BR112013031244B1

BR112013031244B1 - método para a geração de uma linhagem de células de planta monoclonal a partir de uma população heterogênea de células de planta

Info

Publication number: BR112013031244B1
Application number: BR112013031244-0A
Authority: BR
Inventors: Schiermeyer Andreas; Schinkel Helga; Kirchhoff Janina; Fischer Rainer; Schillberg Stefan
Original assignee: Fraunhofer Ges Forschung
Priority date: 2011-06-07
Filing date: 2011-06-07
Publication date: 2019-10-29
Also published as: ZA201309126B; BR112013031244A2; JP2014516553A; TW201300014A; EP2717676B1; CA2835253A1; AU2011370336A1; KR20140048880A; TWI608795B; RU2013157526A; CN103596423A; EP2717676A1; JP5933700B2; IL229168A0; US20140053300A1; AR086674A1; RU2573927C2; WO2012167803A1; CA2835253C; KR101933552B1

Abstract

método para a geração de uma linhagem de células de planta monoclonal a partir de uma população heterogênea de células de planta a invenção provê um método para a geração de uma linhagem de células de planta monoclonais a partir de uma população heteróloga de células de planta, compreendendo as seguintes etapas: (a) provisão de uma população heteróloga de células de plantas; (b) preparação de protoplastos a partir da dita população heteróloga de células de planta; (c) separação de protoplastos únicos submetendo a preparação de protoplastos a classificação citométrica de fluxo; (d) regeneração de um protoplasto transformado único separado até a formação de uma micro-colônia através de co-cultura na presença de material celular alimentador; (e) remoção da microcolônia do material celular alimentador e cultura da micro-colônia até a formação de uma linhagem de células monoclonais de planta.

Description

“MÉTODO PARA A GERAÇÃO DE UMA LINHAGEM DE CÉLULAS DE PLANTA MONOCLONAL A PARTIR DE UMA POPULAÇÃO HETEROGÊNEA DE CÉLULAS DE PLANTA” [001]A presente invenção refere-se ao campo de biotecnologia de planta. Em particular, a presente invenção refere-se à geração de uma linhagem de células de planta monoclonal nativa (tipo selvagem) ou transgênica a partir de uma população heterogênea de células de planta através de classificação citométrica de fluxo. Como será aparente para aqueles versados na técnica, a invenção também compreende o uso de linhagem de células monoclonais de planta para a regeneração de plantas férteis integrais.

[002]Durantes as décadas passadas, enormes esforços foram dedicados ao estabelecimento e cultura de sistemas baseados em plantas para a acumulação e colheita de proteínas nativas ou heterólogas e metabólitos secundários. A literatura provê uma vasta quantidade de material probatório que prova a utilidade de sistemas baseados em plantas para produção de uma grande variedade de substâncias desejadas que tanto são secretadas no meio de cultura ou isoladas das células produtoras, tecidos, organelas ou mesmo plantas inteiras ou suas partes. Da mesma maneira, existe uma ampla faixa de protocolos de transformação que asseguram o estabelecimento de material de planta transformada estavelmente ou transientemente. Entretanto, ainda há uma necessidade de uma tecnologia confiável, de custo relativamente eficiente e rápida para obter altos rendimentos de um desejado produto a partir de células de planta.

[003]Foi repetidamente reportado que transformação de uma população de células de planta tal como uma cultura em suspensão de planta frequentemente resulta em culturas transgênicas que exibem células com níveis de expressão altamente heterogêneos (mistos) e inconsistentes da proteína alvo relacionada à mistura de células epigeneticamente diferentes dentro de população primária de células he

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2/28 terogêneas. Dentro de linhas de células recombinantes a heterogeneidade em expressão de transgene demonstra um problema sério em termos de taxas de produção.

[004]Um principal problema é que clones de alta produção são eventos frequentemente raros dentro de um ensaio de transformação e é muito consumidor de tempo estabelecer uma linhagem de células homogêneas de alta produção. Um desafio técnico ainda em andamento, por isso, é a produção de evento transgênico elite e recuperação a partir de uma cultura de planta já transgênica ou recentemente transformada.

[005]Para classificação citométrica de fluxo tal como, por exemplo, aplicação FACS, células esféricas únicas têm de ser obtidas a partir da população de células de planta usualmente agregadas ou cultura através de digestão enzimática das células para liberar protoplastos. Para a maior parte de espécies de plantas, entretanto, a regeneração de protoplastos únicos é dificultada pela necessidade de ser mantida em certas densidades de população.

[006]Um procedimento confiável e reproduzível para a regeneração de um protoplasto/ célula transgênica única ou para a regeneração de uma planta fértil integral a partir do mesmo (especialmente após classificação citométrica de fluxo) até agora não foi descrito.

[007]A presente invenção é assim primariamente relacionada com a provisão de um sistema baseado em planta para produzir altos níveis de desejados produtos nativos ou recombinantes que faz uso de uma linhagem de células monoclonais de planta transgênicas ou não-transformadas gerada de uma população heterogênea (mista) de células de planta tal como uma cultura em suspensão e supera os problemas da técnica anterior, em particular com relação à rápida separação e subsequente regeneração de protoplastos únicos (transgênicos) até a formação de uma micro-colônia que pode ser usada para estabelecer uma linhagem de células mono

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3/28 clonais de planta que, preferivelmente, é capaz de produzir e acumular altas quantidades do produto desejado. É claro para aqueles versados na técnica que a presente invenção da mesma maneira permite prover plantas férteis integrais regeneradas a linhagem de células monoclonais de planta estabelecida.

[008]Contrário a muitos sistemas atualmente usados e desenvolvidos que são baseados no uso de plantas intactas ou pelo menos tecido de planta intacto e diferenciado, o uso de células em suspensão tem a vantagem de que material homogêneo pode ser reproduzivelmente produzido sob condições controladas, assépticas e contidas.

[009]Existem atualmente duas principais estratégias para produção de proteínas recombinantes em plantas, por exemplo, (i) a geração de linhas de células em suspensão ou de plantas transgênicas estáveis ou (ii) a expressão transiente de gene(s) heterólogos após infecção de hospedeiros de expressão de planta (planta, tecido ou células) com uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium), um vírus (por exemplo, vírus de mosaico de Tabaco), vírus X/Y de batata, vírus mosaico de feijãode-vaca e muitos outros), ou uma combinação de ambos (por exemplo, magnifecção) para permitir o hospedeiro expressar a informação genética heteróloga (DNA ou RNA). Na alternativa e como conhecido na técnica, a informação genética também pode ser introduzida no hospedeiro de expressão em planta através de meios mecânicos estabelecidos como, por exemplo, eletroporação ou perfuração com laser.

