DK174310B1 - Intermediær kloningsvektor, bakterie indeholdende denne, fremgangsmåde til transformering af en plantecelle, fremgangsmåde til fremstilling af en plante, transformeret plantecelle og plante af sådanne celler og frø af en sådan plante - Google Patents

Description

• ---—- J

DK 174310 B1 i i

Den foreliggende opfindelse angår en intermediær kloningsvektor, en bakterie indeholdende denne, en fremgangsmåde til transformering af en plantecelle, en fremgangsmåde til fremstilling af en sådan plante, en trans-5 formeret plantecelle og en plante af sådanne celler og frø af en sådan plante. Nærmere betegnet vedrører opfindelsen DNA-sekvenser, som skal kopieres i passende værtsplanteceller. Disse DNA-sekvenser koder for produkter, f.eks. aminosyrer eller polypeptider, som er nyttige til plantens vækst 10 eller til forbedring af dens kvalitet som næringsmiddel eller til dannelse af værdifulde metaboliter, f.eks. alkaloider eller steroid-precursere.

I beskrivelsen anvendes følgende udtryk: 15 bom-områdei DNA-område, hvor mob-funktioner specielt vekselvirker og initierer autonom DNA-overføring. Grænsesekvens: DNA-sekvens, som indeholder enderne af T- DNA'et.

20 Bred-vært-område replikon; Et DNA-molekule, som kan overføres og opretholdes i mange forskellige værtsceller.

Callus-væv; En masse af uorganiserede og udifferentierede celler.

25 Kloning; Tilvejebringelse af en population af organis mer eller DNA-sekvenser afledt af en sådan organisme eller sekvens ved ukønnet formering, eller bedre isoleringen af en særlig organisme eller del 30 deraf og formeringen af denne underfraktion som en homogen population.

Kloningsmiddel: Et plasmid, fag-DNA eller andre DNA-se kvenser, som kan kopieres i en værtscelle, karakteriseret ved et eller et mindre antal [ 35 endonucleasegenkendelsessteder, ved hvilke så danne DNA-sekvenser kan spaltes på bestemme-lig måde uden dermed følgende tab af en væsentlig biologisk funktion ved DNA'et, f.eks. kopiering, produktion af coat-proteiner eller tab 2 DK 174310 B1

af promotor- eller bindingssteder, og som indeholder en markør, som er egnet til an- I

vendelse ved identificeringen af transformerede celler, f.eks. tetracyclinresistens 5 eller ampiciilinresistens. Et kloningsmiddel kaldes ofte en vektor.

Kodningssekvens: DNA-sekvens, som bestemmer eller fast lægger aminosyresekvensen i et polypeptid.

Kointegrat: Den struktur, som fremkommer ved en enkelt 10 overkrydsning mellem to cirkulære DNA-moleky- ler.

Koplementering in trans: Fremgangsmåde hvor et DNA-mole- kyle (replikon), som ikke er fysisk bundet til et andet replikon, kan danne eller til-15 vejebringe et diffunderbart stof, som det andet ubundne replikon mangler og kræver.

Konjugation: Fremgangsmåde hvor DNA overføres fra bakte rier af en type til bakterier af en anden type under celle-celle-kontakt.

20 Overkrydsning: Udveksling af genetisk materiale mellem homologe DNA-sekvenser.

Sletningssubstitution: Fjernelse og ombytning af en DNA- sekvens med en anden DNA-sekvens.

Differentiering i Fremgangsmåde hvor afkom af en celle 25 opnår og opretholder specialisering med hen syn til struktur og funktion.

DNA-sekvens eller DNA-segment: En lineær række nucleoti- der, som er indbyrdes forbundet ved phospho-diesterbindinger mellem 3'- og 5'-carbonatomer-30 ne i nabostillede pentoseenheder.

Pobbelt-overkrydsning: Opløsning af en kointegrat struk tur i to cirkulære DNA-molekyler. Denne proces anvendes til udveksling af genetisk information. Det ene af de to cirkulære DNA-35 molekyler har to homologe områder med mål-DNA'et, hvorigennem rekombination kan forekomme. Disse to områder omgiver en ikke-homolog DNA-sekvens, som skal udskiftes med mål-DNA'et. Hvis denne anden overkrydsning foregår i samme DNA- 3 DK 174310 B1 område som den første, vil de oprindelige cirkulære DNA-molekyler dannes. Hvis denne 1 anden overkrydsning forekommer i det andet homologe område, vil der foregå genetisk ud-5 veksling mellem de to cirkelområder.

