CN115232217B - 一种SynNotch结构及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种SynNotch结构及其应用；SynNotch结构包括启动调控蛋白区，该结构进行逻辑调控嵌合抗原受体免疫细胞，在调控过程中，第一靶点结合SynNotch后功能激活，水解脱离的启动蛋白启动自分泌hIL‑15/Ra超激动蛋白基因、CAR结构基因及iCas9自杀基因的表达。该发明同时解决了传统CAR结构的常时激活导致的免疫细胞提前耗竭问题、免疫细胞的增殖浸润问题、免疫细胞的过度杀伤及可能发生严重副反应的问题和肿瘤微环境的改善问题，极大的提高了免疫细胞增殖能力、抗凋亡能力、对于肿瘤的杀伤能力及免疫细胞治疗的安全性。

Description

一种SynNotch结构及其应用
技术领域
本发明涉及细胞制备技术领域，尤其涉及一种SynNotch结构及其应用。
背景技术
肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。其中，恶性肿瘤因易发生转移，治疗后易复发且在某些特殊的微环境下导致极难治愈。
IL-15在T细胞、NK细胞及其发育、稳态和功能中起着至关重要的作用，并且还对B细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞和肥大细胞具有各种功能。IL-15是细胞因子4-α-螺旋束家族的成员，分子量为14-15kDa，含有114个氨基酸。IL-15具有两种同种类型：①SSP：包含21个氨基酸组成的较短的信号肽(SSP，short signal peptide)，SSP型IL-15被充分翻译但并不分泌，因此，它的活动范围被限制在细胞质和细胞核，可能在其转录调控中起着重要作用；②LSP：包含48个氨基酸组成的更长的信号肽(LSP，long signal peptide)，LSP-IL-15是作为免疫调节剂被分泌至胞外的。IL-15以及IL-15Rα由抗原呈递细胞(单核细胞和树突细胞)协同表达。IL-15广泛表达于多种细胞中，细胞类型包括单核细胞、巨噬细胞、DC细胞、成纤维细胞、上皮细胞和骨骼肌细胞，但在T细胞中并不表达IL-15细胞因子。
IL-15与抗原受体的结合方式为反式呈递方式：IL-15与表达在抗原提呈细胞上高亲和力的α受体结合，形成IL-15Rα；IL-15Rα将IL-15递呈给IL-2/15Rβγ二聚体形成三元复合物。可激活JAK和STAT型号通路，并具有促进靶细胞增殖与活化、IFN-γ、TNF-α分泌水平提升等功能。
传统的Notch信号通路包括Notch受体、Notch配体、细胞内效应分子、DNA结合蛋白、受调控的下游基因等。Notch受体是跨膜受体，当胞外域结合到Notch配体后，细胞运动致使s2位点暴露，被金属蛋白酶等识别切割，释放胞内段入核，从而启动下游基因表达。Wendella.Lim团队改造了鼠的Notch1受体，将其胞外域用单链抗体或者纳米抗体替换，胞内域用转录激活或转录抑制的结构域替换，仅保留了可以被蛋白酶识别切割的跨膜核心域，还配备了下游被调控的基因元件。针对不同的疾病或者肿瘤抗原，胞外域采用特异识别该抗原的抗体单链，而胞内域调控预先设定的目标基因或因子的表达。难得的是，在同一细胞中可以设计由不同抗原启动的基因调控环路，并具有很好的正交性。SynNotch系统可以被应用到许多细胞类型中，包括神经细胞、免疫细胞。CAR-T技术和SynNotch系统组合应用到T细胞改造中，可以实现T细胞的“与”门激活，即只有当细胞同时表达两种特定的表面抗原时，才能将T细胞激活。改变SynNotch下游调控的基因元件，T细胞可以在接触特定抗原后，分泌单链抗体、细胞因子等等具有治疗作用的因子，并且在体外、体内都具有抗肿瘤的作用。可见SynNotch受体系统，在细胞改造中具有极大的技术优势。
近几年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，尤其是过继性细胞疗法(ACT)，即指从病人体内分离出T细胞、NK细胞等免疫细胞，通过体外修饰扩增培养，随后回输入患者体内进行肿瘤治疗的方法。2013年，肿瘤的免疫疗法被Science杂质评为“十大突破”之首。
