CN115505601A - 一种两级SynNotch逻辑调控结构及其应用 - Google Patents

一种两级SynNotch逻辑调控结构及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种两级SynNotch逻辑调控结构及其应用；该两级SynNotch逻辑调控结构包括靶点结合区域、Notch core区和启动调控蛋白区，且该两级SynNotch逻辑调控结构分为一级SynNotch逻辑调控结构和二级SynNotch逻辑调控结构，而二级SynNotch逻辑调控结构的表达受到一级SynNotch逻辑调控结构的调控。该发明两级SynNotch可以使免疫细胞形成浸润效果，解决了传统CAR结构的常时激活导致的免疫细胞提前耗竭问题、免疫细胞的增殖浸润问题、免疫细胞的过度杀伤及可能发生严重副反应的问题和肿瘤微环境的改善问题，极大的提高了对于肿瘤的杀伤能力及免疫细胞治疗的安全性。

Description

一种两级SynNotch逻辑调控结构及其应用
技术领域
本发明涉及细胞基因改造技术领域，尤其涉及一种两级SynNotch逻辑调控结构及其应用。
背景技术
肿瘤（tumour）是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物（neogrowth），因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物（neoplasm）。其中，恶性肿瘤因易发生转移，治疗后易复发且在某些特殊的微环境下导致极难治愈。
IL-7是由骨髓基质细胞分泌的糖蛋白，分子量为25KD；其基因位于第8号染色体。现多采用基因工程手段，从转染含IL-7CDna表达性质粒的哺乳类细胞培养上清中获取IL-7。IL-7的靶细胞主要为淋巴细胞，对来自人或小鼠骨髓的B祖细胞、胸腺细胞及外周成熟的T细胞等均有促生长活性。其功能有：①与干细胞生长因子（SCF）协同能够刺激b前体发生有丝分裂，这一效应可被TGF所抑制；但对B祖细胞（pro-B）的生长没有明显作用。②促进双阴性胸腺细胞的成熟，提供胚胎胸腺细胞发育过程中TCR基因重组的始动信号；但对成熟T细胞无明显作用。③诱导胸腺细胞或外周血淋巴细胞产生LAK细胞活性，其效应细胞主要为CD8+亚群；但IL-7诱导的LAK细胞不具有NK活性。④IL-7能刺激髓样前体细胞和巨核细胞产生集落形成单位和血小板，使机体从环磷酰胺的免疫抑制作用中恢复过来；在较高浓度时，IL-7还能增强巨噬细胞的细胞毒活性，诱导单核细胞分泌细胞因子。
CCL-19 属于 CC 类趋化因子，又称 EB 病毒诱导分子( EBV-induced molecule1 ligand chemokine，ELC)或人巨噬细胞炎性蛋白 3β (macrophage inflammatoryprotein-7eta，MIP-3β)，编码基因定位于9号染色体短臂上，主要在次级淋巴组织和器官如脾和淋巴结的T细胞中表达，趋化幼稚T细胞和成熟DC细胞。有研究发现，CCL-19在抗肿瘤中起诱导T细胞、DC细胞和NK细胞作用，这类免疫细胞浸润到肿瘤组织中各自发挥免疫功能，如细胞毒性、抗原提呈、吞噬和分泌细胞因子来抑制肿瘤生长。在特定的环境下，免疫细胞识别并攻击肿瘤细胞，从而发挥抗肿瘤作用。近年来也有研究发现，CCL-19 可直接与CCR-7受体结合激活受体后通路抑制肿瘤增殖、迁移及侵袭。
幽门螺杆菌（Hp）中性粒细胞激活蛋白（Neutrophil activating protein，NAP）是Hp感染所致胃炎的重要致病因子之一，它促进了炎性细胞中性粒细胞、单核细胞在胃黏膜的聚集，并释放大量的炎症因子，同时诱导氧化活性产物的产生，导致胃黏膜损伤。然而，NAP具有多种生物活性，它可作为配体，激活 Toll样受体（Toll Like receptor，TLR2）促使以分泌IFN-γ为主的Th1免疫应答并抑制Th2免疫反应，为支气管哮喘、过敏等Th2免疫为主的疾病提供了新的治疗手段。同时有学者发现NAP通过激活细胞毒Th1免疫应答抑制了小鼠膀胱癌、肝癌的生长。
传统的Notch信号通路包括Notch受体、Notch配体、细胞内效应分子、DNA结合蛋白、受调控的下游基因等。Notch受体是跨膜受体，当胞外域结合到Notch配体后，细胞运动致使s2位点暴露，被金属蛋白酶等识别切割，释放胞内段入核，从而启动下游基因表达。Wendella.Lim团队改造了鼠的Notch1受体，将其胞外域用单链抗体或者纳米抗体替换，胞内域用转录激活或转录抑制的结构域替换，仅保留了可以被蛋白酶识别切割的跨膜核心域，还配备了下游被调控的基因元件。针对不同的疾病或者肿瘤抗原，胞外域采用特异识别该抗原的抗体单链，而胞内域调控预先设定的目标基因或因子的表达。难得的是，在同一细胞中可以设计由不同抗原启动的基因调控环路，并具有很好的正交性。SynNotch系统可以被应用到许多细胞类型中，包括神经细胞、免疫细胞。CAR-T技术和SynNotch系统组合应用到T细胞改造中，可以实现T细胞的“与”门激活，即只有当细胞同时表达两种特定的表面抗原时，才能将T细胞激活。改变SynNotch下游调控的基因元件，T细胞可以在接触特定抗原后，分泌单链抗体、细胞因子等等具有治疗作用的因子，并且在体外、体内都具有抗肿瘤的作用。可见SynNotch受体系统，在细胞改造中具有极大的技术优势。
