JP5222139B2 - 1,5−アンヒドログルシトールの測定方法及び1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物 - Google Patents
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Description
本願は、2006年6月22日に、日本に出願された特願2006−172619号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
非特許文献1に記載されているように、1,5−AGは、血糖値とヘモグロビンA1c(HbA1c)の中間に位置するマーカーであり、軽症糖尿病患者の自己管理に適していると考えられる。
川合厚生、赤沼安夫、"1,5−アンヒドログルシトール"、臨床検査 vol.33 no.8 1989年8月 901〜907 「Medical Technology」臨時増刊号2002 Vol.30 No.13(臨時増刊号) 糖尿病検査のすべて スクリーニングから合併症の検査まで pp. 1498-1499(医歯薬出版株式会社)
このPRODに代えて、グルコースへの作用性が低い1,5−AG酸化酵素(脱水素酵素)を用いることで、1,5−AGの測定がより簡便になり、測定精度の向上、測定時間の短縮を図ることが可能であるため、このような酵素を用いた1,5−AGの測定方法の提供が切望されていた。
[1] (a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;または
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質:
を用いることを特徴とする1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
[2] 前記タンパク質が、シノリゾビウム(Sinorhizobium)属に属する菌由来である[1]に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
[3] 前記タンパク質が、シノリゾビウム エスピー.97507(Sinorhizobium sp. 97507)(受託番号:FERM BP−10843)由来である[1]又は[2]に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
[4] 前記タンパク質のソルボースに対する反応性を100%とした場合、前記タンパク質の1,5−アンヒドログルシトールに対する反応性が10%以上である[1]〜[3]のいずれかに記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
[6] 前記タンパク質を、発色基質の存在下で、試料中の1,5−アンヒドログルシトールに作用させることにより反応した発色基質の量を測定する[1]〜[5]のいずれかに記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
[7] 前記タンパク質を試料中の1,5−アンヒドログルシトールに作用させる前に、試料中のD−グルコースを予め除去する[1]〜[6]のいずれかに記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
[8]前記タンパク質を、発色基質及び電子キャリアーの存在下で、試料中の1,5−アンヒドログルシトールに作用させる[1]〜[7]のいずれかに記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
[9]1,5−アンヒドログルシトールを基質として測定した場合の前記タンパク質の酵素活性を基本単位として、試料1mL当たり、1〜500単位となるように前記タンパク質を添加する[1]〜[8]に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
[10] 試料中の1,5−アンヒドログルシトールに作用させる前に、前記タンパク質を、電子キャリアーを用いて活性化する[1]〜[9]のいずれかに記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;または
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質:
を含有することを特徴とする1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
[12] 前記タンパク質が、シノリゾビウム(Sinorhizobium)属に属する菌由来である[11]に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
[13] 前記タンパク質が、シノリゾビウム エスピー.97507(Sinorhizobium sp. 97507)(受託番号:FERM BP−10843)由来である[11]又は[12]に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
[14] 前記タンパク質のソルボースに対する反応性を100%とした場合、前記タンパク質の1,5−アンヒドログルシトールに対する反応性が10%以上である[11]〜[13]のいずれかに記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
[15] 前記タンパク質の1,5−アンヒドログルシトールに対する反応性を100%とした場合、前記タンパク質のD−グルコースに対する反応性が10%以下である[11]〜[14]のいずれかに記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
[16] 前記タンパク質が、電子キャリアーを用いて活性化されたものである[11]〜[15]のいずれかに記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
[18] 前記1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物が、さらに、発色基質を含有する[11]〜[17]のいずれかに記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
[19] さらに、電子キャリアーを含有する前記1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物であって、前記発色基質が還元性発色基質である[18]に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
[21] [11]に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物の、1,5−アンヒドログルシトールの測定への使用。
[22] (a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;または
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質:
の、1,5−アンヒドログルシトールの測定への使用。
さらに、本発明による1,5−AG測定方法及び1,5−AG測定試薬組成物によれば、血漿、血清、髄液、尿等の臨床検体に適用することが可能であり、迅速、かつ、簡便に検体中の1,5−AGの定量、検出を可能とできる。また、小スケールによる測定も可能であって、臨床検査で汎用されている全自動生化学検査分析装置等においても、高精度かつ高感度な1,5−AGの検出、定量を実現できる。
以下、上記タンパク質をソルボースデヒドロゲナーゼと表記する。
(1)至適pH:約8.0。ただし6.3−9.1の範囲で50%以上の活性を示す。
(2)pH安定性:40℃、15分処理後、pH5.9〜8.6の間で安定である。
(3)至適温度:pH7.0緩衝液中、至適温度が60℃付近である。
(4)温度安定性:pH7.0緩衝液中、45℃、10分間処理後でも77%以上の残存活性を有し、約45℃以下で安定である。
(5)基質特異性及びKm値:基質として1,5−AG及びL-ソルボースに強く作用し、D−ガラクトース、D−グルコースなどの糖に対して殆ど作用しないか、又は弱く作用する。Km値は、1,5−AGに対し82.5mM程度、L−ソルボースに対し65.6mM程度である。
