CN105462941A - 一种生物素化atps的表达方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生物素化ATPS的表达方法。该方法将一种生物素受体蛋白编码基因(ATGGCTTTCTCTCTGCGTTCTATCCTGGAAGCTGGTAAAATGGAACTGCGTAACACCCCGGGTGGTTCT)构建于大肠杆菌表达载体中，获得重组表达载体；再将酿酒酵母ATPS编码基因构建于该重组表达载体中生物素受体蛋白编码基因的下游，转化大肠杆菌宿主细胞并进行诱导表达培养。按照本发明提供方法表达的生物素化ATPS均以可溶形式存在，产量达到26.7～35.6mg/100mL培养基，比活力达到5.9×104～6.8×104U/mg，能够有效地和连接着亲和素的磁珠结合，并用于焦磷酸测序反应。

Description

一种生物素化ATPS的表达方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种生物素化ATPS的表达方法。
背景技术
ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase，ATPS，EC2.7.7.4)是一种可逆催化腺苷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfate，APS)与焦磷酸盐(pyrophosphate，PPi)反应生成三磷酸腺苷(ATP)与硫酸盐的酶，在生物体硫代谢中发挥重要作用。ATP硫酸化酶广泛存在于植物、动物及微生物中。目前，科研工作者已成功从酿酒酵母、产黄青霉菌、拟南芥根瘤菌、端嗜热微生物中分离纯化出ATP硫酸化酶，并且成功从真核生物、植物和动物中克隆出ATP硫酸化酶的编码基因并实现其异源表达。ATP硫酸化酶偶联荧光素酶可以应用于PPi定量、DNA聚合酶酶活测定以及焦磷酸测序技术等方面。
焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是新一代的利用生物发光反应进行序列测定的技术，它是由DNA聚合酶(polymerase)、ATPS、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)四种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和上述4种酶构成，反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)和荧光素(luciferin)。在每一轮测序反应中，只加入四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的一种，若该dNTP能够与DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的催化下，将其掺入到测序引物链的3’末端，同时释放出一分子的PPi；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成等量的ATP；生成的ATP在荧光素酶的催化下，可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
近年来出现了一种高通量光导纤维皮升级微反应池阵列焦测序技术，该技术一次可以测定上百万个样品，其出现带来了测序技术的革命，这极大地推动了后基因组计划的发展。然而，这种高通量焦磷酸测序技术需要将包括ATPS在内的测序反应体系的四种酶固定在微球表面。为了实现固定化，ATPS需要经过生物素标记，通过与微球表面的链亲和素反应，从而被固定在微球表面。目前实现ATP硫酸化酶生物素化的手段主要有化学修饰法和生物修饰法两种。化学修饰法主要通过化学反应将生物素连接到蛋白质中赖氨酸残基游离氨基上。生物修饰法制备生物素化ATPS是通过将大肠杆菌生物素酰基载体蛋白(biotincarboxylcarrierprotein)的C端87个氨基酸(BCCP87)作为生物素受体，与ATPS构建到同一表达载体上，并进行融合表达，在大肠杆菌生物素合成酶(biotinholoenzymesynthetase,BirA)的催化下，使融合表达的ATPS连上生物素。例如，有研究公开以大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增BCCP87基因并酶切后，再将其克隆到含有ATPS基因的质粒pET28a(+)-ATPS(a)中ATPS基因的上游，获得重组表达载体，转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)后，诱导培养后获得的融合蛋白具有ATPS的活性，且能够在且能够在大肠杆菌内被生物素化(邹秉杰,罗娟,武海萍,周国华.生物素化ATP硫酸化酶的表达、固定化与应用[J].生物化学与生物物理进展，2009，07:923-928)。