近几年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，尤其是过继性细胞疗法（ACT），即指从病人体内分离出T细胞、NK细胞等免疫细胞，通过体外修饰扩增培养，随后回输入患者体内进行肿瘤治疗的方法。2013年，肿瘤的免疫疗法被Science杂质评为“十大突破”之首。
CAR-T和TCR-T是过继性细胞疗法重要的组成部分，尤其CAR-T疗法，在血液肿瘤的治疗上取得了显著的成就，取得了较高的缓解率，典型的CAR结构由三部分组成，胞外识别肿瘤抗原的scFv、铰链和跨膜结构域、胞内共刺激信号和激活结构域。第一代的CAR并不包含胞内共刺激信号，CAR-T细胞的杀伤活性较低且生存时间较短。因此，第二代CAR开始加入共刺激信号如CD28和4-1BB，采用不同的共刺激信号的CAR-T细胞的特性也不尽相同，CD28增强了CAR-T细胞的杀伤活性而4-1BB则增强CAR-T细胞杀伤活性的同时延长了CAR-T细胞的生存时间。随后，出现了共同表达两个共刺激信号域的三代CAR，然而其抗肿瘤效果并不如二代CAR-T。因此，现在临床应的主要为二代CAR-T细胞。
CAR-T疗法不仅在血液肿瘤治疗的药物中成果显著，而且商业化进展顺利，美国FDA于2017年正式批准了两种CAR-T药品上市。尽管CAR-T细胞疗法在血液肿瘤治疗药物中大放异彩，但对于实体瘤却并没有较好的治疗效果，存在缓解率低且容易发生脱靶等毒副作用。
提高抗肿瘤免疫治疗的疗效也可以针对相关的间质细胞的良性肿瘤完成。这些细胞分泌生长因子、细胞因子和趋化因子、促进肿瘤生长、转移和血管生成。间质成纤维细胞活化蛋白（FAP），是一种的丝氨酸蛋白酶，在上皮癌90%选择性表达。三个不同的研究单位都报道了使用抗FAP CAR T细胞的疗效。靶向FAP的多模式抗肿瘤作用的潜力，给出了合理的且有趣的未来的治疗方法包括带有抗肿瘤T细胞或检查站封锁的抗基质CAR T细胞的使用。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种可以调控IL-7和CCL-19细胞因子分泌、NAP免疫刺激蛋白分泌、嵌合抗原受体表达及iCasp9自杀基因表达的两级SynNotch调控结构及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种两级SynNotch逻辑调控结构，可以调控IL-7和CCL-19细胞因子的分泌、NAP免疫刺激蛋白的分泌、嵌合抗原受体表达及iCasp9自杀基因的表达；该两级SynNotch逻辑调控结构分为一级SynNotch逻辑调控结构和二级SynNotch逻辑调控结构，且二级SynNotch逻辑调控结构的表达受到一级SynNotch逻辑调控结构的调控；所述SynNotch逻辑调控结构包括靶点结合区域、Notch core区和启动调控蛋白区。
在其中一个实施例中，所述启动调控蛋白区中，包括有调控蛋白GAL4-VP64和tetR中的任一种；其中，调控蛋白GAL4-VP64对应一级SynNotch逻辑调控结构的启动调控蛋白区，为第一启动调控蛋白；调控蛋白tetR对应二级SynNotch逻辑调控结构的启动调控蛋白区，为第二启动调控蛋白。
在其中一个实施例中，所述一级SynNotch逻辑调控结构的靶点结合区域为第一靶点，该靶点靶向FAP蛋白；SynNotch逻辑调控结构的启动调控蛋白区为第一启动调控蛋白GAL4-VP64。
在其中一个实施例中，所述一级SynNotch逻辑调控结构用于调控靶向第二靶点CLDN18.2的嵌合抗原受体基因、IL-7和CCL-19细胞因子基因、iCas9自杀基因及二级SynNotch逻辑调控结构基因表达。
在其中一个实施例中，被调控靶向第二靶点CLDN18.2的嵌合抗原受体基因、IL-7和CCL-19细胞因子基因、iCas9自杀基因及二级SynNotch基因序列前分别包含有可与所述第一启动调控蛋白GAL4-VP64相匹配结合第一调控蛋白结合区的核酸序列UAS。
在其中一个实施例中，所述二级SynNotch逻辑调控结构的靶点结合区域为第二靶点，该靶点靶向CLDN18.2蛋白，该二SynNotch逻辑调控结构启动调控蛋白区为第二启动调控蛋白tetR。
在其中一个实施例中，所述二级SynNotch逻辑调控结构用于调控NAP蛋白基因表达。
在其中一个实施例中，被调控的NAP蛋白基因序列前包含有可与所述第二启动调控蛋白tetR相匹配结合第二调控蛋白结合区的核酸序列tTA。
在其中一个实施例中，所述嵌合抗原受体膜表达于免疫细胞表面、嵌合抗原受体结构为信号肽、第二靶点结合区域、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区、CD3zeta激活区；其中，第二靶点结合区域与第一靶点结合区域不同，以达到多靶点靶向及逻辑控制目的。
在其中一个实施例中，第一靶点及第二靶点分别为FAP和CLDN18.2。
在其中一个实施例中，所述第一靶点结合区域及第二靶点结合区域结合形式包括scFv、Fab、或scFv与Fab组合转中的任一种或多种。
在其中一个实施例中，所述iCASP9膜表达于免疫细胞表面，可通过AP1903小分子药物诱导免疫细胞凋亡。
在其中一个实施例中，一种表达盒，包含有SynNotch逻辑调控结构。
在其中一个实施例中，一种载体，包含有表达盒或者SynNotch逻辑调控结构。
