CN105400749B - 一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法 - Google Patents

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    • C12Y306/01001—Inorganic diphosphatase (3.6.1.1)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，其中：使用一种由23个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白BAP23，将BAP23的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中后，获得重组表达载体，当无机焦磷酸酶编码基因插入到上述重组表达载体中后，表达的融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰。按照本发明提供的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶的产量达到21～38mg/100mL培养基；比活力达到94.2～151.6U/mg。表达的生物素化无机焦磷酸酶被磁珠固定后得到的Bead‑LUC被反复洗涤3次后，催化活力几乎不受影响；被反复洗涤15次后，仍能够维持相较于洗涤前91％以上的相对活力。

Description

一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法。
背景技术
无机焦磷酸酶(Inorganic Pyrophosphatase,PPase,EC3.6.1.1)是一类能够催化焦磷酸水解为正磷酸的酶。焦磷酸(Pyrophosphoric acid，PPi)是生物体内DNA和RNA聚合、氨基酸活化、氨酰tRNA合成、脂肪酸的β-氧化、脂酰辅酶A合成、纤维素合成、葡萄糖合成以及淀粉合成等过程的副产物，PPase通过分解PPi可使上述反应向合成方向进行并为多种生物合成反应提供能量。PPase广泛存在于自然界，在动物、植物和微生物中均有发现，并随着技术手段的发展，现已成功地从日本吸血虫、水稻、大麦、烟草、酵母、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌以及嗜热细菌中获得了PPase的cDNA克隆。生物体内存在无机焦磷酸酶共分为四类：膜结合的无机焦磷酸酶(H+-PPase)和可溶性的家族I、II、III三类无机焦磷酸酶。根据其细胞定位与亚基结构，PPase在催化反应中，需要结合三或四个2价金属阳离子，例如二价镁离子(Mg2+)。PPase在体外具有增强DNA聚合酶的扩增效率以及增强RNA聚合酶在体外转录反应中的产量的功能。除此之外，PPase在焦磷酸测序等DNA测序技术中发挥重要作用。
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是利用生物发光反应进行序列测定的新一代测序技术。其基本原理为：在每一轮测序反应中，只加入四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的一种，若该dNTP能够与DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的催化下，将其掺入到测序引物链的3’末端，同时释放出一分子的PPi；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和5’-磷酰硫酸(Adenosine-5’-phosphosulfat，APS)结合形成等量的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)；生成的ATP在荧光素酶的催化下，可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比；如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰；反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)的作用下发生降解；待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。近年来出现了一种高通量光导纤维微反应池阵列焦磷酸测序技术，该技术一次可以测定上百万个样品，其出现带来了测序技术的革命，极大地推动了后基因组计划的发展。在上述高通量焦磷酸测序技术中，除了DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶以外，PPase是另一个重要用酶，其作用是通过清除多余的PPi来减少每一轮碱基加入期间反应仓微孔之间的交叉干扰，并且能够降低测序反应中的背景噪音。