(6)分子量及びサブユニット分子量:総分子量は約150kDa及び約672kDa程度、サブユニット分子量約59.6kDa程度。
(7)阻害剤特異性:重金属イオン(Mn2+,Hg2+,Cu2+)で強く阻害される。
(8)L−ソルボースに作用して、L−ソルボソンを生成する。
(9)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする。
ここで、「由来である」とは、上記の菌が有するソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるタンパク質を意味し、該菌体から直接抽出したもの、遺伝子工学的手法により発現させたもの、化学的に合成したもの等、その製造方法は特に限定されるものではない。
(DNAの抽出)
シノリゾビウム エスピー.97507(Sinorhizobium sp. 97507)(FERM P−19428)の菌体を、超音波処理や溶菌酵素処理で細胞壁の破壊を行った後、フェノール等でDNAを抽出し、塩析及びエタノール沈澱等でDNAの回収を行う。
前記の通り抽出したシノリゾビウム エスピー.97507(Sinorhizobium sp. 97507)(FERM P−19428)由来DNAをテンプレートとし、またソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を元に作成した複数のプライマーを用いて、PCRを行い、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅させる。得られたPCR産物は、アガロースゲル電気泳動などによって精製し、アガロースゲルからソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子DNAを抽出する。
組換えベクター作製用の発現ベクターは、発現させるタンパク質がそのままの形で生産されるもの、あるいはそのN末端またはC末端にヒスチジンのタグが付加された形で生産されるもの、あるいはN末端またはC末端にマルトース結合タンパク質やGSTペプチドが融合された形で生産されるものなどから、適宜選択される。組換えベクターは、発現ベクターと、前記PCRで得られたソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子DNAを、例えばNcoI、HindIII等の同じ制限酵素を用いて切断した後、酵素遺伝子DNAをベクターにライゲーションすることにより作製できる。
なお、発現ベクターは、市販品を用いることができるが、当該市販のプラスミドベクターの特定部位を置換して安定化したものを用いることがより好ましい。
これらアミノ酸配列の相同性を考慮しつつ、かつ、製造される組換え型ソルボースデヒドロゲナーゼが本発明の目的を達成する限りにおいて、前記発現ベクターに挿入したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子コード領域に、Kunkel法等の公知の塩基置換技術を用いる部位特異的突然変異によりアミノ酸の置換、付加、欠失等の操作を行っても良く、またエラープローンPCR法等の公知の塩基置換技術を用いるランダム変異によりアミノ酸の置換、付加、欠失等の操作を行ってもよい。さらに、複数種のバクテリア等から単離したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子について、DNAシャッフリング等の公知技術により、より優位な性状を有するソルボースデヒドロゲナーゼを製造することも想定される。
なお、本発明において「相同性」という語は、2以上の遺伝子配列の互いに対する同一性の程度を指す。したがって、ある二つの遺伝子の相同性が高い程、それらの配列の同一性又は類似性は高い。2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって、又は核酸の場合にはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって、調べることができる。
前記ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子が組込まれた組換えベクターの宿主細胞への導入(形質転換(形質移入))は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌(E. coli、Bacillus subtilis等)の場合は、例えばCohenらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci. USA.、第69巻、第2110頁、1972年)、プロトプラスト法(Mol.Gen.Genet.、第168巻、第111頁、1979年)やコンピテント法(ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)、第56巻、第209頁、1971年)によって、酵母(Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris等)の場合は、例えばハイネン(Hinnen)らの方法(Proc.Natl.Acad.USA.、第75巻、第1927頁、1978年)やリチウム法(J.Bacteriol.、第153巻、第163頁、1983年)によって、動物細胞の場合は、例えば、グラハム(Graham)の方法(バイロロジー(Virology)、第52巻、第456頁、1973年)によって、昆虫細胞の場合は、例えば、サマーズ(Summers)らの方法(Mol.Cell.Biol.、第3巻、第2156〜第2165頁、1983年)によってそれぞれ形質転換することができる。なお、形質転換は、前記組換えベクターによって発現させる必要はなく、例えば、本発明に用いるソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を宿主細胞の染色体DNAに直接挿入し、発現させる手段を用いてもよい。本発明においては、取り扱いが容易であり、比較的短時間に大量の組換えタンパク質を製造することが可能である点で、細菌及び酵母を宿主とすることが好ましく、エッシェリシア(Escherichia)属に属する微生物を宿主とすることが、より好ましい。
本発明の測定方法において用いるソルボースデヒドロゲナーゼは、前記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養し、発現したソルボースデヒドロゲナーゼを採取することによって得ることができる。栄養培地は、宿主細胞(形質転換体)の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素(例えば無機塩(例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム)、ビタミン類、抗生物質(例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等)など)を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のpH及び培養時間は、前記ソルボースデヒドロゲナーゼが大量に生産されるように適宜選択される。
したがって、上述の製造工程において、また、本発明の1,5−AG測定方法及び1,5−AG試薬組成物に、人為的にFADを添加することは必須ではない。
本発明のソルボースデヒドロゲナーゼは、電子キャリアーの存在下にインキュベートすると活性化される。このため、本発明の測定方法及び1,5−AG測定試薬組成物の製造に先立って、予め、該活性化処理を行ってもよい。特に、適用する試料が、血液等の臨床検体である場合には、高感度の1,5−AGの検出を可能とする点で、前記ソルボースデヒドロゲナーゼを予め活性化処理することが好ましい。
活性化に用いられる電子キャリアーとしては、フェナジンメトサルフェイト(PMS)や1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト(1m−PMS)等がある。1m−PMSを用いた場合、前記調製済みのソルボースデヒドロゲナーゼに、最終濃度0.01〜50mM、より好ましくは、0.01〜10mMの1m−PMSを添加し、pH5〜9、温度4〜45℃で、30分〜1日間インキュベートする。活性化処理後、測定試薬を調製するうえで1m−PMSが過剰な場合には、透析や限外ろ過等によって過剰の1m−PMSを除去し、本発明の測定方法及び1,5−AG測定試薬組成物の製造に使用することができる。