在其中一个实施例中，所述重组细胞系中，SynNotch基因、NAP蛋白基因、细胞因子及趋化因子基因、嵌合抗原受体基因和自杀基因的融合是通过构建表达框的方式来实现。
在其中一个实施例中，所述重组细胞系中，SynNotch基因、NAP蛋白基因、细胞因子及趋化因子基因、嵌合抗原受体基因和自杀基因需分别构建表达框进行基因表达，各基因表达框可构建于同一载体或多个载体中。
在其中一个实施例中，所述重组细胞系中，优选免疫细胞，所述免疫细胞中的各基因构建表达框时的载体递送方式包括慢病毒、逆转录病毒、普通质粒、附加体、纳米递送系统、电转导或转座子中的一种或几种。
在其中一个实施例中，所述重组细胞系含有SynNotch逻辑调控结构、表达盒、或者载体。
在其中一个实施例中，一种生物制剂，包括SynNotch逻辑调控结构基因编码的核酸或者氨基酸序列构建的表达盒、载体或重组细胞系等，其中，重组细胞系优选为免疫细胞。
本发明还提供生物制剂在预防和/或治疗癌症或肿瘤生物制剂中的应用，如，生物制剂具体为药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂上的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、两级SynNotch调控结构中的第一级SynNotch逻辑调控结构靶向肿瘤基质中的FAP蛋白，可初步使嵌合抗原受体免疫细胞，如CAR-T细胞形成浸润效果，如，①IL-7促进CAR-T增殖；②CCL-19趋化因子可对周围免疫细胞进行招募，提升自身免疫杀瘤效果、③第二级SynNotch逻辑调控结构及嵌合抗原受体均靶向CLDN18.2，使得CAR-T在浸润非靶向组织时，不会激活二级SynNotch调控产生不必要的炎症反应及CAR-T激活形成非特异杀伤；④iCasp9自杀基因表达可及时诱导CAR-T凋亡，避免严重副反应产生；
2、第一级SynNotch逻辑调控结构可以调控IL-7和CCL-19细胞因子的分泌、靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体的表达以及iCasp9自杀基因和第二级SynNotch逻辑调控结构的表达；
3、第二级SynNotch逻辑调控结构可以调控NAP蛋白表达，仅在CAR-T浸润至肿瘤组织中由CLDN18.2抗原激活时才产生NAP蛋白分泌，并形成局部炎症反应提升CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力。
本发明设计的这种由两级SynNotch元件调控的免疫细胞，如CAR-T细胞，可提升CAR-T细胞的浸润效果，避免免疫细胞过度表达提前耗竭，同时IL-7细胞因子分泌可达成增强免疫细胞增殖能力、抗凋亡能力和对于肿瘤的杀伤能力，CCL-19可招募其他免疫细胞提升自身免疫效果，NAP蛋白可在肿瘤组织形成局部炎症提升杀瘤效果；SynNotch逻辑调控结构与嵌合抗原受体配合，可达成多靶点调控免疫细胞激活的效果，解决脱靶问题；并且若发生严重毒副作用，iCasp9自杀基因的存在可使用AP1903小分子药物诱导免疫细胞凋亡。
附图说明
图1为免疫细胞中的细胞因子、蛋白和氨基酸序列结构设计图；
图2为靶细胞HGC-27的表型流式检测图；
图3为靶细胞HGC-27-FAP的表型流式检测图；
图4为靶细胞HGC-27-CLDN18.2的表型流式图；
图5为靶细胞HGC-27-CLDN18.2-FAP的表型流式图；
图6为空白对照样阳性率流式检测图；
图7为针对靶细胞CAR-T-CLDN18.2的阳性率流式图；
图8为针对靶细胞CAR-T-SynNotch的阳性率流式图；
图9为T细胞对照样流式图；
图10为CAR-T-SynNotch培养流式图；
图11为CAR-T-SynNotch与HGC27-FAP共混培养流式图；
图12为CAR-T-SynNotch与HGC27-CLDN18.2-FAP共混培养流式图；
图13为 SynNotch CAR-T由HGC27-FAP细胞激活后，IL-7细胞因子分泌浓度检测图；
图14为 SynNotch CAR-T由HGC27-FAP细胞激活后，CCL-19细胞因子分泌浓度检测图；
图15为 SynNotch CAR-T由HGC27-CLDN18.2-FAP细胞激活后，NAP蛋白分泌浓度检测图；
图16为激活后CAR-T-SynNotch的活细胞比例图；
图17为激活后CAR-T-SynNotch加入AP1903药物诱导凋亡6h后的活细胞比例图；
图18为无抗原HGC27-FAP刺激的扩增能力曲线图；
图19为有抗原HGC27-FAP刺激时的扩增能力曲线图；
图20的靶细胞为HGC27对肿瘤细胞体外杀伤效果图;
图21的靶细胞为HGC27-FAP对肿瘤细胞体外杀伤效果图;
图22的靶细胞为HGC27-CLDN18.2对肿瘤细胞体外杀伤效果图;
图23的靶细胞为HGC27-CLDN18.2-FAP对肿瘤细胞体外杀伤效果图;
图24为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体外杀伤时分泌细胞因子IFN-γ的浓度曲线图（E:T=10:1）；
图25为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体外杀伤时分泌细胞因子IL-2的浓度曲线图（E:T=10:1）;
图26为SynNotch CAR-T动物实验生存曲线图；
