JP6906591B2 - 筋特異的核酸調節エレメント並びにその方法及び使用 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子の筋特異的発現を増強することができる核酸調節エレメント、これら調節エレメントを用いる方法、及びその使用に関する。本発明は更に、これら調節エレメントを含んでなる発現カセット、ベクター及び医薬組成物を包含する。本発明は、特に、遺伝子治療(より具体的には筋指向遺伝子治療)を利用する適用及びワクチン接種目的に有用である。
筋肉は遺伝子治療について魅力的な標的である。筋肉への遺伝子送達は、例えば筋ジストロフィーの処置を目的として、筋構造タンパク質(例えば、ジストロフィン及びサルコグリカン)の発現を増強するために使用することができる。加えて、筋肉は、糖尿病、アテローム性動脈硬化、血友病、ガンなどのために非筋性の分泌/調節経路タンパク質を発現させる治療プラットフォームとして利用することができる。
な能力を示す。プラスミドは極僅かな免疫原性及び毒性しか示さず、非常に大きなクローニング能力を有する。プラスミドの主な短所は、典型的な送達プロトコル下での比較的乏しいトランスフェクション効率である。プラスミドの保持は別の1つの重要な考慮事項である。
しかし、幾つかの遺伝子送達アプローチの効率及び安全性に関して懸念が残る。主要な制限要因は、不十分な及び/又は一過性の導入遺伝子発現レベル、及び望んでいない細胞タイプでの不適切な導入遺伝子発現である。具体的には、抗原提示細胞(APC)における偶然の導入遺伝子発現は、遺伝子改変細胞及び/又は治療用導入遺伝子産物に対する不都合な免疫応答(これは結果的に長期の遺伝子発現を妨げる)のリスクを増大させることが示されている。
改変された距離差マトリクス(DDM)-多次元尺度構成法(MDS)ストラテジ(De Bleserら,2007 Genome Biol 8, R83)に依存する計算論的アプローチは、肝臓(WO 2009/130208)及び心臓(WO2011/051450)における頑強な組織特異的発現に関連する進化上保存された転写因子結合部位(TFBS)モチーフのクラスターのインシリコでの同定に有用であることが証明されている。
本発明者らは、改変DDM-MDSストラテジ(De Bleserら,2007)と増強スクリーニングストラテジとの組合せに依拠して、高発現の筋特異的遺伝子と関連する進化上保存された転写因子結合部位(TFBS)モチーフ(本明細書において核酸調節エレメントと定義する)を同定した。実験の項に示すように、本発明者らは、心臓及び骨格筋の両方での遺伝子発現を特異的に増強する核酸調節エレメント及び骨格筋特異的核酸調節エレメントを同定することができた。これら調節エレメントは、その後、効率的で組織特異的な遺伝子発現をインビボで生じることが確証された。よって、このアプローチにより、治療効力を最大化しつつ、より低い、したがってより安全なベクター用量の使用が可能になる。
観点1:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、尚より好ましくは少なくとも95%、例えば95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群より選択される配列の機能的フラグメントであって、それが由来する配列からの少なくとも20、好ましくは少なくとも25、より好ましくは少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200又は少なくとも250の連続ヌクレオチドを含み、該由来配列中に存在する転写因子結合部位(TFBS)の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも5つ、より好ましくは少なくとも10又は少なくとも15を含む機能的フラグメントを含んでなるか、該機能的フラグメントから本質的になるか又は該機能的フラグメントからなる、筋特異的遺伝子発現を増強する核酸調節エレメント。
観点6:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又はこれら配列のいずれかと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、尚より好ましくは少なくとも95%、例えば95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、観点1〜5のいずれか1つの従う核酸調節エレメント。
観点8:配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又はこれら配列のいずれかと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、尚より好ましくは少なくとも95%、例えば95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列からなる群より選択される配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための観点1、3〜6のいずれか1つに従う核酸調節エレメント。
観点13:観点1〜12のいずれか1つに従う核酸調節エレメントとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメント。
観点14:1000ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド、より好ましくは600ヌクレオチド、例えば550ヌクレオチド、500ヌクレオチド、450ヌクレオチド、400ヌクレオチド、350ヌクレオチド又は300ヌクレオチドの最大長を有し、配列番号1〜13のいずれか1つにより規定される調節エレメント又は観点3〜5のいずれか1つに規定されるその機能的フラグメントを依然として含んでなる、観点1〜13のいずれか1つに従う核酸調節エレメント。
観点16:プロモーターに作動可能に連結した少なくとも1つ、例えば1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれより多くの観点1〜14のいずれか1つに従う核酸調節エレメントを含んでなる核酸発現カセット。
観点17:核酸調節エレメントがプロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結している、観点16に従う核酸発現カセット。
観点18:プロモーターが筋特異的プロモーター、好ましくはデスミン(DES)遺伝子に由来するプロモーターである、観点16又は17に従う核酸発現カセット。
観点19:導入遺伝子が治療用タンパク質又は免疫原性タンパク質をコードする、観点17又は18に従う核酸発現カセット。
観点21:イントロン、好ましくはマウス微小ウイルス(MVM)のイントロンを更に含んでなる、観点16〜20のいずれか1つに従う核酸発現カセット。
観点22:ポリアデニル化シグナル、好ましくはシミアンウイルス40(SV40)のポリアデニル化シグナルを更に含んでなる、観点16〜21のいずれか1つに従う核酸発現カセット。
観点23:観点1〜14のいずれか1つに従う核酸調節エレメント又は観点16〜22のいずれか1つに従う核酸発現カセットを含んでなるベクター。
観点24:ウイルスベクター、好ましくはアデノ関連ウイルス(AAV)ベクター、より好ましくはAAV9ベクターである観点23に従うベクター。
観点26:観点16〜22のいずれか1つに従う核酸発現カセット又は観点23〜25のいずれか1つに従うベクターと医薬的に許容され得るキャリアとを含んでなる医薬組成物。
観点27:内科療法において使用するための観点1〜14のいずれか1つに従う核酸調節エレメント、観点16〜22のいずれか1つに従う核酸発現カセット、観点23〜25のいずれか1つに従うベクター又は観点26に従う医薬組成物。
観点28:遺伝子治療、好ましくは筋指向遺伝子治療において使用するための観点1〜14のいずれか1つに従う核酸調節エレメント、観点16〜22のいずれか1つに従う核酸発現カセット、観点23〜25のいずれか1つに従うベクター又は観点26に従う医薬組成物。
観点31:
− 観点16〜22のいずれか1つに従う核酸発現カセット又は観点23〜25のいずれか1つに従うベクターを筋細胞に導入し;
− 導入遺伝子産物を筋細胞において発現させる
ことを含んでなる、筋細胞、好ましくは心臓の筋細胞及び/又は骨格筋細胞において導入遺伝子産物を発現させる方法、好ましくはインビトロ又はエキソビボ法。
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」には、その文脈がそうでないことを明確に述べているときを除き、指称物の単数形及び複数形の両方が含まれるものとする。
用語「含んでなる」は、本明細書で使用する場合、「含む」又は「含有する」と同義であり、限定的な表現ではなく、言及されてない追加のメンバー、要素又は工程を排除しておらず、これらを更に含み得る。この用語は、(特許の用語法において十分に確立された意味を有する)「からなる」及び「から本質的になる」もまた包含する。
