感染の間（黒丸）又は感染の非存在における（白丸）ＡＴＰ放出を、３つの独立した実験において、異なる時点で、ＡＴＰ依存的生物発光により決定した。１つの代表的な実験を示す（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｂ）ＨＩＶ−１感染に対するアピラーゼの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、３時間の間に、異なる濃度のアピラーゼの存在において感染させた。次に、アピラーゼを含む培地を除去し、完全培地により置き換え、標的細胞の感染性を、感染後２４時間に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（黒丸）の間に放出されたＡＴＰも異なる時間点で評価した。ＡＴＰ放出を、Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（対、Ｅｎｖを発現しない細胞（白丸）と標的細胞との共培養）の間でのＡＴＰ放出の増加（倍）として表現した。エラーバーは、３つの独立した決定のＳＤを示す（平均値±ＳＤ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）ＨＩＶ−１エンベロープ媒介性アクチン重合に対するアピラーゼによるＡＴＰ枯渇の効果。２つの相互作用する細胞の間でのアクチン重合を、３つの独立した実験において蛍光顕微鏡法により決定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｅ）初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（緑）及び初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の局在化（共焦点顕微鏡法により可視化）。矢印は、一次感染と非感染リンパ芽球の間で観察された界面上での宿主細胞のｐａｎｎｅｘｉｎ−１蓄積を指摘する。代表的な顕微鏡写真を示す。ｘｚ及びｙｚ光学的断面の混合画像も示す。（ｆ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の蓄積を、初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（青）と初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１の検出により明らかにする。（ｅ、ｆ）中の画像は、３つの独立した実験における少なくとも４０の細胞を代表する。ウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の円形分布に注目すること。（ｇ）ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を標的とする低分子干渉ＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞中でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、３つの独立した実験において推定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｈ）ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、４８時間の間に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１について特異的なｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次に、ＨＩＶＮＬ４３を用いて感染させた（感染多重度＝１）。ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１枯渇の効果を、それぞれ３時間後（ＡＴＰ依存的生物発光による）及び２４時間後に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。結果は平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５である。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１ヘミチャネルを通じたＡＴＰ放出は、ＨＩＶ−１と標的細胞との相互作用を調節する。（ａ）ＨＩＶ−１感染の間（黒丸）又は感染の非存在における（白丸）ＡＴＰ放出を、３つの独立した実験において、異なる時点で、ＡＴＰ依存的生物発光により決定した。１つの代表的な実験を示す（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｂ）ＨＩＶ−１感染に対するアピラーゼの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、３時間の間に、異なる濃度のアピラーゼの存在において感染させた。次に、アピラーゼを含む培地を除去し、完全培地により置き換え、標的細胞の感染性を、感染後２４時間に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（黒丸）の間に放出されたＡＴＰも異なる時間点で評価した。ＡＴＰ放出を、Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（対、Ｅｎｖを発現しない細胞（白丸）と標的細胞との共培養）の間でのＡＴＰ放出の増加（倍）として表現した。エラーバーは、３つの独立した決定のＳＤを示す（平均値±ＳＤ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）ＨＩＶ−１エンベロープ媒介性アクチン重合に対するアピラーゼによるＡＴＰ枯渇の効果。２つの相互作用する細胞の間でのアクチン重合を、３つの独立した実験において蛍光顕微鏡法により決定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｅ）初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（緑）及び初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の局在化（共焦点顕微鏡法により可視化）。矢印は、一次感染と非感染リンパ芽球の間で観察された界面上での宿主細胞のｐａｎｎｅｘｉｎ−１蓄積を指摘する。代表的な顕微鏡写真を示す。ｘｚ及びｙｚ光学的断面の混合画像も示す。（ｆ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の蓄積を、初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（青）と初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１の検出により明らかにする。（ｅ、ｆ）中の画像は、３つの独立した実験における少なくとも４０の細胞を代表する。ウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の円形分布に注目すること。（ｇ）ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を標的とする低分子干渉ＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞中でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、３つの独立した実験において推定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｈ）ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、４８時間の間に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１について特異的なｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次に、ＨＩＶＮＬ４３を用いて感染させた（感染多重度＝１）。ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１枯渇の効果を、それぞれ３時間後（ＡＴＰ依存的生物発光による）及び２４時間後に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。結果は平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５である。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１ヘミチャネルを通じたＡＴＰ放出は、ＨＩＶ−１と標的細胞との相互作用を調節する。（ａ）ＨＩＶ−１感染の間（黒丸）又は感染の非存在における（白丸）ＡＴＰ放出を、３つの独立した実験において、異なる時点で、ＡＴＰ依存的生物発光により決定した。１つの代表的な実験を示す（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｂ）ＨＩＶ−１感染に対するアピラーゼの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、３時間の間に、異なる濃度のアピラーゼの存在において感染させた。次に、アピラーゼを含む培地を除去し、完全培地により置き換え、標的細胞の感染性を、感染後２４時間に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（黒丸）の間に放出されたＡＴＰも異なる時間点で評価した。ＡＴＰ放出を、Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（対、Ｅｎｖを発現しない細胞（白丸）と標的細胞との共培養）の間でのＡＴＰ放出の増加（倍）として表現した。エラーバーは、３つの独立した決定のＳＤを示す（平均値±ＳＤ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）ＨＩＶ−１エンベロープ媒介性アクチン重合に対するアピラーゼによるＡＴＰ枯渇の効果。２つの相互作用する細胞の間でのアクチン重合を、３つの独立した実験において蛍光顕微鏡法により決定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｅ）初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（緑）及び初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の局在化（共焦点顕微鏡法により可視化）。矢印は、一次感染と非感染リンパ芽球の間で観察された界面上での宿主細胞のｐａｎｎｅｘｉｎ−１蓄積を指摘する。代表的な顕微鏡写真を示す。ｘｚ及びｙｚ光学的断面の混合画像も示す。（ｆ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の蓄積を、初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（青）と初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１の検出により明らかにする。（ｅ、ｆ）中の画像は、３つの独立した実験における少なくとも４０の細胞を代表する。ウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の円形分布に注目すること。（ｇ）ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を標的とする低分子干渉ＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞中でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、３つの独立した実験において推定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｈ）ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、４８時間の間に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１について特異的なｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次に、ＨＩＶＮＬ４３を用いて感染させた（感染多重度＝１）。ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１枯渇の効果を、それぞれ３時間後（ＡＴＰ依存的生物発光による）及び２４時間後に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。結果は平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５である。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１ヘミチャネルを通じたＡＴＰ放出は、ＨＩＶ−１と標的細胞との相互作用を調節する。（ａ）ＨＩＶ−１感染の間（黒丸）又は感染の非存在における（白丸）ＡＴＰ放出を、３つの独立した実験において、異なる時点で、ＡＴＰ依存的生物発光により決定した。１つの代表的な実験を示す（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｂ）ＨＩＶ−１感染に対するアピラーゼの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、３時間の間に、異なる濃度のアピラーゼの存在において感染させた。次に、アピラーゼを含む培地を除去し、完全培地により置き換え、標的細胞の感染性を、感染後２４時間に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（黒丸）の間に放出されたＡＴＰも異なる時間点で評価した。ＡＴＰ放出を、Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（対、Ｅｎｖを発現しない細胞（白丸）と標的細胞との共培養）の間でのＡＴＰ放出の増加（倍）として表現した。エラーバーは、３つの独立した決定のＳＤを示す（平均値±ＳＤ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）ＨＩＶ−１エンベロープ媒介性アクチン重合に対するアピラーゼによるＡＴＰ枯渇の効果。２つの相互作用する細胞の間でのアクチン重合を、３つの独立した実験において蛍光顕微鏡法により決定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｅ）初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（緑）及び初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の局在化（共焦点顕微鏡法により可視化）。矢印は、一次感染と非感染リンパ芽球の間で観察された界面上での宿主細胞のｐａｎｎｅｘｉｎ−１蓄積を指摘する。代表的な顕微鏡写真を示す。ｘｚ及びｙｚ光学的断面の混合画像も示す。（ｆ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の蓄積を、初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（青）と初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１の検出により明らかにする。（ｅ、ｆ）中の画像は、３つの独立した実験における少なくとも４０の細胞を代表する。ウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の円形分布に注目すること。（ｇ）ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を標的とする低分子干渉ＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞中でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、３つの独立した実験において推定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｈ）ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、４８時間の間に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１について特異的なｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次に、ＨＩＶＮＬ４３を用いて感染させた（感染多重度＝１）。ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１枯渇の効果を、それぞれ３時間後（ＡＴＰ依存的生物発光による）及び２４時間後に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。結果は平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５である。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１ヘミチャネルを通じたＡＴＰ放出は、ＨＩＶ−１と標的細胞との相互作用を調節する。（ａ）ＨＩＶ−１感染の間（黒丸）又は感染の非存在における（白丸）ＡＴＰ放出を、３つの独立した実験において、異なる時点で、ＡＴＰ依存的生物発光により決定した。１つの代表的な実験を示す（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｂ）ＨＩＶ−１感染に対するアピラーゼの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、３時間の間に、異なる濃度のアピラーゼの存在において感染させた。次に、アピラーゼを含む培地を除去し、完全培地により置き換え、標的細胞の感染性を、感染後２４時間に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（黒丸）の間に放出されたＡＴＰも異なる時間点で評価した。ＡＴＰ放出を、Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（対、Ｅｎｖを発現しない細胞（白丸）と標的細胞との共培養）の間でのＡＴＰ放出の増加（倍）として表現した。エラーバーは、３つの独立した決定のＳＤを示す（平均値±ＳＤ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）ＨＩＶ−１エンベロープ媒介性アクチン重合に対するアピラーゼによるＡＴＰ枯渇の効果。２つの相互作用する細胞の間でのアクチン重合を、３つの独立した実験において蛍光顕微鏡法により決定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｅ）初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（緑）及び初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の局在化（共焦点顕微鏡法により可視化）。矢印は、一次感染と非感染リンパ芽球の間で観察された界面上での宿主細胞のｐａｎｎｅｘｉｎ−１蓄積を指摘する。代表的な顕微鏡写真を示す。ｘｚ及びｙｚ光学的断面の混合画像も示す。（ｆ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の蓄積を、初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（青）と初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１の検出により明らかにする。（ｅ、ｆ）中の画像は、３つの独立した実験における少なくとも４０の細胞を代表する。ウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の円形分布に注目すること。（ｇ）ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を標的とする低分子干渉ＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞中でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、３つの独立した実験において推定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｈ）ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、４８時間の間に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１について特異的なｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次に、ＨＩＶＮＬ４３を用いて感染させた（感染多重度＝１）。ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１枯渇の効果を、それぞれ３時間後（ＡＴＰ依存的生物発光による）及び２４時間後に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。結果は平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５である。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１ヘミチャネルを通じたＡＴＰ放出は、ＨＩＶ−１と標的細胞との相互作用を調節する。（ａ）ＨＩＶ−１感染の間（黒丸）又は感染の非存在における（白丸）ＡＴＰ放出を、３つの独立した実験において、異なる時点で、ＡＴＰ依存的生物発光により決定した。１つの代表的な実験を示す（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｂ）ＨＩＶ−１感染に対するアピラーゼの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、３時間の間に、異なる濃度のアピラーゼの存在において感染させた。次に、アピラーゼを含む培地を除去し、完全培地により置き換え、標的細胞の感染性を、感染後２４時間に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ）Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（黒丸）の間に放出されたＡＴＰも異なる時間点で評価した。ＡＴＰ放出を、Ｅｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養（対、Ｅｎｖを発現しない細胞（白丸）と標的細胞との共培養）の間でのＡＴＰ放出の増加（倍）として表現した。エラーバーは、３つの独立した決定のＳＤを示す（平均値±ＳＤ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）ＨＩＶ−１エンベロープ媒介性アクチン重合に対するアピラーゼによるＡＴＰ枯渇の効果。２つの相互作用する細胞の間でのアクチン重合を、３つの独立した実験において蛍光顕微鏡法により決定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｅ）初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（緑）及び初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の局在化（共焦点顕微鏡法により可視化）。矢印は、一次感染と非感染リンパ芽球の間で観察された界面上での宿主細胞のｐａｎｎｅｘｉｎ−１蓄積を指摘する。