TW201300014A - 產生單株植物細胞株的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種由植物細胞的異源性群體產生單株植物細胞株的方法，其包含下列步驟：(a)提供植物細胞的異源性群體；(b)由該植物細胞的異源性群體製備原生質體；(c)藉由將原生質體的製備物進行流式細胞分選而分離單獨原生質體；(d)於餵食細胞材料存在的情況下，藉由共培育使分離的單一經轉形原生質體再生直到形成小聚落；(e)將小聚落自餵食細胞材料移去並培育小聚落直到形成單株植物細胞株。

Description

產生單株植物細胞株的方法
本發明是有關於植物生物技術領域。具體而言，本發明是有關於透過流式細胞分選由植物細胞的異源性群體產生天然(野生型)或基因轉殖單株植物細胞株。對於習於技藝者而言明顯的是，本發明亦包含使用該單株植物細胞株以供再生整株可育性植株。
在過去數十年間，已將許多努力投注在建立並培養以植物為基礎的系統供用於積聚並收取天然或異源性蛋白質與次級代謝物。文獻提供大量證據證實，以植物為基礎的系統在生產眾多被分泌至培養基或從生產細胞、組織、胞器或甚至整個細胞或其部分被分離之所要物質的實用性。同樣地，存在有廣泛的轉形實驗計畫可確保建立經穩定或暫時轉形的植物材料。但是，對於可靠、相對合乎成本並且快速的技術以從植物細胞獲得高產量的所要產物仍有需要。
已重複報導使植物細胞群體(諸如植物懸浮培養物)轉形通常會產生表現高度異源性(混合型)與目標蛋白質表現程度不一之細胞的基因轉殖培養物，其與初級異源性細胞群體中混合在表觀基因上不同的細胞有關。在重組細胞株中，基因轉殖表現的異源性證實是生產率的重要問題。
主要問題為在轉形分析中高生產株通常是罕見的 結果，而且要建立同源性高生產細胞株相當耗時。因此，仍存在著的技術挑戰為從剛基因轉殖或已基因轉殖的植物培養物中生產與回收的優異基因轉殖結果。
關於流式細胞分選(諸如FACS應用)，必須由通常聚集在一起的植物細胞群體或培養物透過以酵素分解細胞而釋放出原生質體來取得單獨球形細胞。但是，對於大部分的植物物種來說，單獨原生質體的再生會受限於必須維持在特定群體密度下。
迄今，並未描述過一種用於再生單獨基因轉殖細胞/原生質體或用於自其再生完整可育性植株(特別是在流式細胞分選之後)的可靠且可再現程序。
因此，本發明主要是涉及提供一種以植物為基礎的系統，利用由植物細胞的異源性(混合型)群體(諸如懸浮培養物)產生的未經轉形或基因轉殖的單株植物細胞株，以產生高水平的所要天然或重組產物，並且克服先前技藝的問題，尤其是關於快速分離，接著再生單獨(基因轉殖)原生質體直到形成可用來建立單株植物細胞株的小聚落(microcolony)，其較佳地能夠生產並積聚大量的所要產物。對於習於技藝者而言清楚的是，本發明同樣提供由已建立的單株植物細胞株再生而來的完整可育性植株。
相對於許多目前使用與已發展之以使用完整植株或至少完整與已分化植物組織為基礎的系統，使用懸浮 細胞的優勢在於同源性材料在受到控制、無菌與被控制的條件下可再現地生產。
在植物中，目前有兩種生產重組蛋白質的主要策略，亦即(i)產生穩定的基因轉殖植物或懸浮細胞株，或(ii)在以細菌(例如農桿菌)、病毒(例如菸草鑲嵌病毒、馬鈴薯病毒X/Y、豇豆嵌紋病毒與許多其他病毒)或兩者組合(例如magnifection)感染植物表現宿主(植物、組織或細胞)後，使得宿主表現異源性遺傳信息(DNA或RNA)而暫時地表現異源性基因。另外且為本技藝所熟知，遺傳信息亦可藉由已建立的機械方法(例如電穿孔或雷射打孔)被引入植物表現宿主。
儘管本發明較佳地涉及使用供暫時表現之經穩定轉形的植物細胞材料、系統，其具有速度(基因對產物、上市時間、緊急反應)以及達到比通常經穩定轉形之基因轉殖植物或其部分(諸如細胞)所得高得多的積聚水平的優勢，亦涉及本發明之方法。
依據本發明，提供一種由植物細胞的異源性群體產生天然(野生型、非轉形)或基因轉殖單株植物細胞株的方法。該方法包含，首先提供該植物細胞群體(例如形成來源植物細胞材料的植物懸浮細胞)，其可進行如本發明所包含的更多步驟。通常，此植物細胞材料可易於由，例如異源性植物懸浮培養物(其較佳地在受控制及/或無菌條件下培育)衍生而來。來源細胞可以是經(穩定地/暫時地)轉形的基因轉殖細胞或野生型(天然、未經轉 形)細胞，其能夠生產並積聚所要產物。