用于高通量焦磷酸测序技术的PPase需要被固定在微球表面，实现固定化的常用手段是将酶蛋白经过生物素标记后，通过与微球表面的链亲和素反应，从而被固定在微球表面。这就需要对PPase进行生物素化修饰。目前，通过化学手段能够实现蛋白质的生物素化修饰，其原理是通过化学反应将生物素连接到蛋白质中赖氨酸残基的游离氨基上。酶作为一种生物活性蛋白质，对有机试剂等因素非常敏感，然而在化学修饰过程中常常需要引入大量有机试剂，存在使酶活性降低甚至丧失的可能性；在化学修饰的过程中，如果处于蛋白质活性中心的赖氨酸残基被修饰，也很可能影响到酶蛋白质的催化活性；此外，化学修饰法还存在操作繁琐和产物不均一的缺点。
因此，提供一种PPase的生物素化修饰方法，使其能够直接在细胞内被生物素修饰，能有效避免化学修饰法的缺陷或不良影响，同时增强其在焦磷酸测序技术中的实际应用性。
发明内容
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
本发明中的术语“BAP23”指序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的生物素受体蛋白。
本发明要解决的问题是提供一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，以实现无机焦磷酸酶在宿主细胞内的生物素化修饰，为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，其中：使用一种由23个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白BAP23，将该生物素受体蛋白的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得一种携带上述生物素受体蛋白编码基因的重组表达载体，当无机焦磷酸酶的编码基因构建到上述重组表达载体中后，能够表达该生物素受体蛋白和无机焦磷酸酶的融合蛋白，该融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰。
其中，所述的生物素受体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：
MAQRLFHILDAQKIEWHGPKGGS
一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，包括以下步骤：
⑴.合成生物素受体蛋白BAP23的编码基因；
⑵.将步骤⑴合成的生物素受体蛋白BAP23的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得重组表达载体A；
⑶.将无机焦磷酸酶的编码基因构建到步骤⑵所得的重组表达载体A中，获得重组表达载体B；
⑷.用步骤⑶所得的重组表达载体B转化大肠杆菌宿主细胞，获得重组基因工程菌A；
⑸.以步骤⑷所得的重组基因工程菌A作为生产菌株，进行诱导表达培养。
本发明所述的表达方法步骤⑴中所述的BAP23编码基因的核苷酸序列可以为SEQID NO：2所示的序列。但根据本领域公共知识，密码子具有简并性，编码同一种氨基酸可以有几种不同的密码子，因此本发明所述的BAP23的编码基因序列并不局限于SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
本发明所述的表达方法步骤⑵中的大肠杆菌表达载体为pMAL-p4E、pMAL-p4X、pMAL-p5E、pMAL-p5X、pET22b(+)、pET28a(+)、pET30a(+)和pET32a(+)中的任意一种；优选为pMAL-p4E、pMAL-p5E、pET28a(+)和pET30a(+)中的任意一种；进一步优选为pMAL-p4E和pET30a(+)中的任意一种；最优选为pET30a(+)。
本发明所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因可以通过PCR扩增或化学全合成的方式获得。
本发明所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因应当与BAP23的编码基因位于同一多克隆位点区。
本发明所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因可以构建到BAP23的编码基因的上游或下游；优选为上游。
当本发明所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因位于BAP23的编码基因上游时，应当去掉无机焦磷酸酶的编码基因的终止密码子。
本发明所述的表达方法步骤⑷中所述的大肠杆菌宿主细胞可以为E.coliRosetta(DE3)。但根据本领域公共知识，功能基因连接到各类载体获得的重组载体，转入适当宿主细胞，在一定条件下均可实现目的蛋白的表达，因此本发明所述的大肠杆菌宿主细胞并不局限于E.coliRosetta(DE3)。
