CN115746137A - 一种抗cd8抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物工程抗体制备领域，特别是涉及一种抗CD8抗体及其应用。所述抗CD8抗体包括轻链恒定区、轻链可变区、重链恒定区和重链可变区；所述轻链可变区包括如SEQ ID No.29或SEQ ID No.30所示的氨基酸序列；所述重链可变区包括如SEQ ID No.31或SEQ ID No.32所示的氨基酸序列。本发明将筛选得到的优选抗体偶联到磁性颗粒上，获得抗CD8抗体偶联磁珠。使用此偶联磁珠从人外周血单个核细胞中富集分选CD8T细胞，再将CD22靶向的嵌合抗原受体基因导入CD8T细胞，制备CD8⁺CD22‑CAR‑T细胞，能够有效杀伤表达CD22的肿瘤细胞。

Description

一种抗CD8抗体及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种抗CD8抗体及其应用。

背景技术

CD8 T细胞能够帮助机体维持稳态。当机体遭遇病原体感染或者癌细胞侵袭时，静息态的初始CD8 T细胞可以通过与抗原递呈细胞的相互作用而大量增殖并分化为细胞毒性效应CD8 T细胞，细胞毒性效应CD8 T细胞可以通过分泌大量细胞因子活化其他免疫细胞以及直接杀伤感染的细胞或者癌细胞，从而帮助机体重塑稳态。

过继转移经过改造以表达靶向肿瘤细胞表面相关抗原的人工嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)是一种革命性的癌症免疫细胞疗法。CAR是人工合成的受体，可以重新定向淋巴细胞，最常见的是T细胞，以识别和杀伤表达特定抗原的靶细胞。近年来，快速发展的CAR-T细胞疗法临床试验积极探索其潜在的应用场景。CAR-T细胞疗法由于其具有持续优化的巨大潜力，如更好的靶点、更好的CAR结构和更高效的制备工艺因此比传统药物更受关注。

CAR-T细胞的生产制造包含多个步骤，并且要在整个过程中进行质量控制测试。简单的来说，首先使用白细胞分离术从患者/正常人体内去除血液，分离白细胞，并将剩余的血液重新输回到循环系统，然后将白细胞进行CD4 T细胞和CD8 T细胞分选以富集T细胞，然后将富集得到的T细胞进行激活并通过基因工程方法使其表达特异性的CAR，继续扩增CAR-T细胞达到合适的数量，最后回输至病人体内。

对于细胞分选来说，抗体是必不可少的，综上所述，开发新的用于分选的抗CD8抗体具有重要意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供一种抗CD8抗体及其应用，特别是用筛选得到的优选CD8抗体，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供抗CD8抗体用于富集分选CD8T细胞的用途，其中，所述抗CD8抗体包括轻链恒定区、轻链可变区、重链恒定区和重链可变区；所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列；所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的序列；所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的序列；所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的序列；所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示的序列；所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所示的序列。

本申请第二方面提供一种富集分选CD8 T细胞的方法，包括以下步骤：

1)将所述用途中的抗CD8抗体偶联到纳米磁性颗粒上，获得抗CD8抗体偶联磁珠；

2)将所述抗CD8抗体偶联磁珠与含有CD8 T细胞的混合细胞共孵育，然后将孵育后的细胞置于磁场中，通过磁场与所述抗CD8抗体偶联磁珠的结合，富集分选CD8 T细胞。

本申请第三方面提供所述的方法在制备CAR-T细胞中的用途。

与现有技术相比，本申请的有益效果为：

(1)本发明筛选得到的优选抗CD8抗体能够高效靶向CD8抗原，且易于制备。

(2)本发明分选得到的CD8 T细胞制备所得的CD22-CAR-T细胞能被抗原高效特异性激活。

附图说明

图1A为PBMC富集分选前以及使用CD8-1或CD8-4偶联磁珠富集分选后CD8 T细胞所占比例图。

图1B为用抗CD8-1磁珠或抗CD8-4磁珠进行PBMC富集分选后废液中CD8 T细胞所占比例图。

图2A为分别采用CD8-2抗体、CD8-3抗体和CD8-7抗体识别CD8抗原的结果图。

图2B为采用CD8-8抗体识别CD8抗原的结果图。

图3A为分别采用抗CD8-2磁珠、抗CD8-3磁珠和抗CD8-7磁珠分选富集前和后的细胞中CD8T细胞比例的结果图。

图3B为分别采用抗CD8-2磁珠、抗CD8-3磁珠和抗CD8-7磁珠分选富集后的细胞废液中CD8T细胞比例的结果图。

图3C为采用抗CD8-8磁珠分选富集前细胞中CD8T细胞比例以及富集后废液的细胞中CD8T细胞比例的结果图。

图4为CD8 T细胞感染病毒后第5、8、11、14天后总细胞数。

图5A、5B、5C、5D分别为CD8 T细胞感染病毒后第5、8、11、14天后CAR-T细胞中嵌合抗原受体表达率图。

图6A为本发明CAR-T细胞对K562-luci细胞杀伤效果图。

图6B为本发明CAR-T细胞对K562-CD22-luci细胞杀伤效果图。

图7为CAR-T细胞的IFN-γ细胞因子分泌水平图。

具体实施方式

为了使本申请的发明目的、技术方案和有益效果更加清晰，下面结合实施例对本申请作进一步说明。应理解，所述实施例只用于解释本申请，并非用于限定申请的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请的其他优点及功效。