端点による数値範囲の記載には、それぞれの範囲内に含まれる全ての数字及び端数並びに記載の端点が含まれる。
用語「1又はそれより多い」又は「少なくとも1つ」(例えば、一群のメンバーの少なくとも1つのメンバー或いは1又はそれより多いメンバー)はそれ自体明確であるが、更なる例示として、この用語は、とりわけ、当該メンバーの任意の1つ、又は当該メンバーの任意の2つ若しくはそれより多く(例えば、当該メンバーの任意の3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上若しくは7つ以上など)、そして最大で当該メンバーの全てへの言及を包含する。別の1つの例においては、「1又はそれより多い」又は「少なくとも1つ」とは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ又はそれより多くであってもよい。
本開示を通して、種々の刊行物、特許及び公開された特許出願には、特定した引用によって言及する。本明細書で引用した全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、本明細書で具体的に言及した文献の教示又は節(section)が参照により組み込まれる。
特に断らない限り、本発明の開示に使用する全ての用語(技術用語及び科学用語を含む)は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者が共通して理解する意味を有する。用語の定義は、更なるガイダンスとして、本発明の教示をより良好に理解するために含ませたものである。特定の用語が本発明の特定の観点又は本発明の特定の実施形態に関連して規定されている場合、その意味は、特に断らなければ、本明細書を通して、すなわち本発明の他の観点又は実施形態に関しても、適用されるものとする。
本明細書を通して、「1つの実施形態」への言及は、当該実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造又は特性が、本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書の諸所に現れる句「1つの実施形態において」は、必ずしも、全てが同じ実施形態に言及するものではないが、そうであってもよい。更に、当該特定の特徴、構造又は特性を、1つ又はそれより多い実施形態において、本開示から当業者に明らかであるように、任意の適切な様式で組み合わせてもよい。更に、本明細書に記載の幾つかの実施形態は、その他の実施形態に含まれる幾つかの特徴を含み、その他の特徴は含まないが、当業者が理解するように、異なる実施形態の特徴の組合せは本発明の範囲内のものとし、異なる実施形態を構成する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求された実施形態のいずれも、任意の組合せで用いることができる。
本発明に関する一般的方法に関しては、とりわけ、周知の教科書(例えば、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版」(Sambrookら,1989)、「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubelら,1987)を含む)を参照する。
用語「機能的フラグメント」とは、本出願で用いる場合、本明細書に開示の調節エレメント配列の、筋特異的発現を調節する能力を保持するフラグメントをいう。すなわち、フラグメントは、組織特異性を依然として付与することができ、それが由来する配列と(おそらくは、同じ程度ではないが)同じ様式で(導入)遺伝子の発現を調節する能力を有する。機能的フラグメントは、好ましくは、それが由来する配列からの少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも120、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350又は少なくとも400の連続ヌクレオチドを含んでなり得る。また、好ましくは、機能的フラグメントは、それが由来する配列に存在する転写因子結合部位(TFBS)の少なくとも1つ、より好ましくは少なくとも2つ、少なくとも3つ又は少なくとも4つ、尚より好ましくは少なくとも5つ、少なくとも10又は少なくとも15を含んでなり得る。
本明細書で使用する場合、「心筋及び骨格筋特異的発現」とは、心臓(特に心筋)及び骨格筋における(導入)遺伝子の優先的又は優勢な発現をいう。特定の実施形態によれば、(導入)遺伝子発現の少なくとも50%、より具体的には少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%が心臓及び骨格筋で生じる。よって、特定の実施形態によれば、(導入)遺伝子発現の10%未満、5%未満、2%未満又は1%未満が心臓及び骨格筋以外の器官又は組織で生じる。
同じことが、適切な変更を加えて、筋細胞特異的及び筋芽細胞特異的発現(これらは筋特異的発現の特定の形態と考えてよい)に適用される。本出願を通して、発現に関して筋特異的に言及する場合、筋細胞特異的発現及び筋芽細胞特異的発現も明白に認識される。同様に、本願において心筋及び骨格筋特異的発現を用いる場合には、心筋細胞及び骨格筋細胞特異的発現並びに心筋筋芽細胞及び骨格筋筋芽細胞特異的発現も明白に認識される。同様に、本願において骨格筋特異的発現を用いる場合、骨格筋細胞特異的及び骨格筋筋芽細胞特異的発現も明白に認識される。
本明細書で使用する場合、用語「骨格筋」とは、骨格に付着している随意制御性の横紋筋タイプの筋肉をいう。骨格筋の非限定的な例としては、二頭筋、三頭筋、四頭筋、前脛骨筋(tibialis interior)及び腓腹筋が挙げられる。
用語「筋細胞」とは、本明細書で使用する場合、適切な条件下で筋特異的表現型を発現することができるように始原筋芽細胞から分化した細胞をいう。最終的に分化した筋細胞は互いに融合して筋線維の主要な構成要素である筋管を形成する。用語「筋細胞」は脱分化した筋細胞をもいう。この用語には、インビボの細胞及びエキソビボで培養された細胞(当該細胞が初代であるか継代されているかにかかわらず)が含まれる。
用語「筋芽細胞」とは、本明細書で使用する場合、筋細胞を生じるように分化する中胚葉の胚性細胞をいう。この用語には、インビボの細胞及びエキソビボで培養された細胞(当該細胞が初代であるか継代されているかにかかわらず)が含まれる。
更なる実施形態において、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又はこれら配列のいずれかと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、尚より好ましくは少なくとも95%、例えば95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントを提供する。
尚更なる実施形態において、本発明は、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13又はこれら配列のいずれかと少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、尚より好ましくは少なくとも95%、例えば95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含んでなるか、該選択配列から本質的になるか、又は該選択配列からなる、骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントを提供する。
また、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、これら配列のいずれかと少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、例えば95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する配列、又はそれらのフラグメントからなる群より選択される少なくとも2つの配列を含んでなる、筋特異的遺伝子発現、特に骨格筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメントが本明細書に開示される。
しかし、本開示の核酸調節エレメントは、調節活性(すなわち、特異性及び/又は転写活性に関する調節活性)を保持しているため、特に、20ヌクレオチド、25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、35ヌクレオチド、40ヌクレオチド、45ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、150ヌクレオチド、200ヌクレオチド、250ヌクレオチド、300ヌクレオチド、350ヌクレオチド又は400ヌクレオチドの最短長を有すると理解されるべきである。