代表的な顕微鏡写真を示す。ｘｚ及びｙｚ光学的断面の混合画像も示す。（ｆ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の蓄積を、初代ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（青）と初代非感染リンパ芽球の間の接触部位でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１の検出により明らかにする。（ｅ、ｆ）中の画像は、３つの独立した実験における少なくとも４０の細胞を代表する。ウイルス学的シナプス上でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１の円形分布に注目すること。（ｇ）ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を標的とする低分子干渉ＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞中でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、３つの独立した実験において推定した（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｈ）ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、４８時間の間に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１について特異的なｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次に、ＨＩＶＮＬ４３を用いて感染させた（感染多重度＝１）。ＡＴＰ放出及び宿主細胞の感染性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１枯渇の効果を、それぞれ３時間後（ＡＴＰ依存的生物発光による）及び２４時間後に、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター遺伝子を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。結果は平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５である。 プリン作動性受容体はＨＩＶ−１感染を調節する。（ａ、ｂ、ｃ）ＨＩＶＮＤＫ、ＨＩＶＢａＬ、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ、ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖを用いた感染の間（ａ、ｂ）又はＥｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養の間（ｃ）に観察された、ウイルス産出（ａ）、宿主細胞の感染性（ｂ）、及び半融合／融合（ｃ）に対する一般的なＰ２−受容体アンタゴニストであるスラミン、ピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）、及びＯｘＡＴＰの効果。ａ−ｃ中のカラムは平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ、ｅ）野生型（ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ）又はＶＳＶＧ偽型ＨＩＶ−１（ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖ）のウイルスＲＮＡ発現及び全ウイルスＤＮＡ発現に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、スラミン、ＰＰＡＤＳ、ＯｘＡＴＰ、及びエファビレンツの効果。ウイルスＲＮＡ及び全ウイルスＤＮＡを、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ又は偽型ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖウイルスを用いて、５μM ＡＭＤ３１００、１０UI/mlアピラーゼ、１０μMスラミン、１００μM ＰＰＡＤＳ、１００μM ＯｘＡＴＰ、又は５００nMエファビレンツ（Ｅｆａｖ）の非存在又は存在において感染させたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞から推定した。ウイルスＲＮＡを、方法において記載する通りに、定量的ＰＣＲにより検出した。偽型ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖウイルスの内在化が、これらの阻害剤により低下しないことに注目すること（ｄ）。全ウイルスＤＮＡを、ＰＣＲ定量化を使用して決定した（方法において記載する通り）。結果を、ＨＩＶ−１ ＤＮＡ対ＧＡＰＤＨコントロールＤＮＡの標準化比率として示す。結果は、３つの独立した実験について代表する。 プリン作動性受容体はＨＩＶ−１感染を調節する。（ａ、ｂ、ｃ）ＨＩＶＮＤＫ、ＨＩＶＢａＬ、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ、ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖを用いた感染の間（ａ、ｂ）又はＥｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養の間（ｃ）に観察された、ウイルス産出（ａ）、宿主細胞の感染性（ｂ）、及び半融合／融合（ｃ）に対する一般的なＰ２−受容体アンタゴニストであるスラミン、ピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）、及びＯｘＡＴＰの効果。ａ−ｃ中のカラムは平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ、ｅ）野生型（ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ）又はＶＳＶＧ偽型ＨＩＶ−１（ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖ）のウイルスＲＮＡ発現及び全ウイルスＤＮＡ発現に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、スラミン、ＰＰＡＤＳ、ＯｘＡＴＰ、及びエファビレンツの効果。ウイルスＲＮＡ及び全ウイルスＤＮＡを、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ又は偽型ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖウイルスを用いて、５μM ＡＭＤ３１００、１０UI/mlアピラーゼ、１０μMスラミン、１００μM ＰＰＡＤＳ、１００μM ＯｘＡＴＰ、又は５００nMエファビレンツ（Ｅｆａｖ）の非存在又は存在において感染させたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞から推定した。ウイルスＲＮＡを、方法において記載する通りに、定量的ＰＣＲにより検出した。偽型ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖウイルスの内在化が、これらの阻害剤により低下しないことに注目すること（ｄ）。全ウイルスＤＮＡを、ＰＣＲ定量化を使用して決定した（方法において記載する通り）。結果を、ＨＩＶ−１ ＤＮＡ対ＧＡＰＤＨコントロールＤＮＡの標準化比率として示す。結果は、３つの独立した実験について代表する。 プリン作動性受容体はＨＩＶ−１感染を調節する。（ａ、ｂ、ｃ）ＨＩＶＮＤＫ、ＨＩＶＢａＬ、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ、ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖを用いた感染の間（ａ、ｂ）又はＥｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養の間（ｃ）に観察された、ウイルス産出（ａ）、宿主細胞の感染性（ｂ）、及び半融合／融合（ｃ）に対する一般的なＰ２−受容体アンタゴニストであるスラミン、ピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）、及びＯｘＡＴＰの効果。ａ−ｃ中のカラムは平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ、ｅ）野生型（ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ）又はＶＳＶＧ偽型ＨＩＶ−１（ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖ）のウイルスＲＮＡ発現及び全ウイルスＤＮＡ発現に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、スラミン、ＰＰＡＤＳ、ＯｘＡＴＰ、及びエファビレンツの効果。ウイルスＲＮＡ及び全ウイルスＤＮＡを、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ又は偽型ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖウイルスを用いて、５μM ＡＭＤ３１００、１０UI/mlアピラーゼ、１０μMスラミン、１００μM ＰＰＡＤＳ、１００μM ＯｘＡＴＰ、又は５００nMエファビレンツ（Ｅｆａｖ）の非存在又は存在において感染させたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞から推定した。ウイルスＲＮＡを、方法において記載する通りに、定量的ＰＣＲにより検出した。偽型ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖウイルスの内在化が、これらの阻害剤により低下しないことに注目すること（ｄ）。全ウイルスＤＮＡを、ＰＣＲ定量化を使用して決定した（方法において記載する通り）。結果を、ＨＩＶ−１ ＤＮＡ対ＧＡＰＤＨコントロールＤＮＡの標準化比率として示す。結果は、３つの独立した実験について代表する。 プリン作動性受容体はＨＩＶ−１感染を調節する。（ａ、ｂ、ｃ）ＨＩＶＮＤＫ、ＨＩＶＢａＬ、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ、ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖを用いた感染の間（ａ、ｂ）又はＥｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養の間（ｃ）に観察された、ウイルス産出（ａ）、宿主細胞の感染性（ｂ）、及び半融合／融合（ｃ）に対する一般的なＰ２−受容体アンタゴニストであるスラミン、ピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）、及びＯｘＡＴＰの効果。ａ−ｃ中のカラムは平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ、ｅ）野生型（ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ）又はＶＳＶＧ偽型ＨＩＶ−１（ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖ）のウイルスＲＮＡ発現及び全ウイルスＤＮＡ発現に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、スラミン、ＰＰＡＤＳ、ＯｘＡＴＰ、及びエファビレンツの効果。ウイルスＲＮＡ及び全ウイルスＤＮＡを、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ又は偽型ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖウイルスを用いて、５μM ＡＭＤ３１００、１０UI/mlアピラーゼ、１０μMスラミン、１００μM ＰＰＡＤＳ、１００μM ＯｘＡＴＰ、又は５００nMエファビレンツ（Ｅｆａｖ）の非存在又は存在において感染させたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞から推定した。ウイルスＲＮＡを、方法において記載する通りに、定量的ＰＣＲにより検出した。偽型ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖウイルスの内在化が、これらの阻害剤により低下しないことに注目すること（ｄ）。全ウイルスＤＮＡを、ＰＣＲ定量化を使用して決定した（方法において記載する通り）。結果を、ＨＩＶ−１ ＤＮＡ対ＧＡＰＤＨコントロールＤＮＡの標準化比率として示す。結果は、３つの独立した実験について代表する。 プリン作動性受容体はＨＩＶ−１感染を調節する。（ａ、ｂ、ｃ）ＨＩＶＮＤＫ、ＨＩＶＢａＬ、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ、ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖを用いた感染の間（ａ、ｂ）又はＥｎｖ発現細胞とＨＩＶ−１標的細胞との共培養の間（ｃ）に観察された、ウイルス産出（ａ）、宿主細胞の感染性（ｂ）、及び半融合／融合（ｃ）に対する一般的なＰ２−受容体アンタゴニストであるスラミン、ピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）、及びＯｘＡＴＰの効果。ａ−ｃ中のカラムは平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ、ｅ）野生型（ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ）又はＶＳＶＧ偽型ＨＩＶ−１（ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖ）のウイルスＲＮＡ発現及び全ウイルスＤＮＡ発現に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、スラミン、ＰＰＡＤＳ、ＯｘＡＴＰ、及びエファビレンツの効果。ウイルスＲＮＡ及び全ウイルスＤＮＡを、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ又は偽型ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖウイルスを用いて、５μM ＡＭＤ３１００、１０UI/mlアピラーゼ、１０μMスラミン、１００μM ＰＰＡＤＳ、１００μM ＯｘＡＴＰ、又は５００nMエファビレンツ（Ｅｆａｖ）の非存在又は存在において感染させたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞から推定した。ウイルスＲＮＡを、方法において記載する通りに、定量的ＰＣＲにより検出した。偽型ＨＩＶＮＬ４３ΔＥｎｖウイルスの内在化が、これらの阻害剤により低下しないことに注目すること（ｄ）。全ウイルスＤＮＡを、ＰＣＲ定量化を使用して決定した（方法において記載する通り）。結果を、ＨＩＶ−１ ＤＮＡ対ＧＡＰＤＨコントロールＤＮＡの標準化比率として示す。結果は、３つの独立した実験について代表する。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 ＨＩＶ−１感染に対するＰ２Ｙ２の役割。（ａ、ｂ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節生検（ａ）及び前頭皮質生検（ｂ）上でのＰ２Ｙ２発現の代表的な免疫組織化学。上の挿入は、陽性の融合細胞を示し、下の挿入は、非感染患者からのリンパ節生検の染色の非存在を例証する。（ｃ、ｄ）リンパ節（ｃ）及び前頭皮質生検（ｄ）におけるＰ２Ｙ２発現を決定し、方法において記載する通りに、Ｐ２Ｙ２指数により明らかにした。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）非感染又は未処置のＨＩＶ−１感染患者から得られた末梢血単核細胞上でのＰ２Ｙ２発現のフローサイトメトリーによる検出（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ）ＨＩＶ−１感染の間でのＰ２Ｙ２発現の動態。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、示した時間の間に、ＨＩＶＮＬ４３（感染多重度＝１）を用いて感染させた。次に、Ｐ２Ｙ２発現をイムノブロットにより評価した。３つの独立した実験の代表的なイムノブロットを示す。（ｇ）リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２分極の頻度。ｇ中のデータは、３つの独立した実験での平均値±ＳＥＭである。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｈ、ｉ、ｊ）ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰ２Ｙ２細胞内局在化の検出（共焦点顕微鏡法により可視化）。ＨＩＶ−１により誘導されたウイルス学的シナプスでのＰ２Ｙ２蓄積に注目すること（ｈ、ｉ、ｊ）。共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２分極を示す（ｈ）。ｉ中の挿入はｙｚ光学的断面を表し、Ｐ２Ｙ２の円形分布を示す。ｈ及びｉ中のコントラスト相は、相互作用するリンパ芽球を明らかにした。３Ｄ映像は、相互作用するリンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の環状分布を明らかにする（ｊ）。（ｋ）相互作用するリンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープにより媒介されるウイルス学的シナプス上でのＰ２Ｙ２の蓄積。ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間でのＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１周囲のＰ２Ｙ２の環状分布に注目すること。ｈ−ｋ中の画像は、少なくとも４つの独立した実験の代表である。（ｌ）Ｐ２Ｙ２のノックダウンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（方法において記載する通り）により及びウエスタンブロットにより、２つの異なるｓｉＲＮＡを使用して確認した。（ｍ）ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導されるＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染、半融合、及び融合に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性融合に対するＰ２Ｙ２過剰発現の効果。Ｐ２Ｙ２が枯渇した又はしていない細胞を、ヒトＰ２Ｙ２野生型又はヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体を用いてトランスフェクトした。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される細胞融合を、次に、方法において記載する通りに、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋発現細胞との共培養の間でのＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性を決定することにより評価した。エラーバーは、（ｌ）、（ｍ）、及び（ｎ）についての３つの独立した決定でのＳＥＭを示す。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間での原形質膜の脱分極を制御する。（ａ）ＨＩＶＮＤＫを用いた１時間の感染後（感染多重度（ＭＯＩ）１）での初代リンパ芽球の原形質膜の脱分極。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。代表的なプロファイルを示す。（ｂ）７０mM ＫＣｌを用いて３時間にわたり処理されたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の原形質膜の脱分極の代表的なプロファイル。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。（ｃ）３時間の７０mM ＫＣｌ処理後の原形質膜の脱分極を示すＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の頻度（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）７０mM ＫＣｌの非存在又は存在において実現されるＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導性融合に対する５μM ＡＭＤ３１００の効果。細胞融合を、方法において記載する通りに決定した。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）１時間のＨＩＶＮＤＫ感染後での原形質膜の脱分極に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果。示されたデータを、３つの独立した実験において（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）、DiBac4(3)プローブ及びフローサイトメトリーを使用して決定した。（ｆ）Ｐ２Ｙ２発現は、ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導される原形質膜の脱分極を調節する。ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性の原形質膜の脱分極に対するヒトＰ２Ｙ２野生型又は変異体（Ｐ２Ｙ２／４Ａ）コンストラクトのトランスフェクションの効果を、ａにおいて記載する通りに決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間での原形質膜の脱分極を制御する。（ａ）ＨＩＶＮＤＫを用いた１時間の感染後（感染多重度（ＭＯＩ）１）での初代リンパ芽球の原形質膜の脱分極。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。代表的なプロファイルを示す。（ｂ）７０mM ＫＣｌを用いて３時間にわたり処理されたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の原形質膜の脱分極の代表的なプロファイル。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。（ｃ）３時間の７０mM ＫＣｌ処理後の原形質膜の脱分極を示すＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の頻度（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）７０mM ＫＣｌの非存在又は存在において実現されるＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導性融合に対する５μM ＡＭＤ３１００の効果。細胞融合を、方法において記載する通りに決定した。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）１時間のＨＩＶＮＤＫ感染後での原形質膜の脱分極に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果。