CN114910579B - 血清中脱氧尿苷定量测定方法及在心肌梗死诊断中的应用 - Google Patents

血清中脱氧尿苷定量测定方法及在心肌梗死诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了血清中脱氧尿苷定量测定方法，包括以下步骤：步骤1：13C9，15N2‑脱氧尿苷储备液和标准溶液的配制；步骤2：血清样本中加入内标及样品处理；步骤3：采用液相系统、色谱柱和质谱仪对步骤2中处理后的血清样本进行HILIC‑MS/MS检测，包括内源性脱氧尿苷和内标的测定；步骤4：同步骤2配制含系列浓度稳定同位素13C9，15N2‑脱氧尿苷的标准曲线溶液，同步骤3测定稳定同位素13C9，15N2‑脱氧尿苷及内标，获得标准工作曲线；步骤5：根据步骤3、4结果，经内标校正后，计算并获得血清样品中内源性脱氧尿苷浓度。本发明建立了一种简单、可靠且重复性好的血清中内源性脱氧尿苷的定量方法，并成功应用于测定正常受试者以及心肌梗死病人血清脱氧尿苷水平。

Description

血清中脱氧尿苷定量测定方法及在心肌梗死诊断中的应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及血清中脱氧尿苷定量测 定方法及在心肌梗死诊断中的应用。
背景技术
急性心肌梗死发生迅速、危害极大，因心肌梗死损伤的不可逆性， 急性心梗的早期识别、危险分级一直是急性心梗诊疗的基础与重点， 及时诊断、早期诊断极为重要。这对及早介入和救治、赢得宝贵时间， 临床意义重大。心肌损伤的标志物是识别与预警急性心梗的重要辅助 工具，相关的科学探索研究从未停止进行。但目前临床上应用的急性 心肌标志物在疾病发展中变化的背后原理不尽相同，通常代表心肌受 到损害(如肌钙蛋白家族成员、谷草转氨酶等)或炎症状态(MPO、CRP 等)两者其一，容易受到疾病或者外部不同因素的干扰，且随检测时 间不同有不稳定的波动问题，影响临床准确诊断。冠脉造影的方法虽然准确可靠，但操作复杂、对身体有损伤，尤其是在条件不具备的边 远地区、或者医护人员缺乏、医疗资源缺乏、紧张情况下，难以开展， 也不适合大规模的高危人群普筛。临床上亟需研究和发现简单、可靠 的急性心梗早期预警和诊断标志物。
越来越多的研究发现，急性心梗的发生、发展并不孤立，急性 心梗发生、发展过程中，广泛涉及到循环免疫系统的变化，而循环免 疫系统中，包含中性粒细胞、巨噬细胞等循环细胞的活动、功能改变， 一定伴随着基础物质代谢-分子水平的改变。代谢物是生命活动的下 游分子，血浆/血清中的代谢物变化与循环细胞功能、状态密不可分， 甚至直接决定着循环细胞的活力与功能。
近年来，基于循环系统研究，发现一些与急性心梗代谢发生相关 标记物，但大部分的代谢标志物研究仍处于初始起步阶段，绝大部分 结果仅基于代谢组学全谱扫描、非绝对定量方法测定结果，因此需要 进一步建立准确、可靠的绝对定量方法，对其体内水平进行准确定量， 增强其真正的临床应用价值。
发明内容
1.要解决的技术问题
本发明的目的是为了解决现有技术中无法准确定量测定内源性 脱氧尿苷浓度，以及无法消除人体内源性脱氧尿苷的测定干扰的问题， 而提出的血清中脱氧尿苷定量测定方法及在心肌梗死诊断中的应用。
2.技术方案
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
血清中脱氧尿苷定量测定方法，包括以下步骤：
步骤1：储备液及工作液配制，包括13C9，15N2-脱氧尿苷储备液 的配制和内标储备液的配制；
其中13C9，15N2-脱氧尿苷储备液的配制包括以下步骤：先取 25mM的13C9，15N2-脱氧尿苷标准品溶液适量溶解于超纯水中配制成 相当于1.0mg/mL储备液，置-20℃冰箱中保存，然后临用时用超纯 水稀释成系列工作液浓度；
其中内标储备液的配制包括以下步骤：先精密称取4-氯-DL-氯 苯丙氨酸溶解于超纯水中配制成相当于1mg/mL储备液，临用时用甲 醇稀释到1μg/mL作为蛋白沉淀剂；
步骤2：血清样本的处理，其中处理方法包括以下步骤：
S2.1：取50μL血清样本，加入200μL含内标甲醇，震荡5min 沉淀蛋白后4℃冰箱静置30min；
S2.2：随后对静置后的血清样本进行离心处理，取上清液180μ L减压挥干；
S2.3：再加入100μL超纯水，震荡5min后，再进行离心处理， 然后取上清5μL进样；