[0010]Embora a invenção seja preferivelmente relacionada com o uso de material de célula de planta transformado estavelmente, sistemas para a expressão transiente tendo a vantagem de velocidade (gene-para-produto, tempo-paramercado, resposta de emergência) assim como a possibilidade para obter níveis de acumulação que são muito maiores que aqueles que podem ser tipicamente obtidos em plantas transgênicas transformadas estavelmente ou suas partes tais como células também podem ser envolvidos no método de acordo com a presente invenção.

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4/28 [0011]De acordo com a invenção, é provido um método para a geração de uma linhagem de células de planta monoclonais transgênicas ou nativas (tipo selvagem, não-transformadas). O método compreende primeiramente prover a dita população de células de planta, tais como, por exemplo, células de planta em suspensão formando o material de fonte de células de planta que é submetido ainda às etapas compreendidas pelo método de acordo com a invenção. Usualmente, este material de células de planta pode ser facilmente derivado de, por exemplo, uma cultura em suspensão de planta heterogênea que, preferivelmente, foi cultivada sob condições controladas e/ou assépticas. As células fonte podem ser células transgênicas transformadas (estavelmente / transientemente) ou células tipo selvagem (nativas, nãotransformadas) capazes de produzir e acumular um desejado produto.

[0012]Uma vez que o método de acordo com a invenção usa classificação citométrica de fluxo tal como, por exemplo, tecnologia FACS para separar ou isolar protoplastos únicos, isto é, individualizados, estes têm de ser preparados de uma população de células de planta como providas acima usando materiais e métodos conhecidos na técnica. De acordo com uma realização preferida, estes protoplastos são transformados e capazes de (i) produzir uma proteína marcadora fluorescente ou polipeptídeo, (ii) produzir um desejado produto, e/ou (iii) sobreviver em presença de um agente de seleção. Os critérios de classificação preferidos para classificação citométrica de fluxo são granularidade de célula como um marcador para, por exemplo, características qualitativas como apoptose, e tamanho de célula. Os critérios de classificação preferidos para FACS podem ser selecionados do grupo compreendendo o antecedente genético (por exemplo, ploidia, aneuploidia), mutantes transgênicos, produtos de troca de gene, e fluorescência (por exemplo, autofluorescência (cloroplastos, metabólitos), proteínas fluorescentes ou fluorescência mediada por enzima). É para ser entendido que o uso de um agente de seleção não é necessário. Assim, o protoplasto não tem necessariamente de ser transformado

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5/28 com uma sequência de ácido nucléico conferindo uma apropriada resistência.

[0013]Após a separação ou isolamento de protoplastos únicos (transformados) através de classificação citométrica de fluxo, tal como, por exemplo, FACS, cada protoplasto transformado único é regenerado até a formação de uma microcolônia (micro-calo) através de co-cultura na presença de material celular alimentador. A origem de fonte de planta não é limitada, mas restrita àquelas linhas, variedades e espécies cujos protoplastos têm o potencial para regenerar até a formação de uma micro-colônia ou micro-calo. A presente invenção é assim aplicável a todas as variedades e espécies de plantas para as quais um protocolo de regeneração tenha sido estabelecido ou será provido no futuro. Em vista do aspecto de acordo com a invenção com relação à ainda regeneração da micro-colônia monoclonal ou linhagem de células de planta em plantas férteis integrais, é para ser entendido que este aspecto pode ser realizado com todas as variedades e espécies de plantas para as quais um protocolo de regeneração tenha sido estabelecido ou será provido no futuro.

[0014]Subsequentemente, a micro-colônia é separada ou removida do material celular alimentador e cultivada até a formação de uma linhagem de células monoclonais de planta.

[0015]De acordo com uma realização preferida, a etapa seguinte compreendida pelo método de acordo com a invenção por isso refere-se à geração de um tecido monoclonal de calo através de (i) transferência de micro-colônia ou micro-calo para meio de cultura sólido e (ii) cultura de micro-colônia ou micro-calo na presença de pelo menos um agente de seleção até a formação de um tecido de calo transgênico do qual uma linhagem de células monoclonais transgênicas de planta pode ser estabelecida através de transferência de tecido de calo para meio de cultura líquido. Como será apreciado por aqueles versados na técnica, a micro-colônia também pode ser removida ou separada do material celular alimentador através de meios me

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6/28 cânicos, tal como, por exemplo, através de escolha de clone. Neste caso, nenhum agente de seleção é necessário e as células compreendidas pela micro-colônia não precisam mostrar resistência contra qualquer agente de seleção.

[0016]De acordo com uma realização preferida, as células compreendidas pela população heterogênea de células de planta são células nativas (por exemplo, tipo selvagem) ou células não-transgênicas que, antes de serem submetidas a classificação citométrica de fluxo, são estavelmente ou transientemente transformadas com pelo menos um vetor de expressão compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucléico heteróloga operavelmente ligada a um promotor funcional, onde a dita pelo menos uma sequência de ácido nucléico heteróloga codifica um produto desejado. Ainda de acordo com uma realização, o pelo menos um vetor de expressão compreende pelo menos duas sequências de ácidos nucléicos heterólogas ligadas operavelmente a um (uns) promotor(es) funcional, onde as ditas pelo menos duas sequências de ácidos nucléicos heterólogas codificam uma proteína marcadora fluorescente ou polipeptídeo e uma resistência contra um agente de seleção ou para um desejado produto. Se desejado, as células adicionalmente podem compreender uma sequência de ácido nucléico heteróloga que codifica um desejado produto a ser acumulado na linhagem de células monoclonais transgênicas de planta como provida de acordo com a invenção.

[0017]O termo “heteróloga” como aqui usado indica que o gene/sequência de nucleotídeos em questão foi introduzido em células de planta através do uso de engenharia genética, isto é, através de intervenção humana. Uma sequência heteróloga de nucleotídeos pode compreender a sequência codificando uma proteína de fusão compreendida por um parceiro de fusão que pode ser formado, por exemplo, em parte por uma proteína de planta que pode ser fundida a uma proteína nãoplanta que pode ser chamada uma proteína de fusão planta: não-planta híbrida para os propósitos da presente invenção. Alternativamente, uma proteína de fusão pode

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7/28 ser uma que é formada por parceiros de fusão que são de origem não-planta. Um gene heterólogo pode aumentar a expressão de uma proteína de interesse a partir de um gene equivalente endógeno, isto é, um que normalmente desempenha a mesma ou similar função, ou a sequência inserida pode ser adicional ao gene endógeno ou outra sequência. Ácido nucléico heterólogo para uma célula pode ser de ocorrência não-natural no tipo, variedade ou espécie de célula cultivada. Assim, o ácido nucléico heterólogo pode compreender uma sequência codificante de, ou derivada de, um tipo particular de organismo, tal como uma espécie de planta ou mamífero, por exemplo, de espécie humana, ovina, bovina, eqüina, ou suína, colocada dentro do contexto de uma célula cultivada tal como uma célula BY2 derivada de tabaco. Ainda uma possibilidade é a sequência de ácido nucléico ser colocada dentro de uma célula alvo cultivada na qual ela ou uma homóloga é encontrada naturalmente, mas onde a sequência de ácido nucléico está ligada e/ou adjacente a ácido nucléico que não ocorre naturalmente dentro da célula, ou células daquele tipo ou espécie ou variedade de planta, tal como ligada operavelmente a uma ou mais sequências reguladoras, tal como uma sequência promotora, para controle de expressão. Além disso, sequências de ácidos nucléicos sintéticos (artificiais) também podem ser usadas.

