JPH0851977A - ブプレウルム属植物の細胞への外来遺伝子の導入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 植物、特にブプレウルム（Ｂｕｐｌｅｕｒｕ
ｍ）属に属する植物細胞内に外来遺伝子をパーティクル
ガンを使用して導入するに際し、被処理細胞を予め飢餓
処理することを特徴とする遺伝子導入方法。 【効果】 導入された外来遺伝子の宿主細胞内での発現
効率が高められる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ブプレウルム（Ｂｕｐ
ｌｅｕｒｕｍ）属植物の細胞への外来遺伝子の導入方法
に関する。より具体的には、本発明はパーティクルガン
法による外来遺伝子の一定の導入効率を維持したまま、
導入された遺伝子発現効率を向上させる改良方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】植物細胞へ外来遺伝子を直接導入するの
にパーティクルガン、すなわち、圧縮空気圧式パーティ
クルガン（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇ
ｕｎ）装置が使用できることは当該技術分野で周知であ
る（例えば、Ｋｏｄａｍａ ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２、１４７−１５２ページ、１９
９３、参照）。例えば、アグロバクテリウム・リゾゲネ
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ
ｓ）を遺伝子の導入媒体として使用する間接導入方法
は、双子葉植物には適用できるが裸子植物や単子葉植物
には適用できないことなど、適用可能な植物種を選ぶの
に対し、パーティクルガンを使用する外来遺伝子の特定
細胞への導入方法（以下、単に「パーティクルガン法」
ということもある）は、植物種を始め、細胞の起源に左
右されない点で注目を集めている。

【０００３】そこで、既に、外来遺伝子の導入にパーテ
ィクルガン法を利用する各種試みがなされている。上述
の学術論文の他にも、例えば、タバコＢＹ−２細胞にパ
ーティクルガン法を適用した場合、遺伝子（ＤＮＡ）を
まぶした金粒子の細胞核内への導入効率と導入された遺
伝子の発現頻度ともある程度満足できる結果が得られて
いる報告もある（例えば、Ｍｏｒｉｋａｗａら、Ａｐｐ
ｌ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３
１、３２０−３２２ページ、１９８９、参照）。

【０００４】しかし、細胞の起源により、遺伝子の前記
導入効率またはその発現効率のいずれか、特に発現効率
について満足できない場合がある。このような外来遺伝
子の発現効率に影響を及ぼす要因として、培地の浸透圧
（高張）処理などの細胞に対する生理条件が挙げられて
いるが、パーティクルガン処理に際して、被処理細胞を
浸透圧調節だけでは、必ずしも十分な成果が得られてい
ない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、パーテ
ィクルガン法で外来遺伝子を被処理細胞核内へ導入する
際に、その導入された遺伝子の発現効率の低い細胞に対
し、かかる発現効率をも高める手段を提供することが望
まれるであろう。

【０００６】従って、本発明の目的は、パーティクルガ
ン法による一定細胞への外来遺伝子の導入効率を維持し
たまま、導入された遺伝子の発現効率を高めることので
きる、パーティクルガン法における改良方法を提供する
ことにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ブプレウ
ルム属植物について前記課題を解決すべく、細胞の処理
条件を検討してきたところ、被処理細胞の処理条件のう
ち、処理培地の、特に栄養条件を制限することによっ
て、トランスジェニック細胞における外来遺伝子の高発
現率が達成できることを見い出した。

【０００８】従って、本発明によれば、パーティクルガ
ンを使用してブプレウルム属植物の細胞内に外来遺伝子
を導入するに際し、被処理細胞を予め飢餓処理すること
を特徴とする遺伝子の導入方法が提供される。

【０００９】本発明で使用できるパーティクルガンは、
型式を問うことなく、既知のパーティクルガン装置はも
とより、それらの改良した任意の装置が使用できる。例
えば、本発明者らによって開発された、図１に記載され
るような圧縮空気圧式装置を好適に使用することができ
る。

