CN101831435A - 小鼠il-15亚型蛋白的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小鼠单抗蛋白的制备，特别涉及一种小鼠IL-15亚型蛋白的制备及其应用；制备在免疫体系处于激发态下制备小鼠IL-15亚型蛋白，通过体外实验检测其对正常小鼠IL-15蛋白的拮抗作用，提供该亚型蛋白在自身免疫性疾病等临床治疗中的应用；本研究证明，未经LPS刺激的脾细胞检测不到该种亚型，而在LPS刺激后的原代培养或细胞株来源的巨噬细胞及B细胞中均可检测到该亚型，提示该亚型有可能在免疫系统激活的条件下发挥着重要的负反馈调控功能；本发明首次在免疫系统激活状态下发现了该亚型蛋白，并做了其功能的相关研究，从而为其在机体免疫调控中发挥的作用提供了更为直接的证据。

Description

小鼠IL-15亚型蛋白的制备及其应用

技术领域

本发明涉及一种小鼠单抗蛋白的制备，特别涉及一种小鼠IL-15亚型蛋白的制备及其应用。

背景技术

IL-15mRNA(interleukin 15，IL-15)广泛表达于各种组织中，包括胎盘、骨骼肌、肾脏、心脏、肺、脑、肠上皮，并同样表达于髓系的造血干细胞中比如巨噬细胞、树突状细胞。IL-15在结构上与白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)有同源性，IL-15受体由具有高亲和力的IL-15受体a链、IL-2/15受体β链以及公共链γ链组成，因此IL-15具有一些和IL-2相近的功能，比如刺激T细胞活化和增殖，增强NK细胞杀伤活性并促进B细胞产生免疫球蛋白。最近研究发现IL-15在NK细胞、NKT细胞以及肠上皮细胞的分化、增殖、活化过程中发挥了重要作用，IL-15与IL-17对CD8记忆性T细胞的稳态调节非常重要。研究还证明IL-15通过一种特殊的“反递呈”机制来调控CD8记忆性T细胞的增殖和NK细胞的生存周期，即一种表达IL-15a链受体的细胞能够将IL-15递呈给表达IL-15β链和γ链的细胞。更多的研究表明IL-15是一种有广泛生物学功能的功能强大的细胞因子，除了对免疫系统有着重要的调节作用，在非免疫系统中也同样重要，比如对骨骼肌合成代谢也发挥重要调节作用。

由于IL-15具有强大的免疫调节功能，并对多种器官具有潜在的调节作用，因此其在体内的表达在多个水平受到严格控制。人和小鼠的IL-15基因5′调控区均包含干扰素反应因子元件(IRF-E)及NF-κB结合位点用于上调IL-15mRNA的表达。IL-15基因的调控主要发生在转录后水平，IL-15mRNA的5′UTR区域存在的多个起始密码子(小鼠为5个AUGs，人类为12个AUGs)阻碍了IL-15蛋白的有效翻译，IL-15mRNA的3′UTR区域的调控序列同样能阻止IL-15蛋白的分泌。选择性剪切也同样参与了对IL-15基因表达的调控。

早期研究发现的三种IL-15亚型编码相同的成熟蛋白，但是其信号肽之间存在区别：由48aa组成的长信号肽(LSP)从3号外显子中编码区内的真正的起始密码子开始表达，而短信号肽(SSP，小鼠为26aa，人类为21aa)则由一个新产生的5号外显子中的起始密码子开始表达终止于非成熟的终止密码子。这些不同的信号肽将IL-15蛋白运输至胞外不同的位置。短信号肽IL-15亚型，蛋白翻译效率很高，但是很难分泌；而长信号肽IL-15亚型，蛋白翻译效率较低，但是能直接被运输至高尔基体并分泌。由于IL-15主要通过IL-15Ra的反式递呈发挥功能，共调节IL-15及IL-15R有可能会促使IL-15产生多种功能活性。近期于小鼠小肠上皮细胞发现的两种新的IL-15亚型，与正常的IL-15mRNA相比，分别缺少6号外显子及7号外显子的一部分，直接导致其编码的成熟蛋白与正常IL-15蛋白有区别，研究证明其信号肽均为LSP。这两种编码成熟蛋白改变的IL-15亚型提示IL15/IL-15-R体系比目前所已知的可能更为复杂。

关于小鼠IL-15亚型蛋白的制备及应用，经查新国外仅有美国康涅狄格州健康中心X Tan和L Lefranc，ois在小肠上皮细胞中发现并命名该亚型为ΔE6IL-15。小鼠小肠上皮细胞中该亚型是在免疫体系处于常态下发现的，而未见在免疫体系处于激发态下制备IL-15亚型蛋白的报道。本发明首次于小鼠脾细胞处于免疫激活状态下发现该种亚型，提示该种亚型蛋白可能在免疫体系的负反馈调节中发挥重要的作用。

发明内容

发明目的

本发明目的为制备在免疫体系处于激发态下制备IL-15亚型蛋白，通过体外实验检测其对正常IL-15蛋白的拮抗作用，提供该亚型蛋白在自身免疫性疾病等临床治疗中的应用。

技术方案

为达到上述目的，本发明具体技术方案是，制备有功能活性的小鼠IL-15亚型蛋白，其制备方法包括以下步骤：

(1)扩增IL-15亚型基因片段：取C57BL/6小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，使用0.1μg/ml-100μg/m LPS作用24h-48h刺激小鼠脾细胞，获得刺激后的C57BL/6小鼠脾细胞悬液，通过Trizol-氯仿法抽提总RNA。根据NCBI所公布小鼠IL-15cDNA序列(NM008357.1)及pET43.1原核表达载体的结构设计特异性引物，见Seq NO.1和SeqNO.2，经逆转录-PCR常规操作扩增获得小鼠IL-15目的片段。