[0018]“Vetor” é definido para incluir, entre outras coisas, qualquer vetor plasmídeo, cosmídeo, fago, ou viral em forma circular ou linear de fita única ou dupla que pode ou não ser auto transmissível ou mobilizável, e que pode transformar um hospedeiro procariótico ou eucariótico e existe extra-cromossoma (por exemplo, plasmídeo replicante autônomo com uma origem de replicação). Especificamente incluídos são vetores lançadores pelos quais é pretendido um veículo DNA capaz, naturalmente ou através de projeto, de replicação em dois diferentes organismos hospedeiros, que podem ser selecionados de actinomicetes e espécies relacionadas, bactérias e células eucarióticas (por exemplo, planta superior, musgos, mamíferos,

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8/28 levedura ou fungo).

[0019]“Vetor de expressão” refere-se a um vetor no qual um ácido nucléico está sob o controle de, e operavelmente ligado a, um apropriado promotor ou outros elementos reguladores para transcrição em uma célula hospedeira tal como uma célula microbiana ou de planta. O vetor pode ser um vetor de expressão bifuncional que funciona em múltiplos hospedeiros. No caso de DNA genômico ou subgenômico, este pode conter seu próprio promotor ou outros elementos reguladores e no caso de cDNA este pode estar sob o controle de um apropriado promotor ou outros elementos reguladores para expressão na célula hospedeira.

[0020]Um “promotor” é uma sequência de nucleotídeos a partir da qual transcrição pode ser iniciada de DNA ligado operavelmente à jusante (isto é, na direção 3' sobre a fita sentido de DNA de fita dupla).

[0021]“Operavelmente ligado” significa ligado como parte da mesma molécula de ácido nucléico, apropriadamente posicionado e orientado para a transcrição ser iniciada a partir do promotor.

[0022]O termo “induzível” como aplicado a um promotor é bem entendido por aqueles versados na técnica. Em essência, expressão sob o controle de um promotor induzível é “ligada” ou aumentada em resposta a um estímulo aplicado. A natureza do estímulo varia entre promotores. Alguns promotores induzíveis causam pequenos ou indetectáveis níveis de expressão (ou nenhuma expressão) na ausência do apropriado estímulo. Outros promotores induzíveis causam expressão constitutiva detectável na ausência do estímulo. Qualquer que seja o nível de expressão na ausência do estímulo, expressão a partir de qualquer promotor induzível é aumentada na presença do correto estímulo.

[0023]A invenção também abrange uso de uma variante de qualquer uma destas sequências. Uma proteína variante compartilha homologia com, ou é idêntica a, todas ou parte das sequências discutidas acima.

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9/28 [0024]Para a expressão de proteínas recombinantes, uma suspensão de Agrobactérias recombinantes ou vírus (vetores) contendo a informação genética para as proteínas de interesse é aplicada às células de planta em suspensão mencionadas acima em uma maneira conhecida na técnica. O vetor infecta as células de planta e transmite a informação genética. Preferivelmente, o material de célula de planta a ser transformado é provido em alta densidade com somente pequenas quantidades de meios estando presentes de modo que a suspensão de vetor pode ser aplicada justo por gotejamento ou espargimento. Esta realização de transformação preferida tem várias vantagens práticas com relação a manuseio, automação, contenção, aumento de escala e produção e remoção de despejo. Na alternativa, técnicas conhecidas como bombardeio de partícula, eletroporação e semelhantes podem ser usadas como conhecido na técnica.

[0025]Apropriados promotores incluem o vírus mosaico de couve-flor 35S (CaMV 35S). O promotor pode ser selecionado para incluir um ou mais motivos de sequência ou elementos conferindo controle de expressão específico de tecido e/ou desenvolvimental.

[0026]Como já mencionado, o pelo menos um marcador genético selecionável, que pode ser desejado para ser produzido, pode ser incluído na construção ou ser provido em uma segunda construção, tais como aqueles que conferem fenótipos selecionáveis como resistência a antibióticos ou herbicidas (incluindo, mas não limitado a, por exemplo, canamicina, higromicina, fosfinotricina, clorsulfurom, metotrexato, gentamicina, spectinomicina, imidazolinonas e glifosato). Alternativamente, as células de planta em suspensão usadas para a preparação de protoplastos também podem ser providas a partir de uma cultura em suspensão de planta heterogênea transgênica compreendendo células transgênicas.

[0027]A linhagem de células monoclonais (transgênicas) de planta estabelecida de acordo com a invenção pode ser tratada ou cultivada na presença de pre

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10/28 cursores, indutores, hormônios, estabilizadores (por exemplo, solutos compatíveis), inibidores, moléculas de RNAi/siRNA, compostos sinalizantes, enzimas (por exemplo, pectinase), e/ou elicitadores em adição a, ou ao invés da, suspensão de vetor, para a produção de proteínas recombinantes ou metabólitos.

[0028]De acordo com uma realização preferida, o produto desejado é selecionado do grupo consistindo em proteínas ou polipeptídeos heterólogos (por exemplo, produtos de sangue, citocinas, hormônios de crescimento, enzimas terapêuticas / diagnósticas / industriais, vacinas, anticorpos de tamanho integral ou vários derivados de anticorpos), metabólitos secundários (por exemplo, fenil propanóides, alcalóides, terpenóides, quinonas ou esteróides), e marcadores para o diagnóstico ou análise de compostos gasosos, sólidos ou fluidos (químicos) e substâncias.

[0029]Os genes de interesse incluem aqueles que codificam proteínas que são elas próprias medicamentos naturais tais como produtos farmacêuticos ou veterinários. Além disso, genes de interesse também incluem qualquer outra proteína recombinante tal como, por exemplo, enzimas técnicas, toxinas, ou proteínas recombinantes conferindo novas características agronômicas de entrada e saída.

[0030]Ácidos nucléicos heterólogos podem codificar, entre outras coisas, genes de origem bacteriana, de fungos, planta ou não-planta tais como proteínas de fusão como citado acima ou origem animal. Polipeptídeos produzidos podem ser utilizados para produção de polipeptídeos que podem se purificar a partir deles mesmos para uso em qualquer outro lugar. Proteínas que podem ser produzidas em um método da invenção incluem heterodímeros, como FSH, imunoglobulinas, anticorpos de fusão e anticorpos de cadeia única. Além disso, os genes acima podem ser alterados para produzirem proteínas com características alteradas tal como estrutura glicano modificada. Entretanto, a invenção também permite o uso de genes sintéticos tais como sequências artificiais que, como tais, não existem em natureza.