Kopiering: Kopiering eller expression er den proces, som et strukturgen undergår til dannelse af et polypeptid. Kopiering er en kombination af transkription og translation.

10 Kopieringskontrolsekvens: En nucleotidsekvens, som kon trollerer og regulerer kopieringen af strukturgener, når den er operativt bundet til disse gener.

F-type plasmid: Plasmid som bærer F (fertilitet) faktoren, 15 som tillader overføringen af en kopi af plas- midet til en vært, som ikke bærer F-faktoren.

Gen: En DNA-sekvens bestående af to dele, (1) kod ningssekvensen for genproduktet og (2) sekvenserne i promotorområdet, som kontrollerer 20 hvorvidt genet kopieres eller ej.

Genom: Hele DNA-indholdet i en celle eller et virus.

Genomet omfatter bl.a. strukturgenerne, som koder for polypeptidet eller polypeptiderne samt operator-, promotor- og ribosombindings-25 og vekselvirkningssekvenser, herunder sekven ser såsom Shine-Dalgarno-sekvenserne.

Genotype: Den totale mængde genetisk information inde holdt i en organisme.

Homolog rekombination: Rekombination mellem to DNA-områder, 30 som indeholder homologe sekvenser.

I-type-plasmid: En gruppe selvoverførbare plasmider af en uforenelighedsgruppe, som er forskellig fra F-type-plasmid.

Uforenelighed: To DNA-molekylers manglende evne til at 35 sameksistere i den samme celle i fraværelse af selektivt tryk.

Indsætning: Addition af en DNA-sekvens til DNA-sekvensen i et andet molekyle.

, DK 174310 B1 4

Ledersekvens: Området i et mRNA-molekyle, som strækker sig fra 5'-enden til begyndelsen af det første strukturgen. Det omfatter også steder, ’ som er vigtige for initiering af translation 5 af kodningssekvensen i strukturgenet.

Meiose: To på hinanden følgende delinger, som for mindsker begyndelsesantallet af kromosomer på 4 n til 1 n i hver af de fire produktceller. Denne proces er vigtig ved kønnet forme-10 ring.

mob (mobiliseringsfunktioner): Et sæt produkter, som kun i kombination med tra-funktioner fremmer DNA-overføring. Mob kan fremme overføring af plas-mider indeholdende et bom-sted.

15 Mobilisering; Proces hvor et DNA-molekyle, som ikke er i stand til at overføres til en anden celle, hjælpes til overføring ved hjælp af et andet DNA-molekyle.

Mobiliserinqshjælperplasmid: Et plasmid som kan tilveje- 20 bringe diffunderbare produkter, som et andet plasmid mangler for at kunne overføres til en anden værtscelle.

Nonkunjugativt rekombinantplasmid: Et DNA-molekyle, som ikke selv kan overføres fra værtscellen til 25 en anden værtscelle under celle-cellekontakt.

For at kunne overføres kræver det yderligere funktioner tilført af andet DNA, f.eks. af et eller flere hjælperplasmider.

Nucleotid: En monomer DNA-eller RNA-enhed, som består af 30 en sukkerdel (pentose), et phosphat og en nitrogenholdig heterocyclisk base. Basen er bundet til sukkerdelen over en glycosid-binding (1'-carbonatomet i pentosen), og denne kombination af base og sukker kaldes et 35 nucleosid. Basen karakteriserer nucleotidet.

De fire DNA-baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C") og thymin ("T"). De fire RNA-ba-ser er A, G, C og uracil ("U”).

5 DK 174310 B1

Phenotype: De observerbare karakteristika for et indi vid, som skyldes vekselvirkningen mellem genotypen og miljøet, hvori udviklingen foregår.

