JPH03108478A - 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 - Google Patents
植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は組換え分子、その調製法、植物細胞へのその導
入法、およびゲノム中に外来ＤＮＡ配列を含んでいる植
物細胞またはその植物に関する。
入法、およびゲノム中に外来ＤＮＡ配列を含んでいる植
物細胞またはその植物に関する。
更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で発現さ
れるＤＮＡ配列に関する。本発明に係る組換えＤＮＡ分
子は、植物の成長、栄養物としてのその品質の改良、ま
たは有用な代謝物（例えばアルカロイドあるいはステロ
イドの前駆体）の生産、に有用なアミノ酸やポリペプチ
ドの如き生産物を暗号化している配列を有することをそ
の特徴としている。
れるＤＮＡ配列に関する。本発明に係る組換えＤＮＡ分
子は、植物の成長、栄養物としてのその品質の改良、ま
たは有用な代謝物（例えばアルカロイドあるいはステロ
イドの前駆体）の生産、に有用なアミノ酸やポリペプチ
ドの如き生産物を暗号化している配列を有することをそ
の特徴としている。
以下に本明細書で使用する用語について説明する。
ｂｏｗサイト 特異的にｍｏｂ機能体が相互作用して自
律的ＤＮＡ転移移動を開始させるＤＮＡ領域境界配列
Ｔ−ＤＮＡの末端を含むＤＮＡ配列広範囲宿主レプリコ
ン 多種多様の宿主細胞に転移（トランスファー）され
、保持され得るＤＮＡ分子 カルス組織 未組織、未分化の細胞の塩クローニング
無性生殖により、１個の生物またはＤＮＡ配列から一部
の該生物またはＤＮＡ配列を得る操作過程、または、よ
りわかり易く言えば、特定の生物またはその一部を分離
し、そのサブフラクションを均質な集団として増殖させ
る操作過程 クローニング媒体 宿主細胞中で複製し得るプラスミド
、ファージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であって、
そのＤＮＡ配列は、例えば複製、外殻蛋白質の生産など
、そのＤＮＡの必須の生物学的機能、あるいはプロモー
ターまたは結合部位を付随的に失なうことなく、その場
所で正確にその配列を切断することのできる１個または
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を持っており、また
、それが導入された細胞（形質転換された細胞）を同定
確認するのに有用なマーカー（例えばテトラサイクリン
耐性あるいはアンピシリン耐性）を持っていることで特
徴づけられる。クローニング媒体は、しばしばベクター
とも呼ばれる。
律的ＤＮＡ転移移動を開始させるＤＮＡ領域境界配列
Ｔ−ＤＮＡの末端を含むＤＮＡ配列広範囲宿主レプリコ
ン 多種多様の宿主細胞に転移（トランスファー）され
、保持され得るＤＮＡ分子 カルス組織 未組織、未分化の細胞の塩クローニング
無性生殖により、１個の生物またはＤＮＡ配列から一部
の該生物またはＤＮＡ配列を得る操作過程、または、よ
りわかり易く言えば、特定の生物またはその一部を分離
し、そのサブフラクションを均質な集団として増殖させ
る操作過程 クローニング媒体 宿主細胞中で複製し得るプラスミド
、ファージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であって、
そのＤＮＡ配列は、例えば複製、外殻蛋白質の生産など
、そのＤＮＡの必須の生物学的機能、あるいはプロモー
ターまたは結合部位を付随的に失なうことなく、その場
所で正確にその配列を切断することのできる１個または
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を持っており、また
、それが導入された細胞（形質転換された細胞）を同定
確認するのに有用なマーカー（例えばテトラサイクリン
耐性あるいはアンピシリン耐性）を持っていることで特
徴づけられる。クローニング媒体は、しばしばベクター
とも呼ばれる。
暗号配列 ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するＤＮ
Ａ配列 相互組込み体（コインテグレート） ２個の環状ＤＮＡ
分子間の単一交叉により得られる構造体トランス柑補性
他のレプリコンに物理的に結合していないＤＮＡ分子
（レプリコン）が、その結合していない他のレプリコン
にとって必要がっ欠落している拡散性物質を供給するこ
とができる過程 接合（コンジュゲーション）細胞同志の接触により、１
つのタイプの細菌から他のタイプの細菌にＤＮＡが転移
すること 釆像木 相同なりＮＡ配列間で遺伝物質が交換すること 欠損置換 １ｆｌｉのＤＮＡ配列が除去され、その代り
として異なったＤＮＡ配列で置換されること分化 ある
細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得し、更にそれを維
持すること ＤＮＡ配列またはＤＮＡセグメント 隣接するペントー
スの３′位と５′位の炭素間の燐酸ジエステル結合によ
り互いに連結したヌクレオチド群の一直線の配列 二重乗換 相互組込み（コインテグレート）構造が２個
の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程は遺伝情報
を交換するのに利用される。このＤＮＡ環状体の一方は
、それによって組換えが生じ得る標的ＤＮＡと相同な２
つの領域を持っており、この２つの領域は、標的ＤＮＡ
と交換される非相同ＤＮＡ配列をはさんでいる。もし１
回目の交叉と２回目の交叉が同じＤＮＡ領域で起ると、
もとのＤＮＡ環状体が生成する。この２回目の交叉が第
２の相同領域で起ると、２つの環状体の間で遺伝子の交
換が起ることになる。
Ａ配列 相互組込み体（コインテグレート） ２個の環状ＤＮＡ
分子間の単一交叉により得られる構造体トランス柑補性
他のレプリコンに物理的に結合していないＤＮＡ分子
（レプリコン）が、その結合していない他のレプリコン
にとって必要がっ欠落している拡散性物質を供給するこ
とができる過程 接合（コンジュゲーション）細胞同志の接触により、１
つのタイプの細菌から他のタイプの細菌にＤＮＡが転移
すること 釆像木 相同なりＮＡ配列間で遺伝物質が交換すること 欠損置換 １ｆｌｉのＤＮＡ配列が除去され、その代り
として異なったＤＮＡ配列で置換されること分化 ある
細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得し、更にそれを維
持すること ＤＮＡ配列またはＤＮＡセグメント 隣接するペントー
スの３′位と５′位の炭素間の燐酸ジエステル結合によ
り互いに連結したヌクレオチド群の一直線の配列 二重乗換 相互組込み（コインテグレート）構造が２個
の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程は遺伝情報
を交換するのに利用される。このＤＮＡ環状体の一方は
、それによって組換えが生じ得る標的ＤＮＡと相同な２
つの領域を持っており、この２つの領域は、標的ＤＮＡ
と交換される非相同ＤＮＡ配列をはさんでいる。もし１
回目の交叉と２回目の交叉が同じＤＮＡ領域で起ると、
もとのＤＮＡ環状体が生成する。この２回目の交叉が第
２の相同領域で起ると、２つの環状体の間で遺伝子の交
換が起ることになる。
＆男 構造遺伝子によりポリペプチドが生産される過
程。これは転写と翻訳の組合せである。
程。これは転写と翻訳の組合せである。
発現調節（コントロール）配列 構造遺伝子に有効に結
合された場合、それらの構造遺伝子の発現を調節し、統
制するヌクレオチド配列 Ｆ型プラスミド Ｆ因子（Ｆはｆｅｒｔ ｉ Ｉ １ｔ
ｙ（生殖力））を持ったプラスミドであって、Ｆ因子を
持たない宿主に該プラスミドのコピーを移入することの
できるブラスミド 直伝子 ２つの部分、即ち（１）遺伝子生産物のための
暗号配列および（２）その遺伝子が発現されるかどうか
を調節しているプロモーター領域内の配列、から構成さ
れているＤＮＡ配列 ゲノム 細胞またはウィルスの全ＤＮＡ０これは、まず
ポリペプチドを暗号化している構造遺伝子、更にオペレ
ーター、プロモーター、リボゾームの結合配列および相
互作用配列（たとえば５ｈｉｎｅＤ ａ１ｇａｒｎｏ配
列）を含んでいる。
合された場合、それらの構造遺伝子の発現を調節し、統
制するヌクレオチド配列 Ｆ型プラスミド Ｆ因子（Ｆはｆｅｒｔ ｉ Ｉ １ｔ
ｙ（生殖力））を持ったプラスミドであって、Ｆ因子を
持たない宿主に該プラスミドのコピーを移入することの
できるブラスミド 直伝子 ２つの部分、即ち（１）遺伝子生産物のための
暗号配列および（２）その遺伝子が発現されるかどうか
を調節しているプロモーター領域内の配列、から構成さ
れているＤＮＡ配列 ゲノム 細胞またはウィルスの全ＤＮＡ０これは、まず
ポリペプチドを暗号化している構造遺伝子、更にオペレ
ーター、プロモーター、リボゾームの結合配列および相
互作用配列（たとえば５ｈｉｎｅＤ ａ１ｇａｒｎｏ配
列）を含んでいる。
遺伝子型 ある生物に含まれている遺伝情報の全て
相同的（性）組換え 相同配列を含んでいるＤＮＡ上の
２つ領域間の組換え ■型プラスミド Ｆとは異なる不和合性グルブの一部の
自律転移性プラスミド 不和合性 選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕ
ｒｅ）がないと、同一の細胞に２個のＤＮＡが共存し得
ないこと 連木 あるＤＮＡ配列を、別の分子のＤＮＡ配列内に付
加すること リータ〜配列 ５゛末端から最初の構造遺伝子の先端に
至るまでのｍＲＮＡ上の領域。これには構造遺伝子の暗
号配列の翻訳を開始するのに重要な部位が含まれている
。
２つ領域間の組換え ■型プラスミド Ｆとは異なる不和合性グルブの一部の
自律転移性プラスミド 不和合性 選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕ
ｒｅ）がないと、同一の細胞に２個のＤＮＡが共存し得
ないこと 連木 あるＤＮＡ配列を、別の分子のＤＮＡ配列内に付
加すること リータ〜配列 ５゛末端から最初の構造遺伝子の先端に
至るまでのｍＲＮＡ上の領域。これには構造遺伝子の暗
号配列の翻訳を開始するのに重要な部位が含まれている
。
減数分裂 はじめの４ｎ個の染色体が、２回の連続した
分裂により生成した４個の細胞のそれぞれに１ｎ個ずつ
分布するようになる過程。この過程は有性生殖に於いて
重要である。
分裂により生成した４個の細胞のそれぞれに１ｎ個ずつ
分布するようになる過程。この過程は有性生殖に於いて
重要である。
ｍｏｂ （授動機能体） ｔｒａ機能体との組合せに
於いてのみＤＮＡの転移を促す一連の生成物。ｍｏｂは
ｂｏｗサイトを含んでいるプラスミドの移動を促すこと
ができる。
於いてのみＤＮＡの転移を促す一連の生成物。ｍｏｂは
ｂｏｗサイトを含んでいるプラスミドの移動を促すこと
ができる。
授動（モビリゼーション）別の細胞へ転移することので
きないＤＮＡ分子が、他のＤＮＡ分子の助けを借りて転
移する過程 授動ヘルパープラスミド 他のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ転移するための拡散性生成物を供給
することができるプラスミド非接合性組換えプラスミド
細胞同志の接触により、それ自体では、もとの宿主細
胞から他の宿主細胞へ転移することができないＤＮＡ分
子。転移するには、他のＤＮＡ、例えばヘルパープラス
ミドによって供給される機能体が必要となる。
きないＤＮＡ分子が、他のＤＮＡ分子の助けを借りて転
移する過程 授動ヘルパープラスミド 他のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ転移するための拡散性生成物を供給
することができるプラスミド非接合性組換えプラスミド
細胞同志の接触により、それ自体では、もとの宿主細
胞から他の宿主細胞へ転移することができないＤＮＡ分
子。転移するには、他のＤＮＡ、例えばヘルパープラス
ミドによって供給される機能体が必要となる。
ヌクレオチド 糖部分（ペントース）、燐酸エステルお
よび含窒素異頃環塩基から構成されているＤＮＡまたは
ＲＮＡの単量体単位。この塩基は糖部分とグリコシド結
合で連結しており（ペントースの１ 位の炭素）、この
塩基と糖とが結合したものがヌクレオシドである。ヌク
レオチドの特性はこの塩基によって決まる。ＤＮＡの４
個の塩基はアデニン（“Ａ”）、グアニン（“Ｇ″）、
シトシン（“Ｃ″）およびチミン（“Ｔ″）である。Ｒ
ＮＡの４個の塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（”Ｕ”
）である。
よび含窒素異頃環塩基から構成されているＤＮＡまたは
ＲＮＡの単量体単位。この塩基は糖部分とグリコシド結
合で連結しており（ペントースの１ 位の炭素）、この
塩基と糖とが結合したものがヌクレオシドである。ヌク
レオチドの特性はこの塩基によって決まる。ＤＮＡの４
個の塩基はアデニン（“Ａ”）、グアニン（“Ｇ″）、
シトシン（“Ｃ″）およびチミン（“Ｔ″）である。Ｒ
ＮＡの４個の塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（”Ｕ”
）である。
表現形質 発育環境と遺伝子形質との相互関係によって
生成する個体の観察し得る特性プラスミド それ自体が
宿主細胞中で複製される、完全な（無傷の）レプリコン
からなる非染色体性の２本鎖ＤＮ’Ａ配列。このプラス
ミドを単細胞生物に入れると、そのプラスミドのＤＮＡ
によって、その生物の性質が変わる、即ち形質転換され
る。例えば、テトラサイクリン耐性（Ｔｃ８）のための
遺伝子を持ったプラスミドにより、本来はテトラサイタ
リンに感受性のある細胞が耐性のある細胞に形質転換さ
れる。プラスミドによって形質転換された細胞を形質転
換体と呼ぶ。
生成する個体の観察し得る特性プラスミド それ自体が
宿主細胞中で複製される、完全な（無傷の）レプリコン
からなる非染色体性の２本鎖ＤＮ’Ａ配列。このプラス
ミドを単細胞生物に入れると、そのプラスミドのＤＮＡ
によって、その生物の性質が変わる、即ち形質転換され
る。例えば、テトラサイクリン耐性（Ｔｃ８）のための
遺伝子を持ったプラスミドにより、本来はテトラサイタ
リンに感受性のある細胞が耐性のある細胞に形質転換さ
れる。プラスミドによって形質転換された細胞を形質転
換体と呼ぶ。
ポリペプチド 隣接するアミノ酸どうしがα−アミ７基
とカルボキシル基とのペプチド結６により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域 遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤＮＡ配列プロモーター配列
ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列であり、ポリメラー
ゼはそれより下流の配列の忠実な転写を促進する。
とカルボキシル基とのペプチド結６により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域 遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤＮＡ配列プロモーター配列
ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列であり、ポリメラー
ゼはそれより下流の配列の忠実な転写を促進する。
組換えＤＮＡ分子または雑種（ハイブリッド）ＤＮＡ
少なくとも２個のヌクレオチド配列がらなり、その一
方の配列は、自然界では通常第２の配列と共存しない、
その様な配列からなる雑種のＤＮＡ配列 紙ｉＡ、ｔ ＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の一部分の
新しい結合体を創製すること 相同領域 ＤＮＡの別の領域に於ける配列と同じＤＮＡ
配列を持っているＤＮＡ領域 レプリコン ＤＮＡの複製開始サイトおよび複製を支配
するのに必要な機能を指定している遺伝子を持った自己
複製遺伝子単位 制限フラグメント 特定の標的ＤＮＡ配列を認識する酵
素による２本鎖開裂によって生じるＤＮＡ分子 ＲＮＡポリメラーゼ ＤＮＡのＲＮＡへの転写をつかさ
どる酵素 選択可能なマーカー遺伝子 あるＤＮＡ配列であって、
それがある細胞内で発現された時、そのＤＮＡ配列を含
んでいない細胞より増殖しやすい有利性をその細胞に与
えるＤＮＡ配列。細胞を適当な選択的増殖培地に置くと
、この２つのタイプの細胞を区別することができる。通
常使用される選択可能なマーカー遺伝子は抗生物質耐性
を暗号化している遺伝子である。
少なくとも２個のヌクレオチド配列がらなり、その一
方の配列は、自然界では通常第２の配列と共存しない、
その様な配列からなる雑種のＤＮＡ配列 紙ｉＡ、ｔ ＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の一部分の
新しい結合体を創製すること 相同領域 ＤＮＡの別の領域に於ける配列と同じＤＮＡ
配列を持っているＤＮＡ領域 レプリコン ＤＮＡの複製開始サイトおよび複製を支配
するのに必要な機能を指定している遺伝子を持った自己
複製遺伝子単位 制限フラグメント 特定の標的ＤＮＡ配列を認識する酵
素による２本鎖開裂によって生じるＤＮＡ分子 ＲＮＡポリメラーゼ ＤＮＡのＲＮＡへの転写をつかさ
どる酵素 選択可能なマーカー遺伝子 あるＤＮＡ配列であって、
それがある細胞内で発現された時、そのＤＮＡ配列を含
んでいない細胞より増殖しやすい有利性をその細胞に与
えるＤＮＡ配列。細胞を適当な選択的増殖培地に置くと
、この２つのタイプの細胞を区別することができる。通
常使用される選択可能なマーカー遺伝子は抗生物質耐性
を暗号化している遺伝子である。
単一乗換 ２個の環状ＤＮＡ分子を組換えて、相互組込
みされた大きい環状体を形成させる操作過程 構造遺伝子 ポリペプチドを暗号化している遺伝子 Ｔ−ＤＮＡ 植物細胞ゲノムに安定に組込まれること
が見い出されているＴｉプラスミドの部分子−領域 植
物細胞ゲノムへ転移するＤＮＡ配列を含んでいるＴｉプ
ラスミドの部分 子ｉプラスミド 感受性植物に腫瘍（クラウンガル）を
誘発させるための遺伝情報を含んでいるＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒ＋ｕｍ ｔｕｍｅｒａｃｉｅｎｓ株に存在する大
きいプラスミド ＴＬ−ＤＮＡおよびＴＲ−ＤＮＡ オクトビンクラウ
ンガル腫瘍細胞は２つのＴ−ＤＮＡ配列、即ち左Ｔ−Ｄ
ＮＡ（ＴＬ−ＤＮＡ）および右Ｔ−ＤＮＡ（ＴＲ−ＤＮ
Ａ）を含有し得る。ＴＬ−ＤＮＡはツバリン腫瘍細胞の
Ｔ−ＤＮＡと共通している配列を持っているがＴＲ−Ｄ
ＮＡは持っていない。
みされた大きい環状体を形成させる操作過程 構造遺伝子 ポリペプチドを暗号化している遺伝子 Ｔ−ＤＮＡ 植物細胞ゲノムに安定に組込まれること
が見い出されているＴｉプラスミドの部分子−領域 植
物細胞ゲノムへ転移するＤＮＡ配列を含んでいるＴｉプ
ラスミドの部分 子ｉプラスミド 感受性植物に腫瘍（クラウンガル）を
誘発させるための遺伝情報を含んでいるＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒ＋ｕｍ ｔｕｍｅｒａｃｉｅｎｓ株に存在する大
きいプラスミド ＴＬ−ＤＮＡおよびＴＲ−ＤＮＡ オクトビンクラウ
ンガル腫瘍細胞は２つのＴ−ＤＮＡ配列、即ち左Ｔ−Ｄ
ＮＡ（ＴＬ−ＤＮＡ）および右Ｔ−ＤＮＡ（ＴＲ−ＤＮ
Ａ）を含有し得る。ＴＬ−ＤＮＡはツバリン腫瘍細胞の
Ｔ−ＤＮＡと共通している配列を持っているがＴＲ−Ｄ
ＮＡは持っていない。
ｔｒａ （転移機能（体））プラスミドに暗号化されて
いる拡散性の生成物、および細胞間のＤＮＡ転移の際に
利用される作用部位の両者を指す。例えば２つの細胞の
間に橋を作るのに必要な生成物およびＤＮＡ転移が開始
する部位。
いる拡散性の生成物、および細胞間のＤＮＡ転移の際に
利用される作用部位の両者を指す。例えば２つの細胞の
間に橋を作るのに必要な生成物およびＤＮＡ転移が開始
する部位。
（亙 構造遺伝子からｍＲＮＡが生産される過程、また
は、塩基対（ベースベア）の形成により、ＤＮＡに含ま
れている遺伝情報に基きそれに相捕的な塩基配列をもつ
ＲＮＡ鎖が形成される過程形質転換 細胞のＤＮＡ補体
（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に外来性ＤＮＡが導入される
ことによって生じる遺伝的修飾 闘 ｍＲＮＡからポリペプチドが生産される過程、ある
いは、ｍＲＮＡ分子に存在する遺伝情報が、ポリペプチ
ド合成において特定のアミノ酸の順序を指定する過程 非分化表現形質 いかなる特異な部分もなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクター 異なった宿主細胞間を転移するように設計さ
れたＤＮＡ分子 組換えＤＮＡ技術の進歩によって、微生物の遺伝子工学
に新たな展望か開けた。もし１個の体細胞から、完全な
生物を再生することができたら、これらの技術は多細胞
真核生物にまで広がるであろう。ある種の高等植物の細
胞は、優れた再生能力を有し、従って高等生物の遺伝子
工学にとってかっこうの材料となる。
は、塩基対（ベースベア）の形成により、ＤＮＡに含ま
れている遺伝情報に基きそれに相捕的な塩基配列をもつ
ＲＮＡ鎖が形成される過程形質転換 細胞のＤＮＡ補体
（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に外来性ＤＮＡが導入される
ことによって生じる遺伝的修飾 闘 ｍＲＮＡからポリペプチドが生産される過程、ある
いは、ｍＲＮＡ分子に存在する遺伝情報が、ポリペプチ
ド合成において特定のアミノ酸の順序を指定する過程 非分化表現形質 いかなる特異な部分もなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクター 異なった宿主細胞間を転移するように設計さ
れたＤＮＡ分子 組換えＤＮＡ技術の進歩によって、微生物の遺伝子工学
に新たな展望か開けた。もし１個の体細胞から、完全な
生物を再生することができたら、これらの技術は多細胞
真核生物にまで広がるであろう。ある種の高等植物の細
胞は、優れた再生能力を有し、従って高等生物の遺伝子
工学にとってかっこうの材料となる。
植物の遺伝子工学の主たる問題点は、外来性ＤＮＡを植
物ゲノムに導入する為の系の利用性にある。この様な系
には、ダラム陰性土壌細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｒａｃｉｅｎｓが持っている腫瘍誘起（Ｔ
ｉ）プラスミドがある。この微生物は、広範囲の双子
葉植物の損傷組織に、クラウンガル（ｃｒ。
物ゲノムに導入する為の系の利用性にある。この様な系
には、ダラム陰性土壌細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｒａｃｉｅｎｓが持っている腫瘍誘起（Ｔ
ｉ）プラスミドがある。この微生物は、広範囲の双子
葉植物の損傷組織に、クラウンガル（ｃｒ。
ｗｎｇａ Ｉ Ｉ、冠状コブ）と呼ばれる腫瘍性形質転
換を引き起す原因となることがわかっている。この増殖
性の腫瘍は、オバイン（ｏｐｉｎｅｓ）と呼ばれるＴｉ
に特異な新しい代謝物を合成する。この形質転換は、分
子レベルでみると、Ｔｉプラスミドの実体のはっきりわ
かっているＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）フラグメントが植
物細胞ゲノムに転移して安定に組込まれたことによって
起る。換言すれば、クラウンガル腫瘍は、その染色体Ｄ
ＮＡに、腫瘍セルラインをもたらしたＴｉプラスミド中
のＤ Ｎ Ａ配列と相同のＴ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡ
セグメントを含んでいる。あらゆる場合に於いて、この
ＴＤＮＡは、連続した一連のＴｉプラスミドＤＮＡに相
当しており、また、これと共直線性である。
換を引き起す原因となることがわかっている。この増殖
性の腫瘍は、オバイン（ｏｐｉｎｅｓ）と呼ばれるＴｉ
に特異な新しい代謝物を合成する。この形質転換は、分
子レベルでみると、Ｔｉプラスミドの実体のはっきりわ
かっているＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）フラグメントが植
物細胞ゲノムに転移して安定に組込まれたことによって
起る。換言すれば、クラウンガル腫瘍は、その染色体Ｄ
ＮＡに、腫瘍セルラインをもたらしたＴｉプラスミド中
のＤ Ｎ Ａ配列と相同のＴ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡ
セグメントを含んでいる。あらゆる場合に於いて、この
ＴＤＮＡは、連続した一連のＴｉプラスミドＤＮＡに相
当しており、また、これと共直線性である。
従ってこれはＴ−領域と呼ばれる。
Ｔｉプラスミドはクラウンガル細胞で合成されたオパイ
ンのタイプによって分類される。クラウンガル細胞でツ
バリン［Ｎ−α−（ｌ、３−ジカルボキシプロピル）−
Ｌ−アルギニン］の合成を惹起させるＡ ｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ株はツバリン株と呼ばれ、オクトピン［Ｎ
−α−（Ｎ−１−カルボキシエチル）−Ｌ−アルギニン
］を合成するものはオクトピン株と呼ばれる。これらが
最も普通に用いられるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株
である。
ンのタイプによって分類される。クラウンガル細胞でツ
バリン［Ｎ−α−（ｌ、３−ジカルボキシプロピル）−
Ｌ−アルギニン］の合成を惹起させるＡ ｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ株はツバリン株と呼ばれ、オクトピン［Ｎ
−α−（Ｎ−１−カルボキシエチル）−Ｌ−アルギニン
］を合成するものはオクトピン株と呼ばれる。これらが
最も普通に用いられるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株
である。
植物の遺伝手術にＴ−ＤＮＡをベクターとして使用する
試みがモデル実験で行なわれた。この実験では、インビ
ボにおいて、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔ３７
株のＴｉプラスミドからのＴ−ＤＮＡの右側境界部の近
くに１４ｋｂ細菌性トランスポソン（ｔｒａｎｓｐｏｓ
ｏｎ） Ｔｎ ７が挿入された。すると、このＴｉプラ
スミドを持っているアゲロバクチリアによって惹起され
る腫瘍中のツバリン合成が消滅した。更に、サザーン・
プロッティング・ハイブリダイゼーンヨンの結果、その
様な挿入を行なわなければ正常であるＴ−ＤＮＡ配列の
一部分として、この腫瘍の染色体ＤＮＡ中に全Ｔｎ７が
存在することがわかった（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓら
、Ｎａｔｕｒｅ２８７（１９８０）、６５４ ６５６；
Ｈｏ１ｓｔｅｒｓら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、 １８５ （１９８２） 、２８３−２８９）。
試みがモデル実験で行なわれた。この実験では、インビ
ボにおいて、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔ３７
株のＴｉプラスミドからのＴ−ＤＮＡの右側境界部の近
くに１４ｋｂ細菌性トランスポソン（ｔｒａｎｓｐｏｓ
ｏｎ） Ｔｎ ７が挿入された。すると、このＴｉプラ
スミドを持っているアゲロバクチリアによって惹起され
る腫瘍中のツバリン合成が消滅した。更に、サザーン・
プロッティング・ハイブリダイゼーンヨンの結果、その
様な挿入を行なわなければ正常であるＴ−ＤＮＡ配列の
一部分として、この腫瘍の染色体ＤＮＡ中に全Ｔｎ７が
存在することがわかった（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓら
、Ｎａｔｕｒｅ２８７（１９８０）、６５４ ６５６；
Ｈｏ１ｓｔｅｒｓら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、 １８５ （１９８２） 、２８３−２８９）。
この様に、２３ｋｂＴ−ＤＮＡに１４ ｋｂＤ Ｎ Ａ
フラグメントを導入しても、２３ｋｂＴＤＮＡの植物細
胞ゲノムへの転移能力に変化は見られなかった。
フラグメントを導入しても、２３ｋｂＴＤＮＡの植物細
胞ゲノムへの転移能力に変化は見られなかった。
ツバリン株、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴ ３７のＴ
ｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界部は非常に正確に調べ
られている。これは全ツバリンＴｉプラスミドの極く一
部、約２３ｋｂに過ぎない。更に、このＴＤＮＡの境界
部は知られている；即ち、このＴＤＮＡの境界部を決め
ているヌクレオチド配列が調べられ、ツバリンＴｉプラ
スミドの同じ領域と比較された（ Ｚ ａｍｂｒｙｓｋ
ｉら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０９ （１９８０）、
１３８５ １３９１；Ｚａｍｂｒｙｓｋｉら、Ｊ、
Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 １（１９
８２）、３６１３７０）。このＴ−領域の境界部が、Ｔ
−ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの組込みに最も関係してい
る様である。
ｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界部は非常に正確に調べ
られている。これは全ツバリンＴｉプラスミドの極く一
部、約２３ｋｂに過ぎない。更に、このＴＤＮＡの境界
部は知られている；即ち、このＴＤＮＡの境界部を決め
ているヌクレオチド配列が調べられ、ツバリンＴｉプラ
スミドの同じ領域と比較された（ Ｚ ａｍｂｒｙｓｋ
ｉら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０９ （１９８０）、
１３８５ １３９１；Ｚａｍｂｒｙｓｋｉら、Ｊ、
Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 １（１９
８２）、３６１３７０）。このＴ−領域の境界部が、Ｔ
−ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの組込みに最も関係してい
る様である。
ＤＮＡを植物細胞へ転移させる為のベクターとしてＴｉ
プラスミドを使用するには、転移したＤＮＡの境界部を
決めているＴ−ＤＮＡ配列を知ることが基本的に必要で
ある。そうすれば、外来性ＤＮＡをこの境界内に挿入し
、確実に植物細胞ゲノムへ転移させることができる。更
に、この系を利用しよ゛うとすれば、形質転換された植
物細胞が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、
正常であるということが重要である。Ｔ−ＤＮＡ転移の
後、正常細胞を生産するには、Ｔ−ＤＮＡ自体によって
暗号化されている機能を知る必要がある。
プラスミドを使用するには、転移したＤＮＡの境界部を
決めているＴ−ＤＮＡ配列を知ることが基本的に必要で
ある。そうすれば、外来性ＤＮＡをこの境界内に挿入し
、確実に植物細胞ゲノムへ転移させることができる。更
に、この系を利用しよ゛うとすれば、形質転換された植
物細胞が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、
正常であるということが重要である。Ｔ−ＤＮＡ転移の
後、正常細胞を生産するには、Ｔ−ＤＮＡ自体によって
暗号化されている機能を知る必要がある。
従って、どの領域が腫瘍表現形質に関係しているか調べ
るために、ＴｉプラスミドのＴ−領域の徹底的な遺伝子
分析が行なわれた。
るために、ＴｉプラスミドのＴ−領域の徹底的な遺伝子
分析が行なわれた。
Ｔ−ＤＮＡは、クラウンガル表現形質の原因となる機能
体を暗号化している。その遺伝子は、ＴＤＮＡの特定の
領域に局在化している（ Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯ
Ｊ、Ｉ（１９８２）、１４７−１５２； Ｗｉｌｉｍｉ
ｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、 １（１９８２）。
体を暗号化している。その遺伝子は、ＴＤＮＡの特定の
領域に局在化している（ Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯ
Ｊ、Ｉ（１９８２）、１４７−１５２； Ｗｉｌｉｍｉ
ｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、 １（１９８２）。
１３９−１４６ ）。一般に、腫瘍カルス組織の非分化
表現形質を支配している少なくとも４つの遺伝子が存在
している。これらの遺伝子の突然変異体（ミュータント
）は、新芽様のあるいは根の様な外観の形質転換組織を
形成させることができる。
表現形質を支配している少なくとも４つの遺伝子が存在