[0031]Tais proteínas incluem, mas não são limitadas a proteína retinoblas

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11/28 toma, p53, angiostatina, e leptina. Da mesma maneira, os métodos da invenção podem ser usados para produção de proteínas reguladoras de mamíferos. Outras sequências de interesse incluem proteínas, hormônios, como hormônio de estimulação de folículo, fatores de crescimento, citocinas, albumina de soro, hemoglobina, colágeno, taumatina, proteínas semelhantes à taumatina, fatores de crescimento de epiderme como VEGF, etc.

[0032]Como será apreciado por aqueles versados na técnica, a invenção permite produção de uma grande variedade de proteínas e polipeptídeos incluindo proteínas (recombinantes) de relevância farmacêutica (como, por exemplo, vacinas, anticorpos, enzimas terapêuticas, alérgenos, e hipoalérgenos, peptídeos antimicrobianos, proteínas estruturais como elastina e colágeno para uso como materiais de revestimento biocompatíveis, partículas semelhantes a vírus, corpos proteína, etc.), proteínas (recombinantes) de valor nutricional (alimento e aditivos de alimentação), proteínas (recombinantes) para aplicações diagnósticas (tais como, por exemplo, enzimas, anticorpos e anticorpos engenheirados, outra enzima ou proteínas de fusão fluorescentes, antígenos para serem usados como controles positivos, ligantes de ligação para arranjos de proteínas), proteínas (recombinantes) de relevância técnica (tais como, por exemplo, ligantes de ligação para adsorventes de afinidade, enzimas de alto valor, biocatalisadores), e proteínas recombinantes aperfeiçoando características agronômicas de entrada e saída.

[0033]Falando genericamente, ácidos nucléicos heterólogos podem ser expressos através de qualquer processo apropriado usado na técnica ou eles podem ser transcritos ou expressos como se segue.

(i) expressão transiente de DNA ‘nu’, por exemplo, compreendendo um promotor ligado operavelmente à sequência heteróloga de interesse, (ii) expressão a partir de um vetor de expressão, tal como um vetor de replicação. Falando genericamente, aqueles versados na técnica são bem capazes de

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12/28 construir vetores e projetar protocolos para expressão transiente de gene recombinante. Apropriados vetores podem ser escolhidos ou construídos, contendo apropriadas sequências reguladoras, incluindo sequências promotoras, fragmentos terminadores, sequências de poliadenilação, sequências aperfeiçoadoras, genes marcadores e outras sequências quando apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2 nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press ou Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., Johm Wiley & Sons, 1992.

(iii) expressão a partir de um vetor não-integrante.

[0034]Será entendido que estas categorias não são mutuamente exclusivas, por exemplo, porque um vetor não-integrante também pode ser um vetor de expressão, etc.

[0035]Como será apreciado por aqueles versados na técnica, as pelo menos duas sequências de ácido nucléico heterólogas codificando para uma proteína marcadora fluorescente ou polipeptídeo ou para uma enzima produzindo uma molécula fluorescente e para a proteína heteróloga de interesse (produto desejado) podem ser providas tanto (i) em configuração policistrônica compreendida por um cassete de expressão única sobre o mesmo vetor, (ii) em uma configuração tandem com pelo menos dois diferentes cassetes de expressão sobre o mesmo vetor, ou (iii) em pelo menos dois cassetes de expressão sobre diferentes vetores, onde a configuração tandem é preferida.

[0036]Ainda de acordo com um aspecto, a invenção assim também provê um método para a produção de pelo menos um produto desejado preferivelmente selecionado do grupo consistindo em proteínas ou polipeptídeos heterólogos, metabólitos secundários, e marcadores. O método compreende usar a linhagem de célula monoclonal (transgênica) de planta como estabelecida de acordo com a invenção de modo a produzir e acumular o pelo menos um produto desejado que é subsequen

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13/28 temente obtido ou isolado a partir das células produtoras ou do meio de cultura.

[0037]Assim, em um aspecto da invenção, é mostrado o uso de uma linhagem de células monoclonais de planta preferivelmente estavelmente transformadas adicionalmente capaz de gerar mRNA codificando um produto desejado tal como uma proteína alvo heteróloga gerada por transcrição a partir de uma construção de ácido nucléico introduzida incluindo a sequência de nucleotídeos alvo operavelmente ligada a um promotor.

[0038]O “ácido nucléico introduzido” assim incluirá a sequência de ácido nucléico heteróloga como uma sequência de DNA provida na forma de uma construção que é capaz de originar a produção e acumulação do desejado produto.

[0039]Assim, em um aspecto preferido da invenção, é mostrado um método de obtenção de expressão estável de uma sequência de nucleotídeos heteróloga em uma linhagem de células monoclonais de planta, cujo método compreende a etapa de introdução estável em uma célula alvo de pelo menos uma primeira sequência de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos heteróloga codificando o desejado produto.

[0040]Em uma realização é provido um método de geração de pelo menos uma proteína heteróloga extracelular, cujo método compreende as etapas de:

(i) introdução estável em uma célula alvo compreendida pela população de partida de células de planta de um primeiro ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotídeos codificando a proteína heteróloga ou produto desejado;

(ii) preparação de protoplastos a partir de células de planta em suspensão providas a partir da dita cultura em suspensão de planta, onde os protoplastos são adicionalmente transformados e capazes de (i) produzir uma proteína marcadora fluorescente ou polipeptídeo e (ii) sobreviver na presença de um agente de seleção;

(iii) separação de protoplastos transformados únicos submetendo a preparação de protoplastos a FACS;

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14/28 (iv) regeneração de um protoplasto transformado único separado até a formação de uma micro-colônia ou micro-calo através de co-cultura na presença de material celular alimentador;

(v) geração de um tecido de calo monoclonal através de (i) transferência de micro-colônia ou micro-calo para meio de cultura sólido e (ii) cultura de micro-colônia ou micro-calo na presença de pelo menos um agente de seleção até a formação de um tecido de calo transgênico;

(vi) estabelecimento de uma linhagem de células monoclonais transgênicas de planta através de transferência de tecido de calo para meio de cultura líquido; e (vii) causando ou permitindo expressão a partir de ácido nucléico da proteína heteróloga ou produto desejado através de provimento de apropriadas condições de cultura, e (viii) colheita de proteína heteróloga acumulada ou produto desejado a partir das células produtoras.

[0041]O isolamento pode ser através de meios inteiramente convencionais, e pode ou não vincular purificação parcial ou completa.

[0042]Naturalmente, aqueles versados na técnica reconhecerão que mais de um gene pode ser usado na, ou cada, construção. Múltiplos vetores (cada um incluindo uma ou mais sequências de nucleotídeos codificando proteína heteróloga de escolha) podem ser introduzidos nas células alvos como aqui descrito ou em outra parte. Isto pode ser útil para produção, por exemplo, de múltiplas subunidades, por exemplo, de uma enzima.

