JP2023062192A - 筋特異的核酸調節エレメント並びにその方法及び使用 - Google Patents

筋特異的核酸調節エレメント並びにその方法及び使用 Download PDF

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Vandendriessche Thierry
チュア，マリニー
Chuah Marinee
デブレサー，ピーテル
De Bleser Pieter
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Abstract

【課題】遺伝子の筋特異的発現を増強することができる核酸調節エレメント、これら調節エレメントを用いる方法、及びその使用を提供する。更に、これら調節エレメントを含んでなる発現カセット、ベクター及び医薬組成物を提供する。【解決手段】特定の配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列又はその機能的フラグメントであって、それが由来する配列からの少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５の連続ヌクレオチドを含み、由来配列中に存在する転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも５つを含む機能的フラグメントを含んでなり、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントを提供する。【選択図】なし

Description

分野
本発明は、遺伝子の筋特異的発現を増強することができる核酸調節エレメント、これら調節エレメントを用いる方法、及びその使用に関する。本発明は更に、これら調節エレメントを含んでなる発現カセット、ベクター及び医薬組成物を包含する。本発明は、特に、遺伝子治療(より具体的には筋指向遺伝子治療)を利用する適用及びワクチン接種目的に有用である。
背景
筋肉は遺伝子治療について魅力的な標的である。筋肉への遺伝子送達は、例えば筋ジストロフィーの処置を目的として、筋構造タンパク質(例えば、ジストロフィン及びサルコ
グリカン)の発現を増強するために使用することができる。加えて、筋肉は、糖尿病、ア
テローム性動脈硬化、血友病、ガンなどのために非筋性の分泌/調節経路タンパク質を発
現させる治療プラットフォームとして利用することができる。
導入遺伝子を筋肉に送達する努力は、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びアデノ関連ウイルス(AAV)に由来するベクター並びにプラスミドに注がれてきた。
アデノウイルスベクターは、比較的大きいクローニング能力を有し、高力価で製造することができ、筋肉の比較的効率的な形質導入を示す。不運なことに、これらベクターは、ウイルス性タンパク質及び幾らかの導入遺伝子タンパク質に対して頑強な細胞性免疫応答を惹起することがある。更に、これらベクターは、用量を制限することになり、かつ危険であり得る炎症性免疫応答の原因となり得る生来の免疫系の迅速な活性化を誘起することがある。アデノウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれないので、長期間存続する能力は不明である。レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターは標的細胞のゲノムに安定的に組み込まれ、おそらく、持続的な遺伝子移入を可能とする。レンチウイルスベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に形質導入することができる一方、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)に由来する従来のレトロウイルスベクターは、分裂細胞のみ
に形質導入することができる。結果として、レンチウイルスベクターは非分裂性の骨格筋細胞の形質導入に使用することができるが、骨格筋細胞は、レトロウイルスベクターの直接注入による形質導入に対しては不応性である。とはいえ、骨格筋のレンチウイルスによる形質導入でさえ然程効率的でない。裸のプラスミドDNAは筋肉へ遺伝子を移入する顕著
な能力を示す。プラスミドは極僅かな免疫原性及び毒性しか示さず、非常に大きなクローニング能力を有する。プラスミドの主な短所は、典型的な送達プロトコル下での比較的乏しいトランスフェクション効率である。プラスミドの保持は別の１つの重要な考慮事項である。
アデノ関連ウイルスベクター(AAV)は、筋指向遺伝子治療に関して最も有望な遺伝子送
達ビヒクルである。天然の筋細胞向性、長期持続性の導入遺伝子発現、複数のセロタイプ及び極僅かな免疫応答のため、AAVベクターは筋指向遺伝子治療に好都合である。AAVベクターは、局所性、領域性及び全身性投与により骨格筋及び心筋の両方に送達することができる。
しかし、幾つかの遺伝子送達アプローチの効率及び安全性に関して懸念が残る。主要な制限要因は、不十分な及び/又は一過性の導入遺伝子発現レベル、及び望んでいない細胞
タイプでの不適切な導入遺伝子発現である。具体的には、抗原提示細胞(APC)における偶
然の導入遺伝子発現は、遺伝子改変細胞及び/又は治療用導入遺伝子産物に対する不都合
な免疫応答(これは結果的に長期の遺伝子発現を妨げる)のリスクを増大させることが示さ
れている。
従来のベクター設計法は、無計画の試行錯誤アプローチに依拠しており、試行錯誤により、発現レベルを増強するように転写エンハンサーとプロモーターとが組み合わされた。このアプローチは、時に有効であり得たが、対象の遺伝子の発現レベルの僅かな増大若しくは増大なし及び/又は組織特異性の喪失をもたらす非生産的な組合せを生じることが多
かった。更に、この従来アプローチは、進化上保存された調節モチーフを発現モジュールに含ませることの重要性(臨床適用に特に関連性がある)を考慮していなかった。
改変された距離差マトリクス(DDM)-多次元尺度構成法(MDS)ストラテジ(De Bleserら，2007 Genome Biol 8, R83)に依存する計算論的アプローチは、肝臓(WO 2009/130208)及び
心臓(WO2011/051450)における頑強な組織特異的発現に関連する進化上保存された転写因
子結合部位(TFBS)モチーフのクラスターのインシリコでの同定に有用であることが証明されている。
当該分野において、筋肉への安全で効率的な遺伝子送達の必要性が依然として存在する。
要旨
本発明者らは、改変DDM-MDSストラテジ(De Bleserら，2007)と増強スクリーニングストラテジとの組合せに依拠して、高発現の筋特異的遺伝子と関連する進化上保存された転写因子結合部位(TFBS)モチーフ(本明細書において核酸調節エレメントと定義する)を同定した。実験の項に示すように、本発明者らは、心臓及び骨格筋の両方での遺伝子発現を特異的に増強する核酸調節エレメント及び骨格筋特異的核酸調節エレメントを同定することができた。これら調節エレメントは、その後、効率的で組織特異的な遺伝子発現をインビボで生じることが確証された。よって、このアプローチにより、治療効力を最大化しつつ、より低い、したがってより安全なベクター用量の使用が可能になる。
したがって、本発明は、以下の観点を提供する：
観点１：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列の機能的フラグメントであって、それが由来する配列からの少なくとも20、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200又は少なくとも250の連続ヌクレオチドを含み、該由来配列中に存在する転写因子結合部位(TFBS)の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも10又は少なくとも15を含む機能的フラグメントを含んでなるか、該機能的フラグメントから本質的になるか又は該機能的フラグメントからなる、筋特異的遺伝子発現を増強する核酸調節エレメント。
観点２：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列の機能的フラグメントであって、それが由来する配列からの少なくとも20、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200又は少なくとも250の連続ヌクレオチドを含み、該由来配列中に存在する転写因子結合部位(TFBS)の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも10又は少なくとも15を含む機能的フラグメントを含んでなる、心筋及び骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための観点１に従う核酸調節エレメント。
観点３：配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列の機能的フラグメントであって、それが由来する配列からの少なくとも20、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200又は少なくとも250の連続ヌクレオチドを含み、該由来配列中に存在する転写因子結合部位(TFBS)の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも10又は少なくとも15を含む機能的フラグメントを含んでなる、骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための観点１に従う核酸調節エレメント。
観点４：配列番号１の33位～58位のヌクレオチド配列；配列番号１の90位～142位のヌ
クレオチド配列；配列番号１の143位～233位のヌクレオチド配列；配列番号１の240位～310位のヌクレオチド配列；配列番号１の90位～233位のヌクレオチド配列；配列番号５の47位～130位のヌクレオチド配列；配列番号５の252位～293位のヌクレオチド配列；配列番号５の330位～450位のヌクレオチド配列；配列番号10の10位～180位のヌクレオチド配列(すなわち、配列番号37)；配列番号10の190位～240位のヌクレオチド配列(すなわち、配列番号38)；配列番号10の241位～300位のヌクレオチド配列(すなわち、配列番号39)；配列番号10の241位～360位のヌクレオチド配列(すなわち、配列番号41)；配列番号10の380位～420位のヌクレオチド配列(すなわち、配列番号40)；又は前記配列のいずれかと少なくとも95％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか又は該選択配列からなる、観点１、２又は３に従う核酸調節エレメント。
観点５：配列番号１の33位～310位のヌクレオチド配列；配列番号５の47位～450位のヌクレオチド配列；配列番号10の10位～420位のヌクレオチド配列、又は前記配列のいずれ
かと少なくとも95％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、観点１～４のいずれか１つの従う核酸調節エレメント。
観点６：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、観点１～５のいずれか１つの従う核酸調節エレメント。
観点７：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、心筋及び骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための観点１、２又は４～６のいずれか１つに従う核酸調節エレメント。
観点８：配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための観点１、３～６のいずれか１つに従う核酸調節エレメント。
観点９：配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、これらの機能的フラグメントであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12若しくは配列番号13を含む機能的フラグメント、又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、観点１～８のいずれか１つに従う核酸調節エレメント。
観点10：配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、これらの機能的フラグメントであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６を含む機能的フラグメント、又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる観点１、２、４～７、９のいずれか１つに従う核酸調節エレメント。
観点11：配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、これらの機能的フラグメントであって、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12若しくは配列番号13を含む機能的フラグメント、又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる観点１、３～６、８又は９のいずれか１つに従う核酸調節エレメント。
観点12：観点１～11のいずれか１つに規定されるとおりの配列の相補鎖を含んでなるか、該相補鎖から本質的になるか、又は該相補鎖からなる、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメント。
観点13：観点１～12のいずれか１つに従う核酸調節エレメントとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメント。
観点14：1000ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド、より好ましくは600ヌクレオチド、例えば550ヌクレオチド、500ヌクレオチド、450ヌクレオチド、400ヌクレオチド、350ヌクレオチド又は300ヌクレオチドの最大長を有し、配列番号１～13のいずれか１つにより規定される調節エレメント又は観点３～５のいずれか１つに規定されるその機能的フラグメントを依然として含んでなる、観点１～13のいずれか１つに従う核酸調節エレメント。
観点15：核酸発現カセット又はベクターにおける、観点１～14のいずれか１つに従う核酸調節エレメントの、特に該核酸発現カセット又はベクターの筋特異的発現を増強するための、使用。
観点16：プロモーターに作動可能に連結した少なくとも１つ、例えば１つ、２つ、３つ
、４つ、５つ又はそれより多くの観点１～14のいずれか１つに従う核酸調節エレメントを含んでなる核酸発現カセット。
観点17：核酸調節エレメントがプロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結している、観点16に従う核酸発現カセット。
観点18：プロモーターが筋特異的プロモーター、好ましくはデスミン(DES)遺伝子に由
来するプロモーターである、観点16又は17に従う核酸発現カセット。
観点19：導入遺伝子が治療用タンパク質又は免疫原性タンパク質をコードする、観点17又は18に従う核酸発現カセット。
観点20：導入遺伝子が分泌可能タンパク質又は構造タンパク質、例えばジストロフィン若しくはサルコグリカンをコードする、観点17～19のいずれか１つに従う核酸発現カセット。
観点21：イントロン、好ましくはマウス微小ウイルス(MVM)のイントロンを更に含んで
なる、観点16～20のいずれか１つに従う核酸発現カセット。
観点22：ポリアデニル化シグナル、好ましくはシミアンウイルス40(SV40)のポリアデニル化シグナルを更に含んでなる、観点16～21のいずれか１つに従う核酸発現カセット。
観点23：観点１～14のいずれか１つに従う核酸調節エレメント又は観点16～22のいずれか１つに従う核酸発現カセットを含んでなるベクター。
観点24：ウイルスベクター、好ましくはアデノ関連ウイルス(AAV)ベクター、より好ま
しくはAAV9ベクターである観点23に従うベクター。
観点25：非ウイルスベクター、好ましくはプラスミド、ミニサークル又はトランスポゾンベースのベクター、例えばPiggyBacベースのベクター若しくはSleeping Beautyベース
のベクターである観点23に従うベクター。
観点26：観点16～22のいずれか１つに従う核酸発現カセット又は観点23～25のいずれか１つに従うベクターと医薬的に許容され得るキャリアとを含んでなる医薬組成物。
観点27：内科療法において使用するための観点１～14のいずれか１つに従う核酸調節エレメント、観点16～22のいずれか１つに従う核酸発現カセット、観点23～25のいずれか１つに従うベクター又は観点26に従う医薬組成物。
観点28：遺伝子治療、好ましくは筋指向遺伝子治療において使用するための観点１～14のいずれか１つに従う核酸調節エレメント、観点16～22のいずれか１つに従う核酸発現カセット、観点23～25のいずれか１つに従うベクター又は観点26に従う医薬組成物。
観点29：遺伝子治療が筋ジストロフィー(例えば、デュシェーヌ筋ジストロフィー(DMD)/ベッカー筋ジストロフィー(BMD))、筋緊張性ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患(MND)、例えばシャルコー‐マリー‐ツース病(CMT)、脊髄性筋萎縮症(SMA)及び筋萎縮性側索硬化症(ALS)、エメリー‐ドライフス筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)、先天性筋ジストロフィー、先天性ミオパシー、肢帯筋ジストロフィー、代謝性ミオパシー、筋炎症性疾患、筋無力症、ミトコンドリアミオパシー、イオンチャネルの異常、核包膜疾患、心筋症、心肥大、心不全、遠位型ミオパシー、心血管疾患、血友病(血友病Ａ及びＢを含む)及び糖尿病のためのものである、観点28に従う使用のための核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物。
観点30：ワクチン、好ましくは予防用ワクチンとして使用するため、又はワクチン接種療法、好ましくは予防用ワクチン接種に使用するための、観点１～14のいずれか１つに従う核酸調節エレメント、観点16～22のいずれか１つに従う核酸発現カセット、観点23～25のいずれか１つに従うベクター又は観点26に従う医薬組成物。
観点31：
－ 観点16～22のいずれか１つに従う核酸発現カセット又は観点23～25のいずれか１つに従うベクターを筋細胞に導入し；
－ 導入遺伝子産物を筋細胞において発現させる
ことを含んでなる、筋細胞、好ましくは心臓の筋細胞及び/又は骨格筋細胞において導入
遺伝子産物を発現させる方法、好ましくはインビトロ又はエキソビボ法。
図１：核酸調節エレメントの同定及び検証のフロー図。以下の工程を含む計算論的アプローチを用いて核酸調節エレメントを同定した：(１)(例えば、正常ヒト組織のマイクロアレイ発現データの統計解析に基づく)高発現する組織特異的遺伝子の同定；(２)公衆に利用可能なデータベースからの対応するプロモーター配列の抽出；(３)それらが含有する調節モジュール及び転写因子結合部位(TFBS)の同定；(４)次に、高発現遺伝子のゲノムコンテクストを進化上保存されたTFBSクラスター(すなわち、核酸調節エレメント)について検索した。同定した核酸調節エレメントを新規に設計し、構築物中に含ませることによりレポーター遺伝子の発現が増大するかどうかを試験することによりインビボで検証した。 図２：心筋及び骨格筋特異的調節エレメントCSk-SH1(Ａ、配列番号１)、CSk-SH2(Ｂ、配列番号２)、CSk-SH3(Ｃ、配列番号３)のヌクレオチド配列。 図２：心筋及び骨格筋特異的調節エレメントCSk-SH4(Ｄ、配列番号４)、CSk-SH5(Ｅ、配列番号５)及びCSk-SH6(Ｆ、配列番号６)のヌクレオチド配列。 図３は、本明細書に開示のAAV9sc-CSk-SH/Sk-SH-Des-Luc2ベクターの概略図を示す。この発現カセットを自己相補性(sc)アデノ関連ウイルス セロタイプ９(AAV9)にパッケージングした。心筋及び骨格筋特異的デスミン(Des)プロモーターは、ルシフェラーゼ(Luc2)導入遺伝子の転写を調節する。同定した心筋及び骨格筋特異的(CSk-SH)又は筋特異的(Sk-SH)核酸調節エレメントをDesプロモーターの上流にクローニングした。発現カセットは、マウス微小ウイルス(MVM)のイントロン及びシミアンウイルス40(SV40)のポリアデニル化シグナル(pA)を更に含む。発現カセットの側方にはアデノ関連ウイルス セロタイプ２(AAV2)に由来する逆方向末端反復(ITR)が位置する。 図４：左から右へ、AAV9sc-CSk-SH1-Des-Luc2(CSk-SH1)、AAV9sc-CSk-SH2-Des-Luc2(CSk-SH2)、AAV9sc-CSk-SH3-Des-Luc2(CSk-SH3)、AAV9sc-CSk-SH4-Des-Luc2(CSk-SH4)、AAV9sc-CSk-SH5-Des-Luc2(CSk-SH5)又はAAV9sc-CSk-SH6-Des-Luc2(CSk-SH6)ベクターを静脈注射したマウスの心臓組織及び筋組織におけるルシフェラーゼ発現(Ａ)の、核酸調節エレメントを含まないコントロールベクターAAV9sc-Des-Luc2を注射したマウス(コントロール、Csk-SHなし)と比較した差。ルシフェラーゼ発現は、注射９週間後に選択組織においてルシフェラーゼ活性により放出される全光束(ステラジアン当たりの平方センチメートル当たりの秒当たりの光子[光子/秒/cm2/sr]で表す)として測定した。結果を平均±標準誤差として示した：* p<0.05；** p<0.001。 図４：左から右へ、AAV9sc-CSk-SH1-Des-Luc2(CSk-SH1)、AAV9sc-CSk-SH2-Des-Luc2(CSk-SH2)、AAV9sc-CSk-SH3-Des-Luc2(CSk-SH3)、AAV9sc-CSk-SH4-Des-Luc2(CSk-SH4)、AAV9sc-CSk-SH5-Des-Luc2(CSk-SH5)又はAAV9sc-CSk-SH6-Des-Luc2(CSk-SH6)ベクターを静脈注射したマウスの心臓組織及び筋組織におけるLuc mRNAレベル(Ｂ)の、核酸調節エレメントを含まないコントロールベクターAAV9sc-Des-Luc2を注射したマウス(コントロール、Csk-SHなし)と比較した差。Luc mRNAレベルは、実験終了時に、示した組織の生検から抽出したトータルRNAからの定量RT-PCR法(qRT-PCR)により測定した。結果を平均±標準誤差として示した：* p<0.05；** p<0.001。 図5A：左から右へ、AAV9sc-Des-Luc2(コントロール、CSk-SHなし)、AAV9sc-CSk-SH1-Des-Luc2(CSk-SH1)、AAV9sc-CSk-SH2-Des-Luc2(CSk-SH2)、AAV9sc-CSk-SH3-Des-Luc2(CSk-SH3)、AAV9sc-CSk-SH4-Des-Luc2(CSk-SH4)、AAV9sc-CSk-SH5-Des-Luc2(CSk-SH5)又はAAV9sc-CSk-SH6-Des-Luc2(CSk-SH6)ベクターを静脈内注射したマウスの選択組織におけるルシフェラーゼ発現。ルシフェラーゼ発現は、注射９週間後に選択組織においてルシフェラーゼ活性により放出される全光束(ステラジアン当たりの平方センチメートル当たりの秒当たりの光子[光子/秒/cm2/sr]で表す)として測定した。結果を平均±標準誤差として示した。 図5B：コントロールベクターAAV9sc-Des-Luc2(コントロール、CSk-SHなし)を注射したマウスと比較した、(左から右へ)AAV9sc-CSk-SH1-Des-Luc2(CSk-SH1)、AAV9sc-CSk-SH2-Des-Luc2(CSk-SH2)、AAV9sc-CSk-SH3-Des-Luc2(CSk-SH3)、AAV9sc-CSk-SH4-Des-Luc2(CSk-SH4)、AAV9sc-CSk-SH5-Des-Luc2(CSk-SH5)又はAAV9sc-CSk-SH6-Des-Luc2(CSk-SH6)ベクターを静脈内注射したマウスの選択組織におけるLuc mRNAレベル。Luc mRNAレベルは、実験終了時に、示した組織の生検から抽出したトータルRNAからの定量RT-PCR法(qRT-PCR)により測定した。結果を平均±標準誤差として示した。 図６：AAV9sc-CSk-SH1-Des-Luc2(CSk-SH1)(Ａ)又はAAV9sc-CSk-SH5-Des-Luc2(CSk-SH5)(Ｂ)を注射したマウスの異なる器官における形質導入効率。５×109vg/マウスの用量の両構築物について、100ngのゲノムDNAに対するAAVコピー数を決定した。 図７：筋特異的調節エレメントSk-SH1(Ａ、配列番号７)、Sk-SH2(Ｂ、配列番号８)、Sk-SH3(Ｃ、配列番号９)、Sk-SH4(Ｄ、配列番号10)のヌクレオチド配列。 図７：筋特異的調節エレメントSk-SH5(Ｅ、配列番号11)、Sk-SH6(Ｆ、配列番号12)、Sk-SH7(Ｇ、配列番号13)のヌクレオチド配列。 図８は、左から右へ、AAV9sc-Sk-SH1-Des-Luc2(Sk-SH1、ｎ=４)、AAV9sc-Sk-SH2-Des-Luc2(Sk-SH2、ｎ=４)、AAV9sc-Sk-SH3-Des-Luc2(Sk-SH3、ｎ=４)、AAV9sc-Sk-SH4-Des-Luc2(Sk-SH4、ｎ=４)、AAV9sc-Sk-SH5-Des-Luc2(Sk-SH5、ｎ=１)、AAV9sc-Sk-SH6-Des-Luc2(Sk-SH6、ｎ=３)又はAAV9sc-Sk-SH7-Des-Luc2(Sk-SH7、ｎ=４)ベクターを静脈注射したマウスの心臓組織及び筋組織におけるルシフェラーゼ発現の、核酸調節エレメントを含まないコントロールベクターAAV9sc-Des-Luc2を注射したマウス(コントロール、Sk-SHなし、ｎ=５)と比較した差を示す。ルシフェラーゼ発現は、注射７週間後に選択組織においてルシフェラーゼ活性により放出される全光束(ステラジアン当たりの平方センチメートル当たりの秒当たりの光子[光子/秒/cm2/sr]で表す)として測定した。結果を平均±標準誤差として示した：* p<0.05；** p<0.001。 図９は、左から右へ、AAV9sc-Des-Luc2(コントロール、Sk-SHなし、ｎ=５)、AAV9sc-Sk-SH1-Des-Luc2(Sk-SH1、ｎ=４)、AAV9sc-Sk-SH2-Des-Luc2(Sk-SH2、ｎ=４)、AAV9sc-Sk-SH3-Des-Luc2(Sk-SH3、ｎ=４)、AAV9sc-Sk-SH4-Des-Luc2(Sk-SH4、ｎ=４)、AAV9sc-Sk-SH5-Des-Luc2(Sk-SH5、ｎ=１)、AAV9sc-Sk-SH6-Des-Luc2(Sk-SH6、ｎ=３)又はAAV9sc-Sk-SH7-Des-Luc2(Sk-SH7、ｎ=４)ベクターを静脈内注射したマウスの選択組織におけるルシフェラーゼ発現を示す。ルシフェラーゼ発現は、注射７週間後に選択組織においてルシフェラーゼ活性により放出される全光束(ステラジアン当たりの平方センチメートル当たりの秒当たりの光子[光子/秒/cm2/sr]で表す)として測定した。結果を平均±標準誤差として示した：* p<0.05；** p<0.001。 図10A：サイトメガロウイルスプロモーター(CMVp)がホタルルシフェラーゼ遺伝子(Luc2)の上流にクローニングされていることが示されているAAVsc-CMV-Luc2-SV40pAプラスミド構築物の概略図。用いた略号は次のとおりである：ITR：ウイルス性逆方向末端反復；SV40pA：シミアンウイルス40ポリアデニル化部位。 図10B：左から右へ、AAV9sc-CMV-Luc2(CMV、ｎ=４)、AAV9sc-Sk-SH4-Des-Luc2(Sk-SH4、ｎ=２)、AAV9sc-CSk-SH1-Des-Luc2(CSk-SH1、ｎ=４)又はAAV9sc-CSk-SH5-Des-Luc2(CSk-SH5、ｎ=４)ベクターを静脈内注射したマウスの選択組織におけるルシフェラーゼ発現。ルシフェラーゼ発現は、選択組織においてルシフェラーゼ活性により放出される全光束(ステラジアン当たりの平方センチメートル当たりの秒当たりの光子[光子/秒/cm2/sr]で表す)として測定した。結果を平均±標準誤差として示した。 図10C：左から右へ、AAV9sc-Sk-SH4-Des-Luc2(Sk-SH4、ｎ=２)、AAV9sc-CSk-SH1-Des-Luc2(CSk-SH1、ｎ=４)又はAAV9sc-CSk-SH5-Des-Luc2(CSk-SH5、ｎ=４)ベクターを静脈注射したマウスの心臓組織及び筋組織におけるルシフェラーゼ発現の、ベクターAAV9sc-CMV-Luc2(CMV、ｎ=４)を注射したマウス(コントロール、Sk-SHなし、ｎ=５)と比較した差。ルシフェラーゼ発現は、注射７週間後に選択組織においてルシフェラーゼ活性により放出される全光束(ステラジアン当たりの平方センチメートル当たりの秒当たりの光子[光子/秒/cm2/sr]で表す)として測定した。結果を平均±標準誤差として示した。 図11Aは、配列番号１の概略図にマッピングされたCSk-SH1の機能的フラグメント及び示された転写因子結合部位(TFBS)を示す。 図11Bは、配列番号５の概略図にマッピングされたCSk-SH-5の機能的フラグメント及び示された転写因子結合部位(TFBS)を示す。 図11Cは、配列番号10の概略図にマッピングされたSk-SH4の機能的フラグメント及び示された転写因子結合部位(TFBS)を示す。 図12：左から右へ、AAV9sc-Sk-SH1-Des-Luc2(Sk-SH1)、AAV9sc-Sk-SH2-Des-Luc2(Sk-SH2)、AAV9sc-Sk-SH3-Des-Luc2(Sk-SH3)、AAV9sc-Sk-SH4-Des-Luc2(Sk-SH4)、AAV9sc-Sk-SH6-Des-Luc2(Sk-SH6)又はAAV9sc-Sk-SH7-Des-Luc2(Sk-SH7)ベクターを静脈注射したマウスの心臓組織及び筋組織におけるLuc mRNAレベルの、核酸調節エレメントを含まないコントロールベクターAAV9sc-Des-Luc2を注射したマウス(コントロール、Sk-SHな)と比較した差。Luc mRNAレベルは、示した組織の生検から抽出したトータルRNAからの定量RT-PCR法(qRT-PCR)により測定した。結果を平均±標準誤差として示した；* p<0.05；** p<0.001。 図13：AAV9sc-Sk-SH4-Des-MVM-Luc-pAベクター(Ａ)又はAAV9sc-Sk-SH1-Des-MVM-Luc-pAベクター(Ｂ)を注射したマウスの異なる器官における形質導入効率。両ベクター(ｎ=３)について100ngのゲノムDNAに対するAAVコピー数を測定した。 図14は、左から右へ、AAV9sc-Des-Luc(コントロール、Sk-SHなし)、AAV9sc-Sk-SH4-Des-Luc(Sk-SH4)、AAV9sc-Sk-SH4a-Des-Luc(Sk-SH4a)、AAV9sc-Sk-SH4b-Des-Luc(Sk-SH4b)、AAV9sc-Sk-SH4c-Des-Luc(Sk-SH4c)、AAV9sc-Sk-SH4d-Des-Luc(Sk-SH4d)又はAAV9sc-Sk-SH4e-Des-Luc(Sk-SH4e)ベクターを静脈内注射したマウスの心臓組織及び筋組織におけるルシフェラーゼ発現を示す。ルシフェラーゼ発現は、注射５週間後に選択組織においてルシフェラーゼ活性により放出される全光束(ステラジアン当たりの平方センチメートル当たりの秒当たりの光子[光子/秒/cm2/sr]で表す)として測定した。結果を平均±標準誤差として示した。Sk-SH4及びSk-SH4bを注射したマウスにおけるルシフェラーゼ発現の、核酸調節エレメントを含まないコントロールベクターAAV9sc-Des-Luc2を注射したマウスと比較した倍数差を示す。 図15：AAV9sc-Sk-SH4-Des-Luc(５×109vg/マウス)を注射したマウスの心臓組織(Ａ)及び筋組織(Ｂ)についてのクロマチン免疫沈降(CHIP)アッセイ。転写因子CEBP、SRF及びMEF2に特異的な抗体を用いた。PCRプライマーは、CEBP及びSRFに結合するSk-SH4の領域又はCEBP及びMEF2に結合するCSk-SH5の領域を増幅するように設計し、ネガティブコントロール(－)として第17染色体上の非転写領域を用いた。103細胞についての結合事象を、対応するプライマー対の各々について決定した。結果を平均±標準誤差として示した。ネガティブコントロールに対する有意差を示す(ｔ検定、* P≦0.05)。 図15：AAV9sc-CSk-SH5-Des-Luc(５×109vg/マウス)を注射したマウスの心臓組織(Ｃ)及び筋組織(Ｄ)についてのクロマチン免疫沈降(CHIP)アッセイ。転写因子CEBP、SRF及びMEF2に特異的な抗体を用いた。PCRプライマーは、CEBP及びSRFに結合するSk-SH4の領域又はCEBP及びMEF2に結合するCSk-SH5の領域を増幅するように設計し、ネガティブコントロール(－)として第17染色体上の非転写領域を用いた。103細胞についての結合事象を、対応するプライマー対の各々について決定した。結果を平均±標準誤差として示した。ネガティブコントロールに対する有意差を示す(ｔ検定、* P≦0.05)。 図16Aは、本明細書に開示の単鎖(ss)AAVプラスミド構築物の概略図を示す。この構築物は、上流にクローニングされた筋特異的核酸調節エレメントSkSH4に作動可能に連結したデスミンプロモーターにより調節されるマイクロジストロフィン１(MD1)(AAVss-SkSH4-Des-MVM-MD1)導入遺伝子を含む。フォリスタチン遺伝子は、Luc2レポーター遺伝子に2Aペプチドを介して連結させた。発現カセットは、マウス微小ウイルス(MVM)のイントロン及び49bpの合成Proudfootポリアデニル化部位(pA)を更に含む。発現カセットの側方には逆方向末端反復(ITR)が位置する。 AAVss-SkSH4-Des-MVM-MD1プラスミド構築物のヌクレオチド配列(配列番号44)。 AAVss-SkSH4-Des-MVM-MD1プラスミド構築物のヌクレオチド配列(配列番号44)(続き)。 AAVss-SkSH4-Des-MVM-MD1プラスミド構築物のヌクレオチド配列(配列番号44)(続き)。 図16Cは、本明細書に開示の単鎖(ss)AAVプラスミド構築物の概略図を示す。この構築物は、上流にクローニングされた筋特異的核酸調節エレメントSkSH4に作動可能に連結したデスミンプロモーターにより調節されるフォリスタチン(FST)(AAVssSkSH4-Des-MVM-FST-2A-Luc2)導入遺伝子を含む。フォリスタチン遺伝子は、Luc2レポーター遺伝子に2Aペプチドを介して連結させた。発現カセットは、マウス微小ウイルス(MVM)のイントロン及び49bpの合成Proudfootポリアデニル化部位(pA)を更に含む。発現カセットの側方には逆方向末端反復(ITR)が位置する。 AAVss-SkSH4-Des-MVM-FST-2A-Luc2プラスミド構築物のヌクレオチド配列(配列番号45)。 AAVss-SkSH4-Des-MVM-FST-2A-Luc2プラスミド構築物のヌクレオチド配列(配列番号45)(続き)。 AAVss-SkSH4-Des-MVM-FST-2A-Luc2プラスミド構築物のヌクレオチド配列(配列番号45)(続き)。 図17：左から右へ、PBS(コントロール)、AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Luc、AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1、又はAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-LucとAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1との組合せを注射したMDX-SCIDマウスについてのトレッドミル試験。結果は、トレッドミル装置上を走ったとき各マウス群が走破した計算上の距離として表す。 図18：(Ａ)PBS(ａ、コントロール)、AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Luc(ｂ)、AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1(ｃ)、又はAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1とAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucとの組合せ(ｄ)を注射したMDX/SCIDマウスの腓腹筋組織のヘマトキシリン/エオシン染色。(Ｂ)野生型C57Bl/6マウス、未処置MDX/SCIDマウス(コントロール)及びAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1(MD1)、AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Luc(FST)又は両(FST＋MD1)治療ベクターを注射したMDX/SCIDマウスにおける中心に核を有する細胞の定量。統計解析は、パラフィン包埋腓腹筋のH&E染色筋線維横断切片について行った。*** ≦0,0001、** ≦0,001、* ≦0,05。 図19A及び19B：AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1ベクター(Ａ)、又はAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1とAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucとの組合せ(Ｂ)を静脈内注射したマウスの心臓組織及び筋組織(腓腹筋及び四頭筋)における、内因性ハウスキーピング遺伝子(GAPDH：グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)の発現と対比した、マイクロジストロフィン１(MD1)のmRNAレベル。結果をMD1の相対的発現(ΔΔCT)として示す。 図19C：AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST(Ｃ)を静脈内注射したマウスの心臓組織及び筋組織(腓腹筋及び四頭筋)における、内因性ハウスキーピング遺伝子(GAPDH：グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ)の発現と対比した、フォリスタチン(FST)(Ｃ)のmRNAレベル。結果をFSTの相対的発現(ΔΔCT)として示す。 図20は、本明細書に開示の自己相補性(sc)AAV構築物の概略図を示す。この構築物は、(ａ)心筋及び骨格筋特異的デスミン(Desmin)プロモーター、(ｂ)SPc5-12プロモーター、(ｃ)サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、(ｄ)上流にクローニングされた筋特異的(Sk-SH)核酸調節エレメントに作動可能に連結したデスミンプロモーター、又は(ｅ)上流にクローニングされた筋特異的(Sk-SH)核酸調節エレメントに作動可能に連結したSPc5-12プロモーターにより調節されるルシフェラーゼ(Luc)導入遺伝子を含む。発現カセット(ａ)、(ｂ)、(ｄ)及び(ｅ)は、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン及びポリアデニル化シグナル(pA)を更に含む。発現カセットの側方には逆方向末端反復(ITR)が位置する。 図21：左から右へ、図20に概略を示したAAVsc-CMV-Luc、AAVsc-Des-MVM-Luc、AAVsc-Sk-SH4-Des-MVM-Luc、AAVsc-SPc5-12-MVM-Luc又はAAVsc-Sk-SH4-SPc5-12-MVM-Lucベクターを静脈注射したCB17/IcrTac/Prkdcscidマウスの選択組織におけるLuc mRNAレベルの、AAVsc-CMV-Lucベクターを注射したマウスと比較した差。Luc mRNAレベルは、示した組織の生検から抽出したトータルRNAからのqRT-PCRにより測定した。結果を平均±標準誤差として示した；* p<0.05；** p<0.001。
説明
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」には、その文脈がそうでないことを明確に述べているときを除き、指称物の単数形及び複数形の両方が含まれるものとする。
用語「含んでなる」は、本明細書で使用する場合、「含む」又は「含有する」と同義であり、限定的な表現ではなく、言及されてない追加のメンバー、要素又は工程を排除しておらず、これらを更に含み得る。この用語は、(特許の用語法において十分に確立された
意味を有する)「からなる」及び「から本質的になる」もまた包含する。
端点による数値範囲の記載には、それぞれの範囲内に含まれる全ての数字及び端数並びに記載の端点が含まれる。
用語「約」又は「およそ」は、本明細書で使用する場合、測定可能な値、例えば、パラメータ、量、期間などに言及するものであるときには、当該特定値の/からの変動(例えば当該特定値の/からの±10％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、
尚より好ましくは±0.1％以下)を包含するものとする(ただし、当該変動が本開示発明の
実施に適切である限りにおいて)。修飾語「約」が言及する値はそれ自体が具体的に、そ
して好適に開示されていることを理解すべきである。
用語「１又はそれより多い」又は「少なくとも１つ」（例えば、一群のメンバーの少なくとも１つのメンバー或いは１又はそれより多いメンバー)はそれ自体明確であるが、更
なる例示として、この用語は、とりわけ、当該メンバーの任意の１つ、又は当該メンバーの任意の２つ若しくはそれより多く(例えば、当該メンバーの任意の３つ以上、４つ以上
、５つ以上、６つ以上若しくは７つ以上など)、そして最大で当該メンバーの全てへの言
及を包含する。別の１つの例においては、「１又はそれより多い」又は「少なくとも１つ」とは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又はそれより多くであってもよい。
本明細書における発明の背景の記載は、本発明の状況を説明するために含ませたものである。当該記載は、言及したいずれかの事項が本願優先日当時にいずれかの国において既に公開され、公知であり、又は技術常識の一部であったことを自認するものとして捉えるべきではない。
本開示を通して、種々の刊行物、特許及び公開された特許出願には、特定した引用によって言及する。本明細書で引用した全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、本明細書で具体的に言及した文献の教示又は節(section)が参照により組み込まれる。
特に断らない限り、本発明の開示に使用する全ての用語(技術用語及び科学用語を含む)は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者が共通して理解する意味を有する。用語の定義は、更なるガイダンスとして、本発明の教示をより良好に理解するために含ませたものである。特定の用語が本発明の特定の観点又は本発明の特定の実施形態に関連して規定されている場合、その意味は、特に断らなければ、本明細書を通して、すなわち本発明の他の観点又は実施形態に関しても、適用されるものとする。
以下で、本発明の種々の観点又は実施形態をより詳細に述べる。述べた各観点又は実施形態は、明確にそうでないと示していない限り、その他の任意の観点又は実施形態と組み合わせてもよい。具体的には、好ましい又は有利であるとして示された任意の特徴を、好
ましい又は有利であるとして示されたその他の任意の特徴と組み合わせてもよい。
本明細書を通して、「１つの実施形態」への言及は、当該実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書の諸所に現れる句「１つの実施形態において」は、必ずしも、全てが同じ実施形態に言及するものではないが、そうであってもよい。更に、当該特定の特徴、構造又は特性を、１つ又はそれより多い実施形態において、本開示から当業者に明らかであるように、任意の適切な様式で組み合わせてもよい。更に、本明細書に記載の幾つかの実施形態は、その他の実施形態に含まれる幾つかの特徴を含み、その他の特徴は含まないが、当業者が理解するように、異なる実施形態の特徴の組合せは本発明の範囲内のものとし、異なる実施形態を構成する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求された実施形態のいずれも、任意の組合せで用いることができる。
本発明に関する一般的方法に関しては、とりわけ、周知の教科書(例えば、「Molecular
Cloning：A Laboratory Manual，第２版」(Sambrookら，1989)、「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubelら，1987)を含む)を参照する。
１つの観点において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列、若しくはその機能的フラグメント(すなわち、配列番号１、配列番号２、配列番号３
、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は前記配列のいずれかと高いパーセンテージの配列同一性を有する配列からなる群より選択される配列の機能的フラグメント)を含
んでなるか、該選択配列若しくは機能的フラグメントから本質的になるか(この場合、調
節エレメントは、例えば、クローニング目的に用いられる配列を追加的に含んでもよいが、示した配列は、該調節エレメントの本質的部分を形成し、例えば、より大きな調節領域(例えばプロモーター)の一部を構成しない)、又は該選択配列若しくは機能的フラグメントからなる、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントに関する。
「調節エレメント」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子の転写、特に遺伝子の組織特異的転写を調節及び/又は制御することができる転写制御エレメント、特に非コーディ
ングのシス作用性転写制御エレメントをいう。調節エレメントは、少なくとも１つの転写因子結合部位(TFBS)、より具体的には少なくとも１つの組織特異的転写因子結合部位、最も具体的には少なくとも１つの筋特異的転写因子結合部位を含んでなる。代表的には、調節エレメントは、本明細書で使用する場合、プロモーター単独(調節エレメントなし)からの遺伝子の転写と比較して、プロモーター駆動遺伝子発現を増大又は増強させる。よって、調節エレメントは具体的にはエンハンサー配列を含むが、転写を増強する調節エレメントは、典型的な、遥か上流のエンハンサー配列に限定されず、それらが調節する遺伝子から任意の距離に現れ得ることを理解すべきである。実際、転写を調節する配列は、インビボでそれらが調節する遺伝子の上流(例えば、プロモーター領域中)又は下流(例えば、3'UTR中)のいずれにも位置し得、該遺伝子の極近傍に又は更に遠く離れて位置し得ることは当該分野において公知である。注目すべきことには、本明細書に開示の調節エレメントは、代表的には、天然に存在する配列、調節エレメント(又はその部分)の組合せ又は調節エレメントの幾つかのコピーを含んでなる。すなわち、天然に存在しない配列を含んでなる調節エレメントそれ自体も、調節エレメントとして意図される。調節エレメントは、本明細書で使用する場合、転写制御に関与するより大きな配列の一部、例えば、プロモーター配列の一部を含んでもよい。しかし、調節エレメント単独は、代表的には、転写を開始するには十分でなく、この目的にはプロモーターを必要とする。本明細書に開示の調節エレメントは、核酸分子、すなわち単離された核酸又は単離された核酸分子として提供される。よって、この核酸調節エレメントは、天然に存在するゲノム配列の小部分に過ぎず、したがってそれ自体としては天然に存在しない配列であって、ゲノム配列から単離される配列を有する。
用語「核酸」とは、本明細書で使用する場合、代表的には、ヌクレオチドから本質的に構成される任意の長さのオリゴマー又はポリマー(好ましくは線形ポリマー)をいう。ヌクレオチド単位は、一般に、複素環式塩基、糖基及び少なくとも１つ(例えば、１つ、２つ
又は３つ)のリン酸基(改変又は置換リン酸基を含む)を含有する。複素環式塩基としては
、とりわけ、プリン及びピリミジン塩基、例えば、天然に存在する核酸に一般的なアデニン(Ａ)、グアニン(Ｇ)、シトシン(Ｃ)、チミン(Ｔ)及びウラシル(Ｕ)、他の天然に存在する塩基(例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン)並びに化学的若しくは生化学的に改変された(例えば、メチル化された)非天然の若しくは誘導体化された塩基が挙げられ得る。糖基としては、とりわけ、ペントース(ペントフラノース)基、例えば好ましくは天然に存在する核酸に一般的なリボース及び/又は2-デオキシリボース、又はアラビノース
、2-デオキシアラビノース、トレオース若しくはヘキソース糖基、並びに改変又は置換糖基が挙げられ得る。本明細書において意図される核酸としては、天然に存在するヌクレオチド、改変ヌクレオチド又はそれらの混合物が挙げられ得る。改変ヌクレオチドとしては、改変複素環塩基、改変糖部分、改変リン酸基又はそれらの組合せが挙げられ得る。リン酸基又は糖の改変は、安定性、酵素的分解に対する抵抗性又は他の幾つかの有用な性質を改善するために導入され得る。用語「核酸」は、更に好ましくは、DNA、RNA及びDNA/RNAハイブリッド分子を包含し、具体的には、hnRNA、pre-mRNA、mRNA、cDNA、ゲノムDNA、増幅産物、オリゴヌクレオチド及び合成(例えば、化学合成された)DNA、RNA又はDNA/RNAハイブリッドを含む。核酸は、天然に存在するものであることができ、例えば、天然に存在し若しくは天然から単離されることができ；又は天然に存在しないもの、例えば組換え物であることができ、すなわち、組換えDNA技術により製造され及び/又は部分的若しくは全体的に、化学的若しくは生化学的に合成されることができる。「核酸」は、二本鎖、部分的に二本鎖又は一本鎖であることができる。一本鎖である場合、核酸は、センス鎖又はアンチセンス鎖であることができる。加えて、核酸は環状又は線状であることができる。
本明細書で使用する場合、「転写因子結合部位」、「転写因子結合配列」又は「TFBS」とは、転写因子が結合する核酸領域の配列をいう。TFBSの非限定的な例としては、転写因子３(TCF3又はE2Aとしても知られる)の結合部位；核因子Ｉ(NF1としても知られる)の結合部位；CCAAT-エンハンサー結合性タンパク質(C/EBPとしても知られる)の結合部位；筋原