CAR-T和TCR-T是过继性细胞疗法重要的组成部分，尤其CAR-T疗法，在血液肿瘤的治疗上取得了显著的成就，取得了较高的缓解率，典型的CAR结构由三部分组成，胞外识别肿瘤抗原的scFv、铰链和跨膜结构域、胞内共刺激信号和激活结构域。第一代的CAR并不包含胞内共刺激信号，CAR-T细胞的杀伤活性较低且生存时间较短。因此，第二代CAR开始加入共刺激信号如CD28和4-1BB，采用不同的共刺激信号的CAR-T细胞的特性也不尽相同，CD28增强了CAR-T细胞的杀伤活性而4-1BB则增强CAR-T细胞杀伤活性的同时延长了CAR-T细胞的生存时间。随后，出现了共同表达两个共刺激信号域的三代CAR，然而其抗肿瘤效果并不如二代CAR-T。因此，现在临床应的主要为二代CAR-T细胞。
CAR-T疗法不仅在血液肿瘤治疗的药物中成果显著，而且商业化进展顺利，美国FDA于2017年正式批准了两种CAR-T药品上市。尽管CAR-T细胞疗法在血液肿瘤治疗药物中大放异彩，但对于实体瘤却并没有较好的治疗效果，存在缓解率低且容易发生脱靶等毒副作用。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种可以调控hIL-15/Ra超激动蛋白分泌蛋白、嵌合抗原受体表达和iCasp9自杀基因表达的SynNotch结构。
本发明的技术方案如下：
一种SynNotch结构，包括第一靶点结合区域、Notch core区及启动调控蛋白区；该SynNotch结构可同时调控hIL-15/Ra超激动蛋白基因、iCas9自杀基因及嵌合抗原受体结构基因的表达。
在其中一个实施例中，所述SynNotch结构膜表达于免疫细胞表面，且SynNotch结构包括第一靶点结合区域、Notch core区、启动调控蛋白区；被调控的hIL-15/Ra超激动蛋白基因、iCas9自杀基因及嵌合抗原受体结构基因序列前，分别包含有与SynNotch结构的启动调控蛋白区的核酸序列相一致的核酸序列。其中，启动调控蛋白区中为调控蛋白GAL4-VP64和tetR中的一种。
在其中一个实施例中，所述hIL-15/Ra超激动蛋白为可分泌蛋白，其结构是IL-15N72D、G4S*4Linker和IL-15RaSu顺序依次串联表达的。
在其中一个实施例中，所述嵌合抗原受体膜表达于免疫细胞表面，嵌合抗原受体结构为信号肽、第二靶点结合区域、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区、CD3zeta激活区；其中，第二靶点结合区域与SynNotch结构第一靶点结合区域不同，以达到多靶点靶向及逻辑控制目的。
在其中一个实施例中，所述第一靶点及第二靶点包括IL-13Rα2、CLDN18.2、GPC3、HER2、TAA、GD2、MSLN、EGFR、NY-ESO-1、MUC1、PSMA和EBV中的一种或几种；优选，第一靶点及第二靶点分别为IL-13Rα2和CLDN18.2。
在其中一个实施例中，所述第一靶点结合区域及第二靶点结合区域结合形式包括scFv、Fab、或scFv与Fab组合转中的任一种或多种。
在其中一个实施例中，所述iCASP9膜表达于免疫细胞表面，可通过AP1903小分子药物诱导免疫细胞凋亡。
在其中一个实施例中，一种表达盒，包含有SynNotch结构。
在其中一个实施例中，一种载体，包含有表达盒、SynNotch结构。
在其中一个实施例中，所述免疫细胞中，SynNotch基因、超激动蛋白基因、嵌合抗原受体基因和自杀基因的融合是通过构建表达框的方式来实现。
在其中一个实施例中，所述免疫细胞中SynNotch基因、超激动蛋白基因、嵌合抗原受体基因和自杀基因需分别构建表达框进行基因表达，各基因表达框可构建于同一载体或多个载体中。
在其中一个实施例中，所述免疫细胞中的各基因构建表达框时的载体递送方式包括慢病毒、逆转录病毒、普通质粒、附加体、纳米递送系统、电转导或转座子中的一种或几种。
在其中一个实施例中，所述免疫细胞含有SynNotch结构、表达盒、或者载体。
在其中一个实施例中，一种生物制剂，包括SynNotch结构基因编码的核酸或者氨基酸序列构建的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系等，其中，重组细胞系优选为免疫细胞。
