CN113854234A - 一种小鼠胰腺癌模型及其构建方法和应用 - Google Patents
一种小鼠胰腺癌模型及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种小鼠胰腺癌模型，是通过用rhIL‑15介导人PBMC‑免疫重构胰腺癌MiaPaca2/h18.2而成的，其构建方法包括(1)细胞转染：(2)细胞培养；(3)细胞接种；(4)PBMC移植。本发明还提供了该模型在药物药效评价中的应用。本发明为药物临床前药效研究提供新的评价模型，为胰腺癌相关药物的评价研究提供新的选择。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种小鼠胰腺癌模型及其构建方法和应用。
背景技术
胰腺癌(Pancreatic Adenocarcinoma，PC)是常见的胰腺肿瘤，具有恶性程度较高、进展迅速、起病隐匿以及早期症状不典型等特点，临床就诊时大部分患者已属于中晚期。胰腺癌的5年相对生存率在常见恶性肿瘤中最差，仅为7.2％，且呈逐年恶化的趋势。目前手术切除依然是胰腺癌患者获得治愈机会和长期生存的唯一有效方法。然而，超过85％的胰腺癌患者因病期较晚而失去手术机会。晚期胰腺癌的一线方面，目前以GEM(Gemcitabine，吉西他滨)为基础的药物治疗是晚期胰腺癌最主要的治疗方式。
研究发现，在正常组织中，CLDN18.2仅表达于分化的胃黏膜上皮细胞，CLDN18.2被超分子复合体包绕，很难被静脉抗体结合。但在细胞恶变过程中，细胞极性发生变化，CLDN18.2抗原表位暴露在了癌细胞表面，可被抗体特异性识别。CLDN18.2在多种恶性肿瘤中均观察到了异常激活和过表达的特征。CLDN18.2对肿瘤的组织学类型具有选择性：表达于食管腺癌，不表达于食管鳞状细胞癌；表达于卵巢粘液癌，不表达于卵巢浆液癌；表达于胰管腺癌，而不表达于胰岛细胞癌。在不同类型的肿瘤组织中，CLDN18.2的表达比例也不相同，CLDN18.2在胃腺癌、食管腺癌、胰腺癌、卵巢粘液癌中的表达率分别约为77％、78％、80％、24％；CLDN18.2不仅表达在原发灶，转移灶中同样高度表达。当前处于研究过程中的CLDN18.2抗体包括IMAB362(Zolbetuximab)等。
胰腺癌由于其特点，临床前针对性的肿瘤模型制备也比较困难(接种后容易产生内部溃烂)，常用的CDX模型不易制备；而免疫重构模型(PBMC和CD34+)模型更适合于T细胞介导的免疫反应(如PD1/PDL1)。以上免疫重构模型不适合评价CLDN18.2抗体；同时CLDN18.2抗体药效作用发挥与细胞表面CLDN18.2表达丰度相关，因此野生型胰腺癌细胞并不适合移植评估。
因此亟需提供一种适合评价CLDN18.2抗体药效的胰腺癌模型及其构建方法和应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足而提供一种小鼠胰腺癌模型及其构建方法和应用。
本发明的技术方案为：
一种小鼠胰腺癌模型，其特征在于，所述小鼠胰腺癌模型是通过用rhIL-15介导人PBMC-免疫重构胰腺癌MiaPaca2/h18.2而成的。
本发明提供了一种小鼠胰腺癌模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)细胞转染：用人CLDN18.2基因转染MiaPaca2细胞，构建MiaPaca2/h18.2细胞；
(2)细胞培养：将MiaPaca2/h18.2细胞用完全培养基进行培养，收集对数生长期的细胞，离心制备细胞悬浮液；
(3)细胞接种：取步骤(2)制备的细胞悬浮液接种于小鼠单侧腋窝皮下，选取肿瘤体积生长至100±50mm3的小鼠；
(4)PBMC移植：将步骤(3)选取的小鼠静脉注射人PBMC，接种人PBMC后的小鼠每天腹腔注射rhIL-15，小鼠胰腺癌模型构建完成。
优选地，步骤(2)中所述的完全培养基为含10±1％FBS、800±50μg/mL G418的RPMI-1640培养基。
优选地，步骤(2)中所述的细胞悬浮液的浓度为(2.5±0.5)×107个/mL。
更为优选地，步骤(2)中所述的细胞悬浮液的浓度为(2.5±0.2)×107个/mL。
优选地，步骤(3)中所述的取步骤(2)制备的细胞悬浮液以0.2±0.05mL/只的量接种于小鼠单侧腋窝皮下。
更为优选地，步骤(3)中所述的取步骤(2)制备的细胞悬浮液以0.2mL/只的量接种于小鼠单侧腋窝皮下。
优选地，步骤(3)中所述的选取肿瘤体积生长至100±20mm3的小鼠。
优选地，步骤(4)中所述的静脉注射人PBMC的量为(1.5±0.3)×107个/只。
更为优选地，步骤(4)中所述的静脉注射人PBMC的量为(1.5±0.1)×107个/只。