示されたデータを、３つの独立した実験において（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）、DiBac4(3)プローブ及びフローサイトメトリーを使用して決定した。（ｆ）Ｐ２Ｙ２発現は、ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導される原形質膜の脱分極を調節する。ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性の原形質膜の脱分極に対するヒトＰ２Ｙ２野生型又は変異体（Ｐ２Ｙ２／４Ａ）コンストラクトのトランスフェクションの効果を、ａにおいて記載する通りに決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間での原形質膜の脱分極を制御する。（ａ）ＨＩＶＮＤＫを用いた１時間の感染後（感染多重度（ＭＯＩ）１）での初代リンパ芽球の原形質膜の脱分極。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。代表的なプロファイルを示す。（ｂ）７０mM ＫＣｌを用いて３時間にわたり処理されたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の原形質膜の脱分極の代表的なプロファイル。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。（ｃ）３時間の７０mM ＫＣｌ処理後の原形質膜の脱分極を示すＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の頻度（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）７０mM ＫＣｌの非存在又は存在において実現されるＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導性融合に対する５μM ＡＭＤ３１００の効果。細胞融合を、方法において記載する通りに決定した。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）１時間のＨＩＶＮＤＫ感染後での原形質膜の脱分極に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果。示されたデータを、３つの独立した実験において（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）、DiBac4(3)プローブ及びフローサイトメトリーを使用して決定した。（ｆ）Ｐ２Ｙ２発現は、ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導される原形質膜の脱分極を調節する。ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性の原形質膜の脱分極に対するヒトＰ２Ｙ２野生型又は変異体（Ｐ２Ｙ２／４Ａ）コンストラクトのトランスフェクションの効果を、ａにおいて記載する通りに決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間での原形質膜の脱分極を制御する。（ａ）ＨＩＶＮＤＫを用いた１時間の感染後（感染多重度（ＭＯＩ）１）での初代リンパ芽球の原形質膜の脱分極。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。代表的なプロファイルを示す。（ｂ）７０mM ＫＣｌを用いて３時間にわたり処理されたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の原形質膜の脱分極の代表的なプロファイル。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。（ｃ）３時間の７０mM ＫＣｌ処理後の原形質膜の脱分極を示すＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の頻度（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）７０mM ＫＣｌの非存在又は存在において実現されるＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導性融合に対する５μM ＡＭＤ３１００の効果。細胞融合を、方法において記載する通りに決定した。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）１時間のＨＩＶＮＤＫ感染後での原形質膜の脱分極に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果。示されたデータを、３つの独立した実験において（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）、DiBac4(3)プローブ及びフローサイトメトリーを使用して決定した。（ｆ）Ｐ２Ｙ２発現は、ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導される原形質膜の脱分極を調節する。ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性の原形質膜の脱分極に対するヒトＰ２Ｙ２野生型又は変異体（Ｐ２Ｙ２／４Ａ）コンストラクトのトランスフェクションの効果を、ａにおいて記載する通りに決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間での原形質膜の脱分極を制御する。（ａ）ＨＩＶＮＤＫを用いた１時間の感染後（感染多重度（ＭＯＩ）１）での初代リンパ芽球の原形質膜の脱分極。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。代表的なプロファイルを示す。（ｂ）７０mM ＫＣｌを用いて３時間にわたり処理されたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の原形質膜の脱分極の代表的なプロファイル。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。（ｃ）３時間の７０mM ＫＣｌ処理後の原形質膜の脱分極を示すＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の頻度（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）７０mM ＫＣｌの非存在又は存在において実現されるＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導性融合に対する５μM ＡＭＤ３１００の効果。細胞融合を、方法において記載する通りに決定した。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）１時間のＨＩＶＮＤＫ感染後での原形質膜の脱分極に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果。示されたデータを、３つの独立した実験において（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）、DiBac4(3)プローブ及びフローサイトメトリーを使用して決定した。（ｆ）Ｐ２Ｙ２発現は、ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導される原形質膜の脱分極を調節する。ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性の原形質膜の脱分極に対するヒトＰ２Ｙ２野生型又は変異体（Ｐ２Ｙ２／４Ａ）コンストラクトのトランスフェクションの効果を、ａにおいて記載する通りに決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間での原形質膜の脱分極を制御する。（ａ）ＨＩＶＮＤＫを用いた１時間の感染後（感染多重度（ＭＯＩ）１）での初代リンパ芽球の原形質膜の脱分極。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。代表的なプロファイルを示す。（ｂ）７０mM ＫＣｌを用いて３時間にわたり処理されたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の原形質膜の脱分極の代表的なプロファイル。原形質膜の脱分極を、フローサイトメトリーにより、DiBac4(3)プローブの蛍光の増加を評価することにより決定した。（ｃ）３時間の７０mM ＫＣｌ処理後の原形質膜の脱分極を示すＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の頻度（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。（ｄ）７０mM ＫＣｌの非存在又は存在において実現されるＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導性融合に対する５μM ＡＭＤ３１００の効果。細胞融合を、方法において記載する通りに決定した。エラーバーは平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）を表す。（ｅ）１時間のＨＩＶＮＤＫ感染後での原形質膜の脱分極に対するＡＭＤ３１００、アピラーゼ、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果。示されたデータを、３つの独立した実験において（平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）、DiBac4(3)プローブ及びフローサイトメトリーを使用して決定した。（ｆ）Ｐ２Ｙ２発現は、ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導される原形質膜の脱分極を調節する。ＨＩＶ−１エンベロープ誘導性の原形質膜の脱分極に対するヒトＰ２Ｙ２野生型又は変異体（Ｐ２Ｙ２／４Ａ）コンストラクトのトランスフェクションの効果を、ａにおいて記載する通りに決定した（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１感染の間にＰｙｋ２活性化を誘導する。（ａ）Ｐ２Ｙ２枯渇は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性複合体形成の間に誘導されるＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化を阻害する。Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊及びＰｙｋ２発現に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果を、方法において記載する通りに、イムノブロットにより決定した。ブロットは、３つの独立した実験について代表する。（ｂ）共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を明らかにする。ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の代表的なＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を示す。相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の環状分布に注目すること。ｂ中の挿入はｙｚ断面を示す。（ｃ）共焦点顕微鏡法によるＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の検出。ＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプス形成の間での標的細胞上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の蓄積に注目すること。左の挿入はｘｚ光学的断面及び相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の分極を表す。右の挿入はｙｚ光学的断面を明らかにし、複合体内の接触部位におけるＰｙｋ２Ｙ４０２＊の末梢分布を示す。画像は、４つの独立した実験の代表である。（ｄ、ｅ）ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋の共培養（ｄ）又はＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の共培養（ｅ）の間の単一細胞及び複合体の間のＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の頻度を、３つの独立した実験において決定した（平均値± ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ、ｇ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節切片（ｆ）及び前頭皮質生検（ｇ）上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の検出。ＨＩＶ感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）生検上で観察された融合細胞の陽性染色（上流の挿入上）ならびに非感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）の陰性染色パターンに注目すること。（ｊ）末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊及び未処置ＨＩＶ−１キャリアから得られたウイルス血症の間の正相関。ｐ値は相関係数に対応する。（ｋ）未処置ＨＩＶ−１感染患者と比較した、処置患者から得られた末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊に対する高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）の効果（スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＝０．０００９）。（ｌ）複合体の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｍ）２つの異なるｓｉＲＮＡを用いたＰｙｋ２のノックダウンを、イムノブロットを使用することにより確認した。ブロットは、３つの独立した決定の代表である。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染及び半融合／融合に対するＰｙｋ２ノックダウンの効果（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１感染の間にＰｙｋ２活性化を誘導する。（ａ）Ｐ２Ｙ２枯渇は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性複合体形成の間に誘導されるＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化を阻害する。Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊及びＰｙｋ２発現に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果を、方法において記載する通りに、イムノブロットにより決定した。ブロットは、３つの独立した実験について代表する。（ｂ）共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を明らかにする。ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の代表的なＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を示す。相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の環状分布に注目すること。ｂ中の挿入はｙｚ断面を示す。（ｃ）共焦点顕微鏡法によるＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の検出。ＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプス形成の間での標的細胞上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の蓄積に注目すること。左の挿入はｘｚ光学的断面及び相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の分極を表す。右の挿入はｙｚ光学的断面を明らかにし、複合体内の接触部位におけるＰｙｋ２Ｙ４０２＊の末梢分布を示す。画像は、４つの独立した実験の代表である。（ｄ、ｅ）ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋の共培養（ｄ）又はＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の共培養（ｅ）の間の単一細胞及び複合体の間のＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の頻度を、３つの独立した実験において決定した（平均値± ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ、ｇ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節切片（ｆ）及び前頭皮質生検（ｇ）上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の検出。ＨＩＶ感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）生検上で観察された融合細胞の陽性染色（上流の挿入上）ならびに非感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）の陰性染色パターンに注目すること。（ｊ）末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊及び未処置ＨＩＶ−１キャリアから得られたウイルス血症の間の正相関。ｐ値は相関係数に対応する。（ｋ）未処置ＨＩＶ−１感染患者と比較した、処置患者から得られた末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊に対する高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）の効果（スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＝０．０００９）。（ｌ）複合体の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｍ）２つの異なるｓｉＲＮＡを用いたＰｙｋ２のノックダウンを、イムノブロットを使用することにより確認した。ブロットは、３つの独立した決定の代表である。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染及び半融合／融合に対するＰｙｋ２ノックダウンの効果（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１感染の間にＰｙｋ２活性化を誘導する。（ａ）Ｐ２Ｙ２枯渇は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性複合体形成の間に誘導されるＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化を阻害する。Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊及びＰｙｋ２発現に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果を、方法において記載する通りに、イムノブロットにより決定した。ブロットは、３つの独立した実験について代表する。（ｂ）共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を明らかにする。ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の代表的なＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を示す。相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の環状分布に注目すること。ｂ中の挿入はｙｚ断面を示す。（ｃ）共焦点顕微鏡法によるＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の検出。ＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプス形成の間での標的細胞上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の蓄積に注目すること。左の挿入はｘｚ光学的断面及び相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の分極を表す。右の挿入はｙｚ光学的断面を明らかにし、複合体内の接触部位におけるＰｙｋ２Ｙ４０２＊の末梢分布を示す。画像は、４つの独立した実験の代表である。（ｄ、ｅ）ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋の共培養（ｄ）又はＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の共培養（ｅ）の間の単一細胞及び複合体の間のＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の頻度を、３つの独立した実験において決定した（平均値± ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ、ｇ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節切片（ｆ）及び前頭皮質生検（ｇ）上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の検出。ＨＩＶ感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）生検上で観察された融合細胞の陽性染色（上流の挿入上）ならびに非感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）の陰性染色パターンに注目すること。（ｊ）末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊及び未処置ＨＩＶ−１キャリアから得られたウイルス血症の間の正相関。ｐ値は相関係数に対応する。（ｋ）未処置ＨＩＶ−１感染患者と比較した、処置患者から得られた末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊に対する高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）の効果（スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＝０．０００９）。（ｌ）複合体の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｍ）２つの異なるｓｉＲＮＡを用いたＰｙｋ２のノックダウンを、イムノブロットを使用することにより確認した。ブロットは、３つの独立した決定の代表である。