KR101933552B1 - 단클론 식물세포주의 발생 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물세포의 이형 개체군으로부터 단클론 식물세포주를 발생시키는 방법을 제공하고, 이는 다음의 단계를 포함한다: (a) 식물세포의 이종 개체군 준비; (b) 상기 식물세포의 이종 개체군으로부터의 원형질체 준비; (c) 상기 준비된 원형질체에 유동 세포 계측 분류(flow cytometric sorting)를 적용함에 의한 단일 원형질체 분리; (d) 배양보조세포 재료의 존재하에서 공배양에 의해 마이크로콜로니(microcolony)가 형성되기 전까지 분리된 단일 형질전환된 원형질체의 재생; (e) 배양보조세포 재료로부터의 마이크로콜로니의 제거 및 단클론 식물세포주가 형성될 때까지의 마이크로콜로니의 배양의 단계.

Description

단클론 식물세포주의 발생 방법 {METHOD FOR THE GENERATION OF A MONOCLONAL PLANT CELL LINE}

본 발명은 식물 생명공학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 식물세포의 이종개체군으로부터의 유동 세포 계측 분류(flow cytometric sorting)를 통한 네이티브(native)(와일드 타입) 또는 형질전환(transgenic) 단클론 식물세포주의 발생에 관한 것이다. 숙련된 기술자에게 명백할 것처럼, 본 발명은 완전한 번식능력이 있는 식물의 재생을 위한 단클론 식물세포주의 사용 또한 포함한다.

지난 세월동안, 네이티브 또는 이종 단백질 및 이차 대사물의 축적 및 회수를 위한 식물 기반 시스템의 구축 및 배양을 위한 막대한 노력이 기울여져 왔다. 문헌은, 배양액으로 분비되거나 생산 세포, 조직, 세포기관 또는 심지어 완전한 식물 또는 이의 일부로부터 분리(isolate)되는 온갖 종류의 목적하는 물질을 생산하기 위한 식물 기반 시스템의 유용성을 증명하는 증거 자료를 대량으로 제공한다. 마찬가지로, 안정적으로 혹은 일시적으로 형질변화된 식물 재료의 구축을 보장하는 광범위한 형질전환 프로토콜이 존재한다. 그러나, 여전히 식물세포로부터 고수율의 목적하는 생산물을 얻기 위한 신뢰할 수 있는, 상대적으로 비용-효율적이고 신속한 기술이 필요하다.

식물 현탁 배양과 같은 식물세포 개체군의 형질전환은, 초기 이종 세포 개체군 내의 후생적으로 상이한 세포들의 혼합물과 관련한 고도로 이종의(혼합된) 그리고 불규칙한 타겟 단백질 발현 레벨을 갖는 세포를 나타내는 형질전환 배양을 종종 야기한다는 것이 반복적으로 보고되었다. 재조합 세포주 내에서 이식유전자 발현에서의 이질성은 생산 속도의 관점에서 심각한 문제를 나타낸다.

주된 문제는, 고생산 클론들은 종종 형질전환 분석에 있어서 드문 성과이며, 동종의 고생산 세포주를 구축하기 위해서는 시간이 매우 많이 걸린다는 점이다. 따라서, 여전히 진행중인 기술적 도전은 선발된 형질전환 성과 생산 및 갓 형질전환된 또는 이미 형질전환된 식물 배양으로부터의 회복이다.

예를 들면 FACS 응용과 같은 유동 세포 계측 분류를 위해서, 단일 구형 세포는 일반적으로 응집된 식물세포 개체군 또는 원형질체를 유리시키기 위한 세포의 효소 소화에 의한 배양으로부터 얻어져야 한다. 그러나, 대부분의 식물 종들에 대하여, 단일 원형질체의 재생은 일정 개체군 밀도로 유지되어야 할 필요에 의하여 방해된다.

단일 형질전환 세포/원형질체의 재생 또는 그로부터의 완전한 번식능력이 있는 식물의 재생(특히 유동 세포 계측 분류 이후)을 위한 신뢰할 수 있고 재현가능한 과정은 지금까지 개시되지 않았다.

본 발명은 따라서, 주로, 현탁 배양과 같은 식물세포의 이종(혼합된) 개체군으로부터 발생된, 형질전환되지 않은 또는 형질전환 단클론 식물세포주를 이용하는, 높은 레벨의 목적하는 네이티브 또는 재조합 생산물을 생산하기 위한 식물 기반의 시스템의 제공에 관한 것이고; 특히 신속한 분리 및 그 이후의, 바람직하게는 많은 양의 목적하는 생산물을 생산 및 축적할 수 있는 단클론 식물세포주를 구축하기 위해 사용될 수 있는, 마이크로콜로니(microcolony) 형성 전까지의 단일 (형질변환) 원형질체의 재생에 관한 선행기술의 문제점을 극복한다. 본 발명은 또한 구축된 단클론 식물세포주로부터 재생된 완전한 번식능력이 있는 식물을 제공할 수 있게 한다는 것은, 숙련된 기술자에게 명백하다.

변형되지 않은 식물 또는 적어도 변형되지 않았고 분화된 식물 세포의 사용에 기반한 현재 사용되고 있는 그리고 개발된 많은 시스템들에 대비하여, 현탁 세포의 사용은 동종의 재료가 조절된, 무균의 밀폐된 조건 하에서 재현적으로 생산될 수 있다는 장점이 있다.

현재는 식물에서 재조합 단백질을 생산하기 위한 두 개의 주된 전략이 있고, 이는 즉, (ⅰ) 안정된 형질전환 식물 또는 현탁 세포주의 발생, 또는 (ⅱ) 식물 발현 호스트(식물, 조직 또는 세포)를 호스트가 이종의 유전적 정보(DNA 또는 RNA)를 발현할 수 있게 하기 위하여 박테리아(예를 들어, 아그로박테리움(Agrobacterium)), 바이러스(예를 들어, 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus), 감자바이러스(Potato virus) X/Y, 동부 모자이크 바이러스(Cowpea mosaic virus) 및 기타 다수), 또는 이 둘 모두의 조합(예를 들어, 매그니펙션(magnifection))으로 감염시킨 다음의 이종 유전자(들)의 일시적인 발현이다. 대체적으로 그리고 당해 분야에 공지된 바와 같이, 유전 정보는 또한 예를 들어 전기 천공법(electroporation) 또는 레이저 천공(laser perforation)과 같은 입증된 기계적 방법에 의해 식물 발현 호스트에 도입될 수 있다.

비록 본 발명은 바람직하게는 안정적으로 형질전환된 식물세포 재료, 속도의 이점(유전자에서 생산물, 시장 대응 시간, 비상 대응)을 갖는 일시적인 발현을 위한 시스템의 사용에 관한 것이고, 또한 안정적으로 형질전환된 형질전환 식물 또는 세포와 같은 이의 부분에서 전형적으로 얻을 수 있는 것들보다 훨씬 높은 축적 레벨을 달성 할 수 있는 가능성도 본 발명에 따른 방법에 포함될 수 있다.