(2)获取IL-15亚型基因克隆：取步骤1所得PCR产物，按照凝胶回收试剂盒说明回收IL-15基因亚型片段。将回收所得PCR产物与PGEM-T克隆载体连接、4℃连接过夜。取连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒。取该质粒进一步测序鉴定其基因序列见Seq NO.3。

(3)构建重组IL-15的pET43.1原核表达载体：取测序鉴定正确的步骤2所得质粒及原核表达载体pET43.1，分别进行双酶切并按照凝胶回收试剂盒说明书回收酶切所得片段。将回收所得酶切片段连接过夜，取连接产物转化感受态DH10B菌，挑菌，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒酶切鉴定。

(4)pET43.1-IL-15转化菌的表达：取鉴定正确的步骤3中重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3)，挑取单菌落，抽提质粒，酶切鉴定，筛选正确转化的表达菌pET43.1-IL-15/BL21。本发明采用转化菌自发表达方案进行融合蛋白的表达。这种实验方案，只需转化菌生长密度培养至饱和，操作方便，且其表达量可达IPTG诱导的几倍，Western-blot鉴定所得融合蛋白。

(5)纯化并获得无标签的IL-15亚型蛋白：非变性裂解液裂解步骤4所得融合蛋白，并进行超声裂解。取所得蛋白样品经蛋白纯化工作站进行纯化。应用超滤离心管去除纯化所得蛋白中的咪唑，肠激酶切融合蛋白中用于提高表达蛋白可溶性的大片段的Nus-标签蛋白。利用超滤离心截留管离心酶切处理后的蛋白样品，所得滤膜的下层液，即为酶切后的无标签蛋白的IL-15亚型蛋白，Western-blot鉴定所得该亚型蛋白，见Seq NO.4。

本发明还涉及该IL-15亚型蛋白的功能检测。其功能检测包括以下步骤：

(1)CTLL-2细胞增殖实验检测纯化所得IL-15亚型蛋白的功能：收集生长良好的CTLL-2细胞，制备成细胞悬液。取制备好的IL-15及其亚型的纯化蛋白，及rhIL-15蛋白标准品，进行梯度稀释，100μl/孔加入96孔板中，每反应孔也同样加入100μl的CTLL-2细胞，并设只加入100μl CTLL-2细胞和100μl1640培养基的孔作为对照。37℃、5％CO₂培养箱培养18h，于检测前6h加入³H(1μCi/孔)，收集细胞，β液闪计数器计数。

(2)IL-15亚型蛋白在免疫激活状态中的负调控功能：取C57BL/6小鼠脾脏，制备脾细胞悬液加至96孔板中，加入倍比稀释的LPS培养24h，另设两组在此基础上分别加入倍比稀释的纯化所得正常IL-15蛋白及IL-15亚型蛋白培养24h，各组稀释度均设3个复孔，37℃、5％CO₂培养箱培养18h，于检测前6h加入3H(1μCi/孔)，收集细胞，β液闪计数器计数。

一种小鼠IL-15亚型蛋白在制备自身免疫性疾病药物的应用。

所述的自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、多发性硬化、强直性脊柱炎、炎症性肠病、难治性乳糜泄、银屑病、丙型病毒性肝炎和逆转录病毒HTLV-1相关疾病、阿狄森病、儿童哮喘、纤维肌痛、慢性疲劳综合征、甲状腺炎、血管炎、克隆病、肠炎以及雷诺氏病的任一种或多种。

本研究同样取临床上进行初诊的类风湿性关节炎患者的外周血进行实验，经红细胞裂解处理后，取病人外周血直接进行培养，并加入LPS刺激培养72h，同时取正常人外周血同样经过或未经LPS刺激进行培养作为对照。取所培养的外周血细胞抽提总RNA并进行逆转录-PCR。结果显示，正常人外周血经LPS刺激72h后出现小片段的亚型条带，而患者的外周血则刺激不出小片段的亚型条带。该实验目前已收集6名患者外周血进行研究，均能得到很好的重复，从而证明在类风湿性关节炎患者中无法产生此种具有拮抗作用的IL-15亚型。

流感病毒所引发的急性肺炎会导致流感患者尤其是处于儿童阶段的流感患者极高的病死率。Risa Nakamura等发现IL-15敲基因小鼠在感染流感病毒后其急性肺炎发病率显著降低，而机体抵抗流感病毒的能力却未受影响，这就预示着阻断流感患者体内IL-15的功能能够在不影响患者对流感病毒的抵抗能力的情况下，显著降低流感所致的急性肺炎的发病率及病死率。本发明已证明所发现的缺少六号外显子的IL-15亚型蛋白对正常IL-15功能起到负调控作用，因此该种IL-15亚型蛋白在用于流感所致的急性肺炎治疗上具有非常广阔的应用前景。

有益效果

1、IL-15是一种促炎症细胞因子，可通过抑制IL-2诱导的AICD及促进CD8⁺记忆性T细胞生存而导致自身免疫性疾病。本发明于LPS刺激过的小鼠脾脏细胞发现缺失第6号外显子的IL-15亚型。本发明所述拮抗正常IL-15基因功能的IL-15亚型蛋白为制备预防或治疗IL-15基因高表达相关疾病的药物或制剂提供了新的、较好的选择。

本发明在小鼠脾脏细胞中发现的缺失6号外显子的IL-15亚型蛋白，与之前小鼠小肠上皮细胞发现的ΔE6IL-15亚型蛋白结构相同。不同之处在于，本研究中小鼠脾脏细胞经过LPS刺激培养即在免疫系统激活状态下发现了该种亚型，而小鼠小肠上皮细胞中该亚型是在免疫体系处于常态下发现的。本研究证明，未经LPS刺激的脾细胞检测不到该种亚型，而在LPS刺激后的原代培养或细胞株来源的巨噬细胞及B细胞中均可检测到该亚型，提示该亚型有可能在免疫系统激活的条件下发挥着重要的负反馈调控功能。

