CN102258768A - 重组人白介素15在治疗肾癌病症药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组人白介素15(rhIL-15)以及含有重组人白介素15在治疗肾癌及转移性肾癌药物中的应用，经体内药理实验证明，rhIL-15对裸鼠肾癌移植瘤及肾癌细胞786-0静脉散播模型小鼠有较好的治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及重组人白介素15(rhIL-15)在制备具有治疗肾癌，尤其是转移性肾癌病症药物中的应用，属于生物制药领域。
背景技术
肾癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全身恶性肿瘤的3％，居泌尿系统肿瘤的第二位，约有20％-30％的肾癌患者就诊时已出现不同程度的扩散或转移，有20％-40％的术后患者仍会出现远处转移，发展成为转移性肾癌。
转移性肾癌(Metastatic Renal Cell Carinoma)的治疗是临床难题之一，激素治疗、化疗、放疗等方法的疗效均令人失望。近年来，以干扰素为代表，并在其研究推动和启迪下，发展形成了包括细胞因子、抗癌细胞、肿瘤免疫等第三代生物治疗方法，并迅速地应用于晚期肾癌的临床治疗。1992年美国食品与药品管理局(FDA)批准高剂量白细胞介素2(IL-2)作为转移性肾癌的标准治疗，其客观有效率达15.0％～25.0％，完全缓解率约为3.0％～5.0％，且有效持续时间长，对患者的总体生存有益，美国国家综合癌症网指南中将高剂量白细胞介素2作为转移性肾癌的标准治疗。大剂量的白介素2虽然可以改善预后，但因其较大的毒付作用(S.A.Rosenberg，J.C.Yang，S.L.Topalian，et al.Treatment of 283 consecutive patients withmetastatic melanoma or renal cell cancer using high dose bolus interleukin-2[comment]JAMA 1994.271：907-913)和昂贵的价格，使其并不是一种理想的治疗方案，因此很多研究者在不停地寻找着其它的一些可行的治疗方案，比如用低剂量的白介素2和IFN-a联合应用，此种联合可增加有效率，但生存时间没有明显的改善，McDermott D F等(McDermott D F，Regan M，Clark J I，et al.Randomized phase iiitrial of high-dose interleukin-2 versus subcutaneous interleukin-2 and interferon inpatients with metastatic renal cell carcinoma[J].J Clin Oncol，2005，23(1)：133-141)在最近一项大型III期临床试验将小剂量的IL-2和IFN-a联用与大剂量IL-2作比较，进一步证实两者治疗转移性肾癌没有显著性差异。
白细胞介素15(IL-15)是Grabstein等人于1994年发现的一种约为12-14kD的细胞因子，与大多数细胞因子相似，IL-15可在机体正常的免疫应答中发挥作用，如促进T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞的发育等，IL-15还可对免疫系统外的多种组织和细胞发挥广泛而多效的作用。体外研究显示IL-15与IL-2由于共有的受体组分共有几种生物学活性，在T细胞上存在的IL-15受体包括一种特有的α链，IL-15Rα，但是与IL-2R共有β链和γ链，结果，两种受体都利用相同的Jak/STAT信号传递元件，不过，基于IL-2和IL-15及其受体的复杂调控和不同表达，已经报道了体内功能的显著差异(Kirman等，1998；Waldmann and Tagaya，1999；Waldmann等，2001)。IL-15和IL-2的抗肿瘤效应应受到重视，比较IL-15与IL-2对肺腺癌转移模型的疗效时，它诱导的NK杀伤活性比IL-2诱导的高3-4倍，此外，6倍剂量的IL-15才能引起肺血管渗漏等毒副作用的出现，在大鼠的结肠癌模型中也发现，IL-15能显著降低化疗英气的胃肠道毒性，增强药物的最大耐受剂量。朱法良等(朱法良，孙油，田志刚，等.rhIL-15和rhIL-2诱生的LAK细胞特性比较.中国免疫学杂志[J].2002，18(4)：252-258)在研究重组人白细胞介素15和重组人白介素2诱导的粘附性自然杀伤细胞(LAK)时发现，rhIL-15诱生的LAK细胞杀伤K562细胞的能力强于rhIL-2诱生的LAK细胞，同时，rhIL-15诱生的LAK细胞的CD3-CD56+细胞、CD94+细胞百分率均要高于rhIL-2诱生的LAK细胞，证明rhIL-15在体内对NK细胞功能可能具有较强的调节作用。
发明内容
本发明研究人员发现，rhIL-15在治疗肾癌及转移性肾癌方面，具有较IL-2更为高效和更为安全的效果。