本发明还提供上述免疫细胞在制备预防和/或治疗癌症或肿瘤生物制剂中的应用，如，生物制剂具体为药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂上的应用；肿瘤选自血液肿瘤、实体瘤或其组合；所述血液肿瘤选自急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或其组合；所述实体瘤选自胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌或其组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
SynNotch结构可以调控hIL-15/Ra超激动蛋白分泌蛋白、嵌合抗原受体表达和iCasp9自杀基因的表达；该设计可由SynNotch元件调控hIL-15/Ra超激动蛋白，膜表达嵌合抗原受体和iCasp9自杀基因的表达，避免免疫细胞过度表达提前耗竭，同时hIL-15/Ra超激动蛋白可达成增强免疫细胞增殖能力、抗凋亡能力和对于肿瘤的杀伤能力；SynNotch结构与嵌合抗原受体配合，可达成多靶点调控免疫细胞激活的效果，解决脱靶问题；并且若发生严重毒副作用，iCasp9自杀基因的存在可使用AP1903小分子药物诱导免疫细胞凋亡。
附图说明
图1a、1b分别为免疫细胞中的融合蛋白和氨基酸序列结构设计图；其中，图1a中，启动调控蛋白区为调控蛋白；A#～D#中的结构为SynNotch调控序列，使用GAL4-VP64调控蛋白与调控蛋白区的核酸序列UAS结合启动下游基因表达；E#为对照CAR结构设计图；图1b中，启动调控蛋白区为tetR调控蛋白；1#～4#中的结构为SynNotch调控序列，使用tetR调控蛋白与启动调控蛋白区的核酸序列tTA结合启动下游基因表达；
图2a、2b、2c、2d分别为靶细胞HGC-27、HGC-27-CLDN18.2、HGC-27-IL13Ra2、HGC-27-CLDN18.2-IL13Ra2的表型流式检测结果；
图3a、3b、3c为SynNotch CAR-T阳性率检测图；其中，图3a为空白对照样；图3b、3c分别为针对靶细胞CAR-T-CLDN18.2、CAR-T-SynNotch的阳性率；
图4a、4b、4c为SynNotch CAR-T细胞体外共培养激活流式图；其中，图4a为T细胞对照样流式图；图4b为CAR-T-SynNotch培养流式图；图4c为CAR-T-SynNotch与HGC27-IL13Ra2共混培养流式图；
图5为SynNotch CAR-T激活后hhIL-15/Ra/Ra超激动蛋白分泌蛋白浓度检测图；
图6a、6b为激活后CAR-T-SynNotch自杀基因诱导凋亡图；其中，图6a为激活后CAR-T-SynNotch的活细胞比例图；图6b为激活后CAR-T-SynNotch加入AP1903药物诱导凋亡6h后的活细胞比例图；
图7a、7b为SynNotch CAR-T扩增生长曲线图；其中，图7a为无抗原HGC 27-IL13Ra2刺激的扩增能力曲线图；图7b为有抗原HGC27-IL13Ra2刺激时的扩增能力曲线图；
图8a、8b、8c、8d为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体外杀伤效果图；其中，图8a的靶细胞为HGC27；图8b的靶细胞为HGC27-IL13Ra2；图8c的靶细胞为HGC27-CLDN18.2；图8d的靶细胞为HGC27-CLDN18.2-IL13Ra2；
图9a、9b为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体外杀伤实验因子浓度曲线图；其中，图9a为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体时分泌细胞因子IFN-γ的浓度曲线图(E:T＝10:1)；图9b为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体时分泌细胞因子IL-2的浓度曲线图(E:T＝10:1)；
图10为SynNotch CAR-T动物实验生存曲线。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明设计原理：