【００１０】本発明にいうブプレウルム（Ｂｕｐｌｅｕ
ｒｕｍ）属に属する植物の具体的なものとしては、根が
サイコ剤として使用されるミシマサイコ（Ｂｕｐｌｅｕ
ｒｕｍ ｆａｌｃａｔｕｍ Ｌ．）を始め、ブプレウル
ム・チャイニーズ（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ Ｃｈｉｎｅｓ
ｅ）ＤＣ．、ブプレウルム・コマロビアナム（Ｂｕｐｌ
ｅｕｒｕｍ Ｋｏｍａｒｏｖｉａｎｕｍ）Ｌｉｎｃ
ｚ．、ブプレウルム・スコルカツォネラフオリウム（Ｂ
ｕｐｌｅｕｒｕｍ ｓｃｏｒｚｏｎｅｒａｅｆｏｌｉｕ
ｍ）ｗｉｌｌｄ．などが挙げられる。

【００１１】以下、本発明をミシマサイコを参照しなが
ら説明するが、当業者であれば、以下の説明から他のブ
プレウルム属植物の細胞についてもミシマサイコと同様
に本発明の効果を確認できるであろう。

【００１２】本発明では、上述のような細胞がパーティ
クルガンによる外来遺伝子の導入に先立って、飢餓処理
される。ミシマサイコの細胞または組織は、通常の植物
の細胞、組織の培養に使用できる培地を若干改変して培
養されている。このような培地には、多量必須元素と微
量必須元素、さらに水、無機塩および糖類、必要により
ビタミンなどの有機物、オーキシン、サイトカイニンな
どの植物成長調節物質などが含められる。より具体的
に、リンスマイヤー・スクーグ（Ｌｉｎｓｍｅｉｅｒ−
Ｓｋｏｏｇ）培地（ＬＳ培地）を利用する場合を例にと
ると、ショ糖が３重量％、２,４−Ｄが０.２ｍｇ／ｌと
なるように含められたＬＳ培地（ｐＨ５.８）を標準培
地として使用する。

【００１３】ミシマサイコの被処理細胞は、適当な植物
体切片から誘導したカルスを上記標準培地で継代培養
し、懸濁培養細胞を得て、本発明による飢餓処理に付す
ることによって調製することができる。飢餓処理の培地
条件は、細胞の種類および通常の継代培養に使用する培
地組成によってある程度変動するので限定されるもので
ない。ところで、ミシマサイコの細胞に対し、上記標準
培地を使用する場合には、その培地成分から、窒素源、
炭素源、リン酸およびカリのいずれか一種、またはそれ
らの任意の組み合わせを除去した培地を使用する。

【００１４】ミシマサイコの場合、窒素源、炭素源、リ
ン酸およびカリを同時に欠く培地での飢餓処理が、特に
好ましい。処理すべき植物細胞に関し、それぞれ最適の
飢餓処理条件の選定は後述するミシマサイコについての
具体例を参考すれば、当業者には容易であろう。従っ
て、本発明にいう飢餓処理は、標準培地から窒素源、炭
素源、リン酸およびカリのすべてを除去した培地による
処理に限定されないものでなく、標準培地から何等かの
成分を除去することにより本発明の目的が達成できるす
べての処理条件が包含されることが理解できるであろ
う。

【００１５】本発明により被処理細胞に導入される外来
遺伝子は、その細胞内への導入および発現が有意な作用
効果を奏するものであれば遺伝子の機能を問うものでな
いが、例えば、有用産物をコードする遺伝子、そのよう
な遺伝子の発現を調節する遺伝子などが挙げられる。以
下に説明する遺伝子の導入例は、本発明の効果を例証す
るものであって、本発明にいう外来遺伝子がこれらに限
定されるものでない。

【００１６】従って、本明細書では、遺伝子の導入効率
および発現効率を容易に確認することができるβ−グル
クロニダーゼ（ＧＵＳ：ＥＣ ３.２.１.３１.）をコー
ドする遺伝子の導入例について説明する。本発明方法に
より導入する遺伝子は、それらが導入される宿主細胞内
で自律増殖できるか、またはゲノムへ安定に組み込まれ
る状態のものを使用するのが好ましい。ミシマサイコに
由来する細胞へのＧＵＳ遺伝子を導入するには、その遺
伝子を有するベクターの状態で導入する。このようなベ
クターとしては、市販のプラスミドｐＢＩ ２２１（Ｃ
ｌｏｎ ｔｅｃｈ Ｃｏ．）を使用するのが好都合であ
る。このプラスミドでは、ＧＵＳ遺伝子はカリフラワー
モザイクウイルス３５Ｓプロモーターとノパリン合成酵
素のターミネーターの制御下にある。

