CN118005808A - 慢病毒载体及其应用 - Google Patents

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CN118005808A
CN118005808A CN202410207604.7A CN202410207604A CN118005808A CN 118005808 A CN118005808 A CN 118005808A CN 202410207604 A CN202410207604 A CN 202410207604A CN 118005808 A CN118005808 A CN 118005808A
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闫忠辉
何丽花
古松海
蔡晓晴
徐道俊
刘婷怡
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及慢病毒载体及其应用。本发明对嵌合包膜的胞质尾区的蛋白酶底物序列进行了优化设计，得到一系列新型嵌合包膜结构，所得包膜结构用来假型化携带CAR基因的慢病毒载体，相比已报道的嵌合型包膜BaEVTR或BaEVRless，本发明的包膜结构假型化的慢病毒载体具有更高的病毒滴度，并且对包装细胞的毒性没有明显增加，甚至毒性是微弱的。本发明的慢病毒载体对NK、静息T、静息B或单核细胞、γδT、HSC具有更高的转导效率。

Description

慢病毒载体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及慢病毒载体及其应用。
背景技术
目前临床上针对肿瘤患者有多种治疗手段，比如放化疗、抗体、ADC、免疫检查点抑制剂、免疫细胞治疗等，每种治疗手段各有优势，与其他传统药物不同的是，细胞治疗是一种高度个性化的精准治疗，其药物形式是一种活的免疫细胞。目前在临床上取得突破进展的是CAR-T，其在血液瘤方面具有显著的治疗的效果，但因为自体CAR-T属于高度个性化的精准治疗，其生产和质控成本昂贵、治疗周期较长，且制备成功率不高，因此急需开发通用型的细胞治疗技术。
CAR-NK属于仅次于CAR-T的研究较热门的通用型细胞治疗技术，其依赖于NK的受体识别不受MHC限制，无GvHD风险，另外NK细胞是天然的肿瘤杀伤细胞，可以天然识别并杀伤广谱的肿瘤细胞，加上CAR结构后使得NK对肿瘤细胞的识别更加精准，从而提高其肿瘤的杀伤功能。
不管是CAR-T还是CAR-NK，其制备过程中均涉及到对免疫细胞的基因修饰，也就是CAR基因的导入。常见的CAR基因的导入方式包括慢病毒转导、γ-逆转录病毒转导、脂质体瞬转、电穿孔等，目前主流的针对免疫细胞的CAR基因修饰主要以慢病毒和γ-逆转录病毒转导为主，由于γ-逆转录病毒载体偏向于插入到宿主启动子附近，因此具有更高的插入突变风险，在临床研究中需要更多的考虑到其遗传毒性。相比γ逆转录病毒，慢病毒载体在临床应用中具有更高的安全性。
目前已上市的CAR-T产品大多数采用的是慢病毒载体进行CAR基因修饰。传统的慢病毒载体是经VSV G(水疱性口炎病毒)包膜假型化的HIV-1，其对T细胞具有较高的转导效率，但主要转导处于分裂期的细胞，对于静息状态的细胞几乎没有感染效率。另外对于难转染的细胞如HSC、NK细胞、B细胞几乎没有转导效率。即使在培养基中添加不同细胞因子组合刺激后并使用较高比例的慢病毒转导，在NK细胞上也只能观察到约10％的转导效率，这可能跟NK细胞的天然抗病毒防御机制有关。
除了CAR-NK外，γδT、HSC等都属于比较难转染的细胞，常规的VSVG包膜的慢病毒难以实现稳定的转导。因此迫切需要开发一种新型的慢病毒载体，使其能够稳定高效的转导大多数难以转染的细胞。
在WO2013/045639A1中(法国里昂)，首次公开了使用修饰的狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)包膜糖蛋白假型化的病毒载体转导静止HSC以及静息T和B细胞的方法。该技术涉及的嵌合包膜糖蛋白，包含或由BaEV包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成，即BaEVTR；或修饰的BaEV包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性R肽,即BaEVRless。如图1所示：
该技术的发明主要针对造血系统的遗传障碍(如免疫缺陷)，通过对HSC、静息T或B进行基因修饰，达到基因治疗或免疫治疗的目的。该专利采用GFP为核心表达蛋白，采用BaEV和MLV嵌合组成的包膜糖蛋白融合体假型化的慢病毒载体，与VSV G假型化的慢病毒载体做对比研究，发现对于HSC、静息T和B具有显著的转导效率，但在NK细胞的转导效率，该专利未做相应的研究。
在WO2019121945A1(美天旎)，采用跟上述法国里昂同样的结构设计，将其应用到NK细胞的转导，提供了NK细胞的一种培养转导方案，采用GFP以及CD19 CAR为表达蛋白，研究了与WO2013/045639A1中相同的假型化的慢病毒载体即BaEVTR或BaEVRless，两者在外周血来源的NK细胞上的转导效率。相比VSV G，具有显著的转导效率。
现有技术采用BaEV的跨膜和胞外结构域与MLV的胞质尾进行组合，形成一种嵌合形式的包膜糖蛋白，或者野生型的BaEV去掉R肽。现有技术重点提供了GFP的转导效率，因GFP本身是一个相对比较容易表达的蛋白，而在其他蛋白如CAR这种跨膜蛋白的研究数据较少。综合已报道数据以及本实验室实验验证，现有的技术缺点主要有，(1)相比VSV G包膜，BaEVTR或BaEVRless的病毒滴度急剧下降；(2)BaEVTR或BaEVRless对包装细胞的毒性明显，尤其是BaEVRless，引起293T细胞产生合胞体的现象非常明显。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了慢病毒载体及其应用。