步骤3：采用液相系统、色谱柱和质谱仪对步骤2中处理后的血 清样本进行HILIC-MS/MS检测，包括内源性脱氧尿苷和内标的测定；
步骤4：标准曲线的分析：选取若干人体血清样本混匀，分别取 45μL的混合血清，加入5μL步骤1中制备的不同浓度的13C9， 15N2-脱氧尿苷系列工作液，配制成终浓度分别为0.3、1、3、10、 30、100ng/mL的标准血清样本，按步骤2中的方法处理进样分析。
优选地，所述步骤1中工作液浓度为3、10、30、100、300或 1000ng/mL。
优选地，所述S2.2和S2.3中的离心处理具体参数为18000× rpm、4℃离心10min。
优选地，所述步骤3中液相系统包括LC-30A二元泵，SIL-30AC 自动进样器和CTO-30AC柱温箱(Shimadzu，Kyoto，日本)；
色谱柱型号为Amide XBridge HPLC column(3.5μm；4.6mm×100mm；Waters，美国)；柱温40℃；水相(流动相A)为含0.1％甲 酸和5mM甲酸铵水，有机相(流动相B)为乙腈，流动相梯度：0-2 min，85％B；2-5min，85-20％B；5-8min，20％B；8-10min，20-85％ B；10-14min，85％B；流动相流速为0.4mL/min；
质谱仪采用AppliedBiosystemsAPI4000三重四级杆质谱仪(AB SCIEX，FosterCity，美国)，采用ESI源正离子检测，扫描模式为 MRM，分析物的MS/MS参数和保留时间；质谱参数如下所示:离子源 温度为50℃；离子喷雾电压为4.5kV；curtain gas设置为30；离子源气体1设置为55；离子源气体2设置为55。
本发明还提出了血清中脱氧尿苷定量测定方法在心肌梗死诊断 中的应用，应用于心肌梗塞的诊断标记物测定。
本发明还提出了诊断标记物，为血清中的内源性脱氧尿苷，也可 以扩展为血浆、全血中内源性脱氧尿苷。
优选地，血清/血浆中脱氧尿苷浓度水平用于诊断心肌梗塞。
本发明还提出了心肌梗塞诊断方法，心肌梗塞病人血清/血浆中 脱氧尿苷浓度高于5.15μg/mL，而健康人群脱氧尿苷浓度低于5.15 μg/mL。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本发明中，建立了一种13C和15N标记的脱氧尿苷(13C9， 15N2-脱氧尿苷)替代血清中内源性脱氧尿苷的替代分析物的 LC-MS/MS定量方法，在Applied Biosystems API4000三重四级杆质 谱仪上采用MRM扫描模式进行检测。首先测定替代分析物和真正分析物响应因子(RF)以消除同位素效应和离子化效率的差异。测定结果 显示在线性范围内响应因子的值恒定且趋近于1，说明可以用血清中 系列浓度的13C9，15N2-脱氧尿苷建立标准曲线用于定量内源性脱氧 尿苷，实验结果表明，13C9，15N2-脱氧尿苷特异性良好，灵敏度高， 定量下限为0.3ng/mL。人血清中13C9，15N2-脱氧尿苷在0.3 -100.0ng/mL范围内线性良好，相关系数r>0.99，彻底解决了脱 氧尿苷这一内源性物质定量的难题。
(2)本发明中，将所建立的内源性脱氧尿苷的定量方法用于测 定健康受试者以及心肌梗死病人血清中脱氧尿苷，发现心肌梗死病人 血清中脱氧尿苷水平都显著高于正常组，ROC曲线下面积为0.794， 提示血清中的脱氧尿苷水平对心肌梗死具有极高的预测性。
(3)本发明中，根据测定结果划定了每个组别受试者血清中脱 氧尿苷分别于90％和95％置信区间的浓度范围，计算得到cutoff临界 值为5.15ng/ml，即按照临床检测结果，高于5.15ng/ml的病人，有 79.4％把握诊断为急性心梗，为临床应用提供了可以直接参考的指标。 预计在临床上联合脱氧尿苷、高敏肌钙蛋白hs-TnT两个测定指标， 可以更为准确地对急性心梗进行诊断。
附图说明
图1为13C9，15N2-脱氧尿苷、脱氧尿苷和内标的MRM质谱图；
其中a：脱氧尿苷质谱图；b：13C9，15N2-脱氧尿苷质谱图；c： 内标质谱图；
图2为特异性色谱图；
其中a：人空白血清中的13C9，15N2-脱氧尿苷色谱图；b：人血 清标曲中的13C9，15N2-脱氧尿苷色谱图(300ng/mL)；c：人血清中 内源性脱氧尿苷色谱图；d：人血清中内标色谱图；
图3为人血清中13C9，15N2-脱氧尿苷标准曲线；