上記の処理により、本発明に用いるソルボースデヒドロゲナーゼを活性化することができるが、下記のとおり、1,5−AGを基質として測定した場合の酵素活性が、活性化処理前と処理後において、好ましくは、2倍以上(2〜20倍)、さらに、4倍以上(4〜10倍)活性化されているこがより好ましい。
本発明の1,5−AGの測定方法は、血液や髄液などの検体中の1,5−AG量を正確に測定することができる。前述したように、血液中の1,5−AG値は、糖尿病のコントロールマーカーとして有用であることから、本発明の測定方法は、糖尿病の診断において有用である。
なお、本発明において、「発色基質」とは、上述した、デヒドロゲナーゼによって直接反応する発色基質;電子キャリアーの存在下で還元発色する発色基質;及び、電子キャリアーが存在すると強く還元発色する発色基質を含むものとし、さらに、「還元性発色基質」とは、電子キャリアーの存在下で還元発色する発色基質;及び、電子キャリアーが存在すると強く還元発色する発色基質を含むものとする。
なお、上記の「反応性」は、反応に使用する酵素量に対して、大過剰の基質、この場合はソルボース、1,5−AG、D−グルコースを作用させて、基質との反応を触媒する酵素の最大反応速度で反応性を評価したものである。ソルボースの場合で具体例を示すと、後述するソルボースの[酵素活性測定方法]に示すとおりである。
さらに、高度なD−グルコースの消去が必要な場合、例えば、上記のグルコキナーゼを用いるD−グルコースの6位リン酸化系を用いる場合では、さらに酵素サイクリング系、例えば、ピルビン酸キナーゼを用いるATPサイクリング系などを組み込んで、完全なD−グルコースの消去を達成することができる。
また、フェリシアン化カリウムのようなフェリシアン化合物を電子受容体として、ソルボースデヒドロゲナーゼによる酸化還元反応の後に、電子受容体自体の呈色の変化を検出するか、または、硫酸第二鉄‐ドゥパノール・リージェント(ferric sulfate-dupanol reagent)を添加し、プロッシアンブルーとして発色させる方法も適用が可能であるが、簡便性及び検出感度を考慮すると、DCIP等の直接反応して高い感度で測定できる発色基質を使用することが好ましい。
本発明の1,5−AG測定試薬組成物は、前記ソルボースデヒドロゲナーゼを必須成分として含むものであり、糖尿病の診断において有用であるが、目的とする検体試料、使用する発色剤、測定形態等に応じて、その試薬形態を適宜変えることができる。
これらの自動測定器用の1,5−AG測定試薬組成物を調製する場合、例えば、D−グルコース消去剤、還元性発色剤、還元性発色剤がテトラゾリウムの場合にはテトラゾリウムと電子キャリアー、ソルボースデヒドロゲナーゼの検体への添加は、D−グルコース消去剤を先にすれば、その他は、全て同時に行ってもよく、すなわち、これらの成分を1つの試薬にまとめて調製することもできる。また、例えば、D−グルコース消去剤、テトラゾリウム、電子キャリアー、ソルボースデヒドロゲナーゼのうち、相互に干渉するものが存在する場合、これらを分離して別々の試薬として調製すれば、干渉を避けることができる。
[使用菌株の同定]
実験に用いた菌株は、アルファルファの根粒から分離した菌株であり、この菌株の菌学的性質は、下記の通りであった。
酵母エキス−マンニトール培地で生育した本菌株の形態的性質を以下に記述する。細胞の形態は桿菌で、大きさは0.5〜0.9×1.2〜3.0μmである。胞子を形成せず、グラム染色性は陰性である。
2.各培地における生育状態
酵母エキス−マンニトール培地で生育した本菌株の生育状態を以下に記述する。コロニーは、クリーム色を呈し、形状は円形、凸状に隆起しており、粘性がある。30℃で3日間培養後のコロニーは、直径2〜4mmとなる。また、鞭毛があり、運動性を有する。
3.生理学的性質
本菌株は、好気性で、生育の至適温度は25〜30℃であり、生育の至適pHは6〜8であった。また、各種糖類の利用性は表2に記した通りであり、オキシダーゼ及びカタラーゼを生産する。
なお、本出願人は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(国際寄託当局)に2007年6月22日付で、上記シノリゾビウム エスピー.97507(Sinorhizobium sp. 97507)(受託番号:FERM P−19428)について国際寄託への移管の申請を行い、同日付で同当局によって本申請が受領された。当該受領書において、受託番号FERM BP−10843が発行された。
前述した寄託菌株から染色体DNAを抽出し、以下の手順によってソルボースデヒドロゲナーゼのクローニングを行った。
前記寄託菌株の菌体を、溶菌酵素処理して細菌の細胞壁を破壊した後、フェノールでDNAを抽出し、塩析して染色体DNAを抽出、回収した。
下記条件でPCRを行い、約1.6kbpのソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むPCR産物を取得した。
テンプレート :1.で抽出した寄託菌株由来のDNA
プライマー :配列番号3及び配列番号4で表されるDNA
(Sinorhizobium meliloti strain 1021 Genome Project(ウェブサイトhttp://sequence.toulouse.inra.fr/meliloti.html)で公開されている塩基配列SMa1414(L−ソルボースデヒドロゲナーゼと推定)を元に、プライマー1,2を合成した。)
ポリメラーゼ :TaKaRa LA Taq(タカラバイオ社製)
反応条件 :
a.変性94℃、1分(1サイクル)
b.変性94℃、30秒
c.アニーリング57℃、1分
d.伸長反応72℃、2分
e.伸長反応72℃、5分(1サイクル)
なお、b〜dの反応は、30サイクル行った。
2.で取得したPCR産物をアガロースゲル電気泳動することで精製し、QIAEXII Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用いて、アガロースゲルからソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子DNAを抽出した。
3.でアガロースゲルから抽出精製したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子DNA及びプラスミドpUCNNT2を、制限酵素NcoI、HindIIIで制限酵素処理した。制限酵素処理したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子DNA及びプラスミドpUCNNT2をアガロースゲル電気泳動する事で精製し、QIAEXII Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用いて、アガロースゲルからソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子DNA及びプラスミドpUCNNT2を抽出した。
なお、前記プラスミドpUCNNT2は、市販のプラスミドpUC19(タカラバイオ社製)に、NcoIリンカー及び、プラスミドの安定化に寄与するpKK223−3(Pharmacia Biotech社製)由来のrrnB ribosomal terminatorを付加したプラスミドであり、本発明に用いるソルボースデヒドロゲナーゼを発現させるのに特に適している。図1及び図2は、本実施例で用いたプラスミドpUCNNT2を構築するフロー図である。図1、図2に示したように、このプラスミドpUCNNT2は、以下の工程1〜5を経て構築した。
工程1:市販のプラスミドpUC19(タカラバイオ社製)に、NdeIリンカーを付加したpUCNdeを作製。
工程2:pKK223−3(Pharmacia Biotech社製)のEcoRI−SspI領域をPCRにて増幅。その際、NdeIリンカーを付加(PCR product NdeI-SspI断片)。
なお、図1中に示されるPCRproduct NdeI-SspI断片におけるrrnBT1T2は、プラスミドの安定化に寄与するものである。
工程3:pUCNdeのNdeI−SspI領域を、前記PCR product NdeI-SspI断片と置換したプラスミドpUCNNTを作製する。
工程4:前記pUCNNTのCfr10I−BamHI領域をPCRにて増幅。その際、NdeIリンカーをNcoIリンカーに変換。
工程5:前記増幅断片を、pUCNNTのCfr10I−BamHIと置換してプラスミドpUCNNT2を作製する。