化学修饰法制备生物素化ATPS存在操作繁琐、产物不均一的缺点。此外，在化学修饰的过程中，如果处于蛋白质活性中心的赖氨酸残基被修饰，就很可能影响到蛋白质的活性。生物修饰法虽然可以避免上述缺点，但利用BCCP87和ATPS构建的重组表达载体在进行融合表达时，由于需要多表达87个氨基酸残基，一定程度降低了融合蛋白的表达量；并且存在部分包涵体表达的重组蛋白；表达出的融合蛋白ATPS活性相对较低。因此，无法更好地满足实际应用。
综上所述，提供一种更加高效的生物素化ATPS的表达方法，使得表达的生物素化ATPS的产量与活性均大幅提高，是实际应用中亟待解决的问题。
发明内容
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
本发明要解决的问题是提供一种生物素化ATPS的表达方法，该表达方法表达生物素化ATPS的产量和活性均高于现有技术。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种生物素化ATPS的表达方法，其中：使用一种由23个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白，将上述生物素受体蛋白的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得一种携带上述生物素受体蛋白编码基因的重组表达载体，当ATPS的编码基因插入到上述重组表达载体中生物素受体蛋白编码基因的下游时，能够表达该生物素受体蛋白和ATPS的融合蛋白，表达的融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰。
其中，所述的生物素受体蛋白的序列如SEQIDNO：1所示：MAFSLRSILEAGKMELRNTPGGS
一种生物素化ATPS的表达方法，包括以下步骤：
⑴.合成一种生物素受体蛋白编码基因；
⑵.将步骤⑴所述的生物素受体蛋白编码基因构建于大肠杆菌表达载体，获得重组表达载体A；
⑶.将酿酒酵母ATPS编码基因构建于步骤⑵所得的重组表达载体A中生物素受体蛋白编码基因的下游，获得重组表达载体B；
⑷.用步骤⑶所得的重组表达载体B转化大肠杆菌宿主细胞，获得重组基因工程菌A；
⑸.以步骤⑷所得的重组基因工程菌A作为生产菌株，进行诱导表达培养。
本发明所述的表达方法步骤⑴中所述的生物素受体蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示:
ATGGCTTTCTCTCTGCGTTCTATCCTGGAAGCTGGTAAAATGGAACTGCGTAACACCCCGGGTGGTTCT
本发明所述的表达方法步骤⑵中所述的大肠杆菌表达载体为pMAL-p5E或pMAL-p5X中的任意一个；优选为pMAL-p5X。
本发明所述的表达方法步骤⑶中所述的酿酒酵母ATPS编码基因可以是GenBank编号为NM_001181668.3的基因；该基因可以通过化学全合成或PCR扩增的方法获得。
本发明所述的表达方法步骤⑷中所述的大肠杆菌宿主细胞为E.coliK12或E.coliBL21(DE3)中的任意一个；优选为E.coliK12。
本发明所述的表达方法步骤⑸中所述的诱导表达培养的方法为：挑取生产菌株单菌落接种于LB培养基，37℃培养12h，获得种子液；将上述种子液以5％(v/v)的接种量接种于LB培养基，37℃培养3小时后，加入终浓度为0.02mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，28℃培养24h。
按照本发明所述的表达方法表达的生物素化ATPS可以采用Amylose亲和层析柱进行分离纯化。
本发明的有益效果：