性分化(MyoDとしても知られる)の結合部位；ステロール調節エレメント結合性タンパク質(SREBPとしても知られる)の結合部位；白血病/リンパ腫関連因子(LRFとしても知られる)
の結合部位；タンパク質53(p53としても知られる)の結合部位；肝細胞核因子３-α(HNF3aとしても知られる)の結合部位；肝細胞核因子３-β(HNF3bとしても知られる)の結合部位
；肝細胞核因子４(HNF4としても知られる)の結合部位；筋細胞特異的エンハンサー因子2A(MEF2A又はRSRFC4としても知られる)の結合部位；ペルオキシソーム増殖因子活性化レセ
プター(PPARとしても知られる)の結合部位；血清応答因子(SRFとしても知られる)の結合
部位；転写活性化因子様タンパク質1b(Tal1_bとしても知られる)の結合部位が挙げられる。転写因子結合部位はデータベース(例えばTransfac(登録商標))において見出し得る。
本明細書に開示の配列は、筋特異的遺伝子の転写をインビボで制御するとことができる、具体的には次の遺伝子：デスミン(DES、CSM1又はCSM2としても知られる)；アクチニン α2(ACTN2又はCMD1AAとしても知られる)；フィラミン-Ｃ(FLNC)(アクチン結合性様タンパク質(ABLP)、フィラミン-２(FLN2)、ABP-280、ABP280A、ABPA、ABPL、MFM5又はMPD4としても知られる)；筋小胞体/小胞体カルシウムATPアーゼ１(ATP2A1、ATP2A又はSERCA1としても知られる)；トロポニンＩタイプ１(遅筋)(TNNI1、SSTNI又はTNN1としても知られる)；ミオシン軽鎖リン酸化可能速筋(MYLPF)；ミオシン-１(MYH1、MYHSA1、MYHaとしても知られる)；MyHC-2X/D又はMyHC-2x；トロポミオシンα-3鎖(TPM3、CFTD、NEM1、OK/SW-cl.5、TM-5、TM3、TM30、TM30nm、TM5、TPMsk3、TRK、hTM5又はhscp30としても知られる)；及びアンキリン反復ドメイン含有タンパク質２(ANKRD2又はARPPとしても知られる)を制御することができる調節エレメントの配列の一部であり得る。したがって、実施形態において、本明細書に開示の核酸調節エレメントは、Des調節エレメント、すなわちDes遺伝子の発現をインビボで制御する調節エレメント、例えば、配列番号１、配列番号17、配列番号２、配列番号18又はそれらの機能的フラグメントを含む調節エレメントに由来する配列を含んでなる。実施形態において、本明細書に開示の核酸調節エレメントは、ACTN2調節エレメント、すなわちACTN2遺伝子の発現をインビボで制御する調節エレメント、例えば、配列番号３、配列番号19、配列番号４、配列番号20又はそれらの機能的フラグメントを含む調節エレメントに由来する配列を含んでなる。実施形態において、本明細書に開示の核酸調節エレメントは、FLNC調節エレメント、すなわちFLNC遺伝子の発現をインビボで制御する調節エレメント、例えば、配列番号５、配列番号21、配列番号６、配列番号22又はそれらの機能的フラグメントを含む調節エレメントに由来する配列を含んでなる。実施形態において、本明細書に開示の核酸調節エレメントは、ATP2A1調節エレメント、すなわちATP2A1遺伝子の発現をインビボで制御する調節エレメント、例えば、配列番号７、配列番号23又はそれらの機能的フラグメントを含む調節エレメントに由来する配列を含んでなる。実施形態において、本明細書に開示の核酸調節エレメントは、TNNI1調節エレメント、すなわちTNNI1遺伝子の発現をインビボで制御する調節エレメント、例えば、配列番号８、配列番号24、配列番号９、配列番号25又はそれらの機能的フラグメントを含む調節エレメントに由来する配列を含んでなる。実施形態において、本明細書に開示の核酸調節エレメントは、MYLPF調節エレメント、すなわちMYLPF遺伝子の発現をインビボで制御する調節エレメント、例えば、配列番号10、配列番号26又はそれらの機能的フラグメントを含んでなる調節エレメント(例えば、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40又は配列番号41を含むか又はこれらのいずれかからなる調節エレメント)に由来する配列を含んでなる。実施形態において、本明細書に開示の核酸調節エレメントは、MYH1調節エレメント、すなわちMYH1遺伝子の発現をインビボで制御する調節エレメント、例えば、配列番号11、配列番号27又はそれらの機能的フラグメントを含む調節エレメントに由来する配列を含んでなる。実施形態において、本明細書に開示の核酸調節エレメントは、TPM3調節エレメント、すなわちTPM3遺伝子の発現をインビボで制御する調節エレメント、例えば、配列番号12、配列番号28又はそれらの機能的フラグメントを含む調節エレメントに由来する配列を含んでなる。実施形態において、本明細書に開示の核酸調節エレメントは、ANKRD2調節エレメント、すなわちANKRD2遺伝子の発現をインビボで制御する調節エレメント、例えば、配列番号13、配列番号29又はそれらの機能的フラグメントを含む調節エレメントに由来する配列を含んでなる。
本明細書で使用する場合、用語「同一性」及び「同一」並びにこれに類する表現は、２つのポリマー分子間、例えば２つの核酸分子間、例えば２つのDNA分子間の配列類似性を
いう。配列アラインメント及び配列同一性の決定は、例えば、Altschulら，1990(J Mol Biol 215：403-10)により最初に記載されたBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)、例えばTatusova and Madden 1999(FEMS Microbiol Lett 174：247-250)により記載された「Blast 2 sequences」アルゴリズムを用いて行うことができる。代表的には、パーセンテージでの配列同一性は、当該配列の全長にわたって算出する。本明細書で使用する場合、用語「実質的に同一」は、少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性をいう。
用語「機能的フラグメント」とは、本出願で用いる場合、本明細書に開示の調節エレメント配列の、筋特異的発現を調節する能力を保持するフラグメントをいう。すなわち、フラグメントは、組織特異性を依然として付与することができ、それが由来する配列と(お
そらくは、同じ程度ではないが)同じ様式で(導入)遺伝子の発現を調節する能力を有する
。機能的フラグメントは、好ましくは、それが由来する配列からの少なくとも20、少なく
とも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも120、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350又
は少なくとも400の連続ヌクレオチドを含んでなり得る。また、好ましくは、機能的フラ
グメントは、それが由来する配列に存在する転写因子結合部位(TFBS)の少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ又は少なくとも４つ、尚より好ましくは少なくとも５つ、少なくとも10又は少なくとも15を含んでなり得る。
「筋特異的発現」とは、本願で使用する場合、他の(すなわち非筋肉)組織と比較して、筋肉又は筋組織における(導入)遺伝子の優先的又は優勢な発現(RNA及び/又はポリペプチ
ドとして)をいう。特定の実施形態によれば、(導入)遺伝子発現の少なくとも50％、より
具体的には少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100
％が筋肉で生じる。１つの特定の実施形態によれば、筋特異的発現は、遺伝子発現産物の筋肉以外の器官又は組織、例えば肺、肝臓、脳、腎臓及び/又は脾臓への「漏れ」がない
という結果をもたらす。
本明細書で使用する場合、「心筋及び骨格筋特異的発現」とは、心臓(特に心筋)及び骨格筋における(導入)遺伝子の優先的又は優勢な発現をいう。特定の実施形態によれば、(
導入)遺伝子発現の少なくとも50％、より具体的には少なくとも60％、少なくとも70％、
少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％が心臓及び骨格筋で生じる。よって、特定の
実施形態によれば、(導入)遺伝子発現の10％未満、５％未満、２％未満又は１％未満が心臓及び骨格筋以外の器官又は組織で生じる。
本明細書で使用する場合、「骨格筋特異的発現」とは、骨格筋における(導入)遺伝子の優先的又は優勢な発現をいう。特定の実施形態によれば、(導入)遺伝子発現の少なくとも50％、より具体的には少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％が骨格筋で生じる。よって、特定の実施形態によれば、(導入)遺伝子発現の10％未満、５％未満、２％未満又は１％未満が骨格筋以外の器官又は組織で生じる。
同じことが、適切な変更を加えて、筋細胞特異的及び筋芽細胞特異的発現(これらは筋
特異的発現の特定の形態と考えてよい)に適用される。本出願を通して、発現に関して筋
特異的に言及する場合、筋細胞特異的発現及び筋芽細胞特異的発現も明白に認識される。同様に、本願において心筋及び骨格筋特異的発現を用いる場合には、心筋細胞及び骨格筋細胞特異的発現並びに心筋筋芽細胞及び骨格筋筋芽細胞特異的発現も明白に認識される。同様に、本願において骨格筋特異的発現を用いる場合、骨格筋細胞特異的及び骨格筋筋芽細胞特異的発現も明白に認識される。
本明細書で使用する場合、用語「心筋」とは、心臓に見出される自律調節性の横紋筋タイプの筋肉をいう。
本明細書で使用する場合、用語「骨格筋」とは、骨格に付着している随意制御性の横紋筋タイプの筋肉をいう。骨格筋の非限定的な例としては、二頭筋、三頭筋、四頭筋、前脛骨筋(tibialis interior)及び腓腹筋が挙げられる。
用語「筋細胞」とは、本明細書で使用する場合、適切な条件下で筋特異的表現型を発現することができるように始原筋芽細胞から分化した細胞をいう。最終的に分化した筋細胞は互いに融合して筋線維の主要な構成要素である筋管を形成する。用語「筋細胞」は脱分化した筋細胞をもいう。この用語には、インビボの細胞及びエキソビボで培養された細胞(当該細胞が初代であるか継代されているかにかかわらず)が含まれる。
用語「筋芽細胞」とは、本明細書で使用する場合、筋細胞を生じるように分化する中胚葉の胚性細胞をいう。この用語には、インビボの細胞及びエキソビボで培養された細胞(
当該細胞が初代であるか継代されているかにかかわらず)が含まれる。
実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列の機能的フラグメントであって、それが由来する配列からの少なくとも20、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200又は少なくとも250の連続ヌクレオチドを含み、該由来配列中に存在する転写因子結合部位(TFBS)の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも10又は少なくとも15を含む機能的フラグメントを含んでなるか、該機能的フラグメントから本質的になるか、又は該機能的フラグメントからなる、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントに関する。
更なる実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列の機能的フラグメントであって、それが由来する配列からの少なくとも20、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200又は少なくとも250の連続ヌクレオチドを含み、該由来配列中に存在する転写因子結合部位(TFBS)
の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも10又は少なくとも15を含む機能的フラグメントを含んでなる、心筋及び骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントに関する。
尚更なる実施形態において、本発明は、配列番号１及び配列番号５又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列の機能的フラグメントであって、配列番号１の33位～58位のヌクレオチド配列；配列番号１の90位～142位のヌクレオチド配列；配列
番号１の143位～233位のヌクレオチド配列；配列番号１の240位～310位のヌクレオチド配列；配列番号１の90位～233位のヌクレオチド配列；配列番号５の47位～130位のヌクレオチド配列；配列番号５の252位～293位のヌクレオチド配列；又は配列番号５の330位～450位のヌクレオチド配列からなる機能的フラグメントを含んでなる、心筋及び骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントに関する。
更なる実施形態において、本発明は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列の機能的フラグメントであって、それが由来する配列からの少なくとも20、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200又は少なくとも250の連続ヌクレオチドを含み、該由来配列中に存在する転写因子結合部位(TFBS)の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも10又は
少なくとも15を含む機能的フラグメントを含んでなる、骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントに関する。
尚更なる実施形態において、本発明は、配列番号10又は配列番号10と少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくと
も95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列の機能的フラグメントであって、配列番号10の10位～180位のヌクレオチド配列；配列番号10の190位～240位のヌクレオチド配列；配列番号10の241位～300位のヌクレオチド配列；配列番号10
の241位～360位のヌクレオチド配列；又は配列番号10の380位～420位のヌクレオチド配列からなる機能的フラグメントを含んでなる、骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントに関する。
特定の実施形態において、本発明の核酸調節エレメントは、配列番号１の33位～58位のヌクレオチド配列；配列番号１の90位～142位のヌクレオチド配列；配列番号１の143位～233位のヌクレオチド配列；配列番号１の240位～310位のヌクレオチド配列；配列番号１
の90位～233位のヌクレオチド配列；配列番号５の47位～130位のヌクレオチド配列；配列番号５の252位～293位のヌクレオチド配列；配列番号５の330位～450位のヌクレオチド配列；配列番号10の10位～180位のヌクレオチド配列；配列番号10の190位～240位のヌクレ
オチド配列；配列番号10の241位～300位のヌクレオチド配列；配列番号10の241位～360位のヌクレオチド配列；配列番号10の380位～420位のヌクレオチド配列；又は前記配列のいずれかと少なくとも95％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、又は該選択配列からなる。
特定の実施形態において、本発明の核酸調節エレメントは、配列番号１の33位～310位
のヌクレオチド配列；配列番号５の47位～450位のヌクレオチド配列；配列番号10の10位
～420位のヌクレオチド配列又は前記配列のいずれかと少なくとも95％の同一性を有する
配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、又は該選択配列からなる。
更なる実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントを提供する。
尚更なる実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなる、心筋及び骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントを提供する。
尚更なる実施形態において、本発明は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントを提供する。
更なる実施形態において、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントは、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、その機能的フラグメントであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12若しくは配列番号13を含む機能的フラグメント、又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる。
更なる実施形態において、心筋及び骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントは、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、その機能的フラグメントであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６を含んでなる機能的フラグメント、又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる。
更なる実施形態において、骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントは、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、その機能的フラグメントであって、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12若しくは配列番号13を含んでなる機能的フラグメント、又はこれら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる。
２又はそれより多い本明細書に開示の同一の若しくは異なる配列又はその機能的フラグメントを組み合わせることにより人工的配列を含んでなる核酸調節エレメントを作製することも可能である。したがって、或る特定の実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列、又はそれらの機能的フラグメントからなる群より選択される少なくとも２つの配列を含んでなる、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントが提供される。
また、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、これら配列のいずれかと少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列、又はそれらのフラグメントからなる群より選択される少なくとも２つの配列を含んでなる、筋特異的遺伝子発現、特に心筋及び骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントが本明細書に開示される。
また、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列、又はそれらのフラグメントからなる群より選択される少なくとも２つの配列を含んでなる、筋特異的遺伝子発現、特に骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントが本明細書に開示される。
例えば、配列番号１及び配列番号５を含んでなるか、配列番号１及び配列番号５から本質的になるか、又は配列番号１及び配列番号５からなる核酸調節エレメント；配列番号１及び配列番号10を含んでなるか、配列番号１及び配列番号10から本質的になるか、又は配列番号１及び配列番号10からなる核酸調節エレメント；配列番号１、配列番号５及び配列番号10を含んでなるか、配列番号１、配列番号５及び配列番号10から本質的になるか、又は配列番号１、配列番号５及び配列番号10からなる核酸調節エレメント；配列番号１の２
、３、４又は５つの反復(例えばタンデム反復)を含んでなるか、該反復から本質的になるか、又は該反復からなる核酸調節エレメント；配列番号５の２、３、４又は５つの反復(
例えばタンデム反復)を含んでなるか、該反復から本質的になるか、又は該反復からなる
核酸調節エレメント；又は、配列番号10の２、３、４又は５つの反復(例えばタンデム反
復)を含んでなるか、該反復から本質的になるか、又は該反復からなる核酸調節エレメン
トが本明細書に開示される。
人工的配列を含んでなる核酸調節エレメントの特定の例としては、本明細書に開示の配列に存在する転写因子結合部位(TFBS)を再配置することにより取得される調節エレメントが挙げられる。前記再配置には、TFBSの順序を変更すること及び/又は１若しくはそれよ
り多いTFBSの位置を他のTFBSに関して変更すること及び/又はTFBSのうちの１若しくはそ
れより多くのコピー数を変更することが含まれ得る。例えば、E2A、HNH1、NF1、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPの結合部位；又はE2A、NF1、p53、C/EBP、LRF及びSREBPの結合部位；
又はE2A、HNH1、HNF3a、HNF3b、NF1、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPの結合部位；又はE2A、HNF3a、NF1、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPの結合部位；又はE2A、HNF3a、NF1、CEBP、LRF
、MyoD及びSREBPの結合部位；又はHNF4、NF1、RSRFC4、C/EBP、LRF及びMyoD、又はNF1、PPAR、p53、C/EBP、LRF及びMyoDの結合部位を含んでなる、筋特異的遺伝子発現、特に心筋及び骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントもまた本明細書に開示される。例えば、E2A、NF1、SRFC、p53、C/EBP、LRF及びMyoDの結合部位；又はE2A、NF1、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPの結合部位；又はE2A、HNF3a、C/EBP、LRF、MyoD、SEREBP及びTal1_bの結合部位；又はE2A、SRF、p53、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPの結合部位；又はHNF4、NF1、RSRFC4、C/EBP、LRF及びSREBPの結合部位；又はE2A、HNF3a、HNF3b、NF1、SRF、C/EBP、LRF、MyoD及びSREBPの結合部位；又はE2A、CEBP及びMyoDの結合部位を含んでなる、筋特異的遺伝子発現、特に骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントもまた本明細書に開示される。更なる例において、これら核酸調節エレメントは、記載されたTFBSのうちの１又はそれより多くの少なくとも２つ、例えば２、３、４又はそれより多くのコピーを含んでなる。
調節エレメントが、(例えば一本鎖AAVベクターを用いて)一本鎖核酸として提供される
場合、その相補鎖は開示配列の均等物とみなす。よって、本明細書に記載の配列、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列、又はその機能的フラグメントからなる群より選択される配列の相補鎖を含んでなるか、該相補鎖から本質的になるか、又は該相補鎖からなる、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントもまた本明細書に開示される。
本明細書に記載の核酸調節エレメント、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列、それらの機能的フラグメント又はそれらの相補鎖からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる核酸調節エレメントとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントもまた本明細書に開示される。この核酸調節エレメントは、それがハイブリダイズする配列と長さが等しいものである必要はない。好適な実施形態において、前記のようなハイブリダイズする核酸調節エレメントのサイズは、それがハイブリダイズする配列の長さの25％を超えて、特には20％を超えて、より具体的には15％を超えて、とりわけ10％を超えて異ならない。
表現「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、核酸分子が温度及び塩濃度の規定条件下で標的核酸分子にハイブリダイズする能力をいう。代表的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、天然型二重鎖の融解温度(Tm)より25℃～30℃(例えば、20℃、15℃、10℃又は５℃)を超えて下回らない。Tmの算出法は当該分野において周知である。非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するための代表的な塩及び温度条件は、１×SSC、0.5％ SDS、65℃である。略号SSCとは、核酸ハイブリダイゼーション溶液に使用する緩衝液をいう。１リットルの20×(20倍濃縮物)ストックSSC緩衝溶液(pH7.0)は、175.3ｇの塩化ナトリウム及び88.2ｇのクエン酸ナトリウムを含有する。ハイブリダイゼーションを達成するための代表的な期間は12時間である。
好ましくは、本明細書に記載のとおりの調節エレメントは、限定された長さのものでありつつ、十分に機能的である。このことにより、調節エレメントは、その搭載能力を不当に制限されることなく、ベクター又は核酸発現カセットにおける使用が可能になる。したがって、実施形態において、本明細書に開示の調節エレメントは、1500ヌクレオチド以下、1000ヌクレオチド以下、900ヌクレオチド以下、800ヌクレオチド以下、700ヌクレオチド以下、より好ましくは600ヌクレオチド以下、例えば550ヌクレオチド以下、500ヌクレオチド以下、450ヌクレオチド以下、400ヌクレオチド以下、350ヌクレオチド以下、又は300ヌクレオチド以下の核酸である(すなわち、核酸調節エレメントは、1500ヌクレオチド、1000ヌクレオチド、900ヌクレオチド、800ヌクレオチド、700ヌクレオチド、好ましくは600ヌクレオチド、例えば550ヌクレオチド、500ヌクレオチド、450ヌクレオチド、400ヌクレオチド、350ヌクレオチド又は300ヌクレオチドの最大長を有する)。
しかし、本開示の核酸調節エレメントは、調節活性(すなわち、特異性及び/又は転写活性に関する調節活性)を保持しているため、特に、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30
ヌクレオチド、35ヌクレオチド、40ヌクレオチド、45ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、150ヌクレオチド、200ヌクレオチド、250ヌクレオチド、300ヌクレオチド、350ヌクレオチド又は400ヌクレオチドの最短長を有すると理解されるべきである。
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、尚より好ましくは少なくとも95％、例えば95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する配列、又はその機能的フラグメントからなる群より選択される配列を含んでなる、筋特異的遺伝子発現のための、1000ヌクレオチド以下、好ましくは600ヌクレオチド以下、例えば550ヌクレオチド以下、500
ヌクレオチド以下、450ヌクレオチド以下、400ヌクレオチド以下、350ヌクレオチド以下
又は300ヌクレオチド以下の核酸調節エレメントを提供する。
本明細書に開示の核酸調節エレメントは、核酸発現カセット中で使用してもよい。したがって、１つの観点において、本発明は、本明細書に記載のとおりの核酸調節エレメントの核酸発現カセットにおける使用を提供する。
１つの観点において、本発明は、プロモーターに作動可能に連結した本明細書に記載のとおりの核酸調節エレメントを含んでなる核酸発現カセットを提供する。実施形態において、核酸発現カセットは導入遺伝子を含有しない。このような核酸発現カセットは、内因性遺伝子の発現を駆動するために使用し得る。好適な実施形態において、核酸発現カセットは、プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結した本明細書に記載のとおりの核酸調節エレメントを含んでなる。
本明細書で使用する場合、用語「核酸発現カセット」とは、１又はそれより多い所望の細胞タイプ、組織又は器官における(導入)遺伝子発現を導く１又はそれより多い転写制御
エレメント(例えば、限定されないが、プロモーター、エンハンサー及び/又は調節エレメント、ポリアデニル化配列及びイントロン)を含む核酸分子をいう。代表的には、核酸発
現カセットは、導入遺伝子も含有するが、該核酸カセットが挿入された細胞において内因性遺伝子の発現を導くこともまた認識される。
用語「作動可能に連結した」とは、本明細書で使用する場合、種々の核酸分子エレメントが機能的に接続し、互いに相互作用できるような各々との関係で配置されていることをいう。このようなエレメントとしては、プロモーター、エンハンサー及び/又は調節エレ
メント、ポリアデニル化配列、１又はそれより多いイントロン及び/又はエキソン並びに
発現させるべき対象の遺伝子(すなわち、導入遺伝子)のコーディング配列が挙げられるが、これらに限定されない。核酸配列エレメントは、適切に配向されるか又は作動可能に連結しているときには一緒に作用して、互いの活性をモジュレートし、最終的には導入遺伝子の発現レベルに影響し得る。「モジュレート」とは、特定のエレメントの活性レベルを増大させ、減少させ又は維持させることを意味する。各エレメントの他のエレメントに対する位置は、各エレメントの5'末端及び3'末端について表してもよく、任意の特定のエレメント間の距離は、当該エレメント間に介在するヌクレオチド又は塩基対の数で言及してもよい。当業者が理解するように、「作動可能に連結した」とは、機能的活性を意味し、必ずしも、天然の位置的連関に関しない。事実、核酸発現カセットに使用する場合、調節エレメントは、代表的には、プロモーターの直ぐ上流に位置する(このことは一般的に当てはまるが、決して、核酸発現カセット内での位置の制限又は除外と解釈すべきでない)が、このことはインビボでは必要ない。例えば、天然では遺伝子の下流に存在し、該遺伝子の転写に影響を及ぼす調節エレメント配列は、プロモーターの上流に位置しても、同じ様式で機能することがある。よって、１つの具体的実施形態によれば、調節エレメントの調節効果又は増強効果は位置に非依存性である。
特定の実施形態において、核酸発現カセットは、１つの本明細書に記載のとおりの核酸調節エレメントを含んでなる。代替の実施形態において、核酸発現カセットは、２又はそれより多く、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の本明細書に記載のとおりの核酸調節エレメントを含んでなる。すなわち、核酸調節エレメントは、調節(及び/又は増強)効果が増強されるように、モジュール様式で組み合わされる。更なる実施形態にお
いて、当該２又はそれより多い核酸調節エレメントの少なくとも２つは、同一であるか又は実質的に同一である。尚更なる実施形態において、当該２又はそれより多い核酸調節エレメントの全てが同一であるか又は実質的に同一である。当該同一であるか又は実質的に同一である核酸調節エレメントのコピーは、核酸発現カセットにおいてタンデム反復として提供されてもよい。更なる代替の実施形態において、当該２又はそれより多い核酸調節エレメントの少なくとも２つは互いに異なる。核酸発現カセットは、同一であるか又は実質的に同一である核酸調節エレメントと非同一の核酸調節エレメントとの組合せを含んでなってもよい。
例えば、核酸発現カセットは、配列番号１を含む核酸調節エレメント及び配列番号５を含む核酸調節エレメントを含んでなってもよく；又は、核酸発現カセットは、配列番号１を含む核酸調節エレメント及び配列番号10を含む核酸調節エレメントを含んでなってもよく；又は、核酸発現カセットは、配列番号１を含む核酸調節エレメント、配列番号５を含む核酸調節エレメント及び配列番号10を含む核酸調節エレメントを含んでなってもよく；又は、核酸調節エレメントは、配列番号１を含む、２、３、４又は５つの核酸調節エレメントを含んでなってもよく；又は、核酸調節エレメントは、配列番号５を含む、２、３、４又は５つの核酸調節エレメントを含んでなってもよく；又は、核酸調節エレメントは、配列番号10を含む、２、３、４又は５つの核酸調節エレメントを含んでなってもよい。
本願において使用する場合、用語「プロモーター」とは、それが作動可能に連結した対
応の核酸コーディング配列(例えば、導入遺伝子又は内因性遺伝子)の転写を直接又は間接に調節する核酸配列をいう。プロモーターは、単独で、転写を調節するように機能してもよく、又は１若しくはそれより多い他の調節配列(例えば、エンハンサー若しくはサイレ
ンサー又は調節エレメント)との組合せで作用してもよい。本願に関しては、プロモータ
ーは、代表的には、(導入)遺伝子の転写を調節するように、本明細書に開示のとおりの調節エレメントに作動可能に連結している。本明細書に記載のとおりの調節エレメントは、プロモーター及び導入遺伝子の両方に作動可能に連結している場合、(１)インビボ(及び/又はインビトロで筋芽細胞、筋細胞若しくは筋由来細胞株、特に心筋及び骨格筋の若しくは骨格筋の筋芽細胞、心筋及び骨格筋の若しくは骨格筋の筋細胞、又は心筋及び骨格筋由来の若しくは骨格筋由来の細胞株)において、有意な程度の筋特異的、特に心筋及び骨格
筋特異的又は骨格筋特異的な導入遺伝子の発現を付与することができ、及び/又は(２)筋
肉、特に心筋及び骨格筋又は骨格筋(及び/又はインビトロで筋芽細胞、筋細胞若しくは筋由来細胞株、特に心筋及び骨格筋の若しくは骨格筋の筋芽細胞、心筋及び骨格筋の若しくは骨格筋の筋細胞、又は心筋及び骨格筋由来の若しくは骨格筋由来の細胞株)において導
入遺伝子の発現レベルを増大させることができる。
プロモーターは、同種(すなわち、核酸発現カセットをトランスフェクトすべき動物(特に哺乳動物)と同じ種に由来)であっても、異種(すなわち、発現カセットをトランスフェ
クトすべき動物(特に哺乳動物)の種以外の供給源に由来)であってもよい。このため、プ
ロモーターの供給源は、任意のウイルス、任意の単細胞の原核生物若しくは真核生物、任意の脊椎若しくは無脊椎生物又は任意の植物であってもよく、或いは合成プロモーター(
すなわち、天然に存在しない配列を有するもの)であってさえよい(ただし、該プロモーターが本明細書に記載の調節エレメントとの組合せで機能的であることを前提とする)。好適な実施形態において、プロモーターは哺乳動物プロモーター、特にマウス又はヒトプロモーターである。
プロモーターは、誘導性又は構成性プロモーターであり得る。
本明細書に開示の核酸調節エレメントにおける筋特異的TFBSの富化により、原理上、調節エレメントは、それ自体は筋特異的でないプロモーターからでさえも、筋特異的発現を導くことが可能となる。よって、本明細書に開示の調節エレメントは、核酸発現カセットにおいて天然プロモーターとの組合せでも別のプロモーターとの組合せでも使用することができる。好ましくは、本明細書に開示の核酸発現カセットは筋特異的プロモーターを含んでなる。これは、筋特異性を増大させ及び/又は他の組織における発現の漏れを回避す
るためである。筋特異的プロモーターの非限定的な例としては、デスミン(DES)プロモー
ター、α２アクチニン(ACTN2)プロモーター、フィラミン-Ｃ(FLNC)プロモーター、筋小胞体/小胞体カルシウムATPアーゼ１(ATP2A1)プロモーター、トロポニンＩタイプ１(TNNI1)
プロモーター、ミオシン-１(MYH1)プロモーター、リン酸化可能速筋ミオシン軽鎖(MYLPF)プロモーター、α-３鎖トロポミオシン(TPM3)プロモーター、アンキリン反復ドメイン含
有タンパク質２(ANKRD2)プロモーター、ミオシン重鎖(MHC)プロモーター、ミオシン軽鎖(MLC)プロモーター、筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、Liら(1999. Nat Biotechnol. 17:241-245)に記載されるような合成筋プロモーター、例えばSPc5-12プロモーター、筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、Wangら(2008. Gene Ther. 15:1489-1499)に記載されるようなMCKエンハンサー～MCK基本プロモーターのそれぞれ二重タンデム又は三重タンデムからなるdMCKプロモーター及びtMCKプロモーターが挙げられる。
特に好適な実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の筋特異的プロモーター、特に、マウス又はヒトの筋特異的プロモーターである。
好適な実施形態において、プロモーターは、デスミン遺伝子由来、特にマウス又はヒトのデスミン遺伝子由来、例えば配列番号16に規定されるプロモーターである。例えば、マウスデスミンプロモーターはpDRIVE-mデスミン(Invivogen)として市販されている。デス
ミンプロモーターは心筋及び骨格筋の両方で発現される。
実施形態において、プロモーターは、骨格筋特異的プロモーター、特に筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、より特にはWangら(2008. Gene Ther. 15:1489-1499)に記載されるような、MCKエンハンサー及びMCK基本プロモーターの二重又は三重タンデムからなる二重MCKプロモーター又は三重MCKプロモーターである。
更に、プロモーターは、核酸発現カセット中の導入遺伝子のプロモーターである必要はないが、導入遺伝子は自身のプロモーターから転写されることも可能である。
核酸発現カセットの長さを最小化するため、調節エレメントは、最小プロモーター又は本明細書に記載のプロモーターの短縮型に連結してもよい。「最小プロモーター」(基本
プロモーター又はコアプロモーターとも呼ぶ)は、本明細書で使用する場合、発現を依然
として駆動することはできるが、その配列の(例えば組織特異的)発現の調節に寄与する部分を少なくとも欠いている、完全サイズのプロモーターの一部である。この定義は、(組
織特異的)調節エレメントが欠失しており、遺伝子の発現を駆動することはできるが、組
織特異的様式で当該遺伝子を発現させる能力を喪失しているプロモーター、及び、(組織
特異的)調節エレメントが欠失しており、遺伝子の(おそらくは、減少した)発現を駆動す
ることはできるが、組織特異的様式で当該遺伝子を発現させる能力を必ずしも喪失していないプロモーターの両方を包含する。好ましくは、本明細書に開示の核酸発現カセットに含まれるプロモーターは、長さが、1000ヌクレオチド以下、900ヌクレオチド以下、800ヌクレオチド以下、700ヌクレオチド以下、600ヌクレオチド以下、500ヌクレオチド以下、400ヌクレオチド以下、300ヌクレオチド以下又は250ヌクレオチド以下である。
用語「導入遺伝子」とは、本明細書で使用する場合、細胞において発現させるべきポリペプチド又は該ポリペプチドの一部分をコードする特定の核酸配列であって、当該細胞に導入される核酸配列をいう。しかし、導入遺伝子は、代表的には、当該核酸配列が挿入されている細胞における特定ポリペプチドの量を制御する(例えば、低下させる)ために、RNAとして発現させることも可能である。これらRNA分子としては、RNA干渉及びマイクロRNA調節により機能を発揮する分子(shRNA、RNAi、及びmiR)(これは特異的遺伝子の発現を制御するために用いることができる)、触媒性RNA、アンチセンスRNA、RNAアプタマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。核酸配列を細胞に導入する方法は、本発明にとって本質的でなく、例えばゲノムへの組込みによる導入又はエピソームプラスミドとしての導入であり得る。注目すべきことに、導入遺伝子の発現は、核酸配列が導入される細胞のサブセットに制限され得る。用語「導入遺伝子」は、(１)それが導入された細胞に天然には見出されない核酸配列(すなわち、異種核酸配列)；(２)それが導入された細胞に天然に見出される核酸配列の変異形態である核酸配列；(３)それが導入された細胞に天然に存在する同じ(すなわち、同種の)又は類似の核酸配列の更なるコピーを加えるように働く核酸配列；又は(４)それが導入された細胞において発現が誘導されるサイレントな天然に存在するか又は同種の核酸配列を含むものとする。
導入遺伝子は、プロモーター(及び/又は(例えば核酸発現カセットが遺伝子治療に使用
される場合には)当該導入遺伝子が導入される動物(特に哺乳動物))に対して同種であっても異種であってもよい。
導入遺伝子は、全長cDNA若しくはゲノムDNA配列、又は少なくとも幾らかの生物学的活
性を有する任意のそのフラグメント、サブユニット若しくは変異体であり得る。特に、導入遺伝子は、ミニ遺伝子、すなわち、そのイントロン配列の一部、ほとんど又は全部を欠く遺伝子配列であり得る。よって、導入遺伝子は、場合により、イントロン配列を含有してもよい。随意に、導入遺伝子は、ハイブリッド核酸配列、すなわち、同種及び/又は異
種のcDNA及び/又はゲノムDNAフラグメントから構築されたものであり得る。「変異形態」は、野生型の若しくは天然に存在する配列とは異なる１又はそれより多いヌクレオチドを含有する核酸配列を意味するものとする。すなわち、変異体核酸配列は、１又はそれより
多いヌクレオチド置換、欠失及び/又は挿入を含有する。ヌクレオチド置換、欠失及び/又は挿入は、野生型アミノ酸/核酸配列とはアミノ酸/核酸配列が異なる遺伝子産物(すなわ
ち、タンパク質又は核酸)を生じることがある。そのような変異体の作製は当該分野にお
いて周知である。幾つかの場合には、導入遺伝子はまた、導入遺伝子産物が細胞から分泌されるように、リーダーペプチド又はシグナル配列をコードする配列を含んでもよい。
本明細書に記載の核酸発現カセットに含まれ得る導入遺伝子は、代表的には、遺伝子産物、例えばRNA又はポリペプチド(タンパク質)をコードする。
実施形態において、導入遺伝子は治療用タンパク質をコードする。治療用タンパク質は分泌型タンパク質であり得る。分泌型タンパク質、特に分泌型治療用タンパク質の非限定的な例としては、凝固因子(例えば第VIII因子又は第IX因子)、インスリン、エリスロポエチン、リポタンパク質リパーゼ、抗体又はナノボディ、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、血漿因子などが挙げられる。治療用タンパク質はまた構造タンパク質であり得る。構造タンパク質、特に治療用構造タンパク質の非限定的な例としては、ジストロフィン及びサルコグリカンが挙げられる。実施形態において、導入遺伝子は、マイクロジストロフィン１(MD1)遺伝子又はフォリスタチン(FST)遺伝子を含んでなる。
実施形態において、導入遺伝子は免疫原性タンパク質をコードする。免疫原性タンパク質の非限定的な例としては、病原体に由来するエピトープ及び抗原が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「免疫原性」とは、免疫応答を惹起することができる物質又は組成物をいう。
本明細書に開示の核酸発現カセットには、代表的には導入遺伝子産物の発現を更に増大又は安定化させるために、他の配列(例えば、イントロン及び/又はポリアデニル化配列)
も組み込んでよい。
本明細書に記載の発現カセットには、任意のイントロンを利用することができる。用語「イントロン」は、全体イントロンの任意の一部であって、核のスプライシング装置により認識されスプライスされるに十分に大きい部分を包含する。代表的には、短い機能的イントロン配列が、発現カセットのサイズを可能な限り小さく維持するために好適であり、このことにより発現カセットの構築及び操作が容易になる。幾つかの実施形態において、イントロンは、発現カセット内のコーディング配列によりコードされるタンパク質をコードする遺伝子から得る。イントロンは、コーディング配列の5'側若しくは3'側又はコーディング配列内に位置することができる。イントロンをコーディング配列の5'側に配置する利点は、イントロンがポリアデニル化シグナルの機能と干渉する可能性を最小にすることである。実施形態において、本明細書に開示の核酸発現カセットはイントロンを更に含んでなる。適切なイントロンの非限定的な例は、マウス微小ウイルス(MVM)のイントロン、βグロビンのイントロン(betaIVS-II)、第IX因子(FIX)のイントロンＡ、シミアンウイルス40(SV40)の小ｔイントロン及びβアクチンのイントロンである。
好ましくは、イントロンはMVMのイントロンである。
ポリＡテイルの合成を導く任意のポリアデニル化シグナルが本明細書に記載の発現カセットにおいて有用であり、その例は当業者に周知である。例示的なポリアデニル化シグナルとしては、シミアンウイルス40(SV40)後期遺伝子に由来するポリＡ配列、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナル、最小ウサギβグロビン(mRBG)遺伝子及びLevittら(1989, Genes Dev 3:1019-1025)に記載される合成ポリＡ s(SPA)部位(配列番号46)が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、ポリアデニル化シグナルはSV40に由来する(すなわちSV40 pA)。
特定の実施形態において、本発明は、プロモーター(好ましくはデスミン遺伝子に由来
するプロモーター又はSPc5-12プロモーターからなる群より選択されるプロモーター)及び導入遺伝子(好ましくはルシフェラーゼをコードする導入遺伝子)に作動可能に連結した配列番号10又は該配列と95％の同一性を有する配列からなる核酸調節エレメントを含んでな
る核酸発現カセットを提供する。更なる実施形態において、核酸発現カセットはMVMイン
トロンを更に含んでなる。尚更なる実施形態において、核酸発現カセットは、ポリアデニル化シグナル、好ましくはSV40由来のポリアデニル化シグナルを更に含んでなる。
特定の実施形態において、本発明は、プロモーター(好ましくはデスミン遺伝子に由来
するプロモーター)及び導入遺伝子(好ましくはマイクロジストロフィン１又はフォリスタチンをコードする導入遺伝子)に作動可能に連結した配列番号10又は該配列と95％の同一
性を有する配列からなる核酸調節エレメントを含んでなる核酸発現カセットを提供する。更なる実施形態において、核酸発現カセットはMVMイントロンを更に含んでなる。尚更な
る実施形態において、核酸発現カセットはポリアデニル化シグナルを更に含んでなり、好ましくはポリアデニル化シグナルは配列番号46を有する。
本明細書に開示の核酸調節エレメント及び核酸発現カセットは、そのまま使用してもよいし、又は代表的には、それらは核酸ベクターの一部であってもよい。したがって、更なる観点は、ベクター、特に核酸ベクターにおける、本明細書に記載のとおりの核酸調節エレメント又は本明細書に記載のとおりの核酸発現カセットの使用に関する。
１つの観点において、本発明はまた、本明細書に開示のとおりの核酸調節エレメントを含んでなるベクターを提供する。更なる実施形態において、ベクターは本明細書に開示のとおりの核酸発現カセットを含んでなる。
用語「ベクター」とは、本願で使用する場合、別の核酸分子(挿入核酸分子)(例えばcDNA分子；ただしこれに限定されない)が挿入され得る核酸分子、例えば二本鎖DNAをいう。
ベクターは、適切な宿主細胞に挿入核酸分子を輸送するために使用される。ベクターは、挿入核酸分子の転写の可能にする必要なエレメントと、任意に、当該転写物をポリペプチドに翻訳する必要なエレメントとを含有してもよい。挿入核酸分子は、宿主細胞に由来してもよく、又は異なる細胞若しくは生物に由来してもよい。宿主細胞中では、ベクターは、宿主染色体DNAとは独立して又はこれと同時発生的に複製することができ、ベクター及びその挿入核酸分子の幾つかのコピーが生成されてもよい。ベクターは、エピソームベクター(すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれないベクター)であることができ、又は宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターであることもできる。よって、用語「ベクター」は、標的細胞への遺伝子移入を容易にする遺伝子送達ビヒクルとして定義されてもよい。この定義には、非ウイルス性ベクター及びウイルス性ベクターの両方が含まれる。非ウイルス性ベクターとしては、カチオン性脂質、リポソーム、ナノ粒子、PEG、PEI、プラスミドベクター(例えば、pUCベクター、bluescriptベクター(pBS)及びpBR322、又は細菌性配列を欠いているそれらの派生物(ミニサークル))、トランスポゾンベースのベクター(例えば、PiggyBac(PB)ベクター又はSleeping Beauty(SB)ベクター)などが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターはウイルスに由来し、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。代表的には(必ずではない)、ウイルスベクターは複製欠損である。なぜならば、複製欠損ウイルスベクターは、複製に必須のウイルス遺伝子が除去されているため、所与の細胞で伝播する能力を喪失しているからである。しかし、幾つかのウイルスベクターは、所与の細胞(例えば、ガン細胞)で特異的に複製するように適合させることもでき、代表的には(ガン)細胞特異的(腫瘍)溶解を誘引するために使用する。ビロゾームは、ウイルス性エレメント及び非ウイルス性エレメントの両方を含んでなるベクターの非限定的な例である。具体的には、ビロゾームはリポソームと不活化HIV又はインフルエンザウイルスとの組合せである(Yamadaら，2003)。別の例は、カチオン性脂質と混合されたウイルスベクターを包含する。
好適な実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターであり、より好ま
しくはAAVベクターである。AAVベクターは、好ましくは、AAV形質導入における律速段階