[0043]A proteína marcadora fluorescente ou polipeptídeo pode ser qualquer proteína detectável por fluorescência tal como GUS, proteínas fluorescentes como GFP ou DsRed, luciferase, etc. Preferivelmente, o repórter é um marcador nãoinvasivo tal como DsRed ou GFP.

[0044]Ainda de acordo com um aspecto, a invenção provê um método para a

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15/28 identificação de loci de inserção de maior expressão através de classificação de célula compreendendo as etapas de transformação de células (por exemplo, como descrito em Exemplo 1B abaixo), por exemplo, com uma construção contendo proteína fluorescente 1, e identificação e separação de células únicas de alta produção de proteína fluorescente 1 através de FACS incluindo a regeneração para micro-colônia e cultura em suspensão e a troca de gene, por exemplo, com proteína fluorescente 2, e identificação e separação de produtos raros de troca de gene.

[0045]A invenção será agora ainda descrita com referência às seguintes Figuras e Exemplos não-limitantes. Outras realizações da invenção ocorrerão àqueles versados na técnica à luz destes.

[0046]A Figura 1 é um desenho esquemático ilustrando a estrutura de um cassete de expressão usado para a preparação da linhagem MTED BY-2 transgênica como aqui descrito. Em particular, a figura ilustra o T-DNA do vetor de expressão em planta pTRAkc::MTED usado para a transformação de células em suspensão BY-2.

[0047]LB e RB: borda esquerda e direita do T-DNA; Pnos e pAnos: promotor e terminador do gene nopalina sintase; nptII: sequência codificante do gene neomicina fosfotransferase; SAR: região de tablado de ligação; P35SS e pA35S: promotor com duplicado aperfeiçoador e terminador do gene 35S de vírus mosaico de couveflor CaMV); CHS: 5'-UTR da calcona sintase de Petroselinum crispum; SP: peptídeo sinal; HC e LC: sequência codificante da cadeia pesada e leve do anticorpo M12; TL: 5'-UTR do vírus etch de tabaco (TEV); TP: peptídeo de trânsito; DsRed: sequência codificante para a proteína fluorescente vermelha de Discosoma spec.

Exemplos

Exemplo 1

Geração rápida de linhas de células monoclonais produtoras de elite após um evento de transformação

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A. Cultura de célula de tabaco [0048]A cultura em suspensão tipo selvagem de Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) foi mantida no escuro sob condições estéreis como alíquotas de 50 mL em frascos Erlenmeyer de vidro de 100 mL a 26^oC, com uma agitação orbital constante de 180 rpm. O meio de cultura compreendeu meio MSMO basal (pH 5,8) suplementado com sucrose (3%, peso / volume) e 1 mg/L de ácido 2,4—dicloro fenoxi acético. Sub-cultura foi feita em intervalos de 7 dias através de transferência de 5% (v/v) das células em 50 mL de meio novo.

[0049]Para preparação de protoplasto a cultura de células em suspensão foi sub-cultivada através de transferência de 2% (v/v) em 50 mL de meio novo.

B. Geração acelerada de eventos transgênicos para subseqüente classificação [0050]Células BY-2 tipo selvagem em suspensão foram cultivadas como descrito na seção A. Em paralelo Agrobacterium Tumefaciens transgênico abrigando uma construção compreendendo vários cassetes de expressão sobre o mesmo vetor (ver Fig. 1) foram cultivados em meio YEB contendo o apropriado antibiótico (caldo nutriente 0,5%, extrato de levedura 0,1%, peptona 0,5%, sucrose 0,5%, MgSO4 2 mM, pH 7,4) sobre um agitador orbital em 160 rpm e 27^oC para uma OD600nm de 1. Três dias após sub-cultura 3 mL de células BY-2 tipo selvagem, aceto siringona 200 nM e 150 pL de agrobactérias (OD600nm = 1) foram co-cultivadas em placas de Petri no escuro. Após 3 dias de co-cultura em temperatura ambiente as células BY-2 foram re-suspensas em 10 mL de meio BY-2 suplementado com 200 mg/L de cefotaxime. As células foram transferidas para um tubo estéril de 50 mL e lavadas duas vezes por centrifugação (850 g, 5 minutos) de modo a remover agrobactérias. Após re-suspensão da pelota de células a cultura das células BY-2 transformadas ocorre em frascos de agitação de 100 mL usando 20-50 mL de meio BY-2 suplementado com cefotaxime e um apropriado agente seletivo (180 rpm, 26^oC). Após regeneração

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17/28 de uma suspensão própria (volume de células empacotadas de aproximadamente 50-60%) as células podem ser sub-cultivadas para preparação de protoplasto (ver seção C). Este método requer 14 a 21 dias para estabelecimento de uma cultura em suspensão transgênica que pode ser usada para subseqüente geração de protoplasto (C) e classificação citométrica de fluxo (D).

C .Preparação de protoplasto e regeneração de parede de célula [0051]Culturas de células crescendo ativamente foram usadas 3 dias após sub-cultura para sedimentação de células através de centrifugação em 850 g por 5 minutos em tubos de centrífuga plásticos cônicos estéreis. O sobrenadante foi removido e células foram re-suspensas em 10 mL de solução de digestão PNT (3,6 g/L sais basais Kao Michayluk (Duchefa), sucrose 0,4 M, NAA 0,5 mg/L, BAP 1 mg/L) compreendendo celulase 1% (peso / volume) e macerozima 0,3% (peso / volume). A suspensão de células - enzima foi colocada em placas de Petri de 6 cm seladas com uma fita adesiva. Digestão foi realizada por toda noite (16-18 horas) a 26°C no escuro com agitação suave. Protoplastos foram filtrados através de uma tela de nylon de 100 micrometros e subsequentemente flutuaram para a superfície durante centrifugação (104 g por 8 minutos). A pelota e a interface de meio foram removidas e protoplastos lavados duas vezes com solução de PNT. Protoplastos foram resuspensos em solução W5 (NaCl 154 mM, CaCl2 125 mM, KCl 5 mM, glicose 5 mM, pH 5,6) e sedimentados por centrifugação em 76 g por 2 minutos. Protoplastos foram cultivados no meio de regeneração modificado 8p2c (ver tabela 1 abaixo; otimizado a partir de meio 8p) após suave re-suspensão. Usualmente o procedimento descrito resultou em 7x10⁵ protoplastos por mL com uma porcentagem média de 74% de protoplastos viáveis.

[0052]Protoplastos foram regenerados por 3 dias a 26°C no escuro para iniciar regeneração de parede de célula. Os protoplastos resultantes foram novamente peneirados através de uma tela de nylon de 100 micrometros e então transferidos

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18/28 para um tubo de introdução de amostra estéril para classificação FAC. Protoplastos únicos foram classificados em cada cavidade de uma placa de micro-titulação de 96 cavidades contendo protoplastos ou células alimentadoras tipo selvagem, nãotransgênicas (ver seção D).