본 발명에 따르면, 식물세포의 이종 개체군으로부터의 네이티브(와일드 타입, 형질전환되지 않은) 또는 형질전환 단클론 식물세포주의 발생 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 방법에 포함되는 이후의 단계의 대상인 예를 들어 원천(source) 식물세포 재료를 형성하는 식물 현탁 세포와 같은 상기 식물세포 개체군을 먼저 제공하는 것을 포함한다. 일반적으로, 상기 식물세포 재료는, 예를 들어 바람직하게는 제어된 및/또는 무균 상태에서 배양된 이종 식물 현탁 배양으로부터 쉽게 얻을 수 있다. 상기 원천 세포는 목적하는 생산물을 생산하고 축적할 수 있는 (안정적으로/일시적으로) 형질전환된 형질전환 세포 또는 와일드 타입(네이티브, 형질전환되지 않은) 세포일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 방법이 단일, 즉 독립된 원형질체를 분리(seperation or isolation)시키기 위하여 예를 들어 FACS 기술과 같은 유동 세포 계측 분류를 사용하기 때문에, 이들은 당해 분야에 공지된 재료 및 방법을 사용하여 상기 제공된 바와 같은 식물세포 개체군으로부터 준비되어야 한다. 바람직한 실시예에 따르면, 이들 원형질체는 형질변환되고, (ⅰ) 형광 마커 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하거나, (ⅱ) 목적하는 생산물을 생산하거나, 및/또는 (ⅲ) 선택 시약의 존재하에 생존할 수 있는 것이다. 유동 세포 계측 분류를 위한 바람직한 분류 기준은, 예를 들어 아폽토시스(apoptosis)와 같은 정성적 특성에 대한 마커로서의 세포 입도, 및 세포 크기이다. FACS를 위한 바람직한 분류 기준은, 유전적 배경(예를 들어 배수성, 이수성), 돌연변이 형질전환, 유전자 교환 생성물, 및 형광(예를 들어 자가 형광(엽록체, 대사물), 형광 단백질 또는 효소-매개 형광)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 선택 시약의 사용은 필수적이지 않다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 원형질체는 반드시 적절한 내성을 부여하는 핵산 시퀀스로 형질전환되어야 하는 것은 아니다.

예를 들어 FACS와 같은 유동 세포 계측 분류를 통한 단일 (형질전환된) 원형질체의 분리(seperation or isolation) 이후에, 각 단일 형질전환 원형질체는 배양보조세포 재료(feeder cell material)의 존재 하의 공배양에 의한 마이크로콜로니(마이크로캘러스(microcallus))의 형성 전까지 재생된다. 상기 식물 원천 근원은 제한되지 않지만, 마이크로콜로니 또는 마이크로캘러스의 형성 전까지 재생될 수 있는 잠재력을 갖는 원형질체의 계(lines), 변종(vareties) 및 종(species)으로 한정된다. 본 발명은 따라서 재생 프로토콜이 구축되었거나 장래에 제공될 모든 식물 변종 및 종에 대하여 적용 가능하다. 단클론 마이크로콜로니 또는 식물세포주의 완전한 번식능력이 있는 식물로의 추가적인 재생에 관한 본 발명에 따른 양상의 관점에서, 이러한 양상은 재생 프로토콜이 구축되었거나 장래에 제공될 모든 식물 변종 및 종에 대하여 실행 가능하다는 것이 이해되어야 한다.

이어서, 상기 마이크로콜로니는 배양보조세포 재료로부터 분리 또는 제거되고 단클론 식물세포주의 형성 전까지 배양된다.

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 방법을 포함하는 다음 단계는, (ⅰ) 마이크로콜로니 또는 마이크로캘러스를 고체 배양 배지에 옮기고 (ⅱ) 상기 마이크로콜로니 또는 마이크로캘러스를 적어도 하나의 선택 시약의 존재하에서 형질전환 캘러스 조직의 형성 전까지 배양하고, 상기 캘러스 조직을 액체 배양 배지로 옮김으로서 그로부터 형질전환 단클론 식물세포주가 구축될 수 있는, 단클론 캘러스 조직의 발생에 관한 것이다. 숙련된 기술자에 의해 이해될 것과 같이, 상기 마이크로콜로니는 예를 들어 클론 선택과 같은 기계적 방법에 의해서도 배양보조세포 재료로부터 제거 또는 분리될 수 있다. 이 경우, 선택 시약은 필요하지 않으며, 마이크로콜로니를 포함하는 세포들은 어떠한 선택 시약에 대해서도 내성을 나타낼 필요가 없다.

바람직한 실시예에 따르면, 식물세포의 이종 개체군을 포함하는 세포들은 네이티브(예를 들어 와일드 타입) 또는 비-형질전환 세포로서, 유동 세포 계측 분류가 가해질 때까지, 이들은 기능적 프로모터에 작동 가능하도록 연결된(operably linked) 적어도 하나의 이종 핵산 시퀀스를 포함하는 적어도 하나의 발현 백터로 안정적 또는 일시적으로 형질전환되고, 여기서 적어도 하나의 이종 핵산 시퀀스는 목적하는 생산물을 코딩한다. 다른 실시예에 따르면, 상기 적어도 하나의 발현 벡터는 기능적 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 적어도 두개의 이종 핵산 시퀀스를 포함하고, 여기서 적어도 두개의 이종 핵산 시퀀스는 형광 마커 단백질 또는 폴리펩타이드, 및 선택 시약에 대한 내성 또는 목적하는 생성물을 코딩한다. 만약 원한다면, 상기 세포들은, 본 발명에 따라 제공되는 형질전환 단클론 식물세포주에 축적되는 목적하는 생성물을 코딩하는 이종 핵산 시퀀스를 추가적으로 포함할 수 있다.

본원에 사용되는 "이종(heterologous)"라는 용어는 해당 유전자/뉴클레오타이드의 시퀀스가 유전 공학, 즉, 인간의 개입에 의해 식물 세포에 도입된 것을 의미한다. 뉴클레오타이드의 이종 시퀀스는 형성될 수 있는 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질을 위한 코딩 시퀀스를 포함할 수 있고, 예를 들어, 부분적으로 비-식물 단백질에 융합될 수 있는 식물 단백질로서, 이는 본 발명의 목적에 따라 혼성(hybrid) 식물:비식물 융합 단백질이라고 일컫어질 수 있다. 대체적으로, 융합 단백질은 비-식물 근원인 융합 파트너로 형성된 것일 수 있다. 이종 유전자는 내생의 상응하는 유전자, 즉, 일반적으로 동일하거나 유사한 기능을 나타내는 유전자로부터 대상 단백질의 발현을 증가시키거나, 삽입된 시퀀스가 내생적 유전자 또는 다른 시퀀스에 추가적인 것일 수 있다. 세포에 이종인 핵산은 배양된 세포 타입, 변종 또는 종에서 비-자연적으로 발생할 수 있다. 따라서, 상기 이종 핵산은, 식물 또는 예를 들어 인간, 양, 소, 말, 또는 돼지 종의 포유류 종과 같은 특정 타입의 생물의 코딩 시퀀스를 포함하거나 그로부터 유래될 수 있고, 담배(tobacco)로 부터 유래된 BY2 세포와 같은 배양된 세포의 맥락 내에 위치될 수 있다. 다른 가능성은, 핵산 시퀀스가 그것 또는 그 동족체가 자연적으로 발견되는 배양된 타겟 세포 내에 위치하는 것인데, 여기서 상기 핵산 시퀀스는 상기 세포 또는 그러한 타입의 세포 또는 식물의 종 또는 변종 내에서는 자연적으로 발생하지 않는 핵산에 연결되고/되거나 인접하고, 이는 발현의 조절을 위해 하나 이상의 프로모터 시퀀스와 같은 조절서열에 작동 가능하도록 연결되는 것과 같은 것이다. 더 나아가, 합성 (인공) 핵산 시퀀스도 마찬가지로 사용될 수 있다.