本发明提供了慢病毒载体及其应用。本发明对病毒包膜的胞质尾区进行一系列的优化设计，该区域与病毒颗粒的成熟和出芽效率相关，提高了假型化慢病毒的滴度，并提高了NK细胞的转导效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了PR在制备假型化病毒的包膜胞质尾区蛋白和/或假型化病毒的包膜蛋白中的应用：
所述PR包括PR1和/或PR12：
①、所述PR1具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；或
②、所述PR12具有如SEQ ID No.29所示的氨基酸序列；或
③、在如①或②所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
④、与如①或②所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，
⑤、编码所述PR1的核酸分子具有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；或
⑥、编码所述PR12的核酸分子具有SEQ ID No.30所示的氨基酸序列；或
⑦、在如⑤或⑥所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
⑧、与如⑤或⑥所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述假型化病毒包括慢病毒或γ-逆转录病毒的一种或多种；
所述假型化病毒包括BaEV、HIV、MLV、VSV、RD114或GALV中的一种或多种。
本发明还提供了包膜胞质尾区蛋白，具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、在如(Ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(Ⅲ)、与如(Ⅰ)所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的氨基酸序列。
在上述研究的基础上，本发明还提供了编码所述包膜胞质尾区蛋白的核酸分子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有：
(Ⅳ)、如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
(Ⅴ)、与(Ⅳ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅳ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅵ)、与(Ⅳ)或(Ⅴ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅳ)或(Ⅴ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅶ)、与(Ⅳ)～(Ⅵ)任一项所述核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的核苷酸序列。
本发明还提供了如下任意项在制备假型化病毒的包膜蛋白中的应用。
①)、所述包膜胞质尾区蛋白；和/或
②)、所述核酸分子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述假型化病毒包括慢病毒或γ-逆转录病毒的一种或多种；
所述假型化病毒包括BaEV、HIV、MLV、VSV、RD114或GALV中的一种或多种。
本发明还提供了病毒包膜蛋白，包括所述包膜胞质尾区蛋白、Surface Unit、Ectodomain和TM：
所述Surface Unit、Ectodomain和TM依次具有：
(1)、如SEQ ID
No.43、SEQ ID No.45和SEQ ID No.47所示的氨基酸序列；或
(2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(3)、与如(1)所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒包膜蛋白还包括信号肽；
所述信号肽具有：
1)、如SEQ ID No.41所示的氨基酸序列；或
2)、在如1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
3)、与如1)所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒包膜蛋白具有：
(4)、如SEQ ID No.53或SEQ ID No.75所示的氨基酸序列；或
(5)、在如(4)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(6)、与如(4)所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的氨基酸序列。
本发明还提供了基因元件，包括所述核酸分子、Surface Unit、Ectodomain和TM的核酸分子：
所述Surface Unit、Ectodomain和TM依次具有：
(A)、如SEQ ID No.44、SEQ ID No.46和SEQ ID No.48所示的核苷酸序列；或
