CN110988165B - 一种1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法及其应用 - Google Patents

一种1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明一方面提供了一种1,5‑脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法，用
Figure DDA0002297158690000011
唾液采集管收集测试个体的唾液样本并进行液相色谱质谱联用分析，可精确定量唾液1,5‑AG水平，避免了血液检测给患者带来的痛苦和感染风险以及试剂盒交叉反应所致的不准确性。本发明的另一方面提供了上述方法在在筛查糖尿病中的应用，根据检测的唾液1,5‑脱水葡萄糖醇水平或通过联合唾液1,5‑脱水葡萄糖水平与空腹血糖或糖化血红蛋白，用于筛查糖尿病，提高了糖尿病的筛查效率，同时可减少行OGTT的人数。

Description

一种1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物标志物的测定方法领域，具体涉及一种1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法及其应用。
背景技术
目前糖尿病已发展成为一个全球性的严重公共卫生问题，给家庭和社会带来了巨大的经济负担，血糖控制欠佳导致的糖尿病慢性并发症已成为糖尿病患者早亡和丧失劳动力的重要原因。据2017年国际糖尿病联盟评估，全球约有4.25亿20～79岁的成人糖尿病患者，患病率为8.8％，预计2045年全球糖尿病患病人数将达6.29亿。在20～79岁人群中约有400万人死于糖尿病，相当于每8秒就有1人死亡。糖尿病占全球全因死亡数量的10.7％，高于传染性疾病致死数的总和。但在如此庞大的患病人口中糖尿病未确诊人数高达2.124亿人，各地区未确诊率从37.6％～69.2％不等。
血糖监测是筛查糖尿病及评估糖尿病患者血糖控制水平不可或缺的手段，现有的常规方法包括糖化血红蛋白(HbA1c)、糖化白蛋白、持续葡萄糖监测和患者利用血糖仪进行的自我血糖监测。2003年美国FDA批准将血清1,5-AG(1,5-Anhydroglucitol，1,5-AG)作为评价短期血糖监测的新指标，2015年《中国血糖监测临床应用指南》亦将血清1,5-AG列入辅助血糖监测的指标。由于饮食习惯，中国糖尿病人群多表现为餐后血糖升高，而1,5-AG在反映血糖波动和餐后高血糖的效能尤其显著，既往围绕血清1,5-AG的研究显示1,5-AG水平在糖负荷后保持稳定，可非空腹使用；且1,5-AG联合空腹血糖可提高中国人群糖尿病筛查效率。且已有研究报道唾液1,5-AG水平在糖尿病患者中显著降低，用于未诊断糖尿病的筛查具有一定前景。
但常规基于血液的检测，需要进行有创静脉穿刺或针刺，一定程度上给患者带来痛苦及感染风险，并会影响患者血糖监测的积极性，且采用血清1,5-AG试剂盒检测唾液样本准确性欠佳。因此需要探索无创准确的检测方式用于糖尿病的筛查。这种方法快速便捷可用于大群体的筛查，且针对中国人群的血糖特点有良好的筛查效能。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法及其应用。本发明所采用的的唾液无创检测方法显著提高唾液1,5-AG检测的准确性，并且为糖尿病筛查提供了一种无创便捷的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法，包括如下步骤：
步骤一，用
Figure GDA0003708359740000021
唾液采集管收集测试个体的唾液样本；
步骤二，将步骤一所采集的唾液样本与乙腈：甲醇溶液混合后预处理；
步骤三，将预处理后的样本进行液相色谱质谱联用分析。
进一步地，步骤一的唾液样本的采集方法为采集前至少30分钟刷牙或漱口，保持口腔无刺激，时间≥30分钟，咀嚼
Figure GDA0003708359740000022