【００１７】このような外来遺伝子のパーティクルガン
法による導入は、例えば、図７に示すような装置を使用
して、Ｉｉｄａ ら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．（１９９０）８０、８１３−８１６ページに記載の
方法に従い、濾紙上に均一に広げた飢餓処理細胞に、導
入すべき遺伝子ＤＮＡを塗布した金粒子を導入すること
によって実施する。こうして、外来の遺伝子が導入され
た細胞を適当な培地で後培養し、導入された遺伝子の発
現をその産物のアッセイによって、目的の遺伝子の導入
効率および発現効率を評価することができる。

【００１８】

【実施例】以下、本発明を具体例によってさらに詳細に
説明する。

【００１９】懸濁培養細胞の調製 無菌的に、発芽、生育させた、ミシマサイコ（Ｂｕｐｌ
ｅｕｒｕｍ ｆａｌｃａｔｕｍ Ｌ．）の葉切片を２,
４−Ｄ １ｍｇ／ｌ、カイネチン ０．１ｍｇ／ｌを含
むＬＳ寒天培地上で培養して、カルス誘導を行ない、
２,４−Ｄ ０.２ｍｇ／ｌを含むＬＳ液体培地（標準培
地）に懸濁し、暗所下に１３０ｒｐｍ、２６℃で振とう
培養した。この液体懸濁培養細胞を１週間毎に１／１０
量を新たな培地に移して継代を行なった。こうして、継
代培養した４日目のものを飢餓処理に供する。

【００２０】 （ＬＳ寒天培地組成） （ｇ／ｌ） ＮＨ₄ＮＯ₃ １６５０ ＫＨ₂ＰＯ₄ １７０ ＮＨ₄ＮＯ₃ ６００ ＫＮＯ₃ １９００ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ４４０ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３７０ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２７.８ Ｎａ₂ＥＤＴＡ ３７.３ Ｈ₃ＢＯ₃ ６.２ ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ ２２.３ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ８.６ Ｎａ₂ＭｏＯ₂・２Ｈ₂Ｏ ０.２５ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０.０２５ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ０.０２５ ＫＩ ０.８３ ミオイノシトール １００ チアミン−ＨＣｌ ０.４ （以上単位ｍｇ／ｌ） ショ糖 ３０ｇ／ｌ ０.８パーセント寒天 （ｐＨ５.８に調節）飢餓処理 飢餓処理には、上記標準培地から窒素源（ＮＨ₄ＮＯ₃お
よびＫＮＯ₃）を除いた培地（以下、「−Ｎ」とい
う）、リン酸源（ＫＨ₂ＰＯ₄）を除いた培地（以下、
［−Ｐ］という）、炭素源（ショ糖）を除いた培地（以
下、［−Ｃ］という）、窒素源およびリン酸源（ＮＨ₄
ＮＯ₃、ＫＮＯ₃およびＫＨ₂ＰＯ₄）を除いた培地（以
下、「−ＮＰ」という）、窒素源、リン酸源および炭素
（ＮＨ₄ＮＯ₃、ＫＮＯ₃、ＫＨ₂ＰＯ₄およびショ糖）を
除いた培地（以下、［−ＮＰＣ］という）を用いた。お
のおの培地でのカリの欠如分はＫＣｌで補填した。ま
た、一部の実験は、ＫＣｌで補填してない培地それぞれ
（「−ＮＫ」、「−ＰＫ」、「−ＣＫ」、「−ＮＰ
Ｋ」、「−ＮＰＣＫ」という）を用いた。

【００２１】懸濁培養細胞の処理は、継代後４日目の懸
濁培養細胞を孔径５０μｍのナイロンメッシュを用いて
濾過し、生重量２ｇの細胞を飢餓処理培地あるいは標準
培地（比較）２０ｍｌに移植して、振とうあるいは静置
の条件下、２６℃にて１〜５日間培養した。

【００２２】遺伝子の導入 上記の培養条件下（２ｇ／２０ｍｌ）で培養した懸濁培
養細胞の１ｍｌを遺伝子導入に用いた。一部の実験で
は、各種の培地から細胞をメッシュで濾過して集め、生
重量（１００ｍｇ）を揃えて遺伝子導入を行った。