一般而言，由mRNA选择性剪切所形成的蛋白亚型被认为是产生蛋白功能多样性，组织特异性的一种进化方式。更为特殊的是IL-15基因属于四螺旋束蛋白家族，该家族中许多细胞因子均可通过选择性剪切产生相应亚型，其中IL-2和IL-4通过选择性剪切形成的亚型均对其自身功能发挥竞争性抑制作用。IL-2和IL-4均通过长的AB环与IL-2Ra结合，而其选择性剪切产生的亚型由于缺失2号外显子导致其编码的AB环主要部分缺失，从而形成了天然的IL-2、IL-4的拮抗蛋白，研究表明IL-2、IL-4基因亚型能抑制T细胞的增殖。本研究的体外实验数据也同样显示了缺失6号外显子的IL-15蛋白亚型对正常IL-15蛋白的功能活性具有负向调控作用，并能抑制LPS产生的刺激细胞增殖的功能。然而研究证明IL-15并不依靠AB环与IL-15Ra相结合，因此该种IL-15亚型蛋白的负调控功能并非由此种机制实现。本研究通过软件构建该亚型蛋白结构并进行分析发现，缺失了6号外显子的IL-15亚型蛋白可能由于其无法形成功能活性的二聚体，而直接以单体形式与IL-15R竞争结合，从而产生了对正常IL-15蛋白的负调控功能。

2、大量研究证明IL-15是一种促炎症细胞因子，Alleva等研究发现IL-15位于促炎症细胞因子链的顶部即始发者。IL-15表达引发促炎细胞因子TNFα、IL-1、IL-6、MIP1α、MIP1β和IL-8异常高水平表达。而且，IL-15可通过抑制IL-2诱导的AICD及促进CD8⁺记忆性T细胞生存而导致自身免疫性疾病。事实上多种自身免疫性炎症性疾病患者IL-15表达失调，诸如类风湿性关节炎、多发性硬化、炎症性肠病、难治性乳糜泄、银屑病、丙型病毒性肝炎和逆转录病毒HTLV-1相关疾病。

目前已经研制了多种抑制IL-15活性的药物，包括可溶性IL-15Rα、突变的IL-15和针对IL-15或IL-2/15Rβ的特异性抗体。一种C末端Q101D、Q108D IL-15突变体/Fcγ2a融合蛋白具有拮抗体外IL-15激发的细胞增殖作用，这种突变型IL-15可明显减轻小鼠发生抗原特异性迟发型超敏反应并延长胰岛细胞移植物生存时间。应用可溶性高亲合力IL-15Rα可预防小鼠发生胶原诱导的关节炎并抑制同种异基因移植物排斥。应用抗IL-15的抗体可有效治疗小鼠多种自身免疫性疾病。促炎细胞因子IL-15在类风湿性关节炎发病中起重要作用，而且，I/II期临床试验表明IL-15抗体HuMax-IL15治疗活动性类风湿性关节炎约63％患者有效。针对IL-2/15Rβ的人源抗体Mikβ1单药可延长猴同种异基因心脏移植物存活时间。利用Mikβ1单克隆抗体治疗12例T细胞大颗粒淋巴细胞白血病I期临床试验结果显示毒性作用很少，可封闭白血病细胞表面＞95％的IL-2/15Rβ受体。

然而，以上各种药物其机理都是人为的干预及阻断IL-15与其受体的结合及利用抗体阻断剂特异性降低体内IL-15及其受体的水平来减弱IL-15在体内的作用。这些方式有可能带来各种未知的风险：由于IL-15与IL-2共用一部分受体，而在干预IL-15与受体结合的过程中有可能也会影响IL-2与其相应受体结合，从而影响体内免疫系统的稳态；IL-15可激活T细胞和NK细胞并抑制AICD发生，促进CD8⁺记忆性T细胞增殖与生存因此在增强机体杀伤肿瘤的能力方面发挥着重要作用，IL-15抗体的使用则有可能会影响IL-15在体内的免疫调控作用；人为的加入机体内本不存在的组分，其毒副作用及应用安全性都仍需进一步的长期验证及观察。

本发明中发现的该种IL-15亚型蛋白在机体免疫系统激活后高水平表达，而在免疫系统正常状态下无法检测到该蛋白的表达。提示在此免疫激活状态下此亚型蛋白可能发挥了重要的调控功能，且体外实验结果提示此亚型蛋白对正常IL-15蛋白功能起负调控作用，因此，这种缺失六号外显子的IL-15亚型蛋白可能是正常IL-15蛋白天然的拮抗剂，能够通过与IL-15受体竞争性结合从而阻断自身免疫性疾病中IL-15介导的炎性反应。这种机体在免疫激活状态下天然存在的负向调控蛋白有望在自身免疫疾病的治疗中发挥更为有效且安全的作用。

关于小鼠IL-15亚型蛋白的制备及应用，经查新未见国内有相关报道，国外仅有美国康涅狄格州健康中心X Tan和L Lefranc，ois在小肠上皮细胞中发现并命名该亚型为ΔE6IL-15。本发明首次在免疫系统激活状态下发现了该亚型蛋白，并做了其功能的相关研究，从而为其在机体免疫调控中发挥的作用提供了更为直接的证据。

本发明所述的一种小鼠IL-15亚型蛋白可以治疗自身免疫疾病，特别是类风湿性关节炎、多发性硬化、强直性脊柱炎、炎症性肠病、难治性乳糜泄、银屑病、丙型病毒性肝炎和逆转录病毒HTLV-1相关疾病、阿狄森病、儿童哮喘、纤维肌痛、慢性疲劳综合征、甲状腺炎、血管炎、克隆病、肠炎以及雷诺氏病的任一种或多种。通过临床数据表明，本发明对如上疾病具有很好治疗作用。注所述的LPS购自Promega公司。