本申请的发明人经过大量探索研究，在大量抗体种筛选得到两个优选的CD8抗体序列，通过所述抗体制备的抗CD8抗体偶联磁珠能够高效率、高纯度地从人PBMC中富集CD8T细胞，由此富集得到的CD8 T细胞构建的CD22 CAR-T，能够高效扩增并且高效杀伤表达CD22的肿瘤细胞，在此基础上完成了本申请。

本申请一方面提供抗CD8抗体用于富集分选CD8 T细胞的用途，其中，所述抗CD8抗体包括轻链恒定区、轻链可变区、重链恒定区和重链可变区；所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列；所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的序列；所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的序列；所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ IDNo.7或SEQ ID No.8所示的序列；所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示的序列；所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.11或SEQID No.12所示的序列。

SEQ ID No.1：QDITNY

SEQ ID No.2：QDIGSN

SEQ ID No.3：GAS

SEQ ID No.4：HGT

SEQ ID No.5：QQYNNYPLT

SEQ ID No.6：VQFAQFPYT

SEQ ID No.7：GFIFSNYG

SEQ ID No.8：GYSFTNFG

SEQ ID No.9：IWYDGSNK

SEQ ID No.10：INTYTGEP

SEQ ID No.11：ARSYDMLTGYDGSYGLDV

SEQ ID No.12：ARKDYAGFFDY

本申请提供的抗CD8抗体用于富集分选CD8 T细胞的用途中，所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示的序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示的序列。

本申请提供的抗CD8抗体用于富集分选CD8 T细胞的用途中，所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示的序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.4所示的序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.6所示的序列。

本申请提供的抗CD8抗体用于富集分选CD8 T细胞的用途中，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.7所示的序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.9所示的序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.11所示的序列。

本申请提供的抗CD8抗体用于富集分选CD8 T细胞的用途中，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.8所示的序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.10所示的序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.12所示的序列。

本申请提供的抗CD8抗体用于富集分选CD8 T细胞的用途中，所述轻链可变区还包括框架区FR1-FR4；所述FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示的序列；所述FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.15或SEQ ID No.16所示的序列；所述FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.17或SEQ ID No.18所示的序列；所述FR4的氨基酸序列包括SEQ IDNo.19或SEQ ID No.20所示的序列。

SEQ ID No.13：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS

SEQ ID No.14：DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHAS

SEQ ID No.15：LAWFQQKPGKAPKSLIY

SEQ ID No.16：MGWLQQKPGKSFKALIY

SEQ ID No.17：SLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

SEQ ID No.18：NLEYGVPSRFSGSGSGADYSLSISSLESEDFADYYC

SEQ ID No.19：FGGGTKVEIK

SEQ ID No.20：FGGGTSLEIK

本申请提供的抗CD8抗体用于富集分选CD8 T细胞的用途中，所述重链可变区还包括框架区FR1-FR4；所述FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.21或SEQ ID No.22所示的序列；所述FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.23或SEQ ID No.24所示的序列；所述FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.25或SEQ ID No.26所示的序列；所述FR4的氨基酸序列包括SEQ IDNo.27或SEQ ID No.28所示的序列。

SEQ ID No.21：QVQLVESGGGVDQPGRSLRLSCAAS

SEQ ID No.22：QIQLVQSGPELRKPGETVRISCKAS

SEQ ID No.23：IHWVRQAPGKGLEWVAV

SEQ ID No.24：MIWVKQAPGKGLKWLGW

SEQ ID No.25：YFEDSVKGRFNISRDNSKNIVYLQMNSLRAEDTAVYFC

SEQ ID No.26：TYADDLKGRFAFSLETSANTAYLKINNFKNEDMATYFC

SEQ ID No.27：WGQGTTVTVSS

SEQ ID No.28：WGQGTTLTVSS

本申请提供的抗CD8抗体用于富集分选CD8 T细胞的用途中，所述轻链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID No.29或SEQ ID No.30所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID No.31或SEQ ID No.32所示的序列。

SEQ ID No.29：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDITNYLAWFQQKPGKAPKSLIYGASSLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID No.30：

DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQDIGSNMGWLQQKPGKSFKALIYHGTNLEYGVPSRFSGSGSGADYSLSISSLESEDFADYYCVQFAQFPYTFGGGTSLEIK

SEQ ID No.31：

QVQLVESGGGVDQPGRSLRLSCAASGFIFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYFEDSVKGRFNISRDNSKNIVYLQMNSLRAEDTAVYFCARSYDMLTGSGDYYGLDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID No.32：

QIQLVQSGPELRKPGETVRISCKASGYSFTNFGMIWVKQAPGKGLKWLGWINTYTGEPTYADDLKGRFAFSLETSANTAYLKINNFKNEDMATYFCARKDYAGFFDYWGQGTTLTVSS

本申请提供的抗CD8抗体用于富集分选CD8 T细胞的用途中，所述轻链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID No.33或SEQ ID No.34所示的序列，轻链恒定区的核苷酸序列包括SEQ ID No.35或SEQ ID No.36所示的序列；重链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID No.37或SEQ ID No.38所示的序列，重链恒定区的核苷酸序列包括SEQ ID No.39或SEQ ID No.40所示的序列。

SEQ ID No.33：

gacattcagatgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggagacagagtgaccataacctgcagagccagccaagacataaccaactacctcgcctggtttcagcagaagcccggcaaagccccaaaaagcctcatctacggcgcctcctccctgcaaagcggcgtgccaagcaaattcagcggaagcggctccggaaccgacttcaccctgactatctccagcctccagcccgaagacttcgccacctactactgccaacaatacaacaactaccccctgaccttcggcggcggcacaaaggtggagatcaaa。

SEQ ID No.34：

gacattctgatgacccagagccccagctccatgagcgtgagcctgggagacaccgtgagcatcacctgccacgccagccaagacataggaagcaacatgggctggctgcaacaaaaacccggcaaatcctttaaagctctcatctaccacggaaccaacctcgaatacggcgtgcccagcagattcagcggaagcggcagcggcgcagactacagcctgagcatcagctccctcgaaagcgaggacttcgccgactactactgcgtccagttcgcccaatttccttacacattcggcggcgggaccagcctggagatcaag。

SEQ ID No.35：

cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagttcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt。

SEQ ID No.36：

agagcagatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgt。

SEQ ID No.37：

caggtccaactcgtcgagtcaggcggcggcgtcgaccaacccggaagaagcctcagactcagctgcgcagcaagcggcttcatattttcaaactacggcatccactgggtcagacaagcccccggcaaaggcctggagtgggtggctgtgatttggtacgatggcagcaacaagtacttcgaggatagtgtgaaaggcaggttcaacataagcagggacaacagcaagaacatcgtgtacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacacagcagtgtacttctgcgccaggagctacgacatgctgacaggaagcggagactactacggactggacgtgtggggccaggggaccaccgtgaccgtgagcagc。

SEQ ID No.38：

cagatccaactcgtccaaagcggccccgagctcagaaaacccggcgaaaccgtcagaataagctgcaaggcctccggctacagcttcaccaacttcggcatgatatgggtgaagcaagcacccggcaaaggcctgaagtggctgggatggataaacacctacaccggcgagcccacctacgccgacgacctcaaaggcagattcgccttctctctggagacaagcgctaacaccgcttacctgaaaatcaacaacttcaagaatgaggacatggccacctacttctgcgcccggaaggactacgccggcttctttgactactggggccagggcaccaccctgaccgtctcctcc。

SEQ ID No.39：

gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa。

SEQ ID No.40：

gctaagaccacccccccttccgtgtatcccctggctcctggatctgccgcccagacaaactccatggtgaccctgggctgtctggtgaaaggctattttcctgaacccgtgaccgtgacctggaacagcggctctctgtctagcggcgtgcatacttttcccgccgtgctgcagtccgacctgtataccctgagttcctccgtgaccgtgccctcttccacctggcctagcgagaccgtgacctgcaatgtggcccaccccgcttccagcaccaaggtggataagaaaatcgtgccccgcgactgcggctgtaagccttgtatctgcaccgtgcccgaagtgagctcagtgttcattttcccccccaagcccaaagacgtgctgaccatcaccctgacccccaaagtgacctgcgtggtggtggatattagcaaggatgaccccgaagtgcagttttcttggttcgtggacgacgtggaagtgcacaccgcccagacccagcctagagaggagcagttcaactccacattcaggagtgtgagcgagctgcccattatgcaccaggattggctgaacgggaaggagttcaaatgtagggtgaacagcgccgccttccccgctcctattgaaaaaaccatcagcaagaccaagggcagacccaaggccccccaggtgtacaccatccccccccccaaggagcagatggccaaggacaaggtgagcctgacctgcatgatcaccgacttcttccccgaggacatcaccgtggagtggcagtggaacggccagcccgccgagaactacaagaacacccagcccatcatggacaccgacggcagctacttcgtgtacagcaagctgaacgtgcagaagagcaactgggaggccggaaacaccttcacctgcagcgtgctgcacgagggcctgcacaaccaccacaccgagaagagcctgagccacagccccggcaag。