4.で制限酵素処理したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子DNA及びプラスミドpUCNNT2を、DNA Ligation Kit Ver2.1(タカラバイオ社製)を用いてライゲーションさせ、プラスミドpUCNNT2_AGD1を構築した。
5.で構築したプラスミドpUCNNT2_AGD1を用いて、E.coli JM109 Competent Cell(タカラバイオ社製)を形質転換し、アンピシリンナトリウム含有のLBプレートに播種し、37℃で一晩培養した。ダイレクトPCRにて、アンピシリンナトリウム含有のLBプレートに生育したコロニー20個に、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含んだプラスミドが導入されているか確認した。ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅が確認できた7株を、アンピシリンナトリウム含有のLBプレートに播種し、純化した。
(1)純化した遺伝子組換え体大腸菌7株を、下記の条件で液体培養した。
培地:
LB培地 10mL
Bacto Tryptone(Bectone,Dickinson and Co.製)1.00%(w/v)
Bacto Yeast Extract(Bectone,Dickinson and Co.製)0.50%(w/v)
塩化ナトリウム(ナカライテスク社製)1.00%(w/v)
アンピシリンナトリウム(和光純薬社製)0.005%(w/v)
培養容器 :試験管(直径2.5×長さ20cm)
培養条件 :37℃、15時間、121rpm
(2)培養液10mL分の菌体を集菌(1000×g、10分、室温)。
(3)上清を除去し、破砕バッファー(50mM KPB(pH7.5)、0.25%(w/v) BL-9EX(日光ケミカルズ社製)、0.01%(w/v) フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD))1mLで、菌体を懸濁。
(4)チップ式超音波破砕装置で、菌体を破砕(氷浴、5分)。
(5)菌体破砕液を遠心分離(13000×g 4℃ 5分)し、上清(無細胞抽出液)を回収し、これを活性測定用サンプルとした。
(6)活性発現の確認は、後述する[酵素活性測定方法]に基づいて行い、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性が最も強い株を、E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1とした。なお、培地当りのソルボースデヒドロゲナーゼ活性は、0.080U/mL培地であった。
また、E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1の培養菌体から抽出したプラスミドpUCNNT2_AGD1について塩基配列の決定を行ったところ、ソルボースデヒドロゲナーゼをコードするDNA断片が挿入されていることが確認された。その塩基配列を配列番号1に、アミノ酸配列を配列番号2に示す。
なお、本実施例において決定した塩基配列を、上記のSinorhizobium meliloti strain 1021 のゲノム・プロジェクトに公開されている、ソルボースデヒドロゲナーゼ推定コード領域(Locus tag:SMa1414)と比較した。その結果、第160番目の塩基がSMa1414ではアデニン(A)であるのに対し、本実施例のものではシトシン(C)であった。この塩基の置換により、第54番目のアミノ酸について、SMa1414(ACCESSION No.: NP_436019)ではメチオニン(Met)であるのに対し、本実施例のものではロイシン(Leu)となっている。
前述した通り作製した、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を持つ遺伝子組み換え体(E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1)を培養し、得られた菌体からソルボースデヒドロゲナーゼを分離・精製した。
なお、この遺伝子組み換え体E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1は、本出願人によって、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに2006年3月28日付で寄託し、特許生物寄託センターより2006年3月28日付で通知された受託証において、FERM P−20854の受託番号を得ている。
菌株:遺伝子組み換え体E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1
1.1 種培養
2.0L容の坂口フラスコに、LB培地1.0Lを加え、オートクレーブ滅菌(121℃、20分)し、更にフィルター滅菌したアンピシリンナトリウムを終濃度0.005%(w/v)となるように使用直前に添加した。このLB培地に遺伝子組み換え体E.coli JM109/pUCNNT2_AGD1を白金耳で植菌し、37℃で振盪培養(120rpm)した。培養開始13時間後の培養液を、本培養時の種菌とした。
LB培地組成:
Bacto Tryptone(Bectone,Dickinson and Co.製)1.00%(w/v)
Bacto Yeast Extract(Bectone,Dickinson and Co.製)0.50%(w/v)
塩化ナトリウム(ナカライテスク社製)1.00%(w/v)
アンピシリンナトリウム(和光純薬社製)0.005%(w/v)
30L容培養装置に、GYC培地21Lを加え、オートクレーブ滅菌(121℃、20分)し、更にフィルター滅菌したアンピシリンナトリウム(和光純薬社製)及びイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)を、それぞれ終濃度0.005、0.024%(w/v)となるように使用直前に添加した。
GYC培地組成:(15NのNaOHでpH7.0に調整)
グリセロール(阪本薬品工業社製)4.0%(w/v)
酵母エキス(味の素社製)2.0%(w/v)
コーンスティープリカー(サンエイ糖化社製)4.5%(w/v)
前記培地に、前記1.1で準備した種菌1Lを植菌し、下記条件で15時間培養した。
なお、培養中は、15NのNaOHでpHを7.0に制御した。
培養温度:37℃
通気量:1v/v/m
回転数:350rpm
培養開始15時間後に、遠心分離機を用いて、菌体955.06gを回収した。
前記培養によって得られた菌体から、以下の各精製工程を経て、ソルボースデヒドロゲナーゼを分離・精製した。主な精製工程におけるソルボースデヒドロゲナーゼの全活性、比活性、回収率、比活性倍数(fold)を測定した。その結果を表3に示す。
なお、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性は、後述する[酵素活性測定方法]に基づいて測定した。
前記1.2の本培養で取得した菌体955.06gのうち200gを用いて精製を行った。菌体200gに対し、1Lの破砕バッファー(50mM KPB(pH7.5)、0.25%(w/v) BL-9EX(日光ケミカルズ社製)、0.001mM FAD)を加え、菌体懸濁液を作製した。この菌体懸濁液に、セリンプロテアーゼの阻害剤であるフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を終濃度1mMとなるように添加し、チップ式超音波破砕装置で破砕した。この菌体破砕液を、遠心分離(13000×g、4℃、15分)し上清を回収した。この上清をCFEとした。
前記2.1で回収したCFE 1095mLに対し、終濃度40%(w/v)となるように硫酸アンモニウムを氷浴下で加えた。この際、pHが7.5となるようにアンモニアで調整した。硫酸アンモニウムが溶解して後、4℃で一晩静置した。
遠心分離(13,000×g、4℃、15分)により、硫安沈殿を回収した。回収した硫安沈殿は、透析チューブ(シームレスセルロースチューブ小サイズ18 和光純薬社製)に入れ、透析バッファー(5mM KPB(pH8.0)、0.25%(w/v) BL-9EX(日光ケミカルズ社製)、0.001mM FAD)を用いて透析を行った。
透析チューブ内に不溶物が生じた為、遠心分離(13000×g、4℃、15分)により、これを除去し、上清を回収した。