本申请按照《分子克隆手册》P96-99、P518、P611、P627-628页所述方法，以及Axygen、Fermentas、Takara公司的试剂手册进行试验。

3、流感病毒所引发的急性肺炎会导致流感患者尤其是处于儿童阶段的流感患者极高的病死率。Risa Nakamura等发现IL-15敲基因小鼠在感染流感病毒后其急性肺炎发病率显著降低，而机体抵抗流感病毒的能力却未受影响，这就预示着阻断流感患者体内IL-15的功能能够在不影响患者对流感病毒的抵抗能力的情况下，显著降低流感所致的急性肺炎的发病率及病死率。本发明已证明所发现的缺少六号外显子的IL-15亚型蛋白对正常IL-15功能起到负调控作用，因此该种IL-15亚型蛋白在用于流感所致的急性肺炎治疗上具有非常广阔的应用前景

附图说明

图1.实施例1中小鼠IL-15亚型基因的扩增及克隆；

其中A中的1、50bppladder；2、小鼠脾脏扩增IL-15；3、LPS刺激小鼠脾脏扩增IL-15；

B中的1、100bppladder；2、IL-15扩增产物克隆酶切；3、IL-15亚型克隆酶切；

图2.实施例1中重组小鼠IL-15亚型基因的表达载体的构建及鉴定；

其中1、Marker；2、重组小鼠IL-15亚型基因的pET43.1原核表达载体；

图3.实施例1中小鼠IL-15亚型蛋白的原核表达及可溶性鉴定；其中A中的1、空载pET43.1表达蛋白；2-3、IL-15亚型基因融合蛋白；4、蛋白质Marker；

B中的1、蛋白质Marker；2、IL-15亚型基因表达具体超声裂解上清；

图4.实施例一中小鼠IL-15亚型蛋白的纯化及肠激酶切结果；

其中A中的1、蛋白质Marker；2-3、各洗脱峰所对应蛋白样品；

B中的1、蛋白质Marker；2-3、肠激酶酶切后IL-15亚型融合蛋白；

图5.实施例1中小鼠IL-15亚型蛋白的Western blot鉴定结果；

图6.实施例1中小鼠IL-15亚型蛋白是细胞经LPS刺激后选择性剪切而产生；

其中1、未经任何处理的脾脏细胞IL-15的表达；2经LPS刺激24h后脾脏细胞IL-15的表达；3-经LPS刺激12h后加入放线菌酮继续培养12h脾脏细胞IL-15的表达。

图7.实施例7中小鼠IL-15亚型蛋白的结构模拟及功能预测；

图8.实施例7中小鼠IL-15亚型蛋白的负调控功能；

图9为实施例8初诊的类风湿性关节炎患者的外周血进行实验结果电泳图

其中1、4为DNA Marker

2、为未经LPS刺激培养的正常人外周血

3、为经LPS刺激培养的正常人外周血

5、为未经LPS刺激培养的患者外周血

6、为经LPS刺激培养的患者外周血

图10为实施例9小鼠IL-15及其亚型对不同用量的抗CD3CD28抗体激活的初诊类风湿病人外周血单个核淋巴细胞增殖活性的影响。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例1，制备纯化的有功能的无标签小鼠IL-15亚型蛋白

1.细胞总RNA的提取

取C57BL/6小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，使用0.1μg/ml LPS作用48h刺激小鼠脾细胞，获得刺激后的C57BL/6小鼠脾细胞悬液，加裂解液Trizol 1ml，反复吹打混匀，将细胞溶于Trizol中，室温孵育样本5min裂解细胞；加入0.2ml氯仿，剧烈混匀15s，室温孵育样本3-5min，4℃，12000g离心15min；离心后转移上层无色水相至EP管，加入0.5ml异丙醇，混匀，冰浴10min；4℃，12000g离心10min，小心移去上清液；加入1ml75％乙醇，颠倒混匀，4℃，7500g离心5min，洗两次；彻底弃上清，将RNA略干燥后溶解在20μl无RNase水中，-80℃保存。

2.RT-PCR扩增小鼠IL-15亚型基因编码区片段

以4μl步骤1提取的总RNA为模板，1μl Oligo dT为下游引物，加入双蒸水补足体系至12μl，离心混匀，70℃ 5min，放置冰上冷却；加5×逆转录buffer4μl，RNase Inhibitor 1μl，10mM dNTP 2μl离心混匀，37℃放置5min，加入MMLV1μl，42℃ 60min，70℃ 10min，4℃保存所得cDNA。根据NCBI所公布小鼠IL-15cDNA序列(NM008357.1)及pET43.1原核表达载体的结构设计上下游分别带有SacI和XhoI内切酶序列的引物序列(上海生工合成，见SeqNO.1和2或表1)。

表1小鼠IL-15引物序列

以反转录产物为模板，利用所设计引物，进行PCR扩增，反应体系为：10×Taqbuffer 5μl，MgCl2 4μl，10mM dNTP 1μl，10μM上下游引物各1μl，模板cDNA 5μl，Taq DNA聚合酶1μl，ddH2O补充至总体积50μl。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，扩增34个循环，72℃延伸10min。2％琼脂糖凝胶电泳鉴定所得PCR扩增产物(图1A)。