本发明将所述抗CD8抗体的编码基因插入表达载体，得到重组表达载体，将所述重组表达载体导入细胞并进行培养，进行分离纯化，得到所述抗CD8抗体。本发明所述的表达载体能够准确表达所述的抗CD8抗体。

具体的，所述表达载体为病毒载体或非病毒载体。例如，非病毒载体包括：质粒，噬菌粒，柯斯质粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)，噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。病毒载体包括：逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。

具体的，所述导入的细胞可以是原核细胞，如细菌细胞等；或是低等真核细胞，如酵母细胞等；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞等。

更具体的，所述导入的细胞包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。

本申请另一方面提供一种富集分选CD8 T细胞的方法，包括以下步骤：

1)将所述用途中的抗CD8抗体序列偶联到纳米磁性颗粒上，获得抗CD8抗体偶联磁珠；

2)将所述抗CD8抗体偶联磁珠与含有CD8 T细胞的混合细胞共孵育，然后将孵育后的细胞置于磁场中，通过磁场与所述抗CD8抗体偶联磁珠的结合，富集分选CD8 T细胞。

本申请提供的富集分选CD8 T细胞的方法中，步骤1)中，所述的磁珠与所述的分离的抗体的质量比为(1～10):1。

本申请提供的富集分选CD8 T细胞的方法中，步骤1)中，所述偶联反应是在缓冲液中进行，在某个优选的实施方式中，可以为BB溶液，加入缓冲液是为了调节反应液的pH值。

本申请提供的富集分选CD8 T细胞的方法中，步骤1)中，还需要在封闭液中封闭1～2h，在某个具体的实施方式中，所属封闭时间为1h，所述封闭液可以为BSA水溶液，所述的BSA水溶液的浓度为10～30mg/mL。更具体地，在某个优选的实施方式中，所述的BSA水溶液的浓度为20mg/mL。

本申请提供的富集分选CD8 T细胞的方法中，步骤2)中，所述含有CD8 T细胞的混合细胞包括人外周血单个核细胞。

本申请提供的富集分选CD8 T细胞的方法中，步骤2)中，所述孵育是指所述外周血单个核细胞和分离的抗体的比例为16×10⁶个细胞：(0.5～1.5)μg。所述孵育是在流式缓冲液中进行，所述流式缓冲液为含有1.8％～2.2％FBS和1.8mM～2.2mM EDTA的1×PBS溶液。具体地，所述流式缓冲液为含有2％FBS和2mM EDTA的1×PBS溶液。

本申请提供的富集分选CD8 T细胞的方法中，步骤2)中，所述富集分选是指将所述孵育液过分选柱，弃去流下来的细胞，用流式缓冲液冲洗脱离磁场的柱子，收集流下的液体，得到所述的CD8 T细胞。

本申请另一方面提供所述的方法在制备CAR-T细胞的用途。具体的，所述CAR-T细胞可以为CD8+CD22-CAR-T细胞。所述CD8⁺CD22-CAR-T细胞可用于治疗癌症、适应性免疫疾病、自身免疫疾病、炎症性疾病或感染性疾病。具体的，所述癌症选自白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病、复发性或难治性B细胞前体急性淋巴母细胞性白血病)和淋巴瘤。

下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

本申请的下述实施例中：

HD SIN03 CD22(V29)41BBz(ka)慢病毒载体和K562-luci、K562-CD22-luci靶细胞可参见申请号CN 114149506 A。

实施例1抗体制备

本发明通过既往文献和专利检索，从大量抗体数据库中筛选得到两种优选抗体，命名为CD8-1和CD8-4。

CD8-1抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.29，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.31。CD8-1抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ ID No.33，重链可变区的核酸序列为SEQ ID No.37，轻链恒定区的核酸序列为SEQ ID No.35，重链恒定区的核酸序列为SEQ ID No.39，重链恒定区用的是human IgG1，轻链恒定区用的是kappa。

CD8-4抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.30所示的序列，重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.32所示的序列。CD8-4抗体的轻链可变区的核酸序列为SEQ IDNo.34，重链可变区的核酸序列为SEQ ID No.38，轻链恒定区的核酸序列为SEQ ID No.36，重链恒定区的核酸序列为SEQ ID No.40，重链恒定区用的是human IgG1，轻链恒定区用的是kappa。