SynNotch结构，属于逻辑门控制元件，构建于嵌合抗原受体免疫细胞中。SynNotch结构作为第一靶点结合元件，当其不与抗原结合时，不表达hIL-15/Ra超激动蛋白分泌蛋白、iCasp9自杀基因和/或嵌合抗原受体基因，此时，免疫细胞处于静息状体可保持长期的记忆性和增殖潜力，不会因过度表达及激活导致提早耗竭；当第一靶点抗原与SynNotch元件上靶点结合域结合后，hIL-15/Ra超激动蛋白基因、iCasp9自杀元件基因和嵌合抗原受体元件基因启动表达，hIL-15/Ra超激动蛋白使免疫细胞在疑似肿瘤组织周围大量增殖，并改善局部微环境，使免疫细胞根据嵌合抗原受体上的第二靶点搜索肿瘤组织进行定点清除；并为防止潜在的严重毒副反应发生，由iCasp9自杀元件介导的免疫细胞凋亡可有效组织毒副反应进展保证患者安全；该设计最大限度的兼顾了细胞因子的增幅效果，多靶点的靶向效果及安全性，用以达成增强免疫细胞的增殖能力、抗凋亡能力和对于肿瘤的杀伤能力；本发明的免疫细胞杀伤效果精准，安全性更高，不易复发，提高患者的生存质量。
本发明提供了一种通过SynNotch结构进行逻辑控制的嵌合抗原受体免疫细胞。在调控过程中SynNotch结构的第一靶点与被调控基因结合后，SynNotch功能激活，水解脱离的启动蛋白启动自分泌hIL-15/Ra超激动蛋白基因、CAR结构基因及iCas9自杀基因的表达，此时免疫细胞接受hIL-15/Ra超激动蛋白刺激增强增殖、浸润及抗凋亡能力，并且iCas9自杀基因表达可随时人工清除该嵌合抗原受体免疫细胞，以防副反应的发生；当第二靶点即CAR结构靶向靶点结合后激活免疫细胞免疫反应对肿瘤造成杀伤效果。
上述逻辑门控制的嵌合抗原受体免疫细胞，其细胞膜表面表达SynNotch结构，该结构同时调控hIL-15/Ra超激动蛋白基因、iCas9自杀基因及嵌合抗原受体结构基因的表达。
免疫细胞本身并不会表达上述提及的融合蛋白，但为了使免疫细胞分泌该融合蛋白，就需经过相应的基因编辑，如，CAR-T、CAR-NK、TCR-T、IPS等用于肿瘤治疗的细胞，它们本身已是经过相应基因编辑了，再使其分泌融合蛋白也进行相应基因编辑，这类细胞在此统称为经过基因编辑的免疫细胞。
本发明中，SynNotch结构膜表达于免疫细胞表面，且SynNotch结构包括第一靶点结合区域、Notch core区、启动调控蛋白区，被调控基因序列(如，hIL-15/Ra超激动蛋白基因、CAR结构基因及iCas9自杀基因等序列)前包括有与SynNotch结构的启动调控蛋白区的核酸序列相一致的核酸序列。SynNotch结构中的启动调控蛋白包括GAL4-VP64-UAS、tetR-tTA中的一种。
本发明中，由SynNotch结构调控的hIL-15/Ra超激动蛋白为分泌蛋白，其结构是IL-15N72D、G4S*4Linker和IL-15RaSu顺序依次串联表达的。
本发明中，由SynNotch结构调控的嵌合抗原受体膜表达于免疫细胞表面，嵌合抗原受体为信号肽、第二靶点结合区域、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区、CD3zeta激活区；其中，第二靶点结合区域与SynNotch结构中的第一靶点结合区域不同，以达到多靶点靶向及逻辑控制目的。
上述第一靶点及第二靶点包括IL-13Rα2、CLDN18.2、GPC3、HER2、TAA、GD2、MSLN、EGFR、NY-ESO-1、MUC1、PSMA和EBV中的一种或几种。并且第一靶点结合区域及第二靶点结合区域形式包括scFv、Fab、单域抗体中的一种或几种或其组合形式。
本发明，由SynNotch结构调控的自杀开关iCASP9膜表达于免疫细胞表面，可通过AP1903小分子药物诱导免疫细胞凋亡。
含SynNotch结构的免疫细胞中，SynNotch基因分别与超激动蛋白基因、嵌合抗原受体基因和自杀基因的融合是通过构建表达框的方式来实现。
本发明免疫细胞中，SynNotch基因、超激动蛋白基因、嵌合抗原受体基因和自杀基因需分别构建表达框进行基因表达，各基因表达框可构建于同一载体中，也可以构建于多个载体中。
本发明免疫细胞中，各基因构建表达框时的载体递送方式包括慢病毒、逆转录病毒、普通质粒、附加体、纳米递送系统、电转导或转座子中的一种或几种。