由於本發明方法使用流式細胞分選(諸如FACS技術)來分離或單離單獨細胞，例如個別的原生質體，此等必須由上面提供之植物細胞群體使用本技藝中已知的材料與方法製備。依據較佳具體例，此等原生質體經轉形且能夠(i)生產螢光標記蛋白質或多肽、(ii)生產所要產物，及/或(iii)於篩選劑存在下存活下來。關於流式細胞分選的較佳分選標準為細胞顆粒性，作為如定性特徵的標記(例如細胞凋亡與細胞大小)。FACS的較佳分選標準是選自包含遺傳背景(例如染色體套數、非整倍性)、突變基因轉殖、基因互換產物與螢光(例如自發螢光(葉綠體、代謝物)、螢光蛋白質或酵素媒介的螢光)的群組。應了解，使用篩選劑不是必要的。因此，原生質體不必要經賦予適當抗性的核酸序列轉形。
在藉由流式細胞分選(諸如FACS)分離或單離單獨(經轉形)原生質體後，藉由於餵食細胞材料存在下共培育而再生各個單獨經轉形的原生質體直到形成小聚落(小癒傷組織)。植物來源並未受到限制，但限於原生質體具有再生直到形成小聚落或小癒傷組織之潛力的株、品種與物種。因此，本發明可應用於所有再生步驟已被建立或未來將被提供的植物品種與物種。關於本發明涉及將單株小聚落或植物細胞株進一步再生為完整可育性植株的態樣，應了解此態樣可在所有再生步驟已被建立或未來將被提供的植物品種與物種進行。
之後，從餵食細胞材料分離或移除小聚落並培育直到形成單株細胞植物細胞株。
依據較佳具體例，次一個步驟包含如本發明之方法，其係有關於藉由如下產生單株癒傷組織：(i)將小聚落或小癒傷組織轉移至固體培育培養基，以及(ii)於至少一篩選劑存在下培育小聚落或小癒傷組織直到形成基因轉殖癒傷組織，由該基因轉殖癒傷組織可透過將癒傷組織轉移至液體培育培養基而建立基因轉殖單株植物細胞株。如習於技藝者所知，小聚落亦可藉由機械方法(諸如藉由選殖株挑取)從餵食細胞材料移除或分開。在此情況下，不需要篩選劑且由小聚落組成的細胞不需要展現出對抗任何篩選劑的抗性。
依據較佳具體例，由植物細胞的異源性群體所組成的細胞在進行流式細胞分選之前為天然(例如野生型)或非基因轉殖細胞，其經至少一種含有至少一異源性核酸序列(可操作地連接至功能性啟動子)之表現載體穩定地或暫時地轉形，其中該至少一異源性核酸序列編碼所要產物。依據進一步具體例，該至少一種表現載體含有至少兩個異源性核酸序列可操作地連接至功能性啟動子，其中該至少兩個異源性核酸序列編碼螢光標記蛋白質或多肽以及對抗篩選劑的抗性或所要產物。若需要的話，細胞可另外包含異源性核酸序列，其編碼要在如本發明所提供之基因轉殖單株植物細胞株中積聚的所要產物。
術語「異源性」如本文所用表示所論核苷酸的基因/序列已藉由使用遺傳工程(亦即藉由人為干擾)被引入植物細胞。為本發明之目的，核苷酸的異源性序列可包含由融合伴侶所組成的融合蛋白質的編碼序列，該融合蛋白質可藉由(例如)部分透過可融合至非植物蛋白質的植物蛋白質形成，其可被稱為雜交植物：非植物融合蛋白質。另外，融合蛋白質可以是由非植物來源的融合伴侶所形成。異源性基因可提高來自於相對內源性等效基因的感興趣蛋白質的表現，該內源性等效基因一般表現相同或類似的功能，或內源性基因或其他序列以外的插入序列。對於細胞為異源性的核酸在培育的細胞、品種或物種類型中可以是非天然存在的。因此，異源性核酸可含有特定類型生物的編碼序列，或衍生自特定類型生物的編碼序列，特定類型生物為諸如植物或哺乳動物物種，例如人類、綿羊、牛、馬或豬物種，其位在培育細胞(諸如衍生自菸草的BY2細胞)內。另一可能性為核酸序列位在培育目標細胞內，其中異源性核酸或相似物是天然存在的，但其中核酸序列連接至及/或相鄰於那個植物類型或物種或品種的細胞內非天然存在的核酸，諸如可操作連接至一或多個調節序列(例如啟動子序列)以供控制表現。此外，亦可使用合成(人工)核酸序列。
「載體」定義為尤其包括任何呈雙股或單股線狀或環狀形式的質體、黏質體、噬菌體或病毒載體，其可以是或不是本身可傳遞(transmissible)或可移動的，且其可 轉形原核生物或真核生物宿主並存在於染色體以外(例如具有複製原點的自發複製質體)。特別包括穿梭載體，其表示一種能夠在兩種不同宿主生物中複製的天然或經設計的DNA媒介物，其可選自於放線菌與相關物種、細菌和真核生物(例如高等植物、蘚、哺乳動物、酵母菌或真菌)細胞。
「表現載體」意指一種載體，其中受到控制的情況下並可操作地連接至適當啟動子或其他調節要素以供在宿主細胞(諸如微生物或植物細胞)中轉錄的核酸。載體可以是雙功能性表現載體，其在多種宿主中發揮作用。在基因或次基因DNA中，這可含有其自有的啟動子或其他調節要素，而在cDNA的情況下這可受到適當啟動子或其他調節要素控制以供在宿主細胞內表現。