[0053]Protoplastos BY-2 tipo selvagem, que foram usados como protoplastos alimentadores foram ajustados para aproximadamente 2x10³ células/mL meio 8p2c usando uma câmara de contagem Fuchs-Rosenthal. Cinqüenta microlitros destes protoplastos foram transferidos para cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades de modo que aproximadamente 100 protoplastos alimentadores tipo selvagem foram transferidos em cada cavidade.

Tabela 1 :Composição do meio 8p2c (pH 5,6)

- Mistura de sal basal Kao e Michayluk (Duchefa)

- Solução de vitamina Kao e Michayluk (Sigma)

Ácido p-amino benzóico 0,02 mg/L

Ácido L-ascórbico 2 mg/L

Biotina 0,01 mg/L

Pantotenato de D-cálcio 1 mg/L

Cloreto de colina 1 mg/L

Ácido fólico 0,4 mg/L

Mio-inositol 100 mg/L

Nicotinamida 1 mg/L

Piridoxina HCl 1 mg/L

Riboflavina 0,2 mg/L

Tiamina HCl 1 mg/L

Vitamina A 0,01 mg/L

Vitamina D 0,01 mg/L

- Ácidos orgânicos (pH 5,5 com NH4OH)

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Piruvato de sódio 20 mg/L

Ácido málico 40 mg/L

Ácido cítrico 40 mg/L

Ácido fumárico 40 mg/L

- Açúcar e álcoois de açúcar

Sucrose 0,25 g/L

Manose 250 mg/L

Glicose 68,4 g/L

Ramnose 250 mg/L

Frutose 250 mg/L

Celobiose 250 mg/L

Ribose 250 mg/L

Sorbitol 250 mg/L

Xilose 250 mg/L

Manitol 250 mg/L

- Hormônios

2,4-D 0,2 mg/L

Zeatina 0,5 mg/L

NAA 1,0 mg/L

- 2% (v/v) água de coco

Ácido casamino 500 mg/L

D. Análise e classificação citométrica de fluxo [0054]O instrumento FACS Vantage (DIVA option, BD Bioscience) com um laser de íon Argônio 488 nm / 635 nm foi usado para classificação de protoplastos de planta transgênica. O fluido de revestimento, uma solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4), foi esterilizado por autoclavagem e por passagem através de um filtro de 0,22 pm. Antes de classificação os tubos de amostra foram limpos de

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20/28 etanol residual através de passagem de fluido de revestimento estéril. As fixações de classificação / sistema citômetro foram alinhadas usando partículas de calibração autofluorescentes padrões comerciais. O classificador de fluxo foi operado em 488 nm com uma saída de laser de 175 mW. Antes de classificação as janelas de classificação eletrônica foram posicionadas baseadas em sinais coletados por espalhador de luz dianteiro, espalhador de luz lateral e fluorescência de uma amostra de cultura de protoplasto de modo a definir a população fortemente fluorescente. Os sinais foram mostrados como gráficos de pontos usando o suporte lógico DIVA (BD Bioscience). Regiões classificadas foram definidas através de criação de portões primeiro ao redor de população de protoplastos viáveis e segundo, baseado no primeiro portão, ao redor de população de protoplastos fortemente fluorescentes. Classificação foi realizada através de uma ponta de fluxo de 200 pm com uma pressão de revestimento de sistema de 4-6 psi, uma freqüência de gota de aproximadamente 7 kHz e uma taxa de fluxo de amostra de aproximadamente 1000 eventos / segundo.

[0055]Usando os parâmetros de classificação descritos uma eficiência de revestimento de 20% (isto é, 20% das cavidades contidas intactas e protoplastos classificados únicos viáveis) foi obtida.

E. Regeneração de protoplastos classificados únicos através de co-cultura com protoplastos fornecedores / alimentadores [0056]Antes de classificação de protoplastos únicos altamente fluorescentes cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades foi enchida com 50 microlitros de meio de regeneração 8p2c estéril contendo aproximadamente 100 protoplastos de N. tabacum cv. BY-2 tipo selvagem como células alimentadoras. Os protoplastos transgênicos classificados foram analisados por microscopia de fluorescência inversa em diferentes pontos de tempo para verificar deposição de célula única após o método de classificação e também para monitorar a proliferação e formação de micro-colônia (14-20 dias após classificação) dos protoplastos transgênicos.

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A cultura de protoplastos classificados em placas de 96 cavidades ocorreu a 26^oC 27^oC no escuro, as placas foram fechadas com uma tampa estéril e seladas com fita adesiva.

[0057]Micro-colônias transgênicas foram então transferidas para meio de regeneração sólido (ágar 0,8% (peso/volume)), contendo um marcador de seleção antibiótico (por exemplo, canamicina). Por isso, o tecido de micro-calo incluindo as células alimentadoras presentes nas cavidades foi suavemente ressuspenso através de pipetação e transferido usando uma pipeta com uma extremidade de ponta larga. Subsequentemente, as cavidades e também os micro-calos transferidos sobre o meio de regeneração sólido foram analisados por microscopia de fluorescência inversa para verificar a transferência bem sucedida das micro-colônias fluorescentes e transgênicas. Com a transferência micro-calos transgênicos foram crescidos por 1420 dias e transferidos para placa nova contendo meio de regeneração sólido incluindo o marcador de seleção. Tecido de calo com um tamanho de aproximadamente 2 cm em diâmetro foi usado para estabelecer culturas em suspensão através de transferência do material de célula para 5 mL de meio de cultura (descrito na seção A) em frascos plásticos de cultura de tecido de 50 mL. Estes frascos foram cultivados como descrito na seção A até a suspensão de células ter crescido para um volume de célula empacotada de cerca de 50-60% para transferência para frascos Erlenmeyer de vidro de 100 mL. O cultivo da cultura em suspensão monoclonal transgênica foi realizado como descrito na seção A.

[0058]A estratégia de célula alimentadora descrita permite a regeneração de cerca de 50% dos protoplastos únicos intactos e viáveis inicialmente classificados (isto é, aproximadamente 10% dos protoplastos únicos classificados nas cavidades de uma placa de micro-titulação de 96 cavidades desenvolveram para micro-calos).

F. Verificação da eliminação bem sucedida de sobrevivência de célula alimentadora durante regeneração de protoplastos únicos classificados

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22/28 [0059]Um procedimento foi desenvolvido que permite a regeneração confiável de protoplastos selecionados FCS únicos para culturas em suspensão monoclonais. Uma vez que protoplastos únicos têm de ser regenerados após classificação, células alimentadoras são requeridas para suportar regeneração e proliferação de protoplastos únicos classificados. Devido aos protoplastos alimentadores serem temporariamente co-cultivados com protoplastos alvos fluorescentes classificados é imperativo excluir uma sobrevivência de protoplastos alimentadores durante a regeneração de culturas monoclonais.