の１つ(すなわち一本鎖AAVから二本鎖AAVへの転換)を克服するために、自己相補性二本鎖AAVベクター(scAAV)として使用する(McCarty, 2001, 2003；Nathwaniら，2002, 2006, 2011；Wuら，2008)が、一本鎖AAVベクター(ssAAV)の使用もまた本発明に包含される。
AAVセロタイプ９(AAV9)は、心臓及び骨格筋における効率的形質導入を達成するに理想
的に適切である。したがって、特に好適な実施形態において、ベクターはAAV9ベクターであり、より具体的には自己相補性AAV9ベクター(scAAV9)である。
他の実施形態において、ベクターは、非ウイルスベクター、好ましくはプラスミド、ミニサークル又はトランスポゾンベースのベクター、例えばSleeping Beauty(SB)ベースの
ベクター又はpiggyBac(PB)ベースのベクターである。
更に他の実施形態において、ベクターは、ウイルス性エレメント及び非ウイルス性エレメントを含んでなる。
特定の実施形態において、本発明は、配列番号10からなる核酸調節エレメント、プロモーター(好ましくはデスミン遺伝子由来プロモーター)、MVMイントロン、導入遺伝子(好ましくはマイクロジストロフィン１をコードする導入遺伝子)及びポリアデニル化シグナル(好ましくは配列番号46を有するポリアデニル化シグナル)を含む核酸発現カセットを含んでなるベクターを提供する。特定の実施形態において、ベクターは配列番号44を有する。
特定の実施形態において、本発明は、配列番号10からなる核酸調節エレメント、プロモーター(好ましくはデスミン遺伝子由来プロモーター)、MVMイントロン、導入遺伝子(好ましくはフォリスタチンをコードする導入遺伝子)及びポリアデニル化シグナル(好ましくは配列番号46を有するポリアデニル化シグナル)を含む核酸発現カセットを含んでなるベクターを提供する。特定の実施形態において、ベクターは配列番号45を有する。
本明細書に開示の核酸発現カセット及びベクターは、例えば、筋肉で通常発現され利用されるタンパク質(すなわち、構造タンパク質)を発現させるため、又は筋肉で発現され、その後身体の他の部分への輸送のために血流に輸出されるタンパク質(すなわち、分泌型
タンパク質)を発現させるために使用してもよい。例えば、本明細書に開示の発現カセッ
ト及びベクターは、治療目的(特に遺伝子治療)のために、治療量の遺伝子産物(例えば、
ポリペプチド(特に治療用タンパク質)又はRNA)を発現させるために使用してもよい。代表的には、遺伝子産物は、発現カセット又はベクター内の導入遺伝子によりコードされるが、原理的には、治療目的に内因性遺伝子の発現を増大させることも可能である。１つの代替の例においては、本明細書に開示の発現カセット及びベクターは、ワクチン接種目的に、免疫学的量の遺伝子産物(例えばポリペプチド(特に免疫原性タンパク質)又はRNA)を発現させるために使用してもよい。
本明細書に教示のとおりの核酸発現カセット及びベクターは、医薬的に許容され得る賦形剤、すなわち１又はそれより多い医薬的に許容され得るキャリア物質及び/又は添加物(例えば、緩衝液、キャリア、賦形剤、安定化剤など)と共に医薬組成物に製剤化してもよ
い。医薬組成物はキットの形態で提供してもよい。
用語「医薬的に許容され得る」は、本明細書で使用する場合、当該分野において意味するところと一致して、医薬組成物の他の成分と適合性であり、レシピエントに有害でないことを意味する。
したがって、本発明の１つの更なる観点は、本明細書に記載の核酸発現カセット又はベクターを含んでなる医薬組成物に関する。
これら医薬組成物の製造のための本明細書に記載の核酸調節エレメントの使用もまた、本明細書に開示する。
実施形態において、医薬組成物はワクチンであってもよい。ワクチンは、免疫応答を増強するための１又はそれより多いアジュバントを更に含んでもよい。適切なアジュバントとしては、例えば、サポニン、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例え
ばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン)、ペプチド、油又は炭化水素
エマルジョン、カルメット-ゲラン桿菌(BCG)、ざ瘡菌(Corynebacterium parvum)及び合成アジュバントQS-21が挙げられるが、これらに限定されない。随意に、ワクチンは、１又
はそれより多い免疫刺激分子を更に含んでもよい。免疫刺激分子の非限定的な例としては、免疫刺激活性、免疫増強活性及び炎症促進活性を有する種々のサイトカイン、リンホカイン及びケモカイン(例えばインターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13))；増殖因子(例えば、顆粒球-マクロファージ(GM)-コロニー刺激因子(CSF))；及び他の免疫刺激分子(例えばマクロファージ炎症性因子、Flt3リガンド、B7.1；B7.2)などが挙げられる。
１つの更なる観点において、本発明は、医薬において使用するための本明細書に記載の核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物に関する。
本明細書で使用する場合、用語「処置する」又は「処置」とは、治療的処置及び予防手段の両方をいう。有益な又は所望される臨床結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかに関わらず、望ましくない臨床状態又は障害の防止、障害発症率の低減、障害に伴う症状の緩和、障害の程度の縮小、障害の安定化された(すなわち、悪化しない)状態、障害進行の遅延又は減速、障害状態の改善又は緩和、寛解(部分的又は全体的に関わらず)、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存と比較したときの生存延長を意味することがある。
本明細書で使用する場合、用語「治療的処置」又は「治療法」及びこれに類する用語は、対象者の身体若しくは身体要素を望ましくない生理学的変化若しくは障害から望ましい状態、例えば重篤度若しくは不快感が小さい状態へ移行させること(例えば、改善又は緩和)、又は、健常状態への復帰(例えば、対象者の健康、身体的完全性及び身体的快適性の回復)、又は、望ましくない生理学的変化又は障害の維持(例えば、安定化又は悪化させないこと)、又は望ましくない生理学的変化又は障害と比較して、より重篤な又は悪い状態への進行を防止し又は減速させることが目的である処置をいう。
本明細書で使用する場合、用語「防止」、「予防」、「予防的処置」又はこれに類する語は、疾患又は障害に苦しむ前に、当該疾患又は障害の発症を防止すること(疾患若しく
は障害又はそれらに関連する症状の重篤度の低減を含む)を包含する。このような、苦し
む前の防止又は低減は、投与時には疾患又は障害の明確な症状に苦しんでいない患者への、本明細書に記載の核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物の投与をいう。「防止」は、例えば改善期間の後の、疾患又は障害の再発防止も包含する。実施形態において、本明細書に記載の核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物は、遺伝子治療、特に筋指向遺伝子治療、より具体的には心臓及び骨格筋指向遺伝子治療又は骨格筋指向遺伝子治療に使用するためのものであってもよい。
本明細書に記載の核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物の、遺伝子治療用、特に筋指向遺伝子治療用、より具体的には心臓及び骨格筋指向遺伝子治療用又は骨格筋指向遺伝子治療用の医薬の製造のための使用も本明細書に開示される。
遺伝子治療、特に筋指向遺伝子治療、より具体的には心臓及び骨格筋指向遺伝子治療又は骨格筋指向遺伝子治療を必要とする対象者における遺伝子治療の方法であって、
－ 対象者に、特には対象者の筋肉に、より具体的には対象者の心筋又は骨格筋に、本明細書に記載の核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物であって、プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結した本明細書に記載の核酸調節エレメントを含む核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物を導入し；及び
－ 対象者において、特に対象者の筋肉、より具体的には対象者の心臓及び骨格筋又は骨格筋において治療有効量の導入遺伝子産物を発現させる
ことを含んでなる方法もまた本明細書に開示される。
導入遺伝子産物は、ポリペプチド、特には構造タンパク質、例えばジストロフィン若し
くはサルコグリカン、又は分泌型タンパク質、例えば、凝固因子(例えば、第IX因子若し
くは第VIII因子)、サイトカイン、増殖因子、抗体若しくはナノボディ、ケモカイン、血
漿因子、インスリン、エリスロポエチン、リポタンパク質リパーゼであってもよい。特定の実施形態において、導入遺伝子産物はフォリスタチン又はマイクロジストロフィン、特にはマイクロジストロフィン１である。或いは、導入遺伝子産物はRNA、例えばsiRNAであってもよい。
本明細書に記載の核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物を用いる遺伝子治療の利益を享受し得る例示的な疾患及び障害としては、筋ジストロフィー(例えば、デュシェーヌ筋ジストロフィー(DMD)/ベッカー筋ジストロフィー(BMD))、筋緊
張性ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患(MND)、例えばシャルコー-マリー-ツース病(CMT)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、及び筋萎縮性側索硬化症(ALS)、エメリー-ドライフス筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)、先天性筋ジストロフィー、先天性ミオパシー、肢帯筋ジストロフィー、代謝性ミオパシー、筋肉炎症性疾患、筋無力症、ミトコンドリアミオパシー、イオンチャネルの異常、核包膜疾患、心筋症、心肥大、心不全、遠位型ミオパシー、心血管疾患、血友病(血友病Ａ及びＢを含む)、及び糖尿病が挙げられる。
遺伝子治療プロトコルは当該分野で広く記載されている。これには、プラスミド(裸の
もの又はリポソーム中のもの)の筋内注入、種々の組織(筋肉を含む)における水力学的遺
伝子送達、間質性注入、気道への点滴、上皮、肝臓内実質への適用、及び静脈内又は動脈内投与が挙げられるが、これらに限定されない。標的細胞へのDNAのアクセシビリティを
高めるために種々のデバイスが開発されている。簡単なアプローチは、標的細胞と、DNA
を含有するカテーテル又は移植可能材料との物理的接触である。別の１つのアプローチは、液柱を高圧下で標的組織に直接発射するニードルなしジェット注入デバイスの使用である。これら送達パラダイムはベクターの送達にも使用することができる。標的付けられた遺伝子送達への別の１つのアプローチは、細胞への核酸の特異的標的化のための、核酸結合性又はDNA結合性物質が結合したタンパク質又は合成リガンドからなる分子接合体の使用である(Cristianoら，1993)。実施形態において、本明細書に記載の核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物は、ワクチンとして、より具体的には予防用ワクチンとして使用するためのものであり得る。
ワクチンの製造、特には予防用ワクチンの製造のための、本明細書に記載の核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物の使用も本明細書に開示される。
本明細書には、
－ 対象者に、特には対象者の筋肉に、より具体的には対象者の心筋又は骨格筋に、本明細書に記載の核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物であって、プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結した本明細書に記載の核酸調節エレメントを含む核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物を導入し；及び
－ 対象者において、特には対象者の筋肉に、より具体的には対象者の心筋又は骨格筋において、免疫学的有効量の導入遺伝子産物を発現させる
ことを含んでなる、ワクチン接種を必要とする対象者のワクチン接種、特には予防用ワクチン接種の方法も開示される。
本明細書で使用する場合、「処置を必要とする対象者」のような句は、言及された疾患又は障害の処置の利益を享受する対象者を含む。このような対象者として、当該疾患又は障害と診断された者、該疾患又は障害に罹患し易いか又はこれらを発症し易い者及び/又
は該疾患又は障害を予防すべき者を挙げてもよいが、これらに限定されない。
用語「対象者」及び「患者」は、本明細書において互換的に使用し、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物をいい、具体的にはヒト患者及び非ヒト哺乳動物を含む。「哺乳動物」対象者としては、ヒト、家畜動物、商用動物、農業用動物、動物園の動
物、スポーツに用いられる動物、ペット及び実験動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ；霊長類、例えば類人猿、サル、オラウータン及びチンパンジー；イヌ科動物、例えばイヌ及びオオカミ；ネコ科動物、例えばネコ、ライオン及びトラ；ウマ科動物、例えばウマ、ロバ及びシマウマ；食用動物、例えばウシ、ブタ及びヒツジ；有蹄動物、例えばシカ及びキリン；げっ歯動物、例えばマウス、ラット、ハムスター及びモルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適な患者又は対象者はヒト対象者である。
「治療量」又は「治療有効量」とは、本明細書で使用する場合、対象者において疾患又は障害を処置するに、すなわち、所望の局所的又は全身的効果を得るに有効な遺伝子産物の量をいう。よって、この用語は、組織、系、動物又はヒトにおいて、研究者、獣医、医師又は他の医者が求める生物学的又は医学的応答を惹起する遺伝子産物の量をいう。この量は、代表的には遺伝子産物及び疾患の重篤度に依存するが、おそらくはルーチンの実験により、当業者が決定することができる。
「免疫学的有効量」は、本明細書で使用する場合、(導入)遺伝子によりコードされる免疫原へのその後の曝露に対する対象者の免疫応答を増強するに有効な(導入)遺伝子産物の量をいう。誘導された免疫のレベルは、例えばプラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着又はマイクロ中和化アッセイにより、例えば中和性の分泌及び/又は血清抗体の量を測
定することにより、決定することができる。
代表的には、本明細書に記載のとおりの(すなわち、少なくとも１つの筋特異的核酸調
節エレメントを有する)発現カセット又はベクターを用いたときの(導入)遺伝子産物の発
現量は、核酸調節エレメントを有さない同じ発現カセット又はベクターを用いた場合より高い。より具体的には、発現は、核酸調節エレメントを有さない同じ核酸発現カセット又はベクターと比較して、少なくとも２倍高く、少なくとも５倍高く、少なくとも10倍高く、少なくとも20倍高く、少なくとも30倍高く、少なくとも40倍高く、少なくとも50倍高く、又は少なくとも60倍高い。更に、この高発現は、筋肉、特に心臓及び骨格筋の両方又は骨格筋単独に特異的なままである。更に、本明細書に記載の発現カセット及びベクターは、治療量の遺伝子産物の発現をより長期間導く。代表的には、治療的発現は、少なくとも20日間、少なくとも50日間、少なくとも100日間、少なくとも200日間、幾つかの場合には300日間又はそれより長く持続するように企図される。例えば、遺伝子産物の治療的発現が達成されているかどうかを評価するために、遺伝子産物(例えば、ポリペプチド)の発現は、任意の当該分野で認められた手段、例えば抗体ベースのアッセイ(例えば、ウェスタンブロット又はELISAアッセイ)により測定することができる。遺伝子産物の発現は、遺伝子産物の酵素的又は生物学的活性を検出するバイオアッセイにおいて測定してもよい。また、筋細胞、好ましくは心筋細胞及び/又は骨格筋細胞をトランスフェクト又は形質導入するための、本明細書に開示の核酸調節エレメント、核酸発現カセット又はベクターの使用も本明細書に開示される。
更に、筋細胞、好ましくは心筋細胞及び/又は骨格筋細胞における導入遺伝子産物の発
現のための、本明細書に開示の核酸発現カセット又はベクターであって、プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結した本明細書に開示の核酸調節エレメントを含む核酸発現カセット又はベクターの使用も本明細書に開示される。
更に、
－ 本明細書に開示の核酸発現カセット又はベクターであって、プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結した本明細書に開示の核酸調節エレメントを含む核酸発現カセット又はベクターで筋細胞をトランスフェクト又は形質導入し；及び
－ 筋細胞において導入遺伝子産物を発現させる
ことを含んでなる筋細胞、好ましくは心筋細胞及び/又は骨格筋細胞において導入遺伝子
産物を発現させる方法も本明細書に開示される。
筋細胞の非ウイルス性トランスフェクション又はウイルスベクター媒介形質導入は、インビトロ、エキソビボ又はインビボ手順により実施してよい。インビトロアプローチは、筋細胞、例えば、対象者から予め採取した筋細胞、筋細胞株又は例えば人工多能性幹細胞若しくは胚性細胞から分化した筋細胞のインビトロトランスフェクション又は形質導入を要する。エキソビボアプローチは、対象者からの筋細胞の採取、インビトロトランスフェクション又は形質導入、及び随意に、トランスフェクト筋細胞の対象者への再導入を要する。インビボアプローチは、対象者への本明細書に開示の核酸発現カセット又はベクターの投与を要する。好適な実施形態において、筋細胞のトランスフェクションは、インビトロ又はエキソビボで実施される。
当業者は、本明細書に開示の核酸調節エレメント、核酸発現カセット及びベクターの使用は、遺伝子治療以外、例えば幹細胞の筋原細胞への誘導分化、筋肉におけるタンパク質の過剰発現についてのトランスジェニックモデルなどにも有意義であると理解する。
本発明を、以下の非限定的な実施例により更に説明する。
実施例
実施例１：心筋及び骨格筋特異的調節エレメントの同定
実験手順
心臓及び筋肉の両方で高発現するが、他の組織では僅かな発現しか示さない遺伝子を、Xiaoら(2010. Bioinformatics 26:1273-1275)に記載された特異性測定(SPM)法を用いて同定した。データセットとして、本発明者らはヒトタンパク質をコードするトランスクリプトームのU133A/GNF1H Gene Atlas(GSE1133)を使用した(Suら，2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6062-6067)。これにより次の５遺伝子の最終候補リストがもたらされた：
フィラミン-ｃ遺伝子(FLNC)、アクチニン、α２遺伝子(ACTN2)、ミオシン調節軽鎖２、心室/心筋イソフォーム遺伝子(MYL2)、デスミン遺伝子(DES)及びテレトニン(telethonin)遺伝子(TCAP)。次に、これら遺伝子のゲノムコンテクストを、筋肉及び心臓での高発現に関連する転写因子結合部位(TFBS)に富む種間保存領域について検索した。ENCODEプロジェクト(The ENCODE Project Consortium. 2012. Nature 489:57-74)で規定されるようなオー
プンクロマチン構造及び/又は転写調節に関連する再現可能な生化学的特徴を有する領域
とオーバーラップするか又は該領域を含有する推定の核酸調節エレメントを選択することにより、追加のフィルタリングを行った。
心臓特異的調節エレメントについて、本発明者らは、30人の異なる個体の19の異なる器官からの158の正常ヒトサンプルに由来するマイクロアレイに基づく、18,927の独特な遺
伝子の高密度遺伝子発現データベースを使用した(Son, S.ら，2005. Database of mRNA gene expression profiles of multiple human organs. Genome Res. 15:443-450)。これ
を用いて、他の組織と比較して心臓で最も高発現(すなわち「過剰発現」)する遺伝子セットを同定した。各ペアの比較には両側ｔ検定を用いた。逆に、他の組織と比較して心臓で最も低い発現を示す遺伝子に相当する「過少発現」遺伝子のセットを同定した。この分析により、43セットの過剰発現遺伝子及び37の過少発現した心臓特異的遺伝子の一団が得られた。次に、これら「過剰発現」及び「過少発現」心臓特異的遺伝子の参照配列(RefSeq)識別(ID)リストを、UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu)データベースのrefGene表に格納された転写開始位置データを用いる、報告された転写開始部位(TSS)の1000塩
基上流の対応するプロモーター配列の抽出に使用した(NCBI36/hg18ゲノムアセンブリ)。
これにより、「過剰発現」又は「過少発現」遺伝子のプロモーターに相当する２セットの心臓特異的プロモーター配列がもたらされた。代表的プロモーター配列の非冗長なセットを作製するため、「uclust」(http://www.drive5.com/usearch/)を用いてプロモーター配列をフィルタリングした。
「過剰発現」又は「過少発現」遺伝子のプロモーターに相当する２セットの非冗長な組織特異的プロモーター配列を、De Bleserら(2007. Genome Biol 8:R83)(これは参照によ
り本明細書に具体的に組み込まれる)に詳細に記載されるDDM/MDS法のインプットとして使用した。観察された示差的挙動は、アップレギュレート又はダウンレギュレートする遺伝子群のプロモーターに特徴的な１又はそれより多いTFBSエレメントの存在により説明され得る。これら「示差的」TFBSエレメントは、以下の手順を用いて見出すことができた。第一に、TFBS位置重み行列(PWM)のライブラリ(TRANSFAC(登録商標) 2010.3)を用いて、プロモーター配列ごとにTFBSを予測した。筋特異的プロモーターについて、本発明者らは、Ｐ値カットオフ10-3を用いるFind Individual Motif Occurences(fimo)アプリケーションを用いた。プロモーターにつきPWMあたりの予想されたTFBSエレメントの数を、行列の形態(各横列はプロモーター配列に対応し、縦列は用いたPWMに対応)で集めた。２つのTFBSは、行列の対応する縦列が距離関数を用いて測定されるものと類似しているとき、相関しているとみなした。このアプローチを用いて、全てのTFBS関連性をまとめる距離行列を、両プロモーターセットにおけるTFBSについて構築した。最後に、距離差分行列(DDM)を計算し、このDDMに対して多次元スケーリング法を実施してその内容を二次元で可視化することによって、観察された示差的遺伝子発現に寄与していないTFBS(なぜならば、これらはDDM-MDSプロットの原点の近傍にマッピングされたからである)と、観察された示差的遺伝子発現の原因である可能性が高い「逸脱している」TFBSとを識別することができた。MDS手順は、より強く関連するTFBS同士を、関連性が少ないものより近くにプロットするので、プロモーターデータセット中のTFBS同士間の相互作用を強調することが可能であった。この手順により、心臓特異的プロモーターについて組織特異的高発現に関連するTFBSのリストが得られた。
筋特異的調節エレメントについては、筋特異的遺伝子のリストを、組織特異的遺伝子発現及び調節(TiGER)データベースから抽出した。これを用いて、筋組織で最も高発現(すなわち「過剰発現」)する遺伝子セットを同定した。逆に、筋肉で最も低い発現を示す遺伝
子に相当する「過少発現」遺伝子のセットを同定した。次に、これら「過剰発現」及び「過少発現」筋特異的遺伝子の参照配列(RefSeq)識別(ID)リストを、UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu)データベースのrefGene表に格納された転写開始位置データを用いる、報告された転写開始部位(TSS)の1000塩基上流の対応するプロモーター配列の抽出に使用した(NCBI36/hg18ゲノムアセンブリ)。これにより、「過剰発現」又は「過少発現」遺伝子のプロモーターに相当する２セットの筋特異的プロモーター配列がもたらされた。代表的プロモーター配列の非冗長なセットを作製するため、「uclust」(http://www.drive5.com/usearch/)を用いてプロモーター配列をフィルタリングした。
「過剰発現」又は「過少発現」遺伝子のプロモーターに相当する２セットの非冗長な組織特異的プロモーター配列を、De Bleserら(2007. Genome Biol 8:R83)(これは参照によ
り本明細書に具体的に組み込まれる)に詳細に記載されるDDM/MDS法のインプットとして使用した。観察された示差的挙動は、アップレギュレート又はダウンレギュレートする遺伝子群のプロモーターに特徴的な１又はそれより多いTFBSエレメントの存在により説明され得る。これら「示差的」TFBSエレメントは、以下の手順を用いて見出すことができた。第一に、TFBS位置重み行列(PWM)のライブラリ(TRANSFAC(登録商標) 2010.3)を用いて、プロモーター配列ごとにTFBSを予測した。筋特異的プロモーターについて、本発明者らは、Ｐ値カットオフ10-3を用いるFind Individual Motif Occurences(fimo)アプリケーションを用いた。プロモーターにつきPWMあたりの予想されたTFBSエレメントの数を、マトリクス
の形態(各横列はプロモーター配列に対応し、縦列は用いたPWMに対応)で集めた。２つのTFBSは、マトリクスの対応する縦列が距離関数を用いて測定されるものと類似していると
き、相関しているとみなした。このアプローチを用いて、全てのTFBS関連性をまとめる距離行列を、両プロモーターセットにおけるTFBSについて構築した。最後に、距離差分行列(DDM)を計算し、このDDMに対して多次元スケーリング法を実施してその内容を二次元で可
視化することによって、観察された示差的遺伝子発現に寄与していないTFBS(なぜならば
、これらはDDM-MDSプロットの原点の近傍にマッピングされたからである)と、観察された示差的遺伝子発現の原因である可能性が高い「逸脱している」TFBSとを識別することができた。MDS手順は、より強く関連するTFBS同士を、関連性が少ないものより近くにプロッ
トするので、プロモーターデータセット中のTFBS同士間の相互作用を強調することが可能であった。この手順により、筋特異的プロモーターについて組織特異的高発現に関連するTFBSのリストが得られた。
結果
この計算論的アプローチにより、表１にまとめた６つの心筋及び骨格筋特異的調節配列が同定された。
Figure 2023062192000001
 表１：心筋及び骨格筋特異的調節エレメント。Bp：塩基対.
実施例２：AAVベクターによる心筋及び骨格筋特異的調節エレメントのインビボ検証
実験手順
AAVプラスミド構築物(pAAV-CSk-SH-Des-Luc2)の創出
心筋及び骨格筋特異的調節エレメント(CSk-SH1～CSk-SH6)を従来のオリゴヌクレオチド合成により合成し、Acc65I及びMluI制限部位を側方に配置した。アデノ関連ウイルスベクター(AAV)骨格(pAAV-Des-Luc2と呼ぶ)において、ホタルルシフェラーゼ(Luc2)レポーター遺伝子の発現を駆動するデスミン(Des)プロモーターの上流に異なるCSk-SHをクローニン
グした(図３に概略図を示す)。対応するAAVプラスミド構築物をpAAV-CSk-SH-Des-Luc2と
呼ぶ。これらプラスミドは、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン及びシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化部位(pA)も含有していた。
AAVベクター(AAV9sc.CSk-SH1-6.Des.Luc2)の作製及び精製
AAV9ベクターは、Vandendriesscheら(2007. J Thromb Haemost 5:16-24)(これは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるとおりに、興味対象のpAAVプラスミドと、ア
デノウイルスヘルパープラスミドと、AAV2 rep遺伝子をAAV9 cap遺伝子と共に送達するキメラパッケージング構築物とでの293Tヒト胚性腎細胞のリン酸カルシウム(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)コトランスフェクションにより作製した。
簡潔には、トランスフェクションの２日後に、細胞を採取し、等密度遠心分離法を用いてベクター粒子を精製した。採取した細胞を、凍結/融解連続サイクル及び超音波処理に
より溶解し、ベンゾナーゼ(Novagen, Madison, WI)及びデオキシコール酸(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で処理した後、連続３回の塩化セシウム(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)密度勾配超遠心分離に供した。AAVベクター含有画分を回収し、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)(Gibco, BRL)中１mM MgCl2において濃縮し、－80℃で保存した。
ベクター力価(ウイルスゲノム(vg)/ml)を、ABI 7500リアルタイムPCRシステム(Applied
Biosystem, Foster city, CA, USA)においてSYBR Greenミックス(これはSYBR Green色素、Taqmanポリメラーゼ、ROX及びdNTPの全てを一体で含む)及びルシフェラーゼ特異的プライマーを用いる定量的リアルタイムPCRにより測定した。用いたフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ5'-CCCACCGTCGTATTCGTGAG-3'(配列番号14)及び5'-TCAGGGCGATGGTTTTGTCCC-3'(配列番号15)であった。
代表的には、全てのベクターについて、1.5～6.1×1011vg/mlの範囲の力価が、20ペト
リ皿のプロデューサー細胞の小製造バッチから達成された。より多数のペトリ皿(例えば60皿)のプロデューサー細胞を用いれば、より高い力価(代表的には、1012～1013gc/ml)のAAV粒子が達成されよう。既知のコピー数(102～107)の、対応するAAVベクターの創出に使
用したそれぞれのベクタープラスミド(適切なcDNAを含有)を用いて標準曲線を作成した。
動物研究
全ての動物手順は、ブリュッセル自由大学(VUB)(Brussels, Belgium)の大学内動物倫理委員会による承認を受けた。全てのマウスを特定病原体フリー条件下で飼育した；食餌及び水は自由摂取とした。
２日齢のCB.17/IcrTac/Prkdcscidマウスの眼窩周囲静脈に、表２にまとめたとおりの異なるCSk-SH(すなわち、CSk-SH1～CSk-SH6)調節エレメントを含有する濃縮ベクター(５×109vg/マウス)又は濃縮AAV9-Des-Luc2コントロールベクター(５×109vg/マウス)を50μl静脈内注射した。
Figure 2023062192000002
 表２：心筋及び骨格筋特異的調節エレメントの注射についての実験設計
注射後５～８週間の間に、週１回、生体内腔インビボ撮像システム(IVIS)を用いてマウスを撮影した。CCDを－120℃に冷却し、視野(FOV)をサンプル台の高さ25cmに設定した。
電荷結合素子(CCD)カメラは、CCDピクセルに衝突する波長400～1000nmの光子を電子に変
換することにより動作する。このことにより、２％イソフルラン及び酸素で麻酔したマウスからの可視像化赤外光の検出が可能になる。。Ｄ-ルシフェリン基質を150μg/g体重の
用量で静脈内注射した。注射９週間後にマウスを安楽死させ、インタクトな器官を採集し、生体内腔インビボ撮像システム(IVIS)を用いて撮影した。
mRNA分析
トータルRNAを、マウスの異なる器官からシリカ膜ベースの精製キットにより、製造業
者(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA)の指示に従って抽出した。その後、各サンプルに由来する50ngのトータルRNAを、cDNA合成キット(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA)を用いる逆転写(RT)に供した。次に、10ngのトータルRNAに相当するcDNA量を、ABI 7700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)で、5'-CCCACCGTCGTATTCGTGAG-3'(配列番号14)をフォワードプライマーとし、5'-TCAGGGCGATGGTTTTGTCCC-3'(配列番号15)をリバースプライマーとして用いる定量的(q)PCRにより増幅した(アンプリコン：217bp)。qPCR標準物は、既知量の系列希釈AAV9-CSk-SH-Des-Luc2プラスミドからなった。Luc2 mRNAレベルは、5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'(配列番号31)をフォワードプライマーとし、5'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'(配列番号32)をリバースプライマーとして用いる内因性マウスグリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ(mGAPDH)遺伝子のmRNA(アンプリコン：82bp)レベルに対して規格化した。RNAサンプルを逆転写酵素あり及びなし(DNA増幅を排除するため)で増幅した。増幅PCRフラグメントのサイズを1.8％アガロースゲルで検証した。
形質導入効率及びベクターの生体内分布
ウイルスベクターの形質導入効率及び生体内分布を、以前(Pacak, C.A.,ら，2008. Genet Vaccines Ther 6：13)に記載されたように、異なる器官及び組織でLuc2導入遺伝子のコピー数を定量することにより評価した。簡潔には、ゲノムDNAを30mgの各組織からDNeasy Blood & Tissueキットプロトコル(Qiagen, Chatsworth, CA, USA)に従って抽出し、各サンプルからの100ngのゲノムDNAを、Luc2特異的フォワードプライマー5'-CCCACCGTCGTATTCGTGAG-3'(配列番号14)及びリバースプライマー5'-TCAGGGCGATGGTTTTGTCCC-3'(配列番号15)を用いるqPCRに供した(アンプリコン：217bp)。既知のコピー数(102～107)の対応するプラスミドpAAV-CSk-SH-Des-Luc2を用いて標準曲線を作成した。結果を平均AAVコピー数/100ngゲノムDNAとして表した。
結果
インシリコで同定した心筋及び骨格筋特異的調節エレメント(CSk-SH)のインビボでの効果を評価するため、キメラプロモーターからルシフェラーゼ遺伝子luc2を発現するアデノ関連ベクターを創出した。このプロモーターは、心筋及び骨格筋特異的調節エレメントCSk-SH1～6に連結した筋特異的デスミン(Des)プロモーターから構成された。これらベクターをマウスに静脈内注射し、注射５及び６週間後にマウス全身画像を撮影して、ルシフェラーゼ発現レベルを調べた。
心筋及び骨格筋特異的調節エレメント(CSk-SH1～6)を含むベクターを注射した全てのマウスは、調節エレメントを含まない対応AAV9ベクターを注射したコントロールマウスと比較して増大したルシフェラーゼ活性を示した。このことから、試験した調節エレメントの全てがルシフェラーゼ発現を増大させることが示された(データは示さず)。本発明者らは、調節エレメントCSk-SH1、CSk-SH3又はCSk-SH5を含むAAV9ベクターを注射したマウスにおいて、注射５及び６週間後に、コントロールマウスのルシフェラーゼ活性と比較して、増強した非常に堅牢なルシフェラーゼ活性を観察した。
本発明者らはまた、個々の器官におけるルシフェラーゼ活性を測定した。注射９週間後、マウスを安楽死させ、個々の器官を分析してルシフェラーゼ発現及び生体内分布パターンを評価した。本発明者らは、調節エレメントCSk-SH1～6を含むAAVベクターを注射したマウスの心臓、二頭筋、三頭筋、四頭筋、前脛骨筋及び腓腹筋におけるルシフェラーゼ活性レベルの、コントロールマウスと比較した有意な増大を観察した。CSk-SH5調節エレメントを含むAAVベクターを注射したマウスの心臓では、コントロールマウスと比較して48倍までのルシフェラーゼ活性増強が測定された(図4A)。この調節エレメントは、筋肉、特には腓腹筋、前脛骨筋、四頭筋、二頭筋及び三頭筋でも最も強かった。よって、最強の調節エレメントはCSk-SH5であった。２番目に強力な調節エレメントはCSk-SH1であった。CSK-SH1を含むAAVベクターを注射したマウスの心臓では、コントロールマウスと比較して25倍のルシフェラーゼ活性増強が測定された。強いルシフェラーゼ活性は、CSk-SH1を注射したマウスの他の筋肉でも測定された。３番目に強力な調節エレメントはCSk-SH3であり、続いてCSk-SH6、CSk-SH4及びCSk-SH2であった。更に、その発現は心筋及び骨格筋に特異的であった。なぜならば、ベクターは他の全ての器官に形質導入されていたにも関わらず(図6A～6B)、ルシフェラーゼ発現は、他の全ての器官においてみられなかったか又は制限されていたからである(図5A)。器官で測定したルシフェラーゼ活性レベルは、それぞれの器官で測定したルシフェラーゼmRNAレベルと一致していた(図4B、5B)。これらインビボデータは、核酸調節エレメントCSk-SH、具体的にはCSk-SH1、CSk-SH3及びCSk-SH5、特にCSk-SH1及びCsk-SH5が心臓及び骨格筋特異的ルシフェラーゼ発現を増強することができることを示している。
実施例３：骨格筋特異的調節エレメントの同定
実験手順
先ず、筋特異的遺伝子のリストを組織特異的遺伝子発現及び調節(TiGER)データベース
から抽出した。これを用いて、筋組織で最も高発現(すなわち「過剰発現」)する遺伝子セットを同定した。逆に、筋肉で最も低い発現を示す遺伝子に相当する「過少発現」遺伝子のセットを同定した。次に、これら「過剰発現」及び「過少発現」筋特異的遺伝子の参照配列(RefSeq)識別(ID)リストを、UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu)データベースのrefGene表に格納された転写開始位置データを用いる、報告された転写開始部位(TSS)の1000塩基上流の対応するプロモーター配列の抽出に使用した(NCBI36/hg18ゲノムアセンブリ)。これにより、「過剰発現」又は「過少発現」遺伝子のプロモーターに相当する２セットの筋特異的プロモーター配列がもたらされた。代表的プロモーター配列の非冗長なセットを作製するため、「uclust」(http://www.drive5.com/usearch/)を用いてプロモーター配列をフィルタリングした。
「過剰発現」又は「過少発現」遺伝子のプロモーターに対応する２セットの非冗長な組織特異的プロモーター配列を、De Bleserら(2007. Genome Biol 8:R83)(これは参照によ
り本明細書に具体的に組み込まれる)に詳細に記載されるDDM/MDS法のインプットとして使用した。観察された示差的挙動は、アップレギュレート又はダウンレギュレートする遺伝子群のプロモーターに特徴的な１又はそれより多いTFBSエレメントの存在により説明され得る。これら「示差的」TFBSエレメントは、以下の手順を用いて見出すことができた。第一に、TFBS位置重み行列(PWM)のライブラリ(TRANSFAC(登録商標) 2010.3)を用いて、プロモーター配列ごとにTFBSを予測した。筋特異的プロモーターについて、本発明者らは、Ｐ値カットオフ10-3を用いるFind Individual Motif Occurences(fimo)アプリケーションを用いた。プロモーターにつきPWMあたりの予想されたTFBSエレメントの数を、行列の形態(各横列はプロモーター配列に対応し、縦列は用いたPWMに対応)で集めた。２つのTFBSは、行列の対応する縦列が距離関数を用いて測定されるものと類似しているとき、相関しているとみなした。このアプローチを用いて、全てのTFBS関連性をまとめる距離行列を、両プロモーターセットにおけるTFBSについて構築した。最後に、距離差分行列(DDM)を計算し、このDDMに対して多次元スケーリング法を実施してその内容を二次元で可視化することによって、観察された示差的遺伝子発現に寄与していないTFBS(なぜならば、これらはDDM-MDSプロットの原点の近傍にマッピングされたからである)と、観察された示差的遺伝子発現の原因である可能性が高い「逸脱している」TFBSとを識別することができた。MDS手順は、より強く関連するTFBS同士を、関連性が少ないものより近くにプロットするので、プロモーターデータセット中のTFBS同士間の相互作用を強調することが可能であった。この手順により、筋特異的プロモーターについて組織特異的高発現に関連するTFBSのリストが得られた。
次に、組織特異的過剰発現遺伝子のゲノムコンテクストを、組織特異的遺伝子高発現に関連するTFBSの種間保存領域について検索した。この目的のために、NCBI36/hg18ゲノム
アセンブリ中の全ての保存配列エレメントの配列を、UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu)データベースのphastConsElements44way表に格納された情報に基いてダウンロードした。予想された保存配列エレメントに、(保存モデル下でのlog確率)－(非保存モデル下でのlog確率)に等しいlogオッズスコアを割り当てた。このことにより、最も保存された配列エレメントと同時発生する推定の調節エレメントについての検索を限定することが可能となる。保存配列エレメントを、組織特異的高発現と関連するTFBSについてfimoアプリケーションを用いて上記のとおり走査した。内部で開発したパールスクリプト(Perl script)を用いて、これにより、組織特異的高発現に関連するTFBSのクラスターを含有する高度に保存された配列エレメント(すなわち核酸調節エレメント)が同定された。ENCODEプロジェクト(The ENCODE Project Consortum. 2012. Nature 489:57-74)で規定されたようなオープンクロマチン構造及び/又は転写調節に関連する再現可能な生化学的特徴を有する領域とオーバーラップするか又は該領域を有する推定の核酸調節エレメントを選択することにより、追加のフィルタリングを行った。
結果
この計算論的アプローチにより、表３にまとめた６つの筋特異的調節配列が同定された。
Figure 2023062192000003
 表３：筋特異的調節エレメント。Bp：塩基対.
実施例４：デスミンプロモーターを含むAAVベクターによる骨格筋特異的調節エレメント
のインビボ検証
実験手順
骨格筋特異的調節エレメント(pAAV-Sk-SH-Des-Luc2)を含むAAVプラスミド構築物を、実施例２に記載のプロトコルに従って創出した。簡潔には、骨格筋特異的調節エレメントを従来のオリゴヌクレオチド合成により合成し、Acc65I及びMluI制限部位(Sk-SH1、Sk-SH2
、Sk-SH3、Sk-SH4、Sk-SH5及びSk-SH7)又はBsiWI及びMluI制限部位(Sk-SH6)を側方に配置した。AAVベクター骨格pAAV-Des-Luc2において、ホタルルシフェラーゼ(Luc2)レポーター遺伝子の発現を駆動するデスミン(Des)プロモーターの上流に異なるSk-SHをクローニングした。これらプラスミドは、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン及びシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化部位(pA)も含有していた。
AAVベクターの作製及び精製並びに動物研究は、実施例２に記載のとおりに行った。実
験設計を表４にまとめる。
Figure 2023062192000004
 表４：骨格筋特異的調節エレメントの注射についての実験設計
mRNA分析及び形質導入効率並びにベクターの生体内分布は、実施例２に記載のとおりに評価した。
結果
骨格筋特異的調節エレメントSk-SH1～7に連結したデスミン(Des)プロモーターから構成されるキメラプロモーターからルシフェラーゼ遺伝子luc2を発現するアデノ関連ベクターを創出した。これらベクターをマウスに静脈内注射し、注射５及び６週間後にマウス全身画像を撮影して、ルシフェラーゼ発現レベルを調べた。
骨格筋特異的調節エレメント(Sk-SH1～7)を含むベクターを注射した全てのマウスは、
調節エレメントを含まない対応AAV9ベクターを注射したコントロールマウスと比較して増大したルシフェラーゼ活性を示した。このことから、試験した調節エレメントの全てがデスミンプロモーターからのルシフェラーゼ発現を増大させることが示された(データは示
さず)。本発明者らは、調節エレメントSk-SH1又はSk-SH4を含むAAV9ベクターを注射した
マウスにおいて、注射５及び６週間後に、コントロールマウスのルシフェラーゼ活性と比較して、増強した非常に堅牢なルシフェラーゼ活性を観察した。
注射７週間後、マウスを安楽死させ、個々の器官を分析してルシフェラーゼ発現及び生体内分布パターンを評価した(図８及び９)。Sk-SH4調節エレメントを含むAAVベクターを
注射したマウスの骨格筋、特に、腓腹筋、前脛骨筋、四頭筋、二頭筋及び三頭筋では、コ
ントロールマウスと比較して200～400倍までのルシフェラーゼ活性増強が測定された(図
８)。心臓で測定した場合も、心臓及び骨格筋の両方に特異的であるデスミンプロモータ
ーの使用により、36倍のルシフェラーゼ活性増強が依然として存在した(図８)。ルシフェラーゼ発現は、心筋及び骨格筋組織以外の他の全ての器官においてみられなかったか又は制限されていた(図９)。２番目に強力な調節エレメントはSk-SH1であった。これもまた、デスミンプロモーターからのルシフェラーゼ発現を骨格筋で有意に増大させ、より弱い程度ではあるが心筋でも増大させた。
心臓及び異なる骨格筋で測定したルシフェラーゼ活性レベルは、それぞれの器官で測定したルシフェラーゼmRNAレベルと一致していた(図12)。図13に示すとおりベクターは種々の器官に形質導入されていたにも関わらず、ルシフェラーゼ発現は、心筋及び骨格筋組織以外の他の全ての器官においてみられなかったか又は制限されていた(図９)。
これらインビボデータは、核酸調節エレメントSk-SH、特にSk-SH1及びSk-SH4が心臓及
び骨格筋特異的ルシフェラーゼ発現を増強することができることを示している。核酸調節エレメントSk-SH4は、同定した他の５つの調節エレメントと比較して、心臓及び骨格筋で最高レベルのルシフェラーゼ発現を導く最強のエレメントである。本発明者らが測定した最高活性は、脛骨におけるルシフェラーゼ活性の400倍のアップレギュレーションであっ
た。
実施例５：筋特異的調節エレメント及びCMVプロモーターのインビボ比較
実験手順
筋特異的調節エレメントを含むAAVプラスミド構築物(pAAV-Sk-SH4-Des-Luc2、pAAV-CSk-SH1-Des-Luc2、pAAV-CSk-SH5-Des-Luc2)を、実施例２に記載のプロトコルに従って創出した。簡潔には、筋特異的調節エレメントを従来のオリゴヌクレオチド合成により合成し、AAVベクター骨格pAAV-Des-Luc2において、ホタルルシフェラーゼ(Luc2)レポーター遺伝子の発現を駆動するデスミン(Des)プロモーターの上流にクローニングした。これらプラスミドは、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン及びシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化部位(pA)も含有していた。
AAVベクター骨格pAAV-Des-Luc2において、デスミンプロモーターの代わりにサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(配列番号30)がホタルルシフェラーゼ(Luc2)レポーター遺
伝子の上流にクローニングされているpAAVsc-CMV-Luc2-SV40pAプラスミド構築物を創出した。これらプラスミドはシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化部位(pA)も含有していた。pAAVsc-CMV-Luc2-SV40pAの概略図を図10Aに示す。AAVsc-CMV-Luc2-SV40pAのクローニングのために、フラグメント5'-Acc65I-CMV-HindIII-3'を合成し、同じ酵素対(すなわち
、Acc65I及びHindIII)で制限したAAVsc-Luc2-SV40pAベクターにクローニングした。
AAVベクターの作製及び精製は実施例２に記載のとおりに行った。
平均体重17.4±1.6ｇの６週齢雄性CB17 SC SCIDマウスの眼窩周囲静脈に、１×1010vg/マウスの濃縮ベクターを静脈内注射した。実施例２に記載のとおり、注射４週間後にマウスを撮像した。注射５週間後にマウスを安楽死させ、インタクトな器官を採集し、実施例２に記載のとおりに撮像した。
結果
ルシフェラーゼ活性を、筋特異的調節エレメントSK-SH4、CSk-SH1又はCSk-SH5に作動可能に連結したデスミン(Des)プロモーターからルシフェラーゼ遺伝子luc2を発現するベク
ターを注射したマウスとサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターからルシフェラーゼ遺
伝子luc2を発現するベクターを注射したマウスとで比較した。CMVプロモーターは、心臓
での強力な遺伝子発現を可能にすることが知られている最も強力なプロモーターの１つであると考えられている。後者のベクターには筋特異的調節エレメントは存在させなかった。
図10A及び10Bは、デスミンプロモーターに作動可能に連結した本発明の筋特異的調節エ
レメントを含むベクターが、CMVプロモーターを含むベクターより遥かに良好な発現を可
能にすることを示している。
実施例６：骨格筋特異的プロモーターを含むAAVベクターによる骨格筋特異的調節エレメ
ントのインビボ検証
実験手順
デスミンプロモーターがWangら(2008. Gene Ther. 15:1489-1499)に記載された筋特異
的プロモーターで置換されたAAVプラスミドを実施例４に記載のとおりに構築した。
AAVベクターの作製及び精製並びに動物研究は、実施例２に記載のとおりに行った。

