CN117209605A - 特异性结合il-15的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体技术领域，具体涉及特异性结合IL‑15的抗体及其应用。本发明提供能够特异性结合IL‑15的抗体，该抗体对IL‑15具有高亲和力，且对其它细胞因子无交叉反应，能够实现IL‑15的高特异性和高灵敏度检测。本发明还提供IL‑15的检测试剂，该检测试剂能够实现不同基质样品中IL‑15的定量检测，具有较高的灵敏度、特异性、准确度和精密度，且不受基质的干扰，操作简单、快速，可用于细胞制品等产品中IL‑15的检测，有利于加速细胞基因治疗的应用。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及特异性结合IL-15的抗体及其应用。
背景技术
白细胞介素-15（IL-15）是一种广泛表达的促炎细胞因子，属于4-螺旋束细胞因子家族，它主要由骨髓细胞表达，在其他细胞类型中也有表达。IL-15在结构和功能方面与IL-2相关。作为一种可溶性细胞因子，IL-15具有多种功能，包括刺激活化的T细胞增殖、控制T细胞反应、调节组织修复和B细胞归巢、产生细胞毒性效应T细胞以及激活和维持NK细胞、调节炎症等，在NK细胞、T细胞和B细胞的复制和分化中均具有重要作用。由于IL-15的广泛表达以及严格调控的分泌、反式呈递和治疗潜力，其在细胞因子中的作用是独一无二的。近年来，IL-15因具有诱导和维持T细胞反应的治疗潜力而被广泛研究。此外，IL-15还可以通过抗体或突变IL-15疗法靶向以减少炎症，其多方面的生物学应用在免疫治疗中至关重要。
CAR-T又称嵌合抗原受体T细胞疗法，它是将人的T细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，回输患者体内，通过CAR与靶细胞表面抗原的特异性结合，T细胞能够精准识别并杀死靶细胞，达到治疗肿瘤的目的。CAR-T细胞疗法在血液瘤治疗领域的优异效果令其成为近年全球发展最为迅速的细胞疗法之一。
基于IL-15的功能，在细胞治疗领域中的细胞培养过程中，通常会添加IL-15促进细胞的增殖。这使得，对于IL-15的残留检测成为细胞制品质量控制中关键环节。目前IL-15的定量检测试剂普遍存在批间差异较大、检测方法不稳定且受不同基质干扰的问题。
因此，开发特异性结合IL-15的抗体、试剂盒和检测方法对于保证细胞制品的质量以及确保在T细胞、自然杀伤细胞（NK）细胞、B细胞和嵌合抗原受体（CAR-T）细胞的增殖和分化中实现工作流程可预测的性能具有重要意义。
发明内容
本发明提供特异性结合IL-15的抗体及其应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供IL-15的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段为以下（1）-（2）中的任意一种：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段为以下（1）-（2）中的任意一种：
（1）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；
（2）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体或多特异抗体。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为12B11E5的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
在本发明的一些实施方式中提供克隆号为9B5G1的抗体，其重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
本发明提供的上述IL-15的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL-15，与其它白细胞介素等细胞因子无交叉反应，且对IL-15具有较高的亲和力。
本发明提供编码以上所述的IL-15的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
本发明还提供含有所述核酸分子的生物材料；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒可通过在所述核酸分子的上游连接启动子等转录或翻译调控元件和/或在其下游连接终止子等转录或翻译调控元件得到。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。
上述宿主细胞包括微生物细胞、昆虫细胞或其它动物细胞。
本发明提供一种抗体偶联物，其为将所述IL-15的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
本发明提供IL-15的抗体组合物，所述抗体组合物包含以下（1）-（2）中的抗体：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
以上（1）-（2）中的抗体结合不同的抗原空间表位。
上述抗体组合物可用于作为双抗体夹心ELISA（酶联免疫吸附试验）法检测IL-15的配对抗体，抗体组合物中的两个抗体分别作为双抗体夹心ELISA法中的捕获抗体和检测抗体。其中，检测抗体还可携带可检测的标记。
本发明提供一种检测试剂盒，其包含以上所述的IL-15的抗体或其抗原结合片段，或包含所述抗体偶联物，或包含所述IL-15的抗体组合物。
上述试剂盒可作为IL-15的检测试剂盒。
在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂盒为双抗体夹心ELISA检测试剂盒。
基于本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体偶联物或抗体组合物，通过双抗体夹心ELISA法可特异性检测培养基、血清、血浆、细胞制品等样品中IL-15的含量，具有较高的灵敏度和特异性。
上述试剂盒中，所述抗体或其抗原结合片段还可包括可检测的标记；所述试剂盒还可包括携带可检测的标记的第二抗体以检测所述抗体或其抗原结合片段。
为便于检测，所述试剂盒还可包含用于ELISA检测的其他试剂，这些试剂包括但不限于IL-15标准品、PBST洗液、封闭液、显色液、终止液等。