本明細書に開示の核酸調節エレメントは、核酸発現カセット中で使用してもよい。したがって、1つの観点において、本発明は、本明細書に記載のとおりの核酸調節エレメントの核酸発現カセットにおける使用を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「核酸発現カセット」とは、1又はそれより多い所望の細胞タイプ、組織又は器官における(導入)遺伝子発現を導く1又はそれより多い転写制御エレメント(例えば、限定されないが、プロモーター、エンハンサー及び/又は調節エレメント、ポリアデニル化配列及びイントロン)を含む核酸分子をいう。代表的には、核酸発現カセットは、導入遺伝子も含有するが、該核酸カセットが挿入された細胞において内因性遺伝子の発現を導くこともまた認識される。
プロモーターは、誘導性又は構成性プロモーターであり得る。
好適な実施形態において、プロモーターは、デスミン遺伝子由来、特にマウス又はヒトのデスミン遺伝子由来、例えば配列番号16に規定されるプロモーターである。例えば、マウスデスミンプロモーターはpDRIVE-mデスミン(Invivogen)として市販されている。デスミンプロモーターは心筋及び骨格筋の両方で発現される。
実施形態において、プロモーターは、骨格筋特異的プロモーター、特に筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、より特にはWangら(2008. Gene Ther. 15:1489-1499)に記載されるような、MCKエンハンサー及びMCK基本プロモーターの二重又は三重タンデムからなる二重MCKプロモーター又は三重MCKプロモーターである。
更に、プロモーターは、核酸発現カセット中の導入遺伝子のプロモーターである必要はないが、導入遺伝子は自身のプロモーターから転写されることも可能である。
導入遺伝子は、全長cDNA若しくはゲノムDNA配列、又は少なくとも幾らかの生物学的活性を有する任意のそのフラグメント、サブユニット若しくは変異体であり得る。特に、導入遺伝子は、ミニ遺伝子、すなわち、そのイントロン配列の一部、ほとんど又は全部を欠く遺伝子配列であり得る。よって、導入遺伝子は、場合により、イントロン配列を含有してもよい。随意に、導入遺伝子は、ハイブリッド核酸配列、すなわち、同種及び/又は異種のcDNA及び/又はゲノムDNAフラグメントから構築されたものであり得る。「変異形態」は、野生型の若しくは天然に存在する配列とは異なる1又はそれより多いヌクレオチドを含有する核酸配列を意味するものとする。すなわち、変異体核酸配列は、1又はそれより多いヌクレオチド置換、欠失及び/又は挿入を含有する。ヌクレオチド置換、欠失及び/又は挿入は、野生型アミノ酸/核酸配列とはアミノ酸/核酸配列が異なる遺伝子産物(すなわち、タンパク質又は核酸)を生じることがある。そのような変異体の作製は当該分野において周知である。幾つかの場合には、導入遺伝子はまた、導入遺伝子産物が細胞から分泌されるように、リーダーペプチド又はシグナル配列をコードする配列を含んでもよい。
実施形態において、導入遺伝子は治療用タンパク質をコードする。治療用タンパク質は分泌型タンパク質であり得る。分泌型タンパク質、特に分泌型治療用タンパク質の非限定的な例としては、凝固因子(例えば第VIII因子又は第IX因子)、インスリン、エリスロポエチン、リポタンパク質リパーゼ、抗体又はナノボディ、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、血漿因子などが挙げられる。治療用タンパク質はまた構造タンパク質であり得る。構造タンパク質、特に治療用構造タンパク質の非限定的な例としては、ジストロフィン及びサルコグリカンが挙げられる。実施形態において、導入遺伝子は、マイクロジストロフィン1(MD1)遺伝子又はフォリスタチン(FST)遺伝子を含んでなる。
実施形態において、導入遺伝子は免疫原性タンパク質をコードする。免疫原性タンパク質の非限定的な例としては、病原体に由来するエピトープ及び抗原が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「免疫原性」とは、免疫応答を惹起することができる物質又は組成物をいう。
本明細書に記載の発現カセットには、任意のイントロンを利用することができる。用語「イントロン」は、全体イントロンの任意の一部であって、核のスプライシング装置により認識されスプライスされるに十分に大きい部分を包含する。代表的には、短い機能的イントロン配列が、発現カセットのサイズを可能な限り小さく維持するために好適であり、このことにより発現カセットの構築及び操作が容易になる。幾つかの実施形態において、イントロンは、発現カセット内のコーディング配列によりコードされるタンパク質をコードする遺伝子から得る。イントロンは、コーディング配列の5'側若しくは3'側又はコーディング配列内に位置することができる。イントロンをコーディング配列の5'側に配置する利点は、イントロンがポリアデニル化シグナルの機能と干渉する可能性を最小にすることである。実施形態において、本明細書に開示の核酸発現カセットはイントロンを更に含んでなる。適切なイントロンの非限定的な例は、マウス微小ウイルス(MVM)のイントロン、βグロビンのイントロン(betaIVS-II)、第IX因子(FIX)のイントロンA、シミアンウイルス40(SV40)の小tイントロン及びβアクチンのイントロンである。
好ましくは、イントロンはMVMのイントロンである。
好ましくは、ポリアデニル化シグナルはSV40に由来する(すなわちSV40 pA)。
特定の実施形態において、本発明は、プロモーター(好ましくはデスミン遺伝子に由来するプロモーター又はSPc5-12プロモーターからなる群より選択されるプロモーター)及び導入遺伝子(好ましくはルシフェラーゼをコードする導入遺伝子)に作動可能に連結した配列番号10又は該配列と95%の同一性を有する配列からなる核酸調節エレメントを含んでなる核酸発現カセットを提供する。更なる実施形態において、核酸発現カセットはMVMイントロンを更に含んでなる。尚更なる実施形態において、核酸発現カセットは、ポリアデニル化シグナル、好ましくはSV40由来のポリアデニル化シグナルを更に含んでなる。
本明細書に開示の核酸調節エレメント及び核酸発現カセットは、そのまま使用してもよいし、又は代表的には、それらは核酸ベクターの一部であってもよい。したがって、更なる観点は、ベクター、特に核酸ベクターにおける、本明細書に記載のとおりの核酸調節エレメント又は本明細書に記載のとおりの核酸発現カセットの使用に関する。
1つの観点において、本発明はまた、本明細書に開示のとおりの核酸調節エレメントを含んでなるベクターを提供する。更なる実施形態において、ベクターは本明細書に開示のとおりの核酸発現カセットを含んでなる。
AAVセロタイプ9(AAV9)は、心臓及び骨格筋における効率的形質導入を達成するに理想的に適切である。したがって、特に好適な実施形態において、ベクターはAAV9ベクターであり、より具体的には自己相補性AAV9ベクター(scAAV9)である。
他の実施形態において、ベクターは、非ウイルスベクター、好ましくはプラスミド、ミニサークル又はトランスポゾンベースのベクター、例えばSleeping Beauty(SB)ベースのベクター又はpiggyBac(PB)ベースのベクターである。
更に他の実施形態において、ベクターは、ウイルス性エレメント及び非ウイルス性エレメントを含んでなる。
特定の実施形態において、本発明は、配列番号10からなる核酸調節エレメント、プロモーター(好ましくはデスミン遺伝子由来プロモーター)、MVMイントロン、導入遺伝子(好ましくはフォリスタチンをコードする導入遺伝子)及びポリアデニル化シグナル(好ましくは配列番号46を有するポリアデニル化シグナル)を含む核酸発現カセットを含んでなるベクターを提供する。特定の実施形態において、ベクターは配列番号45を有する。
本明細書に教示のとおりの核酸発現カセット及びベクターは、医薬的に許容され得る賦形剤、すなわち1又はそれより多い医薬的に許容され得るキャリア物質及び/又は添加物(例えば、緩衝液、キャリア、賦形剤、安定化剤など)と共に医薬組成物に製剤化してもよい。医薬組成物はキットの形態で提供してもよい。
したがって、本発明の1つの更なる観点は、本明細書に記載の核酸発現カセット又はベクターを含んでなる医薬組成物に関する。
これら医薬組成物の製造のための本明細書に記載の核酸調節エレメントの使用もまた、本明細書に開示する。