5 Plasmid: En ikke-kromosomal dobbeltstrenget·DNA-sekvens indeholdende et intakt "replikon", således at plasmidet kopieres i en værtscelle. Når plasmidet anbringes i en encellet organisme, ændres eller transformeres denne orga-10 nismes karakteristika som følge af plasmidets DNA. Eksempelvis transformerer et plasmid, som bærer genet for tetracyclinresistens p (Tc ) , en celle, som før var følsom overfor tetracyclin til en celle, som er resistent 15 overfor tetracyclin. En celle, som er trans formeret ved hjælp af et plasmid, kaldes en "transformant".

Polypeptid: En lineær række aminosyrer, som er indbyrdes forbundet ved peptidbindinger mellem a-amino-20 og carboxygrupperne i naboaminosyrer.

Promotorområde: DNA-sekvenser, som ligger ovenfor (up stream) begyndelsen af kodningssekvensen, som regulerer transkriptionen af genet.

Promotorsekvens: Sekvens, hvortil RNA-polymerase bindes 25 og fremmer den sande transkription af "med strøms "-sekvenser.

Rekombinant DNA-molekyle eller hybrid-DNA: En hybrid-DNA- sekvens indeholdende mindst to nucleotidsekven-ser, hvor den første sekvens sædvanligvis ikke 30 findes i naturen sammen med den anden sekveris.

Rekombination: Dannelse af en ny forbindelse mellem DNA- molekyler eller dele af DNA-molekyler.

Homologiområde: Et DNA-område, som deler den samme DNA- sekvens som den, der findes i et andet DNA-35 område.

Replikon: Et selvkopierende genetisk element, som inde holder et sted for initiering af DNA-kopiering og gener, som specificerer de funktioner, som er er nødvendige for kontrollering af kopieringen.

6 DK 174310 B1

Restriktionsfragment: Et DNA-molekyle, som er fremkom met ved dobbeltstrenget spaltning ved hjælp af et enzym, som genkender en specifik mål-DNA-sekvens.

RNA-polymerase: enzym, som bevirker transskription af DNA 5 til RNA.

Selekterbart markørgen: En DNA-sekvens, som efter kopiering giver denne celle en vækstfordel i forhold til celler, som ikke indeholder denne DNA-sekvens, når alle cellerne findes i et vækstmedium, som 10 kan adskille de to celletyper. Almindeligt an vendte selekterbare markørgener er sådanne, som koder for resistens overfor antibiotika.

Enkelt overkrydsning: Rekombination af 2 cirkulære DNA-mole-kyler til dannelse af en kointegrat større 15 cirkel.

Strukturgen: Et gen, som koder for et polypeptid.

T-DNÅ: Del af Ti-plasmidet, som det findes stabilt integreret i plantecellegenomet.

T-område: Del af Ti-plasmidet, som indeholder DNA-se- 20 kvenserne, der overføres til plantecellegenomet.

Ti-plasmid; Store plasmider, som findes i Agrobacterium tumefaciens stammer indeholdende den genetiske information for tumor (krongalle) induktion på følsomme planter.

25 TL-DNA og TR-DNA: Octopin krongalletumorceller kan indeholde 2 T-DNA-sekvenser, et venstre T-DNA, dvs.

TL-DNA, og et højre TR-DNA. TL-DNA indeholder sekvenser, som også findes sammen med T-DNA fra nopalintumorceller, hvilket derimod ikke er 30 tilfældet med TR-DNA.

tra (overføringsfunktioner): Såvel plasmidkodede diffunder-bare produkter som aktionssteder, der anvendes under DNA-overføring mellem celler, f.eks. produkter, der er nødvendige for at danne en bro 35 mellem to celler og det sted, hvor DNA-overfø ring ini tieres.

7 DK 174310 B1

Transskription: Dannelse af mRNA ud fra et strukturgen, eller processen, som involverer baseparing, hvorved den genetiske information indeholdt i DNA anvendes 5 til en komplementær sekvens af baser i en RNA- kæde.

Transformation: Genetisk modifikation fremkaldt ved inkorporering af exogent DNA til DNA-komplementet i en celle.

10 Translation: Dannelsen af et polypeptid ud fra mRNA, eller processen, hvor den genetiske information i et mRNA-molekyle styrer rækkefølgen af specifikke aminosyrer under syntesen af et polypep-15 tid.

Udifferentieret phenotype: Et homologt udseende af celler i et væv uden nogen specialiserede dele.

Vektor: Et DNA-molekyle udformet til overføring mellem forskellige værtceller.