本发明提供的表达方法中，使用的生物素受体蛋白只有23个氨基酸残基，比现有技术中使用的生物素受体BCCP87少64个氨基酸残基，能够减少宿主细胞的合成负担，提高生物素化ATPS的表达量，并且对ATPS的活性影响小。按照本发明提供的方法表达的生物素化ATPS均以可溶形式存在，无包涵体状态；生物素化ATPS的产量高，能够达到26.7～35.6mg/100mL培养基，比现有技术提高了65％以上；表达的生素化ATPS活性高，比活力达到5.9×104～6.8×104U/mg，比现有技术提高了40％以上。利用本发明提供的表达方法表达的生物素化ATPS，能够有效地和连接着亲和素的磁珠结合，并用于焦磷酸测序反应。制备的磁珠-ATPS在1次洗涤后，活力几乎不受影响；在2次洗涤后，仍能保持相较于洗涤前98％以上的相对活力。
附图说明
图1为酿酒酵母ATPS编码基因PCR扩增结果。M:核酸分子量Marker；Lane1-Lane3：酿酒酵母ATPS编码基因。
图2为本发明表达的生物素化ATPS的SDS-PAGE结果。M：蛋白质分子量Marker；Lane1：细胞破碎后的上清；Lane2：细胞破碎后的沉淀。表达的生物素化ATPS全部存在于上清液，说明其全部以可溶状态存在。
图3为本法明表达的生物素化ATPS的纯化结果。M：蛋白质分子量Marker；Lane1：纯化后的生物素化ATPS。
图4为本发明表达的生物素化ATPS与磁珠进行固定化后所得的磁珠-ATPS进行焦测序的结果。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明涉及的以下英文名称的含义为：Tris-Ac指利用三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制的缓冲液；Tris-HCl指利用三羟甲基氨基甲烷(Tris)和盐酸配制的缓冲液；EDTA指四乙酸二氨基乙烷；BSA指牛血清白蛋白；DTT指二硫苏糖醇；PVP指聚乙烯吡咯烷酮。
本发明所用宿主菌株E.coliK12和E.coliBL21(DE3)感受态细胞购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；质粒pMAL-p5E和pMAL-p5X、购自NEB公司；限制性内切酶购于NEB公司；核酸序列的化学合成由上海生工生物工程公司完成；DNA凝胶回收试剂盒与PCR产物清洁试剂盒购自Axygen公司；磁珠混悬液购自Invitrogen公司；Amylose亲和层析柱购自NEB公司；超微量蛋白浓度测定仪购自Nanodrop公司，型号为ND2000；PPi和APS购自sigma公司；d-虫荧光素和荧光素酶购自Promega公司；生物发光检测仪购自Promega公司，型号为GloMax20/20；BPCL微量发光检测仪购自北京建新力拓科技有限公司；其余试剂购自Sigma-Aldrich公司。
实施例1生物素化ATPS的表达方法
包括以下步骤：
⑴.在SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的上游和下游分别引入NdeⅠ和NotⅠ的酶切位点以及相应保护碱基，得到如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，命名为序列A1，化学全合成序列A1；
⑵.用限制性内切酶NdeⅠ和NotⅠ酶切pMAL-p5E质粒和实施例1步骤⑴所得序列A1，并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，将酶切后的核苷酸序列A1和pMAL-p5E质粒于16℃连接过夜，获得重组表达载体A1；
⑶.设计引物特异性引物，以酿酒酵母基因组DNA为模板，PCR扩增酿酒酵母ATPS编码基因：正向引物的酶切位点为EcoRⅤ，序列如SEQIDNO：4所示，反向引物的酶切位点为BamHⅠ，序列如SEQIDNO：5所示，PCR程序为：95℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min；并用PCR清洁试剂盒回收PCR产物，得到酿酒酵母ATPS编码基因，扩增结果如图1所示；
⑷.用限制性内切酶EcoRⅤ和BamHⅠ酶切实施例1步骤⑶所得酿酒酵母ATPS编码基因和实施例1步骤⑵所得重组表达载体A1，将酶切后的酿酒酵母ATPS编码基因和重组表达载体A1于16℃连接过夜，获得重组表达载体B1；
⑸.用实施例1步骤⑷所得重组表达载体B1转化E.coliK12感受态细胞，获得重组基因工程菌A1；
⑹.挑取实施例1步骤⑸所得重组基因工程菌A1单菌落接种于5mL含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12h，获得种子液；将上述5mL种子液全部接种于100mL含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入终浓度为0.02mM的IPTG，28℃培养24h，表达结果如图2所示。