実施形態において、医薬組成物はワクチンであってもよい。ワクチンは、免疫応答を増強するための1又はそれより多いアジュバントを更に含んでもよい。適切なアジュバントとしては、例えば、サポニン、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン)、ペプチド、油又は炭化水素エマルジョン、カルメット-ゲラン桿菌(BCG)、ざ瘡菌(Corynebacterium parvum)及び合成アジュバントQS-21が挙げられるが、これらに限定されない。随意に、ワクチンは、1又はそれより多い免疫刺激分子を更に含んでもよい。免疫刺激分子の非限定的な例としては、免疫刺激活性、免疫増強活性及び炎症促進活性を有する種々のサイトカイン、リンホカイン及びケモカイン(例えばインターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13));増殖因子(例えば、顆粒球-マクロファージ(GM)-コロニー刺激因子(CSF));及び他の免疫刺激分子(例えばマクロファージ炎症性因子、Flt3リガンド、B7.1;B7.2)などが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「処置する」又は「処置」とは、治療的処置及び予防手段の両方をいう。有益な又は所望される臨床結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかに関わらず、望ましくない臨床状態又は障害の防止、障害発症率の低減、障害に伴う症状の緩和、障害の程度の縮小、障害の安定化された(すなわち、悪化しない)状態、障害進行の遅延又は減速、障害状態の改善又は緩和、寛解(部分的又は全体的に関わらず)、又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存と比較したときの生存延長を意味することがある。
本明細書で使用する場合、用語「治療的処置」又は「治療法」及びこれに類する用語は、対象者の身体若しくは身体要素を望ましくない生理学的変化若しくは障害から望ましい状態、例えば重篤度若しくは不快感が小さい状態へ移行させること(例えば、改善又は緩和)、又は、健常状態への復帰(例えば、対象者の健康、身体的完全性及び身体的快適性の回復)、又は、望ましくない生理学的変化又は障害の維持(例えば、安定化又は悪化させないこと)、又は望ましくない生理学的変化又は障害と比較して、より重篤な又は悪い状態への進行を防止し又は減速させることが目的である処置をいう。
本明細書に記載の核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物の、遺伝子治療用、特に筋指向遺伝子治療用、より具体的には心臓及び骨格筋指向遺伝子治療用又は骨格筋指向遺伝子治療用の医薬の製造のための使用も本明細書に開示される。
− 対象者に、特には対象者の筋肉に、より具体的には対象者の心筋又は骨格筋に、本明細書に記載の核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物であって、プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結した本明細書に記載の核酸調節エレメントを含む核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物を導入し;及び
− 対象者において、特に対象者の筋肉、より具体的には対象者の心臓及び骨格筋又は骨格筋において治療有効量の導入遺伝子産物を発現させる
ことを含んでなる方法もまた本明細書に開示される。
本明細書に記載の核酸調節エレメント、核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物を用いる遺伝子治療の利益を享受し得る例示的な疾患及び障害としては、筋ジストロフィー(例えば、デュシェーヌ筋ジストロフィー(DMD)/ベッカー筋ジストロフィー(BMD))、筋緊張性ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患(MND)、例えばシャルコー-マリー-ツース病(CMT)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、及び筋萎縮性側索硬化症(ALS)、エメリー-ドライフス筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)、先天性筋ジストロフィー、先天性ミオパシー、肢帯筋ジストロフィー、代謝性ミオパシー、筋肉炎症性疾患、筋無力症、ミトコンドリアミオパシー、イオンチャネルの異常、核包膜疾患、心筋症、心肥大、心不全、遠位型ミオパシー、心血管疾患、血友病(血友病A及びBを含む)、及び糖尿病が挙げられる。
本明細書には、
− 対象者に、特には対象者の筋肉に、より具体的には対象者の心筋又は骨格筋に、本明細書に記載の核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物であって、プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結した本明細書に記載の核酸調節エレメントを含む核酸発現カセット、ベクター又は医薬組成物を導入し;及び
− 対象者において、特には対象者の筋肉に、より具体的には対象者の心筋又は骨格筋において、免疫学的有効量の導入遺伝子産物を発現させる
ことを含んでなる、ワクチン接種を必要とする対象者のワクチン接種、特には予防用ワクチン接種の方法も開示される。
用語「対象者」及び「患者」は、本明細書において互換的に使用し、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物をいい、具体的にはヒト患者及び非ヒト哺乳動物を含む。「哺乳動物」対象者としては、ヒト、家畜動物、商用動物、農業用動物、動物園の動物、スポーツに用いられる動物、ペット及び実験動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ;霊長類、例えば類人猿、サル、オラウータン及びチンパンジー;イヌ科動物、例えばイヌ及びオオカミ;ネコ科動物、例えばネコ、ライオン及びトラ;ウマ科動物、例えばウマ、ロバ及びシマウマ;食用動物、例えばウシ、ブタ及びヒツジ;有蹄動物、例えばシカ及びキリン;げっ歯動物、例えばマウス、ラット、ハムスター及びモルモットなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適な患者又は対象者はヒト対象者である。
「免疫学的有効量」は、本明細書で使用する場合、(導入)遺伝子によりコードされる免疫原へのその後の曝露に対する対象者の免疫応答を増強するに有効な(導入)遺伝子産物の量をいう。誘導された免疫のレベルは、例えばプラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着又はマイクロ中和化アッセイにより、例えば中和性の分泌及び/又は血清抗体の量を測定することにより、決定することができる。
更に、
− 本明細書に開示の核酸発現カセット又はベクターであって、プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結した本明細書に開示の核酸調節エレメントを含む核酸発現カセット又はベクターで筋細胞をトランスフェクト又は形質導入し;及び
− 筋細胞において導入遺伝子産物を発現させる
ことを含んでなる筋細胞、好ましくは心筋細胞及び/又は骨格筋細胞において導入遺伝子産物を発現させる方法も本明細書に開示される。
当業者は、本明細書に開示の核酸調節エレメント、核酸発現カセット及びベクターの使用は、遺伝子治療以外、例えば幹細胞の筋原細胞への誘導分化、筋肉におけるタンパク質の過剰発現についてのトランスジェニックモデルなどにも有意義であると理解する。
本発明を、以下の非限定的な実施例により更に説明する。
実施例1:心筋及び骨格筋特異的調節エレメントの同定
実験手順
心臓及び筋肉の両方で高発現するが、他の組織では僅かな発現しか示さない遺伝子を、Xiaoら(2010. Bioinformatics 26:1273-1275)に記載された特異性測定(SPM)法を用いて同定した。データセットとして、本発明者らはヒトタンパク質をコードするトランスクリプトームのU133A/GNF1H Gene Atlas(GSE1133)を使用した(Suら,2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6062-6067)。これにより次の5遺伝子の最終候補リストがもたらされた:フィラミン-c遺伝子(FLNC)、アクチニン、α2遺伝子(ACTN2)、ミオシン調節軽鎖2、心室/心筋イソフォーム遺伝子(MYL2)、デスミン遺伝子(DES)及びテレトニン(telethonin)遺伝子(TCAP)。次に、これら遺伝子のゲノムコンテクストを、筋肉及び心臓での高発現に関連する転写因子結合部位(TFBS)に富む種間保存領域について検索した。ENCODEプロジェクト(The ENCODE Project Consortium. 2012. Nature 489:57-74)で規定されるようなオープンクロマチン構造及び/又は転写調節に関連する再現可能な生化学的特徴を有する領域とオーバーラップするか又は該領域を含有する推定の核酸調節エレメントを選択することにより、追加のフィルタリングを行った。