唾液采集管匹配的棉棒。
进一步地，咀嚼
Figure GDA0003708359740000023
唾液采集管匹配的棉棒1分钟，咀嚼次数为40～50次。
进一步地，步骤二乙腈：甲醇溶液中的乙腈和甲醇的体积比值为8：2。
进一步地，步骤二中预处理的操作过程为混合后的溶液涡旋3-8分钟后，于-20℃冷冻，离心，取上清液待进样测试。
进一步地，步骤三中的液相色谱质谱联用分析的步骤或参数如下：
(1)所用测定仪器为液相，采用2.1mm×100mm,1.7μm的氨基柱或Hilic柱，流动相A是0.05％的氨水溶液，B相由含0.05％氨水的乙腈：异丙醇的水溶液组成，乙腈：异丙醇：水的体积比为95:5:5；流速为0.5mL/分钟，梯度洗脱1～2分钟时，保持A相80％，B相20％；2.5分钟时，A相从80％降低到50％，B相由20％升至50％，并保持到4分钟。4.1分钟时，A相回到100％，平衡2分钟后重新进样；
(2)质谱采用负离子模式：毛细管电压为2.0KV，脱气温度为500℃，脱溶剂气流速为1000L/Hr，锥孔反吹气流流速为50L/Hr，碰撞气流速为0.15mL/分钟。
本发明的第二方面是提供该1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法在筛查糖尿病中的应用，根据检测的唾液1,5-脱水葡萄糖醇水平或通过联合唾液1,5-脱水葡萄糖水平与空腹血糖或糖化血红蛋白，用于筛查糖尿病。
进一步地，唾液1,5-脱水葡萄糖醇水平是在空腹或糖负荷后2小时检测的。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供了一种1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法，可避免血液检测给患者带来的痛苦和感染风险，也避免了尿液检测带来的尴尬，唾液采集操作便捷，患者接受度高，更易在临床及大范围糖尿病筛查时推广使用。由于唾液糖类物质成分较血液更为复杂，本发明建立的唾液1,5-AG液相质谱色谱联用检测方法可精确定量唾液1,5-AG水平，避免了试剂盒交叉反应所致的不准确性。此外唾液1,5-AG联合空腹血糖或糖化血红蛋白筛查糖尿病提高了糖尿病的筛查效率，同时可减少行OGTT的人数。
附图说明
图1是本发明一实施例中利用唾液1,5-AG水平筛查糖尿病的受试者工作特性(ROC)曲线图；
其中，图1a是受试者空腹唾液1,5-AG的工作特性曲线图，图1b是受试者糖负荷2小时唾液1,5-AG的工作特性曲线图；
图2是本发明一实施例中单用FPG筛查糖尿病判断是否需行OGTT流程图；
图3是本发明一实施例中联合使用空腹血浆葡萄糖和空腹唾液1,5-AG筛查糖尿病判断是否需行OGTT流程图；
图4是本发明一实施例中联合使用糖化血红蛋白和糖负荷后2小时唾液1,5-AG筛查糖尿病判断是否需行OGTT流程图；
图5是本发明一实施例中联合使用空腹血浆葡萄糖和糖化血红蛋白筛查糖尿病判断是否需行OGTT流程图。
具体实施方式
本发明提供一种1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法及该方法在在筛查糖尿病中的应用。下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
以下实施例中所有唾液样本采集时均要求受试者应排除牙龈出血，实验当天避免涂唇膏等唇部产品，采集前至少30分钟避免吸烟、刷牙、进食、饮水等，保持口腔无刺激至少30分钟。所有唾液样本采集后即刻对唾液采集管进行离心(2500转/分钟，10分钟)，立即检测或储藏于-80℃待检。
以下实施例中的受试者及实验样本获上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。
实施例1
本实施例为使用专门的
Figure GDA0003708359740000041
唾液采集管采集唾液样本方式的建立。
对象入选条件：(1)年龄18～70岁；(2)糖代谢正常；(3)无肝、肾功能异常；(4)不存在影响体内1,5-AG水平的因素，如囊性纤维化、胃大部分切除术后、服用某些中药如远志、美远志等。