图27为SynNotch CAR-T动物实验中DPBS组中T细胞浸润情况检测图；
图28为SynNotch CAR-T动物实验中T细胞组中T细胞浸润情况检测图；
图29为SynNotch CAR-T动物实验中CAR-T-CLDN18.2细胞组中CAR-T细胞浸润情况检测图；
图30为SynNotch CAR-T动物实验中CAR-T-SynNotch细胞组中CAR-T细胞浸润情况检测图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明设计原理：
SynNotch逻辑调控结构，属于逻辑门控制元件，构建于嵌合抗原受体免疫细胞中。两级SynNotch调控结构中第一级SynNotch逻辑调控结构作为第一靶点FAP结合元件，当其不与抗原结合时，不表达IL-7和CCL-19分泌细胞因子基因、iCasp9自杀基因、嵌合抗原受体基因和第二级SynNotch逻辑调控结构基因，此时，免疫细胞处于静息状体可保持长期的记忆性和增殖潜力，不会因过度表达及激活导致提早耗竭；当第一靶点抗原与第一级SynNotch元件上靶点结合域结合后，IL-7和CCL-19分泌细胞因子基因、iCasp9自杀基因、嵌合抗原受体基因和第二级SynNotch逻辑调控结构基因启动表达，IL-7细胞因子使免疫细胞在疑似肿瘤组织周围大量增殖，同时CCL-19趋化因子招募周围免疫细胞浸润疑似肿瘤组织并改善局部微环境，并且若该浸润组织为非第二靶点靶向的肿瘤组织，其不会启动第二级SynNotch逻辑调控结构和嵌合抗原受体结构，造成不必要的炎症反应和CAR-T细胞的过度激活及非特异性杀伤；当浸润部位为第二靶点靶向的CLDN18.2阳性肿瘤组织时，其抗原使第二级SynNotch逻辑调控结构激活，表达分泌的NAP蛋白进一步改善肿瘤局部微环境，刺激招募而来的免疫细胞进行细胞因子分泌，造成局部炎症，提升自身免疫对肿瘤细胞的抑制及杀伤作用，同时免疫细胞根据嵌合抗原受体上的第二靶点搜索肿瘤组织进行定点清除；并为防止潜在的严重毒副反应发生，由iCasp9自杀元件介导的免疫细胞凋亡可有效组织毒副反应进展保证患者安全；该设计最大限度的兼顾了细胞因子的增幅效果，多靶点的靶向效果及安全性，用以达成增强免疫细胞的增殖能力、抗凋亡能力和对于肿瘤的杀伤能力；本发明的免疫细胞杀伤效果精准，安全性更高，不易复发，提高患者的生存质量。
本发明提供了一种通过两级SynNotch逻辑调控结构进行逻辑控制的嵌合抗原受体免疫细胞。在调控过程中第一级SynNotch逻辑调控结构的第一靶点与被调控基因结合后，第一级SynNotch功能激活，水解脱离的启动蛋白启动自分泌IL-7和CCL-19分泌细胞因子基因、iCasp9自杀基因、嵌合抗原受体基因和第二级SynNotch逻辑调控结构基因的表达，此时免疫细胞接受IL-7和CCL-19刺激增强增殖、浸润及抗凋亡能力，并且iCas9自杀基因表达可随时人工清除该嵌合抗原受体免疫细胞，以防副反应的发生；当第二靶点即CAR结构和第二级SynNotch靶向靶点结合后激活NAP免疫刺激蛋白分泌改善肿瘤微环境，并且免疫细胞免疫反应对肿瘤造成杀伤效果。
上述逻辑门控制的嵌合抗原受体免疫细胞，其细胞膜表面表达两级SynNotch逻辑调控结构，第一级SynNotch逻辑调控结构同时调控L-7和CCL-19分泌细胞因子基因、iCasp9自杀基因、嵌合抗原受体基因和第二级SynNotch逻辑调控结构基因的表达，第二级SynNotch逻辑调控结构受第一级SynNotch调控，并且在表达后调控NAP免疫激活蛋白基因的表达。
免疫细胞本身并不会表达上述提及的融合蛋白，但为了使免疫细胞分泌该融合蛋白，就需经过相应的基因编辑，如，CAR-T、CAR-NK、TCR-T、IPS等用于肿瘤治疗的细胞，它们本身已是经过相应基因编辑了，再使其分泌融合蛋白也进行相应基因编辑，这类细胞在此统称为经过基因编辑的免疫细胞。
本发明中，两级SynNotch逻辑调控结构膜表达于免疫细胞表面，且两级SynNotch逻辑调控结构包括靶点结合区域、Notch core区、启动调控蛋白区，被调控基因序列（如，L-7和CCL-19分泌细胞因子基因、iCasp9自杀基因、嵌合抗原受体基因、第二级SynNotch逻辑调控结构基因及NAP蛋白基因等序列）前包括有与SynNotch逻辑调控结构的启动调控蛋白区的核酸序列相一致的核酸序列。SynNotch逻辑调控结构中的启动调控蛋白包括GAL4-VP64-UAS、tetR-tTA中的一种。
本发明中，由两级SynNotch逻辑调控结构调控的IL-7、CCL-19、NAP为分泌蛋白。
本发明中，由两级SynNotch逻辑调控结构调控的嵌合抗原受体膜表达于免疫细胞表面，嵌合抗原受体为信号肽、第二靶点结合区域、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区、CD3zeta激活区；其中，第二靶点结合区域与SynNotch逻辑调控结构中的第一靶点结合区域不同，以达到多靶点靶向及逻辑控制目的。
上述第一靶点及第二靶点包括FAP、IL-13Rα2、CLDN18.2、GPC3、HER2、TAA、GD2、MSLN、EGFR、NY-ESO-1、MUC1、PSMA和EBV中的一种或几种。并且第一靶点结合区域及第二靶点结合区域形式包括scFv、Fab、单域抗体中的一种或几种或其组合形式。