对比抗体：

本实施例提供四个对比CD8抗体：CD8-2、CD8-3、CD8-7和CD8-8。

其中，CD8-2抗体的重链氨基酸序列为：

SEQ ID No.41：

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPANDNTLYASKFQGRATITADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCGRGYGYYVFDHWGQGTLVTVSS。

CD8-2抗体的轻链氨基酸序列为：

SEQ ID No.42：

DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRTSRSISQYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNENPLTFGQGTKVEIK。

CD8-3抗体的重链氨基酸序列为：

SEQ ID No.43：

EVQLQQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWMGRIDPANDNTLYASKFQGRVTITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGYGYYVFDHWGQGTTVTVSS。

CD8-3抗体的轻链氨基酸序列为：

SEQ ID No.44：

DIKMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSRSISQYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNENPLTFGAGTKLEIK。

CD8-7抗体的重链氨基酸序列为：

SEQ ID No.45：

EVQLQQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWMGRIDPANDNTLYARKFQGRVTITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRGYGYYVFDTWGQGTTVTVSS。

CD8-7抗体的轻链氨基酸序列为：

SEQ ID No.46：

DIKMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSRSISQYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVNEFPVTFGAGTKLEIK。

CD8-8购自义翘神州，货号：10980-MM28。

1.1、构建重组表达载体

基于CD8-1抗体及CD8-4抗体的核酸/氨基酸序列构建重组表达载体，可将CD8-1抗体及CD8-4抗体及对比抗体的核酸采用常规方法克隆入常用原核表达载体中构建，或者委托专业的载体制备公司制备，本实施例中抗体分离抗体表达载体委托上海百英生物科技有限公司完成并验证正确。

1.2、分离抗体的原核表达

1.2.1 CHO细胞的培养

CHO细胞株置于RPMI1640培养基中，RPMI1640培养基含10％灭活小牛血清、青霉素100IU/mL和链霉素100IU/mL，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，每隔48h换培液。

1.2.2转染与表达

1)取145M本实施例中步骤1.4.1得到的细胞，离心去上清，保留沉淀。

2)用0.5mL左右电转液加入1)得到的沉淀中，混匀后添加适量的1.3获得的构建重组表达载体(浓度500ng/μL)，得到细胞质粒混悬液。

3)上述细胞质粒混悬液充分混匀后取1mL加入1mL电击管，把电击管放入电转仪进行电击。

4)电击完成后，将电击管内细胞分装进提前准备好含有20mL培养液摇瓶内，静止孵育40min。

5)孵育结束后将摇瓶放入37℃，270rpm，8％ CO₂培养，24h后添加补料/丁酸钠/双抗，继续培养3～7d。第5d抽检取样送测ELISA。

1.2.3抗体纯化

实验方法：Protein A亲和层析柱纯化

(1)平衡层析柱：l×PBS，流速lmL/min，20mL；

(2)上样：流速lmL/min；

(3)洗杂：l×PBS，流速lmL/min，20mL；

(4)洗脱：柠檬酸缓冲液(PH3.4)，lmL/min，分管收集，每管约500μL。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值；

(5)透析：将高浓度蛋白吸至透析袋放l×PBS的烧杯中透析，得到纯化后的分离抗体。

1.2.4抗体基础质控

1)浓度检测；

2)纯度检测(SEC-HPLC)；

实验材料：高效液相色谱仪、凝胶色谱柱、去离子水、流动相(Na₂HPO₄.12H₂O、NaH₂PO₄.2H₂O、NaCl)；

实验方法：

使用高效液相色谱仪LC-20AT及凝胶色谱柱进行SEC实验，实验条件如下：

流速：1mL/min；进样量：20μL

柱温：35℃

检测波长：214nm，280nm

采集时间：15min

将水更换为流动相，流速缓慢升至1.000mL/min，至基线平稳。取50μL的抗体至对应编号的进样瓶中，将样品瓶放入仪器相应的位置，进样时间是15min，分析处理数据并保存，将流动相更换成去离子水，冲洗1.5h。

结果显示，抗体纯度>90％。

实施例2抗体偶联至纳米磁性颗粒制备

本实施例将实施例1制备得到的抗体偶联至纳米磁性颗粒，制备抗体偶联磁珠，实验步骤如下：

(1)取1mg纳米磁性颗粒，加入1mg的EDC和NHS(MES pH5.5溶解)，37度震荡反应0.5h；20000g离心30min去除NHS和EDC，

(2)沉淀中加入0.5mg的抗体，再加入500μL pH8.0的BB溶液调节缓冲液的pH值，室温震荡2.5h。

(3)20000g离心30min，保留上清(上清后面一起离心去除干扰)待测BCA；

(4)使用含有20mg/mL的BSA的水溶液封闭1h，37度摇床震荡反应。20000g离心30min，去上清。

(5)再用DEPC清洗，重悬至1mL，取20μL至1mL的纯水中待测DLS。

(6)20000g离心30min，去上清，用保存液重悬至500μL。0.22μm滤膜过滤。

实施例3 PBMC富集分选

本实施例使用实施例2制备得到的抗体偶联磁珠对PBMC进行分选。实验步骤如下：

(1)复苏PBMC，37℃，5％CO₂培养条件静息2h；

(2)将PBMC收集到15mL离心管，500g离心5min，弃上清，用2mL流式缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤一遍；