「啟動子」係自其轉錄可在操作連接之下游DNA開始(亦即在3’方向上於雙股DNA的有義股)的核苷酸序列。
「可操作連結」意指連結作為相同核酸分子的一部分，經適當地定位與定向以供從啟動子起始轉錄。
術語「可誘發」當應用於啟動子時應為習於技藝者所充分了解。簡言之，在受到可誘發之啟動子控制下的表現是對施加的刺激有所反應而「被開啟」或增加。刺激的本質會隨著啟動子而不同。於不存在適當刺激的情況下，一些誘導性啟動子產生些許或無法偵測到的表現水平(或無表現)。於不存在刺激的情況下，其他可誘發 之啟動子會產生可偵測到的基本表現。於不存在刺激的情況下不論表現水平如何，任何可誘發之啟動子的表現於存在正確刺激的情況下會增加。
本發明亦含括任何此等序列之變異體的用途。變異體蛋白質與所論序列的全部或部分具有同源性，或相同。
為了表現重組蛋白質，將含有感興趣蛋白質之遺傳信息的重組農桿菌或病毒(載體)的懸浮物以技藝中熟知的方法施用於上述植物懸浮細胞。載體感染植物細胞並且傳送遺傳信息。較佳地，待轉形的植物細胞材料是以高密度而僅有少量培養基存在的方式提供，使得載體懸浮物可以僅透過滴落或噴灑而施用。這個轉形的較佳具體例在操作、自動化、包裝、放大與廢棄物製造及移除方面有數個實施上的優勢。另外，可使用技藝中熟知的已知技術，諸如粒子衝擊、電穿孔與類似技術。
適當啟動子包括花椰菜嵌紋病毒35S(CaMV 35S)。可選定具有賦予發育及/或組織特異性調節控制表現之一或多個序列模式或要素的啟動子。
如已提及的，該至少一可選擇的遺傳標記(可以是要被製造的)可包括在建構物或以第二建構物提供，諸如賦予可選擇表現型的遺傳標記(諸如對抗生素或殺草劑(包括，但不限於例如康那黴素、潮黴素、草銨膦、綠黃隆、胺甲葉酸、健他黴素、觀黴素、咪唑啉酮與嘉磷塞)的抗性)。
另外，用於製備原生質體的植物懸浮細胞亦可由已經基因轉殖的異源性植物懸浮培養物(含有基因轉殖細胞)所提供。
依據本發明所建立的(基因轉殖)單株植物細胞株可於載體懸浮物以外或取代載體懸浮物之下列物質存在下被處理或培育以供生產重組蛋白質或代謝物：前驅體、誘導物、激素、穩定劑(例如可相容的溶質)、抑制劑、RNAi/siRNA分子、信號傳遞化合物、酵素(例如果膠酶)，及/或誘引劑。
依據較佳具體例，所要產物是選自由異源性蛋白質或多肽(例如，血液產物、細胞激素、生長激素、治療性/診斷性/工業酵素、疫苗、全尺寸抗體或各種抗體衍生物)、次級代謝物(例如苯丙素、生物鹼、類萜、醌或類固醇)及診斷或分析氣體、固體或流體(化學)化合物與物質的標記所組成之群組。
感興趣基因包括編碼本身是天然藥品之蛋白質(諸如藥品或獸醫產物)的基因。此外，感興趣基因亦包括任何其他重組蛋白質，諸如工業酵素、毒素或賦予新穎農藝輸入型與輸出型性狀的重組蛋白質。
異源性核酸尤其可編碼細菌、真菌、植物或非植物來源(諸如上文略有提到的融合蛋白質)或動物來源的基因。所生產的多肽可用於生產可自其純化以供其他用途的多肽。可在本發明方法中生產的蛋白質包括異二聚體，諸如FSH、免疫球蛋白、融合抗體與單鏈抗體。此 外，可改變上面的基因以生產具有特性有所變化(諸如經改變的聚醣結構)的蛋白質。但是，本發明不容許使用諸如不存在自然界中之人工序列的合成基因。
此等蛋白質包括，但不限於視網膜胚細胞瘤蛋白質、p53、血管抑制素及瘦素。同樣地，本發明方法可用於生產哺乳動物調節性蛋白質。其他感興趣的序列包括蛋白質、激素(諸如濾泡刺激素)、生長因子、細胞激素、血清白蛋白、血紅素、膠原蛋白、奇甜蛋白、奇甜蛋白樣蛋白質、表皮生長因子(諸如VEGF)等。
如習於技藝者所知，本發明可生產多樣化蛋白質及多肽，包括與藥劑相關的(重組)蛋白質(諸如疫苗、抗體、治療性酵素、致敏原與低致敏原、抗微生物肽、結構蛋白質(諸如彈力蛋白與膠原蛋白供作為生物相容性塗覆材料)、病毒樣顆粒、蛋白體等)、具營養價值的(重組)蛋白質(食品與飼料添加物)、用於診斷用途的(重組)蛋白質(諸如酵素、抗體與經工程化抗體、其他酵素或螢光融合蛋白質、用作為陽性對照的抗原、用於蛋白質陣列的結合配體)、與工業相關的(重組)蛋白質(諸如用於親和力吸附的結合配體、高價值酵素、生物催化劑)，以及增進農藝輸入型或輸出型性狀的重組蛋白質。
一般而言，異源性核酸可以藉由技藝中所用任何適當的方法表現，或它們可如下轉錄或表現：