实施例2生物素化ATPS的表达方法
包括以下步骤：
⑴.在SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的上游和下游分别引入NdeⅠ和NotⅠ的酶切位点以及相应保护碱基，得到如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，命名为序列A1，化学全合成序列A1；
⑵.用限制性内切酶NdeⅠ和NotⅠ酶切pMAL-p5X质粒和实施例2步骤⑴所得序列A1，并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，将酶切后的核苷酸序列A1和pMAL-p5X质粒于16℃连接过夜，获得重组表达载体A2；
⑶.设计引物特异性引物，以酿酒酵母基因组DNA为模板，PCR扩增酿酒酵母ATPS编码基因：正向引物的酶切位点为NotⅠ，序列如SEQIDNO：6所示，反向引物的酶切位点为BamHⅠ，序列如SEQIDNO：5所示，PCR程序同实施例1步骤⑶；用PCR清洁试剂盒回收PCR产物，得到酿酒酵母ATPS编码基因；
⑷.用限制性内切酶NotⅠ和BamHⅠ酶切实施例2步骤⑶所得酿酒酵母ATPS编码基因和实施例2步骤⑵所得重组表达载体A2，将酶切后的酿酒酵母ATPS编码基因和重组表达载体A2于16℃连接过夜，获得重组表达载体B2；
⑸.用实施例2步骤⑷所得重组表达载体B2转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，获得重组基因工程菌A2；
⑹.挑取实施例2步骤⑸所得重组基因工程菌A2单菌落接种于5mL含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12h，获得种子液；将上述5mL种子液全部接种于100mL含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入终浓度为0.02mM的IPTG，28℃培养24h。
实施例3生物素化ATPS的纯化
将按照实施例1或2的方法表达的生物素化ATPS利用Amylose亲和层析柱进行纯化。
纯化方法，包括以下步骤：
⑴.离心收集诱导表达培养后的菌体，超声波破碎菌体，将破碎液于4℃、12000rpm，离心30分钟，收集上清液；
⑵.使用10倍柱床体积的平衡缓冲液(终浓度15mMTris-HCl+终浓度150mMNaCl+终浓度0.5mMEDTA)平衡Amylose亲和层析柱；
⑶.将上清液以1mL/min的流速加入Amylose亲和层析柱，使目的蛋白挂柱；
⑷.用20倍柱床体积的平衡缓冲液漂洗至基本无杂蛋白；
⑸.用洗脱缓冲液液(平衡缓冲液+终浓度15mM麦芽糖)洗脱目的蛋白，并以1mL/tube的体积收集目的蛋白。
按照实施例2的表达方法表达的生物素化ATPS的纯化结果如图3所示。
按照实施例1和实施例2的方法表达的生物素化ATPS，经纯化后，超微量蛋白浓度测定仪测定其浓度分别为9.8mg/mL和7.9mg/mL，生物素化ATPS总量分别为35.6mg/100mL培养基和26.7mg/100mL。
实施例4表达产物的固定化
固定化方法：取10μL链亲合素包被的磁珠混悬液DynabeadsM-280Streptavidin静置于磁铁上1min后，弃去上清液；用50μL洗涤缓冲液(20mMTris-HCl(pH7.7)+0.5mMEDTA+2mMNaCl+0.02％(w/v)BSA，1mMDTT)洗涤磁珠两次；用40μL洗涤缓冲液重选磁珠后，加入10μL纯化后的生物素化ATPS混匀，4℃放置1h，得到溶液A；将溶液A静置于磁铁上，待磁珠完全集中后弃去上清液，用洗涤缓冲液洗涤磁珠两次，最后将磁珠悬于10μL洗涤缓冲液中，获得磁珠-ATPS。
实施例5ATPS活性测定
利用ATPS和荧光素酶两步偶联反应测定ATPS的酶活。
标准测活反应液的组成为：0.1mMTris-Ac(pH7.75)、0.5mMEDTA、5mMMgAc2、0.4mg/mLPVP、0.02％(w/v)BSA、1mMDTT、4μMPPi、4μMAPS、0.4mMd-虫荧光素和1.46μg/mL荧光素酶。
ATPS酶活定义为：在25℃，在1min内将APS和PPi转化生成1.0μmol的ATP所用的酶量为1个活力单位(U)。