本发明的免疫细胞包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、gamma-delta T细胞、TIL细胞、TCR-T细胞或其它肿瘤杀伤细胞。
上述表达SynNotch调控结构的免疫细胞，可被制成生物制剂，该生物制剂为药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
生物制剂的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。该生物制剂可应用于预防和/或治疗实体肿瘤的药物中。
本发明提供的免疫细胞同时解决了传统CAR结构的常时激活导致的免疫细胞提前耗竭问题、免疫细胞的增殖浸润问题、免疫细胞的过度杀伤及可能发生严重副反应的问题和肿瘤微环境的改善问题，极大的提高了免疫细胞增殖能力、抗凋亡能力、对于肿瘤的杀伤能力及免疫细胞治疗的安全性。
以下为具体实施例说明。
下列实施例，以外周血中T细胞制备CAR-T表达SynNotch调控结构为例，对免疫细胞的制备方法及功能验证等进行详细说明。
(一)、免疫细胞的制备方法具体包括以内容：
1、融合蛋白的结构设计；
2、构建表达SynNotch调控结构的CAR-T细胞并进行体外功能试验；
3、表达SynNotch调控结构的CAR-T细胞体内功能试验。
具体实施过程如下：
1、融合蛋白的结构设计
按照图1a、1b所示的结构图，设计如A#～D#中的SynNotch调控结构，并将其设计到CAR-T载体中，并命名为CAR-T-SynNotch；其中，图1a中，启动调控蛋白区为调控蛋白；A#～D#中的结构为SynNotch调控序列，使用GAL4-VP64调控蛋白与调控蛋白区的五个UAS重复(表示UAS*5)核酸序列结合启动下游基因表达；E#为对照CAR结构设计图；图1b中，启动调控蛋白区为tetR调控蛋白；1#～4#中的结构为SynNotch调控序列，使用tetR调控蛋白与启动调控蛋白区的核酸序列tTA结合启动下游基因表达。
图1a中，A#为SynNotch门逻辑调控元件的结构示意图；其中，anti-IL13Ra2 scFv、Notch core、GAL4-VP64分别位于SynNotch结构的第一靶点结合区域、Notch core区和启动调控蛋白区中；T2A为嵌合抗原受体(CAR)与融合蛋白之间的蛋白分割功能元件；
B#为SynNotch门逻辑调控hIL-15/Ra超激动蛋白结构示意图；其中，UAS*5为hIL-15/Ra超激动蛋白的调控蛋白区的核酸序列，该UAS*5核酸序列与Syn Notch结构的GAL4-VP64核酸序列匹配结合，实现SynNotch结构调控hIL-15/Ra超激动蛋白分泌蛋白；
C#为SynNotch门逻辑调控嵌合抗原受体(CAR)结构示意图；其中，UAS*5为嵌合抗原受体的调控蛋白区的核酸序列，该UAS*5核酸序列与SynNotch结构的GAL4-VP64核酸序列匹配结合，实现SynNotch结构调控嵌合抗原受体的表达；
D#为SynNotch门逻辑调控iCas9自杀基因结构示意图；其中，UAS*5为iCas9自杀基因的调控蛋白区的核酸序列，该UAS*5核酸序列与SynNotch结构的GAL4-VP64核酸序列匹配结合，实现SynNotch结构调控iCas9自杀基因的表达；
E#为对照CAR-T结构，并命名为CAR-T-CLDN18.2；其中，嵌合抗原受体的结构中包括信号肽CD8SP、跨膜结构域CD8Hinger、CD8TM、胞内激活元件4-1BB及CD3Zeta中的一种或多种。
图1b中，1#为SynNotch门逻辑调控元件的结构示意图；其中，anti-IL13Ra2 scFv、Notch core、tetR分别位于SynNotch结构的第一靶点结合区域、Notch core区和启动调控蛋白区中；T2A为嵌合抗原受体(CAR)与融合蛋白之间的蛋白分割功能元件；
2#为SynNotch门逻辑调控hIL-15/Ra超激动蛋白结构示意图；其中，tTA为hIL-15/Ra超激动蛋白的调控蛋白区的核酸序列，该tTA核酸序列与SynNot ch结构的tetR核酸序列匹配结合，实现SynNotch结构调控hIL-15/Ra超激动蛋白分泌蛋白；