これにより、「過剰発現」又は「過少発現」遺伝子のプロモーターに相当する2セットの心臓特異的プロモーター配列がもたらされた。代表的プロモーター配列の非冗長なセットを作製するため、「uclust」(http://www.drive5.com/usearch/)を用いてプロモーター配列をフィルタリングした。
実験手順
AAVプラスミド構築物(pAAV-CSk-SH-Des-Luc2)の創出
心筋及び骨格筋特異的調節エレメント(CSk-SH1〜CSk-SH6)を従来のオリゴヌクレオチド合成により合成し、Acc65I及びMluI制限部位を側方に配置した。アデノ関連ウイルスベクター(AAV)骨格(pAAV-Des-Luc2と呼ぶ)において、ホタルルシフェラーゼ(Luc2)レポーター遺伝子の発現を駆動するデスミン(Des)プロモーターの上流に異なるCSk-SHをクローニングした(図3に概略図を示す)。対応するAAVプラスミド構築物をpAAV-CSk-SH-Des-Luc2と呼ぶ。これらプラスミドは、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン及びシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化部位(pA)も含有していた。
AAV9ベクターは、Vandendriesscheら(2007. J Thromb Haemost 5:16-24)(これは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるとおりに、興味対象のpAAVプラスミドと、アデノウイルスヘルパープラスミドと、AAV2 rep遺伝子をAAV9 cap遺伝子と共に送達するキメラパッケージング構築物とでの293Tヒト胚性腎細胞のリン酸カルシウム(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)コトランスフェクションにより作製した。
簡潔には、トランスフェクションの2日後に、細胞を採取し、等密度遠心分離法を用いてベクター粒子を精製した。採取した細胞を、凍結/融解連続サイクル及び超音波処理により溶解し、ベンゾナーゼ(Novagen, Madison, WI)及びデオキシコール酸(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で処理した後、連続3回の塩化セシウム(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)密度勾配超遠心分離に供した。AAVベクター含有画分を回収し、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)(Gibco, BRL)中1mM MgCl2において濃縮し、−80℃で保存した。
代表的には、全てのベクターについて、1.5〜6.1×1011vg/mlの範囲の力価が、20ペトリ皿のプロデューサー細胞の小製造バッチから達成された。より多数のペトリ皿(例えば60皿)のプロデューサー細胞を用いれば、より高い力価(代表的には、1012〜1013gc/ml)のAAV粒子が達成されよう。既知のコピー数(102〜107)の、対応するAAVベクターの創出に使用したそれぞれのベクタープラスミド(適切なcDNAを含有)を用いて標準曲線を作成した。
全ての動物手順は、ブリュッセル自由大学(VUB)(Brussels, Belgium)の大学内動物倫理委員会による承認を受けた。全てのマウスを特定病原体フリー条件下で飼育した;食餌及び水は自由摂取とした。
2日齢のCB.17/IcrTac/Prkdcscidマウスの眼窩周囲静脈に、表2にまとめたとおりの異なるCSk-SH(すなわち、CSk-SH1〜CSk-SH6)調節エレメントを含有する濃縮ベクター(5×109vg/マウス)又は濃縮AAV9-Des-Luc2コントロールベクター(5×109vg/マウス)を50μl静脈内注射した。
トータルRNAを、マウスの異なる器官からシリカ膜ベースの精製キットにより、製造業者(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA)の指示に従って抽出した。その後、各サンプルに由来する50ngのトータルRNAを、cDNA合成キット(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA)を用いる逆転写(RT)に供した。次に、10ngのトータルRNAに相当するcDNA量を、ABI 7700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)で、5'-CCCACCGTCGTATTCGTGAG-3'(配列番号14)をフォワードプライマーとし、5'-TCAGGGCGATGGTTTTGTCCC-3'(配列番号15)をリバースプライマーとして用いる定量的(q)PCRにより増幅した(アンプリコン:217bp)。qPCR標準物は、既知量の系列希釈AAV9-CSk-SH-Des-Luc2プラスミドからなった。Luc2 mRNAレベルは、5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'(配列番号31)をフォワードプライマーとし、5'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'(配列番号32)をリバースプライマーとして用いる内因性マウスグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(mGAPDH)遺伝子のmRNA(アンプリコン:82bp)レベルに対して規格化した。RNAサンプルを逆転写酵素あり及びなし(DNA増幅を排除するため)で増幅した。増幅PCRフラグメントのサイズを1.8%アガロースゲルで検証した。
ウイルスベクターの形質導入効率及び生体内分布を、以前(Pacak, C.A.,ら,2008. Genet Vaccines Ther 6:13)に記載されたように、異なる器官及び組織でLuc2導入遺伝子のコピー数を定量することにより評価した。簡潔には、ゲノムDNAを30mgの各組織からDNeasy Blood & Tissueキットプロトコル(Qiagen, Chatsworth, CA, USA)に従って抽出し、各サンプルからの100ngのゲノムDNAを、Luc2特異的フォワードプライマー5'-CCCACCGTCGTATTCGTGAG-3'(配列番号14)及びリバースプライマー5'-TCAGGGCGATGGTTTTGTCCC-3'(配列番号15)を用いるqPCRに供した(アンプリコン:217bp)。既知のコピー数(102〜107)の対応するプラスミドpAAV-CSk-SH-Des-Luc2を用いて標準曲線を作成した。結果を平均AAVコピー数/100ngゲノムDNAとして表した。
インシリコで同定した心筋及び骨格筋特異的調節エレメント(CSk-SH)のインビボでの効果を評価するため、キメラプロモーターからルシフェラーゼ遺伝子luc2を発現するアデノ関連ベクターを創出した。このプロモーターは、心筋及び骨格筋特異的調節エレメントCSk-SH1〜6に連結した筋特異的デスミン(Des)プロモーターから構成された。これらベクターをマウスに静脈内注射し、注射5及び6週間後にマウス全身画像を撮影して、ルシフェラーゼ発現レベルを調べた。
心筋及び骨格筋特異的調節エレメント(CSk-SH1〜6)を含むベクターを注射した全てのマウスは、調節エレメントを含まない対応AAV9ベクターを注射したコントロールマウスと比較して増大したルシフェラーゼ活性を示した。このことから、試験した調節エレメントの全てがルシフェラーゼ発現を増大させることが示された(データは示さず)。本発明者らは、調節エレメントCSk-SH1、CSk-SH3又はCSk-SH5を含むAAV9ベクターを注射したマウスにおいて、注射5及び6週間後に、コントロールマウスのルシフェラーゼ活性と比較して、増強した非常に堅牢なルシフェラーゼ活性を観察した。
実験手順
先ず、筋特異的遺伝子のリストを組織特異的遺伝子発現及び調節(TiGER)データベースから抽出した。これを用いて、筋組織で最も高発現(すなわち「過剰発現」)する遺伝子セットを同定した。逆に、筋肉で最も低い発現を示す遺伝子に相当する「過少発現」遺伝子のセットを同定した。次に、これら「過剰発現」及び「過少発現」筋特異的遺伝子の参照配列(RefSeq)識別(ID)リストを、UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu)データベースのrefGene表に格納された転写開始位置データを用いる、報告された転写開始部位(TSS)の1000塩基上流の対応するプロモーター配列の抽出に使用した(NCBI36/hg18ゲノムアセンブリ)。これにより、「過剰発現」又は「過少発現」遺伝子のプロモーターに相当する2セットの筋特異的プロモーター配列がもたらされた。代表的プロモーター配列の非冗長なセットを作製するため、「uclust」(http://www.drive5.com/usearch/)を用いてプロモーター配列をフィルタリングした。
実験手順