本发明所述的表达方法步骤⑸中所述的诱导表达培养的方法为：挑取生产菌株单菌落接种于LB培养基，37℃培养24h，获得种子液；将上述种子液以1％(v/v)的接种量接种于TB培养基，37℃培养3小时后，加入终浓度为0.05mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，30℃培养16h。
按照本发明所述的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶可以根据所选用的大肠杆菌表达载体上带有的亲和层析标签，选择相应的亲和层析柱进行纯化。当使用的大肠杆菌表达载体为pMAL-p4E、pMAL-p4X、pMAL-p5E和pMAL-p5X时，可以选用Amylose亲和层析柱进行纯化；当使用的载体为pET22b(+)、pET28a(+)、pET30a(+)和pET32a(+)时，可以选用组氨酸亲和层析柱进行纯化。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，该表达方法实现了无机焦磷酸酶在宿主细胞内的生物素化修饰。表达的生物素化无机焦磷酸酶的催化活力与未进行融合表达的相同无机焦磷酸酶相比较，没有发生变化。按照本发明提供的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶的产量达到21～38mg/100mL培养基；表达的生物素化无机焦磷酸酶的比活力达到94.2～151.6U/mg；表达的生物素化无机焦磷酸酶被磁珠固定后得到的Bead-LUC被反复洗涤3次后，催化活力几乎不受影响，被反复洗涤6次后，能够维持相较于洗涤前97％以上的相对活力，在反复洗涤9次后，能够维持相较于洗涤前94％以上的相对活力，在反复洗涤15次后，能够维持相较于洗涤前91％以上的相对活力。
附图说明
图1为插入了生物素受体蛋白BAP23编码基因和无机焦磷酸酶编码基因的pET30a(+)质粒图谱。其中，BAP23编码基因位于无机焦磷酸酶编码基因的上游。
图2为生物素化无机焦磷酸酶酶的表达结果。其中M为蛋白质分子量标准；Lane1为实施例1步骤⑸所述的表达结果，黑框中为按照实施1的方法表达的生物素化无机焦磷酸酶。
图3为插入了生物素受体蛋白BAP23编码基因和无机焦磷酸酶编码基因的pET22b(+)质粒图谱。其中，无机焦磷酸酶编码基因位于BAP23编码基因的上游，无机焦磷酸酶编码基因已通过反向引物去掉了终止密码子。
图4为生物素化无机焦磷酸酶的表达结果。其中M为蛋白质分子量标准；Lane1为实施例3步骤⑸所述的表达结果，黑框中为按照实施3的方法表达的生物素化无机焦磷酸酶。
图5为生物素化无机焦磷酸酶酶的表达结果。其中M为蛋白质分子量标准；Lane1为实施例5步骤⑸所述的表达结果，黑框中为按照实施5的方法表达的生物素化无机焦磷酸酶。
图6为测活标准曲线。其中x为PO4 3-浓度，y为700nm处的吸光度。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明涉及的以下英文名称的含义为：Bead-PPase指被固定到磁珠上的无机焦磷酸酶；Tris-HCl指利用三羟甲基氨基甲烷(Tris)和盐酸配制的缓冲液；Tris-Ac指利用三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制的缓冲液；Tris-HCl指利用三羟甲基氨基甲烷(Tris)和盐酸配制的缓冲液；EDTA指乙二胺四乙酸；BSA指牛血清白蛋白；DTT指二硫苏糖醇；PVP指聚乙烯吡咯烷酮。
本发明所用宿主菌株E.coliRosetta(DE3)和E.coli BL21(DE3)感受态细胞以及质粒pET22b(+)和pET30a(+)购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；PPASE重组质粒由北京中科紫鑫科技有限责任公司提供；限制性内切酶购于NEB公司；DNA凝胶回收试剂盒与PCR产物清洁试剂盒购自Axygen公司；核酸序列的化学合成由上海生工生物工程公司完成；组氨酸亲和层析柱购自GE Healthcare公司，型号为17-5248-01；超微量蛋白浓度测定仪购自Nanodrop公司，型号为ND2000；磁珠混悬液购自Invitrogen公司，型号为DynaBeads TM-280Strep tavidin；分光光度计购自上海谱元仪器有限公司，型号为Alpha1506；其余试剂购自Sigma-Aldrich公司。
实施例1生物素化无机焦磷酸酶的表达方法
包括以下步骤：
⑴.在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的上游和下游分别引入NcoⅠ和HindⅢ的酶切位点以及相应保护碱基，得到如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，命名为序列BAP23-1，化学全合成序列BAP23-1；
⑵.用限制性内切酶NcoⅠ和HindⅢ酶切pET30a(+)质粒和实施例1步骤⑴所得序列BAP23-1，并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，将酶切后的核苷酸序列BAP23-1和pET30a(+)质粒于16℃连接过夜，获得重组表达载体A1；