活性测定方法：取上述标准测活反应液50μL于生物发光检测仪中进行基线测定；然后快速加入1μL浓度为6×10-5mg/mL的ATPS酶液，混合均匀后置于生物发光检测仪中进行实时测定。
将按照实施例1的表达方法和实施例3的纯化方法纯化所得的生物素化ATPS编号为样品1；
将样品1按照实施例4的固定化方法固定所得的磁珠-ATPS编号为样品2；
将样品2用实施例4所述的洗涤缓冲液洗涤1次后所得的磁珠-ATPS编号为样品3；
将样品3用实施例4所述的洗涤缓冲液洗涤1次后所得的磁珠-ATPS编号为样品4；
将按照实施例2的表达方法和实施例3的纯化方法纯化所得的生物素化ATPS编号为样品5；
将样品5按照实施例4的固定化方法固定所得的磁珠-ATPS编号为样品6；
将样品6用实施例4所述的洗涤缓冲液洗涤1次后所得的磁珠-ATPS编号为样品7；
将样品7用实施例4所述的洗涤缓冲液洗涤1次后所得的磁珠-ATPS编号为样品8。
分别利用上述活性测定方法对样品1-8进行测定，测定结果如下表所示：
实施例6ATPS用于焦磷酸测序
标准测序反应液的组成为：0.1mMTris-Ac(pH7.75)、2U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶、0.5mMEDTA、90U/mLKlenow(exo-)DNA聚合酶、5mMMgAc2、0.4mg/mLPVP、0.02％(w/v)BSA、1mMDTT、4μMAPS、0.4mMd-虫荧光素和1.46μg/mL荧光素酶和0.2U/mLATPS。待测序序列为5’-ATTGCATT-3’。
测序方法：首先将上述标准测序反应液置于BPCL微量发光检测仪中测定基线，然后按照A-T-G-C的顺序依次加入相应的dNTP，测定产生的信号。利用实施例5中涉及的样品2和样品6对待测序序列测定，测序结果如图4所示。

Claims (7)

1.一种生物素化ATPS的表达方法，其特征在于：所述表达方法通过使用一种由23个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白，将上述生物素受体蛋白的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得一种携带上述生物素受体蛋白编码基因的重组表达载体，当ATPS的编码基因插入到上述重组表达载体中生物素受体蛋白编码基因的下游时，能够表达该生物素受体蛋白和ATPS的融合蛋白，表达的融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰；
其中，所述的生物素受体蛋白的序列为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：所述表达方法包括以下步骤：
⑴.合成一种生物素受体蛋白编码基因；
⑵.将步骤⑴所述的生物素受体蛋白编码基因构建于大肠杆菌表达载体，获得重组表达载体A；
⑶.将酿酒酵母ATPS编码基因构建于步骤⑵所得的重组表达载体A中生物素受体蛋白编码基因的下游，获得重组表达载体B；
⑷.用步骤⑶所得的重组表达载体B转化大肠杆菌宿主细胞，获得重组基因工程菌A；
⑸.以步骤⑷所得的重组基因工程菌A作为生产菌株，进行诱导表达培养；
其中，一种生物素受体蛋白编码基因的序列为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑶中的酿酒酵母ATPS编码基因的GenBank编号为NM_001181668.3。
4.如权利要求2或3所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑵中的大肠杆菌表达载体为pMAL-p5E或pMAL-p5X中的任意一个。
5.如权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑵中的大肠杆菌表达载体为pMAL-p5X。
6.如权利要求2或3所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑷中的大肠杆菌宿主细胞为E.coliK12或E.coliBL21(DE3)中的任意一个。
7.如权利要求6所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑷中的大肠杆菌宿主细胞为E.coliK12。
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