基于本发明的抗体或其抗原结合片段的功能，本发明提供所述IL-15的抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述检测试剂盒的如下任一种应用：
（1）在非疾病诊断目的的检测IL-15在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在制备用于检测IL-15在样品中的存在或其水平的产品中的应用；
（3）在细胞制品中IL-15的残留检测中的应用；
（4）在细胞制品生产中的应用；
（5）在细胞制品质量控制中的应用；
（6）在制备靶向IL-15的药物中的应用。
上述（1）中，所述应用包括利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述检测试剂盒检测IL-15在样品中的存在或其水平。在非疾病诊断目的的检测中，所述样品可为体外培养得到的细胞培养液、细胞制品等并非来源于人或动物的样品。
利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述检测试剂盒检测IL-15的方法可以使用酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
在本发明的一些实施方式中，利用所述抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、抗体组合物或检测试剂盒以双抗体夹心ELISA法检测IL-15。
上述（2）中，所述产品可为非诊断目的的检测试剂或试剂盒或为诊断目的的检测试剂或试剂盒。
上述（3）中，细胞制品中IL-15的残留检测为利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述检测试剂盒检测IL-15在细胞制品中的存在或其水平。
上述（5）中，通过检测细胞制品中IL-15的含量，对细胞制品进行质量控制。
上述（6）中，所述靶向IL-15的药物为通过结合IL-15发挥疾病治疗目的的药物。
本发明提供一种非疾病诊断目的的检测IL-15的方法，所述方法包括：利用所述IL-15的抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述IL-15的抗体组合物或所述检测试剂盒对待测样品中的IL-15进行检测。
上述检测可采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
本发明中，所述IL-15为人IL-15。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供能够特异性结合IL-15的抗体，该抗体对IL-15具有高亲和力，且对其它白细胞介素等细胞因子无交叉反应，能够实现IL-15的高特异性和高灵敏度检测，是理想的IL-15蛋白含量的检测抗体。
本发明基于提供的抗体开发了IL-15的检测试剂，该检测试剂能够实现不同基质样品中IL-15的定量检测，具有较高的灵敏度、特异性、准确度和精密度，且不受基质的干扰，操作简单、快速，可用于生产T细胞、NK细胞以及CAR-T细胞工艺中IL-15的残留检测，有利于加速细胞基因治疗（CGT）的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3中SDS-PAGE检测结果，其中，左侧图为克隆号为12B11E5的抗体，右侧图为克隆号为9B5G1的抗体，M为蛋白分子量，R为抗体样品。
图2为本发明实施例3中克隆号为12B11E5的抗体的ELISA结合实验结果。
图3为本发明实施例3中克隆号为9B5G1的抗体的ELISA结合实验结果。
图4为本发明实施例3中克隆号为12B11E5的抗体的BLI分析结果。
图5为本发明实施例3中克隆号为9B5G1的抗体的BLI分析结果。
图6为本发明实施例3中双抗体夹心ELISA法检测IL-15的含量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明利用人IL-15蛋白作为免疫原进行小鼠免疫，经细胞融合与筛选、细胞亚克隆，获得表达小鼠抗体的杂交瘤细胞株。通过实验验证发现，该抗体能够特异性识别人IL-15蛋白，与其他细胞因子没有交叉反应，而且不受基质的干扰。进一步地，本发明通过杂交瘤测序获得了该抗体的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。
实施例1 人IL-15特异性抗体的制备
1、小鼠免疫：用人IL-15蛋白（购自Acrobiosystems）作为免疫原免疫小鼠。免疫结束后，用ELISA方法检测免疫动物血清，以此确定免疫应答的水平。常规免疫结束后，若免疫动物能够达到针对免疫原的免疫应答水平，进行细胞融合。
2、筛选：用ELISA方法筛选融合细胞的上清液，挑选出对人IL-15蛋白特异性结合呈阳性且与IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-21、GM-CSF、TNF-alpha等蛋白等均无结合的细胞。
3、克隆扩大培养：将阳性母克隆细胞转到24孔板扩大培养。每个扩大培养的克隆收集上清，用ELISA方法进行检测。
4、亚克隆：采用有限稀释法对阳性母克隆进行亚克隆，用ELISA方法进行亚克隆筛选。
5、杂交瘤细胞抗体基因测序：提取杂交瘤细胞总RNA，通过RT-PCR反应将RNA反转录成cDNA。克隆抗体轻链和重链序列，将抗体轻链和重链序列构建到T载体上，之后进行DNA测序分析获得抗体基因序列。
6、抗体生产与纯化：将步骤5获得的抗体基因序列转染到CHO细胞中，并进行扩大培养，采用蛋白质A/G亲和层析方法纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液（PBS）中。
实施例2 人IL-15抗体的特异性分析
按照上述实施例1的方法经细胞融合和筛选获得10株杂交瘤细胞的细胞培养上清，采用酶联免疫吸附试验对上述人IL-15抗体进行特异性分析，方法如下：
1、用PBS将IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、GM-CSF、TNF-alpha蛋白稀释至1μg/mL，加入酶标板孔中，每孔100 μL。用封板膜封板，放置4℃过夜。
2、弃去孔中液体，拍干酶标板，用PBST洗液洗板，300 μL/孔浸泡，拍干酶标板，进行下一次清洗，共洗板3次。
3、每孔加入100 μL封闭剂（含有5%BSA的PBST洗液），用封板膜封板，放置37℃孵育，后清洗。