图4为正常受试者与心肌梗死病人血清中脱氧尿苷定量结果；
其中，Health代表健康受试者组别，MI代表心肌梗死病人组别；
*p<0.05，**p<0.01以及***p<0.001vs健康组；
图5为ROC曲线分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
参照图1至图5，血清中脱氧尿苷定量测定方法，包括以下步骤：
步骤1：13C9，15N2-脱氧尿苷储备液的配制：取25mM的13C9， 15N2-脱氧尿苷标准品溶液适量溶解于超纯水中配制成相当于1.0 mg/mL储备液，置-20℃冰箱中保存，临用时用超纯水稀释成系列工 作液浓度(3、10、30、100、300、1000ng/mL)。内标储备液的配制： 精密称取4-氯-DL-氯苯丙氨酸溶解于超纯水中配制成相当于1mg/mL 储备液，临用时用甲醇稀释到1μg/mL作为蛋白沉淀剂；
步骤2：血清样本的处理，取50μL血清样本，加入200μL含 内标甲醇，震荡5min沉淀蛋白后4℃冰箱静置30min。随后18000× rpm、4℃离心10min，取上清液180μL减压挥干，再加入100μL超 纯水，震荡5min后，18000×rpm、4℃离心10min，取上清5μL进 样；
步骤3：采用液相系统、色谱柱和质谱仪对步骤2中处理后的血 清样本进行HILIC-MS/MS参数的检测；
液相系统包括LC-30A二元泵，SIL-30AC自动进样器和 CTO-30AC柱温箱(Shimadzu，Kyoto，日本)。色谱柱型号为Amide XBridge HPLC column(3.5μm；4.6mm×100mm；Waters，美国)； 柱温40℃；水相(流动相A)为含0.1％甲酸和5mM甲酸铵水，有机 相(流动相B)为乙腈，流动相梯度：0-2min，85％B；2-5min，85-20％ B；5-8min，20％B；8-10min，20-85％B；10-14min，85％B；流动相流 速为0.4mL/min；
采用Applied Biosystems API 4000三重四级杆质谱仪(AB SCIEX， FosterCity，美国)，采用ESI源正离子检测，扫描模式为MRM，分 析物的MS/MS参数和保留时间如表1。
其他质谱参数如下所示:离子源温度为50℃；离子喷雾电压为 4.5kV；curtaingas设置为30；离子源气体1设置为55；离子源气 体2设置为55；
表1分析物MS/MS参数和保留时间
Figure BDA0003594697090000071
Figure BDA0003594697090000081
13C9，15N2-脱氧尿苷与脱氧尿苷响应因子的测定；
S4.1：45μL超纯水分别加入5μL不同浓度的13C9，15N2-脱氧 尿苷与脱氧尿苷系列工作液配制成终浓度为1、10、100ng/mL的标准 样本，每一浓度水平配制3份；
S4.2：然后按照步骤2的方法处理进样，响应因子(RF)＝A真实/A 替代，其中A真实代表某浓度下脱氧尿苷的峰面积，A替代代表同等浓度 下13C9，15N2-脱氧尿苷的峰面积，测定结果如表2。
可以看出，RF值在线性范围内为一恒定值且趋近于1，说明在本 发明的测定方法下脱氧尿苷与13C9，15N2-脱氧尿苷与无明显离子化 效率的差异；
表2响应因子的测定
Figure BDA0003594697090000082
步骤4：标准曲线的分析；
选取若干人体血清样本混匀，分别取45μL的混合血清，加入5 μL步骤1中制备的不同浓度的13C9，15N2-脱氧尿苷系列工作液，配 制成终浓度分别为0.3、1、3、10、30、100ng/mL的标准血清样本， 按步骤2中的方法处理进样分析。以所测生物样品中待测物13C9， 15N2-脱氧尿苷与IS的峰面积比值为因变量，待测物的终浓度为自变 量，进行最小二乘法(W＝1/x2)回归运算，求得13C9，15N2-脱氧尿 苷在人血清中的直线回归方程:y＝0.000305x-0.000014 (r2＝0.9998)。
本实施例中，建立了一种简单、可靠且重复性好的血清中内源性 脱氧尿苷的定量方法，并成功应用于测定正常受试者以及心肌梗死病 人血清脱氧尿苷水平，通过数据分析给出血清中脱氧尿苷临界值为 5.15ng/ml，以此进行判断，高于此临界值的诊断准确率达到79％。
实施例2
本实施例中，血清中脱氧尿苷定量测定方法在心肌梗死诊断中的 应用，应用于心肌梗塞的诊断标记物测定。