(B)、与(A)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(A)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(C)、与(A)或(B)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(A)或(B)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(D)、与(A)～(C)任一项所述核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述基因元件还包括编码信号肽的核酸分子；
所述编码信号肽的核酸分子具有：
A)、如SEQ ID No.42所示的核苷酸序列；或
B)、与A)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(A)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
C)、与A)或B)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与A)或B)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
D)、与A)～C)任一项所述核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述基因元件具有：
(E)、如SEQ ID No.54或SEQ ID No.76所示的核苷酸序列；或
(F)、与(E)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(E)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(G)、与(E)或(F)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(E)或(F)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(H)、与(E)～(G)任一项所述核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的核苷酸序列。
本发明还提供了慢病毒载体，包括所述基因元件。
本发明还提供了如下任意项在包装病毒、提高病毒滴度、降低对包装细胞的毒性和/或提高细胞转导效率中的应用：
③)、所述病毒包膜蛋白；和/或
④)、所述慢病毒载体。
本发明还提供了病毒颗粒，包括所述慢病毒载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒颗粒包括CD276 CAR慢病毒。
本发明还提供了宿主，包括如下任意项：
(J)、所述病毒包膜蛋白；和/或
(K)、转染所述慢病毒载体；和/或
(L)、转导所述病毒颗粒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括Jurkat细胞、NK细胞、T细胞、静息B细胞、单核细胞、γδT细胞或HSC细胞中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述T细胞包括静息T细胞。
本发明还提供了如下任意项在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用：
(a)、所述病毒包膜蛋白；和/或
(b)、所述基因元件；和/或
(c)、所述慢病毒载体；和/或
(d)、所述病毒颗粒；和/或
(e)、所述宿主。
在本发明的一些具体实施方案中，所述产品包括药物和/或疫苗。
本发明还提供了药物，以如下任一项为原材料，以及药学上可接受的辅料或助剂；
(a)、所述病毒包膜蛋白；和/或
(b)、所述基因元件；和/或
(c)、所述慢病毒载体；和/或
(d)、所述病毒颗粒；和/或
(e)、所述宿主。
本发明还提供了药物组合，包括所述药物以及其他任意有效成分。
本发明还提供了治疗方法，向受试者施用如下任意项：
(I)、所述药物；和/或；
(II)、所述药物组合。
本发明还提供了疫苗，包括如下任意项：
(a)、所述病毒包膜蛋白；和/或
(b)、所述基因元件；和/或
(c)、所述慢病毒载体；和/或
(d)、所述病毒颗粒；和/或
(e)、所述宿主。
本发明还提供了预防方法，向受试者施用所述疫苗。
本发明提供了慢病毒载体及其应用。本发明对嵌合包膜的胞质尾区的蛋白酶底物序列进行了优化设计，得到一系列新型嵌合包膜结构，所得包膜结构用来假型化携带CAR基因的慢病毒载体，相比已报道的嵌合型包膜BaEVTR或BaEVRless，本发明的包膜结构假型化的慢病毒载体具有更高的病毒滴度，并且对包装细胞的毒性没有明显增加，甚至毒性是微弱的。所得慢病毒载体对NK、静息T、静息B或单核细胞、γδT、HSC具有更高的转导效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示WO2013/045639A1中BaEVTR嵌合型包膜结构的设计；
图2示本发明中包膜结构设计图；
图3示本发明中CAR结构示意图；
图4示实施例1中慢病毒包装及滴度检测流程图；
图5示实施例2中质粒转染后48h包装细胞HEK-293T的形态图；
图6示实施例2中CD276 CAR慢病毒原液对Jurkat细胞的CAR+结果；
图7示实施例2中CD276 CAR慢病毒原液滴度计算结果图；
图8示实施例2中CD276 CAR慢病毒浓缩液滴度结果图；