⑶.设计一对引物特异性引物，以噬热球菌Thermococcus litoralis基因组DNA为模板，PCR扩增其中无机焦磷酸酶(GenBank编号为WP_004067338)的编码基因并用PCR清洁试剂盒回收PCR产物；正向引物的序列如SEQ ID NO：4所示，其酶切位点为HindⅢ；反向引物的序列如SEQ ID NO：5所示，其酶切位点为XhoⅠ；PCR程序为：95℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，最后72℃延伸10min；
⑷.用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ酶切实施例1步骤⑶所得的纯化后的无机焦磷酸酶编码基因和实施例1步骤⑵所得重组表达载体A1，将酶切后的无机焦磷酸酶编码基因和重组表达载体A1于16℃连接过夜，获得重组表达载体B1，其图谱如图1所示；
⑸.用实施例1步骤⑷所得重组表达载体B1转化E.coliRosetta(DE3)感受态细胞，获得重组基因工程菌A1；
⑹.挑取实施例1步骤⑸所得重组基因工程菌A1单菌落接种于5mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃培养24h，获得种子液；将上述5mL种子液全部接种于500mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入终浓度为0.05mM的IPTG，30℃诱导培养16h，表达结果如图2所示。
实施例2生物素化无机焦磷酸酶的纯化
按照实施例1的方法表达的生物素化无机焦磷酸酶，利用组氨酸亲和层析柱进行纯化。
纯化方法包括以下步骤：
⑴.离心收集实施例1步骤⑹诱导培养后的菌体，超声波破碎菌体，将破碎液于4℃、12000rpm/min，离心30min，收集上清液；
⑵.使用5倍柱床体积的平衡缓冲液(50mM pH8.0磷酸钠缓冲液+300mM氯化钠+2mM咪唑)平衡组氨酸亲和层析柱；
⑶.将实施例2步骤⑴所得上清液以1mL/min的流速加入组氨酸亲和层析柱，使生物素化无机焦磷酸酶挂柱；
⑷.用15倍柱床体积的漂洗缓冲液(50mM pH8.0磷酸钠缓冲液+300mM氯化钠+5mM咪唑)漂洗层析柱至基本无杂蛋白；
⑸.用洗脱缓冲液液(50mM pH8.0磷酸钠缓冲液+300mM氯化钠+50mM咪唑)洗脱目的蛋白，并以1mL/tube的体积收集目的蛋白；
采用超微量蛋白浓度测定仪测定纯化后的生物素化无机焦磷酸酶的浓度，约为7.6mg/mL。
实施例3生物素化无机焦磷酸酶的表达方法
包括以下步骤：
⑴.在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的上游和下游分别引入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点以及相应保护碱基，得到如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，命名为序列BAP23-2，化学全合成序列BAP23-2；
⑵.用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切pET22b(+)质粒和实施例3步骤⑴所得序列BAP23-2，并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，将酶切后的核苷酸序列BAP23-2和pET22b(+)质粒于16℃连接过夜，获得重组表达载体A2；
⑶.设计一对引物特异性引物，以酿酒酵母基因组DNA为模板，PCR扩增其中无机焦磷酸酶(GenBank编号为NP_009565)的编码基因并用PCR清洁试剂盒回收PCR产物；正向引物的序列如SEQ ID NO：7所示，其酶切位点为NdeⅠ；反向引物的序列如SEQ ID NO：8所示，其酶切位点为BamHⅠ；PCR程序为：95℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，最后72℃延伸10min；
⑷.用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ酶切实施例3步骤⑶所得的纯化后的无机焦磷酸酶编码基因和实施例3步骤⑵所得重组表达载体A2，将酶切后的无机焦磷酸酶编码基因和重组表达载体A2于16℃连接过夜，获得重组表达载体B2，其图谱如图3所示；
⑸.用实施例3步骤⑷所得重组表达载体B2转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，获得重组基因工程菌A2；
⑹.挑取实施例3步骤⑸所得重组基因工程菌A2单菌落接种于5mL含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养24h，获得种子液；将上述5mL种子液全部接种于500mL含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入终浓度为0.05mM的IPTG，30℃诱导培养16h，表达结果如图4所示。