(i)暫時表現(例如)含有可操作連接至感興趣異源性序列之啟動子的「裸」DNA， (ii)表現載體(諸如複製載體)之表現。一般而言，習於技藝者能夠妥善建構載體並設計用於暫時重組基因表現的程序。可選擇或建構含有適當調節序列(包括啟動子序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因與其他序列(若適合的話))的適當載體。關於更多細節參見，例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition,Sambrook et al,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press或Molecular Biology,Second Edition,Ausubel et al,eds.,John Wiley & Sons,1992的通用程序。
(iii)表現未合併載體。
應了解此等類別並未彼此排除，例如因為未合併載體亦可以是表現載體等。
如習於技藝者所知，編碼螢光標記蛋白質或多肽或生產螢光分子之酵素或感興趣異源性蛋白質(所要產物)之至少兩個異源性核酸序列可呈下列形式提供：(i)相同載體上的單獨表現匣所構成的多順反子構型、(ii)相同載體上與至少兩個不同表現匣的串接構型，或(iii)不同載體上至少兩個不同表現匣，其串接構型較佳。
因此，依據又一態樣，本發明亦提供一種生產至少一種所要產物的方法，該至少一種所要產物較佳是選自由異源性蛋白質或多肽、次級代謝物與標記所組成之群組。該方法包含使用如依據本發明建立的(基因轉殖)單株植物細胞株來生產並積聚至少一種所要產物，其接而由生產細胞或由培育培養基獲得或分離。
因此，在本發明的一個態樣中，揭示使用額外能夠產生編碼所要產物(諸如藉由從引入的核酸建構物轉錄而產生的異源性目標蛋白質，該核酸建構物包括可操作連結至啟動子的目標核苷酸序列)之mRNA的較佳經穩定轉形的單株植物細胞株。
因此，「引入的核酸」包括如DNA序列以建構物形式提供的異源性核酸序列，其能夠生產並累積所要產物。
因此，在本發明的一個較佳態樣中，揭示一種在單株植物細胞株中達到穩定表現異源性核苷酸序列的方法，該方法包含將至少一種第一核酸序列穩定地引入目標細胞的步驟，該第一核酸序列含有編碼所要產物的異源性核苷酸序列。
在一個具體例中，提供一種產生至少一種細胞外異源性蛋白質的方法，該方法包含以下步驟：(i)將包含編碼異源性蛋白質或所要產物之核苷酸序列的第一核酸穩定引入至由植物細胞之起始群體所組成的目標細胞中；(ii)由該植物懸浮培養物提供之植物懸浮細胞製備原生質體，其中該等原生質體另外經轉形且能夠(i)生產螢光標記蛋白質或多肽，以及(ii)於篩選劑存在的情況下存活下來；(iii)藉由將原生質體的製備物進行FACS而分開單獨經轉形原生質體； (iv)在餵食細胞材料存在的情況下，藉由共培育而再生分離的單獨經轉形原生質體直到形成小聚落或小癒傷組織；(v)藉由(i)將小聚落或小癒傷組織轉移至固體培育培養基與(ii)於至少一種篩選劑存在的情況下培育小聚落或小癒傷組織直到形成基因轉殖癒傷組織而產生單株癒傷組織；(vi)藉由將癒傷組織轉移至液體培育培養基而建立基因轉殖單株植物細胞株；以及(vii)透過提供適當培育條件而使或容許異源性蛋白質或所要產物之核酸表現，以及(viii)自生產細胞收取積聚的異源性蛋白質或所要產物。
可藉由完全習知的方法進行分離，並且可或可不必需部分或完全純化。
當然，習於技藝者將認知到在建構物或各建構物中可使用超過一個基因。多載體(各自包括一或多個編碼所選異源性蛋白質的核苷酸序列)可被引入如本文或他處所述的目標細胞中。這可用於生產，例如酵素的(例如)多個次單位。
螢光標記蛋白質或多肽可以是任何可藉由螢光偵測到的蛋白質，諸如GUS、螢光蛋白質(諸如GFP或DsRed)、螢光酶等。較佳地，報導子為非侵入性標記，諸如DsRed或GFP。
依據另一態樣，本發明提供一種根據細胞分選鑑別較高表現插入位點的方法，其包含以含有螢光蛋白質1的建構物轉形細胞(例如，如下面實施例1B中所述)，以及藉由FACS鑑別並分開單獨高螢光蛋白質1生產細胞的步驟，其包括再生成小聚落與懸浮培養物且例如與螢光蛋白質2基因互換，並鑑別與分開罕見基因互換產物。
現將進一步參考下列非限制性圖式與實施例來說明本發明。本發明的其他具體例會因為這些實施例而被習於技藝者所想到。
實施例 實施例1
在轉形事件後快速產生生產良好的單株細胞株
A.菸草細胞培養物