本发明的目的在于提供重组人白细胞介素15在制备具有治疗肾癌病症药物中的应用，更为具体地，本发明的目的在于提供重组人白细胞介素15在制备具有治疗转移性肾癌病症药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种含有重组人白细胞介素15的药物组合物在制备具有治疗肾癌病症药物中的应用，具体地，是提供一种含有重组人白细胞介素15的药物组合物在制备具有治疗转移性肾癌病症药物中的应用。
本发明中，含有重组人白细胞介素15的药物组合物，是指，除含有重组人白细胞介素15外，还包括一些其它药物，如白细胞介素2、IFN-a、抗血管内皮生长因子(VEGF)、索拉非尼、5-FU、吉西他滨、紫杉烷等其它抗癌药物的任意一种或多种。
本发明的一个优选实施例在于提供一种制备rhIL-15的方法，本发明制备方法通过一系列基因克隆的构建策略，合成目的基因IL-15，并将目的基因IL-15克隆到表达载体上，再将含有目的基因的表达载体转化至大肠杆菌，构建工程菌发酵制备rhIL-15。
在本发明的一个优选实施例中，提供了rhIL-15对肾癌小鼠的治疗作用，肾癌小鼠给予有效量的rhIL-15，可显著抑制肿瘤细胞的生长，延长小鼠的生命。
本发明的还一优选实施例中，提供了rhIL-15对转移性肾癌小鼠的治疗作用，rhIL-15可显著延长小鼠的生存时间。
附图说明
图1左为rhIL-15的诱导表达情况电泳图，右为rhIL-15的样品和标准品WesternBlot杂交图，从图中可以看出在大约13kDa的位置出现明显的目的蛋白条带，Western Blot试验表明该目的条带出现明显的印迹反应，说明白介素15获得了正确高效表达。
图2为rhIL-15样品纯化前、后的电泳情况图，纯化后的重组rhIL-15经Tricine-SDS-PAGE电泳检测，结果在大约13kDa的位置出现一条带。
图3为纯化后的rhIL-15样品的高效液相色谱图，纯化后的rhIL-15显示仍为单一峰。
具体实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1制备rhIL-15
试验材料：DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶均为GIBCO公司产品；大肠杆菌宿主菌DH5a，BL21(DE3)菌株(购自Invotrogen公司)；pVB220载体(购自Novagen公司)
1引物的设计与合成：根据报道的hIL1-15的基因序列设计一对引物，上游引物P1：5’-CctcgagTTCATGAACTGGGTGAATGTAATAAG-3’，包括起始密码子ATG，外设Xho I酶切位点；下游引物P2：5’-CGGATCCttaTTAAGAAGTGTTGATGAAGATTTG-3’，将终止密码子变成原核系统高频使用的强终止子TAA，外设BamH I酶切位点，引物由北京雷默生物技术有限公司合成和纯化。
2富含IL-15mRNA单个核细胞的制备及总RNA提取，采用常规密度梯度离心方法分离正常人外周血白细胞，培养与含10％小牛血清、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液中，加入细菌脂多糖5μg/ml和干扰素-γ500u/ml，培养4h，弃去悬浮细胞，收获帖壁的单个核细胞，经异硫氰酸胍法提取细胞总RNA，采用甲醛变形琼脂糖凝胶水平电泳鉴定RNA。
3RT-PCR反应：逆转录反应：取细胞总RNA 5-10μg作为模板，加入DTT10mmol、M-MLV200u、4xdNTP(每种)0.5mmol、下游引物P250pmol，总反应体积20μl、37℃作用1h，95℃10min灭活M-MLV；PCR反应：在RT反应物20μl中，加入MgCl22mmol、4xdNTP 0.1mmol、上游引物P150pmol、95℃、5min，加入TaqDNA聚合酶2u。PCR反应条件：94℃1min、58℃1min、72℃1min，循环35次，72℃延长7min。扩增得到IL-15cDNA序列。
4IL-15重组表达载体构建将RT-PCR扩增后的IL-15eDNA用XhoI和BamHI双酶切后，经低熔点琼脂糖电泳纯化回收片段，再在T4DNA连接酶的作用下与同样酶切的pBV220载体连接，转化入DH5α大肠杆菌，在含氨苄青霉素的选择性培养基上筛选阳性克隆。
5将rhIL-15表达载体转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)，筛选阳性转化子，将阳性的克隆菌株接种于2ml含氨苄青霉素的LB培养液中，30℃活化后，1∶100接种，扩增至OD600＝0.4-0.6时，于37℃诱导培养4h，5000r/min离心5min收集菌体，超声波破碎菌体，收集包涵体，然后通过变性-复性-层析的方法纯化rhIL-15，最后获得95％以上纯度的rhIL-15。纯化的rhIL-15经氨基酸分析，其N端的10个氨基酸序列结果表明，样品中除部分N端多出1个甲硫氨酸外(转录时的起始密码子)，氨基酸序列与天然的人IL-15相同，纯化后的rhIL-15的比活为2×107U/mg.