している。これらの遺伝子の突然変異体（ミュータント
）は、新芽様のあるいは根の様な外観の形質転換組織を
形成させることができる。
この後者の成果は、腫瘍組織ではなく正常植物組織中で
発現させる為にＤＮＡを植物に転移したいと思う場合に
は特に重要である。
発現させる為にＤＮＡを植物に転移したいと思う場合に
は特に重要である。
最近、完全な正常植物に再生することができる形質転換
新芽を誘導するＴｉプラスミド変異体がみつかった。こ
れらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分裂によってＴ
−ＤＮＡ特異配列を伝達することさえした：即ち、子孫
の植物もＴ−ＤＮＡ特異配列を含んでいた（ ０ｔｔｅ
ｎら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１８３（１９８
１）、２０９−２１３ ）。
新芽を誘導するＴｉプラスミド変異体がみつかった。こ
れらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分裂によってＴ
−ＤＮＡ特異配列を伝達することさえした：即ち、子孫
の植物もＴ−ＤＮＡ特異配列を含んでいた（ ０ｔｔｅ
ｎら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１８３（１９８
１）、２０９−２１３ ）。
しかし、この形質転換植物組織は、その染色体ＤＮＡ中
に、腫瘍表現形質を支配しているＴ−ＤＮＡ領域が除去
される大かがすな欠損（欠失）が発生したことにより、
著しく小さくなったＴ−ＤＮＡを含んでいた。この欠損
が当初の形質転換時に起ったのか、新芽の形成をもたら
すその後の過程で起ったのかは不明である。
に、腫瘍表現形質を支配しているＴ−ＤＮＡ領域が除去
される大かがすな欠損（欠失）が発生したことにより、
著しく小さくなったＴ−ＤＮＡを含んでいた。この欠損
が当初の形質転換時に起ったのか、新芽の形成をもたら
すその後の過程で起ったのかは不明である。
Ｔｉプラスミドは太きく（２００ｋｂ）、そのＴｉプラ
スミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子が植物
の形質転換に関係している。従って、Ｔ−領域内の適切
な場所に特殊なエンドヌクレアゼ認識サイトを有し、Ｔ
−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定に挿入する
のに必要な全ての機能を持ったＴｉプラスミド由来の小
型のクロニングベクターを組み立てることは不可能であ
る。
スミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子が植物
の形質転換に関係している。従って、Ｔ−領域内の適切
な場所に特殊なエンドヌクレアゼ認識サイトを有し、Ｔ
−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定に挿入する
のに必要な全ての機能を持ったＴｉプラスミド由来の小
型のクロニングベクターを組み立てることは不可能であ
る。
所望のＤＮＡフラグメントをＴｉプラスミドのＴ−領域
の特定の制限酵素開裂サイトに導入する為の既知の方法
の１つは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （大腸
菌）におけると同様、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに
おいても複製することができ、Ｔ−ＤＮＡの所望の制限
フラグメントを含んでいるクローニングプラスミドを組
み立てることである。この様なりローニングベクターは
「中間ベクター」と命名された。この様な中間ベクター
は、Ｔ−領域によって暗号化されている機能を分析する
のに使用された（ Ｌｅｅｍａｎｓ ら、Ｊ、 Ｍｏ
１． Ａｐｐｌｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １ （１
９８１）、１４９−１６４）。
の特定の制限酵素開裂サイトに導入する為の既知の方法
の１つは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （大腸
菌）におけると同様、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに
おいても複製することができ、Ｔ−ＤＮＡの所望の制限
フラグメントを含んでいるクローニングプラスミドを組
み立てることである。この様なりローニングベクターは
「中間ベクター」と命名された。この様な中間ベクター
は、Ｔ−領域によって暗号化されている機能を分析する
のに使用された（ Ｌｅｅｍａｎｓ ら、Ｊ、 Ｍｏ
１． Ａｐｐｌｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １ （１
９８１）、１４９−１６４）。
本発明は、発現し得る遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入す
る方法に関するものである。本発明の１つの目的は所望
のあらゆる遺伝子（群）を導入することのできる改良さ
れたアクセプターＴｉプラスミドを提供することにある
。導入される所望の遺伝子（群）は、そのアクセプター
Ｔｉプラスミドの相当する領域と相同の領域を持った新
規な中間クローニングベクター内に含まれている。この
中間クローニングベクターを提供することも本発明の目
的の１つである。
る方法に関するものである。本発明の１つの目的は所望
のあらゆる遺伝子（群）を導入することのできる改良さ
れたアクセプターＴｉプラスミドを提供することにある
。導入される所望の遺伝子（群）は、そのアクセプター
Ｔｉプラスミドの相当する領域と相同の領域を持った新
規な中間クローニングベクター内に含まれている。この
中間クローニングベクターを提供することも本発明の目
的の１つである。
所望の遺伝子（群）のアクセプターＴｉプラスミドへの
導入は、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに保持されてい
るアクセプターＴｉプラスミドと中間クローニングベク
ターの２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一乗換
えによって達成される。この中間クロニングベクターは
、ヘルパープラスミドを使って、それが増殖するＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからＡｇｒ。
導入は、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに保持されてい
るアクセプターＴｉプラスミドと中間クローニングベク
ターの２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一乗換
えによって達成される。この中間クロニングベクターは
、ヘルパープラスミドを使って、それが増殖するＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからＡｇｒ。
ｂａｃｔｅｒｉｕｍに授動される。この様なヘルパープ
ラスミドおよび授動のための機能は知られている（Ｆ
ｉｎｎｅｇａｎ ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎ
ｅｔ、 １８５ （１９８２）、３４４ ３５１；
Ｆｉｇｕｒｓｋｉら、Ｐ ｒｏｃ。
ラスミドおよび授動のための機能は知られている（Ｆ
ｉｎｎｅｇａｎ ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎ
ｅｔ、 １８５ （１９８２）、３４４ ３５１；
Ｆｉｇｕｒｓｋｉら、Ｐ ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７６（１９７
９）；Ｄ １ｔｔａら、Ｐ ｒｏｃ、 Ｎ ａ目、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７７（１９８０）
、７３４７）。
９）；Ｄ １ｔｔａら、Ｐ ｒｏｃ、 Ｎ ａ目、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７７（１９８０）
、７３４７）。
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍでの単一乗換えの結果、
ハイブリッドＴ１プラスミドベクターが得られる。この
様なハイブリッドＴｉプラスミドも本発明の目的の１つ
である。
ハイブリッドＴ１プラスミドベクターが得られる。この
様なハイブリッドＴｉプラスミドも本発明の目的の１つ
である。
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに保持されたこのハイブ
リッドプラスミドベクター（以降、ベクター組成物とい
う）を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所望の遺伝
子生成物の発現についてスクリーニングする。植物細胞
をベクター組成物で感染させて形質転換植物細胞を調製
するこの方法、その形質転換された植物細胞、およびそ
れから発生した植物を提供することも本発明の目的であ
る。この技法はＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの植物転
移性のプラスミド全てに適用することができる。
リッドプラスミドベクター（以降、ベクター組成物とい
う）を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所望の遺伝
子生成物の発現についてスクリーニングする。植物細胞
をベクター組成物で感染させて形質転換植物細胞を調製
するこの方法、その形質転換された植物細胞、およびそ
れから発生した植物を提供することも本発明の目的であ
る。この技法はＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの植物転
移性のプラスミド全てに適用することができる。
以下に添付の図面について詳細に説明する。
第１図は、境界配列（１）および（２）を除き、Ｔ領域
の内部部分を除去して得られる本発明のアクセプターＴ
ｉプラスミドの１態様を示している。
の内部部分を除去して得られる本発明のアクセプターＴ
ｉプラスミドの１態様を示している。
この境界配列は、Ｔ−領域を植物細胞ケノムに組込むの
に必須である。境界配列（１）と（２）の間の領域（３
）が、植物に転移されるであろうＤＮＡセグメントであ
る。このアクセプターＴｉプラスミドは、中間クローニ
ングベクターを中−乗換えによって組込まずことを可能
にしている中間クロニングベクター内のＤＮＡ配列の少
なくとも一部と相同のＤＮＡ配列を持ったＤＮＡセグメ
ント（３）を含んでいる。Ｔｉプラスミド領域（４）は
、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによってＴ−領域か植物
細胞ゲノムに転移するのに必要な機能を暗号化している
。この領域は、ｖｉｒ−領域と呼ばれる。
に必須である。境界配列（１）と（２）の間の領域（３
）が、植物に転移されるであろうＤＮＡセグメントであ
る。このアクセプターＴｉプラスミドは、中間クローニ
ングベクターを中−乗換えによって組込まずことを可能
にしている中間クロニングベクター内のＤＮＡ配列の少
なくとも一部と相同のＤＮＡ配列を持ったＤＮＡセグメ
ント（３）を含んでいる。Ｔｉプラスミド領域（４）は
、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによってＴ−領域か植物
細胞ゲノムに転移するのに必要な機能を暗号化している
。この領域は、ｖｉｒ−領域と呼ばれる。
第２図は、単一乗換えによって第１図のアクセプターＴ
ｉプラスミドに挿入される本発明の中間クローニングベ
クターを示している。このベクタは、所望の単一乗換え
を可能にするアクセプタＴｉ プラスミドのＤＮＡセグ
メント（３）の少なくとも一部と相同なりＮＡ配列を持
ったクローニング媒体ＤＮＡセグメン）（３’）を含ん
でいる。
ｉプラスミドに挿入される本発明の中間クローニングベ
クターを示している。このベクタは、所望の単一乗換え
を可能にするアクセプタＴｉ プラスミドのＤＮＡセグ
メント（３）の少なくとも一部と相同なりＮＡ配列を持
ったクローニング媒体ＤＮＡセグメン）（３’）を含ん
でいる。
更に、この中間クローニングベクターは、その天然のプ
ロモーター配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群（５）
を含んでいる。この組み立てに於いては、一般に植物の
遺伝子を使用することができる。
ロモーター配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群（５）
を含んでいる。この組み立てに於いては、一般に植物の
遺伝子を使用することができる。
それは、他のものに比較して発現され易いと思われるか
らである。しかし、原理的には、全ゆる所望の遺伝子を
挿入することができる。この中間クローニングベクター
は選択マーカー遺伝子（６）を含んでいてもよい。この
遺伝子は、植物細胞中でこの遺伝子の発現を可能にする
プロモーター配列を含んでいなければならない。このマ
ーカー遺伝子を含んでいる植物細胞は、それを含んでい
ない細胞より、成長の選択有利性を持っていなければな
らない。何故なら、この様にして、このマーカ遺伝子を
含んでいるＤＮＡによって形質転換された植物細胞を、
非形質転換細胞と区別することができるからである。
らである。しかし、原理的には、全ゆる所望の遺伝子を
挿入することができる。この中間クローニングベクター
は選択マーカー遺伝子（６）を含んでいてもよい。この
遺伝子は、植物細胞中でこの遺伝子の発現を可能にする
プロモーター配列を含んでいなければならない。このマ
ーカー遺伝子を含んでいる植物細胞は、それを含んでい
ない細胞より、成長の選択有利性を持っていなければな
らない。何故なら、この様にして、このマーカ遺伝子を
含んでいるＤＮＡによって形質転換された植物細胞を、
非形質転換細胞と区別することができるからである。
第３図は、第２図の中間クローニングベクタと類似の、
第１図のアクセプターＴｉプラスミドに単一乗換えによ
って挿入される本発明に係る中間クローニングベクター
のもう１つの態様を示している。これは、クローニング
媒体ＤＮＡセグメント（３°）、所望の遺伝子の統制の
とれた発現を可能にする外来性プロモーター配列（８）
、および、所望により、マーカー遺伝子（６）を含んで
いる。
第１図のアクセプターＴｉプラスミドに単一乗換えによ
って挿入される本発明に係る中間クローニングベクター
のもう１つの態様を示している。これは、クローニング
媒体ＤＮＡセグメント（３°）、所望の遺伝子の統制の
とれた発現を可能にする外来性プロモーター配列（８）
、および、所望により、マーカー遺伝子（６）を含んで
いる。
第４図は、第１図のアクセプターＴｉプラスミドおよび
第２図並びに第３図の中間クローニングベクターからの
、単一乗換えによる本発明に係るハイブリッドＴｉプラ
スミドベクターの調製を示す模式図である。
第２図並びに第３図の中間クローニングベクターからの
、単一乗換えによる本発明に係るハイブリッドＴｉプラ
スミドベクターの調製を示す模式図である。
第５図は、Ｅ、 ｃｏｌｉからアクセプターＴｉプラス
ミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの、
中間クローニングベクターの遺伝子転移に関する諸過程
を概略したものである。第１段階は、中間クローニング
ベクターを含んでいるＥ、 ｃｏｌｉ株（１）と、その
後のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとの接合の為の２つ
のヘルパープラスミドを含んでいるもう１つのＥ、ｃ。
ミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの、
中間クローニングベクターの遺伝子転移に関する諸過程
を概略したものである。第１段階は、中間クローニング
ベクターを含んでいるＥ、 ｃｏｌｉ株（１）と、その
後のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとの接合の為の２つ
のヘルパープラスミドを含んでいるもう１つのＥ、ｃ。
ｌｉ株との接合である。１方のヘルパープラスミドはプ
ラスミド転移に重要なりＮＡ配列（ｔｒａ）を含んでお
り、他方のヘルパープラスミドは授動に重要な配列（ｍ
ｏｂ）を含んでいる。接合によってこれらのヘルパープ
ラスミドがＥ、ｃｏｌｉ株（１）に導入されると、そこ
に含まれている中間クローニングベクターが他の細菌株
へ転移することができる様になる。ｔｒａおよびｍｏｂ
ヘルパープラスミドは、中間クローニングベクターが持
っている抗生物質耐性マーカー（Ａｂ’りとは異なるマ
ーカー、Ａｂ”およびＡ ｂ”をそれぞれ持っている。
ラスミド転移に重要なりＮＡ配列（ｔｒａ）を含んでお
り、他方のヘルパープラスミドは授動に重要な配列（ｍ
ｏｂ）を含んでいる。接合によってこれらのヘルパープ
ラスミドがＥ、ｃｏｌｉ株（１）に導入されると、そこ
に含まれている中間クローニングベクターが他の細菌株
へ転移することができる様になる。ｔｒａおよびｍｏｂ
ヘルパープラスミドは、中間クローニングベクターが持
っている抗生物質耐性マーカー（Ａｂ’りとは異なるマ
ーカー、Ａｂ”およびＡ ｂ”をそれぞれ持っている。
従って、全てのプラスミドが存在するかどうかを選択培
地上でモニターすることができる。こうして授動株（３
）か得られる。
地上でモニターすることができる。こうして授動株（３
）か得られる。
この授動株（３）を、第１図のアクセプターＴｉプラス
ミドを含んでいるＡ、 ｔｕｍｅｒａｃｉｅｎｓ株（４
）と接合させ、中間クローニングベクターの抗生物質耐
性マーカーで選択する。中間クローニングベクターはＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製できないので、受
容アクセプターＴｉプラスミドと相互組込み体を形成し
た場合にのみ、保持されることができる。
ミドを含んでいるＡ、 ｔｕｍｅｒａｃｉｅｎｓ株（４
）と接合させ、中間クローニングベクターの抗生物質耐
性マーカーで選択する。中間クローニングベクターはＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製できないので、受
容アクセプターＴｉプラスミドと相互組込み体を形成し
た場合にのみ、保持されることができる。
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中のこの相互組込み構造
体（５）が、ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させるのに
使用される最終的なハイブリッドＴｉプラスミドである
。
体（５）が、ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させるのに
使用される最終的なハイブリッドＴｉプラスミドである
。
第６図は、第１図に示したものと同類のモデルアクセプ
ターＴｉプラスミド（タイプＡ）の組み立てを示してい
る。ここでは、Ｔｉプラスミドと、このもとのＴｉプラ
スミドの一部と置き換わるＤＮＡ配列を含んでいる別の
プラスミドとの間で、二重乗換えが起る。より具体的に
述へると、小さい方のプラスミドはクローニング媒体（
３）の中にＴ−領域の境界配列（１，２）を含んでいる
。二重乗換えの結果、Ｔ領域の内部のＴ部分が除去され
、代ってクローニング媒体で置き換えられる。得られた
アクセプターＴｉプラスミド（Ａ）は、境界配列（Ｌ
２）の間に含まれているＤＮＡを植物細胞ゲノムに転
移させることができる。得られた、形質転換されたＤＮ
Ａは、Ｔｉプラスミド（Ａ）では腫瘍の増殖を支配して
いる遺伝子が除去されているので腫瘍性のクラウンガル
組織をっ（らない。
ターＴｉプラスミド（タイプＡ）の組み立てを示してい
る。ここでは、Ｔｉプラスミドと、このもとのＴｉプラ
スミドの一部と置き換わるＤＮＡ配列を含んでいる別の
プラスミドとの間で、二重乗換えが起る。より具体的に
述へると、小さい方のプラスミドはクローニング媒体（
３）の中にＴ−領域の境界配列（１，２）を含んでいる
。二重乗換えの結果、Ｔ領域の内部のＴ部分が除去され
、代ってクローニング媒体で置き換えられる。得られた
アクセプターＴｉプラスミド（Ａ）は、境界配列（Ｌ
２）の間に含まれているＤＮＡを植物細胞ゲノムに転
移させることができる。得られた、形質転換されたＤＮ
Ａは、Ｔｉプラスミド（Ａ）では腫瘍の増殖を支配して
いる遺伝子が除去されているので腫瘍性のクラウンガル
組織をっ（らない。
Ｔｉプラスミド（Ａ）は、クローニング媒体（３）と相
同性を有するあらゆる中間クローニングベクター用の極
めて普遍的なアクセプターＴｉプラスミドである。この
クローニング媒体（３）は通常のプラスミドでよく、例
えばｐＢ Ｒ３２２またはその誘導体などによって置き
換えることができる。
同性を有するあらゆる中間クローニングベクター用の極
めて普遍的なアクセプターＴｉプラスミドである。この
クローニング媒体（３）は通常のプラスミドでよく、例
えばｐＢ Ｒ３２２またはその誘導体などによって置き
換えることができる。
第７図は、中間クローニングベクターをＥ、 ｃｏｌ
ｉ宿主細胞中で組み立てる工程を模式的に示したもので
ある。制限エンドヌクレアーゼサイトＲ１に囲まれた所
望の遺１云子（５）および制限エンドヌクレアーゼサイ
トＲ１で囲まれた選択し得るマーカー遺伝子（６）を、
酵素Ｒ１およびＲ２の為のそれぞれ１つの制限サイトを
含んでいるクローニング媒体（３′）に挿入する。３つ
の分子を全て制限酵素Ｒ１および／またはＲ７で消化し
、ＤＮＡリガゼを用いてライゲーション（結紮）して中
間クロニングベクターを形成させる。このクローニング
媒体（３”）は、細菌遺伝子学の選択マーカとして使用
する抗生物質耐性（Ａｂ”）を暗号化しているもう１つ
のＤＮＡ配列を含んでいなければならない。所望の遺伝
子（５）はその天然のプロモーターまたは第２図および
第３図に概説した外来性プロモーターの支配下にある。
ｉ宿主細胞中で組み立てる工程を模式的に示したもので
ある。制限エンドヌクレアーゼサイトＲ１に囲まれた所
望の遺１云子（５）および制限エンドヌクレアーゼサイ
トＲ１で囲まれた選択し得るマーカー遺伝子（６）を、
酵素Ｒ１およびＲ２の為のそれぞれ１つの制限サイトを
含んでいるクローニング媒体（３′）に挿入する。３つ
の分子を全て制限酵素Ｒ１および／またはＲ７で消化し
、ＤＮＡリガゼを用いてライゲーション（結紮）して中
間クロニングベクターを形成させる。このクローニング
媒体（３”）は、細菌遺伝子学の選択マーカとして使用
する抗生物質耐性（Ａｂ”）を暗号化しているもう１つ
のＤＮＡ配列を含んでいなければならない。所望の遺伝
子（５）はその天然のプロモーターまたは第２図および
第３図に概説した外来性プロモーターの支配下にある。
第８図は本発明に係るアクセプターＴｉプラスミド（タ
イプＢ）のもう１つの具体的態様を組み立てるための模
式図である。この態様では、境界配列（１）および（２
）のすぐ外側のＴｉ配列に相同の、それぞれＤＮＡ配列
（９）および（１０）を含んでいるクローニング媒体と
Ｔｉプラスミドとの間で二重乗換えが起る。この二重乗
換えによって、境界配列（１）および（２）を含んでい
るＴ〜領領域全全体削除され、それがクローニング媒体
（３）で置き換えられる。Ｔｉプラスミド（Ｂ）は、境
界配列（１）および（２）の間にクローンされた所望の
遺伝子を含有している中間クローニングベクターのため
のアクセプターである（第９図参照）。
イプＢ）のもう１つの具体的態様を組み立てるための模
式図である。この態様では、境界配列（１）および（２
）のすぐ外側のＴｉ配列に相同の、それぞれＤＮＡ配列
（９）および（１０）を含んでいるクローニング媒体と
Ｔｉプラスミドとの間で二重乗換えが起る。この二重乗
換えによって、境界配列（１）および（２）を含んでい
るＴ〜領領域全全体削除され、それがクローニング媒体
（３）で置き換えられる。Ｔｉプラスミド（Ｂ）は、境
界配列（１）および（２）の間にクローンされた所望の
遺伝子を含有している中間クローニングベクターのため
のアクセプターである（第９図参照）。
第９図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミド（Ｂ）
に単一乗換えによって挿入される本発明の中間クローニ
ングベクターを例示している。これは、所望の遺伝子（
５）の両端に位置する境界配列（１）および（２）を含
んでいる。これはまた、２つのプラスミド間の相同的組
換えを可能にするため、アクセプターＴｉプラスミド（
Ｂ）中のクローニング媒体配列と少なくとも一部が相同
であるクローニング媒体配列（３′）をも含んでいる。
に単一乗換えによって挿入される本発明の中間クローニ
ングベクターを例示している。これは、所望の遺伝子（
５）の両端に位置する境界配列（１）および（２）を含
んでいる。これはまた、２つのプラスミド間の相同的組
換えを可能にするため、アクセプターＴｉプラスミド（
Ｂ）中のクローニング媒体配列と少なくとも一部が相同
であるクローニング媒体配列（３′）をも含んでいる。
第１０図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミドおよ
びそれに対応する第９図の中間クローニングベクターか
ら、本発明のハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組
み立てを示す模式図である。
びそれに対応する第９図の中間クローニングベクターか
ら、本発明のハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組
み立てを示す模式図である。
単一乗換えによって第９図の中間クローニングベクター
が第８図のアクセプターＴｉプラスミド（Ｂ）に導入さ
れる。
が第８図のアクセプターＴｉプラスミド（Ｂ）に導入さ
れる。
第１１図〜第２０図は本発明をより具体的に例示するも
のである。
のである。
第１１図は、５．２ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩ！フラグメン
トＡｃｇＢ のｐＢ Ｒ３２２への挿入を示している（
Ｚ ａｍｂｒｙｓｋｉ ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０９
（１９８０）１３８５−１３９１）。このフラグメント
ＡｃｇＢはツバリンＴｉプラスミドの左右の境界領域
を含んでいる。このクローンｐＡｃｇＢは、第６図に示
した「Ａ−タイプ」のアクセプタープラスミド、ｐＧＶ
３８５０の組み立てに使用される。野生型Ｔｉプラスミ
ドの左右の境界領域を含んでいるこのクローンされた制
限フラグメントを使って、クローンｐＡｃｇＢと類似の
クローンを得ることができることは、当業者には容易に
理解されるはずである。
トＡｃｇＢ のｐＢ Ｒ３２２への挿入を示している（
Ｚ ａｍｂｒｙｓｋｉ ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０９
（１９８０）１３８５−１３９１）。このフラグメント
ＡｃｇＢはツバリンＴｉプラスミドの左右の境界領域
を含んでいる。このクローンｐＡｃｇＢは、第６図に示
した「Ａ−タイプ」のアクセプタープラスミド、ｐＧＶ
３８５０の組み立てに使用される。野生型Ｔｉプラスミ
ドの左右の境界領域を含んでいるこのクローンされた制
限フラグメントを使って、クローンｐＡｃｇＢと類似の
クローンを得ることができることは、当業者には容易に
理解されるはずである。
第１２図はツバリンＴｉプラスミドｐＧＶ３８３９のＴ
−領域を示している。Ｈｉｎｄｌｌｌ制限エンドヌクレ
アーゼサイトは（Ｈ）で示しである。変異したＨｉｎｄ
Ｉｌｌフラグメント１９は（１９’）で示しである。
−領域を示している。Ｈｉｎｄｌｌｌ制限エンドヌクレ
アーゼサイトは（Ｈ）で示しである。変異したＨｉｎｄ
Ｉｌｌフラグメント１９は（１９’）で示しである。
カナマイシンまたはネオマイシン耐性を付与するアセチ
ルホスホトランスフェラーゼ遺伝子はａｐｔで表わし、
これは黒くぬりつぶした部分に存在している。Ｔ領域の
境界は矢印で示しである。ツバリンシンターゼ（ｓｙｎ
ｔｈａｓｅ）遺伝子はｎｏｓて表わした。数値は、Ｄ
ｅｐｉｃｋｅｒら（ｐｌａｓｍｉｄ。
ルホスホトランスフェラーゼ遺伝子はａｐｔで表わし、
これは黒くぬりつぶした部分に存在している。Ｔ領域の
境界は矢印で示しである。ツバリンシンターゼ（ｓｙｎ
ｔｈａｓｅ）遺伝子はｎｏｓて表わした。数値は、Ｄ
ｅｐｉｃｋｅｒら（ｐｌａｓｍｉｄ。
３（１９８０）、１９３−２１１）の方法による制限フ
ラグメントの大きさを表わしている。Ｔｉプラスミドｐ
ＧＶ３８３９は、実施例１およびそこに挙げた２つの文
献に従って組み立てることができる。
ラグメントの大きさを表わしている。Ｔｉプラスミドｐ
ＧＶ３８３９は、実施例１およびそこに挙げた２つの文
献に従って組み立てることができる。
第１３図は、アクセプターＴｉプラスミドｐＧ■３８５
０の組み立てを示している。プラスミドｐＢＲ３２２−
ｐＡｃｇＢ （第１１図）は、線状化した形で描いであ
る。ｐＢ Ｒ３２２の配列は斜線を入れた領域で示し、
ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子はＡｐＩｌで示
した。第１２図に示したｐＧ Ｖ ３８３９のＴ−領域
の一部がここに描かれている ： ｐＡｃｇＢ との相
同的組換えに関与するＨｉｎｄ ＩＩＩフラグメント（
１０）および（２３）およびａｐｔ遺伝子が含まれてい
る。二重乗換えによってｐＧ Ｖ ３８５０および失わ
れたａｐｔ遺伝子を含むもう１つのレブリフンが組み立
てられる。
０の組み立てを示している。プラスミドｐＢＲ３２２−
ｐＡｃｇＢ （第１１図）は、線状化した形で描いであ
る。ｐＢ Ｒ３２２の配列は斜線を入れた領域で示し、
ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子はＡｐＩｌで示
した。第１２図に示したｐＧ Ｖ ３８３９のＴ−領域
の一部がここに描かれている ： ｐＡｃｇＢ との相
同的組換えに関与するＨｉｎｄ ＩＩＩフラグメント（
１０）および（２３）およびａｐｔ遺伝子が含まれてい
る。二重乗換えによってｐＧ Ｖ ３８５０および失わ
れたａｐｔ遺伝子を含むもう１つのレブリフンが組み立
てられる。
第１４図は、実施例２に詳細に記載した中間クローニン
グベクターｐＧＶ７００の組み立てを模式的に示したも
のである。制限エンドヌクレアセサイトを示すのに以下
の略号を用いた： Ｂ＝Ｂａｍｌ（［ＳＢｇ ＝Ｂｇｌ
ＩＩ ５Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、 Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
、 ５＝Ｓａｌ Ｉ、Ｓ ｍ＝ Ｓ ｍａ Ｉ ｏ抗生
物質耐性を示すのに以下の略号を用いた：Ａｐ−アンピ
シリン、Ｃｍ−クロラムフェニコール、Ｓｍストレプト
マイシン、Ｔｃ−テトラサイクリン。
グベクターｐＧＶ７００の組み立てを模式的に示したも
のである。制限エンドヌクレアセサイトを示すのに以下
の略号を用いた： Ｂ＝Ｂａｍｌ（［ＳＢｇ ＝Ｂｇｌ
ＩＩ ５Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、 Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
、 ５＝Ｓａｌ Ｉ、Ｓ ｍ＝ Ｓ ｍａ Ｉ ｏ抗生
物質耐性を示すのに以下の略号を用いた：Ａｐ−アンピ
シリン、Ｃｍ−クロラムフェニコール、Ｓｍストレプト
マイシン、Ｔｃ−テトラサイクリン。
ＴＬ−ＤＮＡで示した図の下部の数値は、この領域のＲ
ＮＡ転写体を示している（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒら、Ｅ
ＭＢＯＪ、１（１９８２）、１３９１４６）。
ＮＡ転写体を示している（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒら、Ｅ
ＭＢＯＪ、１（１９８２）、１３９１４６）。
第１５図は中間クローニングヘクターｐＧＶ７５０の構
造を示している。その組み立ては実施例２に記載した。
造を示している。その組み立ては実施例２に記載した。
制限エンドヌクレアーセサイトは、キロ塩基対（ｋｂ）
の数で表わしたその相対的位置で示した。Ｐｓｔｌサイ
トは示していないがＫｍＲ／ＮｍＲ領域に３つ、ＣｂＲ
遺伝子に１つ存在する。
の数で表わしたその相対的位置で示した。Ｐｓｔｌサイ
トは示していないがＫｍＲ／ＮｍＲ領域に３つ、ＣｂＲ
遺伝子に１つ存在する。
左右の境界領域も示しである。ｐＧＶ７５０ の組み立
てに使用されたＢｇｌ ＩＩ、／ ＢａｍＨＩサイトお
よびＨｐａｌ／Ｓｍａｌサイトが示されているが、これ
はｐＧＶ７５０ には存在しない。影をつけた領域はＴ
Ｌ−ＤＮＡに、黒い領域はＫ ｍＲ／ Ｎ ｍＲ領領域
、白ぬき部分は隣接するＴｉプラスミド配列に、そして
線はクローニング媒体ｐＢＲ３２５にそれぞれ相当する
。その他の略号は以下の意味を有する：○ｃｓ”オクト
ピンシンターゼ、ＣｍＲ＝クロラムフェニコールｉ性、
ｃｂ” ＝カルベニシリン（アンピシリン類似体）耐性