优选地，步骤(4)中所述的接种人PBMC后的小鼠每天腹腔注射1±0.2μg/只的rhIL-15。
更为优选地，步骤(4)中所述的接种人PBMC后的小鼠每天腹腔注射1μg/只的rhIL-15。
本发明还提供了如上所述的小鼠胰腺癌模型在药物药效评价中的应用。
进一步地，所述药物是针对CLDN18.2靶点的抗体。
有益效果：
本发明是结合CLDN18.2抗体的作用机制，通过多次试验，构建了野生株工程化的MiaPaca-2/h18.2+PBMC+IL-15肿瘤模型，能够反映药物作用机制临床前药效。
针对CLDN18.2靶点的药物，在本发明的高表达人CLDN18.2胰腺癌模型中能够对抑瘤效果进行验证，为药物临床前药效研究提供新的评价模型，为胰腺癌相关药物的评价研究提供新的选择。
附图说明
图1为各组小鼠的肿瘤体积变化图；
图2为各组小鼠的相对肿瘤体积变化图；
图3为各组小鼠的相对肿瘤增殖率(T/C，％)变化图；
图4为各组小鼠的肿瘤体积抑制率(IRTV，％)变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1小鼠胰腺癌模型的构建
1、试验试剂、细胞株及动物：
重组人白介素15(rhIL-15)：购自金斯瑞生物科技有限公司，批号：P50131507；
MiaPaca2细胞：来自American Type Culture Collection；
pEZ-M02质粒：购自GeneCopoeia，货号EZ007；
人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)：新鲜来源，即采集后24h内使用，未冷冻处理，购自澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司；
完全培养基：10％FBS(质量分数)+800μg/mL G418+RPMI-1640；
RPMI-1640培养基：购自Gibco公司；
G418：购自Gibco公司；
SPF级NOD-Cg.PrkdcSCID IL-2Rgcnull/vst小鼠(NSG小鼠)：购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物使用许可证号：SCXK(京)2019-0002，动物许可证号：No.1103411911000207，接收时体重13.4～16.9g，共60只，雌雄各半。
2、具体构建方法：
(1)细胞转染：用人CLDN18.2基因(NCBI Reference Sequence:NM_001002026)转染MiaPaca2细胞，构建表达人CLDN18.2蛋白的MiaPaca2/h18.2细胞，其中所用质粒为pEZ-M02；
(2)细胞培养：将MiaPaca2/h18.2细胞用完全培养基进行培养，收集对数生长期的细胞，离心制备细胞悬浮液，调整细胞悬浮液浓度为2.64×107个/mL；
(3)细胞接种：取步骤(2)制备的细胞悬浮液以0.2mL/只的量接种于小鼠右侧腋窝皮下，选取肿瘤体积生长至100±10mm3的小鼠40只；
(4)PBMC移植：将步(3)选取的40只小鼠随机分为4组，每组小鼠静脉注射1.4×107个/只的人PBMC，接种人PBMC后的小鼠从当天开始每天腹腔注射1μg/只的rhIL-15，胰腺癌模型构建完成。
其中，步骤(4)中所述的接种人PBMC后的小鼠从当天开始每天腹腔注射1μg/只的rhIL-15直至(需药效评价药物)给药结束。
实施例2受试药物对人PBMC免疫重构MiaPaca2/h18.2模型抑制试验
1、试验药物和试剂：
受试药物(WO2020/018852中披露的分子M5，一种CLDN18.2抗体)：来自江苏奥赛康药业有限公司，规格：25mg/瓶，批号：201905001，用生理盐水稀释至相应浓度临用时配制；
0.9％氯化钠注射液：购自安徽双鹤药业有限责任公司，规格：500mL/瓶，批号：1707308A/1805303204。
2、具体分组与给药：
将实施例1中接种人PBMC 24h后的各组小鼠尾静脉给药，给药方案见表1。
表1给药方案
各组均为尾静脉给药，以首次给药当天计为day1，首次给药后在day4、day8、day11、day15、day18和day22各给药一次，模型对照组给予对应体积的0.9％氯化钠注射液。
3、试验指标：
首次给药前(分组时)、给药后在day4、day8、day11、day15、day18和day22各测量瘤径一次，游标卡尺测量并记录肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积(V＝1/2×长径×短径2)，并根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，比较各组间肿瘤生长曲线的差异。