实施例2rhIL-15对裸鼠肾癌移植瘤的治疗作用
试剂：rhIL-2(市售，购于深圳晶美生物工程有限公司)，rhIL-15(自制)；人肾癌细胞系786-0细胞由本公司保存；Balb/c裸鼠购自购自中国医学科学院动物实验中心：4-5周龄，体重(17-20g)，雌雄各半；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自Invitrogen公司：
肾癌小鼠模型建立：人肾癌细胞系786-0用10％的FBS、RPMI1640培养基在37℃、5％的CO2孵育箱进行培养，待细胞生长至对数生长期时，用0.25％的胰酶消化并收集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后重悬，调整细胞浓度为2.5×1010/L。每只裸鼠于前肢腋部皮下注射重悬液0.2ml(5×106/L)，成瘤一周后，将模型小鼠随机分为5组，分别为生理盐水组、重组白细胞介素-2组(给予5×104U/次)、重组白细胞介素-15低(给予2×104U/次)、中(5×104U/次)、高(8×104U/次)剂量组及rhIL-15+IFN-a组(剂量分别为1×104U/次和2×104U/次)，每组动物10只。于接种肿瘤后第8天开始腹腔注射给药0.1ml(给药溶剂为生理盐水)，每周连续给药5天，停药2天，连续给药6周，共给药30天，于第41天停止给药。
每天观察注意小鼠肿瘤生长及小鼠死亡情况，每隔一周测量肿瘤的长径(L)和短径(W)，连续观测6周，根据公式V＝0.52×L×W2来计算肿瘤体积。结束给药后继续观察2周，记录两周后小鼠的总死亡数量，解剖实验结束前死亡和最终处死的小鼠，结果见表1。
表1rhIL-15对裸鼠肾癌移植瘤的治疗作用
注：与生理盐水组相比，**P＜0.01
从表1中可以看出，小鼠接种肾癌细胞后，随时间推移，肿瘤体积呈增大趋势，但各给药组与生理盐水组相比，肿瘤生长速度明显要受到抑制，抑制肿瘤增长的速度差异具有显著性，各给药组间，低剂量的重组白介素15与重组白介素2效果相当(给药六周后的瘤体的体积分别为612.6±62.3和592.7±48.1mm3)，中剂量(与重组白介素2同等剂量)重组白介素15的剂量要好于重组白介素2，但相互差异无显著性，随着重组白介素15给药剂量的增加，其抑制肿瘤生长效果更为明显，与小剂量的重组白介素15和重组白介素2相比，差异具有显著性(P＜0.05)。从停止给药后观察两周小鼠的死亡数量上看，各给药组肾癌小鼠的死亡数量也要明显少于生理盐水组，高剂量的重组白介素15组没有发现荷肾癌小鼠死亡，而中剂量和低剂量的重组白介素15分别有2只和4只死亡，重组白介素2组有3只死亡。上结果证明，对于给予同等剂量的重组白介素15及重组白介素2，重组白介素15的效果要好于重组白介素2组。
将低剂量的rhIL-15和IFN-a联合使用，可明显抑制肿瘤体积的增长，降低小鼠的死亡率，其效果要明显好于同等剂量的rhIL-15组。
实施例3重组人白介素15对小鼠肾癌静脉散播模型鼠的抗肿瘤转移的作用
将新鲜培养的肾癌细胞株786-0稀释到大约1×107/ml的细胞悬浮液，在Balb/c小鼠的尾静脉注射100μl，建立肾癌瘤静脉散播动物模型，设立5个处理组，每组10只小鼠：生理盐水组、白介素2治疗组5×104U/次、白介素15低剂量组2×104U/次、中剂量组5×104U/次、高剂量组8×104U/次和rhIL-15+IFN-a组(剂量分别为1×104U/次和2×104U/次)，接种肿瘤7天后，腹腔给药，1次/天，每周连续6天停药一天，连续给药4周。
表2小鼠肾癌细胞786-0静脉散播模型试验肿瘤转移情况分析
表2结果表明，各不同给药组在肺、肝及其他器官肿瘤细胞的转移发生率明显低于生理盐水组，其中在肾癌肺转移上，各组与生理盐水组相比均具有显著性差异(其中生理盐水组5/10、rhIL-2组2/10、低剂量rhIL-15组1/10、中剂量rhIL-15组3/10、高剂量rhIL-15组1/10)；而对于发生肿瘤转移的小鼠数量上，rhIL-15各剂量组均要少于rhIL-2组，其中高剂量rhIL-15组与rhIL-2组相比，差异具有显著性。重组白介素15具有抗肿瘤转移的作用，转移程度显著低于白介素2治疗组。rhIL-15与IFN-a联合使用，可以显著提高肾癌细胞静脉散播模型鼠的转移现象。
Claims (4)
1.重组人白介素15在制备具有治疗肾癌病症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的重组人白介素15在治疗肾癌病症药物中的应用，其中所述的肾癌为转移性肾癌。
3.含有重组人白介素15的药物组合物在制备具有治疗肾癌病症药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是所述的肾癌为转移性肾癌。
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