(3)使用流式缓冲液将PBMC重悬，计数，取2.5×10⁶细胞，离心后用50μL流式缓冲液重悬，加入5μL的抗体偶联磁珠，混匀后室温孵育15min；

(4)加入500μL流式缓冲液终止反应，转移至MS Columns中(MS Columns需提前根据说明书润湿)，待细胞悬液滴完后，使用500μL流式缓冲液洗涤MS Columns两次，收集细胞废液；

(5)在MS Columns中加入1mL流式缓冲液，使用活塞将分选富集的细胞收集到1.5mL离心管中。

分选富集CD8 T细胞的效率和纯度检测，步骤如下：

(1)在细胞废液和富集的细胞以及富集分选前的PBMC中各取3×10⁵个细胞，4℃、500×g离心5min，弃上清，流式缓冲液清洗一次；

(2)加100μL流式缓冲液重悬细胞，加入1μg的PE-Cy7-anti-CD8抗体和1μg的PE-anti-CD3抗体，冰上孵育30min，流式缓冲液清洗2次后，加入300μL流式缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测分选前以及分选后废液中和富集的细胞中的CD8 T细胞比例。

由图1A可知，富集分选前PBMC中CD8 T细胞所占比例为26.6％，富集分选后，CD8T细胞所占比例大大提升，均超过90％，表明抗CD8-1磁珠或抗CD8-4磁珠能够高纯度地从PBMC中富集CD8 T细胞；由图1B可知，富集分选后废液中仅剩少量CD8 T细胞，由图中比例可得，超过90％的CD8 T细胞被富集，表明抗CD8-1磁珠或抗CD8-4磁珠能够高效率地从PBMC中富集CD8 T细胞。

将实施例1提供的四个对比抗体用于识别CD8抗原。

由图2可知，四个对比抗体均能识别细胞表面的CD8抗原。

由图3A可知，分别采用抗CD8-2磁珠、抗CD8-3磁珠和抗CD8-7磁珠分选富集前PBMC中CD8 T细胞所占比例为20.5％；分选富集后，CD8 T细胞所占比例分别为78.2％、77.7％和92.2％。

由图3B可知，采用抗CD8-2磁珠、抗CD8-3磁珠和抗CD8-7磁珠分选富集后，细胞废液中CD8 T细胞占比分别为9.03％、7.42％和10.3％。

由图3C可知，采用抗CD8-8磁珠分选富集前，PBMC中CD8 T细胞所占比例为25.7％；分选富集后，废液中CD8 T细胞所占比例为25.6％。这说明基本没有富集到CD8T细胞，无法完成富集后细胞的流式检测。

因此，采用抗CD8-2、抗CD8-3、抗CD8-7和CD8-8抗体对PBMC进行分选富集时，富集的细胞中有大量其他杂细胞，废液中还残留大量未富集的CD8 T细胞。

综上所述，本发明制备抗CD8抗体，优选为CD8-1抗体和CD8-4抗体，与其他CD8的抗体如CD8-2、CD8-3、CD8-7、CD8-7相比，本发明优选的抗CD8抗体制备的CD8抗体偶联磁珠，能够高效率、高纯度从PBMC分选富集CD8 T细胞

实施例4 CD8+CD22-CAR-T细胞构建

4.1慢病毒的包装，包括以下步骤：

(1)以1.6×10⁷细胞数接种293T细胞于15cm培养皿中，37℃，5％ CO₂培养过夜准备包装病毒，培养基为DMEM，添加10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)；

(2)将30μg HD SIN03 CD22(V29)41BBz(ka)慢病毒载体分别与12.5μg辅助质粒gag/pol与10μg包膜质粒VSVg溶入2000μL无血清DMEM培养液，混匀；

(3)将157.5μg PEI(1μg/μL)溶解于2000μL的无血清DMEM培养液中，1000rpm涡旋5秒钟，25℃孵育5min；

(4)转染复合物的形成：将PEI混合液加入DNA混合液中，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，25℃下孵育20min；