按照以下公式计算相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增殖率T/C(％)：
RTV＝Vt/V0
Vt：每次测量肿瘤得到的瘤体积
V0：初始瘤体积(首次给药前)
T/C(％)＝给药组的RTV平均值/对照组的RTV平均值×100
瘤体积抑制率IRTV(％)＝100％－T/C4、试验结果：
数据结果以
表示，两两比较采用Student’s t检验，P<0.05定义为有统计学显著性差异。
1)肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)变化结果
首次给药前各组动物平均瘤体积相似，分别为95.22±30.44mm3、96.28±29.04mm3、94.48±23.86mm3和96.12±30.25mm3；day15时各组动物平均瘤体积分别为242.40±43.74mm3、124.45±35.56mm3、106.04±67.47mm3和86.17±30.11mm3。与模型对照组相比，供试品M5各组平均肿瘤体积在day11～day15时显著地减小(P<0.05，P<0.01)。
Day15时各组相对瘤体积分别为2.81±0.87、1.24±0.63、1.19±0.86和0.93±0.35；与模型对照组相比，M5低、中和高剂量组在D11时相对肿瘤体积显著地减小(P<0.05，P<0.01)。各组小鼠的肿瘤体积和相对肿瘤体积变化趋势见图1和图2。
2)肿瘤体积抑制率(IRTV，％)变化结果
结果可见，实验期间所有组别肿瘤体积抑制率(IRTV，％)均大于55％。day15时M5低、中、高剂量组的肿瘤体积抑制率分别为55.83％、57.42％和66.94％。day15后由于改模型为PBMC移植模型，在体内会产生GVHD，对模型组肿瘤有抑制作用，导致肿瘤抑制率下降。
各组小鼠的相对肿瘤增殖率(T/C，％)和肿瘤体积抑制率(IRTV，％)的变化趋势见图3和图4。
本发明通过动物试验验证了药物在高表达人CLDN18.2胰腺癌模型中的作用和效果。
针对CLDN18.2靶点的药物，在本发明的高表达人CLDN18.2胰腺癌模型中能够对抑瘤效果进行验证，为药物临床前药效研究提供新的评价模型，为胰腺癌相关药物的评价研究提供新的选择。
Claims (10)
1.一种小鼠胰腺癌模型，其特征在于，所述小鼠胰腺癌模型是通过用rhIL-15介导人PBMC-免疫重构胰腺癌MiaPaca2/h18.2而成的。
2.如权利要求1所述的一种小鼠胰腺癌模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)细胞转染：用人CLDN18.2基因转染MiaPaca2细胞，构建MiaPaca2/h18.2细胞；
(2)细胞培养：将MiaPaca2/h18.2细胞用完全培养基进行培养，收集对数生长期的细胞，离心制备细胞悬浮液；
(3)细胞接种：取步骤(2)制备的细胞悬浮液接种于小鼠单侧腋窝皮下，选取肿瘤体积生长至100±50mm3的小鼠；
(4)PBMC移植：将步骤(3)选取的小鼠静脉注射人PBMC，接种人PBMC后的小鼠每天腹腔注射rhIL-15，小鼠胰腺癌模型构建完成。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的完全培养基为含10±1％FBS、800±50μg/mL G418的RPMI-1640培养基。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的细胞悬浮液的浓度为(2.5±0.5)×107个/mL。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的取步骤(2)制备的细胞悬浮液以0.2±0.05mL/只的量接种于小鼠单侧腋窝皮下。
6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的选取肿瘤体积生长至100±20mm3的小鼠。
7.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述的静脉注射人PBMC的量为(1.5±0.3)×107个/只。
8.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述的接种人PBMC后的小鼠每天腹腔注射1±0.2μg/只的rhIL-15。
9.如权利要求1所述小鼠胰腺癌模型在药物药效评价中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物是针对CLDN18.2靶点的抗体。
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