图9示实施例3中CD276 CAR慢病毒原液在Donor 1T细胞上的感染率；
图10示实施例3中CD276 CAR慢病毒原液在Donor 2T细胞上的感染率；
图11示实施例4中CD276 CAR慢病毒原液在Donor 1NK细胞上的感染率；
图12示实施例4中CD276 CAR慢病毒原液在Donor 2NK细胞上的感染率；
图13示实施例4中不同包膜组的CAR-NK细胞的拷贝数；
图14示实施例4中不同包膜组的CAR-NK对HCC827靶细胞的杀伤率。
具体实施方式
本发明公开了慢病毒载体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明在已有研究基础上，对嵌合包膜的胞质尾区的蛋白酶底物序列进行了优化设计，得到一系列新型嵌合包膜结构，所得包膜结构用来假型化携带CAR基因的慢病毒载体，相比已报道的嵌合型包膜BaEVTR或BaEVRless，本发明的包膜结构假型化的慢病毒载体具有更高的病毒滴度，并且对包装细胞的毒性没有明显增加，甚至毒性是微弱的。所得慢病毒载体对NK、静息T、静息B或单核细胞、γδT、HSC具有更高的转导效率。
相关术语解释
NK：自然杀伤细胞
CAR-NK：嵌合抗原受体NK细胞
γδT：γδT细胞
HSC：造血干细胞
CBMC:脐带血单个核细胞
VSV G：水疱性口炎病毒
BaEV：狒狒内源性逆转录病毒
BaEVRless：去除R肽的BaEV包膜
MLV：鼠白血病病毒
BaEVTR：BaEV胞外区与MLV胞质尾区嵌合型的包膜的简称
BaEVTR-PR：胞质尾区经氨基酸序列优化的BaEV嵌合型包膜的简称
ADC：抗体偶联药物
GvHD：移植物抗宿主反应
MHC：主要组织免疫复合物
HIV：人类免疫缺陷病毒
HSC：造血干细胞
MMLV：莫洛尼鼠白血病病毒
HTLV：人类T淋巴细胞病毒
EIAV：马传染性贫血病毒
FIV：猫免疫缺陷病毒
MPMV：梅森菲舍猴病毒
本发明将来自天然的逆转录病毒蛋白酶的底物序列，包括HIV-1，HIV-2，MMLV，HTLV，EIAV，FIV，MPMV等进行了逐个筛选，寻找到了适用于嵌合型包膜BaEVTR最适配的底物序列，从而提高嵌合型包膜BaEVTR的病毒滴度。
本发明将来自天然的逆转录病毒蛋白酶的底物序列对BaEVTR包膜进行嵌合型设计，对BaEVTR胞质尾区的氨基酸序列优化设计，并发现该嵌合型包膜假型化CAR慢病毒后，显著提高病毒滴度，降低对包装细胞的毒性。在NK细胞上具有显著的转导效率。
本发明所优化设计的序列来自天然的逆转录病毒蛋白酶的底物序列，包括HIV-1，HIV-2，MMLV，HTLV，EIAV，FIV，MPMV。其中SDT-005、SDT-006、SDT-007序列来自天然HIV-1的逆转录病毒蛋白酶的底物序列，SDT-024来自天然HIV-2的逆转录病毒蛋白酶的底物序列。
本发明对BaEVTR的胞质尾区进行氨基酸序列优化设计后，形成的一种新的包膜结构，命名为BaEVTR-PR，其中PR为来自多种天然的逆转录病毒蛋白酶的底物序列；理论上讲，本发明PR序列不仅适用于BaEVTR，同时适用于其他病毒包膜的改造，包括VSVG，RD114，GALV等。本发明由BaEVTR-PR包膜假型化慢病毒形成的新型慢病毒载体，对原代NK细胞具有显著的转导效率。
(1)本发明包膜结构的设计：
针对BaEVTR的R肽剪切序列，采用来自天然逆转录病毒蛋白酶的底物序列进行替换，形成全新的包膜胞质尾区，如图2所示。
表1
表2
BaEVTR包膜蛋白各元件氨基酸序列及核苷酸序列：
SurfaceUnit Ectodomain TM Cytoplasmic Rpeptide
表3
包膜蛋白的氨基酸及核苷酸序列
氨基酸或核苷酸加粗部分为TM序列，氨基酸或核苷酸下划线部分为Cytoplasmic序列
表4
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(2)CAR结构示意图
慢病毒包装的核心质粒采用靶向CD276靶点的CAR质粒，CAR结构如图3所示。
本发明提供的慢病毒载体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1CD276 CAR慢病毒的包装制备及滴度检测方法
慢病毒包装制备及滴度检测流程图，如图4所示：
①HEK293-T接种：在六孔板中，按每孔1.5E+06cell接种细胞，细胞贴壁后(18h-20h)进行病毒包装；
②病毒包装：采用三质粒病毒包装体系，按照4：2：1的比例依次加入表达CD276CAR的核心质粒(1.5μg)、表达Gag-pol的辅助质粒psPAX2(0.75μg)和表达VSV G、BaEVTR-PR(包括SDT-005～SDT-013、SDT-022～SDT-029，其中SDT-005为带有PR1的BaEVTR，SDT-006为带有PR2的BaEVTR，SDT-007为带有PR3的BaEVTR，SDT-008为带有PR4的BaEVTR，SDT-009为带有PR5的BaEVTR，SDT-010为带有PR6的BaEVTR，SDT-011为带有PR7的BaEVTR，SDT-012为带有PR8的BaEVTR，SDT-013为带有PR9的BaEVTR，SDT-022为带有PR10的BaEVTR，SDT-023为带有PR11的BaEVTR，SDT-024为带有PR12的BaEVTR，SDT-025为带有PR13的BaEVTR，SDT-026为带有PR14的BaEVTR，SDT-027为带有PR15的BaEVTR，SDT-028为带有PR16的BaEVTR，SDT-029为带有PR17的BaEVTR，具体氨基酸序列如表4所示)或BaEVRless的包膜质粒(0.375μg)，充分混匀后，加入质粒用量2-3倍的PEI，混匀在200μl DPBS中，静置孵育15min-20min后，逐滴加入HEK293细胞中；