於黑暗中將菸草cv.亮黃2(BY-2)的野生型懸浮培養物以100 ml玻璃錐形瓶中的50 ml等分試樣維持在無菌條件、26℃下，使用180 rpm的恆定軌道攪拌。培育培養基含有基礎MSMO培養基(pH 5.8)，其以蔗糖(3%，w/v)以及1 mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸補充。以7天間隔藉由將5%(v/v)細胞轉移至50 ml新鮮培養基而完成繼代培養。
關於原生質體製備，藉由將2%(v/v)轉移至50 ml新鮮培養基來對懸浮細胞培養物進行繼代培養。
B.加速產生基因轉殖結果以供後續分選
如A段中所述培育BY-2野生型懸浮細胞。同時，在160 rpm的軌道震動器與27℃下，將帶有在相同載體上含數個表現匣之建構物的基因轉殖發腫農桿菌在含有適當抗生素的YEB培養基(0.5%營養肉湯培養基、0.1%酵母菌萃取物、0.5%蛋白腖、0.5%蔗糖、2 mM MgSO4，pH 7.4)中培育至OD600nm為1。繼代培養後3天，於黑暗中將3 ml BY-2野生型細胞、200 nM乙醯丁香酮以及150 μl農桿菌(OD600nm=1)共培育於培養皿中。在室溫下共培育3天後，將BY-2細胞再懸浮於10 ml的BY-2培養基(補充有200 mg/l頭孢黴素)中。將細胞轉移至50 ml無菌試管中並藉由離心洗滌2次(850 g，5分鐘)以移除農桿菌。再懸浮細胞團塊後，使用20-50 ml BY-2培養基(補充有頭孢黴素與適當篩選劑)將經轉形BY-2細胞培育在100 ml搖瓶中(180 rpm，26℃)。在適當懸浮物再生(細胞容積約為50-60%)後，將細胞進行繼代培養以供原生質體製備(參見C段)。本方法需要14至21天以建立基因轉殖懸浮培養物，其可用於隨後的原生質體產生(C)以及流式細胞分選(D)。
C.原生質體製備以及細胞壁再生
在繼代培養3天後使用活躍生長的細胞培養物以供藉由在無菌錐形塑膠離心管中以850 g離心5分鐘來沉澱細胞。移除上清液並將細胞再懸浮於含有1%(w/v)纖維素酶與0.3%(w/v)離析酶的10 ml PNT消化溶液 (3.6 g/l Kao Michayluk基礎鹽(Duchefa)、0.4 M蔗糖、0.5 mg/l NAA、1 mg/l BAP)中。將細胞-酵素懸浮物置於6 cm培養皿中，以膠帶密封。在26℃下於黑暗中以輕柔攪拌進行消化過夜(16-18小時)。將原生質體濾過100-μm尼龍網目並隨後在離心(104 g持續8分鐘)期間漂浮至表面。移去團塊，培養基介面並以PNT溶液洗滌2次。將原生質體再懸浮於W5溶液(154 mM NaCl、125 mM CaCl2、5 mM KCl、5 mM葡萄糖，pH 5.6)中並藉由以76 g離心2分鐘沉澱。於輕柔再懸浮後，將原生質體培養在經修改再生培養基8p2c(參見下表1；從8p培養績優化而來)中。所述步驟通常會產生每毫升7x105個原生質體，平均約74%存活原生質體百分比。
在26℃下於黑暗中再生原生質體3天以開始細胞壁再生。將所形成的原生質體再次過篩100-μm尼龍網目並接而轉移至無菌樣品導引試管以供FAC分選。單獨原生質體被分選至含有非基因轉殖野生型餵食原生質體或細胞的96孔微量滴定盤的各孔中(參見D段)。
使用Fuchs-Rosenthal計數區將用作為餵食原生質體的BY-2野生型原生質體調整至約2 x 103細胞/ml 8p2c培養基。將50微升的此等原生質體轉移至96孔微量滴定盤的各孔中，以使得約100個野生型餵食原生質體轉移至各孔中。
表1：8p2c培養基的組成(pH 5.6)- Kao與Michayluk基礎鹽混合物(Duchefa)- Kao與Michayluk維生素溶液(Sigma)0.02 mg/l p-胺基苯酸2 mg/l L-抗壞血酸0.01 mg/l生物素1 mg/l D-泛酸鈣1 mg/l氯化膽鹼0.4 mg/l葉酸100 mg/l Myo-肌醇1 mg/l菸鹼醯胺1 mg/l氫氯化吡哆醇0.2 mg/l核黃素1 mg/l噻胺鹽酸鹽0.01 mg/l維生素A 0.02 mg/l維生素B12 0.01 mg/l維生素D- 有機酸(使用NH4OH為pH 5.5)20 mg/l丙酮酸鈉40 mg/l蘋果酸40 mg/l檸檬酸40 mg/l延胡索酸- 糖與糖醇0.25 g/l蔗糖 250 mg/l甘露糖68.4 g/l葡萄糖250 mg/l鼠李糖250 mg/l果糖250 mg/l纖維雙糖250 mg/l核糖250 mg/l山梨醇250 mg/l木糖250 mg/l甘露醇- 激素0.2 mg/l 2.4-D 0.5 mg/l玉米素1.0 mg/l NAA- 2%(v/v)椰子水- 500 mg/l酪蛋白胺基酸