3#为SynNotch门逻辑调控嵌合抗原受体(CAR)结构示意图；其中，tTA为嵌合抗原受体的调控蛋白区的核酸序列，该tTA核酸序列与SynNotch结构的tetR核酸序列匹配结合，实现SynNotch结构调控嵌合抗原受体的表达；
4#为SynNotch门逻辑调控iCas9自杀基因结构示意图；其中，tTA为iCas9自杀基因的调控蛋白区的核酸序列，该tTA核酸序列与SynNotch结构的tetR核酸序列匹配结合，实现SynNotch结构调控iCas9自杀基因的表达。
2、构建分泌型CAR-T细胞并进行体外功能试验
2.1、细胞系培养
将表达CLDN18.2和IL-13Ra2的碱基序列分别克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中，置于EF1α(EF-1α)的启动子下，形成PHBLV-EF1α-CLDN18.2和PHBLV-EF1α-IL-13Ra2，将PHBLV-EF1α-CLDN18.2/PHBLV-EF1α-IL-13Ra2、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)等三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T细胞中制备的慢病毒完整表达载体上；分别在48h和72h收集病毒上清，并对所收集的病毒上清进行超速离心浓缩(Merck Millipore)；浓缩后的病毒即可用于感染HGC-27，最终得到过表达CLDN18.2和/或IL-13Ra2的HGC-27细胞系，分别命名为HGC-27-CLDN18.2、HGC-27-IL13Ra2、HGC-27-CLDN18.2-IL13Ra2。
如图2a、2b、2c、2d所示，分别为靶细胞HGC-27、HGC-27-CLDN18.2、HGC-27-IL13Ra2、HGC-27-CLDN18.2-IL13Ra2等四个细胞系表达CLDN18.2和IL-13Ra2的检测结果；其中，HGC-27对应的检测图为阴性对照图，用以划分阴性区域；图2a、2b、2c、2d中，Q1-LL区为CLDN18.2和IL-13Ra2双阴性；Q1-LR区为CLDN18.2阳性和IL-13Ra2阴性；Q1-UL区为CLDN18.2阴性和IL-13Ra2阳性；Q1-UR区为CLDN18.2和IL-13Ra2双阳性。该检测结果表明，HGC-27细胞为CLDN18.2和IL-13Ra2双阴性；HGC-27-CLDN18.2细胞为CLDN18.2表达阳性；HGC-27-IL13Ra2细胞为IL13Ra2表达阳性。HGC-27-CLDN18.2-IL13Ra2细胞为CLDN18.2和IL-13Ra2双阳性。
S200：外周血PBMC的分离和T细胞的扩增
从供体外周血中分离单个核细胞，使用ficol法进行密度梯度离心，并用T细胞分选试剂盒富集T细胞，如，CD3 MicroBeads、human-lyophilized或130-097-043，并使用偶联anti-CD3/anti-CD28的磁珠激活培养和扩增T细胞；这些都是现有技术，在此不再赘述。
T细胞培养时，使用TexMACS GMP Medium(Miltenyi Biotec，170-076-309)培养基，培养基中含10％FBS、2mM L-glutamine及100IU/ml rhIL2，细胞培养时均置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养；培养周期为13天，静置培养，期间每隔2天左右补液一次，补液量根据细胞数量来决定。
2.2、CAR-T-SynNotch细胞阳性率、SynNotch调控能力、分泌能力、自杀元件及增殖能力评价
通过慢病毒包装并侵染T细胞制备得到的CAR-T，所获得的CAR-T的阳性率检测结果，如图3a、3b、3c所示，其中，图3a为空白对照样；图3b、3c分别为针对靶细胞CAR-T-CLDN18.2、CAR-T-SynNotch的阳性率。结果显示，以T细胞作为阴性对照，慢病毒侵染方法，可以有效制备出CAR-T细胞阳性率分别83.35％和78.25％(阳性率大于50％)，并且CAR-T-CLDN18.2、CAR-T-SynNotch细胞阳性率接近，无明显差异。