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染及び半融合／融合に対するＰｙｋ２ノックダウンの効果（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１感染の間にＰｙｋ２活性化を誘導する。（ａ）Ｐ２Ｙ２枯渇は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性複合体形成の間に誘導されるＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化を阻害する。Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊及びＰｙｋ２発現に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果を、方法において記載する通りに、イムノブロットにより決定した。ブロットは、３つの独立した実験について代表する。（ｂ）共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を明らかにする。ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の代表的なＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を示す。相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の環状分布に注目すること。ｂ中の挿入はｙｚ断面を示す。（ｃ）共焦点顕微鏡法によるＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の検出。ＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプス形成の間での標的細胞上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の蓄積に注目すること。左の挿入はｘｚ光学的断面及び相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の分極を表す。右の挿入はｙｚ光学的断面を明らかにし、複合体内の接触部位におけるＰｙｋ２Ｙ４０２＊の末梢分布を示す。画像は、４つの独立した実験の代表である。（ｄ、ｅ）ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋の共培養（ｄ）又はＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の共培養（ｅ）の間の単一細胞及び複合体の間のＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の頻度を、３つの独立した実験において決定した（平均値± ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ、ｇ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節切片（ｆ）及び前頭皮質生検（ｇ）上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の検出。ＨＩＶ感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）生検上で観察された融合細胞の陽性染色（上流の挿入上）ならびに非感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）の陰性染色パターンに注目すること。（ｊ）末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊及び未処置ＨＩＶ−１キャリアから得られたウイルス血症の間の正相関。ｐ値は相関係数に対応する。（ｋ）未処置ＨＩＶ−１感染患者と比較した、処置患者から得られた末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊に対する高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）の効果（スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＝０．０００９）。（ｌ）複合体の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｍ）２つの異なるｓｉＲＮＡを用いたＰｙｋ２のノックダウンを、イムノブロットを使用することにより確認した。ブロットは、３つの独立した決定の代表である。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染及び半融合／融合に対するＰｙｋ２ノックダウンの効果（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１感染の間にＰｙｋ２活性化を誘導する。（ａ）Ｐ２Ｙ２枯渇は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性複合体形成の間に誘導されるＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化を阻害する。Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊及びＰｙｋ２発現に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果を、方法において記載する通りに、イムノブロットにより決定した。ブロットは、３つの独立した実験について代表する。（ｂ）共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を明らかにする。ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の代表的なＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を示す。相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の環状分布に注目すること。ｂ中の挿入はｙｚ断面を示す。（ｃ）共焦点顕微鏡法によるＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の検出。ＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプス形成の間での標的細胞上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の蓄積に注目すること。左の挿入はｘｚ光学的断面及び相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の分極を表す。右の挿入はｙｚ光学的断面を明らかにし、複合体内の接触部位におけるＰｙｋ２Ｙ４０２＊の末梢分布を示す。画像は、４つの独立した実験の代表である。（ｄ、ｅ）ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋の共培養（ｄ）又はＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の共培養（ｅ）の間の単一細胞及び複合体の間のＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の頻度を、３つの独立した実験において決定した（平均値± ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ、ｇ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節切片（ｆ）及び前頭皮質生検（ｇ）上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の検出。ＨＩＶ感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）生検上で観察された融合細胞の陽性染色（上流の挿入上）ならびに非感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）の陰性染色パターンに注目すること。（ｊ）末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊及び未処置ＨＩＶ−１キャリアから得られたウイルス血症の間の正相関。ｐ値は相関係数に対応する。（ｋ）未処置ＨＩＶ−１感染患者と比較した、処置患者から得られた末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊に対する高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）の効果（スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＝０．０００９）。（ｌ）複合体の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｍ）２つの異なるｓｉＲＮＡを用いたＰｙｋ２のノックダウンを、イムノブロットを使用することにより確認した。ブロットは、３つの独立した決定の代表である。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染及び半融合／融合に対するＰｙｋ２ノックダウンの効果（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１感染の間にＰｙｋ２活性化を誘導する。（ａ）Ｐ２Ｙ２枯渇は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性複合体形成の間に誘導されるＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化を阻害する。Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊及びＰｙｋ２発現に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果を、方法において記載する通りに、イムノブロットにより決定した。ブロットは、３つの独立した実験について代表する。（ｂ）共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を明らかにする。ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の代表的なＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を示す。相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の環状分布に注目すること。ｂ中の挿入はｙｚ断面を示す。（ｃ）共焦点顕微鏡法によるＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の検出。ＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプス形成の間での標的細胞上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の蓄積に注目すること。左の挿入はｘｚ光学的断面及び相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の分極を表す。右の挿入はｙｚ光学的断面を明らかにし、複合体内の接触部位におけるＰｙｋ２Ｙ４０２＊の末梢分布を示す。画像は、４つの独立した実験の代表である。（ｄ、ｅ）ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋の共培養（ｄ）又はＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の共培養（ｅ）の間の単一細胞及び複合体の間のＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の頻度を、３つの独立した実験において決定した（平均値± ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ、ｇ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節切片（ｆ）及び前頭皮質生検（ｇ）上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の検出。ＨＩＶ感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）生検上で観察された融合細胞の陽性染色（上流の挿入上）ならびに非感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）の陰性染色パターンに注目すること。（ｊ）末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊及び未処置ＨＩＶ−１キャリアから得られたウイルス血症の間の正相関。ｐ値は相関係数に対応する。（ｋ）未処置ＨＩＶ−１感染患者と比較した、処置患者から得られた末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊に対する高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）の効果（スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＝０．０００９）。（ｌ）複合体の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｍ）２つの異なるｓｉＲＮＡを用いたＰｙｋ２のノックダウンを、イムノブロットを使用することにより確認した。ブロットは、３つの独立した決定の代表である。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染及び半融合／融合に対するＰｙｋ２ノックダウンの効果（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１感染の間にＰｙｋ２活性化を誘導する。（ａ）Ｐ２Ｙ２枯渇は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性複合体形成の間に誘導されるＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化を阻害する。Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊及びＰｙｋ２発現に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果を、方法において記載する通りに、イムノブロットにより決定した。ブロットは、３つの独立した実験について代表する。（ｂ）共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を明らかにする。ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の代表的なＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を示す。相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の環状分布に注目すること。ｂ中の挿入はｙｚ断面を示す。（ｃ）共焦点顕微鏡法によるＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の検出。ＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプス形成の間での標的細胞上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の蓄積に注目すること。左の挿入はｘｚ光学的断面及び相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の分極を表す。右の挿入はｙｚ光学的断面を明らかにし、複合体内の接触部位におけるＰｙｋ２Ｙ４０２＊の末梢分布を示す。画像は、４つの独立した実験の代表である。（ｄ、ｅ）ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋の共培養（ｄ）又はＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の共培養（ｅ）の間の単一細胞及び複合体の間のＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の頻度を、３つの独立した実験において決定した（平均値± ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ、ｇ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節切片（ｆ）及び前頭皮質生検（ｇ）上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の検出。ＨＩＶ感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）生検上で観察された融合細胞の陽性染色（上流の挿入上）ならびに非感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）の陰性染色パターンに注目すること。（ｊ）末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊及び未処置ＨＩＶ−１キャリアから得られたウイルス血症の間の正相関。ｐ値は相関係数に対応する。（ｋ）未処置ＨＩＶ−１感染患者と比較した、処置患者から得られた末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊に対する高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）の効果（スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＝０．０００９）。（ｌ）複合体の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｍ）２つの異なるｓｉＲＮＡを用いたＰｙｋ２のノックダウンを、イムノブロットを使用することにより確認した。ブロットは、３つの独立した決定の代表である。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染及び半融合／融合に対するＰｙｋ２ノックダウンの効果（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１感染の間にＰｙｋ２活性化を誘導する。（ａ）Ｐ２Ｙ２枯渇は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性複合体形成の間に誘導されるＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化を阻害する。Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊及びＰｙｋ２発現に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果を、方法において記載する通りに、イムノブロットにより決定した。ブロットは、３つの独立した実験について代表する。（ｂ）共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を明らかにする。ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の代表的なＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を示す。相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の環状分布に注目すること。ｂ中の挿入はｙｚ断面を示す。（ｃ）共焦点顕微鏡法によるＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の検出。ＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプス形成の間での標的細胞上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の蓄積に注目すること。左の挿入はｘｚ光学的断面及び相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の分極を表す。右の挿入はｙｚ光学的断面を明らかにし、複合体内の接触部位におけるＰｙｋ２Ｙ４０２＊の末梢分布を示す。画像は、４つの独立した実験の代表である。（ｄ、ｅ）ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋の共培養（ｄ）又はＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の共培養（ｅ）の間の単一細胞及び複合体の間のＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の頻度を、３つの独立した実験において決定した（平均値± ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ、ｇ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節切片（ｆ）及び前頭皮質生検（ｇ）上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の検出。ＨＩＶ感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）生検上で観察された融合細胞の陽性染色（上流の挿入上）ならびに非感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）の陰性染色パターンに注目すること。（ｊ）末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊及び未処置ＨＩＶ−１キャリアから得られたウイルス血症の間の正相関。ｐ値は相関係数に対応する。（ｋ）未処置ＨＩＶ−１感染患者と比較した、処置患者から得られた末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊に対する高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）の効果（スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＝０．０００９）。（ｌ）複合体の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｍ）２つの異なるｓｉＲＮＡを用いたＰｙｋ２のノックダウンを、イムノブロットを使用することにより確認した。ブロットは、３つの独立した決定の代表である。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染及び半融合／融合に対するＰｙｋ２ノックダウンの効果（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１感染の間にＰｙｋ２活性化を誘導する。（ａ）Ｐ２Ｙ２枯渇は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性複合体形成の間に誘導されるＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化を阻害する。Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊及びＰｙｋ２発現に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果を、方法において記載する通りに、イムノブロットにより決定した。ブロットは、３つの独立した実験について代表する。