平衡化バッファー(5mM KPB(pH8.0)、0.25%(w/v) BL-9EX(日光ケミカルズ社製)、0.001mM FAD)で平衡化した強陰イオン交換樹脂TOYOPEARL SuperQ650M(東ソー社製) 350mL(カラムサイズ:φ6.2cm×高さ27cm)に、前記2.3で回収した上清をチャージした。チャージ終了後、樹脂のbed volumeの5倍量の洗浄バッファー(5mM KPB(pH8.0)、0.25% (w/v) BL-9EX(日光ケミカルズ社製)、0.001mM FAD)で洗浄後、樹脂のbed volumeの2.5倍量の2種の溶出バッファー(1: 5mM KPB(pH8.0)、0.25%(w/v) BL-9EX(日光ケミカルズ社製)、0.001mM FAD、2:5mM KPB(pH8.0)、0.25%(w/v) BL-9EX(日光ケミカルズ社製)、0.001mM FAD、1M NaCl)を用いて、目的タンパクをグラジエント溶出させ、活性画分を回収した。
限外濾過装置ビバセル250(ビバサイエンス社製、分画分子量1万)を用いて、前記2.5の強陰イオン交換クロマトグラフィー(TOYOPEARL SuperQ650M)で回収した活性画分の脱塩濃縮を行い、最終的に酵素が溶解しているバッファーを50mM KPB(pH7.5)、0.25%(w/v) BL-9EX(日光ケミカルズ社製)、0.01mM FADに置換し、ソルボースデヒドロゲナーゼを得た。
0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)1mL、1.0M L−ソルボース1.0mL、3mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)0.14mL、3mM 1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト0.2mL、水0.61mLを3mL石英セルに添加し、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして37℃で10分間インキュベート後、酵素溶液0.05mLを添加後、DCIPの600nmにおける吸光度変化(ΔABS600/min)を37℃で測定する。DCIPのpH7.0におけるモル吸光係数を16.3mM−1とし、1分間に1μmolのDCIPが還元される酵素量を1単位(unit)として、酵素活性濃度を次式に従って求めた。
酵素活性濃度(units/mL)=
(−ΔABS600/min×3.0×希釈倍率)/(16.3×1.0×0.05)
光路長:1.0cm
前記[酵素活性測定方法]における測定条件を適宜変更し、前記2.6で得られたソルボースデヒドロゲナーゼの至適pH、pH安定性、至適温度、温度安定性、基質特異性、Km値、総分子量、サブユニット分子量、阻害剤、酵素反応生成物の同定について、以下の通り試験し、本酵素の性質を調べた。
前記[酵素活性測定方法]における緩衝液を、酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液(pH3.71〜5.36)、クエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH5.55〜5.95)、リン酸カリウム緩衝液(pH6.25〜7.35)、トリス・塩酸緩衝液(pH7.52〜8.34)、グリシン・水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.68〜9.11)(各緩衝液とも終濃度で33.3mM)に代え、精製酵素の酵素活性濃度を測定した。なお、酵素活性濃度算出の際には、予め求めておいた各pHにおけるDCIPのモル吸光係数を用いた。その結果を図3に示す。図3に示すように、このソルボースデヒドロゲナーゼの至適pHは、8.0であった。
ソルボースデヒドロゲナーゼを、50mM濃度の緩衝液、すなわち酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.14〜5.91)、クエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH5.91〜6.30)、リン酸カリウム緩衝液(pH6.59〜7.47)、トリス・塩酸緩衝液(pH7.53〜8.39)、グリシン・水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.61〜10.30)の各々に溶解し、40℃で15分間保持した後の酵素活性を前記[酵素活性測定方法]により測定した。その結果を図4に示す。図4に示すように、このソルボースデヒドロゲナーゼはpH5.9〜8.6の領域で安定であった。
ソルボースデヒドロゲナーゼを50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、前記[酵素活性測定方法]における温度を35℃〜70℃までの範囲で変化させ、酵素活性を測定した。その結果を図5に示す。図5に示すように、このソルボースデヒドロゲナーゼの至適温度は60℃付近であった。
ソルボースデヒドロゲナーゼを50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、0.25% BL−9EX(日光ケミカルズ社製)、0.01mM FADに溶解し、30℃〜70℃までの各温度で10分間保持したのち、前記[酵素活性測定方法]により測定し、酵素活性の残存率を求めた。その結果を図6に示す。図6に示すように、このソルボースデヒドロゲナーゼは、45℃においても77%の酵素活性が保持され、約45℃以下で安定であった。
前記[酵素活性測定方法]における活性測定用反応液の基質として、1,5−AG、L−ソルボースおよび表4中に示す他の各基質(いずれも終濃度333mM、ラクトースは167mM)を使用した場合の活性を、[酵素活性測定方法]に従って測定し、相対反応性を求めた。結果は、L−ソルボースの活性値を基準とし、それぞれの基質における相対値として示した。
また、このソルボースデヒドロゲナーゼのKm値は、1,5−AGに対し82.5mM、L−ソルボースに対し65.6mMであった。
このソルボースデヒドロゲナーゼの総分子量を、移動相に0.2M NaClを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)を用いて、TSKgel BioAssist G4SWXLカラム(直径0.78cm×長さ30cm、東ソー社製)にて流速0.5mL/分の条件で分析した。分子量マーカー(オリエンタル酵母社製)、分子量マーカー(アマシャムバイオサイエンス社製)及びIgM(シグマ社製)との比較により、このソルボースデヒドロゲナーゼは総分子量約150kDaと約672kDaの形態で存在すると推定された。
10%ポリアクリルアミドゲルを用い、Laemmliらの方法に従い、このソルボースデヒドロゲナーゼをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)にかけた。泳動後にクマシー・ブリリアント・ブルー染色し、移動度を分子量マーカー(アマシャムバイオサイエンス社製)のそれと比較した結果、本発明のソルボースデヒドロゲナーゼのサブユニット分子量は約59.6kDaと推定された。
前記[酵素活性測定方法]における活性測定用反応液に、終濃度が1mMになるように表5中に示す各種添加物をそれぞれ加え、ソルボースデヒドロゲナーゼの活性を測定した。コントロールは、添加物を加えない以外は[酵素活性測定方法]に従った。コントロールの活性値を100(%)とし、1)〜39)の各種阻害剤を添加した場合に得られた活性値を相対活性(%)として求め、結果を表5に記した。
前記2.6で得られたソルボースデヒドロゲナーゼ3.87Uを添加し、300mM L−ソルボース、50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)、60mM 1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト、498U/mL カタラーゼ(和光純薬社製)となるように調整した酵素反応溶液1.5mLを、攪拌しながら2時間室温にて反応させた。遠心限外濾過器マイクロコンYM−10(アミコン社製、分画分子量1万)にて酵素を除去した酵素反応溶液を、高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、リテンションタイムの標品との比較から、酵素反応生成物はL−ソルボソンであると同定された。ここで、標品として使用したL−ソルボソンは予め化学合成したものである。
