JP5933700B2 - 単クローン性植物細胞系を生成させるための方法 - Google Patents
単クローン性植物細胞系を生成させるための方法 Download PDFInfo
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Description
(i)例えば関心対象の異種配列に機能的に連結されたプロモーターを含む「裸の」DNAの一時的発現
(ii)複製ベクターなどの発現ベクターからの発現。一般的に言えば、当業者は、一時的組換え遺伝子発現のために、ベクターを構築することができ、プロトコルを設計することができる。必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列をはじめとする適切な調節配列を含む好適なベクターを選択することができる、または構築することができる。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992を参照のこと。
(iii)非組み込みベクターからの発現
(i)植物細胞の出発集団に含まれる標的細胞に、異種タンパク質または所望の産物をコードするヌクレオチド配列を含む第1核酸を安定して導入するステップ;
(ii)前記植物懸濁培養物から提供される植物懸濁細胞からプロトプラストを調製するステップであって、プロトプラストがさらに形質転換され、(i)蛍光マーカータンパク質またはポリペプチドを産生することができ、そして(ii)選択剤の存在下で生存することができる、ステップ;
(iii)プロトプラストの調製物をFACSに供することによって、単一形質転換プロトプラストを分離するステップ;
(iv)分離された単一形質転換プロトプラストを、フィーダー細胞材料の存在下での共培養によって微小コロニーまたはミクロカルスが形成されるまで再生するステップ;
(v)(i)微小コロニーまたはミクロカルスを固体培養培地に移し、(ii)その微小コロニーまたはミクロカルスを少なくとも1つの選択剤の存在下で、トランスジェニックカルス組織が形成されるまで培養することによって、単クローン性カルス組織を生成させるステップ;
(vi)カルス組織を液体培養培地に移すことによってトランスジェニック単クローン性植物細胞系を確立するステップ;および
(vii)適切な培養条件を提供することによって、異種タンパク質または所望の産物の核酸から発現を引き起こすまたは許容するステップ、および
(viii)蓄積された異種タンパク質または所望の産物を産生細胞から収集するステップ
を含む方法が提供される。
実施例1
形質転換事象後のエリート産生単クローン性細胞系の急速な生成
A.タバコ細胞培養物
タバコ(Nicotiana tabacum)栽培品種Bright Yellow 2(BY−2)の野生型懸濁培養物を暗所にて無菌条件下、100mlのガラス製三角フラスコ中50mlアリコートとして26℃で一定して180rpmでオービタル撹拌しながら維持した。培養培地は、スクロース(3%、w/v)および1mg/lの2,4−ジクロロフェノキシ酢酸を追加した基本MSMO培地(pH5.8)を含んでいた。5%(v/v)の細胞を50mlの新鮮培地に移すことによって7日間隔で継代培養を実施した。
BY−2野生型懸濁細胞をセクションAで記載したように培養した。並行して、同じベクター上にいくつかの発現カセットを含む構築物を有するトランスジェニックアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)(図1を参照のこと)を、適切な抗生物質を含むYEB培地(0.5%普通ブイヨン、0.1%酵母エキス、0.5%ペプトン、0.5%スクロース、2mMのMgSO4、pH7.4)中、オービタルシェーカー上で、160rpmおよび27℃にてOD600nmが1になるまで培養した。継代培養の3日後、3mlのBY−2野生型細胞、200nMのアセトシリンゴンおよび150μlのアグロバクテリア(OD600nm=1)をペトリ皿中暗所にて共培養した。室温での共培養の3日後、200mg/lのセフォタキシムを追加した10mlのBY−2培地中にBY−2細胞を再懸濁させた。細胞を50mlの無菌管に移し、遠心分離(850g、5分)によって2回洗浄して、アグロバクテリアを除去した。細胞ペレットを再懸濁させた後、形質転換されたBY−2細胞の培養に、100mlの振とうフラスコ中、セフォタキシムおよび好適な選択剤を追加した20〜50mlのBY−2培地を用いる(180rpm、26℃)。適切な懸濁液の再生後(圧縮細胞量約50〜60%)、細胞をプロトプラスト調製のために継代培養することができる(セクションCを参照のこと)。この方法は、その後のプロトプラスト生成(C)およびフローサイトメトリーによる選別(D)に使用可能なトランスジェニック懸濁培養物を確立するために14〜21日を要する。