建立过程为：(1)首先选取正常糖代谢者8例(男5例、女3例)，拟定1分钟咀嚼棉棒70次、3分钟咀嚼70次及含棉棒5分钟三种采集方式，第一天嘱受试者晨起空腹状态下不刷牙，漱口后30分钟分别按照三种方式收集唾液，第二天嘱受试者晨起空腹状态下刷牙后30分钟再次按照上述3种方式采集唾液。
结果显示，无论采取何种咀嚼方式，空腹不刷牙漱口后30分钟采集和空腹刷牙后30分钟采集，唾液1,5-AG水平差异无统计学意义。
(2)为优化唾液采集方法，再次选取正常糖代谢者10例(男4例、女6例)。嘱受试者晨起空腹状态下刷牙后保持口腔无刺激至少30分钟，分别按照1分钟咀嚼棉棒40～50次、50～60次、60～70次的方式收集唾液。
结果显示，三种方式两两比较唾液1,5-AG水平及唾液量差异均无统计学意义。因此，考虑受试者可较为轻松地完成咀嚼次数并获得稳定的唾液量，推荐采用1分钟咀嚼40～50次较为合适。
实施例2
本实施例建立和评估液相色谱质谱联用精确检测唾液1,5-AG水平的方法。
1.以下对受试者的入选条件、临床信息及样本收集和实验室指标检测进行描述。
对象入选条件：18～70岁。排除有以下情况者：既往糖尿病病史，严重肝肾功能异常，胃大部切除术后，服用某些影响1,5-AG水平的药物如远志、美远志等，囊性纤维化，服用甲状腺激素、糖皮质激素及性激素等，急性感染或酮症，妊娠、肿瘤、自身免疫性疾病及精神疾病史，资料缺失。
本实施例采用2010年美国糖尿病协会(ADA)的诊断标准进行糖尿病的诊断，即糖尿病为空腹血浆葡萄糖(FPG)≥7.0mmol/L；和/或75g OGTT下2小时血浆葡萄糖水平(2hPG)≥11.1mmol/L；和/或HbA1c≥6.5％；和/或糖尿病典型症状伴任意时刻血糖≥11.1mmol/L。
临床信息及样本收集：所有的调查员均经过培训后，完成统一的问卷调查，包括现病史、既往史、用药史、家族史及个人饮食生活习惯等。对所有受试者进行体格检查，包括测量身高、体重和血压。利用测定的身高、体重，用体重(kg)除以身高(m)的平方计算出体质指数，即体质指数＝体重(kg)/身高(m)2。使用上臂式电子血压计测定血压。所有受试者隔夜空腹10小时后于次日清晨参加检查，收集空腹静脉血样本后行75gOGTT，于喝糖水后的2小时静脉取血一次。血浆样本即刻检测，血清样本室温静置30分钟后离心，留取上清液分装，放置于4℃或-80℃待检。在抽取血标本的同时收集空腹及餐后2小时唾液样本。嘱受试者咀嚼
Figure GDA0003708359740000051
唾液采集管(莎斯特，德国)1分钟40～50次收集唾液。
实验室指标检测：FPG及2hPG采用葡萄糖氧化酶法测定。HbA1c采用高效液相法测定。血清1,5-AG采用酶法测定，批内变异系数＜3.5％，批间变异系数＜2.5％。血糖和血清1,5-AG测定均使用7600-120全自动生化分析仪(日立，日本)。
2.以下对该方法的建立和评估进行描述。
(1)该液相色谱质谱联用精确检测唾液1,5-AG水平方法的建立包括：
①提取唾液样本
根据实施例1建立的方法获得的唾液样本从-80℃冰箱取出，4℃下解冻。涡旋1分钟后，于13500rpm离心5分钟。取上清液90uL到一干净的EP管中，加入250uL含有50nmol/L13C-1,5-AG内标的乙腈：甲醇为8:2的混合溶剂。涡旋5分钟后，于-20℃冷冻20分钟，于13500rpm离心10分钟。取上清液待进样测试。
②测定条件
所用测定仪器为液相，采用2.1mm×100mm,1.7μm的氨基柱或Hilic柱，流动相A是0.05％的氨水溶液，B相由乙腈、异丙醇、水和氨水组成，乙腈：异丙醇：水的体积比为95:5:5，此后加入氨水，使其在B相中含量达0.05％。流速为0.5mL/分钟，梯度洗脱。1～2分钟时，保持A相80％，B相20％；2.5分钟时，A相从80％降低到50％，B相由20％升至50％，并保持到4分钟。4.1分钟时，A相回到100％，平衡2分钟后重新进样。