③48h和72h收集病毒，并2000rpm离心10min，去除细胞碎片；
④1mL原液感染5E+05Jurkat细胞，并按5μg/ml加入助转剂人纤蛋白(近岸蛋白，#GMP-CH38)；
⑤FACS检测CAR+，计算病毒滴度。
实施例2不同包膜结构的CD276 CAR慢病毒在Jurkat细胞的CAR+及活性滴度计算
(1)不同包膜结构的病毒对HEK-293T细胞的毒性(图5)
采用实施例1制备获得的不同包膜结构的CD276 CAR慢病毒转染HEK-293T细胞。在病毒包装过程中，0h将质粒转染293T细胞，24h后即开始产毒，48h对各组的包装细胞进行拍照，观察不同包膜结构对包装细胞293T的毒性，其中SDT-003(BaEVTR),SDT-004(BaEVRless)为专利结构(WO2013/045639A1)。结果发现，SDT-003对细胞毒性较小，而SDT-004的细胞毒性较大，细胞成碎片状。SDT-005,SDT-006，SDT-012，SDT-023，SDT-024,SDT-026,SDT-028,SDT-029细胞形态较明显，合胞体形成也较明显，细胞毒性相对较小。
(2)CD276 CAR慢病毒原液的CAR+及活性滴度计算
相比SDT-003和SDT-004,SDT-005/006/007/012/022/023/024/026/028/029的感染率(CAR+)及病毒滴度具有显著的提升。其中平均CAR+方面，SDT-005相比SDT-003和SDT-004分别有17.09％(p<0.0001)和35.94％(p<0.0001)的提高。SDT-024相比SDT-003和SDT-004分别有约24.88％(p<0.0001)和43.74％(p<0.0001)的提高；而病毒平均滴度方面，SDT-005相比SDT-003和SDT-004分别有1.34倍(p<0.0001)和2.18倍(p<0.0001)的提高，SDT-024相比SDT-003和SDT-004分别有1.5倍(p<0.0001)和2.43倍(p<0.0001)的提高。
表5 CD276 CAR慢病毒原液对Jurkat细胞的CAR+结果
表6 CD276 CAR慢病毒原液对Jurkat细胞的活性滴度计算结果
(3)CD276 CAR慢病毒浓缩液感染率检测及滴度计算
依次收获质粒转染48h和72h后各组的病毒原液，2000r/min离心10min，去除细胞碎片。然后取上清，转速4000g，4℃过夜离心，去除上清，收集沉淀，用DPBS重悬，浓缩400倍，每组分别取10μL/5μL/2.5μL/1.25μL/0.625μL病毒浓缩液感染5.0×10^5Jurkat细胞，感染条件800g离心90min，感染后24h换液，于72h取细胞检测CD276 CAR+，并根据CAR+结果计算病毒滴度。
相比SDT-003和SDT-004，其他所有组的滴度均有2倍甚至2倍以上的提高，尤其是SDT-005/006/007/023/024/028/029。其中SDT-005相比SDT-003和SDT-004分别提高5.06倍和4.82倍。SDT-024相比SDT-003和SDT-004分别提高3.49倍和3.32倍。
表7 CD276 CAR慢病毒浓缩液滴度
实施例3不同包膜结构的CD276病毒在T细胞上的转导效果
(1)PBMC复苏
PBMC，即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
①将购买的PBMC从液氮中取出，在37℃水浴锅中快速融化，将冻存管在水浴锅中反复晃动，保证在2-3min内溶化，直至冻存管中剩下一小团冰晶；②事先准备15mL KBM581培养基在50ml离心管中，小心将冻存管中的细胞转移至50ml离心管，500g升8降6离心10min；③去除上清，HPBS(1％HSA+DPBS)重悬细胞计数并进行T细胞分选。
(2)T细胞分选与激活
①根据PBMC复苏计数结果，按照细胞：磁珠＝1：3的比例添加分选激活磁珠(Gibco，11132D)；
②吸取所需体积的磁珠至含有HPBS的冻存管中，充分混匀后放入磁力架，静置2min后，吸弃上清，从磁力架上取下冻存管加入1ml HPBS，混匀；
③T细胞分选，将混匀的细胞悬液加入洗涤好的磁珠冻存管中混匀，放入四维混合仪，室温摇晃孵育30min；
④孵育之后，将离心管插入磁力架，静置2min，弃掉上清，将管子取下，加入T细胞完全培养液重悬，计数，调整密度为1.0E+06cells/ml继续培养,48小时后进行病毒转导。
(3)慢病毒转导
①分选后的T细胞培养48小时后，计数统计细胞数量；
②病毒与Novonectin孵育，根据T细胞数量，在24孔板中加入1.5ml病毒原液和2.25μg(1.5μg/ml)Novonectin助转剂，在37℃培养箱孵育30min；
③500g升8降6离心10min收集T细胞，去掉上清，用1ml培养基重悬细胞，计数并调整细胞密度为4.0E+06cells/ml，取200μl细胞液加入孵育之后的24孔板中，并补充150μl胎牛血清；
④离心转导，将24孔板放入离心机，800g、升5降1、32℃离心1.5小时；
⑤离心之后,将24孔板放入二氧化碳培养箱，24小时后离心换液；
(4)CAR+检测
CAR+检测操作方法
①包膜病毒离心转导T细胞72h后，将细胞收集到15ml离心管中，放置到磁力架磁分2min，收集上清；
②将收集的上清500g离心10min，用完全培养基重悬后计数取5.0E+05细胞；
③用FACS Buffer清洗一遍，然后加入抗体，4℃染色20min；