3.小鼠IL-15基因克隆及鉴定

取20μl步骤2所得PCR产物，按照凝胶回收试剂盒说明进行回收。取回收所得PCR产物与PGEM-T克隆载体按以下体系进行连接：PCR产物5μl，PGEM-T克隆载体1μl，T4连接酶1μl，10×连接缓冲液1μl，三蒸水2μl，4℃连接过夜。将此连接产物转化至DH10B的感受态细菌，通过蓝白斑筛选，取白色阳性菌落，摇菌过夜，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒。取所得质粒按照以下体系进行酶切鉴定：质粒5μl，10×buffer 2μl，SacI内切酶1μl，XhoI内切酶1μl，双蒸水11μl，30℃水浴2h。取初步酶切鉴定结果为阳性的相应质粒(图1B)至上海生工测序以得到准确的小鼠IL-15亚型基因克隆(见SeqNO.3)。

4.构建重组小鼠IL-15亚型基因的pET43.1原核表达载体

取测序鉴定正确的PGEM-T-IL-15质粒及原核表达载体pET43.1，进行SacI、XhoI内切酶双酶切，酶切体系如下：质粒5μl，10×buffer 2μl，SacI内切酶1μl，XhoI内切酶1μl，双蒸水11μl，37℃水浴2h。按照凝胶回收试剂盒说明书回收酶切所得片段。按以下体系连接：pET43.1载体3μl，PGEM-T-IL-155μl，T4连接酶1μl，10×连接缓冲液1μl，4℃连接过夜。将连接产物转化感受态DH10B菌，挑菌，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒酶切鉴定(图2)，并将鉴定为阳性的相应质粒至上海生工测序。

5.pET43.1-IL-15亚型基因转化菌的表达

5.1重组质粒pET-43.1-IL-15转化表达菌BL21(DE3)

取鉴定正确的重组质粒pET-43.1-IL-15及空的pET-43.1表达载体质粒转化制备好的感受态细胞BL21(DE3)，均匀涂板，置37℃过夜培养；挑取若干单菌落分别接种于含AMP(75μg/ml)的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，抽提质粒，电泳鉴定，筛选正确转化的表达菌pET-43.1-IL-15/BL21。转化菌株于15％甘油的培养液中置-70℃保种备用。

5.2转化菌的自发表达

本实验采用转化菌自发表达方案。从以上BL-21转化菌平板上挑取菌落，在含AMP(75μg/ml)MDG非表达培养基中37℃培养，过夜，至菌液密度达到饱和，吸取1ml菌液至100ml的含AMP(75μg/ml)ZYM5052表达培养基中37℃培养过夜。这种实验方案，只需转化菌生长密度培养至饱和，操作方便，且其表达量可达IPTG诱导的几倍。

MDG非表达培养基(10ml)    ZYM-5052表达培养基(10ml)

9.15ml  H₂O           9.58ml  ZY

20μl1M MgSO₄         20μl1M MgSO₄

2μl1000×metals      2μl1000×metals

125μl 40％glucose    200μl 50×5052

500μl 5％aspartate   200μl 50×M

200μl 50×M

其中上述培养基的成分配比如下

50×M

以蒸馏水调节终体积为100mL

17.75g Na₂HPO₄

17.0g KH₂PO₄

13.4g NH₄Cl

3.55g Na₂SO₄

1000×metals

以蒸馏水调节终体积为100ml

36ml sterile H₂O

50ml 0.1M FeCl₃ in～0.12M HCl 270.30 50μM Fe

2ml1M CaCl₂ 110.9920μM Ca

1ml1M MnCl₂-4H₂O 197.9110μM Mn

1ml1M ZnSO₄-7H₂O 287.5610μM Zn

1ml 0.2M CoCl₂-6H₂O 237.952μM Co

2ml 0.1M CuCl₂-2H₂O 170.4862μM Cu

1ml 0.2M NiCl₂-6H₂O 237.722μM Ni

2ml 0.1M Na₂MoO₄-5H₂O 241.982μM Mo

2ml 0.1M Na₂SeO₃-5H₂O 263.032μMSe

2ml 0.1M H₃BO₃

50×5052

以蒸馏水调节终体积为100ml

25g glycerol

73ml H₂O

2.5g glucose

10g α-lactose

ZY

以蒸馏水调节终体积为1000ml

10g tryptone

5g yeast extract

1liter of H₂O

5.3小鼠IL-15亚型融合蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定

收集1ml表达培养基中的菌体，12000g、30s离心，弃上清、PBS重悬菌体，12000g、30s离心，小心吸净管壁上的液滴，尽可能使沉淀物不带有残留液体。加入20～25倍于菌体沉淀体积的PBS，振荡混匀，加入等体积的2×上样缓冲液，继续振荡20秒；沸水浴中放置3-5min，12000g离心10min，将上清夜移至另一离心管中，吸取上清样品10μl进行SDS聚丙烯酰胺电泳分析融合蛋白是否表达(图3A)，剩余样品保存于-20℃备用。

6.小鼠IL-15基因原核表达产物的NTA-Agarose亲和层析法纯化

6.1小鼠IL-15基因原核表达产物可溶性的鉴定

将100ml的以上所得的表达菌液4000rpm离心15min，弃上清，10ml裂解液重悬菌体，室温放置15min。将重悬菌液置于超声破碎仪中，以工作功率400W、工作时间10s、间歇时间4s工作50次，于冰上超声裂解1小时。取超声裂解后的菌液于12000rpm，4℃离心20min。吸取上清样品10μl进行SDS聚丙烯酰胺电泳分析，并同时以未经超声裂解10μl制备好的表达产物样品作为对照(图3B)。

6.2保持功能活性的小鼠IL-15基因原核表达产物的制备

经以上检测证明该表达产物是可溶性的，因此在制备过程中，只需裂解液是非变性的，就有可能得到有功能活性的蛋白。按以下配方配制非变性裂解液：50mM Tris-HCl(PH8.0)，500mM NaCl，5mM MgCl₂，0.1％NP-40，2mM咪唑。将100ml的以上所得的表达菌液4000rpm离心15min，弃上清，10ml非变性裂解液重悬菌体并同时加入PMSF防止蛋白降解。将重悬菌液置于超声破碎仪中，于冰上超声裂解1小时。取超声裂解后的菌液于12000rpm，4℃离心20min。所得上清即为可溶的有活性的表达蛋白，置于4℃备用。