本发明，由两级SynNotch逻辑调控结构调控的自杀开关iCASP9膜表达于免疫细胞表面，可通过AP1903小分子药物诱导免疫细胞凋亡。
含SynNotch逻辑调控结构的免疫细胞中，SynNotch基因分别与IL-7/CCL-19/NAP蛋白基因、嵌合抗原受体基因和自杀基因的融合是通过构建表达框的方式来实现。
本发明免疫细胞中，SynNotch基因、分泌蛋白基因、嵌合抗原受体基因和自杀基因需分别构建表达框进行基因表达，各基因表达框可构建于同一载体中，也可以构建于多个载体中。
本发明免疫细胞中，各基因构建表达框时的载体递送方式包括慢病毒、逆转录病毒、普通质粒、附加体、纳米递送系统、电转导或转座子中的一种或几种。
本发明的免疫细胞包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、gamma-delta T细胞、TIL细胞、TCR-T细胞或其它肿瘤杀伤细胞。
上述表达SynNotch调控结构的免疫细胞，可被制成生物制剂，该生物制剂为药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
生物制剂的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。该生物制剂可应用于预防和/或治疗实体肿瘤的药物中。
本发明提供的免疫细胞同时解决了传统CAR结构的常时激活导致的免疫细胞提前耗竭问题、免疫细胞的增殖浸润问题、免疫细胞的过度杀伤及可能发生严重副反应的问题和肿瘤微环境的改善问题，极大的提高了免疫细胞增殖能力、抗凋亡能力、对于肿瘤的杀伤能力及免疫细胞治疗的安全性。
下列实施例，以外周血中T细胞制备CAR-T表达SynNotch调控结构为例，对免疫细胞的制备方法及功能验证等进行详细说明。具体地，免疫细胞的制备方法具体包括以内容：
1、融合蛋白的结构设计；
2、构建表达SynNotch调控结构的CAR-T细胞并进行体外功能试验；
3、表达SynNotch调控结构的CAR-T细胞体内功能试验。
下面详细描述一下本发明的具体实施过程。
实施例1、融合蛋白的结构设计
按照图1所示的结构图，设计如A#~F#中的两级SynNotch调控结构，并将其设计到CAR-T载体中，命名为CAR-T-SynNotch；其中，A#~F#中的结构为SynNotch调控序列，A#为第一级SynNotch，使用GAL4-VP64调控蛋白与调控蛋白区的核酸序列UAS结合启动下游基因B#~E#表达；E#为第二级SynNotch，使用tetR调控蛋白与调控蛋白区的核酸序列tTA结合启动下游基因F#表达；G#为对照CAR结构设计图。
本实施例中，第一级SynNotch逻辑调控结构中选用的启动调控蛋白区为GAL4-VP64调控蛋白，第二级SynNotch逻辑调控结构中选用的启动调控蛋白区为tetR调控蛋白。
图1中，A#为第一级SynNotch门逻辑调控元件的结构示意图；其中，anti-FAPscFv、Notch core、GAL4-VP64分别位于第一级SynNotch逻辑调控结构的第一靶点结合区域、Notch core区和第一启动调控蛋白区中；P2为各功能蛋白之间的蛋白分割功能元件；
B#为第一级SynNotch门逻辑调控IL-7和CCL-19分泌蛋白结构示意图；其中，UAS*5为IL-7和CCL-19分泌蛋白的调控蛋白区的核酸序列，该UAS*5核酸序列与SynNotch逻辑调控结构的GAL4-VP64核酸序列匹配结合，实现第一级SynNotch逻辑调控结构调控IL-7和CCL-19分泌蛋白；
C#为第一级SynNotch门逻辑调控嵌合抗原受体（CAR）结构示意图；其中，UAS*5为嵌合抗原受体的调控蛋白区的核酸序列，该UAS*5核酸序列与SynNotch逻辑调控结构的GAL4-VP64核酸序列匹配结合，实现SynNotch逻辑调控结构调控嵌合抗原受体的表达；
D#为第一级SynNotch门逻辑调控iCas9自杀基因结构示意图；其中，UAS*5为iCas9自杀基因的调控蛋白区的核酸序列，该UAS*5核酸序列与SynNotch逻辑调控结构的GAL4-VP64核酸序列匹配结合，实现SynNotch逻辑调控结构调控iCas9自杀基因的表达；
E#为第一级SynNotch门逻辑调控第二级SynNotch门逻辑结构示意图；其中，UAS*5为嵌合抗原受体的调控蛋白区的核酸序列，该UAS*5核酸序列与第一级SynNotch逻辑调控结构的GAL4-VP64核酸序列匹配结合，实现第二级SynNotch逻辑调控结构调控嵌合抗原受体的表达。同时，anti-CLDN18.2 scFv、Notch core、tetR分别位于第二级SynNotch逻辑调控结构的第二靶点结合区域、Notch core区和第二启动调控蛋白区中SynNotch逻辑调控结构；
F#为第二级SynNotch门逻辑调控NAP免疫刺激蛋白分泌基因结构示意图；其中，tTA为NAP免疫刺激蛋白基因的调控蛋白区的核酸序列，该tTA核酸序列与第二级SynNotch逻辑调控结构的tetR核酸序列匹配结合，实现第二级SynNotch逻辑调控结构调控NAP免疫刺激蛋白基因的表达；
G#为对照CAR-T结构，并命名为CAR-T-CLDN18.2；其中，嵌合抗原受体的结构中包括信号肽CD8SP、跨膜结构域CD8Hinger、CD8TM、胞内激活元件4-1BB及CD3Zeta中的一种或多种。
实施例2、构建分泌型CAR-T细胞
2.1、细胞系培养