20 Udviklingen af rekombinant DNA teknik har givet gensplejsningen af mikroorganismer et ansporende perspektiv. Disse teknikker kunne overføres til flercellede eukaryoter, hvis der kunne gendannes fuldstændige organismer ud fra enkelte somatiske celler. Cellerne fra nogle højere planter udviser 25 udmærkede regenereringsegenskaber og er derfor gode materialer til gensplejsning af højere organismer.

Et væsentligt problem ved gensplejsningen af planter er ‘tilgængeligheden af et system til indføringen af exogent (fremmed) DNA i plantegenomet. Et sådant system tilvejebringes af 30 de tumor inducer ende (Ti) plasmider, som bæres af den gramnegative jordbakterie Agrobacterium tumefaciens. Det er påvist, at denne organisme fremkalder en neoplastisk transformation, som kaldes "krongalle", i sårvæv hos et meget stort antal tokimbladede planter. De formerende neoplasmer synteti-35 serer hidtil ukendte, Ti-specificerede metaboliter, som kaldes opiner. Molekylbasis for denne transformering er over- 8 DK 174310 B1 førslenog den stabile integrering af et veldefineret T-DNA (overført DNA) fragment af Ti-plasmidet i plantecellegeno-met. Med andre ord indeholder krongalletumorer i det kromosomale DNA et DNA-segment, som betegnes T-DNA'et, som er 5 homologt med DNA-sekvenserne i Ti-plasmidet, som anvendes til indføring af tumorlinien. I alle tilfælde svarer dette T-DNA til og er kolineært med et kontinuert stræk af Ti-plasmid DNA, som derfor kaldes T-området.

Ti-plasmider klassificeres i overensstemmelse med den type 10 opin, som dannes i krongalleceller. Agrobacteriumstammer, som inducerer syntesen af nopalin [Ν-α-(1,3-dicarboxyprop-! yl)-L-arginin] i krongalleceller, kaldes nopalinstammer, og stammer, som inducerer syntesen af octopin [N-a-(N-l-carboxyethyl)-L-arginin], kaldes octopinstammer. Disse er 15 de mest almindeligt anvendte Agrobacteriumstammer.

Anvendelsen af T-DNA som en vektor til plantegenspiejsning er påvist ved hjælp af et modelforsøg, i hvilket 14 kb bak-terietransposonet Tn7 indsættes in vivo nær den højre grænse af T-DNA'et fra Ti-plasmidet fra stammen Agrobacterium T37.

20 Nopalinsyntese eliminerers i tumorerne provokeret med agro-bakterier, som bærer dette Ti-plasmid. Endvidere har Southern blotting hybridisering vist, at hele Tn7'et er til stede i det kromosomale DNA i disse tumorer, som en del af en ellers normal T-DNA-sekvens (Hernalsteens et al., 25 Nature 287 (1980), 654-656, Holsters et al-, Mol. Gen.

Genet. 185 (1982), 283-289). Indforingen af dette 14 kb DNA-fragment i 23 kb T-DNA'et har således ikke ændret sidstnævntes evne til at kunne overføres til plantecellegenomet.

Grænserne for T-DNA'et fra Ti-plasmidet fra nopalinstam-30 men Agrobacterium T37 er bestemt meget nøjagtigt. Det udgør kun en del, omtrentlig 23 kb, af hele nopalin Ti-plasmidet. Endvidere kendes grænserne for T-DNA’et. Nucleotidsekven-serne, som fastlægger grænserne for T-DNA’et, er blevet bestemt og sammenlignet med det samme område i nopalin Ti-35 plasmidet (Zambryski et al-, Science 209 (1980), 1385-1391, Zambryski et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 361-370).

9 DK 174310 B1

Grænserne for τ-området er højst sandsynligt involveret i integreringen af T-DNA’et i plantecellegenomet.

Kendskab til T-DNA-sekvenserne, som fastlægger grænserne for det overførte DNA, er et grundlæggende krav for an-5 vendeisen af Ti-plasmidet som en vektor for overføring af DNA til planteceller. Fremmed DNA kan således indsættes indenfor disse grænser for at sikre dets overførsel til plantecellegenomet. Hvis man endvidere forventer at anvende dette system, er det vigtigt at de transformerede 10 planteceller er normale og ikke tumoragtige med hensyn til vækstegenskaber. Dannelsen af normale celler efter T-DNA-overføring kræver kendskab til funktionerne, som T-DNA'et selv koder for. T-området i Ti-plasmidet er således blevet underkastet intens genetisk analyse for at 15 bestemme de områder, som er ansvarlige for tumorphenotypen.