[0060]A potencial contaminação de células BY-2 transgênicas e fluorescentes classificadas únicas com protoplastos alimentadores foi investigada. Células transgênicas foram transformadas com uma construção contendo um cassete de expressão GFP-KDEL e um marcador de seleção AHAS (conferindo resistência Imazetapir). Protoplastos BY-2 únicos transformados com esta construção e produzindo GFP foram classificados em placas de 96 cavidades contendo protoplastos de uma linhagem de células transgênicas contendo um cassete de expressão DsRed e um marcador de seleção nptII (conferindo resistência a canamicina). Em um segundo experimento, protoplastos BY-2 únicos transformados com o cassete de expressão DsRed e um marcador de seleção nptII foram classificados em placas de 96 cavidades contendo protoplastos da linhagem de células transgênicas produzindo GFP. Após regeneração as resultantes culturas fluorescentes DsRed e GFP foram analisadas com relação a sua resistência no sentido de imazetapir ou canamicina e sua fluorescência (verde versus vermelho). Tecido de calo de ambas as abordagens foi revestido sobre meio de seleção contendo tanto imazetapir 1,5 pM como canamicina 100 mg/L. Crescimento de célula foi avaliado visual mente após 14 dias de incubação. Todos os calos testados (20 no total) cresceram exclusivamente sobre placas de meio contendo seu específico agente seletivo. Em resumo, calos transformados com GFP/AHAS cresceram sobre imazetapir mas não sobre placas contendo cana

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23/28 micina enquanto calos transformados com DsRed / canamicina cresceram somente sobre placas de canamicina. Esta observação demonstrou claramente que linhas de células transgênicas regeneradas não foram contaminadas com a respectiva linhagem de célula alimentadora. Uma potencial contaminação com células alimentadoras foi adicionalmente avaliada através de análise citométrica de fluxo. As culturas em suspensão GFP e DsRed foram analisadas com relação a suas propriedades óticas elicitadas pelas proteínas fluorescentes GFP ou DsRed, respectivamente. Esta observação demonstrou claramente que linhas de células transgênicas regeneradas não foram contaminadas com a respectiva linhagem de células alimentadoras. Todas as culturas BY-2 testadas mostraram exclusivamente o padrão de fluorescência esperado. Culturas estabelecidas após classificação de células transformadas GFP mostram somente fluorescência verde enquanto culturas produzindo DsRed foram detectadas exclusivamente no canal de fluorescência vermelha. No caso de uma contaminação com células alimentadoras um sinal de fluorescência em ambos os canais pode ter sido esperado. O resultado da análise citométrica confirmou a eficiente remoção de células alimentadoras sobre placas de seleção como demonstrado antes pelo teste de resistência.

G. Análise de culturas em suspensão transgênicas monoclonais [0061]As culturas em suspensão monoclonais foram primeiro analisadas com relação a sua porcentagem de células altamente fluorescentes. Por isso, protoplastos foram preparados como descrito na seção C. Para a determinação citométrica de fluxo da porção de protoplastos fluorescentes foi usado o instrumento FACS Calibur (BD Bioscience). Baseado nos protoplastos BY-2 tipo selvagem os parâmetros de fixação (por exemplo, amplificação de luz e multiplicadores de dispersão de fluorescência) foram ajustados e as amostras foram medidas. Após retenção de população viável, a distribuição desta população no canal de fluorescência foi usada para fixar um limite, que excluiu todos os sinais de fundo causados pela auto

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24/28 fluorescência tipo selvagem. De acordo com este limite a porcentagem de protoplastos fluorescentes dentro de culturas de protoplastos aperfeiçoados derivadas de um protoplasto único foi calculada. Análises citométricas de fluxo das culturas monoclonais em suspensão produzindo a proteína DsRed recombinante mostraram células distribuídas homogeneamente de similares e fortes intensidades de fluorescência (estreitos picos de fluorescência). O cálculo das porções de células fluorescentes DsRed resultou em porcentagens variando entre 78-88% de células fortemente fluorescentes.

[0062]Os níveis de acumulação para a proteína recombinante podem ser determinados através de diferentes procedimentos (por exemplo, ensaio imuno adsorvente ligado à enzima (ELISA)). Por isso, as células foram centrifugadas (850 g, 5 minutos), re-suspensas em 3 volumes de tampão de extração (PBS, pH 6, 2mercapto etanol 5 mM, EDTA 5 mM, ácido ascórbico 10 mM) e interrompida por sonificação. O extrato foi separado de debris de células através de uma outra etapa de centrifugação (20 minutos, 16 000 g) e usado para análises. Análises imunológicas da acumulação de anticorpo M12 em 5 dpi de extratos de células de culturas em suspensão transformadas com pTRAkc:MTED revelaram até 118 +/- 20 pg/g de peso fresco (1,5 vez maior do que usando o método de geração convencional , isto é, geração de calo e seleção).

Exemplo 2

Geração de linhas de células monoclonais a partir de uma cultura em suspensão transgênica heterogênea

A. Cultura de células de tabaco [0063]A cultura em suspensão de Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY2) transgênica MTED#18 produzindo o anticorpo IgG1 de inteiro tamanho, humano, retardado-ER, M12 e a proteína fluorescente alvejada para plastídeo DsRed foi mantida no escuro sob condições estéreis como alíquotas de 50 mL em frascos Erlen

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25/28 meyer de vidro de 100 mL a 26^oC, com uma agitação orbital constante de 180 rpm. Células BY-2 tipo selvagem foram cultivadas sob as mesmas condições como controle. O meio de cultura compreendeu meio MSMO basal em pH 5,8 suplementado com sucrose (3%, peso/volume) e ácido 2,4-dicloro fenoxi acético 1 mg/L. Subcultura foi feita em intervalos de 7 dias através de transferência de 5% (v/v) das células em 50 mL de meio novo.

[0064]A cultura em suspensão transgênica foi gerada através de transformação mediada por Agrobacterium de células de N tabacum cv. BY-2 seguida por uma seleção baseada em antibiótico e subseqüente separação de tecido de calo transformado. Os tecidos de calos foram separados de acordo com sua produção de anticorpo através de ensaios imunológicos (Dotblot e ELISA) e o melhor candidato foi usado para estabelecimento de cultura em suspensão ( = linhagem de células MTED#18). A específica produção de anticorpo M12 da cultura MTED#18 parente foi de 13 pg/g de peso de célula nova (10 mg/L). Análise citométrica de fluxo revelou que a cultura transgênica consiste em duas sub-populações com somente 24% da população viável produzindo a proteína marcadora fluorescente DsRed.

[0065]Para preparação de protoplasto a cultura de células em suspensão foi sub-cultivada através de transferência de 2% (v/v) em 50 mL de meio novo.