将表达CLDN18.2和FAP的碱基序列分别克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中，置于EF1α(EF-1α)的启动子下，形成PHBLV-EF1α-CLDN18.2和PHBLV-EF1α-FAP，将PHBLV-EF1α-CLDN18.2/PHBLV-EF1α-FAP、慢病毒包膜质粒pMD2.G (Addgene，Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)等三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T细胞中制备的慢病毒完整表达载体上；分别在48h和72h收集病毒上清，并对所收集的病毒上清进行超速离心浓缩(Merck Millipore)；浓缩后的病毒即可用于感染HGC-27，最终得到过表达CLDN18.2和/或FAP的HGC-27细胞系，分别命名为HGC-27-CLDN18.2、HGC-27-FAP、HGC-27-CLDN18.2-FAP。
如图2、3、4、5所示，分别为靶细胞HGC-27、HGC-27-CLDN18.2、HGC-27-FAP、HGC-27-CLDN18.2-FAP等四个细胞系表达CLDN18.2和FAP的检测结果；其中，HGC-27对应的检测图为阴性对照图，用以划分阴性区域；图2、3、4、5中，Q1-LL区为CLDN18.2和FAP双阴性；Q1-LR区为CLDN18.2阳性和FAP阴性；Q1-UL区为CLDN18.2阴性和FAP阳性；Q1-UR区为CLDN18.2和FAP双阳性。
该检测结果表明，HGC-27细胞为CLDN18.2和FAP双阴性。HGC-27-CLDN18.2细胞为CLDN18.2表达阳性。HGC-27-FAP细胞为FAP表达阳性。HGC-27-CLDN18.2-FAP细胞为CLDN18.2和FAP双阳性。
2.2、外周血PBMC的分离和T细胞的扩增
从供体外周血中分离单个核细胞，使用ficol法进行密度梯度离心，并用T细胞分选试剂盒富集T细胞，如，CD3 MicroBeads、 human-lyophilized或130-097-043，并使用偶联anti-CD3/anti-CD28的磁珠激活培养和扩增T细胞；这些都是现有技术，在此不再赘述。
T细胞培养时，使用TexMACS GMP Medium(Miltenyi Biotec，170-076-309）培养基，培养基中含10％FBS、2mM L-glutamine及100IU/ml rhIL2，细胞培养时均置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养；培养周期为13天，静置培养，期间每隔2天左右补液一次，补液量根据细胞数量来决定，并实现T细胞生长扩增。
实施例3、CAR-T细胞体外功能试验
3.1、CAR-T-SynNotch细胞阳性率、SynNotch调控能力、分泌能力、自杀元件及增殖能力评价
如图6、7、8所示，通过慢病毒包装并侵染T细胞制备得到的CAR-T，所获得的CAR-T的阳性率检测结果；其中，图6为空白对照样；图7、8分别为针对靶细胞CAR-T-CLDN18.2、CAR-T-SynNotch的阳性率。
结果显示，以T细胞作为阴性对照，慢病毒侵染方法，可以有效制备出CAR-T细胞阳性率分别85.24%和80.72%（阳性率大于50%），并且CAR-T-CLDN18.2、CAR-T-SynNotch细胞阳性率接近，无明显差异。
如图9、10、11、12所示，SynNotch逻辑调控结构调控能力激活情况；其中，图9为T细胞对照样流式图，用于划分阴性区域；图10为CAR-T-SynNotch培养流式图；图11为CAR-T-SynNotch与HGC27-FAP共混培养流式图；图12中显示CAR-T-SynNotch与HGC27-CLDN18.2-FAP细胞共培养流式图。
图9、10、11中，Q1-LL区为CLDN18.2-CAR和FAP-SynNotch双阴性；Q1-LR区为CLDN18.2-CAR阳性和FAP-SynNotch阴性；Q1-UL区为CLDN18.2-CAR阴性和FAP-SynNotch阳性；Q1-UR区为CLDN18.2-CAR和FAP-SynNotch双阳性。图10中显示CAR-T-SynNotch细胞中，SynNotch逻辑调控结构为常时表达，在未接受刺激时CLDN18.2-CAR表达为阴性；图11中显示CAR-T-SynNotch与HGC27-FAP细胞共培养后，常时表达的SynNotch逻辑调控结构接受刺激，CLDN18.2-CAR表达转为阳性；图12中显示CAR-T-SynNotch与HGC27-CLDN18.2-FAP细胞共培养后，常时表达的FAP-SynNotch逻辑调控结构接受刺激，CLDN18.2-SynNotch表达转为阳性。
如图13、14、15所示，激活后CAR-T-SynNotch细胞的IL-7/CCL-19/NAP分泌蛋白分泌能力检测图。