6.3AKTA蛋白纯化工作站纯化蛋白

1)平衡层析系统

上样缓冲液清洗A泵，洗脱缓冲液清洗B泵。开启A泵，用上样缓冲液平衡管路，上样环和histrap HP预装柱。

2)上样

切换工作站于load位，使用BD 10ml注射器将5ml样本缓缓推入5ml上样环中。切换工作站于inject位，启动A泵用上样缓冲液以0.1ml/min的速度将上样环中的样本推入到预装柱中。

3)洗涤

上样结束后，启动A泵，用15个柱体积的上样缓冲液以1ml/min的速度冲洗柱子。同时启动A泵与B泵，以95％上样缓冲液加5％洗脱缓冲液的输出比例，用15个柱体积的液体以1ml/min的速度冲洗柱子。

4)梯度洗脱

同时启动A泵与B泵，设定程序，使输出比例由95％上样缓冲液加5％洗脱缓冲液逐步过渡到100％洗脱液。在输出比例变化中，工作站监控图出现峰时，点击hold选项，维持输出比例不变，直至峰消失，取消hold选项。收集出现的每一个层析峰所对应的样品。

6.4纯化蛋白样本的鉴定与质控

1)SDS-PAGE电泳检测各个层析峰所对应的样品(图4A)。根据电泳结果确定目标蛋白的洗脱峰，并且通过软件分析目标蛋白的纯度。

2)取0.8ml蛋白标准配制液加入蛋白标准(20mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30分钟。测定各孔OD值(562nm)，根据所得标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

7.获取无大标签片段的目的蛋白

因在以上纯化所得的蛋白中，有大片段的用于提高表达蛋白的可溶性的Nus-Tag，为了排除其对目的蛋白功能活性可能具有的影响，纯化后需利用肠激酶将其切掉。

7.1咪唑的去除

上步所得纯化蛋白处于咪唑环境中，无法进行肠激酶酶切反应，吸1ml纯化蛋白于30KD超滤离心截留管，12000rpm，4℃离心30min，将截留管倒置，2000rpm，4℃离心15min，所得液体即为去除咪唑的纯化蛋白。

7.2肠激酶酶切

用稀释液将10×酶切缓冲液稀释为1×酶切缓冲液，置于4℃待用，取2U/μl的肠激酶做1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.0000001七个稀释度的稀释，取各稀释度稀释好的肠激酶1μl加入50μg的融合蛋白中，再加入相应体积的1×酶切缓冲液，室温孵育16h，取各个酶切反应体系中的样品10μl，通过SDS-PAGE电泳检测，从而确定最佳的肠激酶用量。将蛋白样品按照最佳条件进行肠激酶酶切，利用50KD的超滤离心截留管，离心，截留，离心所得滤膜的下层液，即为酶切后的小片段的目的蛋白(图4B)。

8.Western blot检测纯化所得小鼠IL-15亚型基因蛋白的表达

取制备好的蛋白10μl，加2μl 5×上样缓冲液混匀煮沸后上样，进行SDS-PAGE(20％浓缩液，5％分离胶)电泳40v，4h。40v湿转7h，将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上。丽春红s染膜、考马斯亮蓝染胶，通过与蛋白marker比较，确定目的条带位置。5％TBST脱脂奶粉封闭1h，一抗37℃孵育1小时，充分洗膜，辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育1小时，充分洗膜，ECL显色(图5)。免抗小鼠IL-15一抗工作浓度为1∶200，β-actin工作浓度为1∶800，羊抗兔IgG二抗工作浓度1∶2000。

9.小鼠IL-15亚型蛋白是细胞经LPS刺激后选择性剪切而产生

本发明选用放线菌酮，一种典型的真核生物蛋白合成抑制剂验证这种缺少第六号外显子的小鼠IL-15基因表达的蛋白，是否由LPS刺激细胞后基因进行选择性剪切而表达形成。取C57BL/6小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，调整细胞浓度至1×107/ml，2ml/孔加至六孔板中，设一孔普通培养状态下的脾细胞为对照，一孔加入LPS(10μg/ml)培养24h，一孔加入LPS(10μg/ml)培养12h后加入放线菌酮(1μg/ml)继续培养12h。收集各孔细胞，离心，弃上清，裂解细胞获取蛋白，加入5×上样缓冲液，煮沸变性，经Western Blot检测小鼠IL-15亚型蛋白表达的变化(图6)。由于小鼠IL-15蛋白及其亚型在RNA水平上只相差40个碱基，其表达的蛋白大小两者仅相差1KD左右，因此，本发明利用20％的分离胶，并延长电泳时间，尽可能的把这两种蛋白区分开。结果表明，未经任何处理的脾细胞表达正常的小鼠IL-15蛋白，加入LPS培养24h后的脾细胞表达小鼠IL-15亚型蛋白，放线菌酮的加入减少了小鼠IL-15亚型蛋白的表达，从而证明小鼠IL-15亚型是细胞被LPS刺激后选择性剪切而产生的。