結果
デスミンプロモーターに代えて骨格筋特異的プロモーターを用いた場合、ルシフェラーゼ発現の増大は骨格筋のみに限局される。このことは、核酸調節エレメントSk-SH1～7、
特にSk-SH4及びSk-SH1が骨格筋特異的ルシフェラーゼ発現を増強することを示している。
実施例７：同定した筋特異的調節エレメントの機能的フラグメントのインビボ検証
実験手順
同定した核酸調節エレメントCSk-SH1(配列番号１；381bp)、CSk-SH5(配列番号５；454bp)及びSk-SH4(配列番号10；435bp)を、より小さな機能的フラグメントに分割した。調節
エレメントの転写因子結合部位(TFBS)をそれぞれの配列にマッピングし(図11A～11C)、TFBSを有する領域の無作為クラスター化により機能的フラグメントを創出した。以下の機能的フラグメントを創出した：
配列番号１の機能的フラグメント：
クラスター1A：配列番号１の33位～58位のヌクレオチド配列
クラスター1B：配列番号１の90位～142位のヌクレオチド配列
クラスター1C：配列番号１の143位～233位のヌクレオチド配列
クラスター1D：配列番号１の240位～310位のヌクレオチド配列
クラスター1E：配列番号１の90位～233位のヌクレオチド配列
配列番号５の機能的フラグメント：
クラスター5A：配列番号５の47位～130位のヌクレオチド配列
クラスター5B：配列番号５の252位～293位のヌクレオチド配列
クラスター5C：配列番号５の330位～450位のヌクレオチド配列
配列番号10の機能的フラグメント：
クラスター4A：配列番号10の10位～180位のヌクレオチド配列(配列番号37)；
クラスター4B：配列番号10の190位～240位のヌクレオチド配列(配列番号38)；
クラスター4C：配列番号10の241位～300位のヌクレオチド配列(配列番号39)；
クラスター4E：配列番号10の241位～360位のヌクレオチド配列(配列番号41)
クラスター4D：配列番号10の380位～420位のヌクレオチド配列(配列番号40)
Sk-SH4の機能的フラグメントを表５にまとめる。
Figure 2023062192000005
 表５：筋特異的調節エレメントSk-SH4の機能的フラグメント
Sk-SH4の機能的フラグメントを従来のオリゴヌクレオチド合成により合成し、実施例２に記載のとおりにpAAV9sc-Des-Luc2ベクターにクローニングした。AAVベクターの作製及
び精製は実施例２に記載のとおりに行った。平均体重約17～18ｇ/マウスの６週齢CB17/IcrTac/Prkdc scid成体マウスにAAVベクターを１×1010vg/マウスの用量で静脈内注射した。注射２及び４週間後に、実施例２に記載のものと同じ生体内腔インビボ撮像システムを用いてマウスを撮像した。
結果
図14に示す結果は、Sk-SH4調節エレメントの５つ全てのフラグメントが、調節エレメントを有さない参照構築物と比較したとき、デスミンプロモーターから駆動されるルシフェラーゼ遺伝子発現を増強することができることを示している。フラグメントSk-SH4bは、
その他のフラグメントと比較して最高のルシフェラーゼ発現を示した。しかし、いずれのフラグメントも、全長Sk-SH4フラグメントが誘導する発現と比較して、同等以上のルシフェラーゼ発現を達成することはできなかった。
実施例８：筋特異的調節エレメントのモジュールのインビボ検証
異なる調節エレメントの組合せの作製及び/又は同じ調節エレメントの数コピーの使用(例えば、CSk-SH1とCSk-SH5との組合せ；CSk-SH1とSk-SH4との組合せ；CSk-SH1とCSk-SH5
とSkSH4との組合せ；CSk-SH1の３反復又は４反復；CSk-SH5の３反復又は４反復；Sk-SH4
の３反復又は４反復)により、筋特異的調節エレメントを更に検証した。これら構築物を
、実施例２に記載のプロトコルに従って、Desプロモーターの上流に組み込む。AAVベクターの作製及び精製並びに動物研究は実施例２に記載のとおりに行う。
同定した筋特異的調節エレメントの機能的フラグメントを有する更なる組合せを、実施例７で創出したとおりに作製する。
実施例９：転写因子の筋特異的調節エレメントへの結合
実験手順
４週齢マウスの眼窩周囲静脈に、Sk-SH4及びCSk-SH5調節エレメントを含有するAVVベクター、すなわち、AAV9sc-Sk-SH4-Des-Luc及びAAV9sc-CSk-SH5-Des-Lucを５×109vg/マウ
スの用量で静脈内注射した。
マウスから採取した心臓及び筋組織を、１％ホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝化
生理食塩水(PBS)に浸漬し、小片に切り出し、室温で15分間インキュベートした。0.125Ｍグリシン(最終濃度)の添加により固定を停止した。次いで、組織片をTissue-Tearerで処
理して、最後に遠心沈降させ、PBSで２回洗浄した。溶解緩衝液を添加し、続いてDounce
ホモジナイザーで破壊してクロマチンを単離した。溶解物を超音波処理し、DNAを平均長300～500bpに剪断した。１つのクロマチンアリコートをRNアーゼ、プロテイナーゼＫで処
理し、脱架橋のために加熱し、続いてエタノール沈降に供することにより、ゲノムDNA(インプット)を作製した。ペレットを再懸濁し、得られるDNAをNanoDrop分光計で定量した。元のクロマチン体積に外挿して総クロマチン収量を定量した。１つのクロマチンアリコート(30μg)をプロテインＡアガロースビーズ(Invitrogen, catalogue number 15918-014)
で前処理した。MEF2(Santa Cruz，sc-313)、SRF(Santa Cruz，sc-335)及びCEBP(Santa Cruz，sc-150)に対する抗体４μgを用いて興味対象のゲノムDNA領域を単離した。複合体を洗浄し、SDS緩衝液でビーズから溶出させ、RNアーゼ及びプロテイナーゼＫ処理に付した。65℃にて一晩のインキュベーションにより架橋を還元させ、フェノール-クロロホルム抽出及びエタノール沈降によりChIP DNAを精製した。SYBR Green Supermix(Bio-Rad)を用いる定量的PCR(QPCR)反応を、特定のゲノム領域について３つ組で行った。得られたシグナルは、各プライマー対についてインプットDNAを用いるQPCRを行うことにより、プライマー効率について規格化した。Sk-SH4用のプライマー配列は5'-GTCCCTCACTCCCAACTCAG-3'(配列番号33；フォワード)及び5'-GAGGAGAAGGAGATCAGACACTG-3'(配列番号34；リバース)であり；CSk-SH5用のプライマー配列は：5'-TAGCTGGGCCTTTCCTTCTC-3'(配列番号35；フォワード)及び5'-CGTCTCCCTAGCAGCAACAG-3'(配列番号36；リバース)であった。ネガティブコントロールプライマーは、Active Motif(Carlsbad, CA, USA)(#71012)から購入した。
これは第17染色体上の非転写遺伝子配列に特異的である。
結果
筋特異的調節エレメントSk-SH4は、E2A、SRF、p53、CEBP、LRF、MyoD及びSREBPを含む
幾つかの推定の転写因子結合部位(TFBS)を含有する。クロマチン免疫沈降(CHIP)アッセイを用いて、CEBP及びSRFのSk-SH4エレメントへの結合を、AAV9sc-Sk-SH4-Des-Lucベクターを注射したマウスの心臓及び骨格筋で確証した(図15A、15B)。同様に、CEBP及びMEF2エレメントのCSk-SH5調節エレメントにの結合が、AAV9sc-CSk-SH5-Des-Lucを注射したマウス
の心臓及び骨格筋で示された(図15C、15D)。
実施例10：デスミンプロモーターを含むAAVベクターによる筋特異的調節エレメントの治
療上の評価
発現に対する筋特異的調節エレメントSk-SH4の効果、及び遺伝子治療による筋疾患(例
えばデュシェーヌ筋ジストロフィー(DMD))の処置について治療上の可能性を有する２つの治療用遺伝子(具体的にはマイクロジストロフィン及びフォリスタチン)の治療効力を評価した。MDX-SCIDマウスは、患者におけるデュシェーヌ筋ジストロフィーの疾患徴候を再現し、したがってAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1及びAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucベクタ
ーの治療効力の評価に十分に適する。