如图13所示，未激活CAR-T-SynNotch细胞，无IL-7分泌蛋白分泌， CAR-T-SynNotch细胞与HGC27-FAP细胞共培养后激活了CAR-T-SynNotch细胞，可分泌IL-7分泌蛋白；如图14所示，未激活CAR-T-SynNotch细胞，无CCL-19分泌蛋白分泌, CAR-T-SynNotch细胞与HGC27-FAP细胞共培养后激活了CAR-T-SynNotch细胞，可分泌CCL-19分泌蛋白；如图15所示，未激活CAR-T-SynNotch细胞，无NAP分泌蛋白分泌, CAR-T-SynNotch细胞与HGC27-CLDN18.2-FAP细胞共培养后激活了CAR-T-SynNotch细胞，可分泌NAP分泌蛋白。
如图16、17所示，激活后CAR-T-SynNotch细胞iCASP9自杀元件调控细胞凋亡能力检测图。
图16中，框选部分为激活后CAR-T-SynNotch的活细胞比例，占比85.12%；图17中，框选部分为激活后CAR-T-SynNotch加入AP1903药物诱导凋亡6h后的活细胞比例，占比27.86%，并且经检测活细胞均为T细胞，被激活表达iCASP9自杀元件的CAR-T-SynNotch细胞已全部凋亡。
细胞增殖情况如图18、19所示。图18中，在无抗原刺激的情况下，CAR-T-CLDN18.2与CAR-T-SynNotch表现出基本相同的扩增能力；图19中，加入HGC27-FAP共培养刺激时，CAR-T-SynNotch的调控能力被激活，开始分泌表达IL-7分泌蛋白，刺激CAR-T-SynNotch具有更高的细胞增殖倍数，证明其有更优异的细胞增殖能力。
3.2、细胞体外杀伤实验
使用HGC-27、HGC-27-CLDN18.2、HGC-27-FAP、HGC-27-CLDN18.2-FAP细胞分别作为阳性和阴性靶细胞，采用流式检测方法对CAR-T体外杀瘤功能进行验证。
如图20、21、22、23所示,其中，图20的靶细胞为HGC27; 图21的靶细胞为HGC27-FAP; 图22的靶细胞为HGC27-CLDN18.2; 图23的靶细胞为HGC27-CLDN18.2-FAP。
图20、21、22、23所示的检测结果显示，CAR-T-CLDN18.2对CLDN18.2表达阳性的HGC-27-CLDN18.2和HGC-27-CLDN18.2-FAP细胞显示出特异性的杀伤效果，对HGC-27和HGC-27-FAP无杀伤效果；相比之下，CAR-T-SynNotch细胞仅对HGC-27-CLDN18.2-FAP细胞进行特异性杀伤，对HGC-27、HGC-27-CLDN18.2和HGC-27-FAP无杀伤效果，显示出SynNotch逻辑调控结构的逻辑控制能力仅对FAP和CLDN18.2双阳细胞进行特异性杀伤，并且CAR-T-SynNotch相较CAR-T-CLDN18.2对HGC-27-CLDN18.2-FAP靶细胞具有更强的杀伤效果。
如图24、25所示，SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体外杀伤实验因子浓度曲线图；其中，图24为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体时分泌细胞因子IFN-γ的浓度曲线图（E:T=10:1）；图25为SynNotch CAR-T对肿瘤细胞体时分泌细胞因子IL-2的浓度曲线图。
检测结果显示，CAR-T-SynNotch对非靶向细胞无细胞因子释放，并且CAR-T-SynNotch相较CAR-T-CLDN18.2对HGC-27-CLDN18.2-FAP靶细胞具有更强的IL-2和IFN-r的细胞因子释放能力，该结果与杀伤实验结果相同。
实施例4、CAR-T细胞体内杀伤实验
取6-8周龄NSG小鼠（体重18-22g）42只，适应饲养一周后，皮下接种HGC-27-CLDN18.2-FAP肿瘤细胞株，每只小鼠接种5*106个肿瘤细胞，密切观察动物状态，每三天使用游标卡尺测量小鼠肿瘤体积，当肿瘤体积达到100mm3，根据小鼠体重和肿瘤大小随机分组后，经尾静脉输注CAR-T细胞或对照T细胞。详细的给药方法、给药剂量和给药途径见表1所示。给药完成后1周，在肿瘤未完全消失前，组内随机选择一只小鼠处死，采集肿瘤组织检测CAR-T对肿瘤浸润情况，该小鼠不计入生存曲线统计。
表1 动物实验方案
Figure 210182DEST_PATH_IMAGE001
如图26所示，CAR-T-SynNotch可以大幅延长小鼠生存期。
如图27、28、29、30所示，CAR-T-SynNotch可以大幅提升CAR-T细胞的肿瘤浸润比。其中图27显示，DPBS组作为阴性对照，其CD3和CD45双阳性的肿瘤浸润细胞比例为0.25%；图28所示，T细胞组作为阴性对照，其CD3和CD45双阳性的肿瘤浸润细胞比例为1.11%；图29所示，CAR-T-CLDN18.2细胞组作为阳性对照，其CD3和CD45双阳性的肿瘤浸润细胞比例为1.26%；图30所示，CAR-T-SynNotch细胞组作为待评价组，其CD3和CD45双阳性的肿瘤浸润细胞比例为6.37%。
以上示例证明：两级SynNotch逻辑调控结构调控的CAR-T相对于一般结构的CAR-T具有更强的增殖能力及对肿瘤的体内体外杀瘤活性，由两级SynNotch逻辑调控结构调控具有更强的靶向性，并且由自杀元件控制大大提升安全性。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种两级SynNotch逻辑调控结构，其特征在于，所述逻辑调控结构分为一级SynNotch逻辑调控结构和二级SynNotch逻辑调控结构，且二级SynNotch逻辑调控结构的表达受到一级SynNotch逻辑调控结构的调控；该SynNotch逻辑调控结构包括靶点结合区域、Notch core区和启动调控蛋白区。