"벡터"는 그 중에서도, 자가 전달(transmission) 또는 가동이 가능할 수도 가능하지 않을 수도 있는, 더블 또는 싱글 스트랜드의 선형 또는 원형의, 원핵생물 또는 진핵생물 호스트를 형질 전환할 수 있고 염색체 외에 존재하는, 모든 플라스미드, 코스미드, 파지(phage), 또는 바이러스 벡터를 포함하는 것으로 정의된다(예를 들어 복제 개시점을 갖는 자가 복제 플라스미드). 특히 포함되는 것은, 자연적으로 또는 디자인에 의해, 방선균(actinomycete) 또는 관련 종들, 박테리아 및 진핵생물(예를 들어 고등 식물, 선류, 포유류, 효모 또는 곰팡이) 세포로부터 선택될 수 있는 두 개의 다른 호스트 생물에서 복제가 가능한 DNA 비히클을 의미하는 셔틀 벡터이다.

"발현 벡터"는 핵산이 미생물 또는 식물 세포와 같은 호스트 세포의 전사를 위해 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소에 작동 가능하도록 연결되고, 그 조절 하에 있는 벡터를 나타낸다. 상기 벡터는 복수의 호스트에서 작용하는 이작용성 발현 벡터일 수 있다. 지노믹(genomic) DNA 또는 서브지노믹(subgenomic) DNA의 경우, 이는 그 스스로의 프로모터 또는 다른 조절 요소를 함유할 수 있고, cDNA의 경우, 이는 호스트 세포 내 발현을 위한 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 조절 하에 있을 수 있다.

"프로모터"는 하류(즉, 더블 스트랜드 DNA의 센스 스트랜드의 3' 방향)에 작동 가능하도록 연결된 DNA의 전사가 그로부터 개시될 수 있는 뉴클레오타이드의 시퀀스이다.

"작동 가능하도록 연결된"의 의미는 동일 핵산 분자의 부분으로서 연결되어, 프로모터로부터 개시될 전사를 위해 적합하게 위치하고 배열되는 것이다.

프로모터에 대하여 적용된 "유도"라는 단어는 당해 분야의 숙련된 기술자에게 잘 이해된다. 본질적으로, 유도 프로모터의 조절 하의 발현은 적용된 자극에 대한 응답으로서의 "스위치 켜짐" 또는 증가이다. 자극의 성격은 프로모터에 따라 다양하다. 적절한 자극의 부재시에, 어떤 유도 프로모터들은 작은 또는 감지할 수 없는 레벨의 발현(또는 발현되지 않음)을 야기한다. 자극의 부재시에 다른 유도 프로모터들은 감지가능한 구성적 발현을 야기한다. 자극의 부재시에 발현의 레벨이 어떠하던 간에, 적절한 자극의 존재시에는 모든 유도 프로모터로부터의 발현이 증가된다.

본 발명은 또한 이들 모든 시퀀스의 변종의 사용 또한 포섭한다. 변종 단백질은 상기 언급된 시퀀스의 전체 또는 일부와 상동하거나 동일하다.

재조합 단백질의 발현을 위하여, 관심의 단백질의 유전적 정보를 포함하는 재조합 아그로박테리아(Agrobacteria) 또는 바이러스(벡터들)의 현탁액은 당해 분야에 공지된 방법으로 상기 언급된 식물 현탁 세포들에 적용된다. 상기 벡터는 식물 세포를 감염시켜 유전적 정보를 전달한다. 바람직하게는, 형질전환될 상기 식물 세포 재료는 오직 적은 양의 배지만 존재하는 고농도로 제공되어 벡터 현탁액은 적하 또는 분사 만에 의해서도 적용될 수 있다. 형질전환의 이 바람직한 실시예는 조작, 자동화, 억제, 업 스케일링(up-scaling) 및 폐기물 생성 및 제거의 측면에서 몇몇 실질적인 이점이 있다. 대체적으로, 입자 충격, 전기 천공법 등과 같은 공지의 기술이 당해 분야에 공지된 바와 같이 사용될 수 있다.

적합한 프로모터는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S(Cauliflower Mosaic Virus 35S; CaMV 35S)를 포함한다. 상기 프로모터는 발달 및/또는 조직-특이 발현의 조절 제어를 부여하는 하나 이상의 시퀀스 모티브 또는 요소를 포함하도록 선택될 수 있다.

이미 언급한 바와 같이, 생산되도록 목적될 수 있는 적어도 하나의 선택가능한 유전적 마커는 구성에 포함되거나, 항생제 또는 제초제(예를 들어 카나마이신, 히그로마이신, 포스피노트리신, 클로르설푸론, 메토트렉사트, 젠타마이신, 스펙티노마이신, 이미다졸리논 및 글리포세이트를 포함하지만 이에 제한되지 않음)에 대하여 내성이 있는 것과 같은 선택가능한 표현형을 부여하는 제2 구성으로 제공될 수 있다.

대체적으로, 원형질체의 준비에 사용된 상기 식물 현탁 세포는 또한 형질전환 세포를 포함하는 이미 형질전환된 이종 식물 현탁 배양으로부터 제공될 수 있다.

본 발명에 따라 구축된 상기 (형질전환) 단클론 식물세포주는, 재조합 단백질 또는 대사물의 생성을 위해, 벡터 현탁에 추가적으로 또는 대신에, 전구체, 유도체, 호르몬, 안정제 (예를 들어 친화성 용질), 억제제, RNAi/siRNA 분자, 시그널링 화합물, 효소 (예를 들어 펙티나아제), 및/또는 유출자(elicitor)의 존재 하에 처리 또는 배양될 수 있다.

바람직한 실시예에 따르면, 목적하는 생성물은 이종 단백질 또는 폴리펩타이드(예를 들어 혈액 생성물, 사이토카인, 성장 호르몬, 치료적/진단적/산업적 효소, 백신, 풀 사이즈(full-size) 항체 또는 다양한 항체 유도체), 이차 대사물(예를 들어 페닐프로파노이드, 알카로이드, 테르페노이드, 퀴논 또는 스테로이드) 및 기체, 고체 또는 액체 (화학) 화합물 및 물질의 진단 또는 분석을 위한 마커들로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

관심 유전자는, 그들 자체로 치료약 또는 수의 약품과 같은 천연 치료약인 단백질을 인코딩하는 것을 포함한다. 더 나아가, 관심 유전자는 또한 예를 들어 기술적 효소, 독소와 같은 여타의 재조합 단백질, 또는 새로운 작물 인풋 및 아웃풋 특성을 부여하는 재조합 단백질을 포함한다.

이종 핵산은, 그 중에서도 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 상기에서 암시된 바와 같은 융합 단백질 혹은 동물 근원과 같은 비-식물 근원의 유전자를 인코딩할 수 있다. 생성된 폴리펩타이드는 다른 곳에서의 사용을 위해 정제될 수 있는 폴리펩타이드를 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 공정에 의해 생성될 수 있는 단백질은, FSH, 면역글로불린, 융합 항체 및 단쇄 항체와 같은 헤테로다이머(heterodimer)를 포함한다. 더 나아가, 수정된 글리칸 구조와 같은 대체된 성질을 갖는 단백질을 생성하기 위하여 상기 유전자들은 대체될 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 자연에서는 존재하지 않는 인공적인 시퀀스와 같은 합성 유전자를 사용하는 것도 허용한다.

그러한 단백질은, 레티노블라스토마 단백질, p53, 앤지오스타틴, 및 렙틴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 마찬가지로, 본 발명의 상기 방법은 포유류 조절 단백질을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 관심의 시퀀스는 단백질, 난포자극 호르몬과 같은 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 세럼 알부민, 헤모글로빈, 콜라겐, 타우마틴, 타우마틴-유사 단백질, VEGF와 같은 표피성장인자, 등을 포함한다.