、Ｋ♂／ＮｍＲカナマイシン耐性／ネオマイシン耐性。
てに使用されたＢｇｌ ＩＩ、／ ＢａｍＨＩサイトお
よびＨｐａｌ／Ｓｍａｌサイトが示されているが、これ
はｐＧＶ７５０ には存在しない。影をつけた領域はＴ
Ｌ−ＤＮＡに、黒い領域はＫ ｍＲ／ Ｎ ｍＲ領領域
、白ぬき部分は隣接するＴｉプラスミド配列に、そして
線はクローニング媒体ｐＢＲ３２５にそれぞれ相当する
。その他の略号は以下の意味を有する：○ｃｓ”オクト
ピンシンターゼ、ＣｍＲ＝クロラムフェニコールｉ性、
ｃｂ” ＝カルベニシリン（アンピシリン類似体）耐性
、Ｋ♂／ＮｍＲカナマイシン耐性／ネオマイシン耐性。
第１６図は実施例３に詳細に記載した中間ベクターｐＧ
Ｖ７４５の組み立てを示している。ｐＧＶ７４５は、第
８図に示した「Ｂタイプ」アクセプタプラスミド、ｐＧ
Ｖ２２６０の組み立てに使用される。制限エンドヌクレ
アーゼサイトは以下の略号で示した： Ｂ＝ＢａｍＨＩ
、 Ｈ＝Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ 。
Ｖ７４５の組み立てを示している。ｐＧＶ７４５は、第
８図に示した「Ｂタイプ」アクセプタプラスミド、ｐＧ
Ｖ２２６０の組み立てに使用される。制限エンドヌクレ
アーゼサイトは以下の略号で示した： Ｂ＝ＢａｍＨＩ
、 Ｈ＝Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ 。
Ｒ＝ Ｅ ｃｏＲＩ ｏアンピシリン耐性遺伝子はＡ
ｐＲで示した。斜線を施した領域はオクトピンＴｉ プ
ラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の左（１１１７トＩｌｌ 同
のＤＮＡを、白ぬき領域はオクトピンＴｉ プラスミド
のＴＤＮＡ領域の右側と相同のＤＮＡを示している。
ｐＲで示した。斜線を施した領域はオクトピンＴｉ プ
ラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の左（１１１７トＩｌｌ 同
のＤＮＡを、白ぬき領域はオクトピンＴｉ プラスミド
のＴＤＮＡ領域の右側と相同のＤＮＡを示している。
出発物質であるプラスミドｐＧＶＯ２１９およびｐＧＶ
Ｏ］２０についての物理的位置および記述は、ＤｅＶｏ
ｓらのＰｌａｓｍｉｄ ６（１９８１）、２４９−２５
３にみられる。
Ｏ］２０についての物理的位置および記述は、ＤｅＶｏ
ｓらのＰｌａｓｍｉｄ ６（１９８１）、２４９−２５
３にみられる。
（以下、余白）
第１７図はアクセプタープラスミドｐＧＶ２２６０の組
み立てを示している。ｐＧＶ２２１７ 中の欠損置換が
、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を付与する
アセチルホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｔで表
わしである）を含んでいる黒色部分で示しである。中間
ベクターｐＧＶ７４５（第１６図参照）は線状化して描
いである。これは第１６図に示したｐＧＶ７４５のＨｉ
ｎｄｌｌｌサイトで開裂したものである。ｐＢＲ３２２
の配列は斜線を施した部分で示し、アンピシリン耐性遺
伝子はＡＰＲで示しである。二重乗換えによって、ｐＧ
Ｖ２２６０が組み立てられ、ａｐｔ遺伝子が失われる。
み立てを示している。ｐＧＶ２２１７ 中の欠損置換が
、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を付与する
アセチルホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｔで表
わしである）を含んでいる黒色部分で示しである。中間
ベクターｐＧＶ７４５（第１６図参照）は線状化して描
いである。これは第１６図に示したｐＧＶ７４５のＨｉ
ｎｄｌｌｌサイトで開裂したものである。ｐＢＲ３２２
の配列は斜線を施した部分で示し、アンピシリン耐性遺
伝子はＡＰＲで示しである。二重乗換えによって、ｐＧ
Ｖ２２６０が組み立てられ、ａｐｔ遺伝子が失われる。
制限エンドヌクレアーゼサイトは以下の略号で示した：
Ｂ＝ＢａｍＨ［５Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｒ＝Ｅｃｏ
ＲＩ０ 第１８図は、ツバリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）のプ
ロモーターの下流の遺伝子を発現するためのプラスミド
ｐＬＧＶ２３８１の組み立てを示している。５′および
３′はそれぞれ転写開始と転写終了を意味し、ＡＴＧお
よびＴＡＡは翻訳開始および翻訳終了に使われるコドン
を表わしている。
Ｂ＝ＢａｍＨ［５Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｒ＝Ｅｃｏ
ＲＩ０ 第１８図は、ツバリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）のプ
ロモーターの下流の遺伝子を発現するためのプラスミド
ｐＬＧＶ２３８１の組み立てを示している。５′および
３′はそれぞれ転写開始と転写終了を意味し、ＡＴＧお
よびＴＡＡは翻訳開始および翻訳終了に使われるコドン
を表わしている。
太線はｎｏｓプロモーター領域、白ぬき部分はｎｏｓ暗
号領域を示している。ＡｐＲはアンピシリン耐性、Ｋｍ
Ｒはカナマイシン耐性を示している。
号領域を示している。ＡｐＲはアンピシリン耐性、Ｋｍ
Ｒはカナマイシン耐性を示している。
第１９図は、完全なオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）暗
号配列を含んでいるプラスミドｐＡＧＶ４０の組み立て
、およびプラスミドｐＬＧＶ２３８１（第１８図参照）
中ｎｏｓプロモーターの後部へのその挿入を示している
。太線はプロモーター領域、白ぬき部分はｏｃｓ暗号領
域を示している。その他の記号は第１８図と同じである
。
号配列を含んでいるプラスミドｐＡＧＶ４０の組み立て
、およびプラスミドｐＬＧＶ２３８１（第１８図参照）
中ｎｏｓプロモーターの後部へのその挿入を示している
。太線はプロモーター領域、白ぬき部分はｏｃｓ暗号領
域を示している。その他の記号は第１８図と同じである
。
第２０図は、ツバリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子のプ
ロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列およびオクト
ピンシンターゼ遺伝子暗号領域と融合した後の同じ領域
の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合点は星印
（＊）で示した。いくつかの制限エンドヌクレアーゼサ
イト、即ち、ＢａｒａＨ■、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 、およ
び５ａｃｌｌ も示しである。
ロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列およびオクト
ピンシンターゼ遺伝子暗号領域と融合した後の同じ領域
の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合点は星印
（＊）で示した。いくつかの制限エンドヌクレアーゼサ
イト、即ち、ＢａｒａＨ■、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 、およ
び５ａｃｌｌ も示しである。
５°および３′は転写開始および終了を意味する。
ＡＴＧは翻訳に使われる最初のコドン、ＴＡＡは翻訳に
使われる終了コドンを表わしている。白ぬきの大きい矢
印はツバリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢印はオ
クトピン遺伝子を表わしている。
使われる終了コドンを表わしている。白ぬきの大きい矢
印はツバリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢印はオ
クトピン遺伝子を表わしている。
以下に本発明の詳細な説明する。
第１図にアクセプターＴｉプラスミドを簡単に図式化し
て示した。このアクセプターＴｉプラスミドは、野生型
腫瘍誘起（Ｔ ｉ）プラスミドの２つの境界配列（１，
２）または領域を含んでいる。この境界配列は、Ｔｉプ
ラスミドのＴ−領域を植物細胞ゲノムへ組込むのに必須
である。換言すれば、あらゆるＤＮＡ配列（３）または
Ｔ−領域を、これらの配列間に存在している植物細胞ゲ
ノムに組込むのにこの境界配列が絶対に必要である。
て示した。このアクセプターＴｉプラスミドは、野生型
腫瘍誘起（Ｔ ｉ）プラスミドの２つの境界配列（１，
２）または領域を含んでいる。この境界配列は、Ｔｉプ
ラスミドのＴ−領域を植物細胞ゲノムへ組込むのに必須
である。換言すれば、あらゆるＤＮＡ配列（３）または
Ｔ−領域を、これらの配列間に存在している植物細胞ゲ
ノムに組込むのにこの境界配列が絶対に必要である。
このアクセプターＴｉプラスミドのＤＮＡ配列（３）に
は、第２図および第３図に示した中間クロニングベクタ
ーのＤＮＡ配列（３′）の少なくとも１部と相同のＤＮ
Ａセグメントが含まれている。
は、第２図および第３図に示した中間クロニングベクタ
ーのＤＮＡ配列（３′）の少なくとも１部と相同のＤＮ
Ａセグメントが含まれている。
この相同性は、中間クローニングベクターとアクセプタ
ーＴｉプラスミドか単一乗換え（相同性組換え）によっ
て相互組込みするのに必要である。
ーＴｉプラスミドか単一乗換え（相同性組換え）によっ
て相互組込みするのに必要である。
相互組込み体の得られる頻度は、基本的には相同領域の
長さできまる。相同性組換えを高頻度で起すには、通常
１〜４ｋｂの領域が使われる（ Ｌ ｅｅｍａｎｓら、
Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、
Ｉ （１９８１）。
長さできまる。相同性組換えを高頻度で起すには、通常
１〜４ｋｂの領域が使われる（ Ｌ ｅｅｍａｎｓら、
Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、
Ｉ （１９８１）。
１４９−１６４）。
アクセプターＴｉプラスミドは更に、Ａ ｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｎによってＴｉプラスミドのＴ−領域が植物
細胞ゲノムへ移動するのに必要な配列（４）を含んでい
る。
ｔｅｒｉｕｎによってＴｉプラスミドのＴ−領域が植物
細胞ゲノムへ移動するのに必要な配列（４）を含んでい
る。
この様なアクセプターＴｉプラスミドの組み立ておよび
第２図および第３図に示した中間クロニングベクターと
のその相互組込みについて、第４図を参照しながら以下
に詳述する。
第２図および第３図に示した中間クロニングベクターと
のその相互組込みについて、第４図を参照しながら以下
に詳述する。
第２図および第３図に、発現しようとする、即ち、植物
細胞中でプロモーターの支配下に転写され、翻訳される
所望の原核性または真核性遺伝子をクローンするための
中間クローニングベクタを簡略化した図で示した。これ
らの中間クローニングベクターは、アクセプターＴｉプ
ラスミドのＤＮＡセグメント（３）の少な（とも一部と
相同であり、従って単一乗換えを可能にするＤＮＡ配列
を含んでいるクローニング媒体からのＤＮＡセグメント
（３°）を含んでいる。さらに、この中間クローニング
ベクターは、その天然のあるいは外来性のプロモーター
配列を含む少なくとも１つの所望の遺伝子（５，７）を
含んでいる。このブロモター配列によって、挿入された
遺伝子配列の発現が可能である。所望の挿入遺伝子（群
）の発現を調整するために、外来性のプロモーター配列
（仕立て上げたプロモーター）を使うことも可能である
。
細胞中でプロモーターの支配下に転写され、翻訳される
所望の原核性または真核性遺伝子をクローンするための
中間クローニングベクタを簡略化した図で示した。これ
らの中間クローニングベクターは、アクセプターＴｉプ
ラスミドのＤＮＡセグメント（３）の少な（とも一部と
相同であり、従って単一乗換えを可能にするＤＮＡ配列
を含んでいるクローニング媒体からのＤＮＡセグメント
（３°）を含んでいる。さらに、この中間クローニング
ベクターは、その天然のあるいは外来性のプロモーター
配列を含む少なくとも１つの所望の遺伝子（５，７）を
含んでいる。このブロモター配列によって、挿入された
遺伝子配列の発現が可能である。所望の挿入遺伝子（群
）の発現を調整するために、外来性のプロモーター配列
（仕立て上げたプロモーター）を使うことも可能である
。
調整の各種の例として、以下のものを挙げることができ
る：（ｉ）組織に特異な発現、即ち、葉、根、茎、花な
ど、（ｉｉ）発現レベル、即ち、発現の強弱、（ｉｉｉ
）誘導性発現、即ち、温度、光または添加された化学的
因子による発現など。
る：（ｉ）組織に特異な発現、即ち、葉、根、茎、花な
ど、（ｉｉ）発現レベル、即ち、発現の強弱、（ｉｉｉ
）誘導性発現、即ち、温度、光または添加された化学的
因子による発現など。
中間クローニングベクター用の所望の遺伝子の例として
は、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成をコントロール
して植物の栄養価や成長度を改良する遺伝情報を持った
ＤＮＡフラグメントまたは配列、外部から病原物質に対
する保護、例えば病原生物またはストレスとなる環境因
子に対する耐性、を付与する生産物の合成をコントロー
ルする遺伝情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列
、遺伝子工学によって改良しようとする植物の基本的な
過程に情報を与える生産物の合成をコントロルする遺伝
情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列など。
は、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成をコントロール
して植物の栄養価や成長度を改良する遺伝情報を持った
ＤＮＡフラグメントまたは配列、外部から病原物質に対
する保護、例えば病原生物またはストレスとなる環境因
子に対する耐性、を付与する生産物の合成をコントロー
ルする遺伝情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列
、遺伝子工学によって改良しようとする植物の基本的な
過程に情報を与える生産物の合成をコントロルする遺伝
情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列など。
第２図および第３図は、選択可能なマーカー遺伝子（６
）を含んでいることもある中間クローニングベクターを
表わしている。選択可能なマーカ遺伝子としては、例え
ば抗生物質または有毒な類似物質（例えばアミノ酸類縁
体）を暗号化している遺伝子、受容宿主細胞の欠損を補
う遺伝子なとが挙げられる。
）を含んでいることもある中間クローニングベクターを
表わしている。選択可能なマーカ遺伝子としては、例え
ば抗生物質または有毒な類似物質（例えばアミノ酸類縁
体）を暗号化している遺伝子、受容宿主細胞の欠損を補
う遺伝子なとが挙げられる。
第４図は、ハイブリッドＴｉプラスミドベクタの組み立
てに関与する構成を示しており、第５図は、そのハイブ
リッドＴｉプラスミドベクタを保持しているＡ ｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ｉｕｍの分離に関与する実際の接合工程
を表わしている。この工程は、中間クローニングベクタ
ーがＥ 、 ｃｏｌｉ中で組み立てられるので、この中
間クローニングベクターをＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ中のアクセプタープラスミドに転移させるのに必要で
ある。
てに関与する構成を示しており、第５図は、そのハイブ
リッドＴｉプラスミドベクタを保持しているＡ ｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ｉｕｍの分離に関与する実際の接合工程
を表わしている。この工程は、中間クローニングベクタ
ーがＥ 、 ｃｏｌｉ中で組み立てられるので、この中
間クローニングベクターをＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ中のアクセプタープラスミドに転移させるのに必要で
ある。
Ｔ−領域の一部が変更された配列で置換されている改良
Ｔｉプラスミドを調製するのに用いられる既知の転移手
法は多数の工程からなっている。
Ｔｉプラスミドを調製するのに用いられる既知の転移手
法は多数の工程からなっている。
通常、大抵のＤＮＡ組換え操作は、特別に設計されたク
ローニング媒体、例えばｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ
、 Ｇｅｎｅ ２（１９７７）、 ７５−９３）中で行
なわれる。しかしこのクローニング媒体は、それ自体Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに移動することができない
。この問題は、既知の方法では次の様にして解決されて
いる： ａ） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中でも複製し得る
別の広範囲宿主用クローニング媒体、例えばｍ１ｎｉ−
Ｓａミツラスミド Ｌ ｅｅｍａｎｓら、Ｇｅｎｅ １
９（１９８２）。
ローニング媒体、例えばｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ
、 Ｇｅｎｅ ２（１９７７）、 ７５−９３）中で行
なわれる。しかしこのクローニング媒体は、それ自体Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに移動することができない
。この問題は、既知の方法では次の様にして解決されて
いる： ａ） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中でも複製し得る
別の広範囲宿主用クローニング媒体、例えばｍ１ｎｉ−
Ｓａミツラスミド Ｌ ｅｅｍａｎｓら、Ｇｅｎｅ １
９（１９８２）。
３６１−３６４）でｐＢＲクローニング媒体配列を置換
する。この操作はＥ、ｃｏｌｉ中で行ない、中間クロー
ニングベクターが得られる。
する。この操作はＥ、ｃｏｌｉ中で行ない、中間クロー
ニングベクターが得られる。
ｂ）所望のＤＮＡを含有している中間クローニングベク
ターを保持したＥ 、 ｃｏｌ ｉ株と、Ａ ｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ中では複製できないがそれ自体および
他のＤＮＡのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移を
仲介することのできるヘルパープラスミドを保持した別
のＥｃｏｌｉ株との接合。
ターを保持したＥ 、 ｃｏｌ ｉ株と、Ａ ｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ中では複製できないがそれ自体および
他のＤＮＡのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移を
仲介することのできるヘルパープラスミドを保持した別
のＥｃｏｌｉ株との接合。
Ｃ）工程（ｂ）で得られるＥ 、 ｃｏｌ ｉとＴｉプ
ラスミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの
接合。ヘルパープラスミドは失われる。
ラスミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの
接合。ヘルパープラスミドは失われる。
ｄ）中間クローニングベクターは、独立したレプリコン
としてＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製し、存在
することができるので、工程（ｃ）で得られた接合体は
、中間クローニングベクターとＴｉプラスミドとの相互
組込み体を含んでいる細胞、または中間クローニングベ
クターおよび相互組込みが起らなかったＴｉプラスミド
を含んでいる別の細胞の混合物である。相互組込み体だ
けを特異的に分離する為に、Ｔｉプラスミドのない別の
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株との接合をもう一度行
なわなければならない。この転移は、Ｔｉプラスミド自
体によって暗号化されている機能によって仲介される。
としてＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製し、存在
することができるので、工程（ｃ）で得られた接合体は
、中間クローニングベクターとＴｉプラスミドとの相互
組込み体を含んでいる細胞、または中間クローニングベ
クターおよび相互組込みが起らなかったＴｉプラスミド
を含んでいる別の細胞の混合物である。相互組込み体だ
けを特異的に分離する為に、Ｔｉプラスミドのない別の
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株との接合をもう一度行
なわなければならない。この転移は、Ｔｉプラスミド自
体によって暗号化されている機能によって仲介される。
この第２のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株への中間ク
ローニングベクターの転移は、Ｔｉプラスミドとの相互
組込み体の形でのみ行なわれる。
ローニングベクターの転移は、Ｔｉプラスミドとの相互
組込み体の形でのみ行なわれる。
ｅ）所望の置換を行なった最終的な改良Ｔｉプラスミド
を得るために、第２回目の乗換えが行なわれる （Ｌ
ｅｅｍａｎｓら、Ｊ 、 Ｍｏ１． Ａ ｐｐｌ、
Ｇ ｅｎｅｔ。
を得るために、第２回目の乗換えが行なわれる （Ｌ
ｅｅｍａｎｓら、Ｊ 、 Ｍｏ１． Ａ ｐｐｌ、
Ｇ ｅｎｅｔ。
１（１９８１）、１４９−１６４）。
僅かにもう１つの既知の方法は、上記工程（ｄ）におい
て、中間クローニングベクターと適合しない別のプラス
ミドをＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに導入することを
除けば、上の方法と基本的に同じである。この場合、独
立したレプリコンのままでいる中間クローニングベクタ
ーは全て失われるので、相互組込み（単一乗換え）を選
択することができる（Ｍａｔｚｋｅ ら、Ｊ、 Ｍｏ
１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 １ （１９
８１）、３９−４９ ）。
て、中間クローニングベクターと適合しない別のプラス
ミドをＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに導入することを
除けば、上の方法と基本的に同じである。この場合、独
立したレプリコンのままでいる中間クローニングベクタ
ーは全て失われるので、相互組込み（単一乗換え）を選
択することができる（Ｍａｔｚｋｅ ら、Ｊ、 Ｍｏ
１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 １ （１９
８１）、３９−４９ ）。
ここに本発明者らは、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの
アクセプターＴｉ プラスミドに中間クローニングベク
タを導入する為の、新規な非常に簡素化された方法を提
供するものである。簡単に言えば、この方法は、多くの
通常使用されているクローニングプラスミド（例えばｐ
ＢＲ３２２）をａｔ−？ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
に転移させるのに、Ｅ、 ｃｏｌｉのへルバブラスミド
が役立つということを見い出した事実に基ついている。
アクセプターＴｉ プラスミドに中間クローニングベク
タを導入する為の、新規な非常に簡素化された方法を提
供するものである。簡単に言えば、この方法は、多くの
通常使用されているクローニングプラスミド（例えばｐ
ＢＲ３２２）をａｔ−？ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
に転移させるのに、Ｅ、 ｃｏｌｉのへルバブラスミド
が役立つということを見い出した事実に基ついている。
これらのプラスミドは、いづれもＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ中では複製できないので、アクセプターＴｉプ
ラスミドと相互組込みし得るものだけが保持されること
になる。さらに、本発明者らは、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ中のこの相互組込み体を、植物細胞への感染の
為の直接のベクター組成物として使用するのである。こ
の様にして、本発明者らは前記の工程（ｄ）および（ｅ
）を省略した。これによって、改良ハイブリッドＴｉプ
ラスミドを組み立てるのに要する時間が減少し、可能な
組み立てに柔軟性が増加し、かくして、植物細胞ゲノム
へＤＮＡを転移させる為のベクターとしてこのアクセプ
ターＴｉプラスミドを使用できる可能性が著しく高まっ
たのである。
ｒｉｕｍ中では複製できないので、アクセプターＴｉプ
ラスミドと相互組込みし得るものだけが保持されること
になる。さらに、本発明者らは、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ中のこの相互組込み体を、植物細胞への感染の
為の直接のベクター組成物として使用するのである。こ
の様にして、本発明者らは前記の工程（ｄ）および（ｅ
）を省略した。これによって、改良ハイブリッドＴｉプ
ラスミドを組み立てるのに要する時間が減少し、可能な
組み立てに柔軟性が増加し、かくして、植物細胞ゲノム
へＤＮＡを転移させる為のベクターとしてこのアクセプ
ターＴｉプラスミドを使用できる可能性が著しく高まっ
たのである。
即ち、第５図に概略を示した様に、アクセプタＴｉプラ
スミドへの中間クローニングベクタの導入は２工程で行
なわれる。先づ、中間クロニングベクターを持ったＥ、
ｃｏ！ｉ株（１）を、この中間クローニングベクター
のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの授動を促す２つの
プラスミドを持った別のＥｃｏｌｉ株（２）と接合させ
る。これらのヘルパープラスミドの代表的な、そして好
ましい例は、ｒＱｏｂ機能を含んだＲ６４ｄｒｄｌｌお
よびｔｒａ機能を含んだｐＧＪ２８である（Ｆ ｉｎｎ
ｅｇａｎら、Ｍｏｌ、 ＧｅｎＧｅｎｅｔ、 １８５
（１９８２）、３４４−３５１）。中間クローニングベ
クターのクローニング媒体上のｂｏｍサイト（Ｗａｒｒ
ｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ２７４ （１９７８）。
スミドへの中間クローニングベクタの導入は２工程で行
なわれる。先づ、中間クロニングベクターを持ったＥ、
ｃｏ！ｉ株（１）を、この中間クローニングベクター
のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの授動を促す２つの
プラスミドを持った別のＥｃｏｌｉ株（２）と接合させ
る。これらのヘルパープラスミドの代表的な、そして好
ましい例は、ｒＱｏｂ機能を含んだＲ６４ｄｒｄｌｌお
よびｔｒａ機能を含んだｐＧＪ２８である（Ｆ ｉｎｎ
ｅｇａｎら、Ｍｏｌ、 ＧｅｎＧｅｎｅｔ、 １８５
（１９８２）、３４４−３５１）。中間クローニングベ
クターのクローニング媒体上のｂｏｍサイト（Ｗａｒｒ
ｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ２７４ （１９７８）。
２５９−２６１）が他の２つのプラスミドによって暗号
化されている機能体によって認識され、転移できる様に
なる。全てのプラスミドは、その存在を検出するために
抗生物質耐性マーカーを含んでいるのが好ましい。次い
で、得られたＥ、 ｃｏｌｉ株、即ち３つのプラスミド
全てを保持している授動株（３）を、中間クローニング
ベクターと相同の領域を持ったアクセプターＴｉプラス
ミドを保持しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中と
接合させる。中間クロニングベクターとアクセプターＴ
ｉ プラスミドとの単一乗換えが行なわれたかどうかは
、中間クローニングベクターの抗生物質耐性マーカーに
ついての選択によって検出できる。
化されている機能体によって認識され、転移できる様に
なる。全てのプラスミドは、その存在を検出するために
抗生物質耐性マーカーを含んでいるのが好ましい。次い
で、得られたＥ、 ｃｏｌｉ株、即ち３つのプラスミド
全てを保持している授動株（３）を、中間クローニング
ベクターと相同の領域を持ったアクセプターＴｉプラス
ミドを保持しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中と
接合させる。中間クロニングベクターとアクセプターＴ
ｉ プラスミドとの単一乗換えが行なわれたかどうかは
、中間クローニングベクターの抗生物質耐性マーカーに
ついての選択によって検出できる。
第６図は、第１図のアクセプターＴｉプラスミドの組み
立てに用いられたＤＮＡ分子を模式的に示したものであ
る。本明細書では、このプラスミドをアクセプターＴｉ
プラスミド（タイプＡ）と呼び、他のアクセプターＴ
ｉ プラスミド（タイプＢ）と区別することにする（第
８図参照）。この組み立てには、Ｔｉプラスミドと、ク
ローニング媒体（３）中に境界配列（１）および（２）
を持っているもう１つのプラスミドとの間に二重乗換え
が起ることが必要である。図に示した様に、クローニン
グ媒体配列（３）は左側の境界配列（１）と右側の境界
配列（２）との間にある。このＤＮＡ鎖の正しい極性を
示すために、これを環上に描くことができる。
立てに用いられたＤＮＡ分子を模式的に示したものであ
る。本明細書では、このプラスミドをアクセプターＴｉ
プラスミド（タイプＡ）と呼び、他のアクセプターＴ
ｉ プラスミド（タイプＢ）と区別することにする（第
８図参照）。この組み立てには、Ｔｉプラスミドと、ク
ローニング媒体（３）中に境界配列（１）および（２）
を持っているもう１つのプラスミドとの間に二重乗換え
が起ることが必要である。図に示した様に、クローニン
グ媒体配列（３）は左側の境界配列（１）と右側の境界
配列（２）との間にある。このＤＮＡ鎖の正しい極性を
示すために、これを環上に描くことができる。
しかし、二重乗換えに使用される相同領域を示すために
は、この環を開裂させて図示した。これは理解を助ける
為のやり方として重要であり、第８図に於けるアクセプ
ターＴｉプラスミド（Ｂ）の組み立てに於いても用いら
れている。即ち、もし境界配列（１）および（２）が、
単にクローニング媒体配列（３）内に挿入されたのなら
、二重乗換えによって、Ｔ−領域が削除されてはいるが
この境界配列（１）および（２）の間のクローニング媒
体配列のネいＴｉプラスミドが得られることになる。第
６図に示した様に、二重乗換えによって、境界配列（１
）および（２）の間にもとのＴ−領域を持った環状ＤＮ
Ａ分子が生成する。これはレプリコンではないので消失
する運命にある。この二重乗換えが起ったかどうかは、
例えばＴｉプラスミドのＴ−領域内に含まれる抗生物質
マーカーの欠落について選択したり、クローニング媒体
配列（３）内の抗生物質耐性マーカーについて選択した
りして、遺伝子学的に選択することができる。
は、この環を開裂させて図示した。これは理解を助ける
為のやり方として重要であり、第８図に於けるアクセプ
ターＴｉプラスミド（Ｂ）の組み立てに於いても用いら
れている。即ち、もし境界配列（１）および（２）が、
単にクローニング媒体配列（３）内に挿入されたのなら
、二重乗換えによって、Ｔ−領域が削除されてはいるが
この境界配列（１）および（２）の間のクローニング媒
体配列のネいＴｉプラスミドが得られることになる。第
６図に示した様に、二重乗換えによって、境界配列（１
）および（２）の間にもとのＴ−領域を持った環状ＤＮ
Ａ分子が生成する。これはレプリコンではないので消失
する運命にある。この二重乗換えが起ったかどうかは、
例えばＴｉプラスミドのＴ−領域内に含まれる抗生物質
マーカーの欠落について選択したり、クローニング媒体
配列（３）内の抗生物質耐性マーカーについて選択した
りして、遺伝子学的に選択することができる。
第７図は、第２図および第３図の中間クローニングベク
ターの組み立てを示す模式図である。制限エンドヌクレ
アーゼサイトＲ１またはＲ１でそれぞれ囲まれた所望の
遺伝子（５）および選択可能なマーカー遺伝子（６）が
、酵素Ｒ，およびＲ７の為の特異な制限サイトを含んで
いるクローニング媒体配列（３°）に、これら全ての分
子の消化およびライゲーションによって挿入される。得
られた組換えＤＮＡ分子は、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞を形
質転換するのに使用され、その形質転換体は、クローニ
ング媒体配列（３′）の抗生物質耐性マーカー（Ａｂｌ
ｌ＋）で選択される。
ターの組み立てを示す模式図である。制限エンドヌクレ
アーゼサイトＲ１またはＲ１でそれぞれ囲まれた所望の