2.根据权利要求1所述的两级SynNotch逻辑调控结构，其特征在于，所述一级SynNotch逻辑调控结构的靶点结合区域为第一靶点，该第一靶点靶向FAP蛋白；所述一级SynNotch逻辑调控结构的启动调控蛋白区为第一启动调控蛋白GAL4-VP64。
3.根据权利要求2所述的两级SynNotch逻辑调控结构，其特征在于，所述一级SynNotch逻辑调控结构用于调控靶向CLDN18.2蛋白的嵌合抗原受体基因、IL-7和CCL-19细胞因子基因、iCas9自杀基因及二级SynNotch逻辑调控结构基因表达，且所述CLDN18.2蛋白的嵌合抗原受体基因、IL-7和CCL-19细胞因子基因、iCas9自杀基因及二级SynNotch逻辑调控结构基因序列前分别包含有可与所述第一启动调控蛋白GAL4-VP64相匹配结合的第一调控蛋白结合区的核酸序列UAS。
4.根据权利要求1所述的两级SynNotch逻辑调控结构，其特征在于，所述二级SynNotch逻辑调控结构的靶点结合区域为第二靶点，该第二靶点靶向CLDN18.2蛋白；所述二级SynNotch逻辑调控结构的启动调控蛋白区为第二启动调控蛋白tetR。
5.根据权利要求4所述的两级SynNotch逻辑调控结构，其特征在于，所述二级SynNotch逻辑调控结构用于调控NAP蛋白基因表达，且所述NAP蛋白基因序列前包含有可与所述第二启动调控蛋白tetR相匹配结合的第二调控蛋白结合区的核酸序列tTA。
6.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1至5任一所述的两级SynNotch逻辑调控结构。
7.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1至5任一所述的两级SynNotch逻辑调控结构，或者包含权利要求6所述的表达盒。
8.一种重组细胞系，其特征在于，所述重组细胞系包含权利要求1至5任一所述的两级SynNotch逻辑调控结构、或者包含权利要求6所述的表达盒、或者包含权利要求7所述的载体。
9.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包含权利要求1至5任一所述的两级SynNotch逻辑调控结构、或者包含权利要求6所述的表达盒、或者包含权利要求7所述的载体、或者包含权利要求8所述的重组细胞系。
10.根据权利要求9所述的生物制剂在治疗和/或预防肿瘤和/或癌症药物方面的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160264665A1 (en) * 2015-02-24 2016-09-15 The Regents Of The University Of California Binding-triggered transcriptional switches and methods of use thereof
CN106755023A (zh) * 2015-10-15 2017-05-31 中国人民解放军军事医学科学院附属医院 带安全开关的嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法与应用
CN107109421A (zh) * 2014-10-09 2017-08-29 国立大学法人山口大学 Car表达载体及car表达t细胞
CN113106068A (zh) * 2021-03-26 2021-07-13 深圳市先康达生命科学有限公司 一种自分泌IL-15与anti-PD1融合蛋白的免疫细胞

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107109421A (zh) * 2014-10-09 2017-08-29 国立大学法人山口大学 Car表达载体及car表达t细胞
US20160264665A1 (en) * 2015-02-24 2016-09-15 The Regents Of The University Of California Binding-triggered transcriptional switches and methods of use thereof
CN106755023A (zh) * 2015-10-15 2017-05-31 中国人民解放军军事医学科学院附属医院 带安全开关的嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法与应用
CN113106068A (zh) * 2021-03-26 2021-07-13 深圳市先康达生命科学有限公司 一种自分泌IL-15与anti-PD1融合蛋白的免疫细胞

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOLE T. ROYBAL ET AL: "Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-Sensing Circuits", 《CELL》, vol. 164 *

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