숙련된 기술자에게 이해될 것과 같이, 본 발명은 아주 다양한 단백질 및 폴리펩타이드를 생성할 수 있게 하는데, 이는 약제학적으로 적합한 (재조합) 단백질(예를 들어 백신, 항체, 치료적 효소, 알레르겐(allergen) 및 하이포알레르겐(hypoallergen), 향균 펩타이드, 생적합성 코팅 재료로 사용되는 엘라스틴 및 콜라겐과 같은 구조적 단백질, 바이러스-유사 파티클, 단백립, 등), 영양가 있는 (재조합) 단백질 (음식 및 사료 첨가제), 진단 응용을 위한 (재조합) 단백질 (예를 들어 효소, 항체 및 조작된(engineered) 항체, 다른 효소 또는 형광 융합 단백질, 양성 대조군으로 사용될 항원, 단백질 분석을 위한 바인딩 리간드), 기술적으로 적합한 (재조합) 단백질(예를 들어 친화력 흡착체를 위한 바인딩 리간드, 고가치 효소, 생촉매), 및 작물 인풋 또는 아웃풋 특성을 개선하는 재조합 단백질을 포함한다.

일반적으로, 이종 핵산은 당해 분야에서 사용되는 모든 적합한 공정에 의해 발현되거나 다음과 같이 전사 또는 발현될 수 있다:

(ⅰ) '그대로의' DNA(예를 들어 관심의 이종 시퀀스에 작동 가능하도록 연결된 프로모터를 포함하는)의 일시적인 발현,

(ⅱ) 복제 벡터와 같은 발현 벡터의 발현. 일반적으로, 당해 분야의 숙련된 기술자들은 일시적인 재조합 유전자 발현을 위한 벡터 설계 및 프로토콜 디자인을 잘할 수 있다. 적합한 벡터는, 프로모터 시퀀스, 터미네이터(terminator) 조각, 폴리아데닐레이션 시퀀스, 인헨서(enhancer) 시퀀스, 마커 유전자 및 다른 적절한 시퀀스를 포함하는 적절한 조절 시퀀스를 포함하여 선택 또는 설계될 수 있다. 보다 상세한 내용은 예를 들어, [분자 클로닝: 실험실 메뉴얼: 제2판, Bambrook 등, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 [분자 생물학의 현재 프로토콜, 제2판, Ausubel 등, eds., John Wiley & Sons, 1992]를 참조하라.

(ⅲ) 비-통합(non-integrating) 벡터로부터의 발현.

이들 카테고리는 상호 배타적인 것이 아니라고 이해될 것이며, 이는 예를 들어 비-통합 벡터는 또한 발현 벡터 등이 될 수 있기 때문이다.

숙련된 기술자에 의해 이해될 것과 같이, 형광 마커 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 형광 분자를 생성하는 효소, 및 관심의 이종 단백질(목적하는 생성물)을 코딩하기 위한 상기 적어도 두 이종 핵산 시퀀스는, (ⅰ) 같은 벡터 상의 단일 발현 카셋을 포함하는 다시스트론 배치, (ⅱ) 같은 벡터 상의 적어도 두 개의 다른 발현 카셋의 직렬배치, 또는 (ⅲ) 직렬 배치가 바람직한, 다른 벡터 상의 적어도 두 개의 다른 발현 카셋, 중의 하나로 제공될 수 있다.

더 나아간 측면에 따르면, 본 발명은 따라서 바람직하게는 이종 단백질 또는 폴리펩타이드, 이차 대사물 및 마커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 목적하는 생성물의 생성 방법을 제공한다. 상기 방법은, 이후에 얻어지는 또는 생성된 세포 또는 배양 배지로부터 분리(isolation)되는 적어도 하나의 목적하는 생성물을 생성 및 축적하기 위하여, 본 발명에 따라 구축된 (형질전환) 단클론 식물 세포주를 사용하는 것을 포함한다.

따라서, 본 발명의 한 측면에서, 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 타겟 뉴클레오타이드 시퀀스를 포함하는 도입된 핵산 구조로부터의 전사에 의하여 발생된 이종 타겟 단백질과 같은 목적하는 생성물을 인코딩하는 mRNA를 추가적으로 발생시킬 수 있는 바람직하게 안정적으로 형질전환된 단클론 식물세포주의 사용을 개시하고 있다.

상기 "도입된 핵산"은 따라서, 목적하는 생성물의 생산 및 축적을 야기할 수 있는 구조의 형태로 제공되는 DNA 시퀀스로서 이종 핵산 시퀀스를 포함할 것이다.

따라서 본 발명의 바람직한 측면에서, 단클론 식물세포주에서 이종 뉴클레오타이드 시퀀스의 안정적인 발현을 달성하기 위한 방법을 개시하였고, 상기 방법은 적어도 목적하는 생성물을 코딩하는 이종 뉴클레오타이드 시퀀스를 포함하는 제1 핵산 시퀀스를 타겟 세포에 안정적으로 도입하는 단계를 포함한다.

한 실시예에서, 적어도 하나의 세포외 이종 단백질을 발생시키는 방법을 제공하였고, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다:

(ⅰ) 이종 단백질 또는 목적하는 생성물을 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스를 포함하는 제1 핵산을, 식물 세포의 개시 개체군을 포함하는 타겟 세포에 안정적으로 도입하는 단계;

(ⅱ) 상기 식물 현탁 배양으로부터 제공된 식물 현탁 세포 원형질체를 준비하는 단계로, 여기서 상기 원형질체는 추가적으로 형질전환되고 (ⅰ)형광 마커 단백질 또는 폴리펩타이드를 생성할 수 있고 (ⅱ) 선택 시약의 존재하에 생존할 수 있는, 단계;

(ⅲ) 상기 준비된 원형질체를 FACS에 적용함으로서 단일 형질전환된 원형질체를 분리하는 단계;

(ⅳ) 배양보조세포 재료의 존재하에서의 공배양에 의한 마이크로콜로니 또는 마이크로캘러스의 형성 전까지 분리된 단일 형질전환된 원형질체를 재생하는 단계;

(ⅴ) (ⅰ) 상기 마이크로콜로니 또는 마이크로캘러스를 고체 배양 배지에 옮기고, (ⅱ) 형질전환 캘러스 조직의 형성까지 적어도 하나의 선택 시약의 존재 하에서 마이크로콜로니 또는 마이크로캘러스를 배양함으로써, 단클론 캘러스 조직을 발생시키는 단계;

(ⅵ) 상기 캘러스 조직을 액체 배양 배지에 옮김으로써 형질전환 단클론 식물세포주를 구축하는 단계; 및

(ⅶ) 적절한 배양 조건을 제공함으로써, 이종 단백질 또는 목적하는 생성물의 핵산으로부터의 발현을 야기하거나 허용하는 단계, 및

(ⅷ) 생성되는 세포로부터 축적된 이종 단백질 또는 목적하는 생성물을 회수하는 단계.

상기 분리(isolation)는 전적으로 통상적인 방법에 의한 것일 수도 있고, 부분적 또는 완전한 정제를 수반하거나 수반하지 않을 수 있다.

당연히, 당해 분야의 숙련된 기술자는, 하나 이상의 유전자가 상기, 또는 각 구성에 사용될 수 있다는 이해할 것이다. 복수의 벡터(각각이 선택된 이종의 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 시퀀스를 포함하는)는 본원 또는 다른 곳에서 개시된 타겟 세포 내로 도입될 수 있다. 이는 예를 들어 효소의 예를 들어 복수의 서브유닛을 생산하는데에 유용할 수 있다.