(5)将转染复合物4mL滴加入含25mL DMEM培养基的15cm培养皿中，4h小时后，更换新鲜培养基；

(6)48h后，收集病毒液上清，得到慢病毒。

4.2慢病毒浓缩

将4.1制备的病毒上清用0.45μm滤膜过滤后收集到50mL离心管中，加入1/4的PEG-NaCl病毒浓缩液，上下颠倒混匀，4℃放置过夜；4℃，3500rpm，离心30min；去上清，加入RPMI1640培养基(含10％ FBS)，溶解重悬病毒沉淀；浓缩后的慢病毒悬液分装成50μL每份，保存在成品管中，储存在-80℃。

4.3慢病毒滴度检测

将500μL Jurkat细胞(1×10⁵个细胞)接种细胞于24孔培养板；将4.2浓缩后的慢病毒分别以1μL、0.2μL和0.04μL添加到细胞悬液中，并添加polybrene至终浓度5μg/mL；37℃，5％ CO₂培养过夜后，更换新鲜培养基；感染72h后，400×g离心5min，弃上清收集细胞，加100μL PBS+2％ FBS重悬细胞，加入1μg的PE-anti-VHH抗体，冰上孵育30min；PBS+2％FBS清洗2次后，加入300μL PBS+2％FBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测感染效率；取阳性率为15％的细胞样品为宜，计算滴度(TU/mL)＝细胞数量(10⁵)×阳性率/病毒体积(mL)。

4.4慢病毒转导CD8 T细胞。

用PBS将抗人CD3抗体和抗人CD28抗体稀释，终浓度分别为1μg/mL和0.5μg/mL，包被孔板，4℃冰箱静置过夜；弃去孔板中的抗体包被液，1mL PBS洗两次；用T细胞培养基(X-VIVO+10％ FBS+IL-2(300U/mL))将抗CD8-1磁珠或抗CD8-4磁珠富集分选的CD8T细胞调整至密度为1×10⁶/mL，然后接种到CD3和CD28抗体包被的孔板中活化48h；收集活化的CD8 T细胞，调整细胞密度为1×10⁶/mL，按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)＝10加入4.3制备的慢病毒，添加polybrene至终浓度为5μg/mL；于37℃、5％ CO₂环境中培养过夜后更换新鲜培养基，每2天进行传代。

4.5CD8 T细胞嵌合抗原受体表达，包括以下步骤：

(1)感染5天、8天、11天、14天后，分别计数(图4，感染病毒当天记为第0天)并取3×10⁵的T细胞，4℃、400×g离心5min，弃上清，PBS+2％ FBS清洗一次；

(2)加100μL PBS+2％ FBS重悬细胞，加入1μg的AF488-anti-VHH抗体，冰上孵育30min；PBS+2％ FBS清洗2次后，加入300μL PBS+2％ FBS重悬细胞，以未经感染T细胞作为对照，采用流式细胞仪检测感染效率(见图5)。

由图4可知，CD8 T细胞感染病毒第14天后相较于感染病毒当天增殖将近1000倍，表明富集分选的CD8 T细胞在正常T细胞培养条件下可快速增殖。

由图5可知，CD8 T细胞感染病毒第5天、8天、11天、14天后，嵌合抗原受体能够比较稳定的表达。

实施例5体外毒性实验

本实施例利用实施例4制备的CAR-T细胞进行体外毒性实验，包括以下步骤：

(1)靶细胞接种：

以CD22阴性细胞和CD22阳性肿瘤细胞作为靶细胞，本实施例中，肿瘤细胞为K562，CD22阴性细胞命名为肿瘤细胞K562-luci(CD22^—)，CD22阳性肿瘤细胞命名为K562-CD22-luci(CD22⁺)作为靶细胞，调整靶细胞浓度为2×10⁵/mL，取50μL接种到96孔板；

(2)效应细胞接种：

以实施例4制备的含CD22抗体的CAR-T以及对照T(未进行慢病毒感染)细胞为效应细胞；按效靶比0.3:1、1:1和3:1向96孔板中加入CAR-T细胞及对照T细胞；

各组均设2个复孔，取2个复孔的平均值，其中实验组和对照组如下：

实验组：CAR-T+靶细胞；

对照组：对照T细胞+靶细胞；

(3)效应细胞与靶细胞共培养18h后，使用

萤光素酶检测试剂盒进行检测，具体检测步骤参照

萤光素酶检测试剂盒说明书，结果如图6所示，本发明构建的CAR-T细胞对CD22阳性的肿瘤细胞具有高效杀伤活性，且对CD22阴性细胞无杀伤作用，说明本发明构建的CAR-T细胞还具备高特异性。

实施例6 CAR-T细胞因子分泌检测

1.细胞培养上清

将实施例5中效靶比1:1的细胞培养物400×g离心10min去除沉淀物，取上清置于-80℃贮存待检。

2.试剂准备

使用联科生物ELISA试剂盒(货号为：人γ干扰素ELISA试剂盒：EK180-96)进行检测，检测前将所有的试剂、样本恢复至25℃，按照使用说明配制1×洗液，1×检测缓冲液，检测抗体。