实施例4生物素化无机焦磷酸酶的纯化
按照实施例3的方法表达的生物素化无机焦磷酸酶，利用组氨酸亲和层析柱进行纯化。
纯化方法同实施例2；采用超微量蛋白浓度测定仪测定纯化后的生物素化无机焦磷酸酶的浓度，约为6.9mg/mL。
实施例5生物素化无机焦磷酸酶的表达方法
包括以下步骤：
⑴.在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的上游和下游分别引入NcoⅠ和EcoRⅠ的酶切位点以及相应保护碱基，得到如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，命名为序列BAP23-3，化学全合成序列BAP23-3；
⑵.用限制性内切酶NcoⅠ和EcoRⅠ酶切pET30a(+)质粒和实施例5步骤⑴所得序列BAP23-3，并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，将酶切后的核苷酸序列BAP23-3和pET30a(+)质粒于16℃连接过夜，获得重组表达载体A3；
⑶.设计一对引物特异性引物，以PPASE重组质粒为模版，PCR扩增其中的无机焦磷酸酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO：10所示，用PCR清洁试剂盒回收PCR产物；正向引物的序列如SEQ ID NO：11所示，其酶切位点为EcoRⅠ；反向引物的序列如SEQ ID NO：12所示，其酶切位点为NotⅠ；PCR程序为：95℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，最后72℃延伸10min；
⑷.用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ酶切实施例5步骤⑶所得的纯化后的无机焦磷酸酶编码基因和实施例5步骤⑵所得重组表达载体A3，将酶切后的无机焦磷酸酶编码基因和重组表达载体A3于16℃连接过夜，获得重组表达载体B3；
⑸.用实施例5步骤⑷所得重组表达载体B3转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，获得重组基因工程菌A3；
⑹.挑取实施例5步骤⑸所得重组基因工程菌A3单菌落接种于5mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃培养24h，获得种子液；将上述5mL种子液全部接种于500mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入终浓度为0.05mM的IPTG，30℃诱导培养16h，表达结果如图5所示。
实施例6生物素化无机焦磷酸酶的纯化
按照实施例5的方法表达的生物素化无机焦磷酸酶，利用组氨酸亲和层析柱进行纯化。
纯化方法同实施例2；采用超微量蛋白浓度测定仪测定纯化后的生物素化无机焦磷酸酶的浓度，约为7.2mg/mL。
实施例7无机焦磷酸酶的固定化
固定化方法：
取10μL链亲合素包被的磁珠混悬液Dynabeads M-280Streptavidin静置于磁铁上1min后，弃去上清液；用50μL洗涤缓冲液(0.1M Tris-HCl(pH7.9)+0.5mM EDTA+5mM MgAc2+0.4g/LPVP+0.02％(w/v)BSA+1mM DTT)洗涤两次后，用40μL洗涤缓冲液重悬磁珠；加入10μL纯化后的生物素化无机焦磷酸酶，混匀，4℃放置1h后；置于磁铁上，待磁珠完全集中后弃去上清液，用洗涤缓冲液洗涤Bead-PPase两次，最后将Bead-PPase重悬于10μL洗涤缓冲液中。
实施例8无机焦磷酸酶的活力测定
显色剂配制：将13g钼酸铵溶解于100mL去离子水中，得到溶液A；将0.35g酒石酸锑氧钾溶解于100mL去离子水中，得到溶液B；将溶液A、溶液B和硫酸溶液按3:3:1的体积比混合均匀，得到显色剂。
测活标准曲线的绘制：配制不同浓度的磷酸根离子(PO43-)标准溶液：0mM、0.008mM、0.012mM、0.016Mm、0.024mM、0.032mM；分别向上述标准溶液中加入终浓度为0.2％(w/v)的抗坏血酸，反应30s；加入4％(v/v)的显色剂混合均匀后，放置15min；于700nm下测定吸光度A700。以吸光度A700对磷酸根离子浓度作图，绘制测活标准曲线，如图6所示。
无机焦磷酸酶的活力测定方法：将待测样品加入500μL测活反应液中(100mMpH8.0的Tris-HCl+3mM MgCl2+100mM PPi)反应15min；以柠檬酸终止反应后，加入终浓度为0.2％(w/v)的抗坏血酸，反应30s；加入4％(v/v)的显色剂混合均匀后，放置15min；于700nm下测定吸光度，并通过标准曲线计算生成的磷酸根(PO43-)的浓度。
活力单位定义：在25℃下，1min内，生成1μmol磷酸根(PO43-)所需的酶量定义为1个单位(Unit)。
将按照实施例1的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶编号为样品1；