（ｂ）共焦点顕微鏡法は、ＨＩＶ Ｅｎｖ発現細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を明らかにする。ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞の間の代表的なＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極を示す。相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の環状分布に注目すること。ｂ中の挿入はｙｚ断面を示す。（ｃ）共焦点顕微鏡法によるＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での相互作用の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の検出。ＨＩＶ−１により誘導されるウイルス学的シナプス形成の間での標的細胞上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の蓄積に注目すること。左の挿入はｘｚ光学的断面及び相互作用する細胞の間でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の分極を表す。右の挿入はｙｚ光学的断面を明らかにし、複合体内の接触部位におけるＰｙｋ２Ｙ４０２＊の末梢分布を示す。画像は、４つの独立した実験の代表である。（ｄ、ｅ）ＨＩＶ Ｅｎｖ＋細胞及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋の共培養（ｄ）又はＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の共培養（ｅ）の間の単一細胞及び複合体の間のＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極の頻度を、３つの独立した実験において決定した（平均値± ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ、ｇ）ＨＩＶ−１感染患者から得られたリンパ節切片（ｆ）及び前頭皮質生検（ｇ）上でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の検出。ＨＩＶ感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）生検上で観察された融合細胞の陽性染色（上流の挿入上）ならびに非感染患者から得られたリンパ節（ｆ）及び前頭皮質（ｇ）の陰性染色パターンに注目すること。（ｊ）末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊及び未処置ＨＩＶ−１キャリアから得られたウイルス血症の間の正相関。ｐ値は相関係数に対応する。（ｋ）未処置ＨＩＶ−１感染患者と比較した、処置患者から得られた末梢血単核細胞上で検出されたＰｙｋ２Ｙ４０２＊に対する高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）の効果（スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＝０．０００９）。（ｌ）複合体の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊分極に対するＰ２Ｙ２ノックダウンの効果。（ｍ）２つの異なるｓｉＲＮＡを用いたＰｙｋ２のノックダウンを、イムノブロットを使用することにより確認した。ブロットは、３つの独立した決定の代表である。（ｎ）ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される、ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ感染及び半融合／融合に対するＰｙｋ２ノックダウンの効果（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２の阻害は、ＨＩＶ−１感染性及びＨＩＶ−１感染に関連付けられるＴ細胞枯渇を低下させる。（ａ）治療耐性ＨＩＶ−１変異ウイルス（ＨＩＶＮＬ４３ＲＴＫ１０３Ｎ及びＨＩＶＮＬ４３ＩＮ１４０：１４８）の感染活性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２ノックダウンの効果。標的細胞の感染性を、方法において記載する通りに、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター系を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。（ｂ）ＨＩＶ変異体の感染性に対する異なる濃度のスラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果（ａにおいて記載する通り）。（ｃ）スラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰを用いたＨＩＶ標的細胞の処理は、検出不可能なウイルス血症を伴うＨＡＡＲＴ処置患者から得られた末梢血単核細胞のエクスビボ刺激の間に誘発されたウイルス増殖を低下させる。ウイルス増殖に対する阻害剤の効果を、方法に記載する通りに、感染の１、３、及び７日後に決定した。示された結果は、３人のＨＡＡＲＴ処置患者から得られたものの代表である。（ｄ）スラミン及びＰＰＡＤＳを用いたＨＩＶＮＤＫ感染（ＰＨＡ／ＩＬ−２刺激）リンパ芽球の処理は、ウイルス感染及びＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇を低下させる。感染（示さず）及びＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇を、フローサイトメトリーにより、記載される通りに６３、細胞内ｐ２４抗原染色及び７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）取り込みを決定することにより分析した。（ｅ）ＨＩＶ−１感染の初期段階におけるｐａｎｎｅｘｉｎ−１、ＡＴＰ放出、Ｐ２Ｙ２活性化、及びＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化の関与。細胞共受容体へのＨＩＶ−１エンベロープの結合は、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を通じた、宿主細胞からの迅速なＡＴＰ放出に導き、それは、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ２を活性化し、Ｐｙｋ２の活性化（リン酸化）（Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊）に導く。Ｐ２Ｙ２及びＰｙｋ２は、原形質膜の脱分極、半融合、及び融合を制御し、それらはＨＩＶ−１感染のために要求される。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２の阻害は、ＨＩＶ−１感染性及びＨＩＶ−１感染に関連付けられるＴ細胞枯渇を低下させる。（ａ）治療耐性ＨＩＶ−１変異ウイルス（ＨＩＶＮＬ４３ＲＴＫ１０３Ｎ及びＨＩＶＮＬ４３ＩＮ１４０：１４８）の感染活性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２ノックダウンの効果。標的細胞の感染性を、方法において記載する通りに、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター系を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。（ｂ）ＨＩＶ変異体の感染性に対する異なる濃度のスラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果（ａにおいて記載する通り）。（ｃ）スラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰを用いたＨＩＶ標的細胞の処理は、検出不可能なウイルス血症を伴うＨＡＡＲＴ処置患者から得られた末梢血単核細胞のエクスビボ刺激の間に誘発されたウイルス増殖を低下させる。ウイルス増殖に対する阻害剤の効果を、方法に記載する通りに、感染の１、３、及び７日後に決定した。示された結果は、３人のＨＡＡＲＴ処置患者から得られたものの代表である。（ｄ）スラミン及びＰＰＡＤＳを用いたＨＩＶＮＤＫ感染（ＰＨＡ／ＩＬ−２刺激）リンパ芽球の処理は、ウイルス感染及びＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇を低下させる。感染（示さず）及びＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇を、フローサイトメトリーにより、記載される通りに６３、細胞内ｐ２４抗原染色及び７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）取り込みを決定することにより分析した。（ｅ）ＨＩＶ−１感染の初期段階におけるｐａｎｎｅｘｉｎ−１、ＡＴＰ放出、Ｐ２Ｙ２活性化、及びＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化の関与。細胞共受容体へのＨＩＶ−１エンベロープの結合は、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を通じた、宿主細胞からの迅速なＡＴＰ放出に導き、それは、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ２を活性化し、Ｐｙｋ２の活性化（リン酸化）（Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊）に導く。Ｐ２Ｙ２及びＰｙｋ２は、原形質膜の脱分極、半融合、及び融合を制御し、それらはＨＩＶ−１感染のために要求される。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２の阻害は、ＨＩＶ−１感染性及びＨＩＶ−１感染に関連付けられるＴ細胞枯渇を低下させる。（ａ）治療耐性ＨＩＶ−１変異ウイルス（ＨＩＶＮＬ４３ＲＴＫ１０３Ｎ及びＨＩＶＮＬ４３ＩＮ１４０：１４８）の感染活性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２ノックダウンの効果。標的細胞の感染性を、方法において記載する通りに、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター系を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。（ｂ）ＨＩＶ変異体の感染性に対する異なる濃度のスラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果（ａにおいて記載する通り）。（ｃ）スラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰを用いたＨＩＶ標的細胞の処理は、検出不可能なウイルス血症を伴うＨＡＡＲＴ処置患者から得られた末梢血単核細胞のエクスビボ刺激の間に誘発されたウイルス増殖を低下させる。ウイルス増殖に対する阻害剤の効果を、方法に記載する通りに、感染の１、３、及び７日後に決定した。示された結果は、３人のＨＡＡＲＴ処置患者から得られたものの代表である。（ｄ）スラミン及びＰＰＡＤＳを用いたＨＩＶＮＤＫ感染（ＰＨＡ／ＩＬ−２刺激）リンパ芽球の処理は、ウイルス感染及びＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇を低下させる。感染（示さず）及びＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇を、フローサイトメトリーにより、記載される通りに６３、細胞内ｐ２４抗原染色及び７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）取り込みを決定することにより分析した。（ｅ）ＨＩＶ−１感染の初期段階におけるｐａｎｎｅｘｉｎ−１、ＡＴＰ放出、Ｐ２Ｙ２活性化、及びＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化の関与。細胞共受容体へのＨＩＶ−１エンベロープの結合は、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を通じた、宿主細胞からの迅速なＡＴＰ放出に導き、それは、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ２を活性化し、Ｐｙｋ２の活性化（リン酸化）（Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊）に導く。Ｐ２Ｙ２及びＰｙｋ２は、原形質膜の脱分極、半融合、及び融合を制御し、それらはＨＩＶ−１感染のために要求される。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２の阻害は、ＨＩＶ−１感染性及びＨＩＶ−１感染に関連付けられるＴ細胞枯渇を低下させる。（ａ）治療耐性ＨＩＶ−１変異ウイルス（ＨＩＶＮＬ４３ＲＴＫ１０３Ｎ及びＨＩＶＮＬ４３ＩＮ１４０：１４８）の感染活性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２ノックダウンの効果。標的細胞の感染性を、方法において記載する通りに、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター系を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。（ｂ）ＨＩＶ変異体の感染性に対する異なる濃度のスラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果（ａにおいて記載する通り）。（ｃ）スラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰを用いたＨＩＶ標的細胞の処理は、検出不可能なウイルス血症を伴うＨＡＡＲＴ処置患者から得られた末梢血単核細胞のエクスビボ刺激の間に誘発されたウイルス増殖を低下させる。ウイルス増殖に対する阻害剤の効果を、方法に記載する通りに、感染の１、３、及び７日後に決定した。示された結果は、３人のＨＡＡＲＴ処置患者から得られたものの代表である。（ｄ）スラミン及びＰＰＡＤＳを用いたＨＩＶＮＤＫ感染（ＰＨＡ／ＩＬ−２刺激）リンパ芽球の処理は、ウイルス感染及びＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇を低下させる。感染（示さず）及びＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇を、フローサイトメトリーにより、記載される通りに６３、細胞内ｐ２４抗原染色及び７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）取り込みを決定することにより分析した。（ｅ）ＨＩＶ−１感染の初期段階におけるｐａｎｎｅｘｉｎ−１、ＡＴＰ放出、Ｐ２Ｙ２活性化、及びＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化の関与。細胞共受容体へのＨＩＶ−１エンベロープの結合は、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を通じた、宿主細胞からの迅速なＡＴＰ放出に導き、それは、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ２を活性化し、Ｐｙｋ２の活性化（リン酸化）（Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊）に導く。Ｐ２Ｙ２及びＰｙｋ２は、原形質膜の脱分極、半融合、及び融合を制御し、それらはＨＩＶ−１感染のために要求される。 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２の阻害は、ＨＩＶ−１感染性及びＨＩＶ−１感染に関連付けられるＴ細胞枯渇を低下させる。（ａ）治療耐性ＨＩＶ−１変異ウイルス（ＨＩＶＮＬ４３ＲＴＫ１０３Ｎ及びＨＩＶＮＬ４３ＩＮ１４０：１４８）の感染活性に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２ノックダウンの効果。標的細胞の感染性を、方法において記載する通りに、Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーター系を含むＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を使用して決定した。（ｂ）ＨＩＶ変異体の感染性に対する異なる濃度のスラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果（ａにおいて記載する通り）。（ｃ）スラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰを用いたＨＩＶ標的細胞の処理は、検出不可能なウイルス血症を伴うＨＡＡＲＴ処置患者から得られた末梢血単核細胞のエクスビボ刺激の間に誘発されたウイルス増殖を低下させる。ウイルス増殖に対する阻害剤の効果を、方法に記載する通りに、感染の１、３、及び７日後に決定した。示された結果は、３人のＨＡＡＲＴ処置患者から得られたものの代表である。（ｄ）スラミン及びＰＰＡＤＳを用いたＨＩＶＮＤＫ感染（ＰＨＡ／ＩＬ−２刺激）リンパ芽球の処理は、ウイルス感染及びＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇を低下させる。感染（示さず）及びＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇を、フローサイトメトリーにより、記載される通りに６３、細胞内ｐ２４抗原染色及び７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）取り込みを決定することにより分析した。（ｅ）ＨＩＶ−１感染の初期段階におけるｐａｎｎｅｘｉｎ−１、ＡＴＰ放出、Ｐ２Ｙ２活性化、及びＰｙｋ２Ｙ４０２＊リン酸化の関与。細胞共受容体へのＨＩＶ−１エンベロープの結合は、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１を通じた、宿主細胞からの迅速なＡＴＰ放出に導き、それは、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ２を活性化し、Ｐｙｋ２の活性化（リン酸化）（Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊）に導く。Ｐ２Ｙ２及びＰｙｋ２は、原形質膜の脱分極、半融合、及び融合を制御し、それらはＨＩＶ−１感染のために要求される。 ＨＩＶ−１感染の間及びＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１依存的ＡＴＰ放出。（ａ）標的細胞の生存率に対するアピラーゼ及びＡＭＤ３１００の効果。異なる濃度のアピラーゼ又はＡＭＤ３１００を用いて３時間にわたりインキュベートされ（示す通り）、次に、ＨＩＶ−１ＮＬ４３を用いて２日間にわたり感染させた細胞の生存率を、方法において詳述する通りに、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイにより評価した。（ｂ）ＨＩＶ−１感染の間に検出されたＡＴＰ放出に対するアピラーゼ及びＡＭＤ３１００の効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、２．５、５、もしくは１０UI/mlアピラーゼ又は５□M ＡＭＤ３１００の非存在において又は存在において感染させた。２時間の感染後、ＡＴＰ放出を、方法において記載する通りに決定した。（ｃ、ｄ）細胞生存率（ｃ）及びＨＩＶ−１エンベロープ媒介性融合（ｄ）に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１、カルベノキソロン（ＣＢＸ）、二ナトリウム４，４−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２−ジスルホネート（ＤＩＤＳ）、及び二ナトリウム４−アセトアミド−４−イソチオシアナト−スチルベン−２，２−ジスルホネート（ＳＩＴＳ）の薬理学的阻害剤の効果。ｃ中の細胞生存率をａ中の通りに評価した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞（Ｔａｔタンパク質も発現する）及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼを含む）の間での融合を、方法において記載する通りに、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性（ｄ）を測定することにより決定した。（ｅ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果（（ｃ）において記載する通り）。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）中のデータを、３つの独立した実験において決定した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ−１感染の間及びＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１依存的ＡＴＰ放出。（ａ）標的細胞の生存率に対するアピラーゼ及びＡＭＤ３１００の効果。異なる濃度のアピラーゼ又はＡＭＤ３１００を用いて３時間にわたりインキュベートされ（示す通り）、次に、ＨＩＶ−１ＮＬ４３を用いて２日間にわたり感染させた細胞の生存率を、方法において詳述する通りに、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイにより評価した。（ｂ）ＨＩＶ−１感染の間に検出されたＡＴＰ放出に対するアピラーゼ及びＡＭＤ３１００の効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、２．５、５、もしくは１０UI/mlアピラーゼ又は５□M ＡＭＤ３１００の非存在において又は存在において感染させた。２時間の感染後、ＡＴＰ放出を、方法において記載する通りに決定した。（ｃ、ｄ）細胞生存率（ｃ）及びＨＩＶ−１エンベロープ媒介性融合（ｄ）に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１、カルベノキソロン（ＣＢＸ）、二ナトリウム４，４−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２−ジスルホネート（ＤＩＤＳ）、及び二ナトリウム４−アセトアミド−４−イソチオシアナト−スチルベン−２，２−ジスルホネート（ＳＩＴＳ）の薬理学的阻害剤の効果。ｃ中の細胞生存率をａ中の通りに評価した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞（Ｔａｔタンパク質も発現する）及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼを含む）の間での融合を、方法において記載する通りに、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性（ｄ）を測定することにより決定した。（ｅ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果（（ｃ）において記載する通り）。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）中のデータを、３つの独立した実験において決定した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ−１感染の間及びＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１依存的ＡＴＰ放出。