④染色之后，用FACS Buffer再清洗一遍，用流式细胞仪进行检测CAR+；
Donor 1结果分析：
VSV G包膜的慢病毒对T细胞的感染率最为显著，符合现在的研究报道。相比SDT-003和SDT-004，SDT-005/007/024/028的感染率较显著。相比SDT-003和SDT-004，SDT-005分别提高12.71倍和1.42倍，SDT-024的感染率分别提高17.1倍和1.9倍。
表8 CD276 CAR慢病毒原液在T细胞上的感染率(Donor 1)
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Donor 2结果分析：
相比SDT-003和SDT-004，SDT-005/007/024/028的感染率较显著。相比SDT-003和SDT-004，SDT-005分别提高4.51倍和3.25倍，SDT-024的感染率分别提高5.93倍和4.27倍。
表9 CD276 CAR慢病毒原液在T细胞上的感染率(Donor 2)
包膜 CAR+ 包膜 CAR+
SDT-003 8.52％ SDT-024 50.52％
SDT-004 11.83％ SDT-025 1.75％
SDT-005 38.45％ SDT-026 25.22％
SDT-006 31.06％ SDT-027 0.12％
SDT-007 20.50％ SDT-028 39.17％
SDT-012 21.56％ SDT-029 20.83％
SDT-022 19.88％ SDT-001 83.04％
SDT-023 28.23％ / /
实施例4不同包膜结构的CD276病毒在NK细胞上的转导效果
(1)PBMC复苏
PBMC指外周血单个核细胞，即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞；非骨髓血中的单核造血干细胞、骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，这样得到的干细胞称为外周血单个核细胞。
复苏步骤：①将购买的PBMC从液氮中取出，在37℃水浴锅中快速融化，将冻存管在水浴锅中反复晃动，保证在2-3min内溶化，直至冻存管中剩下一小团冰晶；②事先准备15mLKBM581培养基在50ml离心管中，小心将冻存管中的细胞转移至50ml离心管，500g升8降6离心10min；③去除上清，HPBS(1％HSA+DPBS)重悬细胞计数并进行T细胞分选。
(2)NK细胞激活培养
①根据PBMC复苏计数结果，使用分选激活磁珠(Gibco，#11132D)，按磁珠体积＝细胞数×CD3+％×3÷4.0E+07；
②吸取所需体积的磁珠至含有HPBS的冻存管中，充分混匀后放入磁力架，静置2min后，吸弃上清，从磁力架上取下冻存管加入1ml HPBS，混；
③T细胞分选，将混匀的细胞悬液(5.0E+06cells/ml-1.0E+07cells/ml)加入洗涤好的磁珠冻存管中混匀，放入四维混合仪，室温摇晃孵育30min；
④孵育之后，将离心管插入磁力架，静置2min，收集上清，取下管子重新加入1ml洗液，收集上清计数；
⑤根据计数结果，按NK细胞数量1：1比例添加滋养层细胞，最后NK细胞调整为1.0E+06cells/ml密度进行培养，每培养7天按1：1添加滋养层细胞，Day4进行NK细胞转导；
(3)慢病毒转导
①NK细胞培养第四天时，计数统计细胞数量；
②病毒与Novonectin孵育，根据NK细胞数量，在24孔板中加入1.7ml病毒原液和2.55μg(1.5μg/ml)Novonectin助转剂，在37℃培养箱孵育30min；
③500g升8降6离心10min收集NK细胞，去掉上清，用1ml培养基重悬细胞，计数并调整细胞密度为4.5E+06cells/ml，取200μL细胞液加入孵育之后的24孔板中，并补充150μL胎牛血清；
④离心转导，将24孔板放入离心机，800g、升5降1、32℃离心1.5小时；
⑤离心之后,将24孔板放入二氧化碳培养箱，24小时后离心换液；
(4)CAR+检测
①包膜病毒离心转导NK细胞72h后，将细胞收集到15ml离心管中500g离心10min，用完全培养基重悬后计数取5.0E+05细胞；
②用FACS Buffer清洗一遍，然后加入抗体，4℃染色20min；
③染色之后，用FACS Buffer再清洗一遍，用流式细胞仪进行检测CAR+；
实验结果：
Donor 1：
相比SDT-003和SDT-004，SDT-005/006/007/022/024在NK上的感染率均有不同水平的提高，其中SDT-005相比SDT-003和SDT004分别提高2.06倍和1.57倍，SDT-024相比SDT-003和SDT004分别提高2.38倍和1.81倍。
表10 CD276 CAR慢病毒原液在NK细胞上的感染率(Donor 1)
包膜 CAR+ 包膜 CAR+
SDT-003 32.19％ SDT-023 28.06％
SDT-004 42.42％ SDT-024 76.68％
SDT-005 66.40％ SDT-026 40.95％
SDT-006 56.36％ SDT-028 31.83％
SDT-007 60.13％ SDT-029 43.96％
SDT-012 35.87％ VSVG 1.45％
SDT-022 48.42％ / /
Donor 2
相比SDT-003和SDT-004，SDT-005/006/007/024在NK上的感染率均有不同水平的提高，其中SDT-005相比SDT-003和SDT004分别提高1.92倍和1.42倍，SDT-024相比SDT-003和SDT-004分别提高1.98倍和1.47倍。
表11 CD276 CAR慢病毒原液在NK细胞上的感染率(Donor 2)