实施例3
本实施例中，诊断标记物，为血清中的内源性脱氧尿苷，也可以 扩展为血浆、全血中内源性脱氧尿苷。
本实施例中，血清/血浆中脱氧尿苷浓度水平用于诊断心肌梗塞。
实施例4
本实施例中，心肌梗塞诊断方法，心肌梗塞病人血清/血浆中脱 氧尿苷浓度高于5.15μg/mL，而健康人群脱氧尿苷浓度低于5.15μ g/mL。
实施例5
本实施例中，健康受试者以及心肌梗死病人血清中脱氧尿苷的测 定及ROC曲线分析，包括以下步骤：
步骤一：临床来源的正常健康受试者和心肌梗死病人血清样品， 37度水浴中放置10分钟解冻，取50μl上述血清样本按步骤1中方 法处理进样，根据当日随行血清标准曲线计算每个血清样本中内源性 脱氧尿苷的浓度(图4)。与正常组相比，心肌梗死病人组别血清样 本中内源性脱氧尿苷显著性升高。
步骤二：将两组人血清内源性脱氧尿苷的定量结果绘制ROC曲线 (图5)，心肌梗死病人组别ROC曲线下面积为0.794，其数据分析 结果如表3。
表3正常受试者与MI病人血清中脱氧尿苷定量结果
Figure BDA0003594697090000101
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范 围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技 术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改 变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.血清中脱氧尿苷定量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：储备液及工作液配制，包括13C9，15N2-脱氧尿苷储备液的配制和内标储备液的配制；
其中13C9，15N2-脱氧尿苷储备液的配制包括以下步骤：先取25mM的13C9，15N2-脱氧尿苷标准品溶液适量溶解于超纯水中配制成相当于1.0mg/mL储备液，置-20℃冰箱中保存，然后临用时用超纯水稀释成系列工作液浓度；
其中内标储备液的配制包括以下步骤：先精密称取4-氯-DL-氯苯丙氨酸溶解于超纯水中配制成相当于1mg/mL储备液，临用时用甲醇稀释到1μg/mL作为蛋白沉淀剂；
步骤2：血清样本的处理，其中处理方法包括以下步骤：
S2.1：取50μL血清样本，加入200μL含内标甲醇，震荡5min沉淀蛋白后4℃冰箱静置30min；
S2.2：随后对静置后的血清样本进行离心处理，取上清液180μL减压挥干；
S2.3：再加入100μL超纯水，震荡5min后，再进行离心处理，然后取上清5μL进样；
步骤3：采用液相系统、色谱柱和质谱仪对步骤2中处理后的血清样本进行HILIC-MS/MS参数的检测；
步骤4：标准曲线溶液配制及分析：选取若干人体血清样本混匀，分别取45μL的混合血清，加入5μL步骤1中制备的不同浓度的13C9，15N2-脱氧尿苷系列工作液，配制成终浓度分别为0.3、1、3、10、30、100ng/mL的标准血清样本，按步骤3中的方法处理进样分析；所述步骤1中工作液浓度为3、10、30、100、300和1000ng/mL，所述S2.2和S2.3中的离心处理具体参数为18000×rpm、4℃离心10min，所述步骤3中液相系统包括LC-30A二元泵，
SIL-30AC自动进样器和CTO-30AC柱温箱；
色谱柱型号为Amide XBridge HPLC column，3.5μm；4.6mm×100mm；Waters；柱温40℃；流动相A为含0.1％甲酸和5mM甲酸铵水，流动相B为乙腈，流动相梯度：0-2min，85％B；2-5min，85-20％B；5-8min，20％B；8-10min，20-85％B；10-14min，85％B；流动相流速为0.4mL/min；
质谱仪采用Applied Biosystems API 4000三重四级杆质谱仪，采用ESI源正离子检测，扫描模式为MRM，分析物的MS/MS参数和保留时间；质谱参数如下所示:离子源温度为50℃；离子喷雾电压为4.5kV；curtain gas设置为30；离子源气体1设置为55；离子源气体2设置为55。
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