상기 형광 마커 단백질 또는 원형질체는, GUS와 같은 형광, GFP 또는 DSRed, 루시퍼라아제 등과 같은 형광 단백질에 의해 검출 가능한 모든 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 리포터는 DsRed 또는 GFP와 같은 비-비침습성 마커이다.

더 나아간 측면에 따르면, 본 발명은 세포 분류에 의한 보다 강한 발현 삽입 위치의 확인을 위한 방법을 제공하는데, 이는 예를 들어 형광 단백질 1을 포함하는 구성으로 세포를 형질전환하는(예를 들어 이하의 실시예 1B에 설명된 바와 같은) 단계, 및 마이크로클로니 및 현탁 배양으로의 재생 및 예를 들어 형광 단백질 2로의 유전자 교환을 포함하는 FACS에 의한 단일 고 형광 단백질 1을 생산하는 세포의 확인 및 분리 단계, 드문 유전자 교환 생산물의 확인 및 분리 단계를 포함한다.

본 발명은 이하의 비-제한적인 도면 및 실시예를 참조하여 더 설명될 것이다. 다른 실시예들은 이에 비추어 당해 분야의 숙련된 기술자들에 의하여 이루어질 것이다.

도 1은 본원에 설명된 형질전환 MTED BY-2 라인(line)의 준비를 위하여 사용된 발현 카셋의 구조를 나타내는 도시이다. 특히, 상기 도면은 BY-2 현탁 세포의 형질전환에 사용된 pTRAkc::MTED 식물 발현 벡터의 T-DNA를 나타낸다.
LB 및 RB: T-DNA의 좌측 및 우측 경계; Pnos 및 pAnos: 노파린합성효소 유전자의 프로모터 및 터미네이터; nptⅡ: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자의 코딩 시퀀스; SAR: 뼈대 부착 영역; P35SS 및 pA35S: 콜리플라워 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus; CaMV) 35S 유전자의 복제된 인헨서 및 터미네이터를 갖는 프로모터; CHS: 파슬리(Petroselinum crispum)로부터의 칼콘합성효소의 5'-UTR; SP: 신호 펩타이드; HC 및 LC: M12 항체의 중쇄 및 경쇄의 코딩 시퀀스; TL: 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus; TEV)의 5'-UTR; TP: 변화 펩타이드; DsRed: Discosoma spec .으로부터의 적색 형광 단백질에 대한 코딩 시퀀스.

실시예

실시예 1

형질전환 이후의 선택-생성하는 단클론 세포주의 신속한 발생

A. 담배( tobacco ) 세포 배양

Nicotiana tabacum cv. 밝은 황색 2(BY-2)의 와일드 타입 현탁 배양은, 180 rpm의 지속적인 궤도 교반을 수반하여, 26℃에서 100 ml 유리 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask) 내의 50 ml 샘플로 무균 조건 하에서 암흑속에 유지되었다. 배양 배지는 수크로오스(3%, w/v) 및 1 mg/l 2,4-디클로로페녹시아세트산으로 보충된 기초 MSMO 배지 (pH 5.8)을 포함한다. 계대 배양(subculture)은 7일 간격으로 50 ml의 신선한 배지로 세포를 5% (v/v) 옮김으로써 이루어졌다.

원형질체 준비를 위하여, 상기 현탁 세포 배양을 50 ml의 신선한 배지로 2% (v/v) 옮겨 개대 배양이 이루어졌다.

B. 뒤이은 분류를 위한 형질변환의 가속된 발생

BY-2 와일드 타입 현탁 세포는 섹션 A에 설명된 바와 같이 배양되었다. 동시에 같은 벡터 상의 몇몇 발현 카셋을 포함하는 구조를 포함하는 형질전환 Agrobacterium tumefaciens는(도 1 참조), 27℃ 및 160 rpm으로 궤도 교반기에서 적절한 항생제(0.5% 영양액, 0.1% 이스트 추출물, 0.5% 펩톤, 0.5% 수크로오스, 2 mM MgSO₄, pH 7.4)를 포함하는 YEB 배지에서 OD_600nm이 1이 될 때까지 배양되었다. 계대 배양 3일 후, 3 ml BY-2 와일드 타입 세포, 200 nM 아세토시린곤 및 150 μl 아그로박테리아(OD_600nm = 1)는 암흑에서 페트리접시에서 공배양되었다. 상온에서의 3일간의 공배양 이후, BY-2 세포는 200 mg/l 세포탁심으로 보충된 10 ml의 BY-2 배지에 재현탁되었다. 상기 세포들은 50 ml 무균 튜브에 옮겨지고 아그로박테리아를 제거하기 위하여 원심분리(850 g, 5분)에 의해 2회 세척되었다. 세포 펠릿(pellet)의 재현탁 이후, 형질전환된 BY-2 세포의 배양은 세포탁심 및 적절한 선택 시약에 의하여 보충된 20-50 ml BY-2 배지를 사용하여 100 ml 셰이크 플라스크에서 이루어진다(180 rpm, 26℃). 적절한 현탁의 재생 이후(침적 세포 체적 약 50-60%), 상기 세포들은 원형질체 준비를 위하여 계대 배양 될 수 있다(섹션 C 참조). 이러한 방법은 이후의 원형질체 발생(C) 및 유동 세포 계측 분류(D)에 사용될 수 있는 형질전환 현탁 배양을 구축하는 데에 14 내지 21일을 요한다.

C. 원형질체 준비 및 세포벽 재생

활발하게 성장하는 세포 배양은, 무균의 원뿔형 원심분리 튜브에서 850 g에서 5분 동안의 원심분리에의 한 세포 퇴적물의 계대 배양으로부터 3일 후에 사용되었다. 상청액은 제거되었고, 세포들은 1% (w/v) 셀룰라아제 및 0.3% (w/v) 마세로자임(macerozyme)을 포함하는 10 ml의 PNT 분해액(3.6 g/l Kao Michayluk 기초 염(Duchefa), 0.4 M 수크로오스, 0.5 mg/l NAA, 1 mg/l BAP) 내에 재현탁 되었다. 상기 세포-효소 현탁액 6 cm 페트리접시에 놓아져 접착 태이프로 밀봉되었다. 분해는 온화한 교반을 수반하여 암흑에서 26℃로 오버나이트(16-18 시간)로 수행되었다. 원형질체는 100-μm 나일론 메쉬(mesh)를 통해 걸러지고 이어서 원심분리(8분 동안 104 g)동안에 표면으로 띄워졌다. 펠릿 및 상기 배지 계면은 제거되고, 원형질체는 PNT 용액으로 2회 세척되었다. 원형질체는 W5 용액 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl₂, 5 mM KCl, 5 mM 글루코오스, pH 5.6)에 재현탁되고 및 76 g에서 2분 동안의 원심분리에 의해 퇴적되었다. 원형질체는, 온화한 재현탁 이후에, 수정된 재생 배지 8p2c(이하의 표 1 참조; 8p 배지로부터 최적화 됨)에서 배양되었다. 일반적으로 상기 설명된 공정은 평균 퍼센테이지 74%의 생존가능한 원형질체를 갖는 1 ml 당 7×10⁵ 원형질체를 도출한다.

원형질체는 세포벽 재생을 개시하기 위하여 26℃ 암흑에서 3일 동안 재생되었다. 도출되는 원형질체는 100-μm 나일론 메쉬를 통해 다시 걸러지고 FAC 분류를 위해서 무균 샘플 도입 튜브로 옮겨졌다. 단일 원형질체는 비-형질전환 와일드타입 배양보조 원형질체 또는 세포를 포함하는 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰로 분류되었다(섹션 D 참조).