なお、高速液体クロマトグラフィーの分析条件は、以下の通りである。
カラム:High Performance Carbohydrate Column (ウォーターズ社製)
検出:RI
溶離液: アセトニトリル:蒸留水=6:4(50mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を含む)
流速:1.0mL/min
カラム温度:35℃
インジェクションボリューム:10μL
前記[酵素活性測定方法]における基質を、L−ソルボースから1,5−AGに変え、その終濃度を、1.5〜40.6mMの範囲で変化させ、吸光度変化を測定し、1,5−AG濃度と吸光度変化(ΔABS600/min)との関係をプロットし、図7に示す検量線を作成した。図7に示すように、このソルボースデヒドロゲナーゼは、終濃度1.5〜40.6mMの1,5−AGを定量できることがわかった。
ソルボースデヒドロゲナーゼに酸処理を施し、酸処理によりソルボースデヒドロゲナーゼのタンパクから遊離させたフラビン化合物を、高速液体クロマトグラフィーで分析した。ソルボースデヒドロゲナーゼから遊離したフラビン化合物は、FADの標準品とリテンションタイムが一致したことから、このソルボースデヒドロゲナーゼの補酵素はFADであることがわかった。
次に、置換型高発現プラスミド(以下、pUCpTrcAGD1とする。)を用いた組換えソルボースデヒドロゲナーゼの製造、及び、該ソルボースデヒドロゲナーゼを活性化することにより、高感度に1,5−AGを検出する例を示す。
なお、pUCpTrcAGD1においては、下記の通り、そのソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子の開始コドンの直後に、グルタミン酸(Glu)、フェニルアラニン(Phe)をコードするコドンが付加されている点で、前記pUCNNT2_AGD1とは異なっている。
以下、図8に概略示される手順に沿って、プラスミドpTrcAGD1の構築方法について詳しく説明する。
1. PCR(図8中、工程1)
下記条件でPCRを行い、約1.6kbpの置換型ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むPCR産物を取得した。
テンプレート:pUCNNT2_AGD1
プライマー:配列番号7及び8で表されるDNA
ポリメラーゼ:Takara LA Taq(タカラバイオ社製)
なお、配列番号7で示されるプライマーは制限酵素NcoIサイト、及び、上記グルタミン酸(gaa)、フェニルアラニン(ttc)の付加配列を含み、配列番号8で示されるプライマーは制限酵素BamHIサイトを含んでいる。各プライマーの位置関係は、図8の工程1に示す。
反応条件:
a、変性94℃、2分(1サイクル)
b、変性94℃、40秒
c、アニーリング58℃、30秒
d、伸長反応72℃、2分
e、伸長反応72℃、5分(1サイクル)
なお、b〜dの反応は、35サイクル行った。
1.で取得したPCR産物をアガロースゲル電気泳動することで増幅を確認し、QIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社製)を用いて、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約1.6kbpのDNAを精製した。
2.で精製したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約1.6kbpのDNAを、制限酵素NcoI、BamHIで制限酵素処理した。制限酵素処理したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約1.6kbpのDNAをアガロースゲル電気泳動する事で精製し、QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用いて、アガロースゲルからソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約1.6kbpのDNAを抽出した。
プラスミドpTrc99A(アマシャムバイオサイエンス社製)は、制限酵素NcoI、BamHIで制限酵素処理したのち、QIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社製)を用いて精製した。
3.で制限酵素処理したソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約1.6kbpのDNA、及びpTrc99Aを、Ligation high(東洋紡社製)を用いてライゲーションさせ、プラスミドpTrcAGD1を構築した。pTrcAGD1のプラスミド模式図については図8の工程2に示す。
4.で構築したプラスミドpTrcAGD1を用いて、E. coli JM109 Competent Cell(タカラバイオ社製)を形質転換し、アンピシリンナトリウム含有のLBプレートに播種し、37℃で一晩培養した。生育したコロニーを下記の条件で培養した。
培地:LB培地 10ml
培養容器:試験管(直径2.5×長さ20cm)
培養条件:30℃、20時間、210rpm
培養液よりQIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社製)を用いてプラスミドを抽出し、このプラスミドを制限酵素NcoIもしくはBamHIで処理し、この処理されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動することで、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されているか確認した。
[2]プラスミドpUCpTrcAGD1の構築
1. PCR(図8中、工程3)
下記条件でPCRを行い、約2.2kbpのtrcプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むPCR産物を取得した。
テンプレート:pTrcAGD1
プライマー:配列番号9及び10で表されるDNA
ポリメラーゼ:Takara Ex Taq(タカラバイオ社製)
なお、配列番号9及び配列番号10で示されるプライマーは、それぞれ、BglIIサイトをアダプター配列として含んでいる。
反応条件:
a、変性96℃、5分(1サイクル)
b、変性96℃、40秒
c、アニーリング58℃、40秒
d、伸長反応72℃、2分
e、伸長反応72℃、5分(1サイクル)
なお、b〜dの反応は、25サイクル行った。
1.で取得したPCR産物をアガロースゲル電気泳動することで精製し、QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用いて、アガロースゲルからtrcプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約2.2kbpのDNAを抽出した。
2.でアガロースゲルから抽出精製したtrcプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約2.2kbpのDNAを、制限酵素BglIIで制限酵素処理した。制限酵素処理したtrcプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約2.2kbpのDNAをアガロースゲル電気泳動する事で精製し、QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社製)を用いて、アガロースゲルからtrcプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約2.2kbpのDNAを抽出した。
プラスミドpUC19は、制限酵素BamHIで制限酵素処理したのち、脱リン酸化処理した。
3.で制限酵素処理したtrcプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む約2.2kbpのDNA、及びpUC19を、Ligation high(東洋紡社製)を用いてライゲーションさせ、プラスミドpUCpTrcAGD1を構築した。pUCpTrcAGD1のプラスミド模式図については図8の工程4に示す。