B. Preparação de protoplasto e regeneração de parede de célula [0066]Ver exemplo 1, seção C.

[0067]Usualmente o procedimento descrito resultou em 5x10⁵ protoplastos por mL com uma porcentagem média de 62,2 de protoplastos transgênicos viáveis.

C. Análise citométrica de fluxo e seleção [0068]As fixações de instrumento e pré-arranjos foram feitos como descrito no exemplo 1, seção D.

[0069]Protoplastos de planta fortemente fluorescentes únicos foram obtidos como descrito no exemplo 1, seção D.

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26/28 [0070]Protoplastos de planta fortemente fluorescentes únicos (1-2% de todos os protoplastos classificados) foram classificados em dispositivo de deposição de célula (isto é, placas de micro-titulação) em modo de célula único. Um protoplasto por cavidade, consistente com o segundo critério gated, foi classificado em placas de 96 cavidades enchidas com 50 microlitros de meio de regeneração 8p2c estéril contendo aproximadamente 100 protoplastos tipo selvagem como alimentadores. As placas de 96 cavidades foram fechadas usando uma tampa estéril e seladas por uma fita adesiva. O real número de protoplastos recuperados foi determinado por microscopia de fluorescência inversa. A classificação citométrica de fluxo de protoplastos em modo de célula único resultou em uma eficiência de revestimento de aproximadamente 20% de cavidades contendo um protoplasto intacto e viável por cavidade.

D. Regeneração de protoplastos classificados em baixas densidades [0071]A regeneração de protoplastos classificados únicos foi realizada como descrito em exemplo 1, seção E.

[0072]A classificação citométrica de fluxo de protoplastos altamente fluorescentes no modo de célula único resultou em aproximadamente 20% das cavidades contendo somente um protoplasto classificado. 50% destes protoplastos únicos iniciaram proliferação e podem ser usados para estabelecer culturas em suspensão.

E. Análises de culturas transgênicas monoclonais em suspensão [0073]Para determinar a porcentagem de protoplastos fluorescentes em culturas em suspensão aperfeiçoadas derivadas de um protoplasto único uma análise citométrica de fluxo foi realizada como descrito antes (experimento 1, seção D). Os níveis de acumulação de anticorpo M12 foram determinados através de um ensaio imuno adsorvente ligado a enzima (ELISA). Por isso, as células em suspensão foram centrifugadas (850 g, 5 minutos), re-suspensas em 3 volumes de tampão de extração (PBS, pH 6, 2-mercapto etanol 5 mM, EDTA 5 mM, ácido ascórbico 10 mM)

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27/28 e interrompida por sonificação. O extrato foi separado de debris de células através de uma etapa de centrifugação (20 minutos, 16 000 g) e usado para análises. Devido à montagem escolhida (captura Fc e detecção LC) somente anticorpos inteiramente montados foram detectados.

[0074]Após uma rodada FACS as culturas monoclonais em suspensão mostraram níveis de acumulação significantemente aperfeiçoados para ambas as proteínas recombinantes: 3,7-vezes porcentagem enriquecida do anticorpo M12 (145 pg/g peso fresco ou 9,3 vezes em nível mg/L (93 mg/L) quando comparado à cultura em suspensão parente.

F. Repetição de aperfeiçoamento em cultura em suspensão [0075]De modo à ainda aumentar e estabilizar a produtividade de proteína recombinante de culturas monoclonais transgênicas em suspensão, etapas B-E podem ser repetidas. As mesmas condições para classificação de geração de protoplasto e regeneração como antes foram aplicadas.

[0076]A segunda rodada de classificação resultou ainda em aumento de acumulação de anticorpo: 182 pg/g de peso fresco ou 113 mg/L, que é 14 vezes e 11,3 vezes de aumento comparado à cultura parente.

[0077]Uma terceira rodada de classificação dos melhores produtores de 2^ageração de monoclonais resultou em 3^a geração de culturas monoclonais produzindo similares níveis de acumulação indicando que o nível máximo foi obtido.

G. Estabilidade de culturas monoclonais produzindo elite em termos de produtividade de proteína alvo [0078]A estabilidade de linhas de células monoclonais derivadas de FACS foi exemplarmente investigada para 3 linhas monoclonais. Linhas de células monoclonais foram sub-cultivadas em um ciclo de 7 dias (referir-se a exemplo 1, seção A) enquanto ambas as proteínas alvos recombinantes foram medidas em intervalos de 2 meses sempre no dia 5 após sub-cultura. Sobre um período de 12 meses foi de

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28/28 monstrado para a 1^a geração de culturas monoclonais que estas culturas ainda produzem altas e estáveis quantidades do anticorpo M12 por grama de peso fresco. Somente leves variações de níveis de anticorpos em intervalos de amostragem bimensais (causadas por variações de cultura de células) foram observadas.

[0079]Análises da 2^a geração de monoclonais verificaram estabilidade de linhagem de células mostrando níveis de acumulação similares ou levemente aumentados de ambas as proteínas recombinantes anticorpo M12 e DsRed comparada à cultura monoclonal de 1^a geração da qual foram derivadas. No total as culturas monoclonais analisadas da 2^a geração parecem mais estáveis em termos de produção de proteína alvo (menos variações em intervalos de amostragem de 2 meses) comparadas às culturas monoclonais de 1^a geração. Durante um período de 12 meses duas das três culturas monoclonais analisadas foram verificadas serem altamente estáveis com relação a sua porcentagem de células fluorescentes DsRed no população total assim como acumulação de anticorpo M12.

Claims

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REIVINDICAÇÕES

1. Método para a geração de uma linhagem de células de planta monoclonal a partir de uma população heterogênea de células de planta, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

(a) prover uma população heterogênea de células de plantas;

(b) preparar protoplastos a partir da dita população heterogênea de células de planta e iniciar a regeneração da parede celular;

(c) prover um dispositivo de deposição de célula contendo material celular alimentador em um meio líquido;

(d) separar protoplastos únicos através da submissão da preparação de protoplastos à FACS;

(e) selecionar um protoplasto único no meio líquido do dito dispositivo de deposição de célula contendo material celular alimentador;

(f) regenerar um protoplasto único separado até a formação de uma microcolônia através de co-cultivo na presença do dito material celular alimentador;

(g) remover a micro-colônia do material celular alimentador e cultivar a micro-colônia até a formação de uma linhagem de células de planta monoclonal;

em que os protoplastos conforme preparados na etapa (b) são transformados e capazes de (i) produzir uma proteína ou um polipeptídeo marcador fluorescente e/ou (ii) sobreviver na presença de um agente de seleção.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende a regeneração da linhagem de célula de planta monoclonal conforme obtida na etapa (g) em plantas férteis integrais.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que os protoplastos conforme preparados na etapa (b) são transformados e capazes de produzir um produto desejado.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de

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2/2 que o produto desejado é selecionado do grupo consistindo em proteínas ou polipeptídeos heterólogos, metabólitos secundários e marcadores para propósitos diagnósticos ou analíticos.