D.流式細胞分析與分選
使用具有488 nm/635 nm氬離子雷射的FACS Vantage(DIVA option,BD Bioscience)儀器分選基因轉殖植物原生質體。磷酸鹽緩衝溶液(PBS pH 7.4)之鞘液係藉由高壓蒸氣滅菌法並通過0.22 μm過濾器滅菌。在分選之前，藉由通過無菌鞘液來清除樣品管的殘餘乙醇。細胞計數系統/分選設定是使用商業標準自發螢光校正粒子來校準。流式細胞分選儀係於488 nm下使用175 mW的雷射輸出來操作。在分選之前，電子分選窗 是根據針對原生質體培養物樣品的前向散射光、側向散射光與螢光所收集的訊號來定位，俾以限定強烈螢光的群體。訊號是以點狀圖使用DIVA軟體(BD Bioscience)來顯示。分選區是由首先圈選圍繞存活原生質體之群體，並接而依據第一圈選圍繞強烈螢光之原生質體而限定。分選是透過使用4-6 psi的系統鞘壓、約7 kHz的滴頻率以及約1.000項目/秒的樣品流量通過200 μm的流動尖端來進行。使用已述的分選參數，約20%的平盤效率(如20%的孔含有完整及存活的單一被分選的原生質體)可達成。
E.藉由與看護/餵食原生質體共培育產生單獨分選的原生質體
在分選高螢光單獨原生質體之前，將96孔微量滴定盤的各孔填充含有約100個菸草cv.BY-2野生型原生質體作為餵食細胞的50 μl無菌8p2c再生培養基。藉由倒立式螢光顯微鏡在不同時間點分析單獨分選的基因轉殖原生質體，俾以在分選步驟之後確認單獨細胞沉積並且監控基因轉殖原生質體的增殖與小聚落形成(分選14至20天後)。分選的原生質體在96孔盤中以26℃至27℃於黑暗中培育，將96孔盤以無菌蓋闔上並使用膠帶密封。
接著，將基因轉殖小聚落轉移至含有抗生素篩選標記(例如康那黴素)的固體再生培養基(0.8%(w/v)瓊脂)。因此，藉由吸移並且使用具有寬吸管端的吸管轉 移而輕柔地再懸浮在孔中含有餵食細胞的小癒傷組織。其後，藉由倒立式螢光顯微鏡分析孔以及固體再生培養基上的經轉移小癒傷組織以確認成功轉移基因轉殖與螢光小聚落。在轉移之後，使基因轉殖小癒傷組織生長14至20天並轉移至含有固體再生培養基(具有篩選標記)的新鮮盤。具有直徑大小約2 cm的癒傷組織是藉由將細胞材料轉移至50 ml塑膠組織培養燒瓶的5 ml培育培養基中而用於建立懸浮培養物(A段中所述)。如A段中所述培育這些燒瓶直到細胞懸浮物生長至約50至60%的細胞容積以供轉移至100 ml錐形瓶內。如A段中所述培育基因轉殖單株懸浮培養物。
所述餵食細胞策略容許約50%最初分選的完整與存活單獨原生質體再生(亦即，約10%被分選至96孔微量滴定盤之孔中的單獨原生質體發育成小癒傷組織)。
F.證明在經分選單獨原生質體再生期間成功排除餵食細胞存活
已發展能夠確實將單獨FACS選擇的原生質體再生成單株懸浮培養物的程序。因為單獨原生質體必須在分選之後再生，需要餵食細胞支持經篩選單獨原生質體的再生與增殖。由於餵食原生質體暫時與經分選螢光目標原生質體共培育，故在單株培養物再生期間強制排除餵食原生質體存活下來。
已研究過單獨的經分選基因轉殖及螢光BY-2細胞因為餵食原生質體的可能汙染。已使用含有GFP-KDEL 表現匣以及AHAS篩選標記(賦予咪唑乙烟酸抗性)的建構物將基因轉殖細胞轉形。經此建構物轉形並生產GFP的單獨BY-2原生質體被分選至含有基因轉殖細胞株之原生質體的96孔盤，其含有DsRed表現匣與nptII篩選標記(賦予康那黴素抗性)。在第二個實驗中，經DsRed表現匣與nptII篩選標記轉形的單獨BY-2原生質體被分選至含有生產GFP之基因轉殖細胞株的原生質體的96孔盤中。再生後，分析所得到的GFP及DsRed螢光培養物對應咪唑乙烟酸或康那黴素的抗性及其螢光(綠色對紅色)。由兩種方法而來的癒傷組織被置放在含有1.5 μm咪唑乙烟酸或100 mg/L康那黴素的篩選培養基。培育14天後以視覺評估細胞生長。所有的測試癒傷組織(總計20個)特定生長在含有其特定篩選劑的培養盤上。簡言之，經GFP/AHAS轉形的癒傷組織生長在含咪唑乙烟酸而非含康那黴素的盤上，而經DsRed/康那黴素轉形的癒傷組織僅生長在康那黴素盤上。這個觀察結果清楚地證明經再生的基因轉殖細胞株未受到個別餵食細胞株汙染。餵食細胞的潛在汙染係另外藉由流式細胞分析來評估。分析經再生的GFP及DsRed懸浮培養物分別因為螢光蛋白質GFP或DsRed所產生的光學特性。這個觀察結果清楚地證明經再生的基因轉殖細胞株未因為個別餵食細胞株而汙染。所有的測試BY-2培養物顯示特定的預期螢光形態。在分選經GFP轉形之細胞後所建立的培養物僅顯示綠色螢光，而生產DsRed 的培養物特別偵測到紅色螢光通道。在經餵食細胞汙染的情況下，預期在兩個通道中有螢光訊號。細胞分析結果確認如先前抗性試驗所證實般有效率地移除篩選盤上的餵食細胞。