【００２３】パーティルガンは、図７に示すような圧縮
空気式装置を使用し、（Ｉｉｄａ（１９９０）の方法を
簡単に説明（Ｉｉｄａ ら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇ
ｅｎｅｔ．（１９９０）８０、８１３−８１６ページ、
参照）、濾紙上に均一に広げた細胞（細胞層直径３.５
ｃｍ）にプラスミドｐＢＩ ２２１をコーティングした
金粒子を導入した。使用した材料および条件は次のとお
りであった。

【００２４】金粒子・・・・・真球状、平均直径１．１
μｍ（（株）徳力本店製）； 金粒子量・・・・０.２ｍｇ／ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ； ＤＮＡ量・・・・４μｇ／ｍｇ Ａｕ； 加速圧力・・・・２００ｋｇ／ｃｍ²； ショット回数・・１回； 試料−ストッパー間の距離・・・１０ｃｍ； 減圧・・・・・・６０ｍｍＨｇＧＵＳアッセイ ＧＵＳ遺伝子の発現はＸ−Ｇｌｕｃを基質として組織化
学的方法により検出した。遺伝子導入後、細胞を濾紙ご
と、培地２ｍｌで湿らせた２枚の濾紙上に移し、ペトリ
シャーレで、暗所で２６℃、２４時間培養した。Ｘ−Ｇ
ｌｕｃを含む反応液を添加し、暗所下で、３７℃、２４
時間インキュベートし、顕微鏡下でＧＵＳ遺伝子を発現
している細胞塊からなるブルースポットの数を計測した
（ブルースポットはその大小に関わらず１つとみなし
た）。

【００２５】導入された金粒子の細胞内における局在部
位の観察 細胞内に導入された金粒子の位置の決定は、Ｙａｍａｓ
ｈｉｔａ ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９
１）９７、８２９−８３１ページの方法に従った。遺伝
子導入直後の細胞を培地２〜３ｍｌで１５ｍｌ遠心管に
回収し、遠心により沈殿させ、エタノール／酢酸（３：
１）で固定した（４℃、２４時間以上）。細胞をスライ
ドグラス上にとり、余分な固定液を濾紙で吸い取り、酢
酸オルセインを加え、カバーグラスをかけ染色した（室
温、２〜３分）。余分な染色液を除き、ワラップでカバ
ーグラスの周囲を封じて顕微鏡で観察した（Ｘ１００
０）。金粒子は黒い点として観察されるため、フォーカ
スを変えることにより、細胞内に金粒子が導入された位
置を決定した（１０００細胞以上）。

【００２６】結果 （１） 遺伝子導入前の飢餓処理の効果 ５種類の飢餓処理培地と標準培地で細胞を１日あるいは
３日間振とう培養し、遺伝子発現に及ぼす効果を検討し
た。結果を図１に示す。図１より、ＮＨ_４ＮＯ_３および
ＫＮＯ₃（−ＮＫ）、ＫＨ₂ＰＯ₄（−ＰＫ）、ＮＨ₄ＮＯ
₃、ＫＮＯ₃およびＫＨ₂ＰＯ₄（−ＮＰＫ）を除いた飢餓
培地ではＧＵＳの発現を示すブルースポットの数は、１
日、３日とも標準培地と殆ど変わらず、１０〜２０であ
ることがわかる。これに対し、ショ糖（−Ｃ）あるいは
ＮＨ₄ＮＯ₃、ＫＮＯ₃、ＫＨ₂ＰＯ₄、ショ糖（−ＮＰＣ
Ｋ）を除いた培地では１日処理により、標準培地の値の
２〜３倍に上昇した。３日処理では−Ｃ培地では１日処
理とは殆ど変わらなかったが、−ＮＰＣＫ培地では１日
目のそれよりさらに約４倍上昇した（標準培地での１０
倍以上）。このことから、窒素源、炭素源、リン酸源お
よびカリ源をすべて除いた培地での飢餓処理が遺伝子発
現（遺伝子導入と発現）に最も顕著な効果を示すことが
分かった。