包膜 CAR+ 包膜 CAR+
SDT-003 45.03％ SDT-023 25.25％
SDT-004 60.81％ SDT-024 89.12％
SDT-005 86.36％ SDT-026 53.31％
SDT-006 77.90％ SDT-028 33.52％
SDT-007 78.98％ SDT-029 53.44％
SDT-012 59.25％ VSVG 1.54％
SDT-022 59.35％ / /
(4)拷贝数(VCN)检测
携带CAR基因的慢病毒载体感染宿主细胞后，CAR基因随机整合到宿主基因组内，CAR基因的整合效率一般用CAR+和载体拷贝数(VCN)来评估，两者分别从细胞水平和基因水平反映了CAR基因的转导效率。从细胞药品的临床角度出发，既要保证较高的CAR+，从而实现细胞药品显著的功能，又要保证较低的载体拷贝数，从而实现较高的产品安全性，因为较高的VCN容易引发细胞癌变的可能，从目前已申报上市的CAR-T产品及监管机构的指导原则看，VCN小于5是较安全的范围。
本实验以慢病毒载体的保守元件WPRE(NCBI#35269)为检测基因，因为WPRE和CAR基因同在一个载体上，同时整合到宿主基因组内，因此检测WPRE的拷贝数间接反映了CAR基因的拷贝数水平，细胞骨架蛋白β-actin为内参基因。方法结果如下：
①收集2.0E+06-5.0E+06数量的CAR-NK细胞，用DNA提取试剂盒(QIAGEN，51106)提取DNA；
②按下表配制QPCR反应体系
表12检测基因WPRE反应体系
名称 体积(μL)
PremixExTaq(ProbeqPCR)(2X) 10
引物F(10μM) 0.4
引物R(10μM) 0.4
探针(10μM) 0.8
ROXReferenceDye 0.2
DNA模板 2(总量为100ng)
灭菌水 6.2
Total 20μL
表13引物序列
③按下表反应程序进行实验
表14
④反应结束后，按以下公式整理数据计算拷贝数；
CAR+细胞拷贝数(copies/cell)＝CAR(copies/μL)/[内参拷贝数/2](cells/μL)/CAR+(％)。
实验结果：从检测结果看，除了VSV G组，其余由BaEV包膜衍生的慢病毒载体拷贝数平均水平均在3.5以内，各组之间没有显著性差异。证明了BaEVTR-PR结构包膜对于目的基因的整合是相对安全的。
表15拷贝数(VCN)检测
(5)体外杀伤验证
①将靶细胞按每孔10000cell/100μL加入96孔白板；
②按实验设定的效靶比计算效应细胞用量，然后在透明96孔板中进行稀释，一般做6个梯度稀释的效靶比；
③将稀释后的效应细胞取100μL转移到靶细胞中(96孔白板)；
④靶细胞和效应细胞接种后，将96孔白板放入二氧化碳培养箱培养；
⑤16-18小时后，加入ONE-Glo底物(Promega，#E6120)后，用酶标仪进行检测；
实验结果:从细胞杀伤结果看，不同包膜组的CAR-NK对HCC827靶细胞都有杀伤作用，相对于NK组均有显著性差异，各组之间的整体差异性不大。
表16
显著性差异分析
Two-way ANOVA
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (22)

1.PR在制备假型化病毒的包膜胞质尾区蛋白和/或假型化病毒的包膜蛋白中的应用：
所述PR包括PR1和/或PR12：
①、所述PR1具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；或
②、所述PR12具有如SEQ ID No.29所示的氨基酸序列；或
③、在如①或②所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
④、与如①或②所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述假型化病毒包括慢病毒或γ-逆转录病毒的一种或多种；
所述假型化病毒包括BaEV、HIV、MLV、VSV、RD114或GALV中的一种或多种。
3.包膜胞质尾区蛋白，其特征在于，具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、在如(Ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(Ⅲ)、与如(Ⅰ)所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的氨基酸序列。
4.编码如权利要求3所述的包膜胞质尾区蛋白的核酸分子。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，具有：
(Ⅳ)、如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
(Ⅴ)、与(Ⅳ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅳ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅵ)、与(Ⅳ)或(Ⅴ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅳ)或(Ⅴ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅶ)、与(Ⅳ)～(Ⅵ)任一项所述核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的核苷酸序列。
6.如下任意项在制备假型化病毒的包膜蛋白中的应用：
①)、如权利要求3所述的包膜胞质尾区蛋白；和/或