배양보조 원형질체로서 사용된 BY-2 와일드 타입 원형질체는 Fuchs-Rosenthal 계수판을 사용하여 약 2×10³ 세포 /ml 8p2c 배지로 조정되었다. 약 100 와일드 타입 배양보조 원형질체들이 각 웰에 옮겨지도록, 이들 원형질체의 50 마이크로리터는 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰로 옮겨졌다.

표 1: 8 p2c 배지( pH 5.6)의 조성

- Kao und Michayluk 기초 염 혼합물 (Duchefa)

- Kao und Michayluk 비타민 용액 (Sigma)

0.02 mg/l p-아미노벤조산

2 mg/l L-아스코르브산

0.01 mg/l 비오틴

1 mg/l D-판토텐산 칼슘

1 mg/l 염화콜린

0.4 mg/l 엽산

100 mg/l 미오이노시톨

1 mg/l 니코틴아미드

1 mg/l 피리독신 HCl

0.2 mg/l 리보플라빈

1 mg/l 티아민 HCl

0.01 mg/l 비타민 A

0.02 mg/l 비타민 B12

0.01 mg/l 비타민 D

- 유기산 (pH 5.5, NH₄OH와 함께)

20 mg/l 피루브산 나트륨

40 mg/l 말산

40 mg/l 구연산

40 mg/l 푸마르산

- 당 및 당알코올

0.25 g/l 수크로오스

250 mg/l 만노오스

68.4 g/l 글루코오스

250 mg/l 람노오스

250 mg/l 프록토오스

250 mg/l 셀로비오스

250 mg/l 리보오스

250 mg/l 솔비톨

250 mg/l 자일로오스

250 mg/l 만니톨

- 호르몬

0.2 mg/l 2.4-D

0.5 mg/l 제아틴

1.0 mg/l NAA

-2% (v/v) 코코넛 워터

-500 mg/l 카사미노산

D. 유동 세포 계측 분석 및 분류

488 nm/ 635 nm 아르곤 이온 레이저를 갖는 FACS Vantage (DIVA 옵션, BD 바이오사이언스) 기기는 형질전환 식물 원형질체를 분류하기 위하여 사용되었다. 인산 완충 식염수(PBS pH 7.4)인 시스 용액(sheath fluid)은 오토클레이브 및 0.22 μm 필터에 통과시킴으로써 멸균되었다. 분류에 앞서 샘플 튜브들은 멸균된 시스 용액의 통과에 의해 잔여 에탄올이 제거되었다. 세포주산 시스템/ 분류 세팅은 시판의 표준 자가형광 측정 입자를 사용하여 조정되었다. 상기 유동 분류기는 488 nm에서 레이저 아웃풋 175 mW으로 작동되었다. 분류에 앞서 전자 분류 창은, 강력한 형광 개체군을 정의하기 위하여, 원형질체 배양 샘플의 전방 광 산란, 측면 광 산란 및 형광에 대하여 수집된 시그널에 기초하여 위치되었다. 상기 시그널들은 DIVA 소프트웨어(BD 바이오사이언스)를 사용하여 점 도면으로 나타내어졌다. 분류 영역은, 첫째, 생존가능한 원형질체의 개체군 주변에, 그리고 둘째 ,첫번째 게이트에 기초하여, 강력한 형광 원형질체 개체군 주변에 게이트를 만듦으로서 정의되었다. 분류는 4-6 psi의 시스템 시스 압력, 약 7 kHz의 적하 빈도 및 약 1.000 이벤트/초의 샘플 플로우 속도로 200-μm 플로우 팁(flow tip)을 통해 이루어졌다.

상기 설명된 분류 파라미터를 사용하여 20%의 콜로니형성률(plating efficiency)(즉 웰의 20%가 온전하고 생존가능한 단일 분류된 원형질체를 포함하였음)이 달성되었다.

E. 보육( nurse )/배양보조 원형질체와의 공배양에 의한 단일 분류된 원형질체의 재생

강력한 형광 단일 원형질체의 분류에 앞서, 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰은 배양보조세포로서 약 100 N. tabacum cv. BY-2 와일드 타입 원형질체를 포함하는 50 μl의 무균 8p2c 재생 배지로 채워졌다. 상기 단일 분류된 형질전환 원형질체들은, 분류 공정 후의 단일 세포 축적을 확인하기 위하여, 그리고 또한 형질전환 원형질체의 증식 및 마이크로콜로니 형성(분류로부터 14-20일 후)을 모니터하기 위해서, 상이한 시점에 역 형광 현미경으로 분석되었다. 96-웰 플레이트 내에서의 분류된 원형질체의 상기 배양은 암흑에서 26℃ 내지 27℃에서 이루어졌고, 상기 플레이트는 무균 뚜껑으로 덮여 접착 테이프로 밀봉되었다.

그런 다음 형질전환된 마이크로콜로니는, 항생제 선택 마커(예를 들어 카나마이신)을 포함하는 고체 재생 배지(0/8%(w/v) 한천)로 옮겨졌다. 따라서, 웰 내에 존재하는 배양보조세포를 포함하는 상기 마이크로캘러스 조직은 피페팅에 의해 온화하게 재현탁되고 넓은 팁 끝을 갖는 피펫을 사용하여 옮겨졌다. 이어서, 상기 웰 및 또한 상기 고체 재생 배지에 옮겨진 마이크로캘리(microcalli)는 형질전환 및 형광 마이크로콜로니의 성공적인 이전을 확인하기 위하여 역 형광 현미경으로 분석되었다. 상기 이전에 있어서, 형질전환 마이크로캘리는 14-20일간 성장되어 선택 마커를 포함하는 고체 재생 배지를 포함하는 신선한 플레이트로 옮겨졌다. 지름 약 2 cm 크기인 캘러스 조직이, 50 ml 플라스틱 조직 배양 플라스크 내의 5 ml 배양 배지(섹션 A에 설명된 것)로의 세포 재료의 이전에 의해 현탁 배양을 구축하기 위하여 사용되었다. 이들 플라스크는 상기 세포 현탁이 100 ml 유리 삼각 플라스크로의 이전을 위한 50-60% 침적 세포 용적으로 성장할 때까지 섹션 A에 설명된 바와 같이 배양되었다. 상기 형질전환 단클론 현탁 배양의 배양은 세션 A에 설명된 바와 같이 수행되었다.

상기 배양보조 세포 전략은 당초의 분류된 완전하고 생존할 수 있는 단일 원형질체의 약 50%의 재생을 가능하게 한다(즉, 96-웰 마이크로티터 플레이트의 웰로 분류된 약 10%의 단일 원형질체가 마이크로캘리로 발달하였다).

F. 분류된 단일 원형질체의 재생 동안의 생존 배양보조세포의 성공적인 제거의 확인

단일 FACS에 의해 선택된 원형질체의 단클론 현탁 배양으로의 신뢰할 수 있는 재생이 가능하게 하는 공정이 개발되었다. 단일 원형질체는 분류 이후에 재생되어야 하므로, 배양보조 세포는 분류된 단일 원형질체의 재생 및 증식을 보조할 것이 요구된다. 상기 배양보조 원형질체는 분류된 형광 타겟 원형질체와 일시적으로 공배양 되므로, 상기 단클론 배양의 재생 동안에 생존한 배양보조 원형질체를 배제하는 것이 필수적이다.