【００２７】（２） 遺伝子導入後の培地の検討 飢餓処理培地（−ＮＰＣＫ）と標準培地で細胞を１日あ
るいは２日間振とう培養し、遺伝子導入後、−ＮＰＣＫ
培地あるいは標準培地に戻し、２４時間培養後にＧＵＳ
アッセイを行った。その結果を図２に示す。図２より、
−ＮＰＣＫ培地で１日間飢餓処理し、遺伝子導入後、標
準培地に戻すものでブルースポットは最も多く観察され
た（平均１００）。この結果は、他の組み合わせの約８
〜９倍高い値であった。２日間処理では遺伝子導入前後
いずれの培地で培養した場合でも、発現効率は低い値を
示した。以上のことより、遺伝子発現効率の上昇は遺伝
子導入前に−ＮＰＣＫ培地で処理し、導入後に標準培地
に戻すことにより、引き起こされることが示された。

【００２８】（３） 遺伝子導入前の培養方法の検討 前培養方法［振とう培養（ｔ）と静置培養（ｓ）］の検
討を行ったところ、１〜３日間標準培地での培養では両
者の間で遺伝子発現効率に顕著な差は見られず、ブルー
スポットの数は２０−４０であった（図３参照）。図３
より、−ＮＰＣＫ飢餓培地での１日培養でも、両者の間
で有為な差は見られなかったが、２日、３日の前培養に
おいては、振とう培養は静置培養よりも高い値を示し
た。すなわち、同じ−ＮＰＣＫ飢餓培地で処理する場合
でも、振とう培養は、静置培養より高い効果を示すこと
が分かった（２日では約３倍、３日では約１０倍のブル
ースポット数の上昇が見られた）。

【００２９】よって、以下の実験では、特記しない限
り、すべて振とう培養を行った。

【００３０】（４） 飢餓処理の効果の可逆性 −ＮＰＫ、−ＮＰＣＫ培地および標準培地で細胞を２４
時間振とう培養し、標準培地に戻して０.８、２２時間
後に遺伝子導入を行い、標準培地で２４時間培養後、Ｇ
ＵＳアッセイを行った。その結果を図４に示す。図４よ
り、−ＮＰＣＫ処理では飢餓処理直後に遺伝子発現効率
は最も高く、ブルースポットの数は平均１３０であっ
た。その後、標準培地に戻す時間が長くなるにつれ、ブ
ルースポット数は、次第に減少し、８時間で平均５０、
２２時間では１２の値を示した。それに対し、−ＮＰＫ
培地および標準培地で培養したものでは、いずれの条件
でもブルースポット数は約２０であった。このことよ
り、−ＮＰＣＫ飢餓処理による遺伝子発現効率の上昇の
効果は可逆的であることがわかった。すなわち、−ＮＰ
ＣＫ飢餓処理により引き起こされる細胞の生理状態の変
化は、細胞を標準培地に戻し、培養することで打ち消さ
れ、外来遺伝子の発現はもとの低い状態に戻るものと考
えられる。

【００３１】（５） 飢餓処理日数の外来遺伝子の発現
に及ぼす影響 ５種類の飢餓培地と標準培地で細胞を１−５日間振とう
培養し、遺伝子発現に及ぼす効果を検討した。結果を図
５に示す。図５より、−ＮＫ、−ＰＫ、−ＮＰＫ培地お
よび標準培地での遺伝子発現効率に差はなく、いずれの
処理日数でも、ブルースポット数は１０以下であった。
−Ｃと−ＮＰＣＫ培地で培養したものは、標準培地で培
養したものよりブルースポットは多く観察された。−Ｃ
培地では、１−４日の処理の間、殆ど同じ値（３０−７
０）を示したが、５日間の処理では減少した。−ＮＰＣ
Ｋ培地では、３−４日間で、最も多くのブルースポット
が観察された（約３００）が、２日、５日間では少し下
がり、約２００で、１日では効果は最も少なく、約４０
であった。以上のことより、−ＮＰＣＫ培地による３−
４日間の飢餓処理が最も効果的であることが分かった。

【００３２】（６） 遺伝子導入に用いる細胞の生重量
を揃えた場合の飢餓処理の効果 飢餓処理培地を用いる場合、細胞の増殖速度が異なるた
め、導入に用いる細胞量の影響を考慮する必要がある。
そこで、細胞の生重量（１００ｍｇ）を揃えた条件下
で、遺伝子導入を行った。結果を図６に示す。