実験手順
AAVへのフォリスタチン及びMD1遺伝子のクローニング
マイクロジストロフィン１(MD1)(Kooら，2011)及びフォリスタチン(FST)(Kotaら，2009)遺伝子をクローニングし、筋特異的調節エレメントSk-SH4に作動可能に連結したデスミンプロモーターから駆動させた。MD1遺伝子の5'末端及び3'末端の側方にはそれぞれMluI及びXhoI制限部位を配置し、FST遺伝子の5'末端及び3'末端の側方にはそれぞれMluI及びSalI制限部位を配置し、従来のオリゴヌクレオチド合成により合成した。デスミンプロモーターに作動可能に連結したSk-SH4調節エレメントを、一本鎖アデノ関連ウイルスベクター(AAVss)骨格において、MVMイントロンの上流にクローニングした。こられベクターは、49bpの合成proudfootポリアデニル化部位(Levitt Nら，1989)も含有していた。フォリスタチン遺伝子は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に2Aポリペプチドを介して連結した。創出した構築物をそれぞれpAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1及びpAAVss-Sk-CRM4-Des-MVM-FST-2A-Lucと呼び、概略的に図16に示す。
AAVベクターの作製及び精製は実施例２に記載のとおりに行った。
MDX-SCIDマウスの表現型修正についてのトレッドミル試験
４週齢MDX-SCIDマウス(自家飼育)に用量２×1010vg/マウスのAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1及びAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucベクターを、個別に又は組み合わせて、総容量100μlで静脈内注射した。注射８週間後、処置MDX-SCIDマウス及びコントロールMDX-SCIDマウス(PBSを注射)をトレッドミル試験に供した。トレッドミル試験は、Exer-3/6オープントレッドミル(Columbus instruments, USA)を用いて実施した。試験前に、ベルトの傾斜を10°の上り坂に設定した。初期速度を10ｍ/分に設定した後、速度を毎分１ｍずつ増加させた。マウスがパルスグリル上で５秒間以上休んだときに試験を終了した。その時点で、マウスが走った距離を記録し、試験中にマウスが走った総距離を、次式：距離＝((Ｎ＋ｎ)/２)×(Ｎ－ｎ＋１)(式中、Ｎは試験終了時の時間(分)であり、ｎは試験開始時の時間(分)である)を用いて算出した。