骨格筋特異的調節エレメント(pAAV-Sk-SH-Des-Luc2)を含むAAVプラスミド構築物を、実施例2に記載のプロトコルに従って創出した。簡潔には、骨格筋特異的調節エレメントを従来のオリゴヌクレオチド合成により合成し、Acc65I及びMluI制限部位(Sk-SH1、Sk-SH2、Sk-SH3、Sk-SH4、Sk-SH5及びSk-SH7)又はBsiWI及びMluI制限部位(Sk-SH6)を側方に配置した。AAVベクター骨格pAAV-Des-Luc2において、ホタルルシフェラーゼ(Luc2)レポーター遺伝子の発現を駆動するデスミン(Des)プロモーターの上流に異なるSk-SHをクローニングした。これらプラスミドは、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン及びシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化部位(pA)も含有していた。
AAVベクターの作製及び精製並びに動物研究は、実施例2に記載のとおりに行った。実験設計を表4にまとめる。
骨格筋特異的調節エレメントSk-SH1〜7に連結したデスミン(Des)プロモーターから構成されるキメラプロモーターからルシフェラーゼ遺伝子luc2を発現するアデノ関連ベクターを創出した。これらベクターをマウスに静脈内注射し、注射5及び6週間後にマウス全身画像を撮影して、ルシフェラーゼ発現レベルを調べた。
骨格筋特異的調節エレメント(Sk-SH1〜7)を含むベクターを注射した全てのマウスは、調節エレメントを含まない対応AAV9ベクターを注射したコントロールマウスと比較して増大したルシフェラーゼ活性を示した。このことから、試験した調節エレメントの全てがデスミンプロモーターからのルシフェラーゼ発現を増大させることが示された(データは示さず)。本発明者らは、調節エレメントSk-SH1又はSk-SH4を含むAAV9ベクターを注射したマウスにおいて、注射5及び6週間後に、コントロールマウスのルシフェラーゼ活性と比較して、増強した非常に堅牢なルシフェラーゼ活性を観察した。
注射7週間後、マウスを安楽死させ、個々の器官を分析してルシフェラーゼ発現及び生体内分布パターンを評価した(図8及び9)。Sk-SH4調節エレメントを含むAAVベクターを注射したマウスの骨格筋、特に、腓腹筋、前脛骨筋、四頭筋、二頭筋及び三頭筋では、コントロールマウスと比較して200〜400倍までのルシフェラーゼ活性増強が測定された(図8)。心臓で測定した場合も、心臓及び骨格筋の両方に特異的であるデスミンプロモーターの使用により、36倍のルシフェラーゼ活性増強が依然として存在した(図8)。ルシフェラーゼ発現は、心筋及び骨格筋組織以外の他の全ての器官においてみられなかったか又は制限されていた(図9)。2番目に強力な調節エレメントはSk-SH1であった。これもまた、デスミンプロモーターからのルシフェラーゼ発現を骨格筋で有意に増大させ、より弱い程度ではあるが心筋でも増大させた。
これらインビボデータは、核酸調節エレメントSk-SH、特にSk-SH1及びSk-SH4が心臓及び骨格筋特異的ルシフェラーゼ発現を増強することができることを示している。核酸調節エレメントSk-SH4は、同定した他の5つの調節エレメントと比較して、心臓及び骨格筋で最高レベルのルシフェラーゼ発現を導く最強のエレメントである。本発明者らが測定した最高活性は、脛骨におけるルシフェラーゼ活性の400倍のアップレギュレーションであった。
実験手順
筋特異的調節エレメントを含むAAVプラスミド構築物(pAAV-Sk-SH4-Des-Luc2、pAAV-CSk-SH1-Des-Luc2、pAAV-CSk-SH5-Des-Luc2)を、実施例2に記載のプロトコルに従って創出した。簡潔には、筋特異的調節エレメントを従来のオリゴヌクレオチド合成により合成し、AAVベクター骨格pAAV-Des-Luc2において、ホタルルシフェラーゼ(Luc2)レポーター遺伝子の発現を駆動するデスミン(Des)プロモーターの上流にクローニングした。これらプラスミドは、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン及びシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化部位(pA)も含有していた。
AAVベクター骨格pAAV-Des-Luc2において、デスミンプロモーターの代わりにサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(配列番号30)がホタルルシフェラーゼ(Luc2)レポーター遺伝子の上流にクローニングされているpAAVsc-CMV-Luc2-SV40pAプラスミド構築物を創出した。これらプラスミドはシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化部位(pA)も含有していた。pAAVsc-CMV-Luc2-SV40pAの概略図を図10Aに示す。AAVsc-CMV-Luc2-SV40pAのクローニングのために、フラグメント5'-Acc65I-CMV-HindIII-3'を合成し、同じ酵素対(すなわち、Acc65I及びHindIII)で制限したAAVsc-Luc2-SV40pAベクターにクローニングした。
AAVベクターの作製及び精製は実施例2に記載のとおりに行った。
平均体重17.4±1.6gの6週齢雄性CB17 SC SCIDマウスの眼窩周囲静脈に、1×1010vg/マウスの濃縮ベクターを静脈内注射した。実施例2に記載のとおり、注射4週間後にマウスを撮像した。注射5週間後にマウスを安楽死させ、インタクトな器官を採集し、実施例2に記載のとおりに撮像した。
ルシフェラーゼ活性を、筋特異的調節エレメントSK-SH4、CSk-SH1又はCSk-SH5に作動可能に連結したデスミン(Des)プロモーターからルシフェラーゼ遺伝子luc2を発現するベクターを注射したマウスとサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターからルシフェラーゼ遺伝子luc2を発現するベクターを注射したマウスとで比較した。CMVプロモーターは、心臓での強力な遺伝子発現を可能にすることが知られている最も強力なプロモーターの1つであると考えられている。後者のベクターには筋特異的調節エレメントは存在させなかった。
図10A及び10Bは、デスミンプロモーターに作動可能に連結した本発明の筋特異的調節エレメントを含むベクターが、CMVプロモーターを含むベクターより遥かに良好な発現を可能にすることを示している。
実験手順
デスミンプロモーターがWangら(2008. Gene Ther. 15:1489-1499)に記載された筋特異的プロモーターで置換されたAAVプラスミドを実施例4に記載のとおりに構築した。
AAVベクターの作製及び精製並びに動物研究は、実施例2に記載のとおりに行った。
結果
デスミンプロモーターに代えて骨格筋特異的プロモーターを用いた場合、ルシフェラーゼ発現の増大は骨格筋のみに限局される。このことは、核酸調節エレメントSk-SH1〜7、特にSk-SH4及びSk-SH1が骨格筋特異的ルシフェラーゼ発現を増強することを示している。
実験手順
同定した核酸調節エレメントCSk-SH1(配列番号1;381bp)、CSk-SH5(配列番号5;454bp)及びSk-SH4(配列番号10;435bp)を、より小さな機能的フラグメントに分割した。調節
エレメントの転写因子結合部位(TFBS)をそれぞれの配列にマッピングし(図11A〜11C)、TFBSを有する領域の無作為クラスター化により機能的フラグメントを創出した。以下の機能的フラグメントを創出した:
配列番号1の機能的フラグメント:
クラスター1A:配列番号1の33位〜58位のヌクレオチド配列
クラスター1B:配列番号1の90位〜142位のヌクレオチド配列
クラスター1C:配列番号1の143位〜233位のヌクレオチド配列
クラスター1D:配列番号1の240位〜310位のヌクレオチド配列
クラスター1E:配列番号1の90位〜233位のヌクレオチド配列
配列番号5の機能的フラグメント:
クラスター5A:配列番号5の47位〜130位のヌクレオチド配列
クラスター5B:配列番号5の252位〜293位のヌクレオチド配列
クラスター5C:配列番号5の330位〜450位のヌクレオチド配列
配列番号10の機能的フラグメント:
クラスター4A:配列番号10の10位〜180位のヌクレオチド配列(配列番号37);
クラスター4B:配列番号10の190位〜240位のヌクレオチド配列(配列番号38);
クラスター4C:配列番号10の241位〜300位のヌクレオチド配列(配列番号39);
クラスター4E:配列番号10の241位〜360位のヌクレオチド配列(配列番号41)
クラスター4D:配列番号10の380位〜420位のヌクレオチド配列(配列番号40)