4、将上述人IL-15抗体的细胞培养上清加入酶标板中，每孔100 μL。用封板膜封板，放置37℃孵育，后清洗。
5、用样品稀释液将HRP-Anti-Mouse IgG稀释至0.05 μg/mL，每孔加入100 μL，用封板膜封板，放置37℃孵育，后清洗。
6、每孔加入100 μL显色液，用封板膜封板，放置37℃避光孵育。
7、每孔加入50 μL终止液，轻轻震荡酶标板至显色均匀。
8、用酶标仪读取450 nm和630nm的吸光度值，用OD450扣减OD630值得到吸光度值（OD值），检测结果如表1所示。
9、选择与人IL-15蛋白强结合，与IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-21、GM-CSF、TNF-alpha蛋白弱结合或不结合的克隆进行亚克隆。选择的克隆有：12B11E5、8D10G1、2E9H3、1B9G11、12E7D7、9C12B3、6G9E1、3G2G9、8G2A4和9B5G1，其中12B11E5和9B5G1显示了高特异性，与人IL-15蛋白强结合，且与其他细胞因子没有交叉反应。
表1 不同抗体的ELISA检测OD值
实施例3 人IL-15特异性抗体的鉴定和功能分析
本实施例中，采用本领域已知的方法对实施例2中筛选得到的人IL-15特异性抗体（克隆号：12B11E5、9B5G1）进行鉴定和功能分析，具体如下：
1、SDS-PAGE鉴定结果（图1）显示，克隆号12B11E5、9B5G1的抗体进行还原电泳两条带分子量大小分别为50kDa和25kDa左右，纯度大于99%。
2、ELISA结合实验结果（图2和图3）表明，12B11E5和9B5G1克隆号的抗体能够特异地识别IL-15抗原，但与IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-21、GM-CSF、TNF-alpha蛋白无结合。12B11E5和9B5G11克隆号的抗体与IL-15蛋白的EC50分别为1.620ng/mL和6.419ng/mL。
3、BLI分析数据（图4和图5）显示，拟合线代表IL-15抗原在1000nM浓度下与12B11E5和9B5G1克隆号的抗体之间亲和及解离随时间的变化规律，结果表明，12B11E5和9B5G1克隆号的抗体结合IL-15抗原的亲和力高达0.35nM和1.91nM。
4、人IL-15定量检测实验结果（表2和图6）表明，利用克隆号12B11E5、9B5G1的抗体可以采用双抗体夹心ELISA法对人IL-15进行定量检测，从而获得基质中蛋白的含量，且具有较好的线性相关性，检测的灵敏度小于2pg/mL。
表2 双抗体夹心ELISA法对人IL-15进行定量检测
5、人IL-15定量检测实验结果（表3）表明，利用克隆号12B11E5、9B5G1的抗体进行人IL-15的定量检测，不受基质的干扰。
表3 双抗体夹心ELISA法检测IL-15在不同基质中的回收率
6、人IL-15定量检测实验结果（表4）表明，利用克隆号12B11E5、9B5G1的抗体进行人IL-15的定量检测，具有较好的精密度。
表4 双抗体夹心ELISA法检测IL-15的精密度
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.IL-15的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为以下（1）-（2）中的任意一种：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
2.根据权利要求1所述的IL-15的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为以下（1）-（2）中的任意一种：
（1）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：14所示；
（2）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：16所示。
3.根据权利要求1或2所述的IL-15的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体或多特异抗体。
4.核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1~3任一项所述的IL-15的抗体或其抗原结合片段。
5.生物材料，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.一种抗体偶联物，其特征在于，其为将权利要求1~3任一项所述的IL-15的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
7.IL-15的抗体组合物，其特征在于，所述抗体组合物包含以下（1）-（2）中的抗体：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1~3任一项所述的IL-15的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求6所述的抗体偶联物，或包含权利要求7所述的IL-15的抗体组合物。
9.权利要求1~3任一项所述的IL-15的抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述的IL-15的抗体组合物或权利要求8所述的检测试剂盒的如下任一种应用：
（1）在非疾病诊断目的的检测IL-15在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在制备用于检测IL-15在样品中的存在或其水平的产品中的应用；
（3）在细胞制品中IL-15的残留检测中的应用；
（4）在细胞制品生产中的应用；
（5）在细胞制品质量控制中的应用；
（6）在制备靶向IL-15的药物中的应用。
10.一种非疾病诊断目的的检测IL-15的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1~3任一项所述的IL-15的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述的IL-15的抗体组合物或权利要求8所述的检测试剂盒对待测样品中的IL-15进行检测。
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