遺伝子（５）および選択可能なマーカー遺伝子（６）が
、酵素Ｒ，およびＲ７の為の特異な制限サイトを含んで
いるクローニング媒体配列（３°）に、これら全ての分
子の消化およびライゲーションによって挿入される。得
られた組換えＤＮＡ分子は、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞を形
質転換するのに使用され、その形質転換体は、クローニ
ング媒体配列（３′）の抗生物質耐性マーカー（Ａｂｌ
ｌ＋）で選択される。
第８図は本発明のもう１つの態様、即ちアクセプターＴ
ｉプラスミド（Ｂ）を組み立てるのに使用されるＤＮＡ
分子の模式図である。この場合は、境界配列（１）およ
び（２）のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列（９）および
（１０）の回にクローニング媒体配列（３）を含んでい
るプラスミドとＴｉプラスミドとの間で二重乗換えが起
る。乗換えに使用される相同領域を示す為に、小さい方
のプラスミドは開裂しである（第６図と同様）。二重乗
換えによる生成物は、アクセプターＴｉプラスミド（Ｂ
）と、もとのＴｉプラスミドからのＴ−領域およびＤＮ
Ａ配列（２）、（１０）、（９）および（１）を含んで
いる、消失するもう１つの環状ＤＮＡ分子である。
ｉプラスミド（Ｂ）を組み立てるのに使用されるＤＮＡ
分子の模式図である。この場合は、境界配列（１）およ
び（２）のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列（９）および
（１０）の回にクローニング媒体配列（３）を含んでい
るプラスミドとＴｉプラスミドとの間で二重乗換えが起
る。乗換えに使用される相同領域を示す為に、小さい方
のプラスミドは開裂しである（第６図と同様）。二重乗
換えによる生成物は、アクセプターＴｉプラスミド（Ｂ
）と、もとのＴｉプラスミドからのＴ−領域およびＤＮ
Ａ配列（２）、（１０）、（９）および（１）を含んで
いる、消失するもう１つの環状ＤＮＡ分子である。
遺伝子学的選択は第６図について記載したものと同様に
して行なうことができる。
して行なうことができる。
第９図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミドＢと組
み合せて使用される中間クローニングベクターの模式図
である。ここでは、所望の遺伝子（５）は、クローニン
グ媒体配列（３″）中に含まれている境界配列（１）お
よび（２）の間に挿入される。
み合せて使用される中間クローニングベクターの模式図
である。ここでは、所望の遺伝子（５）は、クローニン
グ媒体配列（３″）中に含まれている境界配列（１）お
よび（２）の間に挿入される。
第１０図は、単一乗換えにより第９図の中間クローニン
グベクターがどの様にしてアクセプターＴｉプラスミド
（Ｂ）に挿入されるかを模式的に示している。この場合
、中間クローニングベクターのクローニング媒体配列（
３”）の抗生物質耐性マカーで選択すると、２つのプラ
スミドの間の相互組込みの結果としてのハイブリッドＴ
ｉプラスミドを確実に見つけることができる。こうして
境界配列（１）および（２）内に含まれている所望の遺
伝子を持ったハイブリッドＴｉプラスミドが得られる。
グベクターがどの様にしてアクセプターＴｉプラスミド
（Ｂ）に挿入されるかを模式的に示している。この場合
、中間クローニングベクターのクローニング媒体配列（
３”）の抗生物質耐性マカーで選択すると、２つのプラ
スミドの間の相互組込みの結果としてのハイブリッドＴ
ｉプラスミドを確実に見つけることができる。こうして
境界配列（１）および（２）内に含まれている所望の遺
伝子を持ったハイブリッドＴｉプラスミドが得られる。
この様にして組み立てられたハイブリッドプラスミドは
、そのＴ−領域に、例えば第４図のハイブリッドＴｉプ
ラスミド中の配列（３）および（３′）の様な直接反復
の配列を含有しておらず、従って、分子内組換えの結果
として、ハイブリッドベクターまたは植物細胞ゲノム中
に導入されたＤＮＡが不安定になる可能性が避けられる
。
、そのＴ−領域に、例えば第４図のハイブリッドＴｉプ
ラスミド中の配列（３）および（３′）の様な直接反復
の配列を含有しておらず、従って、分子内組換えの結果
として、ハイブリッドベクターまたは植物細胞ゲノム中
に導入されたＤＮＡが不安定になる可能性が避けられる
。
本発明者らの研究室で行なった実験結果から、第９図の
中間ベクターの組み立てには、境界配列１および２の両
者を所有する必要はないことがわかった（未発表）。し
かし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込むには、少
なくとも右側の境界配列（２）（第１図および第９図参
照）を有することか必要十分条件である。
中間ベクターの組み立てには、境界配列１および２の両
者を所有する必要はないことがわかった（未発表）。し
かし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込むには、少
なくとも右側の境界配列（２）（第１図および第９図参
照）を有することか必要十分条件である。
ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕＩＩｌのＴｉプラスミド、例
えばツバリンまたはオクトビンＴｉプラスミドの制限エ
ンドヌクレアーゼ地図についての知見（Ｄｅｐｉｃｋｅ
ｒう、Ｐｌａｓｍｉｄ３（１９８０）、１９３ ２１１
；ＤｅＶｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ ６（１９８１）、２
４９ ２５３）およびＴ−ＤＮＡ境界配列を含んでいる
制限フラグメントについての知見（Ｚ ａｍｂｒｙｓｋ
ｉら、Ｊ１ＭｏｌＡｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１（１９８２
）、３６１ ３７０；Ｄ ｅ Ｂ ｅｕｃｋｅｌｅｅｒ
ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １８３
（１９８１）、２８３−２８８）から、当業者であれば
誰れでも、本発明方法に従ってアクセプターＴｉプラス
ミドを組み立てることができる。この他、通常の組換え
ＤＮＡ技術および基礎的な細菌の遺伝子操作を実施でき
る能力が要求されるに過ぎない。本発明は、ハイブリッ
ドＴｉプラスミドベクターを組み立てるのに有効である
ことがわかった本明細書に記載したアクセプターＴｉプ
ラスミドを具体的に提案している点でユニークなもので
ある。更に、これらのアクセプターＴｉプラスミドは、
遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入するための方法の一部を
構成する様に設計されたものである。
えばツバリンまたはオクトビンＴｉプラスミドの制限エ
ンドヌクレアーゼ地図についての知見（Ｄｅｐｉｃｋｅ
ｒう、Ｐｌａｓｍｉｄ３（１９８０）、１９３ ２１１
；ＤｅＶｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ ６（１９８１）、２
４９ ２５３）およびＴ−ＤＮＡ境界配列を含んでいる
制限フラグメントについての知見（Ｚ ａｍｂｒｙｓｋ
ｉら、Ｊ１ＭｏｌＡｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１（１９８２
）、３６１ ３７０；Ｄ ｅ Ｂ ｅｕｃｋｅｌｅｅｒ
ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １８３
（１９８１）、２８３−２８８）から、当業者であれば
誰れでも、本発明方法に従ってアクセプターＴｉプラス
ミドを組み立てることができる。この他、通常の組換え
ＤＮＡ技術および基礎的な細菌の遺伝子操作を実施でき
る能力が要求されるに過ぎない。本発明は、ハイブリッ
ドＴｉプラスミドベクターを組み立てるのに有効である
ことがわかった本明細書に記載したアクセプターＴｉプ
ラスミドを具体的に提案している点でユニークなもので
ある。更に、これらのアクセプターＴｉプラスミドは、
遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入するための方法の一部を
構成する様に設計されたものである。
既述したアクセプターＴｉプラスミド、中間クローニン
グベクター ハイブリッドＴｉプラスミドベクターおよ
びベクター組成物を更に例示し、植物細胞ゲノムへ組込
まれた外来性遺伝子の発現を示す形質転換植物細胞およ
び植物を提供するのにこのベクター組成物が有効である
ことを例証するだめに、以下に実施例を挙げる。
グベクター ハイブリッドＴｉプラスミドベクターおよ
びベクター組成物を更に例示し、植物細胞ゲノムへ組込
まれた外来性遺伝子の発現を示す形質転換植物細胞およ
び植物を提供するのにこのベクター組成物が有効である
ことを例証するだめに、以下に実施例を挙げる。
実施例１ アクセプターＴｉプラスミドｐＧ■３８５０
（Δタイプ）の組み立て 出発株およびプラスミド： Δｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
（野性型Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 由来のりフ
ァンビシンｉ性株ｃ５８ｃ１ およびクロラムフェニコ
ール−エリスロマイシン耐性株Ｃ５８Ｃ１） Ｔｉ プラスミド−ｐＧＶ３８３９ 第１１図のプラスミド＝ ｐＡｃｇＢ ＴｉプラスミドｐＧ Ｖ ３８３９はツバリンプラスミ
ドｐＴｉ Ｃ５８ｔｒａ’ （ｐＧＶ３ ｔｏｏ ；Ｈ
ｏｌｓｔｅｒｓら、 Ｐｌａｓｍｉｄ ３（１９８０
）、 ２１２−２３０）から組み立てる。これはＴ−
領域の中央近くに欠失置換突然変異体（ミュータント）
を含んでいる：即ち、Ｈａｎｄ ＩＩＩ フラグメント
１９の内部のＳｍａ Ｉフラグメント２４ （Ｄｅｐｉ
ｃｋｅｒら、Ｐｌａｓｍｉｄ ３ （１９８０）、１
９３ ２１１）は、Ｔｎ５のａｐｔ （アセチルホスホ
トランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいるｐＫＣ７のＨ
ｉｎｄｌｌフラグメント （Ｒａｏら、Ｇｅｎｅ ７（
１９７９，７９８２）で置換されている。この遺伝子は
アミングリコシドネオマイシンおよびカナマイシンに対
する耐性を暗号化している。ｐＧＶ３８３９のＴ−領域
の制限地図を第１２図に示す。
（Δタイプ）の組み立て 出発株およびプラスミド： Δｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
（野性型Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 由来のりフ
ァンビシンｉ性株ｃ５８ｃ１ およびクロラムフェニコ
ール−エリスロマイシン耐性株Ｃ５８Ｃ１） Ｔｉ プラスミド−ｐＧＶ３８３９ 第１１図のプラスミド＝ ｐＡｃｇＢ ＴｉプラスミドｐＧ Ｖ ３８３９はツバリンプラスミ
ドｐＴｉ Ｃ５８ｔｒａ’ （ｐＧＶ３ ｔｏｏ ；Ｈ
ｏｌｓｔｅｒｓら、 Ｐｌａｓｍｉｄ ３（１９８０
）、 ２１２−２３０）から組み立てる。これはＴ−
領域の中央近くに欠失置換突然変異体（ミュータント）
を含んでいる：即ち、Ｈａｎｄ ＩＩＩ フラグメント
１９の内部のＳｍａ Ｉフラグメント２４ （Ｄｅｐｉ
ｃｋｅｒら、Ｐｌａｓｍｉｄ ３ （１９８０）、１
９３ ２１１）は、Ｔｎ５のａｐｔ （アセチルホスホ
トランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいるｐＫＣ７のＨ
ｉｎｄｌｌフラグメント （Ｒａｏら、Ｇｅｎｅ ７（
１９７９，７９８２）で置換されている。この遺伝子は
アミングリコシドネオマイシンおよびカナマイシンに対
する耐性を暗号化している。ｐＧＶ３８３９のＴ−領域
の制限地図を第１２図に示す。
プラスミドｐＡｃｇＢは、Ｔ−ＤＮＡの境界部だけを含
んでいるｐＢＲ３２２中のＡｃｇＢの挿入体である（第
１１図参照）。この境界部はＴ−ＤＮＡの末端部として
定義され、これらの領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞ゲノ
ムへの安定な組込みに役割を果たす。このクローンの起
源および分析については詳しく記載されている（Ｚ ａ
ｍｂｒｙｓｋｉ ら、５ｃｉｅｎｃｅ２０９ （１９
８０）、１３８５ １３９１）。
んでいるｐＢＲ３２２中のＡｃｇＢの挿入体である（第
１１図参照）。この境界部はＴ−ＤＮＡの末端部として
定義され、これらの領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞ゲノ
ムへの安定な組込みに役割を果たす。このクローンの起
源および分析については詳しく記載されている（Ｚ ａ
ｍｂｒｙｓｋｉ ら、５ｃｉｅｎｃｅ２０９ （１９
８０）、１３８５ １３９１）。
このクローンは、形質転換されたタバコＤＮＡからＴ−
ＤＮＡの部分を再分離することにより得られた。ｐＡｃ
ｇＢは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界を含む様に縦列に並ん
だ２つのＴ−ＤＮＡコピーの接合点を含んでいる。更に
、ｐＡｃｇＢは、その遺伝情報が右側Ｔ−ＤＮＡ境界の
すぐ近くに位置しているという理由で７バリンシンター
ゼ遺伝子を含んでいる。このプラスミドｐＡＣｇＢは、
「タイツＡ」アクセプターＴｉ プラスミド、 ｐＧＶ
３８５０の組み立てに使用される。第６図は関与する構
造の概略を、第１３図はｐＧＶ３８５０を与える二重乗
換えに関与するＤＮＡ領域をより正確に示したものであ
る。
ＤＮＡの部分を再分離することにより得られた。ｐＡｃ
ｇＢは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界を含む様に縦列に並ん
だ２つのＴ−ＤＮＡコピーの接合点を含んでいる。更に
、ｐＡｃｇＢは、その遺伝情報が右側Ｔ−ＤＮＡ境界の
すぐ近くに位置しているという理由で７バリンシンター
ゼ遺伝子を含んでいる。このプラスミドｐＡＣｇＢは、
「タイツＡ」アクセプターＴｉ プラスミド、 ｐＧＶ
３８５０の組み立てに使用される。第６図は関与する構
造の概略を、第１３図はｐＧＶ３８５０を与える二重乗
換えに関与するＤＮＡ領域をより正確に示したものであ
る。
上記のプラスミドｐＡｃｇＢは、そのｐＢＲ３２２部分
にＣｏ１Ｅ１−特異ｂｏｍサイトを持っており、ヘルパ
ープラスミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８を使っ
てＥ、ｃｏｌｉからＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ授
動することができる。Ｅ、ｃｏｌｉに含まれているプラ
スミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８は、接合によ
り、ｐＡｃｇＢを持ったＥ、ｃｏｌｉ株に導入される。
にＣｏ１Ｅ１−特異ｂｏｍサイトを持っており、ヘルパ
ープラスミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８を使っ
てＥ、ｃｏｌｉからＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ授
動することができる。Ｅ、ｃｏｌｉに含まれているプラ
スミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８は、接合によ
り、ｐＡｃｇＢを持ったＥ、ｃｏｌｉ株に導入される。
トランス接合体は、アンピシリン耐性（ｐＡｃｇＢのｐ
ＢＲ３２２配列から）、ストレプトマイシン耐性（Ｒ６
４ｄｒｄ ｌ １から）、およびカナマイシン耐性（ｐ
ＧＪ２８から）コロニーとして選択される。
ＢＲ３２２配列から）、ストレプトマイシン耐性（Ｒ６
４ｄｒｄ ｌ １から）、およびカナマイシン耐性（ｐ
ＧＪ２８から）コロニーとして選択される。
３つのプラスミドの全てを保持している Ｅ。
ｃｏｌｉ株ヲ、リファンビンン耐性でありＴｉブラスミ
ドｐＧＶ３８３９を含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１に接合させる。ツバリンＴｉ プラ
スミドとの最初の単一乗換えを選択するのにｐＢＲ３２
２のアンピシリン耐性を利用する。アンピシリン耐性を
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で安定させることがで
きる唯一の方法は、Ｔ−領域境界近くの相同領域の１つ
でｐＧＶ３８３９と相同組換えにより乗換えをすること
である。他の相同領域での２回目の乗換えにより、ａｐ
ｔ遺伝子（カナマイシン耐性）を含んでいるｐＧＶ３８
３９のＴ−領域の中央部がクローンｐＡｃｇＢのｐＢＲ
３２２配列て置換される。従って、第２の組換え体はア
ンピシリン耐性、カナマイシン感受性である。第２の組
換え体を分離する確率を高めるために、最初の組換え体
（ｐＡｃｇＢ：：ｐＧＶ３８３９）を保持しているリフ
ァンピンン耐性Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、Ｔｉ
プラスミドを持っていない第２のクロラムフェニコール
／エリスロマイシン耐性Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
株と接合させる。この様にして、約６００コロニー中、
１コロニーの割合で、アンピシリン耐性、カナマイシン
感受性のクロラムフェニコール／エリスロマイシン耐性
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐＧ Ｖ ３８５０を得
ることができる。
ドｐＧＶ３８３９を含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１に接合させる。ツバリンＴｉ プラ
スミドとの最初の単一乗換えを選択するのにｐＢＲ３２
２のアンピシリン耐性を利用する。アンピシリン耐性を
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で安定させることがで
きる唯一の方法は、Ｔ−領域境界近くの相同領域の１つ
でｐＧＶ３８３９と相同組換えにより乗換えをすること
である。他の相同領域での２回目の乗換えにより、ａｐ
ｔ遺伝子（カナマイシン耐性）を含んでいるｐＧＶ３８
３９のＴ−領域の中央部がクローンｐＡｃｇＢのｐＢＲ
３２２配列て置換される。従って、第２の組換え体はア
ンピシリン耐性、カナマイシン感受性である。第２の組
換え体を分離する確率を高めるために、最初の組換え体
（ｐＡｃｇＢ：：ｐＧＶ３８３９）を保持しているリフ
ァンピンン耐性Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、Ｔｉ
プラスミドを持っていない第２のクロラムフェニコール
／エリスロマイシン耐性Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
株と接合させる。この様にして、約６００コロニー中、
１コロニーの割合で、アンピシリン耐性、カナマイシン
感受性のクロラムフェニコール／エリスロマイシン耐性
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐＧ Ｖ ３８５０を得
ることができる。
勿論、ｐＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラス
ミドを組み立てるのに使用することができるその他のＴ
ｉプラスミドもある。Ｔ−領域の中央近くに選択し得る
マーカー遺伝子を持ったＴｉプラスミドは全て受容体と
して使用できる。更に、左境界フラグメント−ｐＢ Ｒ
３２２−右境界フラグメントの方向に、左右の境界フラ
グメントの中間にｐＢＲ配列が位置する様に、ｐＢＲ３
２２にＴ−領域境界フラグメントを挿入することによっ
てｐＡｃｇＢ様のプラスミドを組み立てることができる
。例えば、／バリンＴｉプラスミドの左および右境界フ
ラグメントはそれぞれＨｉｎｄｌｌｌ フラグメント１
０および２３である（ Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｐｌａｓ
ＩＩ＋１ｄ３（１９８０）、１９３ ２１１）。
ミドを組み立てるのに使用することができるその他のＴ
ｉプラスミドもある。Ｔ−領域の中央近くに選択し得る
マーカー遺伝子を持ったＴｉプラスミドは全て受容体と
して使用できる。更に、左境界フラグメント−ｐＢ Ｒ
３２２−右境界フラグメントの方向に、左右の境界フラ
グメントの中間にｐＢＲ配列が位置する様に、ｐＢＲ３
２２にＴ−領域境界フラグメントを挿入することによっ
てｐＡｃｇＢ様のプラスミドを組み立てることができる
。例えば、／バリンＴｉプラスミドの左および右境界フ
ラグメントはそれぞれＨｉｎｄｌｌｌ フラグメント１
０および２３である（ Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｐｌａｓ
ＩＩ＋１ｄ３（１９８０）、１９３ ２１１）。
単一乗換えによって、ｐＢ Ｒ３２２またはその誘導体
に挿入されている所望の遺伝子を含んだ中間クローニン
グベクターがｐＧＶ３８５０の改良されたＴ−ＤＮＡ領
域に導入される。唯一つ必要なことは、中間クローニン
グベクターのＥ、ｃｏｌｉからＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍへの転移を選択する為の手段として使用する為に
、導入されるＤＮＡが、既にｐＢ Ｒ３２２に存在する
ものの他にもう１つの耐性マーカー遺伝子を含んでいる
ということである。
に挿入されている所望の遺伝子を含んだ中間クローニン
グベクターがｐＧＶ３８５０の改良されたＴ−ＤＮＡ領
域に導入される。唯一つ必要なことは、中間クローニン
グベクターのＥ、ｃｏｌｉからＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍへの転移を選択する為の手段として使用する為に
、導入されるＤＮＡが、既にｐＢ Ｒ３２２に存在する
ものの他にもう１つの耐性マーカー遺伝子を含んでいる
ということである。
この耐性マーカーは、ｐＢＲ配列内に含まれていてもよ
く （例えばｐＢ Ｒ３２５のＣｍＲ，またはｐＫＣ７
のＫｍＲ）、植物細胞内で試験されるＤＮＡ内に含まれ
ていてもよい。更に、アクセプターＴｉプラスミドｐＧ
Ｖ３８５０におけるＡｐＲ遺伝子ｐＢ Ｒ３２２は、Ｋ
ｍＲの様な別の耐性マーカー遺伝子で置換してもよい。
く （例えばｐＢ Ｒ３２５のＣｍＲ，またはｐＫＣ７
のＫｍＲ）、植物細胞内で試験されるＤＮＡ内に含まれ
ていてもよい。更に、アクセプターＴｉプラスミドｐＧ
Ｖ３８５０におけるＡｐＲ遺伝子ｐＢ Ｒ３２２は、Ｋ
ｍＲの様な別の耐性マーカー遺伝子で置換してもよい。
この様にして、Ａ ｐＲであるｐＢＲ３２２含有中間ク
ローニングベクターですら、このｐＧＶ３８５０タイプ
のアクセプターＴｉプラスミドに直接授動することがで
きる。
ローニングベクターですら、このｐＧＶ３８５０タイプ
のアクセプターＴｉプラスミドに直接授動することがで
きる。
ｐＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラスミドの
もう１つの利点は、形質転換された植物細胞で腫瘍をつ
くらないということである。ｐｃＶ３８５０の短かくな
ったＴ−ＤＮＡ領域は、依然としてツバリンシンターゼ
を暗号化している遺伝子を含んでいるので、ｐＧＶ３８
５０で形質転換された細胞は、ツバリンが存在するかど
うかを分析することにより、非形質転換細胞から簡単に
選り分けることができる。勿論、アクセプタＴｉプラス
ミドｐｃ Ｖ ３８５０に組込まれた中間クローニング
ベクターがマーカー遺伝子を含んでいたら、それも直接
スクリーニング、即ち選別にかけることができる。
もう１つの利点は、形質転換された植物細胞で腫瘍をつ
くらないということである。ｐｃＶ３８５０の短かくな
ったＴ−ＤＮＡ領域は、依然としてツバリンシンターゼ
を暗号化している遺伝子を含んでいるので、ｐＧＶ３８
５０で形質転換された細胞は、ツバリンが存在するかど
うかを分析することにより、非形質転換細胞から簡単に
選り分けることができる。勿論、アクセプタＴｉプラス
ミドｐｃ Ｖ ３８５０に組込まれた中間クローニング
ベクターがマーカー遺伝子を含んでいたら、それも直接
スクリーニング、即ち選別にかけることができる。
ｐＢＲ３２２配列を含んだ上記の中間クローニングベク
ターの単一乗換えによるアクセプタＴｉプラスミドへの
挿入のほか、このアクセプターＴｉプラスミドは、「シ
ョットガン」タイプの実験に於いて、ｐＢＲ３２２また
はその誘導体中のクローンされたＤＮＡバンクの受容体
としても使用することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ中の全てのハイブリッドプラスミドベクターは、
植物細胞の感染に使用することができ、次いで所望の選
択可能な遺伝子（群）の発現についてスクリーニングさ
れる。例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏している植物細
胞に全バンクを適用することにより、アミノ酸合成を暗
号化している遺伝子について簡単に選別することができ
る。
ターの単一乗換えによるアクセプタＴｉプラスミドへの
挿入のほか、このアクセプターＴｉプラスミドは、「シ
ョットガン」タイプの実験に於いて、ｐＢＲ３２２また
はその誘導体中のクローンされたＤＮＡバンクの受容体
としても使用することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ中の全てのハイブリッドプラスミドベクターは、
植物細胞の感染に使用することができ、次いで所望の選
択可能な遺伝子（群）の発現についてスクリーニングさ
れる。例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏している植物細
胞に全バンクを適用することにより、アミノ酸合成を暗
号化している遺伝子について簡単に選別することができ
る。
アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０は、２つの
特徴的な表現形質を持っている：即ち、（ｉ）腫瘍生成
能力がないこと、および（ｉｉ）もしＴ−ＤＮＡが植物
細胞ゲノム内に転移したら、ツバリン合成能を有するこ
と、である。ｐＧＶ３８５０含有Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍで感染させた各種の植物組織のこれらの特徴を
調べるために、種々の実験を行なった。
特徴的な表現形質を持っている：即ち、（ｉ）腫瘍生成
能力がないこと、および（ｉｉ）もしＴ−ＤＮＡが植物
細胞ゲノム内に転移したら、ツバリン合成能を有するこ
と、である。ｐＧＶ３８５０含有Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍで感染させた各種の植物組織のこれらの特徴を
調べるために、種々の実験を行なった。
ａ）ジャガイモおよびニンジンディスクを用いた試験
ジャガイモおよびニンジンの切片にアクセプタＴｉプラ
スミドｐＧＶ３８５０を接種すると、少量の硬結組織が
生成する。この組織にツバリンが存在するかどうかを試
験した所、陽性であることがわかった。この突然変異体
が少量の硬結組織を生産し得ることは興味あることであ
る。しかし、それは、これらのディスクを低濃度のオー
キンンおよびサイトキニンの両者を含んでいる培地で生
育させた時だけ得られる。
スミドｐＧＶ３８５０を接種すると、少量の硬結組織が
生成する。この組織にツバリンが存在するかどうかを試
験した所、陽性であることがわかった。この突然変異体
が少量の硬結組織を生産し得ることは興味あることであ
る。しかし、それは、これらのディスクを低濃度のオー
キンンおよびサイトキニンの両者を含んでいる培地で生
育させた時だけ得られる。
ｂ）全植物をアクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０で接種 ホルモンを含まない滅菌寒天培地で生育しているタバコ
およびペチュニアの苗木にｐＧＶ３８５０を接種する。
０で接種 ホルモンを含まない滅菌寒天培地で生育しているタバコ
およびペチュニアの苗木にｐＧＶ３８５０を接種する。
数カ月後に少量の組織成長が観察されただけである（通
常、２週間後に［野生型Ｊ腫瘍が検出される）。この組
織はホルモンを含まない培地では生育しないが、オーキ
シンおよびサイトキニン含有培地での滅菌組織培養では
、さらに増殖することができる。この組織もツバリン陽
性であることがわかった。
常、２週間後に［野生型Ｊ腫瘍が検出される）。この組
織はホルモンを含まない培地では生育しないが、オーキ
シンおよびサイトキニン含有培地での滅菌組織培養では
、さらに増殖することができる。この組織もツバリン陽
性であることがわかった。
Ｃ）さらに、 ｐＧＶ３８５０ｒ形質転換」細胞は腫瘍
性ではないので、これらの細胞は、転移したＤＮＡセグ
メントをそのゲノムに依然として保持している正常な植
物に再生することができる。この形質転換細胞を通常の
再生培地（実施例５を参照）で培養すると、正常植物が
得られよう。
性ではないので、これらの細胞は、転移したＤＮＡセグ
メントをそのゲノムに依然として保持している正常な植
物に再生することができる。この形質転換細胞を通常の
再生培地（実施例５を参照）で培養すると、正常植物が
得られよう。
ｐＧ Ｖ ３８５０の、アクセプタープラスミドとして
の有用性を証明する為に、以下の実験を行なった。ｐＢ
Ｒ３２５中にオクトピンＴ−ＤＮＡの腫瘍機能を含ん
でいる中間クローニングベクターを、ｐＧＶ３８５０を
保持しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに組み込ん
だ。単一乗換えによって得られたＡｇｒｏｂａｃＬｅｒ
ｉｕｍ中のハイブリッドＴｉプラスミドを、傷つけたタ
バコ植物に接種した。２週間後に腫瘍組織があられれた
。このことは、腫瘍誘導ＤＮＡがｐＧＶ３８５０に再導
入され、形質転換植物細胞中で適切に発現されたことを
示している。
の有用性を証明する為に、以下の実験を行なった。ｐＢ
Ｒ３２５中にオクトピンＴ−ＤＮＡの腫瘍機能を含ん
でいる中間クローニングベクターを、ｐＧＶ３８５０を
保持しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに組み込ん
だ。単一乗換えによって得られたＡｇｒｏｂａｃＬｅｒ
ｉｕｍ中のハイブリッドＴｉプラスミドを、傷つけたタ
バコ植物に接種した。２週間後に腫瘍組織があられれた
。このことは、腫瘍誘導ＤＮＡがｐＧＶ３８５０に再導
入され、形質転換植物細胞中で適切に発現されたことを
示している。
実施例２ 中間クローニングベクターｐｃｖ７００およ
びｐＧＶ７５０の組み立て この組み立ての概略を第１４図に模式的に示した。オク
トピンＴｉプラスミドＢ６Ｓ３のＴＬＤＮＡの右側部分
であり、ｐＧＶＯ２０１（ＤｅＶｏｓら、ＰＩａｓｍｉ
ｄ６（１９８１）、２４９ ２５３）中に存在するＨｉ
ｎｄｌｌｌフラグメント１を、まず、広範囲宿主性ベク
ターｐＧＶ ｌ ｌ ２２ （Ｌｅｅｍａｎｓら、Ｇｅ
ｎｅ １９（１９８２）、３６１−３６４）のＨｉｎ
ｄ ＩＩＩサイトに挿入する。組換えプラスミドｐＧＶ
Ｑ２０１は、多コピーベクターｐＢ Ｒ３２２（Ｂｏｌ
ｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２（１９７７）、９５−１１３
）の特異なＨｉｎｄｌｌｌサイトに挿入されたＨｉｎｄ
ｌｌｌ フラグメントｌを含んでいる。ｐＧＶＯ２０１
およびｐＧＶ１１２２ＤＮＡは、Ｂｅｔｌａｃｈらが記
載している方法で調製される（Ｆｅｄ。
びｐＧＶ７５０の組み立て この組み立ての概略を第１４図に模式的に示した。オク
トピンＴｉプラスミドＢ６Ｓ３のＴＬＤＮＡの右側部分
であり、ｐＧＶＯ２０１（ＤｅＶｏｓら、ＰＩａｓｍｉ
ｄ６（１９８１）、２４９ ２５３）中に存在するＨｉ
ｎｄｌｌｌフラグメント１を、まず、広範囲宿主性ベク
ターｐＧＶ ｌ ｌ ２２ （Ｌｅｅｍａｎｓら、Ｇｅ
ｎｅ １９（１９８２）、３６１−３６４）のＨｉｎ
ｄ ＩＩＩサイトに挿入する。組換えプラスミドｐＧＶ
Ｑ２０１は、多コピーベクターｐＢ Ｒ３２２（Ｂｏｌ
ｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２（１９７７）、９５−１１３
）の特異なＨｉｎｄｌｌｌサイトに挿入されたＨｉｎｄ
ｌｌｌ フラグメントｌを含んでいる。ｐＧＶＯ２０１
およびｐＧＶ１１２２ＤＮＡは、Ｂｅｔｌａｃｈらが記
載している方法で調製される（Ｆｅｄ。
Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７ ２０４３）。
最終量２０μ（中、ｐＧＶＯ２０１ＤＮＡ ２ｕｇを、
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ２単位（全ての制限酵素はＢｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入した）を用い
て、３７°Ｃで１時間完全に消化した。インキュベーシ
ョン緩衝液はＯ’ Ｆ ａｒｒｅｌｌ らにより記載さ
れている（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ １７９（
１９８０）、４２１−４３５）。同じ条件下でｐＧＶｌ