図14に示す結果は、Sk-SH4調節エレメントの5つ全てのフラグメントが、調節エレメントを有さない参照構築物と比較したとき、デスミンプロモーターから駆動されるルシフェラーゼ遺伝子発現を増強することができることを示している。フラグメントSk-SH4bは、その他のフラグメントと比較して最高のルシフェラーゼ発現を示した。しかし、いずれのフラグメントも、全長Sk-SH4フラグメントが誘導する発現と比較して、同等以上のルシフェラーゼ発現を達成することはできなかった。
異なる調節エレメントの組合せの作製及び/又は同じ調節エレメントの数コピーの使用(例えば、CSk-SH1とCSk-SH5との組合せ;CSk-SH1とSk-SH4との組合せ;CSk-SH1とCSk-SH5とSkSH4との組合せ;CSk-SH1の3反復又は4反復;CSk-SH5の3反復又は4反復;Sk-SH4の3反復又は4反復)により、筋特異的調節エレメントを更に検証した。これら構築物を、実施例2に記載のプロトコルに従って、Desプロモーターの上流に組み込む。AAVベクターの作製及び精製並びに動物研究は実施例2に記載のとおりに行う。
同定した筋特異的調節エレメントの機能的フラグメントを有する更なる組合せを、実施例7で創出したとおりに作製する。
実験手順
4週齢マウスの眼窩周囲静脈に、Sk-SH4及びCSk-SH5調節エレメントを含有するAVVベクター、すなわち、AAV9sc-Sk-SH4-Des-Luc及びAAV9sc-CSk-SH5-Des-Lucを5×109vg/マウスの用量で静脈内注射した。
マウスから採取した心臓及び筋組織を、1%ホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に浸漬し、小片に切り出し、室温で15分間インキュベートした。0.125Mグリシン(最終濃度)の添加により固定を停止した。次いで、組織片をTissue-Tearerで処理して、最後に遠心沈降させ、PBSで2回洗浄した。溶解緩衝液を添加し、続いてDounceホモジナイザーで破壊してクロマチンを単離した。溶解物を超音波処理し、DNAを平均長300〜500bpに剪断した。1つのクロマチンアリコートをRNアーゼ、プロテイナーゼKで処理し、脱架橋のために加熱し、続いてエタノール沈降に供することにより、ゲノムDNA(インプット)を作製した。ペレットを再懸濁し、得られるDNAをNanoDrop分光計で定量した。元のクロマチン体積に外挿して総クロマチン収量を定量した。1つのクロマチンアリコート(30μg)をプロテインAアガロースビーズ(Invitrogen, catalogue number 15918-014)で前処理した。MEF2(Santa Cruz,sc-313)、SRF(Santa Cruz,sc-335)及びCEBP(Santa Cruz,sc-150)に対する抗体4μgを用いて興味対象のゲノムDNA領域を単離した。複合体を洗浄し、SDS緩衝液でビーズから溶出させ、RNアーゼ及びプロテイナーゼK処理に付した。65℃にて一晩のインキュベーションにより架橋を還元させ、フェノール-クロロホルム抽出及びエタノール沈降によりChIP DNAを精製した。SYBR Green Supermix(Bio-Rad)を用いる定量的PCR(QPCR)反応を、特定のゲノム領域について3つ組で行った。得られたシグナルは、各プライマー対についてインプットDNAを用いるQPCRを行うことにより、プライマー効率について規格化した。Sk-SH4用のプライマー配列は5'-GTCCCTCACTCCCAACTCAG-3'(配列番号33;フォワード)及び5'-GAGGAGAAGGAGATCAGACACTG-3'(配列番号34;リバース)であり;CSk-SH5用のプライマー配列は:5'-TAGCTGGGCCTTTCCTTCTC-3'(配列番号35;フォワード)及び5'-CGTCTCCCTAGCAGCAACAG-3'(配列番号36;リバース)であった。ネガティブコントロールプライマーは、Active Motif(Carlsbad, CA, USA)(#71012)から購入した。これは第17染色体上の非転写遺伝子配列に特異的である。
筋特異的調節エレメントSk-SH4は、E2A、SRF、p53、CEBP、LRF、MyoD及びSREBPを含む幾つかの推定の転写因子結合部位(TFBS)を含有する。クロマチン免疫沈降(CHIP)アッセイを用いて、CEBP及びSRFのSk-SH4エレメントへの結合を、AAV9sc-Sk-SH4-Des-Lucベクターを注射したマウスの心臓及び骨格筋で確証した(図15A、15B)。同様に、CEBP及びMEF2エレメントのCSk-SH5調節エレメントにの結合が、AAV9sc-CSk-SH5-Des-Lucを注射したマウスの心臓及び骨格筋で示された(図15C、15D)。
発現に対する筋特異的調節エレメントSk-SH4の効果、及び遺伝子治療による筋疾患(例えばデュシェーヌ筋ジストロフィー(DMD))の処置について治療上の可能性を有する2つの治療用遺伝子(具体的にはマイクロジストロフィン及びフォリスタチン)の治療効力を評価した。MDX-SCIDマウスは、患者におけるデュシェーヌ筋ジストロフィーの疾患徴候を再現し、したがってAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1及びAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucベクターの治療効力の評価に十分に適する。
実験手順
AAVへのフォリスタチン及びMD1遺伝子のクローニング
マイクロジストロフィン1(MD1)(Kooら,2011)及びフォリスタチン(FST)(Kotaら,2009)遺伝子をクローニングし、筋特異的調節エレメントSk-SH4に作動可能に連結したデスミンプロモーターから駆動させた。MD1遺伝子の5'末端及び3'末端の側方にはそれぞれMluI及びXhoI制限部位を配置し、FST遺伝子の5'末端及び3'末端の側方にはそれぞれMluI及びSalI制限部位を配置し、従来のオリゴヌクレオチド合成により合成した。デスミンプロモーターに作動可能に連結したSk-SH4調節エレメントを、一本鎖アデノ関連ウイルスベクター(AAVss)骨格において、MVMイントロンの上流にクローニングした。こられベクターは、49bpの合成proudfootポリアデニル化部位(Levitt Nら,1989)も含有していた。フォリスタチン遺伝子は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に2Aポリペプチドを介して連結した。創出した構築物をそれぞれpAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1及びpAAVss-Sk-CRM4-Des-MVM-FST-2A-Lucと呼び、概略的に図16に示す。
AAVベクターの作製及び精製は実施例2に記載のとおりに行った。
4週齢MDX-SCIDマウス(自家飼育)に用量2×1010vg/マウスのAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1及びAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucベクターを、個別に又は組み合わせて、総容量100μlで静脈内注射した。注射8週間後、処置MDX-SCIDマウス及びコントロールMDX-SCIDマウス(PBSを注射)をトレッドミル試験に供した。トレッドミル試験は、Exer-3/6オープントレッドミル(Columbus instruments, USA)を用いて実施した。試験前に、ベルトの傾斜を10°の上り坂に設定した。初期速度を10m/分に設定した後、速度を毎分1mずつ増加させた。マウスがパルスグリル上で5秒間以上休んだときに試験を終了した。その時点で、マウスが走った距離を記録し、試験中にマウスが走った総距離を、次式:距離=((N+n)/2)×(N−n+1)(式中、Nは試験終了時の時間(分)であり、nは試験開始時の時間(分)である)を用いて算出した。
mRNA分析
mRNA分析を実施例2に記載のとおりに行った。マイクロジストロフィン及びフォリスタチン遺伝子のmRNAを定量するため、マイクロジストロフィンについては、プライマー5'-GTGCCCTACTACATCAA-3'(配列番号42)をフォワードプライマーとし、5'-AGGTTGTGCTGGTCCA-3'(配列番号43)をリバースプライマーとして用い(アンプリコン206bp)、フォリスタチン遺伝子については、Luc2特異的フォワードプライマー5'-CCCACCGTCGTATTCGTGAG-3'(配列番号14)及びリバースプライマー5'-TCAGGGCGATGGTTTTGTCCC-3'(配列番号15)(アンプリコン217bp)を用いるqPCRベースの方法を使用した。
トレッドミル試験結果は、MD1若しくはFST単独又はそれらの組合せでの遺伝子治療により処置されたマウスが未処置コントロールMDX-SCIDマウスを凌ぐ成績を示すことを明確に証明した(図17)。AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1又はAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucベクターを注射したMDX-SCIDマウスは、コントロールマウスが走った距離の2倍の距離を走った。両ベクターをMDX-SCIDマウスに同時注射したとき、走った距離は4kmであった。これは、PBSを注射したコントロールMDX-SCIDマウスが走った距離の4倍を越える。これら結果は、これらベクターにより治療効力が達成できることを明確に証明している。
AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1若しくはAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucベクター又はそれらの組合せを用いる遺伝子治療の顕著な生理学的効果は、組織学的検査により確証された。ヘマトキシリン/エオシン染色した筋切片を、異なる実験群について、中心に核を有する細胞の割合(%)を求めた(図18)。C57B6野生型マウスの筋切片は、筋線維において核が周縁部に優勢に位置することを示し(データを示さず)、極少ない割合(<2%)の核が中心に位置していた(図18B)。未処置コントロールMDX/SCIDマウスでは、筋線維の横断切片において、核は中心に優勢に位置していた(約50%の核)(図18Aa、図18B)。AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1(AAV9-MD1)(図18Ac、図18B)又はAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Luc(AAV9-FST)(図18Ab、図18B)を注射したMDX/SCIDマウスは全て、中心に核を有する筋線維の数が減少した。両AAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1及びAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Lucベクターの同時投与は、核位置の筋線維周縁部への更に顕著なシフト及び核が中心に位置する割合の更なる低下をもたらした(図18Ad、図18B)。これら結果は、遺伝子治療後の再生刺激の減少及び表現型修正を示唆している。結果として、筋線維における核位置の中心からより周縁部へのシフトは、トレッドミルアッセイにおける移動性及び筋強度の改善で示される表現型修正と一致する。
定量的RT-PCRを用いて、pAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-MD1構築物、pAAVss-Sk-SH4-Des-MVM-FST-2A-Luc構築物又は両構築物の組合せを注射したマウスの心臓及び筋組織(特に腓腹筋及び四頭筋)からの生検において、マイクロジストロフィン(MD1)及びフォリスタチン(FST)遺伝子の発現を評価した(図19)。
実験手順
AAVベクターの作製及び精製は、実施例2に記載のとおりに行った。
AAVsc-Des-MVM-Lucベクターは、デスミンプロモーターから駆動されるルシフェラーゼ(Luc)導入遺伝子を含有する自己相補性AAVベクターである。このscAAVベクター骨格は、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン及びシミアンウイルス40(SV40)ポリアデニル化部位(pA)も含有していた。
AAVsc-SPc5-12-MVM-LucベクターはAAVsc-Des-MVM-Lucベクターと同じ配置であったが、デスミンプロモーターがSPc5-12プロモーターで置換されていた。
筋特異的調節エレメントSk-SH4を含むAAVベクターを、実施例2に記載のプロトコルに従って創出した。簡潔には、筋特異的調節エレメントSk-SH4を従来のオリゴヌクレオチド合成により合成し、AAVsc-Des-MVM-Luc又はAAVsc-SPc5-12-MVM-LucのAAVベクター骨格においてそれぞれデスミン又はSPc5-12プロモーターの上流にクローニングした。
AAVsc-CMV-Lucベクターは、デスミンプロモーターの代わりに、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(配列番号30)を、(ポリアデニル化部位(pA)も含有する)AAVsc-Des-LucのAAVベクター骨格においてルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングすることにより創出した。
これら異なるベクターの概略図を図20に示す。
成体CB17/IcrTac/Prkdcscidマウスにこれら異なるベクターを1×1010vg/マウスの用量で静脈内注射した(n=3)。
mRNA分析を実施例3に記載のとおりに行った。
ルシフェラーゼmRNAレベルを、筋特異的調節エレメントSk-SH4に作動可能に連結したデスミンプロモーターからルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクターを注射したマウスと、筋特異的調節エレメントに作動可能に連結していないサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター又はSPc5-12プロモーターからルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクターを注射したマウスとで比較した。CMV及びSPc5-12プロモーターは、心臓及び骨格筋での強力な遺伝子発現を可能にすることが知られている最も強力なプロモーターと考えられている。図21は、デスミンプロモーターに作動可能に連結した本発明のSk-SH4筋特異的調節エレメントを含むベクターが、CMV又はSPc5-12プロモーターを含むが筋特異的調節エレメントを有さないベクターより遥かに良好な発現を可能にすることを示している。
同様に、Sk-SH4筋特異的調節エレメントをSPc5-12プロモーターに作動可能に連結すると、ルシフェラーゼmRNAレベルの増加が心臓及び試験した全ての骨格筋タイプで観察された(図21)。しかし、この構築物から誘導されたmRNAレベルは、本発明のSk-SH4筋特異的調節エレメントをデスミンプロモーターに作動可能に連結したときより低かった。
Claims (15)
- 配列番号5の配列を含んでなる筋特異的遺伝子発現を増強するための核酸調節エレメント。
- 心筋及び骨格筋特異的遺伝子発現を増強する請求項1に記載の核酸調節エレメント。
- 600ヌクレオチドの最大長を有する請求項1又は2に記載の核酸調節エレメント。
- 核酸発現カセット又はベクターにおける、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸調節エレメントの使用。
- プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結した請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸調節エレメントを少なくとも1つ含んでなる核酸発現カセット。
- プロモーターが筋特異的プロモーターである、請求項5に記載の核酸発現カセット。
- プロモーターがデスミン(DES)遺伝子のプロモーターである、請求項5又は6に記載の核酸発現カセット。
- 導入遺伝子が治療用タンパク質、免疫原性タンパク質又は構造タンパク質をコードする、請求項5〜7のいずれか1項に記載の核酸発現カセット。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸調節エレメント又は請求項5〜8のいずれか1項に記載の核酸発現カセットを含んでなるベクター。
- ウイルスベクターである請求項9に記載のベクター。
- アデノ関連ウイルスベクターである請求項10に記載のベクター。
- 請求項5〜8のいずれか1項に記載の核酸発現カセット又は請求項9〜11のいずれか1項に記載のベクターと医薬的に許容され得るキャリアとを含んでなる医薬組成物。
- 遺伝子治療に使用するための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸調節エレメント、請求項5〜8のいずれか1項に記載の核酸発現カセット、請求項9〜10のいずれか1項に記載のベクター又は請求項12に記載の医薬組成物。
- ワクチン接種療法に使用するための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸調節エレメント、請求項5〜8のいずれか1項に記載の核酸発現カセット、請求項9〜11のいずれか1項に記載のベクター又は請求項12に記載の医薬組成物。
- 請求項5〜8のいずれか1項に記載の核酸発現カセット又は請求項9〜11のいずれか1項に記載のベクターを筋細胞に導入し;
筋細胞において導入遺伝子産物を発現させる
ことを含んでなる、筋細胞において導入遺伝子産物を発現させるインビトロ法又はエキソビボ法。
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