（ａ）標的細胞の生存率に対するアピラーゼ及びＡＭＤ３１００の効果。異なる濃度のアピラーゼ又はＡＭＤ３１００を用いて３時間にわたりインキュベートされ（示す通り）、次に、ＨＩＶ−１ＮＬ４３を用いて２日間にわたり感染させた細胞の生存率を、方法において詳述する通りに、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイにより評価した。（ｂ）ＨＩＶ−１感染の間に検出されたＡＴＰ放出に対するアピラーゼ及びＡＭＤ３１００の効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、２．５、５、もしくは１０UI/mlアピラーゼ又は５□M ＡＭＤ３１００の非存在において又は存在において感染させた。２時間の感染後、ＡＴＰ放出を、方法において記載する通りに決定した。（ｃ、ｄ）細胞生存率（ｃ）及びＨＩＶ−１エンベロープ媒介性融合（ｄ）に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１、カルベノキソロン（ＣＢＸ）、二ナトリウム４，４−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２−ジスルホネート（ＤＩＤＳ）、及び二ナトリウム４−アセトアミド−４−イソチオシアナト−スチルベン−２，２−ジスルホネート（ＳＩＴＳ）の薬理学的阻害剤の効果。ｃ中の細胞生存率をａ中の通りに評価した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞（Ｔａｔタンパク質も発現する）及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼを含む）の間での融合を、方法において記載する通りに、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性（ｄ）を測定することにより決定した。（ｅ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果（（ｃ）において記載する通り）。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）中のデータを、３つの独立した実験において決定した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ−１感染の間及びＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１依存的ＡＴＰ放出。（ａ）標的細胞の生存率に対するアピラーゼ及びＡＭＤ３１００の効果。異なる濃度のアピラーゼ又はＡＭＤ３１００を用いて３時間にわたりインキュベートされ（示す通り）、次に、ＨＩＶ−１ＮＬ４３を用いて２日間にわたり感染させた細胞の生存率を、方法において詳述する通りに、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイにより評価した。（ｂ）ＨＩＶ−１感染の間に検出されたＡＴＰ放出に対するアピラーゼ及びＡＭＤ３１００の効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、２．５、５、もしくは１０UI/mlアピラーゼ又は５□M ＡＭＤ３１００の非存在において又は存在において感染させた。２時間の感染後、ＡＴＰ放出を、方法において記載する通りに決定した。（ｃ、ｄ）細胞生存率（ｃ）及びＨＩＶ−１エンベロープ媒介性融合（ｄ）に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１、カルベノキソロン（ＣＢＸ）、二ナトリウム４，４−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２−ジスルホネート（ＤＩＤＳ）、及び二ナトリウム４−アセトアミド−４−イソチオシアナト−スチルベン−２，２−ジスルホネート（ＳＩＴＳ）の薬理学的阻害剤の効果。ｃ中の細胞生存率をａ中の通りに評価した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞（Ｔａｔタンパク質も発現する）及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼを含む）の間での融合を、方法において記載する通りに、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性（ｄ）を測定することにより決定した。（ｅ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果（（ｃ）において記載する通り）。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）中のデータを、３つの独立した実験において決定した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ−１感染の間及びＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合の間でのｐａｎｎｅｘｉｎ−１依存的ＡＴＰ放出。（ａ）標的細胞の生存率に対するアピラーゼ及びＡＭＤ３１００の効果。異なる濃度のアピラーゼ又はＡＭＤ３１００を用いて３時間にわたりインキュベートされ（示す通り）、次に、ＨＩＶ−１ＮＬ４３を用いて２日間にわたり感染させた細胞の生存率を、方法において詳述する通りに、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイにより評価した。（ｂ）ＨＩＶ−１感染の間に検出されたＡＴＰ放出に対するアピラーゼ及びＡＭＤ３１００の効果。ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞を、ＨＩＶＮＬ４３を用いて（感染多重度＝１）、２．５、５、もしくは１０UI/mlアピラーゼ又は５□M ＡＭＤ３１００の非存在において又は存在において感染させた。２時間の感染後、ＡＴＰ放出を、方法において記載する通りに決定した。（ｃ、ｄ）細胞生存率（ｃ）及びＨＩＶ−１エンベロープ媒介性融合（ｄ）に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１、カルベノキソロン（ＣＢＸ）、二ナトリウム４，４−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２−ジスルホネート（ＤＩＤＳ）、及び二ナトリウム４−アセトアミド−４−イソチオシアナト−スチルベン−２，２−ジスルホネート（ＳＩＴＳ）の薬理学的阻害剤の効果。ｃ中の細胞生存率をａ中の通りに評価した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ発現細胞（Ｔａｔタンパク質も発現する）及びＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（Ｔａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼを含む）の間での融合を、方法において記載する通りに、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）活性（ｄ）を測定することにより決定した。（ｅ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合に対するｐａｎｎｅｘｉｎ−１ノックダウンの効果（（ｃ）において記載する通り）。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）中のデータを、３つの独立した実験において決定した（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ感染の間での細胞生存率、ウイルス産生、及び宿主細胞の感染性に対するＰ２阻害剤の影響。（ａ−ｅ）初代ヒトリンパ芽球（ａ）、ヒト単球由来マクロファージ（ｂ、ｃ）、ヒト単球由来樹状細胞（ｄ、ｅ）、及びヒトＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（ｆ）を、Ｘ４向性（ＨＩＶ−１ＮＤＫ又はＨＩＶＮＬ４３）又はＲ５向性（ＨＩＶ−１ＢａＬ）ＨＩＶ−１株（感染多重度（ＭＯＩ）１）を用いて、３日間にわたり、示した濃度のＰ２受容体アンタゴニストスラミン、Ｐ２Ｘ選択的アンタゴニスト酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）、又はＰ２Ｙ選択的アンタゴニストピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）の存在又は非存在において感染させた。細胞生存率を、３日の感染後に決定した。ウイルス産生に対するこれらの阻害剤の効果を、以前に記載された通りに６４、３日の感染後に決定した。結果は、３つの独立した実験から得られた（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ感染の間での細胞生存率、ウイルス産生、及び宿主細胞の感染性に対するＰ２阻害剤の影響。（ａ−ｅ）初代ヒトリンパ芽球（ａ）、ヒト単球由来マクロファージ（ｂ、ｃ）、ヒト単球由来樹状細胞（ｄ、ｅ）、及びヒトＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（ｆ）を、Ｘ４向性（ＨＩＶ−１ＮＤＫ又はＨＩＶＮＬ４３）又はＲ５向性（ＨＩＶ−１ＢａＬ）ＨＩＶ−１株（感染多重度（ＭＯＩ）１）を用いて、３日間にわたり、示した濃度のＰ２受容体アンタゴニストスラミン、Ｐ２Ｘ選択的アンタゴニスト酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）、又はＰ２Ｙ選択的アンタゴニストピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）の存在又は非存在において感染させた。細胞生存率を、３日の感染後に決定した。ウイルス産生に対するこれらの阻害剤の効果を、以前に記載された通りに６４、３日の感染後に決定した。結果は、３つの独立した実験から得られた（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ感染の間での細胞生存率、ウイルス産生、及び宿主細胞の感染性に対するＰ２阻害剤の影響。（ａ−ｅ）初代ヒトリンパ芽球（ａ）、ヒト単球由来マクロファージ（ｂ、ｃ）、ヒト単球由来樹状細胞（ｄ、ｅ）、及びヒトＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（ｆ）を、Ｘ４向性（ＨＩＶ−１ＮＤＫ又はＨＩＶＮＬ４３）又はＲ５向性（ＨＩＶ−１ＢａＬ）ＨＩＶ−１株（感染多重度（ＭＯＩ）１）を用いて、３日間にわたり、示した濃度のＰ２受容体アンタゴニストスラミン、Ｐ２Ｘ選択的アンタゴニスト酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）、又はＰ２Ｙ選択的アンタゴニストピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）の存在又は非存在において感染させた。細胞生存率を、３日の感染後に決定した。ウイルス産生に対するこれらの阻害剤の効果を、以前に記載された通りに６４、３日の感染後に決定した。結果は、３つの独立した実験から得られた（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ感染の間での細胞生存率、ウイルス産生、及び宿主細胞の感染性に対するＰ２阻害剤の影響。（ａ−ｅ）初代ヒトリンパ芽球（ａ）、ヒト単球由来マクロファージ（ｂ、ｃ）、ヒト単球由来樹状細胞（ｄ、ｅ）、及びヒトＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（ｆ）を、Ｘ４向性（ＨＩＶ−１ＮＤＫ又はＨＩＶＮＬ４３）又はＲ５向性（ＨＩＶ−１ＢａＬ）ＨＩＶ−１株（感染多重度（ＭＯＩ）１）を用いて、３日間にわたり、示した濃度のＰ２受容体アンタゴニストスラミン、Ｐ２Ｘ選択的アンタゴニスト酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）、又はＰ２Ｙ選択的アンタゴニストピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）の存在又は非存在において感染させた。細胞生存率を、３日の感染後に決定した。ウイルス産生に対するこれらの阻害剤の効果を、以前に記載された通りに６４、３日の感染後に決定した。結果は、３つの独立した実験から得られた（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ感染の間での細胞生存率、ウイルス産生、及び宿主細胞の感染性に対するＰ２阻害剤の影響。（ａ−ｅ）初代ヒトリンパ芽球（ａ）、ヒト単球由来マクロファージ（ｂ、ｃ）、ヒト単球由来樹状細胞（ｄ、ｅ）、及びヒトＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（ｆ）を、Ｘ４向性（ＨＩＶ−１ＮＤＫ又はＨＩＶＮＬ４３）又はＲ５向性（ＨＩＶ−１ＢａＬ）ＨＩＶ−１株（感染多重度（ＭＯＩ）１）を用いて、３日間にわたり、示した濃度のＰ２受容体アンタゴニストスラミン、Ｐ２Ｘ選択的アンタゴニスト酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）、又はＰ２Ｙ選択的アンタゴニストピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）の存在又は非存在において感染させた。細胞生存率を、３日の感染後に決定した。ウイルス産生に対するこれらの阻害剤の効果を、以前に記載された通りに６４、３日の感染後に決定した。結果は、３つの独立した実験から得られた（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ感染の間での細胞生存率、ウイルス産生、及び宿主細胞の感染性に対するＰ２阻害剤の影響。（ａ−ｅ）初代ヒトリンパ芽球（ａ）、ヒト単球由来マクロファージ（ｂ、ｃ）、ヒト単球由来樹状細胞（ｄ、ｅ）、及びヒトＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞（ｆ）を、Ｘ４向性（ＨＩＶ−１ＮＤＫ又はＨＩＶＮＬ４３）又はＲ５向性（ＨＩＶ−１ＢａＬ）ＨＩＶ−１株（感染多重度（ＭＯＩ）１）を用いて、３日間にわたり、示した濃度のＰ２受容体アンタゴニストスラミン、Ｐ２Ｘ選択的アンタゴニスト酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）、又はＰ２Ｙ選択的アンタゴニストピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）の存在又は非存在において感染させた。細胞生存率を、３日の感染後に決定した。ウイルス産生に対するこれらの阻害剤の効果を、以前に記載された通りに６４、３日の感染後に決定した。結果は、３つの独立した実験から得られた（平均値±ｓ．ｅ．ｍ；＊Ｐ＜０．０５）。 ＨＩＶ−１感染の間でのウイルス産出に対するＡＭＤ３１００、スラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果。（ａ、ｂ、ｃ）臨床的ＨＩＶ−１分離株を用いたＣ８１６６ Ｔ細胞株の感染の間でのウイルス産出に対するＰ２阻害剤の効果。示した濃度のＰ２受容体アンタゴニストスラミン、Ｐ２Ｙ選択的アンタゴニストピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）、又はＰ２Ｘ選択的アンタゴニスト酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）の非存在又は存在におけるＣ８１６６ Ｔ細胞株感染の間でのＨＩＶ−１ビリオン放出の動態を決定した。ＨＩＶ−１ウイルス産出を、培地中のｐ２４抗原濃度を定量化することにより評価した。結果は、３つの独立した実験について代表する。 ＨＩＶ−１感染の間でのウイルス産出に対するＡＭＤ３１００、スラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果。（ａ、ｂ、ｃ）臨床的ＨＩＶ−１分離株を用いたＣ８１６６ Ｔ細胞株の感染の間でのウイルス産出に対するＰ２阻害剤の効果。示した濃度のＰ２受容体アンタゴニストスラミン、Ｐ２Ｙ選択的アンタゴニストピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）、又はＰ２Ｘ選択的アンタゴニスト酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）の非存在又は存在におけるＣ８１６６ Ｔ細胞株感染の間でのＨＩＶ−１ビリオン放出の動態を決定した。ＨＩＶ−１ウイルス産出を、培地中のｐ２４抗原濃度を定量化することにより評価した。結果は、３つの独立した実験について代表する。 ＨＩＶ−１感染の間でのウイルス産出に対するＡＭＤ３１００、スラミン、ＰＰＡＤＳ、及びＯｘＡＴＰの効果。（ａ、ｂ、ｃ）臨床的ＨＩＶ−１分離株を用いたＣ８１６６ Ｔ細胞株の感染の間でのウイルス産出に対するＰ２阻害剤の効果。示した濃度のＰ２受容体アンタゴニストスラミン、Ｐ２Ｙ選択的アンタゴニストピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）、又はＰ２Ｘ選択的アンタゴニスト酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）の非存在又は存在におけるＣ８１６６ Ｔ細胞株感染の間でのＨＩＶ−１ビリオン放出の動態を決定した。ＨＩＶ−１ウイルス産出を、培地中のｐ２４抗原濃度を定量化することにより評価した。結果は、３つの独立した実験について代表する。 Ｐ２Ｙ２はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合を制御する。（ａ−ｇ）Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、又はＰ２Ｙ６を標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞中でのＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて推定した。エラーバーは、２通りの決定のＳＥＭを示す。（ｈ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合に対するＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６枯渇の効果。融合アッセイを、図Ｓ１ｄの通りに実施した。Ｐ２Ｙ２枯渇が、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合を効率的に低下させることに注目すること。（ｈ）中のエラーバーは、３通りの決定のＳＥＭを示し、アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｉ）標的細胞におけるヒトＰ２Ｙ２野生型及びヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体コンストラクトのトランスフェクションを、ウエスタンブロットにより確認した。ブロットは、３つの独立した実験を代表する。 Ｐ２Ｙ２はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合を制御する。（ａ−ｇ）Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、又はＰ２Ｙ６を標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞中でのＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて推定した。エラーバーは、２通りの決定のＳＥＭを示す。（ｈ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合に対するＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６枯渇の効果。融合アッセイを、図Ｓ１ｄの通りに実施した。Ｐ２Ｙ２枯渇が、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合を効率的に低下させることに注目すること。（ｈ）中のエラーバーは、３通りの決定のＳＥＭを示し、アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｉ）標的細胞におけるヒトＰ２Ｙ２野生型及びヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体コンストラクトのトランスフェクションを、ウエスタンブロットにより確認した。ブロットは、３つの独立した実験を代表する。 Ｐ２Ｙ２はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合を制御する。（ａ−ｇ）Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、又はＰ２Ｙ６を標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞中でのＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて推定した。エラーバーは、２通りの決定のＳＥＭを示す。（ｈ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合に対するＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６枯渇の効果。融合アッセイを、図Ｓ１ｄの通りに実施した。Ｐ２Ｙ２枯渇が、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合を効率的に低下させることに注目すること。（ｈ）中のエラーバーは、３通りの決定のＳＥＭを示し、アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｉ）標的細胞におけるヒトＰ２Ｙ２野生型及びヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体コンストラクトのトランスフェクションを、ウエスタンブロットにより確認した。ブロットは、３つの独立した実験を代表する。 Ｐ２Ｙ２はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合を制御する。（ａ−ｇ）Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、又はＰ２Ｙ６を標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞中でのＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて推定した。エラーバーは、２通りの決定のＳＥＭを示す。（ｈ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合に対するＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６枯渇の効果。融合アッセイを、図Ｓ１ｄの通りに実施した。Ｐ２Ｙ２枯渇が、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合を効率的に低下させることに注目すること。（ｈ）中のエラーバーは、３通りの決定のＳＥＭを示し、アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｉ）標的細胞におけるヒトＰ２Ｙ２野生型及びヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体コンストラクトのトランスフェクションを、ウエスタンブロットにより確認した。