将样品1按照实施例7的固定化方法制得的Bead-PPase编号为样品2；
将样品2用实施例7所述的洗涤缓冲液反复洗涤3、6、9和15次后的Bead-PPase分别编号为样品3、4、5、6；
将按照实施例3的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶编号为样品7；
将样品6按照实施例7的固定化方法制得的Bead-PPase编号为样品8；
将样品7用实施例7所述的洗涤缓冲液反复洗涤3、6、9和15次后的Bead-PPase分别编号为样品9、10、11、12。
将按照实施例5的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶编号为样品13；
将样品13按照实施例7的固定化方法制得的Bead-PPase编号为样品14；
将样品14用实施例7所述的洗涤缓冲液反复洗涤3、6、9和15次后的Bead-PPase分别编号为样品15、16、17、18。
利用上述测定方法分别活性测定方法样品1-18的相对活力，结果如下表：
表1无机焦磷酸酶相对活力测定结果
样品编号 相对活力 样品编号 相对活力 样品编号 相对活力
1 151.6U/mg 7 94.2U/mg 13 131.2U/mg
2 87.3U/μL 8 65.9U/μL 14 79.5U/μL
3 87.0U/μL 9 65.3U/μL 15 79.1U/μL
4 85.1U/μL 10 64.6U/μL 16 77.4U/μL
5 82.9U/μL 11 62.7U/μL 17 75.1U/μL
6 79.8U/μL 12 60.1U/μL 18 73.6U/μL
其中样品1、样品7和样品13的相对活力指每mg蛋白的催化活力；其余样品的相对活力指每μLBead-PPase的催化活力。

Claims (9)

1.一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，其特征在于：所述表达方法使用一种由23个氨基酸残基组成的生物素受体蛋白BAP23，将该生物素受体蛋白的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得一种携带上述生物素受体蛋白编码基因的重组表达载体，当无机焦磷酸酶的编码基因构建到上述重组表达载体中后，能够表达该生物素受体蛋白和无机焦磷酸酶的融合蛋白，该融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰；其中，所述的生物素受体蛋白BAP23的序列为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：所述表达方法包括以下步骤：
⑴.合成生物素受体蛋白BAP23的编码基因；
⑵.将步骤⑴合成的生物素受体蛋白BAP23的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获得重组表达载体A；
⑶.将无机焦磷酸酶的编码基因构建到步骤⑵所得的重组表达载体A中，获得重组表达载体B；
⑷.用步骤⑶所得的重组表达载体B转化大肠杆菌宿主细胞，获得重组基因工程菌A；
⑸.以步骤⑷所得的重组基因工程菌A作为生产菌株，进行诱导表达培养。
3.如权利要求2所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑴中所述的生物素受体蛋白BAP23的编码基因为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。
4.如权利要求2或3所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑵中所述的大肠杆菌表达载体为pMAL-p4E和pET30a(+)中的任意一种。
5.如权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤(2)中所述的大肠杆菌表达载体为pMAL-p4E。
6.如权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤(2)中所述的大肠杆菌表达载体为pET30a(+)。
7.如权利要求2或3所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑶中所述的重组表达载体B中的无机焦磷酸酶的编码基因构建于BAP23的编码基因的上游或下游。
8.如权利要求7所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑶中所述的重组表达载体B中：无机焦磷酸酶的编码基因构建于BAP23的编码基因的上游。
9.如权利要求7所述的表达方法，其特征在于：所述的表达方法步骤⑶中所述的重组表达载体B中的无机焦磷酸酶的编码基因构建于BAP23的编码基因的下游。
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