１２２ ＤＮＡ２μｇをＨｉｎｄｌｌｌで完全に消化
した。
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ２単位（全ての制限酵素はＢｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入した）を用い
て、３７°Ｃで１時間完全に消化した。インキュベーシ
ョン緩衝液はＯ’ Ｆ ａｒｒｅｌｌ らにより記載さ
れている（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ １７９（
１９８０）、４２１−４３５）。同じ条件下でｐＧＶｌ
１２２ ＤＮＡ２μｇをＨｉｎｄｌｌｌで完全に消化
した。
最終量２０ａ（ｌ中、Ｔ４リガーゼ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ ） ０．０２単位を用い、Ｏ
用μｇのＨｉｎｄｌｌｌ消化ｐＧＶＯ２０１を旧ｎｄｌ
ｌｌ消化ｐＧＶ１１２２とライゲーション（結紮）した
。インキュヘーション緩衝液および条件は、製造業者の
指示に従った（ Ｂ ｒｏｃｈｕｒｅ″Ｔ４リガーゼ”
、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 ｌ ９
８０年８月、＃ｌＯＭ、８８０．４８６ ）。ライゲー
ション混合物のコンピテントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ ５１
４ ｈｓｒ−ｈｓｍ”細胞（Ｃｏｌｓｏｎら、Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ５２（１９６５）、 ｌ Ｏ４３１０５０）へ
の導入（形質転換）は、Ｄ ａｇｅｒｔおよびＥ ｈｒ
ｌｉｃｈの方法（Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、 ２３２
８）に従って行なった。細胞を、ストレプトマイシン（
２０μｇ／ｉ（りおよびスペクチノマイシン（５０μｇ
／ｘｃ）を補足したＬＢ培地（ＭｉｌｌｅｒＥ ｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ）Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ）に塗抹した。組換えプラスミドを含有し
ている形質転換体を、テトラサイクリン耐性を暗号化し
ている遺伝子への挿入によるその不活性化（Ｌ ｅｅｍ
ａｎｓ ら、Ｇｅｎｅ １９（１９８２）、３６１３
６４）に基づき、テトラサイクリン感受性（１０μｇ／
ｘのでスクリーニング（選り分け）した。ストレプトマ
イシンおよびスペクチノマイシンに耐性を示し、テトラ
サイクリンに感受性を有するクロンを物理的に同定した
。マイクロスケールのＤＮＡ調製はＫ Ｉｅｉｎらの方
法（Ｐｌａｓｍｉｄ３ （１９８０）。
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ ） ０．０２単位を用い、Ｏ
用μｇのＨｉｎｄｌｌｌ消化ｐＧＶＯ２０１を旧ｎｄｌ
ｌｌ消化ｐＧＶ１１２２とライゲーション（結紮）した
。インキュヘーション緩衝液および条件は、製造業者の
指示に従った（ Ｂ ｒｏｃｈｕｒｅ″Ｔ４リガーゼ”
、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 ｌ ９
８０年８月、＃ｌＯＭ、８８０．４８６ ）。ライゲー
ション混合物のコンピテントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ ５１
４ ｈｓｒ−ｈｓｍ”細胞（Ｃｏｌｓｏｎら、Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ５２（１９６５）、 ｌ Ｏ４３１０５０）へ
の導入（形質転換）は、Ｄ ａｇｅｒｔおよびＥ ｈｒ
ｌｉｃｈの方法（Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、 ２３２
８）に従って行なった。細胞を、ストレプトマイシン（
２０μｇ／ｉ（りおよびスペクチノマイシン（５０μｇ
／ｘｃ）を補足したＬＢ培地（ＭｉｌｌｅｒＥ ｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ）Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ）に塗抹した。組換えプラスミドを含有し
ている形質転換体を、テトラサイクリン耐性を暗号化し
ている遺伝子への挿入によるその不活性化（Ｌ ｅｅｍ
ａｎｓ ら、Ｇｅｎｅ １９（１９８２）、３６１３
６４）に基づき、テトラサイクリン感受性（１０μｇ／
ｘのでスクリーニング（選り分け）した。ストレプトマ
イシンおよびスペクチノマイシンに耐性を示し、テトラ
サイクリンに感受性を有するクロンを物理的に同定した
。マイクロスケールのＤＮＡ調製はＫ Ｉｅｉｎらの方
法（Ｐｌａｓｍｉｄ３ （１９８０）。
８８−９１）に従って実施した。ｐＧＶ１１２２のＨｉ
ｎｄｌ！！サイト中のＨｉｎｄｌｌｌフラグメントｌの
配向は、５ａｌｌ消化によって決定した。組換えプラス
ミドを消化しく０ ’ Ｆ ａｒｒｅｌ ｌ らの条件
、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １７９（１９
８０）、 ４２１４３５）、アガロースゲル電気泳動
にかけると２個のフラグメントが得られた。α−配向に
は０．７７ｋｂおよび２２．７６ｋｂのフラグメント、
β−配向には、１０．３３ｋｂおよび１３．２０ｋｂの
フラグメントがあった。α−配向の組換えプラスミドを
その後のクローニングに使用し、これをｐＧ・Ｖ１１６
８と名付けた。
ｎｄｌ！！サイト中のＨｉｎｄｌｌｌフラグメントｌの
配向は、５ａｌｌ消化によって決定した。組換えプラス
ミドを消化しく０ ’ Ｆ ａｒｒｅｌ ｌ らの条件
、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １７９（１９
８０）、 ４２１４３５）、アガロースゲル電気泳動
にかけると２個のフラグメントが得られた。α−配向に
は０．７７ｋｂおよび２２．７６ｋｂのフラグメント、
β−配向には、１０．３３ｋｂおよび１３．２０ｋｂの
フラグメントがあった。α−配向の組換えプラスミドを
その後のクローニングに使用し、これをｐＧ・Ｖ１１６
８と名付けた。
ＴＬ−ＤＮＡの左側部分（左の境界配列を含んでいる）
を含有しているＢｇｌ ｌｌ−３ａｔ Ｉ フラグメン
トをＢｇｌ ｌｌ−３ａｌ ｌで開裂したｐＧＶ１１６
８に導入する。このフラグメントは、ベクタｐＢＲ３２
２に挿入された、ｐＴｉＢ６Ｓ３ のＴ領域からの、Ｂ
ａｍＨＩフラグメント８を含んでいる組換えプラスミド
ｐＧＶ Ｏ１５３（Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ
６ （１９８１）、 ２４９ ２５３）から得られ
る。ｐＧＶＯ１５３およびｐＧＶ１１６８ＤＮＡはＢｅ
ｔｌａｃｈらの方法で調製する（Ｆｅｄ。
を含有しているＢｇｌ ｌｌ−３ａｔ Ｉ フラグメン
トをＢｇｌ ｌｌ−３ａｌ ｌで開裂したｐＧＶ１１６
８に導入する。このフラグメントは、ベクタｐＢＲ３２
２に挿入された、ｐＴｉＢ６Ｓ３ のＴ領域からの、Ｂ
ａｍＨＩフラグメント８を含んでいる組換えプラスミド
ｐＧＶ Ｏ１５３（Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ
６ （１９８１）、 ２４９ ２５３）から得られ
る。ｐＧＶＯ１５３およびｐＧＶ１１６８ＤＮＡはＢｅ
ｔｌａｃｈらの方法で調製する（Ｆｅｄ。
Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７ ２０４３）。
ｐＧＶＯ１５３ＤＮＡｌｏμｇをｌＯ単位ノＢｇ１１１
およびＩＯ単位の５ａｌｌを用い、最終量１００μｅ中
３７°Ｃで１時間、完全に消化した。消化混合物をプレ
バラティブ０．８％アガロースゲル上、Ａ ｌｌｉｎｇ
ｔｏｎらの方法（Ａ ｎａｌ、 Ｂ ｉｏｃｈｉｍ、
８５ （１９７８）、１８８−１９６）で電気溶出
し、ゲルから２．１４ｋｂ Ｂｌｇ Ｉｆ−３ａｌ Ｉ
Ｉフラグメントを回収した。ｐＧＶｌ１６８ＤＮＡ
２μｇを２単位のＢｇｌ １１および２単位の５ａｌｌ
で完全に消化した。
およびＩＯ単位の５ａｌｌを用い、最終量１００μｅ中
３７°Ｃで１時間、完全に消化した。消化混合物をプレ
バラティブ０．８％アガロースゲル上、Ａ ｌｌｉｎｇ
ｔｏｎらの方法（Ａ ｎａｌ、 Ｂ ｉｏｃｈｉｍ、
８５ （１９７８）、１８８−１９６）で電気溶出
し、ゲルから２．１４ｋｂ Ｂｌｇ Ｉｆ−３ａｌ Ｉ
Ｉフラグメントを回収した。ｐＧＶｌ１６８ＤＮＡ
２μｇを２単位のＢｇｌ １１および２単位の５ａｌｌ
で完全に消化した。
最終量２０μｇ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．０２単位を
用いてＢｇｌ Ｉｆ−３ａｌ ＩフラグメントＤＮＡＱ
川μｇを０．０２ μｇのＢｇｌ ｌｌｌ−５ａｌｌ消
化ｐＧＶ１１６８とライゲーションした。このライゲー
ション混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ５１４
ｈｓｒ” ｈｓｍ”細胞（Ｄ ａｇｅｒｔおよびＥ
ｒｈｌｉｃｈ。
用いてＢｇｌ Ｉｆ−３ａｌ ＩフラグメントＤＮＡＱ
川μｇを０．０２ μｇのＢｇｌ ｌｌｌ−５ａｌｌ消
化ｐＧＶ１１６８とライゲーションした。このライゲー
ション混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ５１４
ｈｓｒ” ｈｓｍ”細胞（Ｄ ａｇｅｒｔおよびＥ
ｒｈｌｉｃｈ。
Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３−２８）に導入した。
細胞をストレプトマイシン（２０μｇ／ｘのおよびスベ
クチノマイシン（５０μｇ／ｘｉを補足したＬＢ培地（
Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）＋
Ｃｏ１ｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬｏｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ ＹｏｒＫ）に塗抹した。
クチノマイシン（５０μｇ／ｘｉを補足したＬＢ培地（
Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）＋
Ｃｏ１ｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬｏｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ ＹｏｒＫ）に塗抹した。
ストレプトマイシン−およびスペクチノマイシンー耐性
形質転換体から、マイクロスケールＤＮＡプレバレージ
ョン（Ｋｌｅｉｎら、Ｐ ｌａｓｍｉｄ ３ （］９８
０）、８８−９１）を行なった。２．１４ｋｂＢｇｌ
ｌｌ−５ａｌ ＩフラグメントがＢｇｌ ｌｌ−３ａｔ
１消化ｐＧＶ１１６８に挿入されている組換えプラス
ミドをＢｇｌ ｌｌ−３ａｌ Ｉ消化により同定した。
形質転換体から、マイクロスケールＤＮＡプレバレージ
ョン（Ｋｌｅｉｎら、Ｐ ｌａｓｍｉｄ ３ （］９８
０）、８８−９１）を行なった。２．１４ｋｂＢｇｌ
ｌｌ−５ａｌ ＩフラグメントがＢｇｌ ｌｌ−３ａｔ
１消化ｐＧＶ１１６８に挿入されている組換えプラス
ミドをＢｇｌ ｌｌ−３ａｌ Ｉ消化により同定した。
この消化で２．１４ｋｂおよび２１．８２ｋｂの２つの
フラグメントが得られた。これらの分子量（２１４ｋｂ
および２１．８２ｋｂ）に相当する消化バタンを持った
プラスミドをｐＧＶ１１７１と名付け、さらにクローン
するのに用いた。ｐＧＶ１１７１からの１２．６５ｋｂ
フラグメントは、左右のＴＬ−ＤＮＡ境界配列（Ｄ ｅ
Ｂ ｅｕｃｋｅｌｅｅｒら、１ｎＰｒ。
フラグメントが得られた。これらの分子量（２１４ｋｂ
および２１．８２ｋｂ）に相当する消化バタンを持った
プラスミドをｐＧＶ１１７１と名付け、さらにクローン
するのに用いた。ｐＧＶ１１７１からの１２．６５ｋｂ
フラグメントは、左右のＴＬ−ＤＮＡ境界配列（Ｄ ｅ
Ｂ ｅｕｃｋｅｌｅｅｒら、１ｎＰｒ。
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ＩＶｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎＰ ！ａｎｔ
Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ、 Ｍ、
Ｒｉｄｅ’ （ｅｄ、）（１９７８）、 １．Ｎ、Ｒ
，Ａ、、Ａｎｇｒｅｓ、１１５１２６）および腫瘍性の
増殖を可能にする遺伝子（Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯ
Ｊ、（１９８２）、１４７１５２）を含んでいる。この
ＨｉｎｄｌｌｌフラグメントをプラスミドｐＢＲ３２５
に挿入した（Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｇｅｎｅ４（１９７８
）、 １２１−１３６）。
ｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎＰ ！ａｎｔ
Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ、 Ｍ、
Ｒｉｄｅ’ （ｅｄ、）（１９７８）、 １．Ｎ、Ｒ
，Ａ、、Ａｎｇｒｅｓ、１１５１２６）および腫瘍性の
増殖を可能にする遺伝子（Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯ
Ｊ、（１９８２）、１４７１５２）を含んでいる。この
ＨｉｎｄｌｌｌフラグメントをプラスミドｐＢＲ３２５
に挿入した（Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｇｅｎｅ４（１９７８
）、 １２１−１３６）。
ｐＧＶ１１７１およびｐＢ Ｒ３２５はＢｅｔｌａｃｈ
らの方法で調製した（Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、 ３５
（１９７６１２０３７−２０４３）。それぞれのＤＮＡ
２μｇを２単位のＨｉｎｄｌｌｌを用い、３７°Ｃで１
時間完全に消化した（インキュベーション緩衝液はＯ’
Ｆａｒｒｅｌｌらにより記載されている（Ｍｏｌ、 Ｇ
ｅｎ、 Ｇ ｅｎｅｔ、１７９（１９８０）、４２１
−４３５））。０．１μｇのＨｉｎｄｌｌｌ消化したｐ
ＧＶ１１７１を、Ｈｉｎｄｌｌｌで線状化した０、 ０
５ μｇのｐＢ Ｒ３２５と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．
０２単位を用いてライゲーションした。ライゲーション
混合物によるコンピテントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ ５１４
ｈｓｒ−ｈｓｍ’の形質転換はＤ ａｇｅｒｔおよ
びＥ ｈｒｌｉｃｈの方法で行なった（Ｇｅｎｅ６（１
９８０）、２３ ２８）。細胞を、カルベニ／リン（１
００μｇ／ｘ１２）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ
、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に塗抹した。カルベニシリン耐性コ
ロニーを、テトラサイクリン耐性を暗号化している遺伝
子に挿入することによるその不活性化に基づき、テトラ
サイクリン（１０μｇ／Ｘａ＞感受性でスクリーニング
した（Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｇｅｎｅ４（１９７８）、１
２１ １３６）。カルベニ／リン耐性、テトラサイクリ
ン感受性のコロニーを、そのコロニーから調製したＤＮ
Ａの制限酵素消化により、マイクロスケール技法（Ｋ
１ｅｉｎら、 Ｐ ｌａｓｍｉｄ３（１９８０）、８８
９１）によって物理的に特性化した。即ち、ＢａｍＨ
Ｉ消化により、４つのＤＮＡフラグメントが得られる：
α配向の場合は０．９８ｋｂ、４．７１ｋｂ、５．９８
ｋｂおよび７．０２ｋｂのフラグメントが得られ、β配
向の場合はＯ９８ｋｂ、 ４．７１ｋｂ、 １．７１ｋ
ｂおよび１１．２０ｋｂのフラグメントが得られる。こ
うして得られたα配向の組換えプラスミドはｐＧ■７ｏ
ｏと名付けられ、更にその後の実験に用いられた。
らの方法で調製した（Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、 ３５
（１９７６１２０３７−２０４３）。それぞれのＤＮＡ
２μｇを２単位のＨｉｎｄｌｌｌを用い、３７°Ｃで１
時間完全に消化した（インキュベーション緩衝液はＯ’
Ｆａｒｒｅｌｌらにより記載されている（Ｍｏｌ、 Ｇ
ｅｎ、 Ｇ ｅｎｅｔ、１７９（１９８０）、４２１
−４３５））。０．１μｇのＨｉｎｄｌｌｌ消化したｐ
ＧＶ１１７１を、Ｈｉｎｄｌｌｌで線状化した０、 ０
５ μｇのｐＢ Ｒ３２５と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．
０２単位を用いてライゲーションした。ライゲーション
混合物によるコンピテントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ ５１４
ｈｓｒ−ｈｓｍ’の形質転換はＤ ａｇｅｒｔおよ
びＥ ｈｒｌｉｃｈの方法で行なった（Ｇｅｎｅ６（１
９８０）、２３ ２８）。細胞を、カルベニ／リン（１
００μｇ／ｘ１２）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ
、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に塗抹した。カルベニシリン耐性コ
ロニーを、テトラサイクリン耐性を暗号化している遺伝
子に挿入することによるその不活性化に基づき、テトラ
サイクリン（１０μｇ／Ｘａ＞感受性でスクリーニング
した（Ｂｏｌｉｖａｒ、 Ｇｅｎｅ４（１９７８）、１
２１ １３６）。カルベニ／リン耐性、テトラサイクリ
ン感受性のコロニーを、そのコロニーから調製したＤＮ
Ａの制限酵素消化により、マイクロスケール技法（Ｋ
１ｅｉｎら、 Ｐ ｌａｓｍｉｄ３（１９８０）、８８
９１）によって物理的に特性化した。即ち、ＢａｍＨ
Ｉ消化により、４つのＤＮＡフラグメントが得られる：
α配向の場合は０．９８ｋｂ、４．７１ｋｂ、５．９８
ｋｂおよび７．０２ｋｂのフラグメントが得られ、β配
向の場合はＯ９８ｋｂ、 ４．７１ｋｂ、 １．７１ｋ
ｂおよび１１．２０ｋｂのフラグメントが得られる。こ
うして得られたα配向の組換えプラスミドはｐＧ■７ｏ
ｏと名付けられ、更にその後の実験に用いられた。
ｐＧＶ７５０は、ｐＧＶ７００に挿入されたＴＬ領領域
内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している３、４９ｋｂ
Ｂｇｌｌｌ−３ｍａｌフラグメントの代わりに、カナ
マイシン耐性を暗号化している２、８１ｋｂ ＢａｍＨ
Ｔ−Ｈｐａｌルミｌフラグメントすることにより、ｐＧ
Ｖ７００がら誘導される。カナマイシン耐性を暗号化し
ているＢａｍＨＩ −Ｈｐａｒフラグメントはλ：：Ｔ
ｎ５（Ｂｅｒｇら、Ｐ ｒｏｃ、 Ｎ ａｔ ｌ。
内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している３、４９ｋｂ
Ｂｇｌｌｌ−３ｍａｌフラグメントの代わりに、カナ
マイシン耐性を暗号化している２、８１ｋｂ ＢａｍＨ
Ｔ−Ｈｐａｌルミｌフラグメントすることにより、ｐＧ
Ｖ７００がら誘導される。カナマイシン耐性を暗号化し
ているＢａｍＨＩ −Ｈｐａｒフラグメントはλ：：Ｔ
ｎ５（Ｂｅｒｇら、Ｐ ｒｏｃ、 Ｎ ａｔ ｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７２（１９７５）、３６２
８３６３２ ）から得られる。λ：：Ｔｎ５の調製はＭ
ｉｌｌｅｒにより記載されている（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（
１９７２）＋ Ｃｏ１ｄ Ｓ ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ｐＧ
Ｖ７００ＤＮＡはＢｅｔｌａｃｈらの方法で調製する（
Ｆ ｅｄ。
８３６３２ ）から得られる。λ：：Ｔｎ５の調製はＭ
ｉｌｌｅｒにより記載されている（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（
１９７２）＋ Ｃｏ１ｄ Ｓ ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ｐＧ
Ｖ７００ＤＮＡはＢｅｔｌａｃｈらの方法で調製する（
Ｆ ｅｄ。
Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７ ２０４３）。
ｐＧＶ７００ ＤＮＡ ２μｇを２単位のＢｇｌｌ
ｌおよび２単位のＳ ｍａ Ｉで完全に消化した。λ：
：Ｔｎ５ＤＮＡ２μｇを２単位のＢａｍＨＩおよび２単
位のＨｐａｌで完全に消化した。１μｇのＢａｍＨＩ
−Ｈｐａｌ消化λ：：Ｔｎ５を、最終ｆｆ１ｌＯμｇ中
、Ｔ４ ＤＮＡＩＪガーゼ０．５単位を用イテ、０．
２μｇのＢｇＩＩＩ−３ｍａｌ消化ｐＧＶ７００とライ
ゲーションした（製造業者の指示する条件に従った）。
ｌおよび２単位のＳ ｍａ Ｉで完全に消化した。λ：
：Ｔｎ５ＤＮＡ２μｇを２単位のＢａｍＨＩおよび２単
位のＨｐａｌで完全に消化した。１μｇのＢａｍＨＩ
−Ｈｐａｌ消化λ：：Ｔｎ５を、最終ｆｆ１ｌＯμｇ中
、Ｔ４ ＤＮＡＩＪガーゼ０．５単位を用イテ、０．
２μｇのＢｇＩＩＩ−３ｍａｌ消化ｐＧＶ７００とライ
ゲーションした（製造業者の指示する条件に従った）。
このライゲーション混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ５１４ ｈｓｒ” ｈｓ＋ａ”細胞（Ｄ ａｇｅｒ
ｔおよびＥ ｒｈｌｉｃｈＧｅｎｅ ６（１９８０）、
２３ ２８）に導入した。
Ｋ５１４ ｈｓｒ” ｈｓ＋ａ”細胞（Ｄ ａｇｅｒ
ｔおよびＥ ｒｈｌｉｃｈＧｅｎｅ ６（１９８０）、
２３ ２８）に導入した。
細胞を、カルベニシリン（１００μｇ／ｘのおよびカナ
マイシン（２５μｇ／ｍ（１）を補足したＬＢ培地（Ｍ
ｉｌｌｅｒ、 Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）＋ Ｃ
ｏ１ｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）上に塗抹した。マイク
ロスケール技法（Ｋｌｅｉｎら、 Ｐｌａｓｍｉｄ
３（１９８０）、 ８８−９１）に従って調製したＤ
ＮＡの制限酵素分析により、ＣｂＲおよびＫｆｆ１１１
コロニーを物理的に特性化した。
マイシン（２５μｇ／ｍ（１）を補足したＬＢ培地（Ｍ
ｉｌｌｅｒ、 Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）＋ Ｃ
ｏ１ｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）上に塗抹した。マイク
ロスケール技法（Ｋｌｅｉｎら、 Ｐｌａｓｍｉｄ
３（１９８０）、 ８８−９１）に従って調製したＤ
ＮＡの制限酵素分析により、ＣｂＲおよびＫｆｆ１１１
コロニーを物理的に特性化した。
このＤＮＡをＢｇｌｌｌ／ＢａｍＨＩで二重消化すると
、３．９４ｋｂ、５．８９ｋｂおよび８．０９ｋｂの３
＋のフラグメントが、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化すると２
．６８ｋｂ、 ５．９９ｋｂおよび９．２５ｋｂの３つ
のフラグメントが得られる。この消化パターンを示すプ
ラスミドをｐＧＶ７５０と名付け、第１５図に模式的に
示した。
、３．９４ｋｂ、５．８９ｋｂおよび８．０９ｋｂの３
＋のフラグメントが、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化すると２
．６８ｋｂ、 ５．９９ｋｂおよび９．２５ｋｂの３つ
のフラグメントが得られる。この消化パターンを示すプ
ラスミドをｐＧＶ７５０と名付け、第１５図に模式的に
示した。
ｐＧＶ７００とｐＧＶ７５０１；ｉ、オクトビンＴｉプ
ラスミドｐＴｉＢ６Ｓ３のＴＬ二ＤＮＡの左右の境界配
列を含む、２つの相異なる中間クローニングベクターで
ある。更に、これら２つのプラスミドではＴ−領域内の
削除の程度が異なっている。
ラスミドｐＴｉＢ６Ｓ３のＴＬ二ＤＮＡの左右の境界配
列を含む、２つの相異なる中間クローニングベクターで
ある。更に、これら２つのプラスミドではＴ−領域内の
削除の程度が異なっている。
ｐｃｖ７ｏｏは、オクトビンシンターゼ（トランスクリ
プト３ンおよびその他３つの生成物、即ち４．６ａおよ
び６ｂ（Ｔ−領域の生成物についてはＷｉｌｌｍｉｔｚ
ｅｒら、ＥＮＢＯＪ、 ｌ （１９８２）。
プト３ンおよびその他３つの生成物、即ち４．６ａおよ
び６ｂ（Ｔ−領域の生成物についてはＷｉｌｌｍｉｔｚ
ｅｒら、ＥＮＢＯＪ、 ｌ （１９８２）。
１３９−１４６参照）のための遺伝情報を持った縮小Ｔ
−一領域含んでいる。この３つの生成物（４，６ａおよ
び６ｂ）の組み合せが形質転換された植物の新芽形成を
促す。ｐＧＶ７５０はもつと小さいＴ−領域、即ちオク
トビンシンターゼ遺伝子だけを含んでいる。生成物４，
６ａおよび６ｂの為の情報は、カナマイシン（ネオマイ
シン）耐性を暗号化している抗生物質耐性マーカー遺伝
子によって置換されてしまっている。
−一領域含んでいる。この３つの生成物（４，６ａおよ
び６ｂ）の組み合せが形質転換された植物の新芽形成を
促す。ｐＧＶ７５０はもつと小さいＴ−領域、即ちオク
トビンシンターゼ遺伝子だけを含んでいる。生成物４，
６ａおよび６ｂの為の情報は、カナマイシン（ネオマイ
シン）耐性を暗号化している抗生物質耐性マーカー遺伝
子によって置換されてしまっている。
ｐＧＶ７００およびｐＧ Ｖ ７５０は、Ｂタイプのア
クセプターＴｉプラスミド（第８図および後記実施例３
参照）と共に使用し得る中間クローニングベクターの例
である。これらのベクターは、それらが所望の遺伝子を
含んでいないことを除けば、第９図に示したものと部分
的に類似している。これらのベクターは、その改良Ｔ−
領域内にクローンする為の１個の制限エンドヌクレアー
ゼサイトを含んでいるので、所望の遺伝子を簡単にそれ
らのベクターに挿入することができる（第１４図および
第１５図参照）。
クセプターＴｉプラスミド（第８図および後記実施例３
参照）と共に使用し得る中間クローニングベクターの例
である。これらのベクターは、それらが所望の遺伝子を
含んでいないことを除けば、第９図に示したものと部分
的に類似している。これらのベクターは、その改良Ｔ−
領域内にクローンする為の１個の制限エンドヌクレアー
ゼサイトを含んでいるので、所望の遺伝子を簡単にそれ
らのベクターに挿入することができる（第１４図および
第１５図参照）。
（以下、余白）
実施例３ アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ２２６０
（タイプＢ）の組み立て 出発株およびプラスミド： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒａｃｉｅｎ
ｓ （野生型Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから誘導さ
れる、リファンピシン耐性株Ｃ５３Ｃ１およびエリスロ
マイシン−クロラムフェニコール耐性株Ｃ５８Ｃ１） Ｔｉプラスミド−ｐＧＶ２２１７ 中間ベクターく第１６図）＝ｐＧＶ７４５Ｔｉプラスミ
ドｐＧＶ２２１７の組み立てにつ（Ａテハ詳細に記載さ
れている（ Ｌ ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１
９８２）、１４７−１５２）。これ（よ、オクトビンＴ
ｉプラスミドの全Ｔし一領域の欠失置換突然変異体を含
んでいる：即ち、ＢａｍＨＩフラグメント８．３０ｂ、
２８．１７ａおよびＢａｍＨＩフラグメント２の左の３
．７６ｋｂ ＢａｍＨＩ −ＥＣＯＲＩフラグメント（
ＤｅＶｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ ６（１９８１）、２４
９−２５３）が、Ｔｎ５のａｐｔ（アセチルホスホトラ
ンスフェラーゼ）遺伝子を含んでいるｐＫＣ７のＥｃｏ
ＲＩ −ＢａｍＨＩフラグメント（Ｒａｏ ＆ Ｒｏ
ｇｅｒｓ、 Ｇｅｎｅ ７（１９７９）、 ７９−
８２）で置き換えられている。この遺伝子はアミノグリ
コシド、ネオマイシンおよびカナマイシンに対する耐性
を暗号化している。
（タイプＢ）の組み立て 出発株およびプラスミド： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒａｃｉｅｎ
ｓ （野生型Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから誘導さ
れる、リファンピシン耐性株Ｃ５３Ｃ１およびエリスロ
マイシン−クロラムフェニコール耐性株Ｃ５８Ｃ１） Ｔｉプラスミド−ｐＧＶ２２１７ 中間ベクターく第１６図）＝ｐＧＶ７４５Ｔｉプラスミ
ドｐＧＶ２２１７の組み立てにつ（Ａテハ詳細に記載さ
れている（ Ｌ ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１
９８２）、１４７−１５２）。これ（よ、オクトビンＴ
ｉプラスミドの全Ｔし一領域の欠失置換突然変異体を含
んでいる：即ち、ＢａｍＨＩフラグメント８．３０ｂ、
２８．１７ａおよびＢａｍＨＩフラグメント２の左の３
．７６ｋｂ ＢａｍＨＩ −ＥＣＯＲＩフラグメント（
ＤｅＶｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ ６（１９８１）、２４
９−２５３）が、Ｔｎ５のａｐｔ（アセチルホスホトラ
ンスフェラーゼ）遺伝子を含んでいるｐＫＣ７のＥｃｏ
ＲＩ −ＢａｍＨＩフラグメント（Ｒａｏ ＆ Ｒｏ
ｇｅｒｓ、 Ｇｅｎｅ ７（１９７９）、 ７９−
８２）で置き換えられている。この遺伝子はアミノグリ
コシド、ネオマイシンおよびカナマイシンに対する耐性
を暗号化している。
中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立てを第１６図に模式
的に示した。これについて以下に詳述する。組換えプラ
スミドｐＧＶ７１３を、α配向でＨｉｎｄ１１１フラグ
メント１４．１８ｃ、２２ｅおよび３８ｃを含む、オク
トビンＴｉプラスミドサブクｏ−７ｐＧＶＯ２１９（Ｄ
ｅ Ｖｏｓら、Ｐ Ｉａｓｍｉｄ ６ （］９８１）、
２４９−２５３）から誘導した。ｐｃｖ０２１９ＤＮＡ
をＢａｍＨｒで完全に消化し、次いで自己結紮（セルフ
ライゲーシヲン）に有利な条件下でライゲーションした
（ライゲーション混合物中のＤＮＡの最終濃度＜ １Ｈ
ｇ ＤＮＡ／ｍ１２）。アンピシリン耐性で形質転換体
を選別し、制限酵素による消化で物理的に特性化した。
的に示した。これについて以下に詳述する。組換えプラ
スミドｐＧＶ７１３を、α配向でＨｉｎｄ１１１フラグ
メント１４．１８ｃ、２２ｅおよび３８ｃを含む、オク
トビンＴｉプラスミドサブクｏ−７ｐＧＶＯ２１９（Ｄ
ｅ Ｖｏｓら、Ｐ Ｉａｓｍｉｄ ６ （］９８１）、
２４９−２５３）から誘導した。ｐｃｖ０２１９ＤＮＡ
をＢａｍＨｒで完全に消化し、次いで自己結紮（セルフ
ライゲーシヲン）に有利な条件下でライゲーションした
（ライゲーション混合物中のＤＮＡの最終濃度＜ １Ｈ
ｇ ＤＮＡ／ｍ１２）。アンピシリン耐性で形質転換体
を選別し、制限酵素による消化で物理的に特性化した。
こうしてｐｃＶＯ２１９に存在する６、５ｋｂ Ｂａ１
ＨＩフラグメントをもはや含んでいないクローンを分離
し、これをｐＧＶ７１３と名付け、その後のクローニン
グに使用した（以下の記載参照）。ＢａｍＨＩフラグメ
ント２を含んでいるｐＧＶＱ Ｉ ２０（Ｄｅ Ｖｏｓ
ら、Ｐｌａｓｍｉｄ６（１９８１）、２４９ ２５３）
から組換えプラスミドｐＧＶ７３８を誘導した。ｐｃｖ
０１２０ ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＧＶ７１
３の場合と同様にして自己結紮させた。形質転換体をア
ンピシリン耐性によって選別し、制限酵素消化により分
析した。ＥｃｏＲ［フラグメント２０．１２およびＥｃ
ｏＲＩフラグメント１９ａの一部とｐＢ Ｒ３２２の一
部を含んでいる２、９５ｋｂＥｃ。
ＨＩフラグメントをもはや含んでいないクローンを分離
し、これをｐＧＶ７１３と名付け、その後のクローニン
グに使用した（以下の記載参照）。ＢａｍＨＩフラグメ
ント２を含んでいるｐＧＶＱ Ｉ ２０（Ｄｅ Ｖｏｓ
ら、Ｐｌａｓｍｉｄ６（１９８１）、２４９ ２５３）
から組換えプラスミドｐＧＶ７３８を誘導した。ｐｃｖ
０１２０ ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＧＶ７１
３の場合と同様にして自己結紮させた。形質転換体をア
ンピシリン耐性によって選別し、制限酵素消化により分
析した。ＥｃｏＲ［フラグメント２０．１２およびＥｃ
ｏＲＩフラグメント１９ａの一部とｐＢ Ｒ３２２の一
部を含んでいる２、９５ｋｂＥｃ。