实施例2

本实施例中步骤1中所用的LPS的浓度为10μg/ml，作用时间为24小时。其余的试剂和操作步骤完全一样。

实施例3

本实施例中步骤1所用的LPS的浓度为20μg/ml，作用时间为24小时；其余的试剂和操作步骤完全一样。

实施例4

本实施例中步骤1所用的LPS的浓度为70μg/ml，作用时间为36小时。其余的试剂和操作步骤完全一样。

实施例5

本实施例中步骤1所用的LPS的浓度为100μg/ml，作用时间为36小时。其余的试剂和操作步骤完全一样。

实施例6

本实施例中步骤1所用的LPS的浓度为50μg/ml，作用时间为24小时。其余的试剂和操作步骤完全一样。

实施例7：小鼠IL-15亚型蛋白的功能检测

1.小鼠IL-15亚型蛋白结构模拟及功能预测

由上述结果可见，这种小鼠IL-15亚型蛋白是在细胞经LPS刺激后也即免疫系统被激活后经选择性剪切缺失6号外显子表达形成的。本发明经过软件初步分析处理预测了这种在免疫系统激活状态下产生的小鼠IL-15亚型发挥何种功能。可以得到的初步结论是小鼠IL-15亚型蛋白由于6号外显子的缺失，无法折叠形成正常的二聚体，但是其单体仍能和小鼠IL-15受体结合，即小鼠IL-15亚型蛋白可能竞争性的和受体结合，但并不能发挥正常小鼠IL-15的功能活性(图7)。

2.小鼠IL-15亚型蛋白的负向调节功能

本发明利用需依赖IL-2或IL-15基因生长的CTLL-2细胞，体外实验验证小鼠IL-15亚型蛋白发挥的功能。取对数生长期的CTLL-2细胞，台盼蓝染色确定活细胞率达95％以上，无血清1640培养基洗涤细胞两遍。调整细胞浓度至5×10⁵/ml，备用。取以上实验所得的纯化的小鼠IL-15及其亚型蛋白各10μg，于96孔培养板中用1640完全培养基进行倍比稀释，每个稀释度设三个复孔，取CTLL-2细胞100μl/孔加入96孔培养板中，37℃、5％CO₂培养箱培养18h，于检测前6h加入³H(1μCi/孔)，收集细胞，β液闪计数器计数(图8A)。结果显示，正常的小鼠IL-15蛋白可以显著促进CTLL-2细胞的增殖，而小鼠IL-15亚型蛋白不能促进CTLL-2细胞的增殖。

为进一步验证小鼠IL-15亚型蛋白是否可以负调控正常小鼠IL-15蛋白的功能活性，在以上的实验体系中又增设了以下几个实验组：取纯化得到的正常小鼠IL-15蛋白1μg/孔加入96孔培养板中，取8μg小鼠IL-15亚型蛋白倍比稀释加入相应孔中，每个稀释度设3个复孔；取rh小鼠IL-15标准品500ng/孔加入96孔培养板中，取8μg小鼠IL-15亚型蛋白倍比稀释加入相应孔中，每个稀释度设3个复孔；取rh小鼠IL-15标准品500ng/孔加入96孔培养板中，取8μg纯化所得正常小鼠IL-15蛋白倍比稀释加入相应孔中，每个稀释度设3个复孔；取rh小鼠IL-15标准品500ng/孔加入96孔培养板中，并倍比稀释，每个稀释度设3个复孔。同样通过³H嵌入法检测CTLL-2的增殖(图8B，C)。结果表明，8μg的小鼠IL-15亚型蛋白可以显著降低1μg正常小鼠IL-15蛋白及500ngrh小鼠IL-15标准品对CTLL-2细胞的增殖促进作用，并且小鼠IL-15亚型蛋白的这种负调节作用，随着其加入量的倍比稀释而降低。

本发明设计以下体外实验进一步确认小鼠IL-15亚型蛋白的负性调控功能。取C57BL/6小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，调整细胞浓度至5×10⁶/ml，100μl/孔加至96孔板中，加入以1.25μg/ml为起始浓度进行倍比稀释的LPS培养24h，另设两组在此基础上分别加入倍比稀释的8μg纯化所得正常小鼠IL-15蛋白及小鼠IL-15亚型蛋白培养24h，各组稀释度均设3个复孔，37℃、5％CO₂培养箱培养18h，于检测前6h加入³H(1μCi/孔)，收集细胞，β液闪计数器计数。结果显示，8μg的小鼠IL-15亚型蛋白可以显著降低LPS对脾脏细胞的刺激增殖作用，且其负调节作用随加入量的倍比稀释而降低，而纯化所得正常小鼠IL-15蛋白对LPS刺激无此负向调控作用。

本发明公开了一种拮抗正常小鼠IL-15蛋白功能的小鼠IL-15亚型蛋白，所述该小鼠IL-15亚型蛋白由小鼠脾细胞在LPS刺激下经选择性剪切形成缺失第六号外显子的小鼠IL-15亚型基因表达产生。其功能经体外实验检测可以在免疫激活状态下拮抗正常小鼠IL-15蛋白的功能，因此，本发明所述拮抗正常小鼠IL-15基因功能的小鼠IL-15亚型蛋白为制备预防或治疗小鼠IL-15基因高表达相关疾病的药物或制剂提供了新的、较好的选择。

实施例8

本研究同样取临床上进行初诊的类风湿性关节炎患者的外周血进行实验，经红细胞裂解处理后，取病人外周血直接进行培养，并加入LPS刺激培养24h，同时取正常人外周血同样经过或未经LPS刺激进行培养作为对照。取所培养的外周血细胞抽提总RNA并进行逆转录-PCR。结果显示，正常人外周血经LPS刺激72h后出现小片段的亚型条带，而患者的外周血则刺激不出小片段的亚型条带。该实验目前已收集6名患者外周血进行研究，均能得到很好的重复，从而证明在类风湿性关节炎患者中无法产生此种具有拮抗作用的小鼠IL-15亚型。(见下表)