4.で構築したプラスミドpUCpTrcAGD1を用いて、E. coli JM109 Competent Cell(タカラバイオ社製)を形質転換し、アンピシリンナトリウム含有のLBプレートに播種し、37℃で一晩培養した。生育したコロニーを下記の条件で培養した。
培地:LB培地 10ml
培養容器:試験管(直径2.5×長さ20cm)
培養条件:30℃、20時間、200rpm
培養液よりQIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社製)を用いてプラスミドを抽出し、このプラスミドを制限酵素EcoRIもしくはPstIで処理し、この処理されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動することで、trcプロモーター及びソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されているか確認した。
なお、該E. coli JM109/pUCpTrcAGD1から抽出したプラスミドについて、ソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子部位の塩基配列を決定した。その塩基配列は配列番号5に、アミノ酸配列は配列番号6に示すとおりである。
塩基配列を確認した結果、pUCpTrcAGD1においては、挿入されているソルボースデヒドロゲナーゼ遺伝子の開始コドンの直後に、gaa(グルタミン酸)、ttc(フェニルアラニン)が順にイン・フレームで付加されていることが確認された。
また、前記プラスミドpUCNNT2_AGD1のソルボースデヒドロゲナーゼのコード領域における第51番目の塩基シトシン(C)、第108番目の塩基グアニン(G)、及び第168番目の塩基グアニン(G)について、pUCpTrcAGD1においては、これらに相当する塩基が、それぞれ順に、チミン(T)、アデニン(A)、及びアデニン(A)に置換されていることが確認された。しかし、上記二つのアミノ酸が付加されている以外には、前記の塩基置換によって、これにコードされるソルボースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列に置換等の変異は生じていない。
1. 培養
菌株:遺伝子組み換え体E. coli JM109/pUCpTrcAGD1
1.1 種培養
500mL容の三角フラスコに、LB培地100mLを加え、オートクレーブ滅菌し、更にフィルター滅菌したアンピシリンナトリウムを終濃度0.01%(w/v)となるように使用直前に添加した。このLB培地に遺伝子組み換え体E. coli JM109/pUCpTrcAGD1を白金耳で植菌し、25℃で振盪培養(120rpm)した。培養開始21時間後の培養液を、本培養時の種菌とした。
500mL容の三角フラスコに、LB培地100mLを加え、オートクレーブ滅菌し、更にフィルター滅菌したアンピシリンナトリウムを終濃度0.01%(w/v)となるように使用直前に添加したフラスコ培地40本を調製した。各々の培地に、前記1.1で準備した種菌2mLずつを植菌し、25℃で3時間、振盪培養(120rpm)した培養液にフィルター滅菌したイソプロピル―β―D−1−チオガラクトピラノシドを0.0024%(w/v)となるように添加し、更に、25℃で21時間、振盪培養した。培養終了後に、遠心分離機を用いて菌体を回収した。
前記培養によって得られた菌体から、以下の各精製工程を経て、置換型ソルボースデヒドロゲナーゼを分離・精製した。その結果を表6に示す。
なお、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性は、実施例1に記載の[酵素活性測定方法]に基づいて測定した。
前記1.2の本培養で回収した菌体に360mLの50mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.5を加え、菌体懸濁液を作製した。この菌体懸濁液を4分割し、それぞれにつき超音波破砕装置(KUBOTA社製INSONATOR201M)を用いて出力180W、30分間で破砕した。これらの菌体破砕液を合わせて、遠心分離(11,000×g、4℃、30分)し、CFE355mLを回収した。
前記2.1で回収したCFEに、氷浴下、終濃度0.25%(v/v)となるようにBL−9EXを加え30分間攪拌溶解した。更に、飽和濃度25%となるように硫酸アンモニウム51.12gを少しずつ溶解させながら加えた。硫酸アンモニウムが溶解して後、更に30分間攪拌した。この溶解液を遠心分離(11,000×g、4℃、30分)し、上清370mLを回収した。次に、この上清に、氷浴下、飽和濃度40%となるように硫酸アンモニウム34.41gを少しずつ溶解させながら加えた。硫酸アンモニウムが溶解して後、更に30分間攪拌した後、4℃で一晩静置した。
遠心分離(11,000×g、4℃、30分)により、硫安沈殿を回収した。回収した硫安沈殿は、10mLの50mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.5に溶解し、透析チューブに入れ、透析バッファー(20mMTris−HCl,pH7.5,20%グリセリン)を用いて透析を行った。
透析チューブ内に不溶物が生じた為、遠心分離(27,000×g、4℃、15分)により、これを除去し、上清21mLを回収した。
平衡化バッファー(20mMTris−HCl,pH7.5,20%グリセリン)で平衡化した弱陰イオン交換樹脂DEAE Sepharose Fast Flow(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)320mL(カラムサイズ:f2.6cm×高さ60cm)に、前記2.4で回収した上清をチャージした。チャージ終了後、樹脂のbed volumeの3倍量の洗浄バッファー(20mMTris−HCl,pH7.5,20%グリセリン)で洗浄後、樹脂のbed volumeの5倍量の溶出バッファー(1:20mMTris−HCl,pH7.5,20%グリセリン、2:20mMTris−HCl,pH7.5,20%グリセリン,1M NaCl)を用いて、目的タンパクをグラジエント溶出させ、活性画分262mLを回収した。
限外濾過装置モデル8200(アミコン社製、限外ろ過メンブレン分画分子量10万)を用いて、前記2.5の活性画分を21.5mLに濃縮した。この濃縮液を透析チューブに入れ、透析バッファー(50mM HEPES,pH7.5)を用いて透析を行い、バッファーの置換を行った。更に、遠心濃縮器ビバスピン20(ビバサイエンス社製、分画分子量10万)を用いて遠心分離(2,700×g、4℃、3時間)により2.7mLに濃縮し、置換型ソルボースデヒドロゲナーゼ322Uを得た。
前記[3](「置換型ソルボースデヒドロゲナーゼの製造」)で製造したソルボースデヒドロゲナーゼ(以下置換型酵素と略す)を、以下のような方法で1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト(1m−PMS)で処理し、置換型酵素を活性化した。
前記[3]で製造した119U/mL濃度の置換型酵素の溶液0.115mLに、50mMのHEPESバッファー(pH7.5)1.765mLと20mMの1m−PMS水溶液0.12mLを加えて攪拌後、冷蔵庫内で1晩保存して活性化を行った。活性化終了後、遠心濃縮器ビバスピン20(ビバサイエンス社製、分画分子量5万)に、この活性化酵素液の全量を添加し、50mMのHEPESバッファー(pH7.5)10mLで希釈してから遠心分離機にセットして4,500rpmで45分間遠心分離し、約0.3mLまで濃縮した。さらに、この濃縮液に50mMのHEPESバッファー(pH7.5)10mLを加えて希釈後、再度遠心分離して濃縮し、1m−PMSを除去した。さらに同様の操作を2回繰り返して、ほぼ完全に1m−PMSを除去した。最後に、この濃縮液に50mMのHEPESバッファー(pH7.5)を加えて総液量を4mLとし、活性化した置換型酵素の濃度を3.4U/mLに調整した。
1m−PMSで活性化した酵素と未処理の酵素を用いて、それぞれ、実施例3(臨床的な1,5−AGの測定法)のR2試薬を調製した。これらのR試薬を用いて、0と50μg/mLの1,5−AG標準液を測定し、それぞれの発色強度を比較した。50μg/mLの1,5−AG標準液による吸光度の増加は、活性化前の酵素では0.064であったのに対し、活性化処理後の酵素では約4倍の0.248となり、酵素が約4倍に活性化されていることが分かった。