②)、如权利要求4或5所述的核酸分子。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述假型化病毒包括慢病毒或γ-逆转录病毒的一种或多种；
所述假型化病毒包括BaEV、HIV、MLV、VSV、RD114或GALV中的一种或多种。
8.病毒包膜蛋白，其特征在于，包括如权利要求3所述的包膜胞质尾区蛋白、SurfaceUnit、Ectodomain和TM：
所述Surface Unit、Ectodomain和TM依次具有：
(1)、如SEQ ID No.43、SEQ ID No.45和SEQ ID No.47所示的氨基酸序列；或
(2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(3)、与如(1)所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的病毒包膜蛋白，其特征在于，具有：
(4)、如SEQ ID No.53或SEQ ID No.75所示的氨基酸序列；或
(5)、在如(4)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(6)、与如(4)所示的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的氨基酸序列。
10.基因元件，其特征在于，包括如权利要求4或5所述的核酸分子、Surface Unit、Ectodomain和TM的核酸分子：
所述Surface Unit、Ectodomain和TM依次具有：
(A)、如SEQ ID No.44、SEQ ID No.46和SEQ ID No.48所示的核苷酸序列；或
(B)、与(A)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(A)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(C)、与(A)或(B)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(A)或(B)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(D)、与(A)～(C)任一项所述核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的核苷酸序列。
11.如权利要求10所述的基因元件，其特征在于，具有：
(E)、如SEQ ID No.54或SEQ ID No.76所示的核苷酸序列；或
(F)、与(E)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(E)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(G)、与(E)或(F)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(E)或(F)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(H)、与(E)～(G)任一项所述核苷酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的核苷酸序列。
12.慢病毒载体，其特征在于，包括如权利要求10或11所述的基因元件。
13.如下任意项在包装病毒、提高病毒滴度、降低对包装细胞的毒性和/或提高细胞转导效率中的应用：
③)、如权利要求8或9所述的病毒包膜蛋白；和/或
④)、如权利要求12所述的慢病毒载体。
14.病毒颗粒，其特征在于，包括如权利要求12所述的慢病毒载体。
15.宿主，其特征在于，包括如下任意项：
(J)、如权利要求8或9所述的病毒包膜蛋白；和/或
(K)、转染如权利要求12所述的慢病毒载体；和/或
(L)、转导如权利要求14所述的病毒颗粒。
16.如下任意项在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用：
(a)、如权利要求8或9所述的病毒包膜蛋白；和/或
(b)、如权利要求10或11所述的基因元件；和/或
(c)、如权利要求12所述的慢病毒载体；和/或
(d)、如权利要求14所述的病毒颗粒；和/或
(e)、如权利要求15所述的宿主。
17.如权利要求16所述的产品，其特征在于，所述产品包括药物和/或疫苗。
18.药物，其特征在于，以如下任一项为原材料，以及药学上可接受的辅料或助剂；
(a)、如权利要求8或9所述的病毒包膜蛋白；和/或
(b)、如权利要求10或11所述的基因元件；和/或
(c)、如权利要求12所述的慢病毒载体；和/或
(d)、如权利要求14所述的病毒颗粒；和/或
(e)、如权利要求15所述的宿主。
19.药物组合，其特征在于，包括如权利要求18所述的药物以及其他任意有效成分。
20.治疗方法，其特征在于，向受试者施用如下任意项：
(I)、如权利要求18所述的药物；和/或；
(II)、如权利要求19所述的药物组合。
21.疫苗，其特征在于，包括如下任意项：
(a)、如权利要求8或9所述的病毒包膜蛋白；和/或
(b)、如权利要求10或11所述的基因元件；和/或
(c)、如权利要求12所述的慢病毒载体；和/或
(d)、如权利要求14所述的病毒颗粒；和/或
(e)、如权利要求15所述的宿主。
22.预防方法，其特征在于，向受试者施用如权利要求21所述的疫苗。
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