表LPS刺激正常人及初诊类风湿患者外周血24h后通过逆转录PCR检测IL-15及IL-15亚型基因的表达结果

经单因素方差分

析，LPS刺激培养正常人外周血与初诊类风湿患者外周血24h后IL-15亚型基因的表达差异具有显著性P＜0.001

实施例9

小鼠IL-15蛋白及其亚型蛋白对不同用量的抗CD3CD28抗体激活的初诊类风湿病人外周血单个核淋巴细胞增殖活性的影响

将抗CD3CD28抗体按照2μg/60μl/l、4μg/60μl/、8μg/60μl/孔的量加入96孔板中，每种抗体用量设3个复孔，4℃过夜包被培养板。实验前将抗体从孔板中吸走。取初诊类风湿病人外周血4ml，用Ficoll分离液分离得到外周血单个核淋巴细胞并进行细胞计数，调整细胞浓度至5×105个/ml，100μl/孔加入已包被的96孔板中。取纯化所得小鼠IL-15蛋白及其亚型蛋白按10μg/100μl/孔加入96孔板中。37℃、5％CO2培养箱培养18h，于检测前6h加入1微居/孔的³H继续培养后，通过细胞收集器进行收集，经β液闪计数器进行读数。结果证明病人外周血单个核淋巴细胞在被抗CD3CD28抗体激活后，小鼠IL-15亚型蛋白的加入能显著抑制T细胞的增殖，而加入野生型的小鼠IL-15蛋白则显著促进了T细胞的增殖，即小鼠IL-15亚型蛋白的加入能够显著抑制类风湿病人外周血T细胞的增殖活性，从而对自身免疫性疾病的病程起到减缓及治疗的作用。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>海燕，刘

<120>小鼠IL-15亚型蛋白的制备及其应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

Gagctcccaa ctggatagat gtaag                                          25

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctcgagggac gtgttgatga ac                                             22

<210>3

<211>444

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgaaaattt tgaaaccata tatgaggaat acatceatct cgtgctactt gtgtttcctt    60

ctaaacagtc actttttaac tgaggctggc attcatgtct tcattttggg ctgtgtcagt    120

gtaggtctcc ctaaaacaga ggccaactgg atagatgtaa gatatgacct ggagaaaatt    180

gaaagcctta ttcaacccag ttgcaaagtt actgcaatga actgctttct cctggaattg    240

caggttattt tacatgagta cagtaacatg actcttaatg aaacagtaag aaacgtgctc    300

taccttgcaa acagcactct gtcttctaac aagaatgtag cagaatctgg ctgcaaggaa    360

tgtgaggagc tggaggagaa aaccttcaca gagtttttgc aaagctttat acgcattgtc    420

caaatgttca tcaacacgtc ctga                                444

 

<210>4

<211>147

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Met Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Met Arg Asn Thr Ser Ile Ser Cys Tyr

1               5                   10                  15

Leu Cys Phe Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

            20                  25                  30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Val Ser Val Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

        35                  40                  45

Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile

    50                  55                  60

Gln Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu

65                  70                  75                  80

Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val

                85                  90                  95

Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn

            100                 105                 110

Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr

        115                 120                 125

Phe Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile

    130                 135                 140

Asn Thr Ser

145

Claims (5)

1.一种小鼠IL-15亚型融合蛋白的制备方法，其特征包括以下步骤：

(1)扩增小鼠IL-15亚型基因片段：取C57BL/6小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，使用0.1μg/ml-100μg/m LPS作用24h-48h刺激小鼠脾细胞，获得刺激后的C57BL/6小鼠脾细胞悬液，通过Trizol-氯仿法抽提总RNA；根据NCBI所公布小鼠IL-15 cDNA序列NM008357.1及pET43.1原核表达载体的结构设计特异性引物Seq NO.1和SeqNO.2，经逆转录-PCR操作扩增获得小鼠IL-15目的片段；

(2)获取小鼠IL-15亚型基因克隆：取步骤1所得PCR产物，按照凝胶回收试剂盒说明回收IL-15基因亚型片段；将回收所得PCR产物与PGEM-T克隆载体连接、4℃连接过夜；取连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其基因序列Seq NO.3；

(3)构建重组小鼠IL-15的pET43.1原核表达载体：取测序鉴定正确的步骤2所得质粒及原核表达载体pET43.1，分别进行SacI、XhoI内切酶双酶切并按照凝胶回收试剂盒说明书回收酶切所得片段；将回收所得酶切片段连接过夜，取连接产物转化感受态DH10B菌，挑菌，按照质粒小抽试剂盒说明抽提质粒酶切鉴定；

(4)pET43.1-IL-15亚型基因转化菌的表达：取鉴定正确的步骤3中重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3)，挑取单菌落，抽提质粒，酶切鉴定，筛选正确转化的表达菌pET43.1-IL-15/BL21；

(5)纯化并获得无标签的小鼠IL-15亚型蛋白Seq NO.4。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的pET43.1-IL-15亚型基因转化菌的表达进行自发表达，即从以上BL-21转化菌平板上挑取菌落，在含AMP(75μg/ml)MDG非表达培养基中37℃培养，过夜，至菌液密度达到饱和，吸取1ml菌液至100ml的含AMP(75μg/ml)ZYM5052表达培养基中37℃培养过夜，其中所述的

MDG非表达培养基(10ml)     ZYM-5052表达培养基(10ml)

9.15ml H₂O                9.58ml ZY

20μl 1M MgSO₄            20μl 1M MgSO₄

2μl 1000×metals         2μl 1000×metals

125μl 40％glucose        200μl 50×5052

500μl 5％aspartate       200μl 50×M

200μl 50×M。

3.一种小鼠IL-15亚型蛋白在制备自身免疫性疾病药物的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、多发性硬化、强直性脊柱炎、炎症性肠病、难治性乳糜泄、银屑病、丙型病毒性肝炎、逆转录病毒HTLV-1相关疾病、阿狄森病、儿童哮喘、纤维肌痛、慢性疲劳综合征、甲状腺炎、血管炎、克隆病、肠炎或雷诺氏病。

5.一种小鼠IL-15亚型蛋白在制备用于流感所致的急性肺炎治疗药物的应用。

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