G.分析單株基因轉殖懸浮培養物
首先分析單株懸浮培養物的高度螢光細胞百分比。因此，如C段中所述製備原生質體。關於螢光原生質體部分的流式細胞測定，使用FACS Calibur儀器(BD Bioscience)。依據BY-2野生型原生質體調整設定參數(例如光線與螢光散射放大器的放大倍率)並測量樣品。在圈選存活群體後，使用此群體在螢光通道中的分布來設定閾值，其排除所有由野生型自發螢光所造成的背景訊號。根據這個閾值，計算出衍生自單獨原生質體之經改良的原生質體培養物的螢光原生質體百分比。生產重組DsRed蛋白質的單株懸浮培養物的流式細胞分析顯示，同質性分布的細胞具有類似且強烈的螢光強度(窄螢光峰)。計算DsRed螢光細胞部分為百分比介於78至88%的強烈螢光細胞。
重組蛋白質的積聚水平可藉由不同程序(例如酵素連結免疫分析(ELISA))來測定。因此，將細胞離心(850 g，5分鐘)、再懸浮於3倍體積萃取緩衝液(PBS pH 6，5 mM 2-巰基乙醇、5 mM EDTA、10 mM抗壞血酸)並藉由超音波破壞。透過另一個離心步驟(20分鐘，16 000 g)由細胞碎片分離萃取物並用於分析。M12抗體在經 pTRAkc：MTED轉形之懸浮培養物的5dpi細胞萃取物中積聚的免疫學分析揭示，多至118±20 μg/g鮮重(高出使用傳統產生方法1.5倍，亦即癒傷組織產生與篩選)。
實施例2
從異源性基因轉殖懸浮培養物產生單株細胞株
A.菸草細胞培養物
於黑暗中將生產ER妨礙(ER-retarded)人類全尺寸IgG1抗體M12及質體靶定之螢光蛋白質DsRed的基因轉殖菸草cv.亮黃2(BY-2)懸浮培養物MTED#18以100 ml玻璃錐形瓶中的50 ml等分試樣維持在無菌條件、26℃下，使用180 rpm的恆定軌道攪拌。在相同條件下培育BY-2野生型細胞作為對照。培育培養基含有基礎MSMO培養基(pH 5.8)，其以蔗糖(3%，w/v)以及1 mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸補充。以7天間隔藉由將5%(v/v)細胞轉移至50 ml新鮮培養基而完成繼代培養。
藉由菸草cv.BY-2細胞的農桿菌媒介之轉形接著以抗生素篩選與之後分離經轉形癒傷組織產生基因轉殖懸浮培養物。藉由免疫學分析(Dotblot及ELISA)依據癒傷組織的抗體生產來篩選癒傷組織，而最佳候選者用於懸浮培養物建立(=細胞株MTED#18)。MTED#18母培養物的特定M12抗體生產為13 μg/g細胞鮮重(10 mg/L)。流式細胞分析揭示，基因轉殖培養物由兩個僅有24%存活群體會生產螢光標記蛋白質DsRed的次群體所組成。
關於原生質體製備，藉由將2%(v/v)轉移至50 ml新鮮培養基來對懸浮細胞培養物進行繼代培養。
B.原生質體製備及細胞壁再生
參見實施例1，C段。
通常，所述程序產生每毫升5x105個原生質體，平均62.2%存活基因轉殖原生質體百分比。
C.流式細胞分析與分選
如實施例1，D段中所述完成儀器設定以及預先安排。
以單細胞模式將單獨強烈螢光的植物原生質體(全部分選原生質體的1至2%)分選至細胞沉積裝置(亦即微量滴定盤)中。每孔1個原生質體，與第二次圈選標準相同，分選至填充含有約100個野生型原生質體作為餵食的50 μl無菌8p2c再生培養基的96孔微量滴定盤。將96孔盤以無菌蓋闔上並使用膠帶密封。回收原生質體的確切數目是藉由倒立式螢光顯微鏡測定。以單細胞模式流式細胞分選原生質體會使得平盤效率為約20%孔含有每孔1個完整且存活的原生質體。
D.以低密度再生經分選的原生質體
單獨經分選原生質體的再生是如實施例1，E段中所述進行。
以單細胞模式流式細胞分選原生質體會使得平盤效率為約20%孔含有僅1個分選的原生質體。50%的這些單獨原生質體開始增殖且可用於建立懸浮培養物。
E.分析單株基因轉殖懸浮培養物