mRNA分析
mRNA分析を実施例２に記載のとおりに行った。マイクロジストロフィン及びフォリスタチン遺伝子のmRNAを定量するため、マイクロジストロフィンについては、プライマー5'-GTGCCCTACTACATCAA-3'(配列番号42)をフォワードプライマーとし、5'-AGGTTGTGCTGGTCCA-3'(配列番号43)をリバースプライマーとして用い(アンプリコン206bp)、フォリスタチン遺伝子については、Luc2特異的フォワードプライマー5'-CCCACCGTCGTATTCGTGAG-3'(配列番号14)及びリバースプライマー5'-TCAGGGCGATGGTTTTGTCCC-3'(配列番号15)(アンプリコン217bp)を用いるqPCRベースの方法を使用した。
結果
トレッドミル試験結果は、MD1若しくはFST単独又はそれらの組合せでの遺伝子治療により処置されたマウスが未処置コントロールMDX-SCIDマウスを凌ぐ成績を示すことを明確に証明した(図17)。AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1又はAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucベク
ターを注射したMDX-SCIDマウスは、コントロールマウスが走った距離の２倍の距離を走った。両ベクターをMDX-SCIDマウスに同時注射したとき、走った距離は４kmであった。これは、PBSを注射したコントロールMDX-SCIDマウスが走った距離の４倍を越える。これら結
果は、これらベクターにより治療効力が達成できることを明確に証明している。
AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1若しくはAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucベクター又はそ
れらの組合せを用いる遺伝子治療の顕著な生理学的効果は、組織学的検査により確証された。ヘマトキシリン/エオシン染色した筋切片を、異なる実験群について、中心に核を有
する細胞の割合(％)を求めた(図18)。C57B6野生型マウスの筋切片は、筋線維において核
が周縁部に優勢に位置することを示し(データを示さず)、極少ない割合(＜２％)の核が中心に位置していた(図18B)。未処置コントロールMDX/SCIDマウスでは、筋線維の横断切片
において、核は中心に優勢に位置していた(約50％の核)(図18Aa、図18B)。AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1(AAV9-MD1)(図18Ac、図18B)又はAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Luc(AAV9-FST)(図18Ab、図18B)を注射したMDX/SCIDマウスは全て、中心に核を有する筋線維の数が減少した。両AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1及びAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucベクターの同時投与は、核位置の筋線維周縁部への更に顕著なシフト及び核が中心に位置する割合の更なる低下をもたらした(図18Ad、図18B)。これら結果は、遺伝子治療後の再生刺激の減少及び表現型修正を示唆している。結果として、筋線維における核位置の中心からより周縁部へのシフトは、トレッドミルアッセイにおける移動性及び筋強度の改善で示される表現型修正と一致する。
定量的RT-PCRを用いて、pAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1構築物、pAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-F
ST-2A-Luc構築物又は両構築物の組合せを注射したマウスの心臓及び筋組織(特に腓腹筋及び四頭筋)からの生検において、マイクロジストロフィン(MD1)及びフォリスタチン(FST)
遺伝子の発現を評価した(図19)。
実施例11：筋特異的調節エレメントとCMV及びSPc5-12プロモーターとのインビボ比較
実験手順
AAVベクターの作製及び精製は、実施例２に記載のとおりに行った。
AAVsc-Des-MVM-Lucベクターは、デスミンプロモーターから駆動されるルシフェラーゼ(Luc)導入遺伝子を含有する自己相補性AAVベクターである。このscAAVベクター骨格は、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン及びシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化部位(pA)も含有していた。
AAVsc-SPc5-12-MVM-LucベクターはAAVsc-Des-MVM-Lucベクターと同じ配置であったが、デスミンプロモーターがSPc5-12プロモーターで置換されていた。
筋特異的調節エレメントSk-SH4を含むAAVベクターを、実施例２に記載のプロトコルに
従って創出した。簡潔には、筋特異的調節エレメントSk-SH4を従来のオリゴヌクレオチド合成により合成し、AAVsc-Des-MVM-Luc又はAAVsc-SPc5-12-MVM-LucのAAVベクター骨格に
おいてそれぞれデスミン又はSPc5-12プロモーターの上流にクローニングした。
AAVsc-CMV-Lucベクターは、デスミンプロモーターの代わりに、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(配列番号30)を、(ポリアデニル化部位(pA)も含有する)AAVsc-Des-Luc
のAAVベクター骨格においてルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングする
ことにより創出した。
これら異なるベクターの概略図を図20に示す。
成体CB17/IcrTac/Prkdcscidマウスにこれら異なるベクターを１×1010vg/マウスの用量で静脈内注射した(ｎ=３)。
mRNA分析を実施例３に記載のとおりに行った。
結果
ルシフェラーゼmRNAレベルを、筋特異的調節エレメントSk-SH4に作動可能に連結したデスミンプロモーターからルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクターを注射したマウスと、筋特異的調節エレメントに作動可能に連結していないサイトメガロウイルス(CMV)プロモ
ーター又はSPc5-12プロモーターからルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクターを注射し
たマウスとで比較した。CMV及びSPc5-12プロモーターは、心臓及び骨格筋での強力な遺伝子発現を可能にすることが知られている最も強力なプロモーターと考えられている。図21は、デスミンプロモーターに作動可能に連結した本発明のSk-SH4筋特異的調節エレメントを含むベクターが、CMV又はSPc5-12プロモーターを含むが筋特異的調節エレメントを有さないベクターより遥かに良好な発現を可能にすることを示している。
同様に、Sk-SH4筋特異的調節エレメントをSPc5-12プロモーターに作動可能に連結する
と、ルシフェラーゼmRNAレベルの増加が心臓及び試験した全ての骨格筋タイプで観察された(図21)。しかし、この構築物から誘導されたmRNAレベルは、本発明のSk-SH4筋特異的調節エレメントをデスミンプロモーターに作動可能に連結したときより低かった。
SEQUENCE LISTING

<110> VRIJE UNIVERSITEIT BRUSSEL
VIB vzw
Universiteit Gent

<120> MUSCLE-SPECIFIC NUCLEIC ACID REGULATORY ELEMENTS AND METHODS AND
USE THEREOF

<130> VUB-062-PCT

<150> 14151960.3
<151> 2014-01-21

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Heart and skeletal muscle-specific regulatory element 1 (CSk-SH1)

<400> 1
gttctcctct ataaataccc gctctggtat ttggggttgg cagctgttgc tgccagggag 60

atggttgggt tgacatgcgg ctcctgacaa aacacaaacc cctggtgtgt gtgggcgtgg 120

gtggtgtgag tagggggatg aatcagggag ggggcggggg acccaggggg caggagccac 180

acaaagtctg tgcgggggtg ggagcgcaca tagcaattgg aaactgaaag cttatcagac 240

cctttctgga aatcagccca ctgtttataa acttgaggcc ccaccctcga cagtaccggg 300

gaggaagagg gcctgcacta gtccagaggg aaactgaggc tcagggctag ctcgcccata 360

gacatacatg gcaggcaggc t 381


<210> 2
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Heart and skeletal muscle-specific regulatory element 2 (CSk-SH2)

<400> 2
cgtctataaa ttccagggaa ggtctctgat tggccctgct cattcccagg cccattcctt 60

gacccagtca ctgaagtcag ggagatgcag taataagact ggctggaatc agggtcttta 120

ggggtggagg gatggggagg aggcacagca tgtcatcaaa ataaggaaat tgcaaaagaa 180

agcttgcagg ctactttgaa tgacaatgag aaagacggtg ctgcctgagt gtgttaagga 240

tccacatggt ctccaaaatc ctccaggagc atacagtcta gtctgggaga tgagacacaa 300

aaataaccag aacacaacag cttgcactga ctcgagggct ggataagaat atctggaact 360

cccccatcta tttcagaagc ttgtctcttg gatgaaaatt agacacttaa tgggaaaggg 420

ctttgaaaag agtgc 435


<210> 3
<211> 551
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Heart and skeletal muscle-specific regulatory element 3 (CSk-SH3)

<400> 3
aaaaaataaa aataaaaaat aaaaataaat aaagtggatg gcttagagta tcttttctgt 60

ttagacctga ctaaagctta gacataattg ttagtttagg ctctcagggt aaaatttatt 120

actgtaaatc caaaaaatcc cttcttcttc tttttttttt tttttttggt ccttgaatta 180

aatgctgtca cctccttctt gaaaggagaa actattagtc agatttgaaa atcctcttta 240

tcacccagga aaatcatttt tatggacact ttgtctttct gtagtctgac ttagaagcag 300

cctgtttttg ataggttgaa gttttcatct tgaacacaaa ccctgtttgt gtgtccccta 360

ctccccagtt tgatgtgcca ggcactttgt tctcaagccc agcagctgtt gtgggatgag 420

gggacatttt gcatgcttag ccagcagctg ccagaaacat ttctaatctg gttttggcag 480

gaaatagggc acaagtggaa gccaagttaa aagaagctgg aaaaataaac agaataactt 540

tagatgtcac t 551


<210> 4
<211> 430
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Heart and skeletal muscle-specific regulatory element 4 (CSk-SH4)

<400> 4
tgcactgtag actatttatg tttgcatatt tttcaggatt gtgtacagta aaccttaagt 60

gaatacaaag gatccaattg tcctgtaaga ctcacttcaa ttacagattg tgctcagtat 120

taaactttgc tagtactttc aggatgcagt caatcaagag gcagggaaag gtctgtcagc 180

atccacagcc tccttttcaa attggacact tagtctctgg tccgaataat aggtgccccc 240

agtgtcacct cacacaatgg ggtatacaca gtttttaaaa atttattttc agctgggcac 300

agtagctcac acctaaaatc ccagcacttt gggaggctga ggcaggtgga tcacctgagg 360

tcaggagttc aagaccagcc tggccaacgt ggcaaaatcc tgtctctact aaaaatacaa 420

aaattaaccg 430


<210> 5
<211> 454
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Heart and skeletal muscle-specific regulatory element 5 (CSk-SH5)

<400> 5
cagtttactc accagggatt cagaggcagc actgctgaac cctgagccct tggcacatca 60

ggttggctgt cagaagtcgg cctttgtaca tacacagttc ccttgtgagg cccagctgcg 120

tgtcctagga gcggggcctc tctccacagc agagctcagc ctctcaagtg tatggacagc 180

acgggtgcct gatgggtgga tttagccatg agttgaaggt ggcttgggga gaatgagagt 240

tctagagata gggagaaggg gttgccaata ggagagtgga attcctgagc acctcgtcac 300

aggcagccga cagaacatga gccgcagggc ccaggctatt tatacctcgc ctgtcactat 360

cagggtcccc acagctcccc ccacctccag ccacacacag caggtccttt tgctctttct 420

ggtcccttct ctactcctcc ccctccctac ctaa 454


<210> 6
<211> 453
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Heart and skeletal muscle-specific regulatory element 6 (CSk-SH6)

<400> 6
ccctttccct ggcaggatct gccctgtggc ccaaatgggc atgttgccca gggggctccc 60

tggcactatg ggggaagagt ctctccttcc cctcttatca tctcagttga gtcagacttg 120

ggggaggggg atacacagtg tgagtcactg ggtacccttt tcctgagctc agcttcatac 180

cgaggcgatg aggccaaacg ggctggtgac agggacactg agtcaggggc aggggccccg 240

gtcttactcc tgggcctctg gatttgggcc ctacatgagg cttttctatc tgtaaagtca 300

agcaatggct gggaggcaca cacaaccccc cgcccccccg caggcttctc cttcattggc 360

ccgggcaagg tccctgcttc ctctcaggcc gtctctgcac aagcacacac acttcccttc 420

cctgtccaca ggtggacaat gccctgggct agg 453


<210> 7
<211> 495
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Skeletal muscle-specific regulatory element 1 (Sk-SH1)

<400> 7
ctcactcccc gcccaggcag caaggagccc acaccctcat gcccctcagc ttcagccccc 60

acctccagga ggccctaccc acgctcatga ccttgctatt ctgggccttg tgtcctgtag 120

ggagatggac aggagacagc tgggcttcca ggccacccag gcggggggct agccgaggga 180

agcctgctgg ctctcctgct tgctctaatt tctggggctc cccaaacctt ggcctcagga 240

gactggggat aggaccggcc ttgaaagtgg gggaagcttt ggagagccgg gtgctgggtt 300

cttagtgaga tggccagtga aggctgtggt gccccgaggt aagcagggcc tgatcccctc 360

ctaatcttcc agcagcaact ggtgctctga ggctccccct cccccagccc tgccagcctt 420

cagggacctg ccttccaaag atgggcaggg gagggggacg aggacaccca cccactcctc 480

agaccagcat gtctt 495


<210> 8
<211> 344
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Skeletal muscle-specific regulatory element 2 (Sk-SH2)

<400> 8
ccctccagat gggtttcctg gaatctagat ttcccaggtt ccaaaggaca cccgagtctc 60

atgcctggaa ctcagtgaga ctaattcacc tctcctctgc cctaatcttc atctccagcc 120

agaagccaac agatcccagg ggactggagc cacaggggct gcacctgttt accgggtatt 180

tttaggatgg ttgatgaaca cataataccc accctatagt cagagaaaga caatgcctgc 240

tatgttaatc ctgtggctat tatagtctgt catctcatgg gttggggcag gacactgacc 300

ctctcagagg ccagagagag gcctcgcaag caggaggtta ggga 344


<210> 9
<211> 430
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Skeletal muscle-specific regulatory element 3 (Sk-SH3)

<400> 9
atggagacaa tccatgaatt cctgagatgc ttggctggta ttagatttta tgggcagctg 60

cttattctta gggctctgct tctccaaaga cactgaggaa gtccaaagga aacaccagct 120

ggcgaagagc cacctccagg cccatctgtc catcatcagc ctccaggaat gccagtgtcc 180

agagggcacc aggtctgcgt ctgtctccct gggatgtgcc ttgtccttgg tgggcatttg 240

gcagtgatca tgcctccctg tctccctcag agatccaact gtccccattg tggggcccta 300

ccttccaagg ccggtttaca cctcctgcca agctccgggg cctgccccca gcctgcctca 360

ctgacaaatg ccagaccaag gggtcccacg tcaggcaaga ggcctcagcc tgtgctctga 420

cacccctcag 430


<210> 10
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Skeletal muscle-specific regulatory element 4 (Sk-SH4)

<400> 10
ttctgagtcc tctaaggtcc ctcactccca actcagcccc atgtcctgtc aattcccact 60

cagtgtctga tctccttctc ctcacctttc ccatctcccg tttgacccaa gcttcctgag 120

ctctcctccc attccccttt ttggagtcct cctcctctcc cagaacccag taataagtgg 180

gctcctccct ggcctggacc cccgtggtaa ccctataagg cgaggcagct gctgtctgag 240

gcagggaggg gctggtgtgg gaggctaagg gcagctgcta agtttagggt ggctccttct 300

ctcttcttag agacaacagg tggctggggc ctcagtgccc agaaaagaaa atgtcttaga 360

ggtatcggca tgggcctgga ggagggggga cagggcaggg ggaggcatct tcctcaggac 420

atcgggtcct agagg 435


<210> 11
<211> 474
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Skeletal muscle-specific regulatory element 5 (Sk-SH5)