活発に成長する細胞培養物を、850gで5分間、無菌円錐形プラスチック遠心管中で遠心分離することによって細胞を沈降させるために継代培養の3日後に使用した。上清を除去し、1%(w/v)セルラーゼおよび0.3%(w/v)マセロザイムを含む10mlのPNT消化液(3.6g/lのKao Michayluk塩基性塩(Duchefa)、0.4Mスクロース、0.5mg/lのNAA、1mg/lのBAP)中に細胞を再懸濁させた。細胞−酵素懸濁液を、6cmペトリ皿中に入れ、粘着テープで密封した。消化を一晩(16〜18時間)、26℃にて暗所で穏やかに撹拌しながら実施した。プロトプラストは、100μmナイロンメッシュでの濾過後、遠心分離(104gで8分間)にかけると表面へ浮上した。ペレットおよび培地界面を除去し、プロトプラストをPNT溶液で2回洗浄した。プロトプラストをW5溶液(154mMのNaCl、125mMのCaCl2、5mMのKC1、5mMのグルコース、pH5.6)中に再懸濁させ、76gで2分間遠心分離することによって沈降させた。プロトプラストを穏やかに再懸濁させた後、修飾再生培地8p2c(以下の第1表を参照のこと;8p培地から最適化)中で培養した。通常、記載された手順によって、1mlあたり7×105プロトプラストが得られ、平均74%の生存プロトプラストであった。
・ Kao und Michayluk塩基性塩混合物(Duchefa)
・ Kao und Michaylukビタミン溶液(Sigma)
0.02mg/lのp−アミノ安息香酸
2mg/lのL−アスコルビン酸
0.01mg/lのビオチン
1mg/lのD−パントテン酸カルシウム
1mg/lの塩化コリン
0.4mg/lの葉酸
100mg/lのミオイノシトール
1mg/lのニコチンアミド
1mg/lのピリドキシンHCl
0.2mg/lのリボフラビン
1mg/lのチアミンHCl
0.01mg/lのビタミンA
0.02mg/lのビタミンB12
0.01mg/lのビタミンD
・ 有機酸(NH4OHでpH5.5)
20mg/lのピルビン酸ナトリウム
40mg/lのリンゴ酸
40mg/lのクエン酸
40mg/lのフマル酸
・ 糖および糖アルコール
0.25g/lのスクロース
250mg/lのマンノース
68.4g/lのグルコース
250mg/lのラムノース
250mg/lのフルクトース
250mg/lのセロビオース
250mg/lのリボース
250mg/lのソルビトール
250mg/lのキシロース
250mg/lのマンニトール
・ ホルモン
0.2mg/lの2.4−D
0.5mg/lのゼアチン
1.0mg/lのNAA
・ 2%(v/v)のココナツ水
・ 500mg/lのカザミノ酸
488nm/635nmアルゴンイオンレーザーを有するFACS Vantage(DIVA option、BD Bioscience)装置をトランスジェニック植物プロトプラストの選別のために使用した。加圧滅菌および0.22μmフィルターを通過させることによって、シース液であるリン酸緩衝生理食塩水(PBS pH7.4)を殺菌した。選別前に、無菌シース液を通過させることによって、サンプル管から残留エタノールを除去した。商業規格自動蛍光校正粒子を使用して、サイトメーターシステム/選別設定を調整した。フローソーターを488nmにて175mWのレーザー出力で操作した。選別前に、プロトプラスト培養物試料の前方光散乱、側方光散乱および蛍光について集められたシグナルに基づいて電子選別ウィンドウを配置して、強蛍光集団を規定した。DIVAソフトウェア(BD Bioscience)を用いてシグナルをドットプロットとして表示した。ゲートを、第1に生存プロトプラストの集団の周りに、そして第2に、第1ゲートに基づいて強蛍光プロトプラストの集団の周りに作成することによって、選別領域を規定した。4〜6psiのシステムシース圧、約7kHzの低下周波数および約1.000事象/秒の試料流速で200μmフローチップにより選別を実施した。
高蛍光単一プロトプラストの選別前に、96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルを、約100タバコ(N. tabacum)栽培品種BY−2野生型プロトプラストをフィーダー細胞として含む50μlの無菌8p2c再生培地で満たした。単一選別トランスジェニックプロトプラストを様々な時点での逆蛍光顕微鏡法によって分析して、選別過程後の単細胞堆積を検証し、さらにトランスジェニックプロトプラストの増殖および微小コロニー形成(選別後14〜20日)もモニターした。96ウェルプレート中の選別されたプロトプラストの培養を26℃〜27℃の暗所で実施し、プレートを無菌蓋で閉じ、粘着テープで密閉した。
単一FACS選択プロトプラストの単クローン性懸濁培養物への信頼性の高い再生を可能にする手順が開発された。単一プロトプラストは選別後に再生しなければならないので、選別された単一プロトプラストの再生および増殖を支援するためにフィーダー細胞が必要とされる。フィーダープロトプラストは選別された蛍光標的プロトプラストと一時的に共培養されるので、単クローン性培養物の再生中にフィーダープロトプラストの残存を排除することが必須である。