SynNotch结构调控能力激活情况,如图4a、4b、4c所示，其中，图4a为T细胞对照样流式图；图4b为CAR-T-SynNotch培养流式图；图4c为CAR-T-SynNotch与HGC27-IL13Ra2共混培养流式图；图4a中为T细胞对照，用于划分阴性区域；图4a、4b、4c中，Q1-LL区为CLDN18.2-CAR和IL-13Ra2-SynNotch双阴性；Q1-LR区为CLDN18.2-CAR阳性和IL-13Ra2-SynNotch阴性；Q1-UL区为CLDN18.2-CAR阴性和IL-13Ra2-SynNotch阳性；Q1-UR区为CLDN18.2-CAR和IL-13Ra2-SynNotch双阳性。图4b中显示CAR-T-SynNotch细胞中，SynNotch结构为常时表达，在未接受刺激时CLDN18.2-CAR表达为阴性；图4c中显示CAR-T-SynNotch与HGC27-IL13Ra2细胞共培养后，常时表达的SynNotch结构接受刺激，CLDN18.2-CAR表达转为阳性。
图5为激活后CAR-T-SynNotch细胞的hIL-15/Ra超激动蛋白分泌能力检测，如图5所示，未激活CAR-T-SynNotch细胞，无hIL-15/Ra超激动蛋白分泌；CAR-T-SynNotch细胞与HGC27-IL13Ra2细胞共培养后激活了CAR-T-SynNotch细胞，可分泌hIL-15/Ra超激动蛋白。
图6a、6b为激活后CAR-T-SynNotch细胞iCASP9自杀元件调控细胞凋亡能力检测。图6a中，框选部分为激活后CAR-T-SynNotch的活细胞比例，占比82.90％；图6b中，框选部分为激活后CAR-T-SynNotch加入AP1903药物诱导凋亡6h后的活细胞比例，占比24.01％，并且经检测活细胞均为T细胞，被激活表达iCASP9自杀元件的CAR-T-SynNotch细胞已全部凋亡。
增殖情况如图7a、7b所示，图7a中在无抗原刺激的情况下，CAR-T-CLDN18.2与CAR-T-SynNotch表现出基本相同的扩增能力；在图7b中，加入HGC27-IL13Ra2共培养刺激时，CAR-T-SynNotch的调控能力被激活，开始分泌表达hIL-15/Ra超激动蛋白，刺激CAR-T-SynNotch具有更高的细胞增殖倍数，证明其有更优异的细胞增殖能力。
2.3、细胞体外杀伤实验
使用HGC-27、HGC-27-CLDN18.2、HGC-27-IL13Ra2、HGC-27-CLDN18.2-IL13Ra2细胞分别作为阳性和阴性靶细胞，采用流式检测方法对CAR-T体外杀瘤功能进行验证。
如图8a、8b、8c、8d所示,其中，图8a的靶细胞为HGC27；图8b的靶细胞为HGC27-IL13Ra2；图8c的靶细胞为HGC27-CLDN18.2；图8d的靶细胞为HGC27-CLDN18.2-IL13Ra2。
图8a、8b、8c、8d的检测结果显示，CAR-T-CLDN18.2对CLDN18.2表达阳性的HGC-27-CLDN18.2和HGC-27-CLDN18.2-IL13Ra2细胞显示出特异性的杀伤效果，对HGC-27和HGC-27-IL13Ra2无杀伤效果；相比之下，CAR-T-SynNotch细胞仅对HGC-27-CLDN18.2-IL13Ra2细胞进行特异性杀伤，对HGC-27、HGC-27-CLDN18.2和HGC-27-IL13Ra2无杀伤效果，显示出SynNotch结构的逻辑控制能力仅对IL13Ra2和CLDN18.2双阳细胞进行特异性杀伤，并且CAR-T-SynNotch相较CAR-T-CLDN18.2对HGC-27-CLDN18.2-IL13Ra2靶细胞具有更强的杀伤效果。
如图9a、9b为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体外杀伤实验因子浓度曲线图；其中，图9a为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体时分泌细胞因子IFN-γ的浓度曲线图(效靶比E:T＝10:1)；图9b为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体时分泌细胞因子IL-2的浓度曲线图(效靶比E:T＝10:1)。