[1]臨床的な1,5−AGの測定法
臨床検査で汎用されている全自動生化学検査分析装置への対応を考え、最小スケールの測定法を組み立てた。
あらかじめ、以下のような組成の測定試薬、R1−1試薬(グルコース消去剤)、R1−2試薬(1m−PMS水溶液)、R2試薬(1,5−AG検出剤)を調製した。
試験管に、サンプルとして1,5−AG標準液または臨床検体を9μL、R1−1試薬を200μL加えて撹拌し、37℃の恒温水槽で5分間反応した。反応後、さらに、R1−2試薬10μLと、R2試薬100μLを加えて撹拌し、直ちに、この反応液を分光光度計用のセルに移し換え、37℃に加温されたセルホルダーにセットして、450nmにおける吸光度の変化を5分間測定した。
なお、本実施例に使用した臨床検体は、健常者と糖尿病患者から採取した血清である。
R1−1試薬(グルコース消去剤)
塩化カリウム 49.6mM
塩化ナトリウム 100mM
EDTA・2ナトリウム 0.1mM
フォスフォエノールピルビン酸 8.01mM
ATP 0.99mM
塩化マグネシウム 7.38mM
ピルビン酸キナーゼ(東洋紡製) 5U/mL
グルコキナーゼ(ユニチカ製) 4U/mL
WST-1 0.95mM
HEPESバッファー 50mM(pH 7.5)
R1−2試薬(1m−PMS水溶液)
1m−PMS 0.4mM
R2試薬(1,5−AG検出剤)
置換型酵素 3.4U/mL
HEPESバッファー 50mM(pH 7.5)
血清ベースのマトリックスを用いて、1,5−AGの標準液、0、5、12.5、25、50μg/mLを調製した。この標準液を上記の臨床的な1,5−AGの測定法で測定し、図9の検量線を作成した。なお、各標準液について吸光度増加の値を表7に示す。
健常者と糖尿病患者からなる20個の血清検体を、上記の臨床的な1,5−AGの測定法(本法)に従って測定し、既に、確立されている1,5−AG測定キット、「ラナ1,5AGオートリキッド」で測定した結果と比較した。その結果を、表8、図10に示す。
よって、本発明は、極めて高い産業上の利用可能性を有する。
Claims (22)
- (a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;または
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質:
を用いることを特徴とする1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。 - 前記タンパク質が、シノリゾビウム属に属する菌由来である請求項1に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
- 前記タンパク質が、シノリゾビウム エスピー.97507 FERM BP−10843由来である請求項1に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
- 前記タンパク質のソルボースに対する反応性を100%とした場合、前記タンパク質の1,5−アンヒドログルシトールに対する反応性が10%以上である請求項1に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
- 前記タンパク質の1,5−アンヒドログルシトールに対する反応性を100%した場合、前記タンパク質のD−グルコースに対する反応性が10%以下である請求項4に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
- 前記タンパク質を、発色基質の存在下で、試料中の1,5−アンヒドログルシトールに作用させることにより反応した発色基質の量を測定する請求項1に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
- 前記タンパク質を試料中の1,5−アンヒドログルシトールに作用させる前に、試料中のD−グルコースを予め除去する請求項6に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
- 前記タンパク質を、発色基質及び電子キャリアーの存在下で、試料中の1,5−アンヒドログルシトールに作用させる請求項7に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
- 1,5−アンヒドログルシトールを基質として測定した場合の前記タンパク質の酵素活性を基本単位として、前記試料1mL当たり、1〜500単位となるように前記タンパク質を添加する請求項8に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
- 試料中の1,5−アンヒドログルシトールに作用させる前に、前記タンパク質を、電子キャリアーを用いて活性化する請求項8に記載の1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
- (a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;または
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質:
を含有することを特徴とする1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。 - 前記タンパク質が、シノリゾビウム属に属する菌由来である請求項11に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
- 前記タンパク質が、シノリゾビウム エスピー.97507 FERM BP−10843由来である請求項11に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
- 前記タンパク質のソルボースに対する反応性を100%とした場合、前記タンパク質の1,5−アンヒドログルシトールに対する反応性が10%以上である請求項11に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
- 前記タンパク質の1,5−アンヒドログルシトールに対する反応性を100%とした場合、前記タンパク質のD−グルコースに対する反応性が10%以下である請求項14に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
- 前記タンパク質が、電子キャリアーを用いて活性化されたものである請求項11に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
- 前記電子キャリアーが、フェナジンメトサルフェイト及び1−メトキシ−5−メチルフェナジニウムメチルサルフェイトのうち少なくとも一つである請求項16に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
- 前記1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物が、さらに、発色基質を含有する請求項11に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
- さらに、電子キャリアーを含有する前記1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物であって、前記発色基質が還元性発色基質である請求項18に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物。
- 請求項11に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物を用いて、糖尿病の診断を補助するための方法。
- 請求項11に記載の1,5−アンヒドログルシトール測定試薬組成物の、1,5−アンヒドログルシトールの測定への使用。
- (a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;または
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ソルボースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質:
の、1,5−アンヒドログルシトールの測定への使用。
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