ブロットは、３つの独立した実験を代表する。 Ｐ２Ｙ２はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合を制御する。（ａ−ｇ）Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、又はＰ２Ｙ６を標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞中でのＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて推定した。エラーバーは、２通りの決定のＳＥＭを示す。（ｈ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合に対するＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６枯渇の効果。融合アッセイを、図Ｓ１ｄの通りに実施した。Ｐ２Ｙ２枯渇が、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合を効率的に低下させることに注目すること。（ｈ）中のエラーバーは、３通りの決定のＳＥＭを示し、アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｉ）標的細胞におけるヒトＰ２Ｙ２野生型及びヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体コンストラクトのトランスフェクションを、ウエスタンブロットにより確認した。ブロットは、３つの独立した実験を代表する。 Ｐ２Ｙ２はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合を制御する。（ａ−ｇ）Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、又はＰ２Ｙ６を標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞中でのＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて推定した。エラーバーは、２通りの決定のＳＥＭを示す。（ｈ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合に対するＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６枯渇の効果。融合アッセイを、図Ｓ１ｄの通りに実施した。Ｐ２Ｙ２枯渇が、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合を効率的に低下させることに注目すること。（ｈ）中のエラーバーは、３通りの決定のＳＥＭを示し、アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｉ）標的細胞におけるヒトＰ２Ｙ２野生型及びヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体コンストラクトのトランスフェクションを、ウエスタンブロットにより確認した。ブロットは、３つの独立した実験を代表する。 Ｐ２Ｙ２はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合を制御する。（ａ−ｇ）Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、又はＰ２Ｙ６を標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞中でのＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて推定した。エラーバーは、２通りの決定のＳＥＭを示す。（ｈ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合に対するＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６枯渇の効果。融合アッセイを、図Ｓ１ｄの通りに実施した。Ｐ２Ｙ２枯渇が、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合を効率的に低下させることに注目すること。（ｈ）中のエラーバーは、３通りの決定のＳＥＭを示し、アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｉ）標的細胞におけるヒトＰ２Ｙ２野生型及びヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体コンストラクトのトランスフェクションを、ウエスタンブロットにより確認した。ブロットは、３つの独立した実験を代表する。 Ｐ２Ｙ２はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合を制御する。（ａ−ｇ）Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、又はＰ２Ｙ６を標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞中でのＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて推定した。エラーバーは、２通りの決定のＳＥＭを示す。（ｈ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合に対するＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６枯渇の効果。融合アッセイを、図Ｓ１ｄの通りに実施した。Ｐ２Ｙ２枯渇が、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合を効率的に低下させることに注目すること。（ｈ）中のエラーバーは、３通りの決定のＳＥＭを示し、アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｉ）標的細胞におけるヒトＰ２Ｙ２野生型及びヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体コンストラクトのトランスフェクションを、ウエスタンブロットにより確認した。ブロットは、３つの独立した実験を代表する。 Ｐ２Ｙ２はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合を制御する。（ａ−ｇ）Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、又はＰ２Ｙ６を標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋細胞中でのＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて推定した。エラーバーは、２通りの決定のＳＥＭを示す。（ｈ）ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合に対するＰ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６枯渇の効果。融合アッセイを、図Ｓ１ｄの通りに実施した。Ｐ２Ｙ２枯渇が、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ誘導融合を効率的に低下させることに注目すること。（ｈ）中のエラーバーは、３通りの決定のＳＥＭを示し、アステリスクはＰ＜０．０５を示す。（ｉ）標的細胞におけるヒトＰ２Ｙ２野生型及びヒトＰ２Ｙ２／４Ａ変異体コンストラクトのトランスフェクションを、ウエスタンブロットにより確認した。ブロットは、３つの独立した実験を代表する。 ＨＩＶＮＤＫにより媒介されるウイルス学的シナプスでの分極Ｐ２Ｙ２の検出。（ａ、ｃ）蛍光顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の間（ａ、ｃ）、しかし、また、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球の間（緑色）の間（ｃ）のＰ２Ｙ２分極を示す。（ｂ、ｄ）混合画像の３Ｄ再構築は、また、非感染及びＨＩＶ−１感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の同様の分布を明らかにする。画像は、３つの独立した実験を代表する。 ＨＩＶＮＤＫにより媒介されるウイルス学的シナプスでの分極Ｐ２Ｙ２の検出。（ａ、ｃ）蛍光顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の間（ａ、ｃ）、しかし、また、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球の間（緑色）の間（ｃ）のＰ２Ｙ２分極を示す。（ｂ、ｄ）混合画像の３Ｄ再構築は、また、非感染及びＨＩＶ−１感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の同様の分布を明らかにする。画像は、３つの独立した実験を代表する。 ＨＩＶＮＤＫにより媒介されるウイルス学的シナプスでの分極Ｐ２Ｙ２の検出。（ａ、ｃ）蛍光顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の間（ａ、ｃ）、しかし、また、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球の間（緑色）の間（ｃ）のＰ２Ｙ２分極を示す。（ｂ、ｄ）混合画像の３Ｄ再構築は、また、非感染及びＨＩＶ−１感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の同様の分布を明らかにする。画像は、３つの独立した実験を代表する。 ＨＩＶＮＤＫにより媒介されるウイルス学的シナプスでの分極Ｐ２Ｙ２の検出。（ａ、ｃ）蛍光顕微鏡法は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球及び非感染リンパ芽球の間（ａ、ｃ）、しかし、また、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球の間（緑色）の間（ｃ）のＰ２Ｙ２分極を示す。（ｂ、ｄ）混合画像の３Ｄ再構築は、また、非感染及びＨＩＶ−１感染リンパ芽球の間でのＰ２Ｙ２の同様の分布を明らかにする。画像は、３つの独立した実験を代表する。
実施例：
方法：
抗体及び試薬：Ｐ２Ｙ２の検出のためのポリクローナルウサギ抗体を、Abcam又はAlomoneラボから購入した。Ｐａｎｎｅｘｉｎ−１に対するポリクローナルウサギ抗体を、Abcam及びMilliporeから得た。チロシン４０２上のＰｙｋ２のリン酸化形態（Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊）の検出のために使用されるポリクローナルウサギ抗体は、Cell Signaling Technologyからであった。スラミン、ピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）、酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）、カルベノキソロン（ＣＢＸ）、二ナトリウム４，４−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２−ジスルホネート（ＤＩＤＳ）、二ナトリウム−４−アセトアミド−４−イソチオシアナト−スチルベン−２，２−ジスルホネート（ＳＩＴＳ）、アピラーゼ、ＡＭＤ３１００、及びフィトヘマグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ）をSigma-Aldrichより購入した。ヒト組換えマクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン４（ｒｈＩＬ−４）、及びインターロイキン２（ｒｈＩＬ−２）をPeprotechより得た。ＨＩＶ−１ ＬＡＩ／ＩＩＩＢのＥｎｖ遺伝子を用いて安定的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ Ｅｎｖ）及びＣＤ４を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ ＣＤ４）を、単独で、又は、１：１比率で一緒に、１０% ＦＣＳ、２mM Ｌ−グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen）を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で、テスト分子の非存在において又は存在において培養した。
ＨＩＶ−１感染及びプリン作動性阻害剤。初代ヒトリンパ芽球、単球由来マクロファージ、単球由来樹状細胞、又はＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋標的細胞を、９６ウェル培養プレート中に播種し（５×１０５個細胞／ウェル）、３０分間、増加濃度のＣＸＣＲ４アンタゴニスト（ＡＭＤ３１００）、Ｐ２受容体アンタゴニストスラミン、Ｐ２Ｘ選択的アンタゴニスト酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）、又はＰ２Ｙ選択的アンタゴニストピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）を用いてインキュベートした。次に、細胞を、野生型ＨＩＶ−１、ＶＳＶ偽型ＨＩＶ−１、治療耐性ＨＩＶ−１変異ウイルス（１ngのｐ２４抗原）又は臨床的ＨＩＶ−１分離株（１５ngのｐ２４抗原）を用いて、３時間にわたり３７℃で、５% ＣＯ２雰囲気中で、インキュベートした。非吸収ウイルスを洗い落とした後、細胞を、示した時間にわたり、テスト分子の存在において培養した。ＡＴＰ放出、原形質膜の脱分極、ウイルス−細胞融合を、方法において記載する通りに決定した。ウイルスＲＮＡ及びＤＮＡ、ウイルス産生、細胞生存率、及び細胞死を、以前に記載された通りに６３、６４、分析した。
ＲＮＡ干渉 ｐａｎｎｅｘｉｎ−１（ｓｉＲＮＡ−１：５’−ＧＣＵＣＣＡＡＧＧＵＡＵＧＡＡＣＡＵＡ−３‘配列番号２）、Ｐ２Ｘ１（ｓｉＲＮＡ−１：５’−ＧＣＡＣＵＧＣＡＧＡＣＣＣＡＵＣＵＡＵ配列番号３、ｓｉＲＮＡ−２：５’−ＧＵＧＧＣＡＧＵＣＡＧＵＡＡＣＣＡＵＡ−３’配列番号４）、Ｐ２Ｘ４（ｓｉＲＮＡ−１：５’−ＧＧＡＡＡＡＣＵＣＣＣＵＣＵＵＣＧＵＣ−３配列番号５’、ｓｉＲＮＡ ２：ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ Ｐ２Ｘ４）、Ｐ２Ｘ７（ｓｉＲＮＡ−１：５’−ＧＣＵＧＵＣＧＣＵＣＣＣＡＵＡＵＵＵＡ−３’配列番号６、ｓｉＲＮＡ−２：ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ Ｐ２Ｘ７）、Ｐ２Ｙ１（ｓｉＲＮＡ−１：５’−ＧＧＵＣＵＣＡＵＵＡＵＡＵＡＵＵＧＧＧ−３’配列番号７、ｓｉＲＮＡ−２：５’−ＡＵＵＡＵＣＡＣＣＡＧＧＵＡＡＡＵＧＧＡＵＵＵＣＣ−３’配列番号８）、Ｐ２Ｙ２（ｓｉＲＮＡ−１：５’−ＧＧＡＵＡＧＡＡＧＡＵＧＵＧＵＵＧＧＧ−３’配列番号９、ｓｉＲＮＡ−２：５’−ＧＧＣＵＧＵＡＡＣＵＵＡＵＡＣＵＡＡＡ−３’配列番号１０）、Ｐ２Ｙ４（ｓｉＲＮＡ−１：５’−ＧＧＡＣＡＧＵＡＧＣＵＧＣＵＣＵＡＣＵ−３’配列番号１１、ｓｉＲＮＡ−２：５’−ＧＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣ−３’配列番号１２）、Ｐ２Ｙ６（ｓｉＲＮＡ−１：５’−ＧＡＡＣＵＵＣＡＡＧＣＡＡＣＵＧＣＵＧ−３’配列番号１３、ｓｉＲＮＡ−２：５’−ＧＧＵＧＣＵＣＡＣＡＡＡＡＡＵＡＣＡ−３’配列番号１４）、Ｐ２Ｙ１２（ｓｉＲＮＡ−１：ＣＵＧＵＡＣＣＧＧＵＣＡＵＡＣＧＵＡＡ−３配列番号１５’）、ＰＹＫ２（ｓｉＲＮＡ−１：５’−ＧＣＵＧＡＵＣＧＧＣＡＵＣＡＵＵＧＡＡ−３’配列番号１６、ｓｉＲＮＡ−２：５’−ＧＧＣＧＧＵＵＣＵＵＣＡＡＧＧＡＵＡＵ−３’配列番号１７）及びコントロールｓｉｒＲＮＡ（５’−ＧＣＣＧＧＵＡＵＧＣＣＧＧＵＵＡＡＧＵ−３’配列番号１８）について特異的な小分子干渉ＲＮＡを、細胞融合の前に４８時間にわたり、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。プリン作動性受容体のサイレンシングを、以下のプローブを使用した定量的ＰＣＲにより決定した：Ｐ２Ｘ１：５’−ＧＣＴＧＧＴＧＣＧＴＡＡＴＡＡＧＡＡＧＧＴＧ−３’（配列番号１９）、５’−ＡＴＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＧ−３’（配列番号２０）；Ｐ２Ｘ４：５’−ＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号２１）、５’−ＧＣＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＣＡＣＧＡＣＴＴＧＡＧ−３’（配列番号２２）；Ｐ２Ｘ７：５’−ＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴ−３’（配列番号２３）、５’ＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＣ−３’（配列番号２４）；Ｐ２Ｙ１：５’−ＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧ−３’（配列番号２５）、５’−ＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２６）；Ｐ２Ｙ２：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号２７）、５’−ＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＡＣＡＴＣ−３’（配列番号２８）；Ｐ２Ｙ４：５’−ＣＧＣＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号２９）、５’−ＣＣＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧ−３’（配列番号３０）；Ｐ２Ｙ６：５’−ＡＡＣＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＴＧ−３’（配列番号３１）、５’−ＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＧＴＣＡＣＧ−３’（配列番号３２）；Ｐ２Ｙ１２：５’−ＡＣＣＧＧＴＣＡＴＡＣＧＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧ−３’（配列番号３３）、５’−ＧＣＡＧＡＡＴＴＧＧＧＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣ−３’（配列番号３４）；ＧＡＰＤＨ：５’−ＣＡＡＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡ−３’（配列番号３５）、‘５−ＧＴＣＡＴＴＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号３６）。
イムノブロット及び免疫蛍光。全細胞タンパク質を、２５０mM ＮａＣｌ含有溶解バッファー（２５０mM ＮａＣｌ、０．１% ＮＰ４０、５mM ＥＤＴＡ、１０mM Ｎａ３ＶＯ４、１０mM ＮａＦ、５mM ＤＴＴ、３mM Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤錠剤、Roche））中で抽出した。タンパク質抽出物（５０μg）を４−１２% ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で流し、４℃でニトロセルロース膜上にトランスファーした。遮断後、膜を、室温で一晩、一次抗体とインキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス又は抗ウサギ（Southern Biotechnology）抗体を、次に、１時間の間、インキュベートし、増強されたＥＣＬ検出系を用いて明らかにした。ＨＩＶＮＤＫを用いた３日の感染後（感染多重度１）、ＰＨＡ／ＩＬ−２刺激した末梢血リンパ球を、１０μMの５クロロメチルフルオレセインジアセテート（Cell Tracker Green CMFDA、Invitrogen）を用いて染色し、非感染リンパ芽球と４８時間にわたり共培養した。細胞を、次に、４%パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３０分間にわたり固定し、ＰＢＳ中の０．１% ＳＤＳ中で透過性化し、ＦＣＳと２０分間にわたりインキュベートした（以前に記載された通り６５）。示した抗血清を、１mg/ml ＢＳＡを含むＰＢＳ中での免疫検出のために使用し、InvitrogenからのAlexa 546（赤色）蛍光色素に抱合したヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて明らかにした。細胞を、蛍光共焦点顕微鏡法により、Zeiss LSM510上で、６３×対物レンズを使用して分析した。０．２μM増分での光学的断面のＺ系列を取得した。画像デコンボリューション後、相互作用する細胞の三次元画像の再構築を、Imaris 5.7 Software（Bitplane AG）のIsoSurface機能を使用して実施した。
ウイルス及び偽ウイルスコンストラクト。野生型Ｘ４、Ｒ５及び耐性ＨＩＶ−１のウイルスストックを、以前に記載された通りに４３、６６、ウイルスをコードするプラスミドを用いた２９３Ｔのトランスフェクション後に得た。ＨＩＶ−１感染の標準化を、Alliance HIV-1 P24抗原ＥＬＩＳＡアッセイ（PerkinElmer）を用いて達成した。
細胞外ＡＴＰの測定。ＨＩＶ−１を用いた共培養又は感染の間でのＡＴＰ放出を、Enliten（登録商標）ＡＴＰアッセイ系（Promega）を使用して、製造者により記載される通りに決定した。発光を、３秒の時間間隔にわたる積分により、ルミノメーターFluostar OPTIMA（BMG Labtech）を使用して測定した。
半融合及び細胞間融合アッセイ。ＨｅＬａ Ｅｎｖ＋細胞及びＨｅＬａ ＣＤ４＋細胞を、それぞれ、半融合分析のために、１μMの１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸（DiIC18(3)、Invitrogen）及び１０μMの５−クロロメチルフルオレセインジアセテート（Cell Tracker Green CMFDA、Invitrogen）、又は、細胞間融合分析のために、それぞれ、１０μMの５−クロロメチルフルオレセインジアセテート（Cell Tracker Green CMFDA、Invitrogen）及び１０μMの５−，６−，４−クロロメチルベンゾイルアミノテトラメチルローダミン（CellTracker（商標）Orange CMTMR， Invitrogen）を用いて染色した。細胞を、次に、単独で、又は、１：１比率で一緒に、２４時間にわたり、１０% ＦＣＳ、２mM Ｌ−グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen）を添加したダルベッコ改変イーグル培地中で、示した濃度のプリン作動性受容体阻害剤の非存在又は存在において培養した。ＨＩＶ−１エンベロープにより媒介される半融合及び細胞間融合に対するこれらの阻害剤の効果を、蛍光顕微鏡法により評価した。
ウイルス−細胞融合についてのβガラクトシダーゼアッセイ。ＨＩＶ−１末端反復配列（ＬＴＲ）の制御下で、ＣＤ４ならびにＬａｃＺ遺伝子を用いて安定的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ−ＣＤ４）を、５００mg/mlのＧ４１８を含む培地中で選択した。ウイルス−細胞融合を、ＨｅＬａ−ＣＤ４細胞を使用して評価した。３日の感染後、細胞を溶解し、βガラクトシダーゼ活性を、増強されたβガラクトシダーゼアッセイキット（CPRG、Gene Therapy Systems）を使用して測定した。