為測定衍生自單獨原生質體之經改良懸浮培養物之螢光原生質體的百分比，如先前所述進行流式細胞分析(實施例1，D段)。M12抗體積聚水平是藉由酵素連結免疫分析(ELISA)來測定。因此，將懸浮細胞離心(850 g，5分鐘)、再懸浮於3倍體積萃取緩衝液(PBS pH 6，5 mM 2-巰基乙醇、5 mM EDTA、10 mM抗壞血酸)並藉由超音波破壞。透過另一個離心步驟(20分鐘，16 000 g)由細胞碎片分離萃取物並用於分析。由於所選設定(Fc捕捉及LC偵測)之故，僅能偵測到完全組裝抗體。
在1輪FACS後，單株懸浮培養物就兩個重組蛋白質方面顯示明顯增進的積聚水平：當與母懸浮培養物相比時，DsRed螢光細胞為3.7倍增富百分比(90%)，而M12抗體增加11倍(145 μg/g鮮重或以mg/L水平為9.3倍(93 mg/L))。
F.重複懸浮培養物改良
為了進一步增進並穩定基因轉殖單株懸浮培養物的重組蛋白質生產率，可重複步驟B至E。對原生質體產生分選以及再生應用先前所述的相同條件。
第2輪分選使得抗體積聚更為增加：182 μg/g鮮重或113 mg/L，相較於母培養物增加14倍與11.3倍。
最佳生產第2代單株的第三輪分選與第三代單株培養物產生類似的積聚水平，表示達到最大水平。
G.優異生產單株培養物就目標蛋白質生產率方面的穩 定性
FACS衍生的單株細胞株的穩定性係例如針對3個單株來進行研究。以7天週期繼代培養單株細胞株(參見實施例1，A段)，同時以2個月間隔在每當繼代培養後的第5天測定兩種重組目標蛋白質。就第1代單株培養物而言，在12個月期間證明這些培養物仍然生產大量與穩定的M12抗體/g鮮重。僅在雙月取樣間隔觀察到抗體水平略有變化(由細胞培育改變所致)。
第2代單株的分析藉由顯示兩種重組蛋白質M12抗體與DsRed與其衍生而來的第1代單株培養物相比有類似或略為增加的積聚水平證明細胞株穩定性。在所有分析的第2代單株培養物中顯示目標蛋白質生產相較於第1代單株培養物更為穩定(在雙月取樣間隔的變異較少)。在12個月期間，3個分析單株培養物中的兩者被發現就其DsRed螢光細胞在總群體中的百分比以及M12抗體積聚皆為高度穩定。
第1圖為一概圖，說明用於製備如本文所述之基因轉殖MTED BY-2株的表現匣結構。具體而言，第1圖說明用於轉形BY-2懸浮細胞之pTRAkc：：MTED植物表現載體的T-DNA。
LB與RB：T-DNA的左邊界與右邊界；Pnos與 pAnos：胭脂胺酸合成酶基因的啟動子與終止子；nptII：新黴素磷酸轉移酶基因的編碼序列；SAR：骨架附接區；P35SS與pA35S：花椰菜嵌紋病毒(CaMV)35S基因之具有兩個增強子的啟動子與終止子；CHS：洋芫荽之查酮合成酶的5’-UTR；SP：訊號肽；HC與LC：M12抗體之重鏈與輕鏈的編碼序列：TL：菸草蝕紋病毒(TEV)的5’-UTR；TP：轉達肽(transit peptide)；DsRed：圓盤海葵屬紅色螢光蛋白質的編碼序列。

Claims (7)

  1. 一種由植物細胞的異源性群體產生單株植物細胞株的方法，其包含下列步驟：(a)提供植物細胞的異源性群體；(b)由該植物細胞的異源性群體製備原生質體；(c)藉由將原生質體的製備物進行流式細胞分選而分離單一原生質體；(d)於餵食細胞材料存在的情況下，藉由共培育分離的單一經轉形原生質體再生直到形成小聚落；(e)將小聚落自餵食細胞材料移去並培育小聚落直到形成單株植物細胞株。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含使步驟(e)中所得到的單株植物細胞株再生成完整可育性植株。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中步驟(b)中所製備的原生質體經轉形，並且能夠(i)生產螢光標記蛋白質或多肽、(ii)生產所要產物，及/或(iii)於選擇劑存在的情況下存活下來。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該所要產物係選自由異源性蛋白質或多肽、次級代謝物及用於診斷或分析的標記所組成之群組。
  5. 如前述申請專利範圍中任一項之方法，其中步驟(c)中的單一原生質體的分離係藉由將原生質體進行FACS。
  6. 一種單株植物細胞株，其係藉由進行如申請專利範圍第1至5項中任一項所定義之方法而可獲得或獲得。
  7. 一種完整可育性植株，其係藉由進行如申請專利範圍第2至5項中任一項所定義之方法而可獲得或獲得。
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