単クローン性懸濁培養物をまず高蛍光細胞のそれらのパーセンテージに関して分析した。したがって、プロトプラストをセクションCで記載されたようにして調製した。蛍光プロトプラストの一部をフローサイトメトリーで測定するため、FACS Calibur Instrument(BD Bioscience)を使用した。BY−2野生型プロトプラストに基づいて、設定パラメータ(たとえば、光の増幅および蛍光散乱増倍管)を調節し、試料を測定した。生存集団のゲーティング後、蛍光チャンネル中のこの集団の分布を使用して閾値を設定し、これによって、野生型自己蛍光に起因する全てのバックグラウンドシグナルを排除した。この閾値にしたがって、単一プロトプラストから誘導される改善されたプロトプラスト培養物内の蛍光プロトプラストのパーセンテージを算出した。組換えDsRedタンパク質を産生する単クローン性懸濁培養物のフローサイトメトリーによる分析は、類似した強力な蛍光強度の均一に分布した細胞を示した(狭い蛍光ピーク)。DsRed蛍光細胞部分の計算によって、78〜88%強蛍光細胞のパーセンテージが得られた。
不均一なトランスジェニック懸濁培養物からの単クローン性細胞系の生成
A.タバコ細胞培養物
ER遅延ヒトフルサイズIgG1抗体M12およびプラスチド標的蛍光タンパク質DsRedを産生するトランスジェニックタバコ栽培品種Bright Yellow 2(BY−2)懸濁培養物MTED#18を、暗所で無菌条件下、100mlのガラス製三角フラスコ中50mlアリコートとして26℃にて180rpmの一定したオービタル撹拌をしながら維持した。BY−2野生型細胞を対照と同じ条件下で培養した。培養培地は、スクロース(3%、w/v)および1mg/lの2,4−ジクロロフェノキシ酢酸を追加したpH5.8の塩基性MSMO培地を含んでいた。5%(v/v)の細胞を50mlの新鮮培地中に移すことによって7日間隔で継代培養を実施した。
実施例1、セクションCを参照のこと。
装置設定および下準備を実施例1、セクションDで記載されているようにして実施した。
単一選別プロトプラストの再生を実施例1、セクションEで記載したように実施した。
単一プロトプラストから誘導される改善された懸濁培養物における蛍光プロトプラストのパーセンテージを測定するために、フローサイトメトリーによる分析を先に記載したようにして実施した(実験1、セクションD)。M12抗体蓄積レベルを酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)によって測定した。したがって、懸濁細胞を遠心分離し(850g、5分)、3容積の抽出緩衝液(PBS pH6、5mMの2−メルカプトエタノール、5mMのEDTA、10mMのアスコルビン酸)中に再懸濁させ、超音波処理によって破壊した。抽出物を細胞片から遠心分離ステップ(20分、16000g)によって分離し、分析に使用した。選択された設定(Fc捕獲およびLC検出)のために、完全に構築された抗体だけが検出された。
トランスジェニック単クローン性懸濁培養物の組換えタンパク質生産性をさらに増大させ、安定化させるために、ステップB〜Eを繰り返すことができる。先に記載したのと同じプロトプラスト生成選別および再生の条件を適用した。
FACSで誘導される単クローン性細胞系の安定性を3つの単クローン性系の例について調査した。単クローン性細胞系を7日サイクルで継代培養し(実施例1、セクションAを参照)、一方、両組換え標的タンパク質を2か月間隔で、常に継代培養後第5日に測定した。12か月にわたって、単クローン性培養物の第1世代について、これらの培養が、新鮮量1グラムあたり高くかつ安定した量のM12抗体を依然として産生することが示された。隔月のサンプリング間隔で抗体レベルのごくわずかな変動(細胞培養の変動に起因する)が観察された。
Claims (5)
- 植物細胞の不均一集団から単クローン性植物細胞系を生成するための方法であって、次のステップ:
(a)植物細胞の不均一集団を提供するステップ;
(b)植物細胞の前記不均一集団からプロトプラストを調製するステップ;
(c)液体培地中のフィーダー細胞材料を含む細胞堆積装置を提供するステップ;
(d)プロトプラストの調製物をフローサイトメトリーによる選別に供することによって単一プロトプラストを分離するステップ;
(e)単一プロトプラストを、前記細胞堆積装置のフィーダー細胞材料を含む液体培地に分取するステップ;
(f)前記フィーダー細胞材料の存在下での共培養によって微小コロニーが形成されるまで、分離された単一プロトプラストを再生するステップ;
(g)微小コロニーをフィーダー細胞材料から除去し、単クローン性植物細胞系が形成されるまで微小コロニーを培養するステップ
を含む前記方法。 - ステップ(g)で得られる単クローン性植物細胞系の稔性の全植物への再生を更に含む、請求項1記載の方法。
- ステップ(b)で調製されるプロトプラストが、形質転換され、(i)蛍光マーカータンパク質またはポリペプチドを産生することができる、(ii)所望の産物を産生することができる、および/または(iii)選択剤の存在下で生存することができる、請求項1または2記載の方法。
- 所望の産物が、異種タンパク質またはポリペプチド、二次代謝産物、および診断または分析の目的のためのマーカーからなる群から選択される、請求項3記載の方法。
- ステップ(d)における単一プロトプラストの分離が、プロトプラストをFACSに供することによって実施される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
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