原形質膜の脱分極の検出。ＰＨＡ／ＩＬ−２刺激されたヒトリンパ芽球を、３００nMのDiBac4(3)（Invitrogen）を用いて、２０分間にわたり３７℃で染色した。細胞を、次に、ＨＩＶＮＤＫを（感染多重度１で）用いて１時間にわたり感染させた。本発明者らは、次に、蛍光強度の増加を測定し、フローサイトメトリーにより脱分極細胞を明らかにした。ヨウ化プロピジウム取り込みを使用して、壊死細胞を除外し、非壊死細胞における原形質膜の脱分極を評価した。同じ手順を使用し、本発明者らは、ＨＩＶ−１エンベロープにより誘導される原形質膜の脱分極を分析した。
患者。末梢血サンプルを、健康な及びＨＩＶ−１感染した個人（全て男性、平均年齢３６歳）から得て、彼らは、高度に活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）について未感作であり、血漿中ウイルス量＞２０，０００コピー/mlを伴った、又は、ＨＡＡＲＴを受けており、ウイルス量＜５，０００コピー/mlを伴った。血漿中ＨＩＶ−１ ＲＮＡレベルを、Abbott Real-time HIV-1アッセイにより、製造者の指示（Abbott Molecular）に従って決定した。ＨＩＶ−１感染患者のＰＢＭＣを、日常的な臨床管理のためのＨＩＶ ＲＮＡ定量化が意図される残留サンプルから得て、健康なドナー又はＨＩＶ血清陽性の個人のいずれかからのヘパリン化血液のFicoll/Hypaque（Amersham Biosciences AB, Uppsala、Sweden）遠心により単離し、４%パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中、ｐＨ７．２）を用いて固定した。血漿中に検出不可能なウイルスを有するＨＡＡＲＴ処置患者からのＰＢＭＣを、エクスビボ実験のために使用した。これらのエクスビボ実験の間に産生される内因性ウイルスの量を、Vironostika HIV-1 Antigenアッセイを使用することにより、製造者の指示（Biomerieux）に従ってモニターした。
免疫組織化学的分析。腋窩リンパ節からの生検を、National Institute for Infectious Disease<<Lazzaro Spalanzani>>の治験審査委員会による承認後、イタリア及びＥＵの法規に従って得た。パラフィン中のヒト組織切片を、脱パラフィンし、再水和し、１０mMクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中での高温抗原回復に供した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３% Ｈ２Ｏ２により遮断した。Ｐ２Ｙ２（Alomone labs）又はＰｙｋ２Ｙ４０２＊（Abcam）に対するウサギ抗体及びビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧを、組織切片とインキュベートした。前もって形成されたホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（Biogenex）を用いて得られる免疫反応産物を、発色基質としてのアミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）及び０．０１% Ｈ２Ｏ２（Biogenex）を使用して明らかにした。切片を、次に、メイヤーの酸ヘマラム中で対比染色した。ＨＩＶ感染患者からのリンパ節及び脳皮質切片が、３人の独立した観察者により、光顕微鏡を使用して半定量的に評価された。各々のスライドについて、最低限１０視野を、４０×倍率で検証した。各々の標本上でのＰｙｋ２及びＰ２Ｙ２発現の程度を記載するために、０〜３の間に含まれる指数を、切片上に存在する陽性細胞のパーセンテージに基づき、盲検的に割り当てた（０〜５%について０；５〜２５%について１；２５〜７５%について２；及び７５〜１００%について３）。
統計分析。統計的有意性を決定するために、スチューデントのｔ検定をＰ値の算出のために使用した。
結果：
標的細胞からのＡＴＰ放出は、ＨＩＶ−１感染に関与する：なぜなら、膜応力は、哺乳動物細胞からのＡＴＰ放出を誘導することができるため、本発明者らは、ＨＩＶ−１感染が宿主細胞からのＡＴＰ放出を誘発しうると推測した。本発明者らは、Ｘ４向性ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶＮＬ４３）を用いたヒト細胞の感染（それは、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４、ＨＩＶ−１の受容体及び共受容体の発現に依存する）が、最初の２時間の感染の内に、ＡＴＰの迅速な放出に導くことを見出した（図１ａ）。そのアンタゴニストＡＭＤ３１００を用いたＣＸＣＲ４の阻害が、ＡＴＰ放出を防止し、非毒性ＡＴＰ分解酵素アピラーゼ（補足情報、図Ｓ１ａ，ｂ）の添加が、ＨＩＶ−１感染を防止した（図１ｂ）。ＣＤ４／ＣＸＣＲ４発現細胞と、原形質膜にＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質複合体（Ｅｎｖ）を発現する細胞との共培養は、ＡＴＰ放出も起こし、細胞は複合体形成に関与した（図１ｃ）。アピラーゼは、２つの相互作用する細胞の間でのアクチン重合により明らかにされた複合体形成を消失させた（図１ｄ）。細胞からのＡＴＰの放出は、剪断応力及び浸透不均衡への共通の応答を構成し、機械受容ｐａｎｎｅｘｉｎ−１ヘミチャネルを通じて媒介されうる。実際に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１は、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球（表面上にＥｎｖを発現する）と非感染リンパ芽球の間での接触部位で濃縮され（図１ｅ）、２つの相互作用する細胞の間で検出されるウイルス学的シナプスに関連付けられる（図１ｆ）ことが見出された。小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるｐａｎｎｅｘｉｎ−１の枯渇は、ＨＩＶ−１感染の間での宿主細胞からのＡＴＰの放出を阻害した（図１ｇ、ｈ）。また、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１枯渇又はその化学的阻害は、ＨＩＶ−１感染及びＣＤ４／ＣＸＣＲ４とＥｎｖ発現細胞の間での融合を減少させた（図１ｈ、補足情報Ｓ１ｃ−ｅ）。このように、細胞外ＡＴＰ放出は、ＨＩＶ−１と宿主細胞の間でのＥｎｖ依存的な相互作用において主要な役割を果たす。
プリン作動性受容体は、ウイルス取り込みに寄与する：細胞外ＡＴＰは、異なるプリン作動性受容体により感知される共通の危険シグナルを構成する。プリン作動性受容体の一般的な阻害剤は、スラミン、ピリドキサール−リン酸−６−アゾフェニル−２’，４’−ジスルホネート（ＰＰＡＤＳ）、及び酸化ＡＴＰ（ＯｘＡＴＰ）を含み、活性化Ｔリンパ芽球におけるＸ４向性ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶＮＤＫ）及びＲ５向性ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶＢａＬ）の両方の複製を遮断した（図２ａ及び補足情報、図Ｓ２ａ）。プリン作動性受容体アンタゴニストは、また、マクロファージ（補足情報、図Ｓ２ｂ、ｃ）又は樹状細胞（補足情報、図Ｓ２ｄ、ｅ）におけるＲ５向性ＨＩＶ−１の複製及びＣ８１６６ Ｔ白血病細胞（補足情報、図Ｓ３ａ−ｃ）における臨床的ＨＩＶ−１分離株の複製を遮断した。
ＣＤ４／ＣＸＣＲ４ならびにＴａｔ誘導性β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）レポーターを発現するように操作された子宮頸部上皮（ＨｅＬａ）細胞は、リンパ向性ＨＩＶ−１（ＨＩＶＮＬ４３ＷＴ）との感染時にβ−Ｇａｌを発現した。そのような細胞は、また、内因性Ｅｎｖ遺伝子が水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のものにより置換され（ＨＩＶＮＬ４３□Ｅｎｖ）、ウイルスがＣＤ４／ＣＸＣＲ４を欠く細胞に感染することを許す同系ウイルスによる感染時にβ−Ｇａｌを発現した。プリン作動性受容体アンタゴニストは、ＶＳＶ偽型ＨＩＶ−１によるものより、Ｅｎｖ発現によりβ−Ｇａｌ誘導を阻害する際により効率的であったが（図２ｂ及び補足情報、図Ｓ２ｆ）、それらが、ＨＩＶ−１感染の受容体依存的な側面に主に影響を及ぼすことを示している。プリン作動性受容体阻害は、また、ＣＤ４／ＣＸＣＲ４陽性細胞とＥｎｖ発現細胞の間での半融合（それは、相互作用する細胞の間での脂質の交換を起こす）及び細胞間融合（シンシチウム形成）を低下させた（図２ｃ）。最後に、プリン作動性受容体アンタゴニストは、細胞中へのＨＩＶ−１の侵入を防止したが、宿主細胞内でのＲＮＡ（図２ｄ）及びＤＮＡ（図２ｅ）レベルでのＨＩＶゲノムの検出時でのそれらの阻害効果により明らかにされる通りである。対照的に、プリン作動性受容体の阻害は、ＶＳＶ偽型ＨＩＶ−１の複製に影響を及ぼさなかった（図２ｄ、ｅ）。これらの結果は、プリン作動性受容体が、適した標的細胞中へのＨＩＶ−１のＥｎｖ媒介性内在化のために決定的であることを実証する。
プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ２は、ＨＩＶ−１感染を調節する：ＨＩＶ−１内在化に関与する主なプリン作動性受容体を同定するために、本発明者らは、Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ７、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６受容体（それらはＨＩＶ−１標的細胞中で発現される）をコードするｍＲＮＡを、ｓｉＲＮＡにより、系統的に枯渇させた（補足情報、図Ｓ４ａ−ｇ）。Ｐ２Ｙ２の枯渇は、Ｅｎｖ誘発性のシンシチウム形成における最も強い低下を一貫してもたらした（補足情報、図Ｓ４ｈ）。同様に、免疫反応性Ｐ２Ｙ２が、リンパ芽球組織において（図３ａ、ｃ）、前頭皮質（図３ｂ、ｄ）において、ならびに未処置ＨＩＶ−１キャリアからの循環白血球において（図３ｅ）より高いレベルで発現した。Ｐ２Ｙ２は、また、ＨＩＶ−１感染の間に、インビトロで迅速に増加することが見出された（図３ｆ）。また、本発明者らは、蛍光顕微鏡法により、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間での接触部位でＰ２Ｙ２の分極を検出した（図３ｇ−ｋ）。細胞内Ｐ２Ｙ２分布は、ＨＩＶ−１糖タンパク質ｇｐ４１（図３ｋ）及び共受容体ＣＤ４も含む特徴的な環状構造（図３ｉ−ｋ）を明らかにし、Ｐ２Ｙ２が、ＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間に形成されるウイルス学的シナプスで蓄積したことを示している。Ｐ２Ｙ２のノックダウン（図３ｌ）は、ＨＩＶ−１感染、ならびにＥｎｖ媒介性の半融合及び融合を低下させたが（図３ｍ）、Ｐ２Ｙ２がＨＩＶ−１標的細胞の感染性を制御することができることを示唆する。これらの結果は、Ｐ２Ｙ２ ｃＤＮＡを用いた標的細胞のトランスフェクション後に観察されるＨＩＶ−１エンベロープの融合活性における増加により確認された（図３ｎ及び補足情報、図Ｓ４ｉ）。また、Ｐ２Ｙ２特異的ｓｉＲＮＡの融合阻害効果は、非干渉可能なＰ２Ｙ２ ｃＤＮＡを用いたトランスフェクションにより克服されたが、しかし、非機能的なＰ２Ｙ２変異体（Ｐ２Ｙ２／４Ａ）を用いてはされず（図３ｎ及び補足情報、図Ｓ４ｉ）、ＨＩＶ−１感染へのこのプリン作動性受容体の寄与を強調している。
Ｐ２Ｙ２は原形質膜の脱分極を誘発し、ＨＩＶ−１感染を許す：ＨＩＶ−１との感染は、原形質膜の一過性の脱分極に関連付けられる（図４ａ）。細胞を、７０mM ＫＣｌを含む培地中で３時間にわたり培養することによる原形質膜Ｋ＋勾配の一過性の消失は、膜の脱分極を強く誘導し（図４ｂ、ｃ）、ＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００の存在において低下されるＥｎｖ＋細胞及びＣＤ４＋／ＣＸＣＲ４＋細胞の融合を増強したが（図４ｄ）、ＨＩＶ−１標的細胞の原形質膜の脱分極が、Ｅｎｖ依存的な融合事象のために要求されることを実証する。ＨＩＶ−１感染により誘導される原形質膜の脱分極は、また、いくつかの異なるプリン作動性受容体アンタゴニストの、ＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００の添加、又は、アピラーゼを用いたＡＴＰ枯渇により消失したが（図４ｅ）、プリン作動性受容体が、ＨＩＶ−１感染の間に観察される原形質膜の脱分極に関与することを示す。この事象におけるＰ２Ｙ２の関与を決定するために、本発明者らは、非変異Ｐ２Ｙ２ ｃＤＮＡを用いて又は非機能的Ｐ２Ｙ２変異体（Ｐ２Ｙ２／４Ａ）を用いてＣＤ４＋／ＣＸＣＲ４＋をトランスフェクトし、Ｐ２Ｙ２の過剰発現（しかし、非機能的Ｐ２Ｙ２変異体の過剰発現ではない）が、Ｅｎｖ＋細胞と共培養されたＣＤ４／ＣＸＣＲ４＋からの原形質膜の脱分極を増加させることを明らかにした（図４ｆ）。これらの結果は、非機能的Ｐ２Ｙ２変異体（Ｐ２Ｙ２／４Ａ）のカルボキシ末端テールにおいて変異されたＳｒｃホモロジードメイン３結合部位（ＰｘｘＰ）が、原形質膜の脱分極のために要求され、Ｅｎｖ依存的な融合事象に寄与することを実証する。
Ｐｙｋ２のＰ２Ｙ２依存的な活性化が、ＨＩＶ−１感染のために要求される：Ｐ２Ｙ２（しかし、その変異体Ｐ２Ｙ２／４Ａではない、上を参照のこと）は、プロリンリッチチロシンキナーゼ２（Ｐｙｋ２）を活性化するポリタンパク質複合体の形成に関与する。本発明者らは、Ｐｙｋ２のチロシン残基４０２上の活性化（自己）リン酸化（Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊）が、Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４／ＣＸＣＲ４＋ ＨｅＬａ細胞の間での複合体の形成の間に増加することを見出した（図５ａ）。さらに、Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊は、そのような複合体の間（図５ｂ、ｄ）及びＨＩＶ−１感染リンパ芽球と非感染リンパ芽球の間（図５ｃ、ｅ）の接触部位での環状構造において濃縮された。Ｐｙｋ２のリン酸化は、また、未処置ＨＩＶ−１キャリアからのリンパ節において（図５ｆ、ｈ）、ＨＡＥを伴う患者からの前頭皮質において（図５ｇ、ｉ）、ＨＩＶ−１キャリアからの循環リンパ球において検出可能であり、ウイルス量と相関した（図５ｊ）。さらに、高度に活性な抗レトロウイルス治療は、ＨＩＶ−１感染ドナーからのリンパ球における免疫検出可能なＰｙｋ２Ｙ４０２＊を低下させた（図５ｋ）。Ｐ２Ｙ２の枯渇は、複合体形成の間でのＰｙｋ２のリン酸化を低下させ（図５ａ）、共培養された Ｅｎｖ＋細胞とＣＤ４／ＣＸＣＲ４＋細胞の間の接触部位でのＰｙｋ２Ｙ４０２＊の分極を阻害した（図５ｉ）。Ｐｙｋ２枯渇は、また、ＨＩＶ−１感染ならびにＥｎｖ媒介性の半融合及び融合を減少させた（図５ｍ、ｎ）。まとめると、これらの結果は、Ｐｙｋ２がＨＩＶ−１感染の決定的なエフェクターであり、Ｐ２Ｙ２の下流で作動することを示す。
本論文において描写する仮説上のカスケード（ｐａｎｎｅｘｉｎ−１→ＡＴＰ→Ｐ２Ｙ２→Ｐｙｋ２）のタンパク質成分の各々の枯渇は、標準的なＨＩＶ−１分離株による（図１ｈ、２ｂ−ｅ、３ｍ、５ｎ）ならびに選択的な点変異により逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤に対して耐性となったウイルスによる感染を低下させた（図６ａ）。同様に、プリン作動性受容体アンタゴニストは、遺伝的に操作された治療耐性ＨＩＶ−１変異体（図６ｂ）及び三治療選択ウイルス（図６ｃ）による感染を阻害することができ、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１→ＡＴＰ→Ｐ２Ｙ２→Ｐｙｋ２カスケードの阻害が、従来の治療が失敗する条件下で抗レトロウイルス効果を媒介することができる可能性と一致する。また、プリン作動性受容体アンタゴニストは、ＨＩＶ−１により感染された活性化ＣＤ４＋Ｔリンパ芽球の死亡を低下させたが（図６ｄ）、Ｐ２Ｙ２シグナル伝達の妨害が免疫防御効果を与えることを示唆する。
考察：
感染プロセスの多くの初期段階が宿主の膜変化に関連付けられ、ヌクレオチドがウイルス感染の結果として放出されるのか否か、及び、細胞外ヌクレオチドが、宿主細胞に影響を及ぼすシグナルを通じてウイルスライフサイクルに影響を与えうるのか否かを評価する試験はない。本明細書において、本発明者らは、ＡＴＰが、ＨＩＶ−１感染の初期段階の間に細胞外環境中に放出されること、及び、ＡＴＰが効率的なウイルス取り込みのために要求されることを示す。感染プロセスの初期段階の間に、ＡＴＰの放出が、免疫系に対する効果により、ウイルスクリアランス又は感染の持続性を決定することができる。感染の間での大量のＡＴＰ放出が、免疫エフェクターに「危険」シグナルを送達することができることが報告された。細胞外ＡＴＰはインフラモソーム（ｉｎｆｌａｍｍｏｓｏｍｅ）を活性化しうるが、それは、前炎症性サイトカインＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８、及びＩＬ−３３のカスパーゼ１依存的な成熟及び分泌に関与し、又は、好中球の遊走およびファゴサイトーシスを刺激する。報告によれば、細胞外ＡＴＰは、細胞内病原体を直接的に殺すことにより、感染を阻害することができる。ＡＴＰ放出は、宿主からの病原体のクリアランスに寄与することができるが、細胞外ＡＴＰは、また、病原体の生存に関与することができる。このように、最近の試験は、ＯｐｐＡ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ（マイコプラズマ・ホミニス）パーミアーゼの基質結合ドメイン）が、宿主細胞からのＡＴＰの放出を誘導することにより微生物の細胞外生存を増加させることを明らかにした。また、アピラーゼを用いたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ（マイコバクテリウム・アビウム）感染細胞の処理は、桿菌の細胞内生存を減少させた。本発明者らの結果は、それらが、ＨＩＶ−１宿主細胞により放出される細胞外ＡＴＰが、ＨＩＶ−１感染の確立を支持することを実証する点で、これらの試験とは異なる。このように、ＨＩＶ−１標的細胞からの感染プロセスの間に迅速に放出されるＡＴＰは、「危険」シグナルとしてだけでなく、しかし、また、ウイルス取り込みに寄与するシグナル伝達分子としての役割も果たす。
本試験において、本発明者らは、ＨＩＶ−１誘導性ＡＴＰ放出及びウイルス感染に寄与するＡＴＰ媒介性シグナル伝達事象に関与するタンパク質の同定を報告する。このように、本発明者らは、ＣＤ４＋宿主細胞の効率的なＨＩＶ−１感染のために要求されるいくつかの新規タンパク質を同定し、ＨＩＶ−１が、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１ヘミチャネル（恐らくは、宿主細胞膜の機械的応力に起因する）を通じた細胞外環境中へのＡＴＰ放出を刺激することができることを示した。ＡＴＰは、次に、オートクライン／パラクラインの様式で作用し、プリン作動性受容体、特にＰ２Ｙ２（それは、７回膜貫通型アンカーＧタンパク質共役受容体であり、ウイルス学的シナプスへのプロリン／チロシンキナーゼＰｙｋ２のリン酸化／再局在化を誘導することができる）を活性化する。実際に、ｐａｎｎｅｘｉｎ−１、Ｐ２Ｙ２、及びＰｙｋ２は、全て、Ｅｎｖ含有膜とＣＤ４／ＣＸＣＲ４含有膜の間の接触部位に動員されたが、それらが、ウイルス学的シナプス内で作用し、膜間融合を増強し、感染プロセスに関与し、細胞から細胞へのウイルス伝達を促進するシグナルを伝達することを示唆する（図６ｅ）。
現在、Ｐ２Ｙ２がＨＩＶ−１感染を調節する正確な機構は、分かりにくいままである。しかし、本発明者らは、ＨＩＶ−１エンベロープとその共受容体の間での相互作用後、Ｐ２Ｙ２が活性化され、フィラミンＡ（安定な受容体／共受容体複合体の形成に関与するアクチン細胞骨格のモジュレーター）と直接的に相互作用しうることを見出した。Ｐ２Ｙ２は、また、間接的に、そのＳＨ３結合（ＰｘｘＰ）部位を通じて、チロシン４０２上のＰｙｋ２のリン酸化（Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊）を制御することができ、この事象は、ウイルス学的シナプスへのそのリン酸化／再配置を誘導しうる。Ｐｙｋ２は、アクチン細胞骨格の再編成に関与し、ケモカイン刺激に応答して、マクロファージの分極及び遊走に寄与する複数のシグナル伝達事象を調節する。Ｐｙｋ２は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ媒介性融合を制御することができる。ＨＩＶ−１感染の間、Ｐｙｋ２は、Ｘ４及びＲ５向性株からのＥｎｖバリアントとＨＩＶ−１標的細胞上のＥｎｖ受容体（ＣＤ４及びケモカイン受容体）の間での相互作用後にリン酸化される。本発明者らが、ＨＩＶ−１感染の間にインビトロ及びインビボで検出したＰｙｋ２の活性化（自己）リン酸化（Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊）は、ケモカイン刺激に応答して、又は、細胞内カルシウム濃度を上昇させ、Ｓｒｃファミリーキナーゼ及びアクチン相互作用タンパク質を含むシグナル伝達複合体の形成を調節する刺激により誘導されうる。本明細書において、本発明者らは、Ｐｙｋ２のリン酸化（Ｐｙｋ２Ｙ４０２＊）のために要求される上流事象として、プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ２のＡＴＰ媒介性刺激を同定した。Ｐ２Ｙ２活性化は、ヌクレオチド結合後にカルシウム流入を調節することが公知であり、また、チロシンキナーゼＳｒｃを含むポリタンパク質複合体において会合することによりＰｙｋ２活性を制御しうる。本発明者らはＰ２Ｙ２活性化がＰｙｋ２Ｙ４０２＊を誘導することを実証したが、Ｐ２Ｙ２活性化及びＰｙｋ２の分極／リン酸化を連結する厳密な機構は分かりにくいままである。さらに、今後の研究では、原形質膜の脱分極（ＨＩＶ−１感染のために必須である）が、Ｐ２Ｙ２及びＰｙｋ２の活性化時にどのように誘導されるのかを探究しなければならない。
本発明者らが本試験において描写した分子カスケード（ｐａｎｎｅｘｉｎ−１→ＡＴＰ→Ｐ２Ｙ２→Ｐｙｋ２）の構成要素のいずれかの阻害は、ウイルス侵入のレベルでＨＩＶ−１ライフサイクルを妨害しうる。このように、ｐａｎｎｅｘｉｎヘミチャネルの阻害、細胞外ＡＴＰの酵素的枯渇、Ｐ２Ｙ２受容体の遮断、又はＰｙｋ２キナーゼ活性の阻害は、それが局所的（例えば、局所ゲルの適用による）又は全身的（理想的には、経口で利用可能な薬物を用いて）であるかに関わらず、ＨＩＶ−１感染の阻害のための有用な標的でありうる。
参考文献
本願を通して、種々の参考文献が、本発明が関係する最先端を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により、本明細書により組み入れられる。

Claims (4)

  1. ＨＩＶ−１感染の処置又は防止における使用のためのＰ２Ｙ２受容体アンタゴニスト及びＰ２Ｙ２発現の阻害剤からなる群より選択されるプリン作動性シグナル伝達経路の成分の遮断薬剤であって、ここでＰ２Ｙ２受容体アンタゴニストは、抗体及びアプタマーからなる群より選択され、そしてＰ２Ｙ２発現の阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子、小分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ及びリボザイムからなる群より選択される、遮断薬剤。
  2. ＨＩＶ−１感染の処置又は防止における使用のための、請求項１記載の遮断薬剤を含む医薬的組成物。
  3. 局所製剤として製剤化されている、請求項２記載の医薬的組成物。
  4. ゲルである、請求項３記載の医薬的組成物。
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