Ｒ１フラグメントが全て除去されたクローンをｐＧＶ７
３８と名付け、更にその後のクローニングに利用した。
３８と名付け、更にその後のクローニングに利用した。
このプラスミドは、依然としてＢａｍＨＩフラグメント
２の右側部分からの５．６５ｋｂ ＥｃｏＲＩ −Ｂａ
ｎ）［Ｉフラグメントを含んでいる（ＤｅＶｏｓら、Ｐ
ｌａｓ＋＋＋ｉｄ ６（１９８１）、 ２４９−２５
３）。
２の右側部分からの５．６５ｋｂ ＥｃｏＲＩ −Ｂａ
ｎ）［Ｉフラグメントを含んでいる（ＤｅＶｏｓら、Ｐ
ｌａｓ＋＋＋ｉｄ ６（１９８１）、 ２４９−２５
３）。
次いでｐＧＶ７１３ＤＮＡをＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａ
ｍＨＩで消化し、消化物をプレバラティブアガロースゲ
ルにかけた。電気泳動の後、ｐＧＶ７１３内に含まれて
いる２、３０ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨｌフラ
グメントを電気溶出で純化した（Ａｉｌｉｎｇｔｏｎら
、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８５（１９７５
）、 １８８−１９６）。このフラグメントをＨｉｎ
ｄｌｌｌおよびＢａｍＨＩで完全に消化したｐＧＶ７３
８とライゲーンヨンした。形質転換後、アンピシリン耐
性コロニーを、制限酵素消化により物理的に特性化する
。例えば、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ消化により、それ
ぞれ３．９８ｋｂ（＝ベクタ一部分）と７．９５ｋｂ（
−挿入部分）の２つのフラグメントが得られるはずであ
る。この特性を持った組換えプラスミドはｐＧＶ７４５
と命名され、アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ２２６
０を組み立てるための中間ベクターとして使用された。
ｍＨＩで消化し、消化物をプレバラティブアガロースゲ
ルにかけた。電気泳動の後、ｐＧＶ７１３内に含まれて
いる２、３０ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨｌフラ
グメントを電気溶出で純化した（Ａｉｌｉｎｇｔｏｎら
、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８５（１９７５
）、 １８８−１９６）。このフラグメントをＨｉｎ
ｄｌｌｌおよびＢａｍＨＩで完全に消化したｐＧＶ７３
８とライゲーンヨンした。形質転換後、アンピシリン耐
性コロニーを、制限酵素消化により物理的に特性化する
。例えば、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ消化により、それ
ぞれ３．９８ｋｂ（＝ベクタ一部分）と７．９５ｋｂ（
−挿入部分）の２つのフラグメントが得られるはずであ
る。この特性を持った組換えプラスミドはｐＧＶ７４５
と命名され、アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ２２６
０を組み立てるための中間ベクターとして使用された。
プラスミドｐＧＶ７４５はｐＢ Ｒ３２２部分にＣｏ１
Ｅｌ特異的ｂｏＩＩサイトを持っており、実施例１に記
載した様に（アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立てについて）、ヘルパープラスミドＲ６４ｄ
ｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８を使ってＥ、 ｃｏｌｉから
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ授動させることができ
る。
Ｅｌ特異的ｂｏＩＩサイトを持っており、実施例１に記
載した様に（アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立てについて）、ヘルパープラスミドＲ６４ｄ
ｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８を使ってＥ、 ｃｏｌｉから
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ授動させることができ
る。
ｐＧＶ７４５を、リファンピシン耐性でありＴｉプラス
ミドｐＧＶ２２１７を含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ株Ｃ５８ＣＩに授動させた。最初の乗り換えは
、実施例１（アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立て）に記載した方法と同じ方法で、ｐＢ Ｒ
３２２のアンピシリン耐性を使って選択１．た。２回目
の乗り換えにより、ｐＧ Ｖ ２２１７に存在する欠失
置換突然変異体がプラスミドｐＧＶ７４５のｐＢ Ｒ３
２２配列によって置換される。ｐＧＶ７４５のｐＧＶ２
２１７との相互組込みの結果得られるアンピシリン耐性
トランス接合体を、カナマイシン耐性の欠落により直接
選別することにより第２の組換え体を得た。この様にし
て、ｐＧＶ２２６０（アンピシリン耐性、カナマイシン
感受性）を含んでいるリファンピシンＡ ｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１を得た。
ミドｐＧＶ２２１７を含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ株Ｃ５８ＣＩに授動させた。最初の乗り換えは
、実施例１（アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立て）に記載した方法と同じ方法で、ｐＢ Ｒ
３２２のアンピシリン耐性を使って選択１．た。２回目
の乗り換えにより、ｐＧ Ｖ ２２１７に存在する欠失
置換突然変異体がプラスミドｐＧＶ７４５のｐＢ Ｒ３
２２配列によって置換される。ｐＧＶ７４５のｐＧＶ２
２１７との相互組込みの結果得られるアンピシリン耐性
トランス接合体を、カナマイシン耐性の欠落により直接
選別することにより第２の組換え体を得た。この様にし
て、ｐＧＶ２２６０（アンピシリン耐性、カナマイシン
感受性）を含んでいるリファンピシンＡ ｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１を得た。
このＴｉプラスミドｐＧ Ｖ ２２６０ ハ、ｐｃ Ｖ
７００−またはｐＧＶ７５０−タイプの中間クローニ
ングベクター用のアクセプタープラスミド（Ｂタイプ）
として使用されるものである。これらは、（ｉ）アンピ
シリン耐性遺伝子、複製起源およびｐＢＲ３２２のｂｏ
ＩＲサイトを持ったＤＮＡフラグメント、（ｉｉ）ＴＬ
−ＤＮＡの左右の境界配列のすぐ外側に位置するＤＮＡ
配列および、中間クローニングベクターのＥ、 ｃｏｌ
ｉからＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移並びにその
アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ２２６０への相互組
込みを遺伝学的に選別し得る、ｐＢ Ｒ３２２に既に存
在している耐性マーカーとは別の、もう１つの耐性マー
カーを含んでいるＤＮＡフラグメント、で構成されてい
る。
７００−またはｐＧＶ７５０−タイプの中間クローニ
ングベクター用のアクセプタープラスミド（Ｂタイプ）
として使用されるものである。これらは、（ｉ）アンピ
シリン耐性遺伝子、複製起源およびｐＢＲ３２２のｂｏ
ＩＲサイトを持ったＤＮＡフラグメント、（ｉｉ）ＴＬ
−ＤＮＡの左右の境界配列のすぐ外側に位置するＤＮＡ
配列および、中間クローニングベクターのＥ、 ｃｏｌ
ｉからＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移並びにその
アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ２２６０への相互組
込みを遺伝学的に選別し得る、ｐＢ Ｒ３２２に既に存
在している耐性マーカーとは別の、もう１つの耐性マー
カーを含んでいるＤＮＡフラグメント、で構成されてい
る。
例えば、本発明者らは、ｐＧＶ ２２６０とｐｃｖ７０
０との間の相互組込み体を持っているＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍは、所望のＤＮＡ配列（Ｔ−ＤＮＡ境界の間
に含まれている）を植物細胞ゲノムへ転移させ得ること
を立証した。この形質転換された植物細胞は、もしｐＧ
Ｖ７ＱＱが３つの生産物のための遺伝情報（４，６ａ、
６ｂ； Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、Ｉ（＋
９８２）、１３９−１４６）を含んでいる場合は、期待
される表現形質、即ち新芽を生じる腫瘍を示す。この様
に、本発明者らは、ＢタイプのアクセプターＴｉプラス
ミドは、第９図に示し、更に実施例２に記載したタイプ
の中間クローニングベクターとの相互組込み体として使
用すると、ＤＮＡを植物細胞に転移させることができる
ことを証明した。
０との間の相互組込み体を持っているＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍは、所望のＤＮＡ配列（Ｔ−ＤＮＡ境界の間
に含まれている）を植物細胞ゲノムへ転移させ得ること
を立証した。この形質転換された植物細胞は、もしｐＧ
Ｖ７ＱＱが３つの生産物のための遺伝情報（４，６ａ、
６ｂ； Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、Ｉ（＋
９８２）、１３９−１４６）を含んでいる場合は、期待
される表現形質、即ち新芽を生じる腫瘍を示す。この様
に、本発明者らは、ＢタイプのアクセプターＴｉプラス
ミドは、第９図に示し、更に実施例２に記載したタイプ
の中間クローニングベクターとの相互組込み体として使
用すると、ＤＮＡを植物細胞に転移させることができる
ことを証明した。
実施例４ 植物に発現させようとする遺伝子を含んだ中
間クローニングベクターの組み立て本発明が完成される
まで、ＴｉプラスミドのＴ領域内の、多かれ少なかれで
たらめな位置に全遺伝子を挿入しても、その外来性の配
列が植物ゲノムへ転移した後発現されるということはな
かった。本発明方法に従えば、所望の外来性遺伝子（群
）の暗号領域を、植物細胞中で機能することが知られて
いる転写開始および終了信号に連結することができる。
間クローニングベクターの組み立て本発明が完成される
まで、ＴｉプラスミドのＴ領域内の、多かれ少なかれで
たらめな位置に全遺伝子を挿入しても、その外来性の配
列が植物ゲノムへ転移した後発現されるということはな
かった。本発明方法に従えば、所望の外来性遺伝子（群
）の暗号領域を、植物細胞中で機能することが知られて
いる転写開始および終了信号に連結することができる。
この方法の有用性は、ツバリンシンターゼ遺伝子を暗号
化しているＤＮＡ配列が関与する、本発明の実験によっ
て例証される。この遺伝子の全配列および正確な転写開
始および終了は既知である（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ
、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、１（１９８
２）、５６１ ５７４）。本発明によれば外来性遺伝子
の蛋白質暗号化領域はｎｏｓプロモーターの隣りに挿入
することができる。外来性遺伝子配列の例として、オク
トビンシンターゼ遺伝子の暗号領域（Ｄｅ Ｇｒｅｖｅ
ら、Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１（１９
８２）、４９９ ５１２）をｎｏｓプロモーターに隣接
させて挿入する。この構造物はアクセプターＴｉプラス
ミド内に授動され、植物を感染させるのに使用される。
化しているＤＮＡ配列が関与する、本発明の実験によっ
て例証される。この遺伝子の全配列および正確な転写開
始および終了は既知である（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ
、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、１（１９８
２）、５６１ ５７４）。本発明によれば外来性遺伝子
の蛋白質暗号化領域はｎｏｓプロモーターの隣りに挿入
することができる。外来性遺伝子配列の例として、オク
トビンシンターゼ遺伝子の暗号領域（Ｄｅ Ｇｒｅｖｅ
ら、Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１（１９
８２）、４９９ ５１２）をｎｏｓプロモーターに隣接
させて挿入する。この構造物はアクセプターＴｉプラス
ミド内に授動され、植物を感染させるのに使用される。
生成した腫瘍組織にオクトビンが存在するがどうかを分
析した所、陽性であることがわかった。
析した所、陽性であることがわかった。
キメラツバリンプロモーターを含有している中間クロー
ニングベクターの組み立て：オクトビンシンターゼ構造
遺伝子を第１８図〜第２０図に示す。
ニングベクターの組み立て：オクトビンシンターゼ構造
遺伝子を第１８図〜第２０図に示す。
簡単に言えば、ｎｏｓ遺伝子を含んでいる制限フラグメ
ントＨｉｎｄ ｌｌｌ−２３をインビトロで処理してｎ
ｏｓ暗号配列の大部分を除去する一方、制限エンドヌク
レアーゼサイトＢａｆｆ１ＨＩに隣接しているｎｏｓプ
ロモーターは保持する（第１８図）。１ＯｕｇのｐＧＶ
Ｏ４２２（完全なｎｏｓ遺伝子を含むＨｉｎｄ ｌｌｌ
−２３７ラグメントを持ったｐＢＲ３２２誘導体； Ｄ
ｅｐｉｃｋｅｒら、 Ｐｌａｓｍｉｄ （１９８０）
、１９３−２１１）を５ａｕ３Ａで消化し、ｎｏｓフロ
モーターを含んだ３５０ｂｐのフラグメントをプレバラ
ティ１５％ポリアクリルアミドゲルで分離する。このプ
ロモーターフラグメントを、５′−末端燐酸エステル基
を除去するために予め細菌性アルカリホスファターゼ（
ＢＡＰ）で処理した、Ｂｇｌ ＩＩ−切断ｐＫＣ７（Ｒ
ａｏら、Ｇｅｎｅ７（１９７９）、７９−８２）に結合
させる。得られたプラスミド（ｐＬＧＶ １３）２０μ
ｇをＢｇｌ １１で消化し、４００ａＱの１２ｍＭ Ｍ
ｇＣ（！ｔ、ｌ ２ｍＭ ＣａＣＱ、、０．６Ｍ Ｎａ
Ｃｇ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ＱｍＭ）リス−ＨＣｌ
２（ｐＨ８，０）中、３０℃でＢａ１３１エキソヌクレ
アーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ、 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ）
７単位を用いて４〜１０分間処理する。この間、約２
０〜５ｏｂｐのＤＮＡが除去される。このＢａ１３１−
処理分子をＢａｍＨＩで消化した後、ＤＮＡポリメラー
ゼのＫ ｌｅｎｏｗフラグメントと４っのデオキシヌク
レオンドトリホスフエート（それぞれＩＯａ＋Ｍ）と共
にインキュベートして、その末端を満たす。充填された
ＢａｍＨＩ末端とＢａ１３１除去末端とのライゲーショ
ンから得られる再生ＢａｍＨＩサイトを持ったプラスミ
ドを選別する。
ントＨｉｎｄ ｌｌｌ−２３をインビトロで処理してｎ
ｏｓ暗号配列の大部分を除去する一方、制限エンドヌク
レアーゼサイトＢａｆｆ１ＨＩに隣接しているｎｏｓプ
ロモーターは保持する（第１８図）。１ＯｕｇのｐＧＶ
Ｏ４２２（完全なｎｏｓ遺伝子を含むＨｉｎｄ ｌｌｌ
−２３７ラグメントを持ったｐＢＲ３２２誘導体； Ｄ
ｅｐｉｃｋｅｒら、 Ｐｌａｓｍｉｄ （１９８０）
、１９３−２１１）を５ａｕ３Ａで消化し、ｎｏｓフロ
モーターを含んだ３５０ｂｐのフラグメントをプレバラ
ティ１５％ポリアクリルアミドゲルで分離する。このプ
ロモーターフラグメントを、５′−末端燐酸エステル基
を除去するために予め細菌性アルカリホスファターゼ（
ＢＡＰ）で処理した、Ｂｇｌ ＩＩ−切断ｐＫＣ７（Ｒ
ａｏら、Ｇｅｎｅ７（１９７９）、７９−８２）に結合
させる。得られたプラスミド（ｐＬＧＶ １３）２０μ
ｇをＢｇｌ １１で消化し、４００ａＱの１２ｍＭ Ｍ
ｇＣ（！ｔ、ｌ ２ｍＭ ＣａＣＱ、、０．６Ｍ Ｎａ
Ｃｇ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ＱｍＭ）リス−ＨＣｌ
２（ｐＨ８，０）中、３０℃でＢａ１３１エキソヌクレ
アーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ、 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ）
７単位を用いて４〜１０分間処理する。この間、約２
０〜５ｏｂｐのＤＮＡが除去される。このＢａ１３１−
処理分子をＢａｍＨＩで消化した後、ＤＮＡポリメラー
ゼのＫ ｌｅｎｏｗフラグメントと４っのデオキシヌク
レオンドトリホスフエート（それぞれＩＯａ＋Ｍ）と共
にインキュベートして、その末端を満たす。充填された
ＢａｍＨＩ末端とＢａ１３１除去末端とのライゲーショ
ンから得られる再生ＢａｍＨＩサイトを持ったプラスミ
ドを選別する。
いくつかの候補のＢａｍＨ［−３ａｃ Ｉｔ フラグメ
ントのサイズを６％尿素−ポリアクリルアミドゲル中で
見積り、サイズが２００〜２８０ヌクレオチドの範囲に
ある候補のヌクレオチド配列を決定する。プロモーター
を持った２０３ｂｐのＳａｃｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメ
ントを含んでいるクローンｐＬＧＶ８１を、ｐＧＶＯ４
２２の ｎｏｓ遺伝子中のＳａｃ ＩＩ−ＢａｍＨＩ
フラグメントと置換するのに使用する：この最終プロ
モーターベクター１；ｔｐＬＧＶ２３８１と呼ばれる。
ントのサイズを６％尿素−ポリアクリルアミドゲル中で
見積り、サイズが２００〜２８０ヌクレオチドの範囲に
ある候補のヌクレオチド配列を決定する。プロモーター
を持った２０３ｂｐのＳａｃｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメ
ントを含んでいるクローンｐＬＧＶ８１を、ｐＧＶＯ４
２２の ｎｏｓ遺伝子中のＳａｃ ＩＩ−ＢａｍＨＩ
フラグメントと置換するのに使用する：この最終プロ
モーターベクター１；ｔｐＬＧＶ２３８１と呼ばれる。
全ての組換えプラスミドはＥ 、 ｃｏｌ ｉ株ＨＢＩ
ＯＩの形質転換により選択する。
ＯＩの形質転換により選択する。
この様に処理したｎｏｓプロモータを含んでいるプラス
ミドベクターをＢａｍＨＩで消化し、Ｂａｌ！ｌＨ■フ
ラグメントに含まれているｏｃｓの暗号配列をこのサイ
トに挿入する。このｏｃｓ暗号配列も、インビトロで処
理し、第１９図に示した様に、Ｂ ａｍＨ１制限エンド
ヌクレアーゼサイトで囲まれる様にする。オクトピンＴ
ｉプラスミドＢ６Ｓ３のＢａｎＨＩフラグメント１７ａ
１０ ｊｉｇ （Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ
６（１９８１）、２４９ ２５３）をＢａｍＨ１および
Ｓｍａ（で消化し、０ｅＳ−暗号配列を含むフラグメン
トを１％アガロースゲルから分離し、ｐＢ Ｒ３２２の
大きいＢａｍＨＩ −ＰｖｕＩＩフラグメントに結合さ
せる ；得られたプラスミド、ｐＡＧＶ８２８（２０μ
ｇ）をＢａｍＨＩで消化し、第１８図に示した様にエキ
ソヌクレアーゼＢａ１３１で処理し、次いでＨｉｎｄｌ
ｌｌで消化し、末端を充填し、自己結合させる。Ｂａ１
３１除去体のサイズは６％ポリアクリルアミドゲル中で
見積る。いくつかの候補のヌクレオチド配列を決定し、
５”非翻訳リーダー配列の残り７ｂｐだけを持った候補
を選択して以下の操作に付す（ｐＯｃｓ△）。ｏｃｓ配
列をＢａｍＨＩサイトで囲むために、Ｃ１ａ’ＩＲｓａ
Ｉフラグメントを充填し、ｐＬＣ２３６（Ｒｅｍａｕｔ
ら、Ｇｅｎｅ １５（１９８１）、８１ ９３）のＢ
ａ１ｌサイトにサブクローンする。得られたプラスミド
ｐＡＧＶ４ＱをＢａｍＨＩで消化し、ｏｃｓ配列を持っ
たフラグメントをプレバラティ１１％アガロースゲルか
ら電気溶出により分離し、予めＢａｉ＋）ｌ Ｉで消化
しＢＡＰ（細菌性アルカリホスファターゼ）で処理した
ｐＬＧＶ２３８１に結合させる。ｏｃｓ配列のｐＬＧＶ
２３８１への挿入により、両方の配向のものが得られる
（ｐＮｏ−１およびｐＮｏ−２）。
ミドベクターをＢａｍＨＩで消化し、Ｂａｌ！ｌＨ■フ
ラグメントに含まれているｏｃｓの暗号配列をこのサイ
トに挿入する。このｏｃｓ暗号配列も、インビトロで処
理し、第１９図に示した様に、Ｂ ａｍＨ１制限エンド
ヌクレアーゼサイトで囲まれる様にする。オクトピンＴ
ｉプラスミドＢ６Ｓ３のＢａｎＨＩフラグメント１７ａ
１０ ｊｉｇ （Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ
６（１９８１）、２４９ ２５３）をＢａｍＨ１および
Ｓｍａ（で消化し、０ｅＳ−暗号配列を含むフラグメン
トを１％アガロースゲルから分離し、ｐＢ Ｒ３２２の
大きいＢａｍＨＩ −ＰｖｕＩＩフラグメントに結合さ
せる ；得られたプラスミド、ｐＡＧＶ８２８（２０μ
ｇ）をＢａｍＨＩで消化し、第１８図に示した様にエキ
ソヌクレアーゼＢａ１３１で処理し、次いでＨｉｎｄｌ
ｌｌで消化し、末端を充填し、自己結合させる。Ｂａ１
３１除去体のサイズは６％ポリアクリルアミドゲル中で
見積る。いくつかの候補のヌクレオチド配列を決定し、
５”非翻訳リーダー配列の残り７ｂｐだけを持った候補
を選択して以下の操作に付す（ｐＯｃｓ△）。ｏｃｓ配
列をＢａｍＨＩサイトで囲むために、Ｃ１ａ’ＩＲｓａ
Ｉフラグメントを充填し、ｐＬＣ２３６（Ｒｅｍａｕｔ
ら、Ｇｅｎｅ １５（１９８１）、８１ ９３）のＢ
ａ１ｌサイトにサブクローンする。得られたプラスミド
ｐＡＧＶ４ＱをＢａｍＨＩで消化し、ｏｃｓ配列を持っ
たフラグメントをプレバラティ１１％アガロースゲルか
ら電気溶出により分離し、予めＢａｉ＋）ｌ Ｉで消化
しＢＡＰ（細菌性アルカリホスファターゼ）で処理した
ｐＬＧＶ２３８１に結合させる。ｏｃｓ配列のｐＬＧＶ
２３８１への挿入により、両方の配向のものが得られる
（ｐＮｏ−１およびｐＮｏ−２）。
ｎｏｓ ： ｏｃｓ融合の正確な接合点を示すヌクレオ
チド配列を第２０図に示す。
チド配列を第２０図に示す。
更に、処理したｎｏｓプロモーターを含有しているプラ
スミドベクターは、酵素ジヒドロフオレトレダクターゼ
を暗号化しているプラスミドＲ６７からのＤＮＡを挿入
するのに使用される。ジヒドロフオレートレダクターゼ
遺伝子を含んでいる暗号配列は、ＢａｍＨＩに含まれて
おり （○”Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７８（１９８
１）、１５２７−１５３１）、従って既述した様に、プ
ロモーター領域に隣接するＢａ！１ｌＨＩサイトを含ん
でいるｎｏｓプロモーターベクターに容易に挿入される
。この遺伝子は、発現されると抗生物質メトトレキセー
トに対する耐性を付与するので、選択可能なマーカー遺
伝子の１つの例である（第２．３，４．５および７図参
照）。この中間クローニングベクターが野生型ツバリン
アクセプターＴｉプラスミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍに授動されると、単一乗換えが起り、
ハイブリッドＴｉプラスミドベクターが得られる。この
ベクター組成物を、植物の感染に使用する。得られた腫
瘍ａｍは、０．５μｇ／ ｘ（ｌのメトトレキセートの
存在下で継続して生長し得ることがわかった。
スミドベクターは、酵素ジヒドロフオレトレダクターゼ
を暗号化しているプラスミドＲ６７からのＤＮＡを挿入
するのに使用される。ジヒドロフオレートレダクターゼ
遺伝子を含んでいる暗号配列は、ＢａｍＨＩに含まれて
おり （○”Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７８（１９８
１）、１５２７−１５３１）、従って既述した様に、プ
ロモーター領域に隣接するＢａ！１ｌＨＩサイトを含ん
でいるｎｏｓプロモーターベクターに容易に挿入される
。この遺伝子は、発現されると抗生物質メトトレキセー
トに対する耐性を付与するので、選択可能なマーカー遺
伝子の１つの例である（第２．３，４．５および７図参
照）。この中間クローニングベクターが野生型ツバリン
アクセプターＴｉプラスミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍに授動されると、単一乗換えが起り、
ハイブリッドＴｉプラスミドベクターが得られる。この
ベクター組成物を、植物の感染に使用する。得られた腫
瘍ａｍは、０．５μｇ／ ｘ（ｌのメトトレキセートの
存在下で継続して生長し得ることがわかった。
ＯＣ８および上記のｎｏｓプロモーターの後のジヒドロ
フオレートレダクターゼ暗号領域を含んでいる中間クロ
ーニングベクターを組み立て、Ａｇｒ。
フオレートレダクターゼ暗号領域を含んでいる中間クロ
ーニングベクターを組み立て、Ａｇｒ。
ｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋のＴｉプラスミドと相互組込みし
た後、形質転換植物細胞に転移、発現させることにより
、本発明方法によって外来性遺伝子を植物細胞に転移し
、発現させることができるということが証明される。
た後、形質転換植物細胞に転移、発現させることにより
、本発明方法によって外来性遺伝子を植物細胞に転移し
、発現させることができるということが証明される。
実施例５ 染色体中に所望の挿入遺伝子を含む植物細胞
および植物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれかを使って、
非腫瘍性アクセプターＴｉプラスミド誘導体（例えばｐ
ＧＶ３８５０）で形質転換された植物細胞および全植物
を得た。
および植物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれかを使って、
非腫瘍性アクセプターＴｉプラスミド誘導体（例えばｐ
ＧＶ３８５０）で形質転換された植物細胞および全植物
を得た。
（１） インビボでの全植物の接種、次いで新芽の再
生が可能な培地上、インビトロでの培養、（２）損傷部
位で直接新芽の生成を促す他のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉａ株の存在下、インビボにおける全植物の相互感染、 （３）インビトロでの単一植物細胞プロトプラストの共
生培養。
生が可能な培地上、インビトロでの培養、（２）損傷部
位で直接新芽の生成を促す他のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉａ株の存在下、インビボにおける全植物の相互感染、 （３）インビトロでの単一植物細胞プロトプラストの共
生培養。
これらの方法について以下に詳述する。
最初の方法は、クラウンガル組織の生産をもたらす全植
物組織の野生型Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株による
感染体を得る為に通常使用される方法を改良したもので
ある。ｐＧ Ｖ ３８５０は腫瘍を形成しないＡ ｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ誘導体であるので、感染部位にお
いて腫瘍の増殖はみられない。しかし感染した組織を取
り除き、組織培養で増殖させると、形質転換された組織
を容易に得ることができる。初期培養期間（単に組織の
量を増やすため）の後、損傷部位組織を新芽形成が可能
な条件下で増殖させる。
物組織の野生型Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株による
感染体を得る為に通常使用される方法を改良したもので
ある。ｐＧ Ｖ ３８５０は腫瘍を形成しないＡ ｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ誘導体であるので、感染部位にお
いて腫瘍の増殖はみられない。しかし感染した組織を取
り除き、組織培養で増殖させると、形質転換された組織
を容易に得ることができる。初期培養期間（単に組織の
量を増やすため）の後、損傷部位組織を新芽形成が可能
な条件下で増殖させる。
非形質転換細胞およびｐｃ Ｖ ３８５０−形質転換細
胞の両者が新芽を発生する。形質転換新芽は、ツバリン
の存在をみる簡単な分析により容易に区別することがで
きる。
胞の両者が新芽を発生する。形質転換新芽は、ツバリン
の存在をみる簡単な分析により容易に区別することがで
きる。
本発明者らは、次のプロトコールに従って、Ｎ１ｃｏｔ
ｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３８
の頭部を切断したタバコの苗木から、ｐＧＶ３８５０−
形質転換カルスおよび新芽を得た（全ての操作はラミナ
ー７０−フード中、無菌条件下で行なった）。
ｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３８
の頭部を切断したタバコの苗木から、ｐＧＶ３８５０−
形質転換カルスおよび新芽を得た（全ての操作はラミナ
ー７０−フード中、無菌条件下で行なった）。
（１）小さなびん（直径１０ｃｍ、高さｌｏｃｍ）の中
で、０．８％の寒天を含む固形のＭｕｒａｓｈｉｇｅ
＆Ｓ ｋｏｏｇ（Ｍ Ｓ ）培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
およびＳ ｋｏｏｇ＋Ｐｈｙｓ＋ｉｏ１． Ｐｌａｎ
ｔ、 １５（１９６２）、 ４７３−４９７）で生
育させた６周令のタバコの苗木を使用する。
で、０．８％の寒天を含む固形のＭｕｒａｓｈｉｇｅ
＆Ｓ ｋｏｏｇ（Ｍ Ｓ ）培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
およびＳ ｋｏｏｇ＋Ｐｈｙｓ＋ｉｏ１． Ｐｌａｎ
ｔ、 １５（１９６２）、 ４７３−４９７）で生
育させた６周令のタバコの苗木を使用する。
（２）外科用メスで最も若い頭頂の葉を切り取って捨て
る。
る。
（３）選択的条件（例えばＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０を含んでいるリファンピシン耐性、アンピシリン耐性
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の場合は、１００μｇ
／ＩＩＱのりファンピシノとｌＯＯμｇ／ｘ（ｌのカル
ベニシリンを含んでいるＹＥＢ培地を使用する；ＹＥＢ
培地＝ ５ ｇ／ Ｑ Ｂ ａｃｔｏビーフエキス、１
ｇ／ＱＢａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／σペプトン、５ｇ
／ジシュクロース、２Ｘ １０−’ Ｍ Ｍｇ５Ｏ，。
０を含んでいるリファンピシン耐性、アンピシリン耐性
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の場合は、１００μｇ
／ＩＩＱのりファンピシノとｌＯＯμｇ／ｘ（ｌのカル
ベニシリンを含んでいるＹＥＢ培地を使用する；ＹＥＢ
培地＝ ５ ｇ／ Ｑ Ｂ ａｃｔｏビーフエキス、１
ｇ／ＱＢａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／σペプトン、５ｇ
／ジシュクロース、２Ｘ １０−’ Ｍ Ｍｇ５Ｏ，。
ｐＨ７，２，１５ｇ／＆寒天）で増殖させた新鮮な平板
培養からのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、スパーチ
ルまたはつまようじで損傷表面に接種する。各ｐｃｖ３
８５０組み立て物を、少なくとも８本の苗木に接種する
。
培養からのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、スパーチ
ルまたはつまようじで損傷表面に接種する。各ｐｃｖ３
８５０組み立て物を、少なくとも８本の苗木に接種する
。
（４）２週間インキュベートする。接種部位にほとんど
あるいは全く反応が表われないはずであるが、時々悲慮
に小さいカルス（ｃａｌｌｉ）が観察される。
あるいは全く反応が表われないはずであるが、時々悲慮
に小さいカルス（ｃａｌｌｉ）が観察される。
（５）損傷表面から厚さ１ｍｍ以下の薄い切片を切り取
る。損傷表面を、オーキシンおよびサイトキ”−７（１
ｍｇ／ＲＮＡＡ、 ０．２ｍｇ／＆ ＢＡＰ）および１
％シュクロースを添加したＬ １ｎｓＩｌａｉｅｒ ＆
Ｓ ｋｏｏｇ（ＬＳ）寒天培地（Ｌ ｉｎｓｍａｉｅｒ
ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ、 Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、 Ｐ
ｌａｎｔ、 ｌ ８（１９６５）、 １００ １２７
）を含む平板上で培養する。
る。損傷表面を、オーキシンおよびサイトキ”−７（１
ｍｇ／ＲＮＡＡ、 ０．２ｍｇ／＆ ＢＡＰ）および１
％シュクロースを添加したＬ １ｎｓＩｌａｉｅｒ ＆
Ｓ ｋｏｏｇ（ＬＳ）寒天培地（Ｌ ｉｎｓｍａｉｅｒ
ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ、 Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、 Ｐ
ｌａｎｔ、 ｌ ８（１９６５）、 １００ １２７