3.标准品及样品配制

标准品：使用5％ 1640培养基2倍稀释标准品原液，一共8个稀释梯度，包括零浓度。

样品：使用5％ 1640培养基按比稀释样品。

4.检测步骤

(1)浸泡酶标板：加入300μL 1×洗液静置浸泡30s，弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干；

(2)加标准品：标准品孔加入100μL 2×比稀释的标准品，空白孔加入100μL 5％1640培养基；

(3)加样本：样本孔加入100μL细胞培养上清；

(4)加检测抗体：每孔加入50μL稀释的检测抗体(1:100稀释)；

(5)孵育：使用封板膜封板，300rpm振荡，25℃孵育2h；

(6)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL洗液洗板，洗涤6次；

(7)加酶孵育：每孔加入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释)；

(8)孵育：使用新的封板膜封板，300rpm振荡，25℃孵育45min；

(9)洗涤：重复步骤(6)；

(10)加底物显色：每孔加入100μL显色底物TMB，避光，25℃孵育15min；

(11)加终止液：每孔加入100μL终止液，充分混匀；

(12)检测读数：使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和630nm参考波长下的OD值，校准后的OD值为450nm的测定值减去630nm的测定值。

IFN-γ因子分泌结果如图7所示，其中自发为CAR-T细胞单独培养物，在自发以及K562-luci和CAR-T培养物中检测到微量IFN-γ因子，K562-CD22-luci与CAR-T培养物中检测到较高含量的IFN-γ因子，表明本发明构建的CAR-T细胞还能够对CD22阳性的肿瘤细胞释放细胞因子而发挥杀伤功能，且具备高特异性，对CD22阴性细胞无明显细胞因子分泌。

由图7可知，利用分选得到的CD8 T细胞，进一步制备嵌合抗原受体细胞，所述嵌合抗原受体细胞能够高效杀伤肿瘤细胞，并能分泌细胞因子发挥杀伤功能，且具备高特异性。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.抗CD8抗体用于富集分选CD8 T细胞的用途，其中，所述抗CD8抗体

包括轻链恒定区、轻链可变区、重链恒定区和重链可变区；所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列；所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的序列；所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的序列；所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ IDNo.7或SEQ ID No.8所示的序列；所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示的序列；所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.11或SEQID No.12所示的序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，

所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示的序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示的序列；所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.7所示的序列，所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.9所示的序列，所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列包括SEQ IDNo.11所示的序列；

和/或，所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示的序列，CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.4所示的序列，CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.6所示的序列；所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.8所示的序列，所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.10所示的序列，所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.12所示的序列。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述轻链可变区还包括框架区FR1-FR4；所述FR1的氨基酸序列包括SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示的序列；所述FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.15或SEQ ID No.16所示的序列；所述FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.17或SEQ ID No.18所示的序列；所述FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.19或SEQ ID No.20所示的序列；

和/或，所述重链可变区还包括框架区FR1-FR4；所述FR1的氨基酸序列包括SEQ IDNo.21或SEQ ID No.22所示的序列；所述FR2的氨基酸序列包括SEQ ID No.23或SEQ IDNo.24所示的序列；所述FR3的氨基酸序列包括SEQ ID No.25或SEQ ID No.26所示的序列；所述FR4的氨基酸序列包括SEQ ID No.27或SEQ ID No.28所示的序列。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列包括SEQ IDNo.29或SEQ ID No.30所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID No.31或SEQID No.32所示的序列。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，抗CD8抗体的轻链恒定区的核苷酸序列选自包括SEQ ID No.35或SEQ ID No.36所示的序列，重链恒定区的核苷酸序列包括SEQ IDNo.39或SEQ ID No.40所示的序列。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，

所述抗CD8抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID No.29，重链氨基酸序列为SEQ ID No.31；或者，所述抗CD8抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID No.30，重链氨基酸序列为SEQ IDNo.32。

7.一种富集分选CD8 T细胞的方法，包括下列步骤：

1)将权利要求1—6任一权利要求所述用途中的抗CD8抗体偶联到纳米磁性颗粒上，获得抗CD8抗体偶联磁珠；

2)将所述抗CD8抗体偶联磁珠与含有CD8 T细胞的混合细胞共孵育，然后将孵育后的细胞置于磁场中，通过磁场与所述抗CD8抗体偶联磁珠的结合，富集分选CD8 T细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含有CD8 T细胞的混合细胞包括人外周血单个核细胞。

9.根据权利要求7或8所述的方法在制备CAR-T细胞中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，所述CAR-T细胞为CD8+CD22-CAR-T细胞。

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