단일 분류된 원형질체 및 형광 BY-2 세포의 배양보조 원형질체에 의한 잠재적인 감염이 조사되었다. 형질전환 세포는 GFP-KDEL 발현 카세트 및 AHAS 선택 마커(이마제타피르 내성을 부여하는)를 포함하는 구조로 형질전환 되었다. 상기 구조로 형질전환되고 GFP를 생산하는 단일 BY-2 원형질체는 DsRed 발현 카세트 및 nptⅡ 선택 마커(카나마이신 내성을 부여하는)를 포함하는 형질전환 세포주의 원형질체를 포함하는 96-웰 플레이트로 분류되었다. 두번째 실험에서, DsRed 발현 카세트 및 nptⅡ 선택 마커로 형질전환 된 단일 BY-2 원형질체는 GFP를 생산하는 형질전환 세포주의 원형질체를 포함하는 96-웰 플레이트로 분류되었다. 재생 이후, 도출된 GFP 및 DsRed 형광 배양은 그들의 이마제타피르 또는 카나미이신에 대한 내성 및 그들의 형광(녹색 대 적색)에 대하여 분석되었다. 두 시도 모두로부터의 캘러스 조직은 1.5 μM 이마제타피르 또는 100 mg/L 카나마이신을 포함하는 선택 배지에 배양되었다. 세포 성장은 14일의 인큐베이션 후에 시각적으로 평가되었다. 시험된 모든 캘리(총 20)가 그들의 특수한 선택 시약을 포함하는 배지 플레이트에서 현저하게 성장하였다. 요약하자면, GFP/AHAS 형질전환된 캘리는 이마제타피르를 포함하는 플레이트에서는 성장하였지만 카나마이신을 포함하는 포함하는 플레이트에서는 자라지 않았고, 반면 DsRed/카나마이신 형질전환된 캘리는 카나마이신 플레이트에서만 성장하였다. 이러한 관찰은 재생된 형질전환 세포주는 각각의 배양보조 세포주로 감염되지 않았다는 것을 명확히 나타낸다. 배양보조 세포에 의한 잠재적인 감염은 추가적으로 유동세포 계측 분석에 의하여 평가되었다. 재생된 GFP 및 DsRed 현탁 배양은 각각 형광 단백질 GFP 또는 DsRed에 의하여 유발된 광학적 성질에 대하여 분석되었다. 이러한 관찰은 재생된 형질전환 세포주가 각각의 배양보조 세포주에 의하여 감염되지 않았다는 것을 명확하게 나타낸다. 모든 시험된 BY-2 배양은 예측된 형광 패턴을 배타적으로 나타내었다. GFP 형질전환된 세포의 분류 이후에 구축된 배양은 녹색 형광만을 나타내었고, DsRed를 생산하는 배양은 적색 형광 채널에서만 배타적으로 측정되었다. 배양보조 세포에 의한 감염의 경우에는 두 채널 모두에서의 형광 시그널이 예상되었다. 세포주측 분석의 결과는, 내성 테스트에 의하여 이전에 나타내어진 바와 같이, 선택 플레이트 상에서의 배양보조 세포의 효과적인 제거를 확인하였다.

G. 단클론 형질전환 현탁 배양의 분석

상기 단클론 현탁 배양은 먼저 그들의 강력한 형광 세포의 퍼센테이지에 관하여 분석되었다. 따라서, 원형질체는 섹션 C에 설명된 바와 같이 준비되었다. 형광 원형질체의 비율의 유동 세포 계측 확인을 위하여 FACS 칼리버 기기(Calibur Instrument)(BD 바이오사이언스)가 사용되었다. BY-2 와일드 타입 원형질체에 기초하여 세팅 파라미터(예를 들어 빛의 증폭 및 형광 산란 배가기(multiplier))가 조절되고 상기 샘플들이 측정되었다. 생존가능한 개체군을 제어(gating)한 후, 형광 채널 내 이들 개체군의 분포가 한계값을 설정하기 위하여 사용되었고, 이는 와일드 타입 자가 형광에 의해 야기된 모든 백그라운드 시그널을 배제하였다. 상기 한계값에 따라 단일 원형질체로부터 유래하는 개선된 원형질체 배양 내의 형광 원형질체의 퍼센테이지가 계산되었다. 재조합 DsRed 단백질을 생산하는 단클론 현탁 배양의 유동세포 계측 분석은 유사하고 강력한 형광 세기의 동종의 분산된 세포를 나타내었다(좁은 형광 피크). DsRed 형광 세포 비율의 계산은 78-88% 사이 범위의 퍼센테이지의 강력한 형광 세포를 도출하였다.

재조합 단백질의 축적 레벨은 다른 공정에 의하여 확인 될 수 있다(예를 들어 효소 연결 면역 측정법(enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)). 따라서, 상기 세포들은 원심분리되고(850 g, 5분), 3 Vol. 추출 버퍼(PBS pH 6, 5 mM 2-머캅토에탄올, 5 mM EDTA, 10 mM 아스코르브산)에 재현탁되어 초음파처리에 의하여 분쇄되었다. 상기 추출물은 또 다른 원심분리 단계(20분, 16 000 g)에 의해 세포 추출물로부터 분리되어 분석을 위해 사용되었다. pTRAkc:MTED로 형질전환된 현탁 배양의 5 dpi 세포 추출물에서의 M12 항체 축적의 면역 분석은 118±20 μg/g 생중량(종래의 발생 방법 즉, 캘러스 발생 및 스크리닝을 사용한 경우보다 1.5배)까지로 나타났다.

실시예 2

이종 형질전환 현탁 배양으로부터의 단클론 세포주의 발생

A. 담배( tobacco ) 세포 배양

ER-지체 사람 완전히 성장한 IgG1 항체 M12 및 색소체 타겟된 형광 단백질 DsRed를 생성하는 형질전환 Nicotiana tabacum cv. 밝은 황색 2(BY-2) 현탁 배양 MTED#18는 180 rpm의 지속적인 궤도 교반을 수반하여 26℃에서 100 ml 유리 삼각 플라스크 내의 50 ml 표본으로 무균상태에서 암흑속에 유지되었다. BY-2 와일드 타입 세포는 대조군(control)으로서 동일한 조건 하에 배양되었다. 상기 배양 배지는 수크로오스 (3%, w/v) 및 1 mg/l 2,4-디클로로페녹시아세트산으로 보충된 pH 5.8의 기초 MSMO 배지를 포함한다. 계대 배양은 50 ml의 신선한 배지로 5% (v/v)의 세포를 옮김으로서 7일 간격으로 이루어졌다.

상기 형질전환 현탁 배양은, N. tabacum cv. BY-2 세포의 Agrobacterium-매개 형질전환과 뒤이은 항생제 기초의 선택 및 이후의 형질전환 된 캘러스 조직의 분리에 의해 발생한다. 상기 캘러스 조직은 그들의 항체 생산에 따라 면역 분석(점블럿(Dotblot) 및 ELISA)에 의해 스크리닝 되었고, 최상의 후보가 현탁 배양 구축을 위하여 사용되었다(=세포주 MTED#18). 모 MTED#18 배양의 특정 M12 항체 생산은 13 μg/g 생세포 중량(10 mg/L)이었다. 유동 세포 계측 분석은, 형질전환 배양은 오직 24%의 형광 마커 단백질 DsRed를 생산하는 생존가능한 개체군을 갖는 두개의 부분모집단으로 이루어진다는 것을 밝혀내었다.

원형질체 준비를 위하여 상기 현탁 세포 배양은 50 ml의 신선한 배지에 2% (v/v)를 이전함에 의하여 계대 배양 되었다.

B. 원형질체 준비 및 세포벽 재생

실시예 1, 섹션 C를 참조하라.