<400> 11
gactaggaat aaatcacata tcctcaatcc ctggacaact tgtttacttc tagtgttagt 60

tttttcttaa aaaaaaaatt gaaatcattc tgaggctgga atactttgga catgcccagc 120

agttcctggc agttcccaca gaagcattac ctcatgactg gagtgggtaa agcatactgt 180

gggctatgga taagactgac attaaccaca agcatgtttg gcagcagact ggtgctttac 240

aagctccatg ttcagcagga gctgcaaagt gttcctccaa accaatattt gtcattcttg 300

gattctattt aggaggtcct gttactcaca tgtttcaata tcagcagaag ccagtttccc 360

tgtggtaccg aagtggatcc tgatgaattt acccttgtaa gtaaaaaaaa tgatgttata 420

cccaaagctt gaagtacgta gtggggatgc cactgaaata attcagacat gctt 474


<210> 12
<211> 519
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Skeletal muscle-specific regulatory element 6 (Sk-SH6)

<400> 12
gtgctcatag ctccaccttt tgttcctaat atggtctttc cagctccctc caccccatca 60

ttgttctcct gggggaacac agggtgagac gctttgatga actgacatca ccagcaaaaa 120

aaatatctag caacagctga ggctgatttt agacaatgga aagtggggga gggaagaggt 180

tctccctgac cctgaaactt tccactcatt ctgggcagct ctatggatgt tttaaaagaa 240

gaggaagagg ggagggaaga acattgaaat agagaagtgt actttggcaa ttctaggttg 300

gcagtttgca tccagggggt cctggttgcc tttcagcttc ccgtttcact ctcccccaga 360

ctgtgttgaa tgctggtcaa actccgttag ttgagtttta gcttttgatt cctggtattc 420

aaggagcttg ggcacaggga agaggggagg tcactcatga tccttaacaa ttctcccaga 480

tccccagatc aaattgctgt gctattctgg gagtctccg 519


<210> 13
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Skeletal muscle-specific regulatory element 7 (Sk-SH7)

<400> 13
atcgtgtgtc agaggtttgt gtcagcttcc cagcaaggga accagaaagg aaaaggaacc 60

ggttcctcat gcttcctagg ggaatgcatg catatctgaa gagaagggaa tcttatataa 120

ggctgtttag ctaagggcag ccaccagcca ggtgagcctt acagaagcac agggctgggt 180

gtctgcagtt ccctagcaga ttaacctggg tcacagtgac tcagagctcc agcatgcgag 240

ttccaggtgt ggaactgagc aagtacagat ctgcttttgc tccacttggg agtatttttc 300

cttcttagtg agcatgggca gcctcctggc cagggaagtc tggcactgtc tgggcctgac 360

agggaaaccc tg 372


<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Primer

<400> 14
cccaccgtcg tattcgtgag 20


<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer

<400> 15
tcagggcgat ggttttgtcc c 21


<210> 16
<211> 983
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Desmin promoter

<400> 16
accttgcttc ctagctgggc ctttccttct cctctataaa taccagctct ggtatttcgc 60

cttggcagct gttgctgcta gggagacggc tggcttgaca tgcatctcct gacaaaacac 120

aaacccgtgg tgtgagtggg tgtgggcggt gtgagtaggg ggatgaatca gagagggggc 180

gagggagaca ggggcgcagg agtcaggcaa aggcgatgcg ggggtgcgac tacacgcagt 240

tggaaacagt cgtcagaaga ttctggaaac tatcttgctg gctataaact tgagggaagc 300

agaaggccaa cattcctccc aagggaaact gaggctcaga gttaaaaccc aggtatcagt 360

gatatgcatg tgccccggcc agggtcactc tctgactaac cggtacctac cctacaggcc 420

tacctagaga ctcttttgaa aggatggtag agacctgtcc gggctttgcc cacagtcgtt 480

ggaaacctca gcattttcta ggcaacttgt gcgaataaaa cacttcgggg gtccttcttg 540

ttcattccaa taacctaaaa cctctcctcg gagaaaatag ggggcctcaa acaaacgaaa 600

ttctctagcc cgctttcccc aggataaggc aggcatccaa atggaaaaaa aggggccggc 660

cgggggtctc ctgtcagctc cttgccctgt gaaacccagc aggcctgcct gtcttctgtc 720

ctcttggggc tgtccagggg cgcaggcctc ttgcggggga gctggcctcc ccgccccctc 780

gcctgtggcc gcccttttcc tggcaggaca gagggatcct gcagctgtca ggggaggggc 840

gccggggggt gatgtcagga gggctacaaa tagtgcagac agctaagggg ctccgtcacc 900

catcttcaca tccactccag ccggctgccc gcccgctgcc tcctctgtgc gtccgcccag 960

ccagcctcgt ccacgccgcc acc 983


<210> 17
<211> 1000
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of DES regulatory element

<400> 17
ccaaaagggt caggtccaag agggacctgg agtgccaagt ggaggtgtag aggcacggcc 60

agtacccatg gagaatggtg gatgtcctta ggggttagca agtgccgtgt gctaaggagg 120

gggctttgga ggttgggcag gccctctgtg gggctccatt tttgtggggg tgggggctgg 180

agcattatag ggggtgggaa gtgattgggg ctgtcaccct agccttcctt atctgacgcc 240

cacccatgcc tcctcaggta ccccctgccc cccacagctc ctctcctgtg ccttgtttcc 300

cagccatgcg ttctcctcta taaatacccg ctctggtatt tggggttggc agctgttgct 360

gccagggaga tggttgggtt gacatgcggc tcctgacaaa acacaaaccc ctggtgtgtg 420

tgggcgtggg tggtgtgagt agggggatga atcagggagg gggcggggga cccagggggc 480

aggagccaca caaagtctgt gcgggggtgg gagcgcacat agcaattgga aactgaaagc 540

ttatcagacc ctttctggaa atcagcccac tgtttataaa cttgaggccc caccctcgac 600

agtaccgggg aggaagaggg cctgcactag tccagaggga aactgaggct cagggctagc 660

tcgcccatag acatacatgg caggcaggct ttggccagga tccctccgcc tgccaggcgt 720

ctccctgccc tcccttcctg cctagagacc cccaccctca agcctggctg gtctttgcct 780

gagacccaaa cctcttcgac ttcaagagaa tatttaggaa caaggtggtt tagggccttt 840

cctgggaaca ggccttgacc ctttaagaaa tgacccaaag tctctccttg accaaaaagg 900

ggaccctcaa actaaaggga agcctctctt ctgctgtctc ccctgacccc actccccccc 960

accccaggac gaggagataa ccagggctga aagaggcccg 1000


<210> 18
<211> 1000
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of DES regulatory element

<400> 18
aatctggttc tttgggctgt aagtgatcaa agcaatacca agtgccttaa attaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaacgga aagtttgttg gcccaaggcc aggaaggaca gtgtgggagc 120

tcaactcaca aagttgaggg aagcactgca ggaaccaagg ggctggcctg ctcctcctct 180

ccagcctcct ctgcttctta catattgacc tctctttctt cctactcccc cagggggcag 240

gaaacatggc ttccacaggt tccagttgaa gaatcccagt tccgtctata aattccaggg 300

aaggtctctg attggccctg ctcattccca ggcccattcc ttgacccagt cactgaagtc 360

agggagatgc agtaataaga ctggctggaa tcagggtctt taggggtgga gggatgggga 420

ggaggcacag catgtcatca aaataaggaa attgcaaaag aaagcttgca ggctactttg 480

aatgacaatg agaaagacgg tgctgcctga gtgtgttaag gatccacatg gtctccaaaa 540

tcctccagga gcatacagtc tagtctggga gatgagacac aaaaataacc agaacacaac 600

agcttgcact gactcgaggg ctggataaga atatctggaa ctcccccatc tatttcagaa 660

gcttgtctct tggatgaaaa ttagacactt aatgggaaag ggctttgaaa agagtgcagt 720

aacaaagccc cctttacaat ttacccggca cattcacacc catcctgagg ccaaagccac 780

aggctgtgag gtctcactgt ctcagcttcc tgagctataa aatgggaatg atgctagtgt 840

ctacctccta gggttggaga attgggggtc atgggtgtga agtgctcagc agcttggccc 900

acactaggtg gtcagtacat gtaaggtatt attgttgcta catacattag tagggcctgg 960

gcctctttaa acctttatag ggtagcatgg caaggctaac 1000


<210> 19
<211> 1000
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of ACTN2 regulatory element

<400> 19
cagatggatc acctgaagtc aggagtttaa gaccagtctg gccaacatgg caaaaccccg 60

tctctactaa aaatacaaaa atcagctagg tgtggtggca ggcacctgta ttcctagcta 120

ctagggtggt tgaggcggga gaatcacttg aactcgggag gcggagattg cggtgagctg 180

agatcatgcc actgcactcc agcctggaag caagactccg tctcaaaaaa taaaaataaa 240

aaataaaaat aaataaagtg gatggcttag agtatctttt ctgtttagac ctgactaaag 300

cttagacata attgttagtt taggctctca gggtaaaatt tattactgta aatccaaaaa 360

atcccttctt cttctttttt tttttttttt tggtccttga attaaatgct gtcacctcct 420

tcttgaaagg agaaactatt agtcagattt gaaaatcctc tttatcaccc aggaaaatca 480

tttttatgga cactttgtct ttctgtagtc tgacttagaa gcagcctgtt tttgataggt 540

tgaagttttc atcttgaaca caaaccctgt ttgtgtgtcc cctactcccc agtttgatgt 600

gccaggcact ttgttctcaa gcccagcagc tgttgtggga tgaggggaca ttttgcatgc 660

ttagccagca gctgccagaa acatttctaa tctggttttg gcaggaaata gggcacaagt 720

ggaagccaag ttaaaagaag ctggaaaaat aaacagaata actttagatg tcacttaata 780

tatggtccat tttcagccga agatttgccc tagtaatttg ttaatatgac tggactgtga 840

tcccttccaa aggcagggtt gaatatagtc acctttgaga tccaggatgt agtccagtgc 900

ttggaatatg cttgtaggag gttattgtta ttattttttc aatgatagac tatactgcaa 960

atttgtttaa ttgatttaat tagtagctta aaactgttgt 1000


<210> 20
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of ACTN2 regulatory element

<400> 20
agctgaagcc gtgggacgtc tgagcggcac atttttatgg tcatcacaga tggtgctggg 60

tttttccttt tttttttttt tttttttttg gtgagaagtc aattggccaa acttgaaatt 120

taccaataaa accctttaag tgttacaaaa tcactgggca aaggaataca tttgagatgt 180

ggtagcatct gtgaattcca tttacctaag agtatgaatt acaaaccaga tgaatgacag 240

attagttgtc atcaactaca cacagtttat tttttcatgt gagttgcact gtagactatt 300

tatgtttgca tatttttcag gattgtgtac agtaaacctt aagtgaatac aaaggatcca 360

attgtcctgt aagactcact tcaattacag attgtgctca gtattaaact ttgctagtac 420

tttcaggatg cagtcaatca agaggcaggg aaaggtctgt cagcatccac agcctccttt 480

tcaaattgga cacttagtct ctggtccgaa taataggtgc ccccagtgtc acctcacaca 540

atggggtata cacagttttt aaaaatttat tttcagctgg gcacagtagc tcacacctaa 600

aatcccagca ctttgggagg ctgaggcagg tggatcacct gaggtcagga gttcaagacc 660

agcctggcca acgtggcaaa atcctgtctc tactaaaaat acaaaaatta accgggcatg 720

gtggtggcac ctgtagtccc agctactcgg gaggctgagg caggagaatc ttttgaaccc 780

gggaggcaga ggttgcagtg agccaagatc ccaccactgc actccagcct gggtgacaga 840

gtgagactgt gcctcaaaaa aaattaaaaa aagtattttc atttaaaaag gggcgagtca 900

ccaaccaccc tgaagtctag ttttagtgtc tttttatgtt ggagcttgtg gctgctcctg 960

cattgtcctt ttgaagtccc taagtgtcat cagaattta 999


<210> 21
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of FLNC regulatory element

<400> 21
cacactgacc tcccctggag cgagctcttg agtcagaggg aaagcaaggg aagctacgct 60

gggagttcct tctcccctcc ctggcttcct ccggcctctc cacctgaaca gaggcgctca 120

gctggctggg ggacctcaga taatgcctgc aaaacaggac tgtggaccat tagggtctgt 180

aaaggggctg tcagctccga gctacctcac cttaaccctt tctcctcccc agcagctcaa 240

agaggaatgc atcctttctc agatctgtgt ctcagtttac tcaccaggga ttcagaggca 300

gcactgctga accctgagcc cttggcacat caggttggct gtcagaagtc ggcctttgta 360

catacacagt tcccttgtga ggcccagctg cgtgtcctag gagcggggcc tctctccaca 420

gcagagctca gcctctcaag tgtatggaca gcacgggtgc ctgatgggtg gatttagcca 480

tgagttgaag gtggcttggg gagaatgaga gttctagaga tagggagaag gggttgccaa 540

taggagagtg gaattcctga gcacctcgtc acaggcagcc gacagaacat gagccgcagg 600

gcccaggcta tttatacctc gcctgtcact atcagggtcc ccacagctcc ccccacctcc 660

agccacacac agcaggtcct tttgctcttt ctggtccctt ctctactcct ccccctccct 720

acctaaggac caggcaattt cattcataga cccctgtcat cataagcatt gcccccacag 780

aaccctgaca ctttttcctc agctccgtaa cagggggtgc cctcattggc ccttggggga 840

aagagccccc aaagatgctc actatccctt cttttacacc aggtctaggg gtagaagagg 900

aattagatat aatgattcat ctaaaagggc ccagaacctt ccctggctta aagaaacttc 960

tcaggctcag atatggcctc ctagccagct cagctagac 999


<210> 22
<211> 1000
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of FLNC regulatory element

<400> 22
aaaaaaaaaa gaaaaaagaa aaagaaatac gttctctagc tctttctcct caccccaggc 60

cagagtctgt ttgggtgcct cggtttccct gctgttctat tccccaggcc tgcagccttt 120

ggcttgccct gagtgcagct ttgcctgggc atcccagctg gctcccttag gctctccctg 180

accactctgc ccctggtcct gcctacccac ctggtcacat ttccccctgg ctgctctggc 240

tggggctctc cctgtttctg cctggctgac ccaccctttc cctggcagga tctgccctgt 300

ggcccaaatg ggcatgttgc ccagggggct ccctggcact atgggggaag agtctctcct 360

tcccctctta tcatctcagt tgagtcagac ttgggggagg gggatacaca gtgtgagtca 420

ctgggtaccc ttttcctgag ctcagcttca taccgaggcg atgaggccaa acgggctggt 480

gacagggaca ctgagtcagg ggcaggggcc ccggtcttac tcctgggcct ctggatttgg 540

gccctacatg aggcttttct atctgtaaag tcaagcaatg gctgggaggc acacacaacc 600

ccccgccccc ccgcaggctt ctccttcatt ggcccgggca aggtccctgc ttcctctcag 660

gccgtctctg cacaagcaca cacacttccc ttccctgtcc acaggtggac aatgccctgg 720

gctaggagcc agccctcgca ggccctgtca acagcctgcc accaactagt ctagaaaatt 780

ctgtgaacac cagatcagtg ggttttgccc taatcactgg cctcagtttc cccatttacc 840

tcttcagccc gtgcggggtg tggagggagc atatttcatt cctgacagtt tggtgtgttg 900

ggtgtggatg gagaactgtc ggccctcccc gccaccttcc agcgcggcgg caccgggggc 960

ccagggggtg ggcgccctca accccgtccc gccgcccggg 1000


<210> 23
<211> 1000
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of ATP2A1 regulatory element

<400> 23
ccctgtgggc atttgagttt ataacaccac ccccattgtg gcacacccct ccaccccgta 60

aaacacaggc tctgctcttg gaatcagtct tcctgatctg tggctgtgcc ctccaacaga 120

gggcacccct gggcttccca gctctggggg tagtgggtgc caacaaggag gggcctgggg 180

ctgaagaatc ccacccgctg agctcggcct tctcccttcc ccactgtcca gctccgcctt 240

tcagcatcct gcctcactcc ccgcccaggc agcaaggagc ccacaccctc atgcccctca 300

gcttcagccc ccacctccag gaggccctac ccacgctcat gaccttgcta ttctgggcct 360

tgtgtcctgt agggagatgg acaggagaca gctgggcttc caggccaccc aggcgggggg 420

ctagccgagg gaagcctgct ggctctcctg cttgctctaa tttctggggc tccccaaacc 480

ttggcctcag gagactgggg ataggaccgg ccttgaaagt gggggaagct ttggagagcc 540

gggtgctggg ttcttagtga gatggccagt gaaggctgtg gtgccccgag gtaagcaggg 600

cctgatcccc tcctaatctt ccagcagcaa ctggtgctct gaggctcccc ctcccccagc 660

cctgccagcc ttcagggacc tgccttccaa agatgggcag gggaggggga cgaggacacc 720

cacccactcc tcagaccagc atgtcttggc tgttggggcc tgagagactt tccctctaag 780

cctttcttta cagatggtta aaccgaagtt ctgcactcat cagggactgg ccagggtgtc 840

tctgtgtccc atgcttttag ctccagccct caggtgtgac aggaggatca ctttccatcc 900

ctgggcgtgg agacccctgt gggaagggat ccccgagggc gcctctggct cagcctccct 960

ccatggcagt tcacacccac agccttccct agagcagccc 1000


<210> 24
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of TNNI1 regulatory element

<400> 24
gggccacagt gaaggcccag aggggcaagt agcagctggg ggaagaggac cattgggcta 60

accctgcatc tcttataagg caatatggaa atgaggcccc tgaacccatg ccccaaaagc 120

ccaagagggc taaagactca gctttcaggg atttttcagt ggctctggtg cacgtgggat 180

acgagggtgc ctggctgtgg ggagtgatgt gagcagtgtt gcaggctgac cccagtgagt 240

gtttccaggg ctgagcagaa tggcagtggc agcagggcac acctttatgc tcagggaggt 300

ctgagggtct gcagacactc tgcatccccc tccagatggg tttcctggaa tctagatttc 360

ccaggttcca aaggacaccc gagtctcatg cctggaactc agtgagacta attcacctct 420

cctctgccct aatcttcatc tccagccaga agccaacaga tcccagggga ctggagccac 480

aggggctgca cctgtttacc gggtattttt aggatggttg atgaacacat aatacccacc 540

ctatagtcag agaaagacaa tgcctgctat gttaatcctg tggctattat agtctgtcat 600

ctcatgggtt ggggcaggac actgaccctc tcagaggcca gagagaggcc tcgcaagcag 660

gaggttaggg agccccagcc atgctcccca tttggagaag gagagagtaa tgggcagggg 720

tgtcctaagg agacacaccc cagtgcccac agaggtaaag gccctgccct ctctacaacg 780

acattctgct gcctaataga ggttgctcta attctgttct ggtcgggtca actttgagaa 840

gcctctatgt gagacggctg ccagggagaa atgacagggt ctggggaggc ataggggttg 900

gggacatagg attccaagtg gagaggctgt gatggataat gaaggcaggc tccagccaaa 960

aggagcagct agaggggaga aggaatttag gggctttgc 999


<210> 25
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of TNNI1 regulatory element

<400> 25
ttgtggggtc tgggaagtgg ggaattaaaa gacacttgta aagtgcctgc caataattgt 60

atcccagagc caccccttcc tctgccctaa ttctctcctt tccctttgtg cccatgaagc 120

actatcccaa ccccaatgaa cacagctttg gccacctccc ctgaatctcc caacgggtca 180

gaaagccttc tgggcctccc tccacctctg cctccgccac caggggaggg taaggctggg 240

gtggaggagg tggaggtgta gtgtgacccc agagtctcag ctgtcatgct ggggcacaga 300

gggaggggta tggagacaat ccatgaattc ctgagatgct tggctggtat tagattttat 360

gggcagctgc ttattcttag ggctctgctt ctccaaagac actgaggaag tccaaaggaa 420

acaccagctg gcgaagagcc acctccaggc ccatctgtcc atcatcagcc tccaggaatg 480

ccagtgtcca gagggcacca ggtctgcgtc tgtctccctg ggatgtgcct tgtccttggt 540

gggcatttgg cagtgatcat gcctccctgt ctccctcaga gatccaactg tccccattgt 600

ggggccctac cttccaaggc cggtttacac ctcctgccaa gctccggggc ctgcccccag 660

cctgcctcac tgacaaatgc cagaccaagg ggtcccacgt caggcaagag gcctcagcct 720

gtgctctgac acccctcaga cgggggccct tgccaggctc tgtggaagac aagcgaggac 780

tgataagtca ggatgaagat agcagccact ggaaggcttg gagagccagg attccatctc 840

ctctacaagt agcaagcaag gagataatga gaaaatcctc cccccgaggg ggggagcaaa 900

gagtctctgg tggttgcctc agagctgggc tttcccttcc ttgaggcttt gcagcgtgga 960

agggactatc cgctagacta tgagattgag tctgtgtgt 999


<210> 26
<211> 1000
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of MYLPF1 regulatory element

<400> 26
tcttttgggg atccaaggcc ccagtcccgt caacccctct cccctcactg ccacatccct 60

ctgtgctcct catgttccac tgagaatccc gacctcaatc tcatgagcgc tccaggttgt 120

ccttagatca caagcataaa gacctgacgt tatgagctcc aaccttccaa cttctaaacg 180

ccctcttctt tctctgaccc ccatattctg atttccatat agcatccacc atcctggaat 240

tccagtgaga cctagctccc gacttctcag ctcctccttg gtttctgagt cctctaaggt 300

ccctcactcc caactcagcc ccatgtcctg tcaattccca ctcagtgtct gatctccttc 360

tcctcacctt tcccatctcc cgtttgaccc aagcttcctg agctctcctc ccattcccct 420

ttttggagtc ctcctcctct cccagaaccc agtaataagt gggctcctcc ctggcctgga 480

cccccgtggt aaccctataa ggcgaggcag ctgctgtctg aggcagggag gggctggtgt 540

gggaggctaa gggcagctgc taagtttagg gtggctcctt ctctcttctt agagacaaca 600

ggtggctggg gcctcagtgc ccagaaaaga aaatgtctta gaggtatcgg catgggcctg 660

gaggaggggg gacagggcag ggggaggcat cttcctcagg acatcgggtc ctagagggag 720

cgggaggaga aggagatggt tgtccttgcc aacttggggc ttcctcagcc actatttttc 780

cagacttctg ctgcatggag gggactgggt cactgaggcc cagagggaga agagagggta 840

catcaaagtc acacaatcag ccaagctggc tcttggccag aataaagtga gctgccactg 900

gctatcaagg cacctcacag aaagtgacca gctggctgtc cttttagggt cttttcctcc 960

cctcttgagt tccagcctcc acaccagtac ccagagaaaa 1000


<210> 27
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of MYH1 regulatory element

<400> 27
gggatcatta gctaaatctc actggcctct tgagatttca actgaatgtt cctgtgaagt 60

accacatatt atgtctctac aaacactatt gcagttcctc ctgcctcctg ggaaaaaagt 120

gaaatatgct tggctcaaga tattcacttc tcatacagaa gatccttgac atttggaata 180

taattgagtc ctgagactcc ctctgcaggg tcctgtcgcc atataataga gggactacta 240

aaagcaacag tattaaagct cagactagga ataaatcaca tatcctcaat ccctggacaa 300

cttgtttact tctagtgtta gttttttctt aaaaaaaaaa ttgaaatcat tctgaggctg 360

gaatactttg gacatgccca gcagttcctg gcagttccca cagaagcatt acctcatgac 420

tggagtgggt aaagcatact gtgggctatg gataagactg acattaacca caagcatgtt 480

tggcagcaga ctggtgcttt acaagctcca tgttcagcag gagctgcaaa gtgttcctcc 540

aaaccaatat ttgtcattct tggattctat ttaggaggtc ctgttactca catgtttcaa 600

tatcagcaga agccagtttc cctgtggtac cgaagtggat cctgatgaat ttacccttgt 660

aagtaaaaaa aatgatgtta tacccaaagc ttgaagtacg tagtggggat gccactgaaa 720

taattcagac atgctttctc tggcatctaa aggcagagaa gaccctttgg caaccaagag 780

acttacaaag cgagaggagt tgtcattcct cacggtcttg gcgttgccaa aggcctccag 840

tagggggttg gcactgatga tttgatcttc cagagtcccc tgcaaaggca agagcagtcc 900

ttgcatctgg ggcttgggaa tttcctacct gagagtcccg acagagcctg gattctgact 960

aacaatcaga ctcacctgca ttttgccaga agtaacttc 999


<210> 28
<211> 1000
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of TPM3 regulatory element

<400> 28
gtgcctacct gtttacttct ttcttctgcc tgcttctgct cagcttcagc ttgctctgcc 60

cgatccagag cattctcctt gtctaacttc agcatctgca tctttttctt gatggcctcc 120

atcatgagca gtggctgttg gtaggctcac ctgtgaacac tggagaactg gagactgggg 180

caagaaagaa ggggctgctg cctgagtgac caggaggtcc ccagacttga gtctttatct 240

gtgctcatag ctccaccttt tgttcctaat atggtctttc cagctccctc caccccatca 300

ttgttctcct gggggaacac agggtgagac gctttgatga actgacatca ccagcaaaaa 360

aaatatctag caacagctga ggctgatttt agacaatgga aagtggggga gggaagaggt 420

tctccctgac cctgaaactt tccactcatt ctgggcagct ctatggatgt tttaaaagaa 480

gaggaagagg ggagggaaga acattgaaat agagaagtgt actttggcaa ttctaggttg 540

gcagtttgca tccagggggt cctggttgcc tttcagcttc ccgtttcact ctcccccaga 600

ctgtgttgaa tgctggtcaa actccgttag ttgagtttta gcttttgatt cctggtattc 660

aaggagcttg ggcacaggga agaggggagg tcactcatga tccttaacaa ttctcccaga 720

tccccagatc aaattgctgt gctattctgg gagtctccga ttggcaggga gacgtttttc 780

ctccccacca agagccacaa gagtagagta agaggtaggg ttggaatctc caaccctatc 840

cttgaaggct atcccagagc ttcaagtggg gtggggagag aaacagggga gggtcagaac 900

aatccagaca ggatcatacc ctttgttttc ccacagtaat cttaaaatag aactgttgta 960

cccacacaga ctttggtctg tgtggctctc tcctcttctt 1000


<210> 29
<211> 999
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Fragment of ANKRD2 regulatory element