质谱采用负离子模式。毛细管电压为2.0KV，脱气温度为500℃，脱溶剂气流速为1000L/Hr，锥孔反吹气流流速为50L/Hr，碰撞气流速为0.15mL/分钟。
采用多反应监测模式，1,5-AG定量离子对为163/113，内标13C-1,5-AG定量离子对为169/118。
③方法学数据
1)检测限、定量限和线性
按照上述条件，1,5-AG的检测限为0.2ng/mL，定量限为2ng/mL。在0.01～60μg/mL范围内具有良好的线性关系，r2大于0.99。
2)日内和日间精密度
1,5-AG标准品的日内精密度变异系数(RSD)<2％,混合唾液中1,5-AG的日内精密度为RSD<4.7％；1,5-AG标准品3天内的日间精密度RSD<3％，混合唾液中1,5-AG 3天内的日间精密度为RSD<4.7％。
3)稳定性
采用上述样本前处理和测定方法，1,5-AG标准品1周内的稳定性的RSD<5％,混合唾液中1,5-AG1周内的稳定性的RSD<10％。
4)加样回收率
分别在混合唾液样本中加入0.05、0.48、0.75μg/mL的1,5-AG标准品，测定加样回收率。加入低、中、高不同量的标准品后，回收率分别在80～90％、100～105％、105～110％。
上述方法学数据从检测限、线性、精确性、稳定性和回收率五个角度证明了该方法检测唾液1,5-AG水平的可靠性。
3.根据上述建立的方法检测641名受试者的空腹及糖负荷后2小时唾液样本中1,5-AG的水平。
受试者包括男性251名，女性390名，平均年龄36.6(24.4-54.0)岁，平均体质指数为23.1(21.1-25.3)kg/m2，临床特征和测的1,5-AG的水平见表1。
表1受试者临床特征
Figure GDA0003708359740000071
由表1可知，唾液1,5-AG的检测结果可区分非糖尿病与糖尿病人群。
实施例3
本实施例评估检测唾液1,5-AG水平的方法在筛查糖尿病中的优势。
本发明对上述641例唾液1,5-AG水平进行分析，通过采用受试者工作曲线(ROC曲线)分析唾液1,5-AG水平，找到约登指数对应的最佳阈值，约登指数是评价筛查试验真实性的方法，假设其假阴性(漏诊率)和假阳性(误诊率)的危害性同等意义时，即可应用约登指数。约登指数是灵敏度与特异度之和减去1。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大。
以2010年ADA为诊断糖尿病的金标准作ROC分析，单独应用空腹唾液1,5-AG(1,5-AG0)或糖负荷后2小时唾液1,5-AG(1,5-AG120)筛查糖尿病时，其切点均为0.44μg/mL，此时其唾液1,5-AG0的敏感性为63.58％(95％置信区间：55.81％-71.34％)，特异性为60.61％(95％置信区间：56.27％-64.95％)，阳性预测值为33.22％(95％置信区间：27.76％-38.68％)，阴性预测值为84.38％(95％置信区间：80.56％％-88.19％)，曲线下面积为0.657(95％置信区间：0.618-0.693)(附图1a)。唾液1,5-AG120的敏感性为62.25％(95％置信区间：54.43％-70.07％)，特异性为60.41％(95％置信区间：56.06％-64.75％)，阳性预测值为32.64％(95％置信区间：27.19％-38.09％)，阴性预测值为83.85％(95％置信区间：80.00％-87.71％)，曲线下面积为0.660(95％置信区间：0.622-0.697)(图1b)。
当联合FPG和唾液1,5-AG0筛查糖尿病时，即当唾液1,5-AG0≤0.44μg/mL和/或FPG≥7.0mmol/L时，考虑诊断为糖尿病，其敏感性和曲线下面积分别进一步提高至73.51％(66.39％-80.63％)和0.928(0.905-0.947)，敏感性显著优于单用FPG(敏感性：73.51％与41.06％,P＜0.001；曲线下面积:0.928与0.925,P＝0.10)。单纯以FPG进行糖尿病筛查，此时约28.1％的人群(5.6mmol/L≤FPG<7.0mmol/L)需要进行OGTT(图2)。联合唾液1,5-AG0和FPG可使85.2％的人避免行OGTT，较单纯根据FPG结果，需要行OGTT者比例降低了47.3％(图3)。