）を含む平板上で培養する。
（６）約６週間後、カルスはその一部をとってツバリン
の存在を試験するのに十分なだけの大きさになる（少な
くとも直径が約５ｍｍになる）。全ての損傷カルスがツ
バリンを生産する訳ではない。４本の植物の内約１本が
ツバリン陽性損傷カルスをつくる。
の存在を試験するのに十分なだけの大きさになる（少な
くとも直径が約５ｍｍになる）。全ての損傷カルスがツ
バリンを生産する訳ではない。４本の植物の内約１本が
ツバリン陽性損傷カルスをつくる。
（７）ツバリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平板に
移す二上記のＬＳ培地＋１％シュクロースおよび１ ｍ
ｇ／ｆｆ Ｂ Ａ Ｐサイトキニン（８）約４〜６週間
後に良好なサイズの新芽（高さ１ｃｍ）が出る。更に成
長させ、根を形成させるために、この新芽を、ホルモン
を含まないＬＳ培地＋１％シュクロースを含有している
新しい寒天平板に移す。
移す二上記のＬＳ培地＋１％シュクロースおよび１ ｍ
ｇ／ｆｆ Ｂ Ａ Ｐサイトキニン（８）約４〜６週間
後に良好なサイズの新芽（高さ１ｃｍ）が出る。更に成
長させ、根を形成させるために、この新芽を、ホルモン
を含まないＬＳ培地＋１％シュクロースを含有している
新しい寒天平板に移す。
（９）ツバリンの存在を試験するのに、その一部（１〜
２枚の小さな葉）を切り取れる様に、この新芽を１〜２
週間成長させる。
２枚の小さな葉）を切り取れる様に、この新芽を１〜２
週間成長させる。
（１０）ツバリン陽性の新芽を、（１）と同じＭＳ培地
を入れたやや大きい容器（上記と同じ１ｏａ１１のびん
）に移し、更に成長させる。
を入れたやや大きい容器（上記と同じ１ｏａ１１のびん
）に移し、更に成長させる。
注）感染させた組織のための全ての植物培養培地には、
ｐＧＶ３８５０含有Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対
する選択的毒物として、抗生物質セフォタキシム（ｃｅ
「ｏｔａｘｉｍｅ、 Ｃ１ａｆｏｒａｎｌｌ、 ヘキス
ト）５００ μｇ／ｌ（ｌが含まれている。この薬物は
、全てのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（カルベニシリ
ン耐性のものを含む）の生長をよく阻止する。
ｐＧＶ３８５０含有Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対
する選択的毒物として、抗生物質セフォタキシム（ｃｅ
「ｏｔａｘｉｍｅ、 Ｃ１ａｆｏｒａｎｌｌ、 ヘキス
ト）５００ μｇ／ｌ（ｌが含まれている。この薬物は
、全てのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（カルベニシリ
ン耐性のものを含む）の生長をよく阻止する。
本発明者らの研究室で、形質転換された新芽を出す組織
を得る別の方法が開発された。この方法は、 Ａ ｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのある種のミュータントＴｉプラ
スミド株が、新芽を出すクラウンガル腫瘍を生成させる
ということを観察したことに基いて開発された。この様
な新芽−誘起（ｓｈｉ）に関する突然変異はＳＡ、 ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴＤＮＡ（転
移ＤＮＡセグメント）の特定の領域に位置している（
Ｌ ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、
１４７−１５２； Ｊｏｏｓら、 Ｃｅ１ｌ
３２（１９８３）、１０５７−１０６７）。誘起された
新芽は完全に正常な非形質転換細胞で構成されているこ
とが多い。従って本発明者らは、２つの異なったＡ ｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、即ち１つはオクトピンＴｉプラ
スミド放出（ｓｈｏｏｔｅｒ） ミュータントを持った
もの、もう１つはｐＧＶ３８５０を持ったもの、の混合
物で植物を接種した。この様にすることは、オクトピン
放出ミューチージョンが、ｐＧ■３８５０で形質転換さ
れた根を誘起することが出来るよい機会を与える。Ｔｉ
プラスミドｐＧＶ３８５０およびオクトピン新芽誘起Ｔ
ｉプラスミドを５：１の割合で含んでいるＡ ｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍを植物に接種した。こうすることによ
りｐＧ Ｖ ３８５０−形質転換新芽を得た。この新芽
は、ツバリンの存在について分析することにより、容易
に選別することができる。この方法は、精功な組織培養
法を必要としない。ツバリン陽性新芽を、更に成長させ
るために、長調節ホルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含
んだ培地に移す。新芽が十分な大きさに達した後、容易
に繁殖の為の土壌に移すことができる。
を得る別の方法が開発された。この方法は、 Ａ ｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのある種のミュータントＴｉプラ
スミド株が、新芽を出すクラウンガル腫瘍を生成させる
ということを観察したことに基いて開発された。この様
な新芽−誘起（ｓｈｉ）に関する突然変異はＳＡ、 ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴＤＮＡ（転
移ＤＮＡセグメント）の特定の領域に位置している（
Ｌ ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、
１４７−１５２； Ｊｏｏｓら、 Ｃｅ１ｌ
３２（１９８３）、１０５７−１０６７）。誘起された
新芽は完全に正常な非形質転換細胞で構成されているこ
とが多い。従って本発明者らは、２つの異なったＡ ｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、即ち１つはオクトピンＴｉプラ
スミド放出（ｓｈｏｏｔｅｒ） ミュータントを持った
もの、もう１つはｐＧＶ３８５０を持ったもの、の混合
物で植物を接種した。この様にすることは、オクトピン
放出ミューチージョンが、ｐＧ■３８５０で形質転換さ
れた根を誘起することが出来るよい機会を与える。Ｔｉ
プラスミドｐＧＶ３８５０およびオクトピン新芽誘起Ｔ
ｉプラスミドを５：１の割合で含んでいるＡ ｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍを植物に接種した。こうすることによ
りｐＧ Ｖ ３８５０−形質転換新芽を得た。この新芽
は、ツバリンの存在について分析することにより、容易
に選別することができる。この方法は、精功な組織培養
法を必要としない。ツバリン陽性新芽を、更に成長させ
るために、長調節ホルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含
んだ培地に移す。新芽が十分な大きさに達した後、容易
に繁殖の為の土壌に移すことができる。
この共感染法は、簡単に組織培養しにくい種類の植物を
形質転換するのに特に有用である。従って、あらゆる範
囲の農学的にあるいは経済的に重要な植物、例えば豆科
植物、薬用植物および装飾植物をＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｉで処置することができよう。
形質転換するのに特に有用である。従って、あらゆる範
囲の農学的にあるいは経済的に重要な植物、例えば豆科
植物、薬用植物および装飾植物をＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｉで処置することができよう。
第３の方法は、Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ
プロトプラストの単離およびホルモン−非依存性のＴ−
ＤＮＡ−形質転換細胞クローンの選択を、そのプロトプ
ラスト−由来細胞と腫瘍性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
株との共培養後に実施し得るものである。他の優勢な選
択マーカー、例えば高等植物細胞で発現される様に組み
立てられた抗生物質耐性遺伝子を使用すれば（実施例３
参照）、形質転換細胞を選択するのに類似の方法を使用
することができる。しかしこの場合は、それぞれのケー
スについて選択の最適条件をみつける必要がある（選択
剤の濃度、形質転換と選択の間の時間、選択培地中のプ
ロトプラスト−由来細胞または細胞コロニーの濃度など
）。
プロトプラストの単離およびホルモン−非依存性のＴ−
ＤＮＡ−形質転換細胞クローンの選択を、そのプロトプ
ラスト−由来細胞と腫瘍性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
株との共培養後に実施し得るものである。他の優勢な選
択マーカー、例えば高等植物細胞で発現される様に組み
立てられた抗生物質耐性遺伝子を使用すれば（実施例３
参照）、形質転換細胞を選択するのに類似の方法を使用
することができる。しかしこの場合は、それぞれのケー
スについて選択の最適条件をみつける必要がある（選択
剤の濃度、形質転換と選択の間の時間、選択培地中のプ
ロトプラスト−由来細胞または細胞コロニーの濃度など
）。
形質転換細胞の選択ができない場合、例えばｐＧＶ３８
５０またはｐＧ Ｖ ２２１７ （Ｌｅｅｍａｎｓら、
ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、１４７−１５２）の様な
非毒性のＴ−ＤＮＡ ミュータントを用いたために選択
が不可能な場合は、遺伝学的形質転換の後に細胞をオー
キシン−およびサイトキニン−含有培地（例えば２ ｍ
ｇＩＱのＮＡＡ（α−ナフタレン酢酸）および０．３ａ
＋ｇ／（！のカイネチンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅおよ
びＳ ｋｏｏｇ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳ ｋ
ｏｏｇ、 Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ １５（
１９６２）、４７３ ４９７））で培養し、形質転換コ
ロニーをそのオバイン（ｏｐ １ｎｅ）含有量で同定す
ることができる。この様にして、アグロピン（ａｇｒｏ
ｐｉｎｅ）およびマノピン（ｍａｎｎ。
５０またはｐＧ Ｖ ２２１７ （Ｌｅｅｍａｎｓら、
ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、１４７−１５２）の様な
非毒性のＴ−ＤＮＡ ミュータントを用いたために選択
が不可能な場合は、遺伝学的形質転換の後に細胞をオー
キシン−およびサイトキニン−含有培地（例えば２ ｍ
ｇＩＱのＮＡＡ（α−ナフタレン酢酸）および０．３ａ
＋ｇ／（！のカイネチンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅおよ
びＳ ｋｏｏｇ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳ ｋ
ｏｏｇ、 Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ １５（
１９６２）、４７３ ４９７））で培養し、形質転換コ
ロニーをそのオバイン（ｏｐ １ｎｅ）含有量で同定す
ることができる。この様にして、アグロピン（ａｇｒｏ
ｐｉｎｅ）およびマノピン（ｍａｎｎ。
ｐｉｎｅ）合成の電気泳動分析（方法についてはＬ ｅ
ｅｒａａｎｓら、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、
Ｇｅｎｅｔ、 ｌ（１９８１）。
ｅｒａａｎｓら、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、
Ｇｅｎｅｔ、 ｌ（１９８１）。
１４９−１６４参照）の後、約６６０コロニーが、ｐＧ
Ｖ２２１７で感染後に得られ、ＴＲ−暗号化オバイン・
マノピン（Ｎ”−（１−マニチル）−グルタミン）を合
成する Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｓ
Ｒ１セルラインであることがわがった。このセルライン
のカルス切片を再生培地（唯一の植物成長調節剤として
ＢＡＰ（５−ベンジルアミノプリン）（１＠ｇ／（りを
含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ培地）
上で培養すると、数多くの新芽が形成した。分析した２
０の新芽の全てが、依然としてマノピンを合成すること
ができた。ホルモンを含まないＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎ
ｄ、 Ｓ ｋｏｏｇ培地に移した後、これらの新芽は、
依然として７ノピンを含有し、形態学的に正常なタバコ
植物に成長した。
Ｖ２２１７で感染後に得られ、ＴＲ−暗号化オバイン・
マノピン（Ｎ”−（１−マニチル）−グルタミン）を合
成する Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｓ
Ｒ１セルラインであることがわがった。このセルライン
のカルス切片を再生培地（唯一の植物成長調節剤として
ＢＡＰ（５−ベンジルアミノプリン）（１＠ｇ／（りを
含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ培地）
上で培養すると、数多くの新芽が形成した。分析した２
０の新芽の全てが、依然としてマノピンを合成すること
ができた。ホルモンを含まないＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎ
ｄ、 Ｓ ｋｏｏｇ培地に移した後、これらの新芽は、
依然として７ノピンを含有し、形態学的に正常なタバコ
植物に成長した。
Ｎ、 ｔａｂａｃｕｍについて次に記載するプロトプラ
ストの分離および形質転換法は、Ｎ、 ｐｌｕｍｂａｇ
ｉｎｉｒｏｌｉａにも用いることができる。
ストの分離および形質転換法は、Ｎ、 ｐｌｕｍｂａｇ
ｉｎｉｒｏｌｉａにも用いることができる。
２、実験手法
２．１．新芽培養条件
培養室内の無菌条件下（１日１６時間、１５００ルツク
スの白色蛍光（ＡＣＥＣＬＦ ５８Ｗ／２４３００°Ｋ
Ｅ ｃｏｎｏｍｙ”）、２４°Ｃ１相対湿度７０％）
、２５０ｍｆ２のガラスびんに入れたホルモン不含のＭ
ｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒ
ａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、
Ｐｌａｎｔ １５（１９６２）４７３−４９７）上
でＮ１ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの新芽培養を
維持する。５週令の新芽培養をプロトプラストの分離に
使用する。
スの白色蛍光（ＡＣＥＣＬＦ ５８Ｗ／２４３００°Ｋ
Ｅ ｃｏｎｏｍｙ”）、２４°Ｃ１相対湿度７０％）
、２５０ｍｆ２のガラスびんに入れたホルモン不含のＭ
ｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒ
ａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、
Ｐｌａｎｔ １５（１９６２）４７３−４９７）上
でＮ１ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの新芽培養を
維持する。５週令の新芽培養をプロトプラストの分離に
使用する。
２．２．プロトプラストの分離
プロトプラストの分離および培養における全ての工程は
無菌操作で行なう。混合酵素法によりプロトプラストを
分離する。長さ２ｃｍ以下の非常に若い葉を除く、全て
の葉をプロトプラストの分離に使用することができる。
無菌操作で行なう。混合酵素法によりプロトプラストを
分離する。長さ２ｃｍ以下の非常に若い葉を除く、全て
の葉をプロトプラストの分離に使用することができる。
鋭利な外科用のメスで、葉を幅約２−３ｍｍの細長い小
片に切断する。この葉材料２〜３ｇを、酵素混合物５０
ｍ１２中、暗所で、２４°Ｃにて１８時間静置培養する
。この酵素混合物は、ホルモン不含のに３培地中、０．
５％セルラーゼ０ｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０および０．２
％マセロザイムＯｎｏｚｕｋａＲ−Ｉ Ｑからなってい
る（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐ ｆ
ｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、 ７８ （１９７６）
、４５３−４５５）。この混合物は、０．２２μｍ細孔
膜を通して濾過減菌し、顕著な活性の低下をきたすこと
なく、−２０℃で少くとも６力月間貯蔵することができ
る。
片に切断する。この葉材料２〜３ｇを、酵素混合物５０
ｍ１２中、暗所で、２４°Ｃにて１８時間静置培養する
。この酵素混合物は、ホルモン不含のに３培地中、０．
５％セルラーゼ０ｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０および０．２
％マセロザイムＯｎｏｚｕｋａＲ−Ｉ Ｑからなってい
る（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐ ｆ
ｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、 ７８ （１９７６）
、４５３−４５５）。この混合物は、０．２２μｍ細孔
膜を通して濾過減菌し、顕著な活性の低下をきたすこと
なく、−２０℃で少くとも６力月間貯蔵することができ
る。
２．３．プロトプラスト培養
１８時間培養した後、プロトプラストを放出するために
混合物を穏やかに撹拌する。次いでこの混合物を５０μ
ｍのふるいを通して濾過し、濾液を１０ｍＱの遠心管に
移す。振動バケツローターに入れて６０〜８０ｇで６分
間遠心分離すると、プロトプラストが暗緑色の浮遊バン
ド（帯）を形成する。プロトプラストの下層の液および
ペレット状の残骸を、螺動ポンプに連結した毛細管を使
って取り除く。プロトプラストを１つの遠心管に集め、
培養培地で２回洗浄する。この培養培地は、ＮＡＡ（０
，１ｍｇ／Ｑ ）およびカイネチン（０，２ｍｇ／１２
）を成長調節剤として含有するに３培地である（Ｎａｇ
ｙおよびＭａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎ
ｐｈｙｓｉｏｌ。
混合物を穏やかに撹拌する。次いでこの混合物を５０μ
ｍのふるいを通して濾過し、濾液を１０ｍＱの遠心管に
移す。振動バケツローターに入れて６０〜８０ｇで６分
間遠心分離すると、プロトプラストが暗緑色の浮遊バン
ド（帯）を形成する。プロトプラストの下層の液および
ペレット状の残骸を、螺動ポンプに連結した毛細管を使
って取り除く。プロトプラストを１つの遠心管に集め、
培養培地で２回洗浄する。この培養培地は、ＮＡＡ（０
，１ｍｇ／Ｑ ）およびカイネチン（０，２ｍｇ／１２
）を成長調節剤として含有するに３培地である（Ｎａｇ
ｙおよびＭａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎ
ｐｈｙｓｉｏｌ。
７８ （１９７６）、４５３−４５５）。この培地は
ｐＨ５，６に調節し、０．２２μｍの濾過膜を通して減
菌する。２回目の洗浄の後、Ｔ ｈｏｍａ血球計算器（
Ａｓ５ｉｓｔａｎｔ”、西ドイツから入手）を用いてプ
ロトプラストを計測し、最終密度１０５プロトプラスト
／１ａ（ｌとなる様に培養培地に懸濁する。直径９ｃｍ
の組織培養用良質ベトリ皿当たり１０ｍ１２の容量でプ
ロトプラストを培養する。このベトリ皿をＰａｒａｆ
ｉｔｓ”でシールし、２４℃で、暗所次いでかすかな光
（５００〜ｔｏｏｏルツクス）を当てて２４時間培養す
る。
ｐＨ５，６に調節し、０．２２μｍの濾過膜を通して減
菌する。２回目の洗浄の後、Ｔ ｈｏｍａ血球計算器（
Ａｓ５ｉｓｔａｎｔ”、西ドイツから入手）を用いてプ
ロトプラストを計測し、最終密度１０５プロトプラスト
／１ａ（ｌとなる様に培養培地に懸濁する。直径９ｃｍ
の組織培養用良質ベトリ皿当たり１０ｍ１２の容量でプ
ロトプラストを培養する。このベトリ皿をＰａｒａｆ
ｉｔｓ”でシールし、２４℃で、暗所次いでかすかな光
（５００〜ｔｏｏｏルツクス）を当てて２４時間培養す
る。
２．４．共生培養による形質転換
分離５日後にプロトプラスト培養株を感染させる。Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｌｌを液体ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅ
ｒ。
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｌｌを液体ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅ
ｒ。
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）＋ Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ＋Ｎ ｅｗ Ｙ ｏｒｋ）中で１８時間培養後、２
Ｘ１０”細胞／ｒｎＱの密度となる様にに３培養培地に
再懸濁する。この懸濁液５０μａを植物プロトプラスト
培養株に加え、Ｐａｒａｆｉｌｎ＋Ｒでシールした後、
この培養株を２．３゜と同じ条件下で培養する。４８時
間後に培養株をＩＯｍ＆の遠心管に移し、振動バケツロ
ーターに入れ、６０〜８０ｇで６分間遠心分離する。浮
遊バンドおよびベレットを集め、抗生物質（カルベニシ
リン１０００μｇ／ｒｎ（ｌまたはセフォタキシム５０
０μｇ／ｍＱ ）を補足したに３培地（Ｎａｇｙおよび
Ｍａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐｒ１ａｎｚｅｎ ｐｈｙ
ｓｉｏｌ。
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）＋ Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ＋Ｎ ｅｗ Ｙ ｏｒｋ）中で１８時間培養後、２
Ｘ１０”細胞／ｒｎＱの密度となる様にに３培養培地に
再懸濁する。この懸濁液５０μａを植物プロトプラスト
培養株に加え、Ｐａｒａｆｉｌｎ＋Ｒでシールした後、
この培養株を２．３゜と同じ条件下で培養する。４８時
間後に培養株をＩＯｍ＆の遠心管に移し、振動バケツロ
ーターに入れ、６０〜８０ｇで６分間遠心分離する。浮
遊バンドおよびベレットを集め、抗生物質（カルベニシ
リン１０００μｇ／ｒｎ（ｌまたはセフォタキシム５０
０μｇ／ｍＱ ）を補足したに３培地（Ｎａｇｙおよび
Ｍａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐｒ１ａｎｚｅｎ ｐｈｙ
ｓｉｏｌ。
７８（１９７６）、４５３−４５５）ｌｏｍ（に再懸濁
する。
する。
培養２週間後、プロトプラスト−由来マイクロカルスを
遠心分離し、前記と同濃度の成長調節剤および抗生物質
を含むがシュクロースに関しては０．４Ｍの代りに０．
３Ｍ含むに３培地（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、
Ｚ、 ＰＮａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、 ７８（１
９７６）、４５３−４５５）に再懸濁する。この培地の
細胞密度は約２５ＸＩＯ３マイクロカルス／ｍＱに調節
する。同じ条件下で更に２週間培養した後、カルスを、
前記と同濃度の抗生物質を含むが、より低濃度のシュク
ロース（０，２Ｍ）と成長調節剤（ＮＡＡＯ，Ｏ１ｍｇ
／Ｉ２ 、カイネチン０．０２ｍｇ／ρ）を含むに３培
地に移す。更に２〜３週間培養後、形質転換体と推定さ
れるものは、その淡緑色の密な外観、およびより良好な
成長度から認識することができる。これらのコロニーを
、より低濃度の抗生物質（カルベニシリン５００μｇ／
ｍ１２またはセフォタキシム２５０μｇ／ｍＱ ）を含
むがホルモン不含の０．６％寒天固形培地（Ｌ ｉｎｓ
ｍａｉｅｒおよびＳ ｋｏｏｇ＋Ｐｈｙｓｉｏ１．
Ｐｌａｎｔ、 １８（１９６５）、 １００−１２
７）に移す。形質転換体と推定されるものが直径約３−
４ ｍａ＋に達した時、ホルモン不含の培地で生育して
いるそれらにオパイン試験を施すことができる。各コロ
ニーの半分を、オクトビンおよびツバリン（Ａ ｅｒｔ
ｓら、 Ｐ Ｉａｎｔ Ｓ ｃｉ、 Ｌｅｔｔ。
遠心分離し、前記と同濃度の成長調節剤および抗生物質
を含むがシュクロースに関しては０．４Ｍの代りに０．
３Ｍ含むに３培地（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、
Ｚ、 ＰＮａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、 ７８（１
９７６）、４５３−４５５）に再懸濁する。この培地の
細胞密度は約２５ＸＩＯ３マイクロカルス／ｍＱに調節
する。同じ条件下で更に２週間培養した後、カルスを、
前記と同濃度の抗生物質を含むが、より低濃度のシュク
ロース（０，２Ｍ）と成長調節剤（ＮＡＡＯ，Ｏ１ｍｇ
／Ｉ２ 、カイネチン０．０２ｍｇ／ρ）を含むに３培
地に移す。更に２〜３週間培養後、形質転換体と推定さ
れるものは、その淡緑色の密な外観、およびより良好な
成長度から認識することができる。これらのコロニーを
、より低濃度の抗生物質（カルベニシリン５００μｇ／
ｍ１２またはセフォタキシム２５０μｇ／ｍＱ ）を含
むがホルモン不含の０．６％寒天固形培地（Ｌ ｉｎｓ
ｍａｉｅｒおよびＳ ｋｏｏｇ＋Ｐｈｙｓｉｏ１．
Ｐｌａｎｔ、 １８（１９６５）、 １００−１２
７）に移す。形質転換体と推定されるものが直径約３−
４ ｍａ＋に達した時、ホルモン不含の培地で生育して
いるそれらにオパイン試験を施すことができる。各コロ
ニーの半分を、オクトビンおよびツバリン（Ａ ｅｒｔ
ｓら、 Ｐ Ｉａｎｔ Ｓ ｃｉ、 Ｌｅｔｔ。
１７（１９７９）、４３−５０）またはアグロピンおよ
びマノピン（Ｌ ｅｅｍａｎｓら、 ＪｏＭｏｌ、
Ａｐｐｌ。
びマノピン（Ｌ ｅｅｍａｎｓら、 ＪｏＭｏｌ、
Ａｐｐｌ。
Ｇｅｎｅｔ、１（１９８１）、１４９−１６４）の検出
に使用する。この試験により、ホルモン不含の培地で選
択されたコロニーの形質転換された性質を確認すること
ができる。その後、選択されたコロニーを抗生物質不含
の培地で培養することができる。
に使用する。この試験により、ホルモン不含の培地で選
択されたコロニーの形質転換された性質を確認すること
ができる。その後、選択されたコロニーを抗生物質不含
の培地で培養することができる。
２．５．ホルモン不含培地上の選択なしの共生培養
形質転換細胞の為の選択ができない（例えば無毒性Ｔ−
ＤＮＡ ミ、−タントを使ったため）場合、またはそれ
が必要でない場合（抗生物質耐性遺伝子の様な優勢な選
択し得るマーカーがＴ−ＤＮＡに存在している為）、プ
ロトプラスト−由来細胞の処理を簡略化することができ
る（ホルモン減少工程はもはや必要でない）。感染段階
まで、プロトプラストを既述した様に処理する。細菌を
加えて４８時間後にプロトプラスト−由来細胞を遠心分
離しく６分、６０６０−８Ｏ、非常に低密度で細胞の成
長を維持することができるＡＧ培地（Ｃａｂ。
ＤＮＡ ミ、−タントを使ったため）場合、またはそれ
が必要でない場合（抗生物質耐性遺伝子の様な優勢な選
択し得るマーカーがＴ−ＤＮＡに存在している為）、プ
ロトプラスト−由来細胞の処理を簡略化することができ
る（ホルモン減少工程はもはや必要でない）。感染段階
まで、プロトプラストを既述した様に処理する。細菌を
加えて４８時間後にプロトプラスト−由来細胞を遠心分
離しく６分、６０６０−８Ｏ、非常に低密度で細胞の成
長を維持することができるＡＧ培地（Ｃａｂ。
ｃｈｅ、Ｐｌａｎｔａ １４９（１９８０）、７−１８
）に再懸濁する。Ｆ ｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ計
数チェインバ（“Ａｓ５ｉｓｔａｎｔ″、西ドイツより
入手）を使って計測し、以下の操作に必要な密度になる
様に再懸濁する。オバイン試験のためにコロニーを個々
に操作しなければならない場合は、低細胞密度（１−当
たり１００プロトプラスト−由来細胞および細胞コロニ
ー）で植えつけると、１力月の培養で大きい細胞コロニ
ーが得られる。形質転換細胞を薬物で選択できる場合は
、細胞を高密度（１０’−１０’／ｍ１２）で培養し、
各タイプの選択に最適な時期及び濃度で、その使用する
選択剤を培地に添加する。
）に再懸濁する。Ｆ ｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ計
数チェインバ（“Ａｓ５ｉｓｔａｎｔ″、西ドイツより
入手）を使って計測し、以下の操作に必要な密度になる
様に再懸濁する。オバイン試験のためにコロニーを個々
に操作しなければならない場合は、低細胞密度（１−当
たり１００プロトプラスト−由来細胞および細胞コロニ
ー）で植えつけると、１力月の培養で大きい細胞コロニ
ーが得られる。形質転換細胞を薬物で選択できる場合は
、細胞を高密度（１０’−１０’／ｍ１２）で培養し、
各タイプの選択に最適な時期及び濃度で、その使用する
選択剤を培地に添加する。
２．６．カルス組織から全植物の再生
カルス組織から正常植物を容易に得ることができる（例
えばプロトプラスト形質転換から、または全植物接種か
ら（２，７参照）得られる）。カルス組織を、１ ｒａ
ｇ／ｍＱのＢＡＰを含んでいるＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎ
ｄ Ｓｋｏｏｇ培地で増殖させる：この培地は１〜２力
月後に新芽を形成させる。この新芽をホルモン不含の培
地に移し、根を形成させ、完全な植物をつくらせること
ができる。
えばプロトプラスト形質転換から、または全植物接種か
ら（２，７参照）得られる）。カルス組織を、１ ｒａ
ｇ／ｍＱのＢＡＰを含んでいるＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎ
ｄ Ｓｋｏｏｇ培地で増殖させる：この培地は１〜２力
月後に新芽を形成させる。この新芽をホルモン不含の培
地に移し、根を形成させ、完全な植物をつくらせること
ができる。
２．７．タバコ苗木への腫瘍の誘導
タバコの種子（例えば裁培品種Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３
８）の表面を７０％変性エタノール／Ｈ，○で２分間、
次いで１０％の市販の標白剤と０．１％ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）で処理して滅菌し、更に滅菌水で５
回洗浄する。この滅菌した種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ（０，７％寒天）培地の塩
類を含む大型試験管（幅２５ｍｍ、ポリカーボネト製の
キップ付）にまく。次いでこの試験管を培養室（１２，
０００ルツクス、■６時間照射／８時間非照射、７０％
相対湿度、２４°Ｃ）に入れて培養する。４〜６週間経
つと植物は使用できる状態になる。少なくともその後１
カ月間は最適の状態を維持する。苗木は少なくとも高さ
３ｃｍになり、４枚またはそれ以上の葉を持つはずであ
る。新しい外科用メスで植物の最も若い部間を通して横
に頭部を切断する。植物の上の部分を試験管から取り除
き、火にかけたスパーチルで平板寒天培養から細菌を損
傷表面に塗抹する。野生型の場合は２週間後に、ある種
の変性ミュータント株の場合はもっと後に腫瘍が現れる
。この方法は、タバコ（Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔａ
ｂａｃｕｍ）、Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｓｂａ
ｇｉｎｉｒｏｌｉａおよびびＰ ｅｔｕｎｉａ ｈｙ
ｂｒｉｄａを接種するのに使われる。
８）の表面を７０％変性エタノール／Ｈ，○で２分間、
次いで１０％の市販の標白剤と０．１％ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）で処理して滅菌し、更に滅菌水で５
回洗浄する。この滅菌した種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ（０，７％寒天）培地の塩
類を含む大型試験管（幅２５ｍｍ、ポリカーボネト製の
キップ付）にまく。次いでこの試験管を培養室（１２，
０００ルツクス、■６時間照射／８時間非照射、７０％
相対湿度、２４°Ｃ）に入れて培養する。４〜６週間経
つと植物は使用できる状態になる。少なくともその後１
カ月間は最適の状態を維持する。苗木は少なくとも高さ
３ｃｍになり、４枚またはそれ以上の葉を持つはずであ
る。新しい外科用メスで植物の最も若い部間を通して横
に頭部を切断する。植物の上の部分を試験管から取り除
き、火にかけたスパーチルで平板寒天培養から細菌を損
傷表面に塗抹する。野生型の場合は２週間後に、ある種