检测结果显示，CAR-T-SynNotch对非靶向细胞无细胞因子释放，并且CAR-T-SynNotch相较CAR-T-CLDN18.2对HGC-27-CLDN18.2-IL13Ra2靶细胞具有更强的IL-2和IFN-r的细胞因子释放能力，该结果与杀伤实验结果相同。
3、CAR-T细胞体内功能评价
3.1、细胞体内杀伤实验
取6-8周龄NSG小鼠(体重18-22g)30只，适应饲养一周后，皮下接种HGC-27-CLDN18.2-IL13Ra2肿瘤细胞株，每只小鼠接种5*106个肿瘤细胞，密切观察动物状态，每三天使用游标卡尺测量小鼠肿瘤体积，当肿瘤体积达到100mm3，根据小鼠体重和肿瘤大小随机分组后，经尾静脉输注CAR-T细胞或对照T细胞。详细的给药方法、给药剂量和给药途径见表1所示。
表1动物实验方案
Figure GDA0004184870070000141
如图10所示，CAR-T-SynNotch可以大幅延长小鼠生存期。
以上实施例证明：SynNotch结构调控的CAR-T相对于一般结构的CAR-T具有更强的增殖能力及对肿瘤的体内体外杀瘤活性，由SynNotch结构调控具有更强的靶向性，并且由自杀元件控制大大提升安全性。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种包含SynNotch结构的组合物，其特征在于，所述组合物包括：SynNotch结构的启动调控蛋白区、启动调控蛋白区分别调控的hIL-15/Ra超激动蛋白分泌蛋白基因、iCas9自杀基因和嵌合抗原受体基因；其中，所述启动调控蛋白区包括anti-IL13Ra2 scFv、Notchcore及GAL4-VP64调控蛋白；被所述启动调控蛋白区调控的所述超激动蛋白基因序列、iCas9自杀基因序列及嵌合抗原受体基因序列前面分别包含有启动调控序列区，所述启动调控序列区中包含有五个UAS重复核酸序列；所述启动调控序列区的五个UAS重复核酸序列与所述启动调控蛋白区中GAL4-VP64调控蛋白的核酸序列相匹配结合时，所述GAL4-VP64调控蛋白与所述启动调控序列区的五个UAS重复核酸序列结合启动基因表达，实现SynNotch结构分别调控hIL-15/Ra超激动蛋白分泌蛋白的表达、iCas9自杀基因的表达和嵌合抗原受体的表达。
2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒含有权利要求1所述的包含SynNotch结构的组合物。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的包含SynNotch结构的组合物、或者含有权利要求2所述的表达盒。
4.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物含有权利要求1所述的包含SynNotch结构的组合物、或者含有权利要求2所述的表达盒、或者含有权利要求3所述的载体。
5.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞含有权利要求1所述的包含SynNotch结构的组合物、或者含有权利要求2所述的表达盒、或者含有权利要求3所述的载体。
6.根据权利要求5所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞中，SynNotch结构包含有第一靶点结合区域；当所述免疫细胞中，SynNotch结构调控嵌合抗原受体时，该嵌合抗原受体包含有第二靶点结合区域；第一靶点结合区域和第二靶点结合区域分别包含有第一靶点和第二靶点；所述第一靶点及第二靶点分别为IL-13Rα2和CLDN18.2。
7.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂含有权利要求1所述的包含SynNotch结构的组合物、或者含有权利要求2所述的表达盒、或者含有权利要求3所述的载体、或者含有权利要求5或6所述的免疫细胞。
8.根据权利要求7所述的生物制剂在制备治疗和/或预防胃癌药物方面的应用。
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