【００３３】図６より、標準培地では、これまでと同様
にＧＵＳ遺伝子の発現効率は低く、ブルースポット数は
３４以下であった。それに対し、−ＮＰＣＫ培地では１
日処理で、対照での８５倍、２日間処理では対照の２３
倍であった。３日と４日目では、ブルースポット数は減
少し、それぞれ対照の３倍および同程度であった。以上
のことより、同量の細胞に遺伝子導入した場合、１から
２日間−ＮＰＣＫ培地による飢餓処理が最も効果的であ
ることが分かった。

【００３４】（７） 飢餓処理の金粒子の導入効率に及
ぼす効果 前述のように、外来遺伝子の発現は、−ＮＰＣＫ飢餓培
地による２日間の処理で、著しく上昇し、２日間の標準
培地での培養の２３倍、０日対照での１３２倍となっ
た。−ＮＰＣＫ培地による飢餓処理は、遺伝子導入効率
（金粒子の導入効率）に影響するのか、導入後の転写あ
るいは翻訳レベルに影響するのかを調べるため、２日間
−ＮＰＣＫ培地と標準培地で培養した場合の細胞内各部
位への金粒子の導入効率を調べた。結果を表１に示す。

【００３５】 表１ ミシマサイコの細胞を標準培地と飢餓培地でそれぞれ 培養した場合の遺伝子導入頻度と発現頻度の比較 頻度（総金粒子当りの％） 培地（培養期間：日） −ＮＰＣＫ ２ 標準 ２ 標準 ０ ＧＵＳ遺伝子の発現 0.11 0.005 ＜0.001 対照に対する割合 132 23 1 細胞への導入 9.4 9.8 11.1 核内への導入 2.8 2.1 1.7 細胞質への導入 6.6 7.7 9.4 各条件について１０００個を超える細胞をカウントし
た。

【００３６】細胞内への金粒子の導入効率は２日間飢餓
培地で培養したもの、２日間標準培地で培養したもの、
０日の対照、いずれもほぼ同じで、９.４％、９.８％、
１１.１％であった。核内への金粒子の導入効率（核内
への遺伝子の導入効率）もいずれの場合もほぼ同じで、
それぞれ２.８％、２.１％、１.７％であった（細胞質
内への導入効率もほぼ同じである）。すなわち、飢餓処
理は、導入される金粒子の細胞内における局在性には、
影響を及ぼさないことが分かった。このことから、−Ｎ
ＰＣＫ培地による飢餓処理で遺伝子発現効率が著しく上
昇することは、核内への遺伝子導入効率が高くなるので
はなく、遺伝子が核内に導入された後、細胞の生理状態
が変わり、遺伝子発現効率が上昇するものと結論づけら
れる。

【００３７】

【発明の効果】本発明は、ブプレウルム属に属する植物
の細胞に外来遺伝子を導入する改良されたパーティクル
ガン法を提供できる。従来法に比べて改良される点は、
導入遺伝子の発現頻度が顕著に増大することにある。

【図面の簡単な説明】

【図１】遺伝子導入前の飢餓処理培地の種類による外来
遺伝子の発現頻度を示すグラフである。

【図２】遺伝子導入後の生育培地の種類による外来遺伝
子の発現に対する影響を示すグラフである。

【図３】遺伝子導入前の飢餓処理における振とう培養と
静置培養の外来遺伝子発現に対する影響を示すグラフで
ある。

【図４】外来遺伝子発現に対する飢餓処理効果の可逆性
を評価する実験結果を示すグラフである。

【図５】外来遺伝子発現に対する飢餓処理日数の影響を
示すグラフである。

【図６】遺伝子導入に使用する細胞の生重量を揃えた場
合の飢餓処理の効果を示すグラフである。

【図７】本発明で使用するパーティクルガン装置の構成
図である。

【符号の説明】

１・・・・ストッパー ２・・・・試料細胞 ３・・・・プラスチックプロジェクタイル ４・・・・金粒子 ５・・・・空気室 ６・・・・プランジャーポンプ ９・・・・トリガー １１・・・バルブＡ １３・・・バルブＢ １５・・・空気取込み口

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 パーティクルガンを使用してブプレウル
   ム（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ）属に属する植物の細胞内に外
   来遺伝子を導入する方法であって、 被処理細胞を予め飢餓処理したことを特徴とする遺伝子
   の導入方法。