일반적으로 설명된 공정은 62.2 평균 퍼센테이지의 생존가능한 형질전환 원형질체를 갖는 1 ml 당 5×10⁵ 원형질체를 도출하였다.

C. 유동세포 계측 분석 및 분류

기기 설정 및 사전 조정은 실시예 1, 섹션 D에 설명된 바와 같이 이루어졌다.

단일 강력한 형광 식물 원형질체 (모든 분류된 원형질체의 1-2%)는 단일 세포 모드에서 세포 축적 기기(즉 마이크로티터 플레이트) 내로 분류되었다. 제2 제어 기준에 일관되게, 배양보조제(feeder)로서 약 100 와일드 타입 원형질체를 포함하는 50 μl의 무균 8p2c 재생 배지로 채워진 96-웰 플레이트로 웰 당 하나의 원형질체가 분류되었다. 96-웰 플레이트는 무균 뚜껑으로 덮어져 접착테이프로 밀봉되었다. 회복된 원형질체의 실질적인 숫자는 역 형광 현미경으로 확인되었다. 단일 세포 모드에서의 원형질체의 유동 세포 계측 분류는 약 20%의 웰이 웰 당 하나의 완전하고 생존가능한 원형질체를 포함하는 프레이팅 효율을 도출하였다.

D. 낮은 밀도에서의 분류된 원형질체의 발생

단일 분류된 원형질체의 재생은 실시예 1, 섹션 E에 설명된 바와 같이 시행되었다.

강력한 형광 원형질체의 단일 세포 모드에서의 유동 세포 계측 분류는 약 20%의 웰이 오직 하나의 분류된 원형질체를 포함하는 것을 야기하였다. 이들 단일 원형질체의 50%는 증식을 시작하였고 현탁 배양을 구축하기 위하여 사용될 수 있었다.

E. 단클론 형질전환 현탁 배양의 분석

단일 원형질체로부터 유래된 개선된 현탁 배양 내의 형광 원형질체의 퍼센테이지를 확인하기 위하여 앞서 설명된 바와 같이 유동 세포 계측 분석이 수행되었다(실험예 1, 섹션 D). M12 항체 축적 레벨은 효소 연결 면역 측정법(ELISA)을 사용하여 측정되었다. 따라서, 상기 현탁 세포는 원심분리되어(850 g, 5분), 3 Vol. 추출 버퍼(PBS pH 6, 5 mM 2-머캅토에탄올, 5 mM EDTA, 10 mM 아스코르브산)에 재현탁되고 초음파처리에 의해 분쇄되었다. 상기 추출물은 원심분리 단계(20분 16000 g)에 의해 세포 파괴물로부터 분리되었고 분석을 위해 사용되었다. 선택된 설정(Fc 캡쳐 및 LC 검출)으로 인하여 오직 완전히 조립된 항체들 만이 검출되었다.

FACS 한 회전 후, 단클론 현탁 배양은 양 재조합 단백질에 대하여 현저하게 개선된 축적 레벨을 나타내었다: 모 현탁 배양에 비교하여 3.7배 풍부한 DsRed 형광 세포 (90%) 및 11배 증가된 M12 항체 (145 μg/g 생중량 또는 9.3배 mg/L 레벨(93 mg/L)).

F. 현탁 배양 개선의 반복

형질전환 단클론 현탁 배양의 재조합 단백질 생산성을 더 증가시키고 안정화하기 위해서 B 내지 E 단계는 반복될 수 있다. 앞서 설명된 원형질체 발생 분류 및 재생의 동일한 조건이 적용되었다.

분류 제2 회전은 더 증가된 항체 축적을 야기하였다: 182 μg/g 생중량 또는 113 mg/L, 이는 모 배양에 비교하여 14배 및 11.3배 증가이다.

최적 생산 제2 발생 단클론의 분류 제3 회전은 유사한 축적 레벨을 생산하는 제3 세대 단클론 배양을 야기하였고, 이는 최대 레벨이 달성되었음을 의미한다.

G. 타겟 단백질 생산성의 관점에서 선택 생산 단클론 배양의 안정성

FACS 유도된 단클론 세포주의 안정성은 3 단클론 라인에 대하여 예시적으로 조사되었다. 단클론 세포주는 7일 사이클로 계대 배양 되었고(실시예 1, 섹션 A를 참조), 이때 양 재조합 타겟 단백질은 2개월 간격으로 언제나 계대 배양 후 5일째에 측정되었다. 12개월의 기간에 걸쳐 제1 세대 단클론 배양주에 대하여, 이들 배양이 여전히 생중량 1그램 당 많고 안정적인 양의 M12 항체를 생산한다는 것을 나타낸다. 격월의 샘플링 간격에서 오직 약간의 항체 레벨의 차이(세포 배양 차이에 의하여 야기된)만이 관찰되었다.

제2 세대 단클론의 분석은, 그들이 그로부터 유도된 1세대 단클론 배양과 비교하여 재조합 단백질 M12 항체 및 DsRed 둘 모두의 유사하거나 약간 증가된 축적 레벨을 나타냄으로써 세포주의 안정성을 확인하였다. 분석된 모든 제2 세대 단클론 배양에 걸쳐, 제1 세대 단클론 배양에 비교하여 타겟 단백질 생산의 관점에서 보다 안정적(격월 샘플링 간격에서 더 적은 차이)인 것으로 나타났다. 12개월의 기간 동안, 분석된 세개의 단클론 배양 중에서 두개가 총 개체군 내의 DsRed 형광 세포의 퍼센테이지 및 M12 항체 축적과 관련하여 매우 안정적인 것으로 나타났다.

Claims (7)

1. 식물세포의 이종 개체군으로부터의 단클론 식물세포주의 발생 방법으로서,
   (a) 식물세포의 이종 개체군 준비;
   (b) 상기 식물세포의 이종 개체군으로부터의 원형질체 준비 및 세포벽 재생의 개시;
   (c) 액체 배지 내 배양보조세포 재료(feeder cell material)를 함유하는 세포 축적 기기의 제공;
   (d) 상기 준비된 원형질체에 FACS를 적용하여 단일 원형질체 분리;
   (e) 배양보조세포 재료를 함유하는 상기 세포 축적 기기의 액체 배지 내로 상기 단일 원형질체를 분류;
   (f) 상기 배양보조세포 재료의 존재하에서 공배양에 의한, 마이크로콜로니(microcolony)가 형성될 때까지 분리된 단일 원형질체의 재생; 및
   (g) 상기 배양보조세포 재료로부터 마이크로콜로니의 제거 및 단클론 식물세포주가 형성될 때까지 상기 마이크로콜로니의 배양을 포함하며,
   상기 (b) 단계에서 준비된 원형질체는 형질전환된 것으로,
   (i) 형광 마커 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산할 수 있고/있거나,
   (ii) 선택 시약의 존재하에 생존가능한 것인, 식물세포의 이종 개체군으로부터 단클론 식물세포주의 발생 방법.
   
2. 청구항 1에 있어서, (g) 단계에서 획득한 단클론 식물세포주의 완전한 번식능력이 있는 식물로의 재생을 더 포함하는, 단클론 식물세포주의 발생 방법.
   
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, (b) 단계에서 준비된 원형질체가 형질전환되고 목적하는 생산물을 생산할 수 있는, 단클론 식물세포주의 발생 방법.
   
4. 청구항 3에 있어서, 목적하는 생산물이 이종 단백질 또는 폴리펩타이드, 이차 대사물, 및 진단 또는 분석 목적을 위한 마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단클론 식물세포주의 발생 방법.
   
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