<400> 29
ggcatgcaat ctccagcaga gtgagcctgg aactgccagt cttctgggcc ctgatcccag 60

ctcccctggt gtcctcatga gtcctcagga aaagccactc tttgcttttc tttaaagcag 120

agccatgctg cctgccctgc ctcctccatc agttgctggg aggattaagc aggaagacag 180

atgtgaaagt gcttgcaagg cgaagacagc acctcaggaa ggtggtctgc tcctgcagca 240

agaggggcta acttccggcc ctggagacgc tgtagccatc gtgatgttaa agcaaaatct 300

ctgacagatt tagatcgtgt gtcagaggtt tgtgtcagct tcccagcaag ggaaccagaa 360

aggaaaagga accggttcct catgcttcct aggggaatgc atgcatatct gaagagaagg 420

gaatcttata taaggctgtt tagctaaggg cagccaccag ccaggtgagc cttacagaag 480

cacagggctg ggtgtctgca gttccctagc agattaacct gggtcacagt gactcagagc 540

tccagcatgc gagttccagg tgtggaactg agcaagtaca gatctgcttt tgctccactt 600

gggagtattt ttccttctta gtgagcatgg gcagcctcct ggccagggaa gtctggcact 660

gtctgggcct gacagggaaa ccctgggagg gtagaaggat ccagagtagc tgctgttcct 720

cgctagctgg gcttagtgct ttccggagac ccctttcttg aagcaagact ctgtaagccc 780

tgcagaggtc ccctgagcac ttaccaagag aggagacaga ttggataagg tttgttcatg 840

actaaaagtc acccagccaa atgcagtgat gcttaacggg gaagcatgtg ggaccccgga 900

gagccgaagg ccagcgtgag ctgtgatcag agagggagac agctgccctt cctgctacca 960

cggccctggc ctggacaagt agagtgtgac cctcctcac 999


<210> 30
<211> 663
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> CMV promoter

<400> 30
acgcgtggag ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 60

atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 120

ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgtcaat agggactttc 180

cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 240

tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 300

tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 360

atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt 420

gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttgcacc 480

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 540

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 600

cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc 660

tcc 663


<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> Primer

<400> 31
tgtgtccgtc gtggatctga 20


<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer

<400> 32
gcctgcttca ccaccttctt ga 22


<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 33
gtccctcact cccaactcag 20


<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 34
gaggagaagg agatcagaca ctg 23


<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 35
tagctgggcc tttccttctc 20


<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 36
cgtctcccta gcagcaacag 20


<210> 37
<211> 171
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Fragment a of skeletal muscle-specific regulatory element 4
(Sk-SH4a)

<400> 37
ctctaaggtc cctcactccc aactcagccc catgtcctgt caattcccac tcagtgtctg 60

atctccttct cctcaccttt cccatctccc gtttgaccca agcttcctga gctctcctcc 120

cattcccctt tttggagtcc tcctcctctc ccagaaccca gtaataagtg g 171


<210> 38
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Fragment b of skeletal muscle-specific regulatory element 4
(Sk-SH4b)

<400> 38
tggcctggac ccccgtggta accctataag gcgaggcagc tgctgtctga g 51


<210> 39
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Fragment c of skeletal muscle-specific regulatory element 4
(Sk-SH4c)

<400> 39
gcagggaggg gctggtgtgg gaggctaagg gcagctgcta agtttagggt ggctccttct 60


<210> 40
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Fragment d of skeletal muscle-specific regulatory element 4
(Sk-SH4d)

<400> 40
aggagggggg acagggcagg gggaggcatc ttcctcagga c 41


<210> 41
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Fragment e of skeletal muscle-specific regulatory element 4
(Sk-SH4e)

<400> 41
gcagggaggg gctggtgtgg gaggctaagg gcagctgcta agtttagggt ggctccttct 60

ctcttcttag agacaacagg tggctggggc ctcagtgccc agaaaagaaa atgtcttaga 120


<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 42
gtgccctact acatcaa 17


<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 43
aggttgtgct ggtcca 16


<210> 44
<211> 8069
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> AAVss-SkSH4-Des-MVM-MD1 plasmid construct

<400> 44
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tcgtacgttc tgagtcctct aaggtccctc actcccaact 180

cagccccatg tcctgtcaat tcccactcag tgtctgatct ccttctcctc acctttccca 240

tctcccgttt gacccaagct tcctgagctc tcctcccatt cccctttttg gagtcctcct 300

cctctcccag aacccagtaa taagtgggct cctccctggc ctggaccccc gtggtaaccc 360

tataaggcga ggcagctgct gtctgaggca gggaggggct ggtgtgggag gctaagggca 420

gctgctaagt ttagggtggc tccttctctc ttcttagaga caacaggtgg ctggggcctc 480

agtgcccaga aaagaaaatg tcttagaggt atcggcatgg gcctggagga ggggggacag 540

ggcaggggga ggcatcttcc tcaggacatc gggtcctaga gggaccttgc ttcctagctg 600

ggcctttcct tctcctctat aaataccagc tctggtattt cgccttggca gctgttgctg 660

ctagggagac ggctggcttg acatgcatct cctgacaaaa cacaaacccg tggtgtgagt 720

gggtgtgggc ggtgtgagta gggggatgaa tcagagaggg ggcgagggag acaggggcgc 780

aggagtcagg caaaggcgat gcgggggtgc gactacacgc agttggaaac agtcgtcaga 840

agattctgga aactatcttg ctggctataa acttgaggga agcagaaggc caacattcct 900

cccaagggaa actgaggctc agagttaaaa cccaggtatc agtgatatgc atgtgccccg 960

gccagggtca ctctctgact aaccggtacc taccctacag gcctacctag agactctttt 1020

gaaaggatgg tagagacctg tccgggcttt gcccacagtc gttggaaacc tcagcatttt 1080

ctaggcaact tgtgcgaata aaacacttcg ggggtccttc ttgttcattc caataaccta 1140

aaacctctcc tcggagaaaa tagggggcct caaacaaacg aaattctcta gcccgctttc 1200

cccaggataa ggcaggcatc caaatggaaa aaaaggggcc ggccgggggt ctcctgtcag 1260

ctccttgccc tgtgaaaccc agcaggcctg cctgtcttct gtcctcttgg ggctgtccag 1320

gggcgcaggc ctcttgcggg ggagctggcc tccccgcccc ctcgcctgtg gccgcccttt 1380

tcctggcagg acagagggat cctgcagctg tcaggggagg ggcgccgggg ggtgatgtca 1440

ggagggctac aaatagtgca gacagctaag gggctccgtc acccatcttc acatccactc 1500

cagccggctg cccgcccgct gcctcctctg tgcgtccgcc cagccagcct cgtccacgcc 1560

gccacctcta gaaagaggta agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt attaatgttt 1620

aattacctgg agcacctgcc tgaaatcact ttttttcagg ttggacgcgt gccaccatgc 1680

tgtggtggga ggaagtggag gactgctacg agagagagga cgtgcagaag aaaaccttca 1740

ccaagtgggt gaacgcccag ttcagcaagt tcggcaagca gcacatcgag aacctgttca 1800

gcgacctgca ggatggcagg agactgctgg atctgctgga gggactgacc ggccagaagc 1860

tgcccaagga gaagggcagc accagagtgc acgccctgaa caacgtgaac aaggccctga 1920

gagtgctgca gaacaacaac gtggacctgg tgaatatcgg cagcaccgac atcgtggacg 1980

gcaaccacaa gctgaccctg ggcctgatct ggaacatcat cctgcactgg caggtgaaga 2040

acgtgatgaa gaacatcatg gccggcctgc agcagaccaa cagcgagaag atcctgctga 2100

gctgggtgag gcagagcacc agaaactacc cccaggtgaa cgtgatcaac ttcaccacct 2160

cctggagcga cggcctggcc ctgaacgccc tgatccacag ccacagaccc gacctgttcg 2220

actggaacag cgtggtgtgt cagcagagcg ccacccagag actggagcac gccttcaaca 2280

tcgccagata ccagctgggc atcgagaagc tgctggaccc cgaggacgtg gacaccacct 2340

accccgacaa gaaaagcatc ctgatgtata ttacctctct gtttcaggtg ctgccccagc 2400

aggtgtccat cgaggccatc caggaagtgg aaatgctgcc caggcccccc accgtgtccc 2460

tggcccaggg ctatgagaga accagcagcc ccaagcccag attcaagagc accgtgtccc 2520

tggcccaggg ctatgagaga accagcagcc ccaagcccag attcaagagc tacgcctaca 2580

cccaggccgc ctacgtgacc acctccgacc ccaccagaag ccccttcccc agccagcacc 2640

tggaggcccc cgaggacaag agcttcggca gcagcctgat ggagagcgaa gtgaacctgg 2700

acagatacca gaccgccctg gaggaagtgc tgtcttggct gctgtccgcc gaggacaccc 2760

tgcaggccca gggcgagatc agcaacgacg tggaagtggt gaaggaccag ttccacaccc 2820

acgagggcta catgatggat ctgaccgccc accagggcag agtgggcaat atcctgcagc 2880

tgggcagcaa gctgatcggc accggcaagc tgagcgagga cgaggagacc gaagtgcagg 2940

agcagatgaa cctgctgaac agcagatggg agtgcctgag agtggccagc atggagaagc 3000

agagcaacct gcaccgcgtg ctgatggacc tgcagaacca gaagctgaag gagctgaacg 3060

actggctgac caagaccgag gagcggacca gaaagatgga ggaggagccc ctgggccccg 3120

acctggagga cctgaagaga caggtgcagc agcacaaagt gctgcaggag gacctggaac 3180

aggagcaggt gcgcgtgaac agcctgaccc acatggtggt cgtggtggac gagagcagcg 3240

gcgaccacgc cacagccgcc ctggaagagc agctgaaagt gctgggcgac agatgggcca 3300

acatctgccg gtggaccgag gacagatggg tgctgctgca ggacatcctg ctgaagtggc 3360

agagactgac agaggagcag tgcctgttta gcgcctggct gagcgagaag gaggacgccg 3420

tgaacaagat ccacaccacc ggcttcaagg accagaacga gatgctgagc agcctgcaga 3480

agctggccgt gctgaaggcc gatctggaga agaaaaagca gagcatgggc aagctgtact 3540

ccctgaagca ggacctgctg tccaccctga agaacaagag cgtgacccag aaaaccgagg 3600

cctggctgga caatttcgcc cggtgctggg acaatctggt gcagaaactg gagaagagca 3660

ccgcccagat cagccaggcc gtgaccacca cccagcccag cctgacacag accaccgtga 3720

tggagaccgt gaccacagtg accaccaggg agcagatcct ggtgaagcac gcccaggagg 3780

agctgccccc tcccccccct cagaagaagc ggcagatcac agtggacacc ctggagagac 3840

tgcaggagct gcaggaagcc accgacgagc tggacctgaa gctgagacag gccgaagtga 3900

tcaagggcag ctggcagcct gtgggcgatc tgctgatcga cagcctgcag gaccacctgg 3960

agaaagtgaa ggccctgcgg ggcgagatcg cccccctgaa ggagaatgtg agccacgtga 4020

acgacctggc cagacagctg accaccctgg gcatccagct gagcccctac aatctgagca 4080

ccctggaaga tctgaacacc cggtggaaac tgctgcaggt ggccgtggag gatagagtga 4140

ggcagctgca cgaggcccac agagacttcg gccctgcctc ccagcacttc ctgagcacca 4200

gcgtgcaggg cccctgggag agagccatct cccccaacaa agtgccctac tacatcaacc 4260

acgagaccca gaccacctgc tgggaccacc ctaagatgac cgagctgtac cagagcctgg 4320

ccgacctgaa caatgtgcgg ttcagcgcct acagaaccgc catgaagctg cggagactgc 4380

agaaggccct gtgcctggac ctgctgagcc tgagcgccgc ctgcgacgcc ctggaccagc 4440

acaacctgaa gcagaacgac cagcccatgg acattctgca gatcatcaac tgcctgacca 4500

ccatctacga tcggctggag caggagcaca acaacctggt gaacgtgccc ctgtgcgtgg 4560

acatgtgcct gaattggctg ctgaacgtgt acgacaccgg caggaccggc agaatcagag 4620

tgctgtcctt caagaccggc atcatcagcc tgtgcaaggc ccacctggag gataagtacc 4680

gctacctgtt caagcaggtg gccagcagca ccggcttctg cgatcagagg agactgggcc 4740

tgctgctgca cgatagcatc cagatcccta ggcagctggg cgaagtggcc agctttggcg 4800

gcagcaacat cgagccctct gtgaggagct gcttccagtt cgccaacaac aagcccgaga 4860

tcgaggccgc cctgttcctg gattggatga ggctggagcc ccagagcatg gtgtggctgc 4920

ctgtgctgca cagagtggcc gccgccgaga ccgccaagca ccaggccaag tgcaacatct 4980

gcaaggagtg ccccatcatc ggcttccggt acaggagcct gaagcacttc aactacgaca 5040

tctgccagag ctgctttttc agcggcagag tggccaaggg ccacaagatg cactacccca 5100

tggtggagta ctgcaccccc accacctccg gcgaggatgt gagagacttc gccaaagtgc 5160

tgaagaataa gttccggacc aagcggtact ttgccaagca ccccaggatg ggctacctgc 5220

ccgtgcagac cgtgctggag ggcgacaaca tggagaccga caccatgtga tgatgactcg 5280

agaataaaag atctttattt tcattagatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gaggaacccc 5340

tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 5400

caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 5460

gctgcctgca ggggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 5520

accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 5580

tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 5640

cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 5700

ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 5760

tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 5820

gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 5880

tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 5940

aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat 6000

tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca 6060

cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag 6120

acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa 6180

acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 6240

aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 6300

tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 6360

gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 6420

tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 6480

aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 6540

cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 6600

agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 6660

ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 6720

tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 6780

tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 6840

caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 6900

accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 6960

attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 7020

ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 7080

taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 7140

taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 7200

aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 7260

agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 7320

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 7380

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 7440

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 7500

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 7560

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 7620

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 7680

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 7740

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 7800

acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 7860

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 7920

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 7980

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 8040

ggccttttgc tggccttttg ctcacatgt 8069


<210> 45
<211> 7217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> AAVss-SkSH4-Des-MVM-FST-2A-Luc2 plasmid construct

<400> 45
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tcgtacgttc tgagtcctct aaggtccctc actcccaact 180

cagccccatg tcctgtcaat tcccactcag tgtctgatct ccttctcctc acctttccca 240

tctcccgttt gacccaagct tcctgagctc tcctcccatt cccctttttg gagtcctcct 300

cctctcccag aacccagtaa taagtgggct cctccctggc ctggaccccc gtggtaaccc 360

tataaggcga ggcagctgct gtctgaggca gggaggggct ggtgtgggag gctaagggca 420

gctgctaagt ttagggtggc tccttctctc ttcttagaga caacaggtgg ctggggcctc 480

agtgcccaga aaagaaaatg tcttagaggt atcggcatgg gcctggagga ggggggacag 540

ggcaggggga ggcatcttcc tcaggacatc gggtcctaga gggaccttgc ttcctagctg 600

ggcctttcct tctcctctat aaataccagc tctggtattt cgccttggca gctgttgctg 660

ctagggagac ggctggcttg acatgcatct cctgacaaaa cacaaacccg tggtgtgagt 720

gggtgtgggc ggtgtgagta gggggatgaa tcagagaggg ggcgagggag acaggggcgc 780

aggagtcagg caaaggcgat gcgggggtgc gactacacgc agttggaaac agtcgtcaga 840

agattctgga aactatcttg ctggctataa acttgaggga agcagaaggc caacattcct 900

cccaagggaa actgaggctc agagttaaaa cccaggtatc agtgatatgc atgtgccccg 960

gccagggtca ctctctgact aaccggtacc taccctacag gcctacctag agactctttt 1020

gaaaggatgg tagagacctg tccgggcttt gcccacagtc gttggaaacc tcagcatttt 1080

ctaggcaact tgtgcgaata aaacacttcg ggggtccttc ttgttcattc caataaccta 1140

aaacctctcc tcggagaaaa tagggggcct caaacaaacg aaattctcta gcccgctttc 1200

cccaggataa ggcaggcatc caaatggaaa aaaaggggcc ggccgggggt ctcctgtcag 1260

ctccttgccc tgtgaaaccc agcaggcctg cctgtcttct gtcctcttgg ggctgtccag 1320

gggcgcaggc ctcttgcggg ggagctggcc tccccgcccc ctcgcctgtg gccgcccttt 1380

tcctggcagg acagagggat cctgcagctg tcaggggagg ggcgccgggg ggtgatgtca 1440

ggagggctac aaatagtgca gacagctaag gggctccgtc acccatcttc acatccactc 1500

cagccggctg cccgcccgct gcctcctctg tgcgtccgcc cagccagcct cgtccacgcc 1560

gccacctcta gaaagaggta agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt attaatgttt 1620

aattacctgg agcacctgcc tgaaatcact ttttttcagg ttggacgcgt atggtccgcg 1680

cgaggcacca gccgggtggg ctttgcctcc tgctgctgct gctctgccag ttcatggagg 1740

accgcagtgc ccaggctggg aactgctggc tccgtcaagc gaagaacggc cgctgccagg 1800

tcctgtacaa gaccgaactg agcaaggagg agtgctgcag caccggccgg ctgagcacct 1860

cgtggaccga ggaggacgtg aatgacaaca cactcttcaa gtggatgatt ttcaacgggg 1920

gcgcccccaa ctgcatcccc tgtaaagaaa cgtgtgagaa cgtggactgt ggacctggga 1980

aaaaatgccg aatgaacaag aagaacaaac cccgctgcgt ctgcgccccg gattgttcca 2040

acatcacctg gaagggtcca gtctgcgggc tggatgggaa aacctaccgc aatgaatgtg 2100

cactcctaaa ggcaagatgt aaagagcagc cagaactgga agtccagtac caaggcagat 2160

gtaaaaagac ttgtcgggat gttttctgtc caggcagctc cacatgtgtg gtggaccaga 2220

ccaataatgc ctactgtgtg acctgtaatc ggatttgccc agagcctgct tcctctgagc 2280

aatatctctg tgggaatgat ggagtcacct actccagtgc ctgccacctg agaaaggcta 2340

cctgcctgct gggcagatct attggattag cctatgaggg aaagtgtatc aaagcaaagt 2400

cctgtgaaga tatccagtgc actggtggga aaaaatgttt atgggatttc aaggttggga 2460

gaggccggtg ttccctctgt gatgagctgt gccctgacag taagtcggat gagcctgtct 2520

gtgccagtga caatgccact tatgccagcg agtgtgccat gaaggaagct gcctgctcct 2580

caggtgtgct actggaagta aagcactccg gatcttgcaa ctccatttcg gaagacaccg 2640

aggaagagga ggaagatgaa gaccaggact acagctttcc tatatcttct attctagagt 2700

gggtcgagag gtccggcggc ggagagggca gaggaagtct tctaacatgc ggtgacgtgg 2760

aggagaatcc cggcccaatg gaagatgcca aaaacattaa gaagggccca gcgccattct 2820

acccactcga agacgggacc gccggcgagc agctgcacaa agccatgaag cgctacgccc 2880

tggtgcccgg caccatcgcc tttaccgacg cacatatcga ggtggacatt acctacgccg 2940

agtacttcga gatgagcgtt cggctggcag aagctatgaa gcgctatggg ctgaatacaa 3000

accatcggat cgtggtgtgc agcgagaata gcttgcagtt cttcatgccc gtgttgggtg 3060

ccctgttcat cggtgtggct gtggccccag ctaacgacat ctacaacgag cgcgagctgc 3120

tgaacagcat gggcatcagc cagcccaccg tcgtattcgt gagcaagaaa gggctgcaaa 3180

agatcctcaa cgtgcaaaag aagctaccga tcatacaaaa gatcatcatc atggatagca 3240

agaccgacta ccagggcttc caaagcatgt acaccttcgt gacttcccat ttgccacccg 3300

gcttcaacga gtacgacttc gtgcccgaga gcttcgaccg ggacaaaacc atcgccctga 3360

tcatgaacag tagtggcagt accggattgc ccaagggcgt agccctaccg caccgcaccg 3420

cttgtgtccg attcagtcat gcccgcgacc ccatcttcgg caaccagatc atccccgaca 3480

ccgctatcct cagcgtggtg ccatttcacc acggcttcgg catgttcacc acgctgggct 3540

acttgatctg cggctttcgg gtcgtgctca tgtaccgctt cgaggaggag ctattcttgc 3600

gcagcttgca agactataag attcaatctg ccctgctggt gcccacacta tttagcttct 3660

tcgctaagag cactctcatc gacaagtacg acctaagcaa cttgcacgag atcgccagcg 3720

gcggggcgcc gctcagcaag gaggtaggtg aggccgtggc caaacgcttc cacctaccag 3780

gcatccgcca gggctacggc ctgacagaaa caaccagcgc cattctgatc acccccgaag 3840

gggacgacaa gcctggcgca gtaggcaagg tggtgccctt cttcgaggct aaggtggtgg 3900

acttggacac cggtaagaca ctgggtgtga accagcgcgg cgagctgtgc gtccgtggcc 3960

ccatgatcat gagcggctac gttaacaacc ccgaggctac aaacgctctc atcgacaagg 4020

acggctggct gcacagcggc gacatcgcct actgggacga ggacgagcac ttcttcatcg 4080

tggaccggct gaagagcctg atcaaataca agggctacca ggtagcccca gccgaactgg 4140

agagcatcct gctgcaacac cccaacatct tcgacgccgg ggtcgccggc ctgcccgacg 4200

acgatgccgg cgagctgccc gccgcagtcg tcgtgctgga acacggtaaa accatgaccg 4260

agaaggagat cgtggactat gtggccagcc aggttacaac cgccaagaag ctgcgcggtg 4320

gtgttgtgtt cgtggacgag gtgcctaaag gactgaccgg caagttggac gcccgcaaga 4380

tccgcgagat tctcattaag gccaagaagg gcggcaagat cgccgtgtaa aataaaagat 4440

ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtga ggaaccccta gtgatggagt 4500

tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 4560

gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 4620

ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc 4680

aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac 4740

gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc 4800

ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt 4860

agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg 4920

ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac 4980

gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcgggcta 5040

ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 5100

ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt tatggtgcac 5160

tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc 5220

cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac 5280

cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg 5340

aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta 5400

gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta 5460

aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata 5520

ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc 5580

ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga 5640

agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct 5700

tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg 5760

tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta 5820

ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat 5880

gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt 5940

acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga 6000

tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga 6060

gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga 6120

actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc 6180

aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc 6240

cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg 6300

tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat 6360

cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata 6420

tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct 6480

ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga 6540

ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg 6600

cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 6660

aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct 6720

agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 6780

tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 6840

ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 6900

cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 6960

atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 7020

ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 7080

tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 7140

gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 7200

gccttttgct cacatgt 7217


<210> 46
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic polyadenylation signal

<400> 46
aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49

Claims (18)

  1. 配列番号10、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号11、配列番号12、配列番号13、前記配列のいずれかと少なくとも95％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列又はその機能的フラグメントであって、それが由来する配列からの少なくとも20、好ましくは少なくとも25の連続ヌクレオチドを含み、該由来配列中に存在する転写因子結合部位(TFBS)の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも５つを含む機能的フラグメントを含んでなり、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメント。
  2. 配列番号10、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号11、配列番号12、配列番号13、前記配列のいずれかと少なくとも95％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列又はその機能的フラグメントを含んでなる、骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための請求項１に記載の核酸調節エレメント。
  3. 前記機能的フラグメントが配列番号10の10位～180位；配列番号10の190位～240位；配列
    番号10の241位～300位；配列番号10の241位～360位；又は配列番号10の380位～420位のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列である、請求項２に記載の核酸調節エレメント。
  4. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、前記配列のいずれかと少なくとも95％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列又はその機能的フラグメントを含んでなる、心筋及び骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための請求項１に記載の核酸調節エレメント。
  5. 前記機能的フラグメントが、配列番号１の33位～58位；配列番号１の90位～142位；配列
    番号１の143位～233位；配列番号１の240位～310位；配列番号１の90位～233位；配列番
    号５の47位～130位；配列番号５の252位～293位；又は配列番号５の330位～450位のいず
    れか１つから選択されるヌクレオチド配列である、請求項４に記載の核酸調節エレメント。
  6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸調節エレメント又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメント。
  7. 600ヌクレオチド、好ましくは550ヌクレオチドの最大長を有する請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸調節エレメント。
  8. 配列番号10、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号11、配列番号12、配列番号13又は前記配列のいずれかと少なくとも95％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなる請求項７に記載の核酸調節エレメント。
  9. 核酸発現カセット又はベクターにおける、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸調節エレメントの使用。
  10. プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結した請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸調節エレメントを少なくとも１つ含んでなる核酸発現カセット。
  11. プロモーターが筋特異的プロモーター、好ましくはデスミン(DES)遺伝子のプロモーター
    である、請求項１０に記載の核酸発現カセット。
  12. 導入遺伝子が治療用タンパク質、免疫原性タンパク質又は構造タンパク質、好ましくはジストロフィン若しくはサルコグリカンをコードする、請求項１０又は１１に記載の核酸発現カセット。
  13. 請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸調節エレメント又は請求項１０～１２のいずれか１項に記載の核酸発現カセットを含んでなるベクター。
  14. ウイルスベクター、好ましくはアデノ関連ウイルスベクターである請求項１３に記載のベクター。
  15. 請求項１０～１２のいずれか１項に記載の核酸発現カセット又は請求項１３若しくは１４に記載のベクターと医薬的に許容され得るキャリアとを含んでなる医薬組成物。
  16. 遺伝子治療に使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸調節エレメント、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の核酸発現カセット、請求項１３若しくは１４に記載のベクター又は請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. ワクチン接種療法、好ましくは予防ワクチン接種に使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸調節エレメント、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の核酸発現カセット、請求項１３若しくは１４に記載のベクター又は請求項１５に記載の医薬組成物。
  18. － 請求項１０～１２のいずれか１項に記載の核酸発現カセット又は請求項１３若しくは１４に記載のベクターを筋細胞に導入し；
    － 筋細胞において導入遺伝子産物を発現させる
    ことを含んでなる、筋細胞において導入遺伝子産物を発現させるインビトロ法又はエキソビボ法。
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