联合HbA1c和唾液1,5-AG0时，其敏感性、特异性和AUC分别为80.13％(73.70％-86.57％)、60.61％(56.27％-64.95％)和0.959(0.941-0.973)。由于中国人群中餐后高血糖特点较为显著，且HbA1c和唾液1,5-AG120无需空腹检测，临床应用更为便捷，我们进一步分析发现当联合HbA1c和唾液1,5-AG120时，其敏感性、特异性和AUC分别为82.78％(76.69％-88.87％)、60.20％(55.85％-64.55％)和0.960(0.942-0.974)。HbA1c联合唾液1,5-AG120的AUC优于HbA1c联合唾液1,5-AG0(P＝0.03)，但HbA1c联合唾液1,5-AG120与1,5-AG0的敏感性和特异性均无统计学差异(均P＞0.05)。联合HbA1c和唾液1,5-AG120的曲线下面积虽与单用HbA1c及FPG联合HbA1c无统计学差异(P分别为0.06、0.55)，但敏感性显著高于单用HbA1c及FPG联合HbA1c(HbA1c+唾液1,5-AG120与HbA1c：82.78％与62.91％，HbA1c+唾液1,5-AG120与FPG+HbA1c：82.78％与68.87％，均P＜0.001)。联合HbA1c和唾液1,5-AG120可使83.9％避免行OGTT(图4)，较联合HbA1c和FPG需要行OGTT者比例降低了51.4％(图5)。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，用
Figure FDA0003708359730000011
唾液采集管收集测试个体的唾液样本；
步骤二，将步骤一所采集的唾液样本与乙腈、甲醇溶液混合后预处理；
步骤三，将预处理后的样本进行液相色谱质谱联用分析；
所述液相色谱采用氨基柱或Hilic柱，流动相A是0.05％的氨水溶液，流动相B由含0.05％氨水的乙腈：异丙醇的水溶液组成，其中乙腈：异丙醇：水的体积比为95:5:5；
所述步骤三中的液相色谱联用分析的步骤如下：
(1)梯度洗脱1～2分钟时，保持A相80％，B相20％；
(2)2.5分钟时，A相从80％降低到50％，B相由20％升至50％，并保持到4分钟；
(3)4.1分钟时，A相回到100％，平衡2分钟后重新进样。
2.根据权利要求1所述的1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法，其特征在于，步骤一中，所述唾液样本的具体采集方法为：采集前至少30分钟刷牙或漱口，保持口腔无刺激时间≥30分钟，咀嚼
Figure FDA0003708359730000012
唾液采集管匹配的棉棒。
3.根据权利要求2所述的1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法，其特征在于，咀嚼所述
Figure FDA0003708359730000013
唾液采集管匹配的棉棒的时间为1分钟，咀嚼次数为40～50次。
4.根据权利要求1所述的1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法，其特征在于，步骤二中，所述乙腈、甲醇溶液中乙腈和甲醇的体积比为8：2。
5.根据权利要求1所述的1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法，其特征在于，步骤二中，所述预处理的操作过程为：混合后的溶液涡旋3-8分钟后，于-20℃冷冻，离心，取上清液待进样测试。
6.根据权利要求1所述的1,5-脱水葡萄糖醇的唾液无创检测方法，其特征在于，所述质谱采用负离子模式，毛细管电压为2.0KV，脱气温度为500℃，脱溶剂气流速为1000L/Hr，锥孔反吹气流流速为50L/Hr，碰撞气流速为0.15mL/分钟。
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