の変性ミュータント株の場合はもっと後に腫瘍が現れる
。この方法は、タバコ（Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔａ
ｂａｃｕｍ）、Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｓｂａ
ｇｉｎｉｒｏｌｉａおよびびＰ ｅｔｕｎｉａ ｈｙ
ｂｒｉｄａを接種するのに使われる。
以上述べた如く、本発明は、野生型ＴｉプラスミドのＴ
−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブリッドＴｉプラ
スミドを保持しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで
、初めて植物を形質転換することを可能ならしめたもの
である。Ｔｉプラスミドから植物細胞へのＤＮＡの転移
に及ぼすＴ〜領領域腫瘍機能の影響は知られていないの
で、それでも所望の遺伝子を含んでいる改良Ｔ−領領域
植物細胞への転移が起ることは驚くべきことである。こ
の転移ＤＮＡは植物細胞ゲノムに相互組込みされ、安定
に保持される。更に、選択した所望の遺伝子は、その遺
伝子が適当なプロモーター配列を含んでいるか、あるい
は含む様に組み立てられると発現することができる。所
望の遺伝子を含んでいる中間クローニングベクターと、
特別に設計されたアクセプターＴｉプラスミドとの間で
単一乗換えを行わせるという本発明の概念（アイディア
）は、植物細胞の形質転換の為のハイブリッドＴｉプラ
スミドベクターの組み立てを著しく簡単なものにするも
のである。この特別に設計されたアクセプターＴｉプラ
スミドは、所望の遺伝子（これは中間クローニングベク
ターの一部と同じであるかまたはこれに関連しているク
ローニング媒体中に挿入されている）が単一乗換えによ
って相互組込み体を形成することができる様に、通常の
クローニング媒体のＤＮＡセグメントを含んでいる。こ
のクローニング媒体の２つのセグメントが、組換えの為
に必要な相同領域を提供する。
−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブリッドＴｉプラ
スミドを保持しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで
、初めて植物を形質転換することを可能ならしめたもの
である。Ｔｉプラスミドから植物細胞へのＤＮＡの転移
に及ぼすＴ〜領領域腫瘍機能の影響は知られていないの
で、それでも所望の遺伝子を含んでいる改良Ｔ−領領域
植物細胞への転移が起ることは驚くべきことである。こ
の転移ＤＮＡは植物細胞ゲノムに相互組込みされ、安定
に保持される。更に、選択した所望の遺伝子は、その遺
伝子が適当なプロモーター配列を含んでいるか、あるい
は含む様に組み立てられると発現することができる。所
望の遺伝子を含んでいる中間クローニングベクターと、
特別に設計されたアクセプターＴｉプラスミドとの間で
単一乗換えを行わせるという本発明の概念（アイディア
）は、植物細胞の形質転換の為のハイブリッドＴｉプラ
スミドベクターの組み立てを著しく簡単なものにするも
のである。この特別に設計されたアクセプターＴｉプラ
スミドは、所望の遺伝子（これは中間クローニングベク
ターの一部と同じであるかまたはこれに関連しているク
ローニング媒体中に挿入されている）が単一乗換えによ
って相互組込み体を形成することができる様に、通常の
クローニング媒体のＤＮＡセグメントを含んでいる。こ
のクローニング媒体の２つのセグメントが、組換えの為
に必要な相同領域を提供する。
本発明方法によって調製された微生物、中間クローニン
グベクター、アクセプターＴｉプラスミド、およびハイ
ブリッドプラスミドベクターは、１９８３年１２月２１
日、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｄ Ｓ Ｍ）（Ｇｏｅｔ
ｔｉｎｇｅｎ）に寄託され、確認された以下の培養株で
例示される：（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｋ１２ＨＢ１０１中の中間ベクタープラスミドｐＡ
ｃｇＢ。
グベクター、アクセプターＴｉプラスミド、およびハイ
ブリッドプラスミドベクターは、１９８３年１２月２１
日、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｄ Ｓ Ｍ）（Ｇｏｅｔ
ｔｉｎｇｅｎ）に寄託され、確認された以下の培養株で
例示される：（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｋ１２ＨＢ１０１中の中間ベクタープラスミドｐＡ
ｃｇＢ。
（２）カルベニシリン耐性アクセプターＴｉプラスミド
ｐＧＶ３８５０を保有しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕＩＩｌｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８ＣＩ
リファンピシン耐性株、 （３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ １
２株に５１４（ｔｈｒ ｌｅｕ ｔｈｉ ｌａｃ
ｈｓｄＲ）中の中間ベクタープラスミ ドｐＧＶ７
００゜ （４） Ｅ ５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ
ｌ ２株に５１４（（３）と同じ）中の中間ベクター
プラスミドｐｃｖ７５０、 （５）カルベニシリン耐性アクセプターＴｉプラスミド
ｐＧＶ２２６０を保有じているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｇ＋ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８ＣＩ
リファンピシン耐性株、 （６）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ ｌ
２ ＨＢ １０１中の、ツバリンプロモーター支配
下のオクトピンシンターゼ暗号領域を保有している中間
ベクタープラスミドｐＮｏ−１゜ （７）中間ベクターのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ
の授動に使用された株−授動ブラスミドｐＧＪ２８およ
びＲ６４ｄｒｄｌ １ｆｖａｎ Ｈａｕｔｅら、ＥＭ
ＢＯＪ。
ｐＧＶ３８５０を保有しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕＩＩｌｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８ＣＩ
リファンピシン耐性株、 （３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ １
２株に５１４（ｔｈｒ ｌｅｕ ｔｈｉ ｌａｃ
ｈｓｄＲ）中の中間ベクタープラスミ ドｐＧＶ７
００゜ （４） Ｅ ５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ
ｌ ２株に５１４（（３）と同じ）中の中間ベクター
プラスミドｐｃｖ７５０、 （５）カルベニシリン耐性アクセプターＴｉプラスミド
ｐＧＶ２２６０を保有じているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｇ＋ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８ＣＩ
リファンピシン耐性株、 （６）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ ｌ
２ ＨＢ １０１中の、ツバリンプロモーター支配
下のオクトピンシンターゼ暗号領域を保有している中間
ベクタープラスミドｐＮｏ−１゜ （７）中間ベクターのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ
の授動に使用された株−授動ブラスミドｐＧＪ２８およ
びＲ６４ｄｒｄｌ １ｆｖａｎ Ｈａｕｔｅら、ＥＭ
ＢＯＪ。
２（１９８３）、４１１−４１８）を保有しているＧＪ
２３； ＧＪ２３はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｋ ］２、ＪＣ２９２６，ＡＢ１１５７のｒｅｃ
Ａ誘導体である（Ｈｏｗａｒｄ −Ｆ Ｉａｎｄｅｒｓ
ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４９（１９６４）、２３７−
２４６）。
２３； ＧＪ２３はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ Ｋ ］２、ＪＣ２９２６，ＡＢ１１５７のｒｅｃ
Ａ誘導体である（Ｈｏｗａｒｄ −Ｆ Ｉａｎｄｅｒｓ
ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４９（１９６４）、２３７−
２４６）。
これらの培養株の受理番号は、それぞれ２７９２（１）
、２７９８（２）、２７９６（３）、２７９７（４）、
２７９９（５）、２８３３（６）、および２７９３（７
）である。
、２７９８（２）、２７９６（３）、２７９７（４）、
２７９９（５）、２８３３（６）、および２７９３（７
）である。
本発明の態様を色々と記述したが、その基本的な構成を
変化させれば本発明に係る方法および組成物を利用する
その他の態様が得られることは言うまでもない。
変化させれば本発明に係る方法および組成物を利用する
その他の態様が得られることは言うまでもない。
第１図はアクセプターＴｉプラスミドの模式図、第２図
および第３図はアクセプターＴｉプラスミドに挿入され
る中間クローニングベクターの模式図、 第４図はハイブリッドＴｉプラスミドベクタの調製法を
示す模式図、 第５図は中間クローニングベクターの遺伝子転移過程の
概略を示す模式図、 第６図はＡタイプのアクセプターＴｉプラスミドの組み
立てを示す模式図、 第７図は中間クローニングベクターの組み立てを示す模
式図、 第８図はＢタイプのアクセプターＴｉプラスミドの組み
立てを示す模式図、 第９図はＢタイプのアクセプターＴｉプラスミドに挿入
される中間クローニングベクターの模式図、 第１Ｏ図はハイブリッドＴｉプラスミドベクタの組み立
てを示す模式図、 第１１図は５．２ｋｂ Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントＡ
ｃｇＢのｐＢＲ３２２への挿入を示す模式図、第１２図
はツバリンＴｉプラスミドｐＧＶ３８３９のＴ−領域を
示す模式図、 第１３図はアクセプターＴｉプラスミドｐｃｖ３８５０
の組み立てを示す模式図、 第１４図は中間クローニングベク９−ｐＧＶ７００の組
み立てを示す模式図、 第１５図は中間クローニングベクターｐＧＶ７５０の構
造を示す模式図、 第１６図は中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立てを示す
模式図、 第１７図はアクセプタープラスミドＰＧＶ２２６０の組
み立てを示す模式図、 第１８図はプラスミドｐＬＧＶ２３８１の組み立てを示
す模式図、 第１９図はプラスミドｐＡＧＶＩＱの組み立て、および
その、プラスミドｐＬＧＶ２３８１への挿入を示す模式
図、そして 第２０図はオクトビンシンターゼ遺伝子暗合化領域と融
合する前後の７パリンシンターゼ遺伝子のプロモーター
領域の周囲のヌクレオチド配列を示す模式図である。
および第３図はアクセプターＴｉプラスミドに挿入され
る中間クローニングベクターの模式図、 第４図はハイブリッドＴｉプラスミドベクタの調製法を
示す模式図、 第５図は中間クローニングベクターの遺伝子転移過程の
概略を示す模式図、 第６図はＡタイプのアクセプターＴｉプラスミドの組み
立てを示す模式図、 第７図は中間クローニングベクターの組み立てを示す模
式図、 第８図はＢタイプのアクセプターＴｉプラスミドの組み
立てを示す模式図、 第９図はＢタイプのアクセプターＴｉプラスミドに挿入
される中間クローニングベクターの模式図、 第１Ｏ図はハイブリッドＴｉプラスミドベクタの組み立
てを示す模式図、 第１１図は５．２ｋｂ Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントＡ
ｃｇＢのｐＢＲ３２２への挿入を示す模式図、第１２図
はツバリンＴｉプラスミドｐＧＶ３８３９のＴ−領域を
示す模式図、 第１３図はアクセプターＴｉプラスミドｐｃｖ３８５０
の組み立てを示す模式図、 第１４図は中間クローニングベク９−ｐＧＶ７００の組
み立てを示す模式図、 第１５図は中間クローニングベクターｐＧＶ７５０の構
造を示す模式図、 第１６図は中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立てを示す
模式図、 第１７図はアクセプタープラスミドＰＧＶ２２６０の組
み立てを示す模式図、 第１８図はプラスミドｐＬＧＶ２３８１の組み立てを示
す模式図、 第１９図はプラスミドｐＡＧＶＩＱの組み立て、および
その、プラスミドｐＬＧＶ２３８１への挿入を示す模式
図、そして 第２０図はオクトビンシンターゼ遺伝子暗合化領域と融
合する前後の７パリンシンターゼ遺伝子のプロモーター
領域の周囲のヌクレオチド配列を示す模式図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（Ａ）植物において腫瘍を誘起せず、野生型Ｔｉプ
ラスミド内部Ｔ−ＤＮＡ配列および境界配列を含まず、
そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにより野生型Ｔｉプ
ラスミドのＴ−領域を植物細胞ゲノム中に転移させるの
に必須であるＤＮＡ配列を含むが野生型Ｔｉプラスミド
のＴ−領域およびＴ−領域の境界配列（１）および（２
）を含まない野生型ＴｉプラスミドのＤＮＡセグメント
（４）を含有するプラスミドベクターＡ；および （Ｂ）遺伝子の植物ゲノムへの組込みを可能にする野生
型ＴｉプラスミドのＴ−領域の少なくとも右側境界配列
（２）、および少なくとも１つの所望の遺伝子であって
、植物中で遺伝子を発現させることが可能なプロモータ
ーの支配下にあり、該野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域
の右側境界配列の上流に設置された所望の遺伝子（５）
、を含有するプラスミドベクターＢ； を保持しているＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ。 ２、該プラスミドベクターＢが、遺伝子の植物ゲノムへ
の組込みを可能にする野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域
の右側および左側境界配列を含有している特許請求の範
囲第１項に記載のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ。 ３、該プラスミドベクターＢが該所望の遺伝子（５）に
隣接して少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を
更に含有している特許請求の範囲第１項または第２項に
記載のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ。 ４、該所望の遺伝子（５）がその天然のプロモーターの
支配下にある特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか
に記載のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ。 ５、該所望の遺伝子（５）が該所望の遺伝子に対して外
来性であるプロモーターの支配下にある特許請求の範囲
第１項〜第３項のいずれかに記載のＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP83100255 | 1983-01-13 | ||
| EP83100255.5 | 1983-01-13 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62129585A Division JP2769539B2 (ja) | 1983-01-13 | 1987-05-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03108478A true JPH03108478A (ja) | 1991-05-08 |
Family
ID=8190232
Family Applications (6)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59005512A Granted JPS59140885A (ja) | 1983-01-13 | 1984-01-13 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP62129585A Expired - Lifetime JP2769539B2 (ja) | 1983-01-13 | 1987-05-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP63103749A Expired - Fee Related JP2726267B2 (ja) | 1983-01-13 | 1988-04-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP2236922A Pending JPH03108478A (ja) | 1983-01-13 | 1990-09-05 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP4261509A Pending JPH06105629A (ja) | 1983-01-13 | 1992-09-30 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP2000186437A Pending JP2001029092A (ja) | 1983-01-13 | 2000-06-21 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59005512A Granted JPS59140885A (ja) | 1983-01-13 | 1984-01-13 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP62129585A Expired - Lifetime JP2769539B2 (ja) | 1983-01-13 | 1987-05-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP63103749A Expired - Fee Related JP2726267B2 (ja) | 1983-01-13 | 1988-04-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4261509A Pending JPH06105629A (ja) | 1983-01-13 | 1992-09-30 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP2000186437A Pending JP2001029092A (ja) | 1983-01-13 | 2000-06-21 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
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|---|---|
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| CA (2) | CA1341524C (ja) |
| DE (3) | DE3382838T2 (ja) |
| DK (1) | DK173104B1 (ja) |
| IL (1) | IL70610A (ja) |
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| DE3382838T2 (de) * | 1983-01-13 | 2004-04-15 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Transgene dicotyledone Pflanzenzellen und Pflanzen |
| DE3484947D1 (de) * | 1983-01-17 | 1991-09-26 | Monsanto Co | Genetisch transformierte pflanzen. |
| JPH0714349B2 (ja) * | 1983-01-17 | 1995-02-22 | モンサント カンパニ− | 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子 |
| EP0131624B1 (en) * | 1983-01-17 | 1992-09-16 | Monsanto Company | Plasmids for transforming plant cells |
| NL8300699A (nl) * | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
| NZ207766A (en) * | 1983-04-15 | 1987-03-06 | Lubrizol Genetics Inc | Plant structural gene expression |
| NZ209338A (en) * | 1983-09-14 | 1988-02-12 | Lubrizol Genetics Inc | Plasmid for the transformation of a plant cell |
| US4658082A (en) * | 1984-07-25 | 1987-04-14 | Atlantic Richfield Company | Method for producing intact plants containing foreign DNA |
| BR8600161A (pt) * | 1985-01-18 | 1986-09-23 | Plant Genetic Systems Nv | Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio |
| US5180873A (en) * | 1985-04-16 | 1993-01-19 | Dna Plant Technology Corporation | Transformation of plants to introduce closely linked markers |
| EP0267159A3 (de) * | 1986-11-07 | 1990-05-02 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen |
| EP1085090B1 (en) | 1998-06-02 | 2011-12-14 | Nihon University | IgA NEPHROPATHY-ASSOCIATED DNA |
| JP4623825B2 (ja) | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
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| JP4627601B2 (ja) * | 2001-02-28 | 2011-02-09 | 株式会社パイロットコーポレーション | 筆記具用ペン芯およびそれを用いた筆記具 |
| SG135907A1 (en) | 2001-03-15 | 2007-10-29 | Sumitomo Chemical Co | Analysis of agonist-activity and antagonist-activity to cytokinin receptor |
| BRPI0213411B1 (pt) | 2001-10-19 | 2015-11-03 | Sumitomo Chemical Co | dna codificando uma proteína de metabolização de herbicida, seu uso, vetor e micro-organismo transgênico compreendendo o mesmo, métodos de produção de um transformante, da referida proteína, de obtenção e detecção do referido dna e de identificação de uma célula compreendendo o referido dna |
| CN100400660C (zh) | 2002-12-26 | 2008-07-09 | 协和发酵工业株式会社 | 生产二肽的方法 |
| US20090270314A1 (en) | 2005-09-29 | 2009-10-29 | Tohoku University | Polypeptide having anti-angiogenic activity |
| US20100080794A1 (en) | 2006-04-14 | 2010-04-01 | Takashi Tsuji | Mutant polypeptide having effector function |
| US7939294B2 (en) | 2006-09-25 | 2011-05-10 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | DNA encoding proteins having dipeptide-synthesizing activity and methods of using the same |
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| JP5767207B2 (ja) | 2010-03-26 | 2015-08-19 | 協和発酵キリン株式会社 | 新規修飾部位導入抗体および抗体フラグメント |
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| JP6328115B2 (ja) | 2013-07-09 | 2018-05-23 | 協和メデックス株式会社 | 糖化ヘキサペプチドオキシダーゼとその利用 |
| JP6448194B2 (ja) | 2014-01-20 | 2019-01-09 | 住友ゴム工業株式会社 | シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び、ＮｏｇｏＢｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、シス型プレニルトランスフェラーゼ及びＮｏｇｏＢｒｅｃｅｐｔｏｒを発現させた形質転換体、並びに該形質転換体を用いたポリイソプレノイドの製造方法 |
| JP6557990B2 (ja) | 2015-02-23 | 2019-08-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 |
| JP6719174B2 (ja) | 2015-02-23 | 2020-07-08 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 |
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| JP2021080204A (ja) | 2019-11-19 | 2021-05-27 | 住友ゴム工業株式会社 | 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| WO2021177074A1 (ja) | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 住友ゴム工業株式会社 | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP2023040705A (ja) | 2021-09-10 | 2023-03-23 | 住友ゴム工業株式会社 | トランス型ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換生物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP2023127868A (ja) | 2022-03-02 | 2023-09-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ｃｐｔ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP2023127869A (ja) | 2022-03-02 | 2023-09-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ｃｐｔ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP2023127870A (ja) | 2022-03-02 | 2023-09-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ｃｐｔ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS595512A (ja) * | 1982-06-30 | 1984-01-12 | 松下電工株式会社 | 接点材料 |
| JPS59140885A (ja) * | 1983-01-13 | 1984-08-13 | マツクス・プランク・ゲゼルシヤフト・ツア・フエルデルング・デア・ヴイツセンシヤフテン・エ−・フアウ | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JPS62129585A (ja) * | 1985-11-29 | 1987-06-11 | Kyocera Corp | ポンプ運転装置 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2007676B (en) * | 1977-11-08 | 1982-09-08 | Genentech Inc | Method and means for microbial polypeptide expression |
-
1983
- 1983-12-22 DE DE3382838T patent/DE3382838T2/de not_active Expired - Lifetime
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1984
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1987
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1988
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1990
- 1990-09-05 JP JP2236922A patent/JPH03108478A/ja active Pending
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1992
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2000
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS595512A (ja) * | 1982-06-30 | 1984-01-12 | 松下電工株式会社 | 接点材料 |
| JPS59140885A (ja) * | 1983-01-13 | 1984-08-13 | マツクス・プランク・ゲゼルシヤフト・ツア・フエルデルング・デア・ヴイツセンシヤフテン・エ−・フアウ | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JPS62129585A (ja) * | 1985-11-29 | 1987-06-11 | Kyocera Corp | ポンプ運転装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| DE3382839D1 (de) | 2004-12-23 |
| DE3381568D1 (de) | 1990-06-21 |
| JPS59140885A (ja) | 1984-08-13 |
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| AU2327484A (en) | 1984-07-19 |
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