T-DNA'et koder for funktioner, som er ansvarlige for kron-gallephenotypen. Generne er blevet lokaliseret til specifikke områder i T-DNA'et (Leemans et al., EMBO J. 1 (1982), 147-152 og Willmitzer et al., EMBO J. 1 (1982), 139-146).

20 Generelt er der mindst fire gener, som kontrollerer den udifferentierede phenotype for tumorcallusvæv. Muntanter i disse gener kan enten føre til transformeret væv, som virker skudagtigt eller rodagtigt. Sidstnævnte resultater er særligt vigtige, hvis man ønsker at overføre DNA til 25 planter til kopiering i normalt plantevæv og ikke i tumorvæv .

Det har for nyligt vist sig, at et mutant Ti-plasmid inducerer transformerede skud, som er i stand til at regenerere til helt normale planter. Disse planter er frugtbare 30 og overfører endog T-DNA specifikke sekvenser ved meiose, dvs. at afkomsplanter stadig indeholder T-DNA-specifikke sekvenser (Otten et al., Mol. Gen. Genet. 183 (1981), 209-213). Imidlertid indeholder det transformerede plantevæv i det kromosomale DNA et T-DNA, som har en meget 35 mindre størrelse som følge af dannelsen af en stor sletning, som fjernede området for T-DNA'et, som kontrollerede tu- 10 DK 174310 B1 morpheriotypen. Det vides ikke om sletningen foregik under den indledende transformering eller som en senere hændelse, der fører til skuddannelse.

5 Ti-plasmiderne er store (200 kb), og mange gener anbragt på forskellige steder på Ti-plasmidet er involveret i transformationen af planteceller. Det er derfor ikke muligt at konstruere en lille Ti-plasmidafledt kloningsvektor med entydige endonucleasegenkendelsessteder på passende 10 steder i T-området, og som har alle de funktioner, som er essentielle for T-DNA-overføring og stabil inkorporering i plantecellegenomet. En kendt måde til indføring af et valgt DNA-fragment i specifikke restriktionsenzymspaltningssteder i T-området i et Ti-plasmid er at 15 danne kloningsplasmider, som kan danne kopier i Agro-bacterium samt i Escherichia coli, og som indeholder et valgt restriktionsfragment af T-DNA'et. Sådanne kloningsplasmider betegnes "intermediate vektorer". Sådanne intermediate vektorer anvendes til at analysere funktionerne, 20 som indkodes af T-området (Leemans et al., J. Mol. Appl.

Genet. 1 (1981), 149-164).

Leemans et al. (J. Mol. Appl. Genet. 1 (1981), 149-164) beskriver Ti-plasmidmutanter og transformation af plante-25 celler med disse plasmider. Alle Ti-plasmider, der er beskrevet af Leemans et al. (1981), indeholder imidlertid stadig T-DNA-gener, der kontrollerer neoplastisk vækst. De Greve et al. (Nature 300 (1982), 752-755) beskriver regenerering af normale og fertile tobaksplanter, der eksprimerer 30 octopin-synthase fra tobakskrongaller. Det Ti-plasmid, der anvendes til transformation, indeholder imidlertid T-DNA-gener, der kontrollerer neoplastisk vækst, og produktionen af normale planter var kun mulig, fordi der skete en spontan deletion af disse gener i et tilfælde. Dette dokument be-35 skriver således ikke reproducerbar fremstilling af morfologisk normale transgene planter. Leemans et al. beskriver (i "Molecular Biology of Plant Tumors" (1982), 537-545) perspektiver for anvendelse af Ti-plasmider til fremstilling af 11 DK 174310 B1 transgene planter. Dette dokument angiver imidlertid ikke, hvilke sekvenser der skal deleteres, og hvilke der skal bibeholdes i et Ti-plasmid for at muliggøre produktion af normale transgene planter.

5 I modsætning til denne kendte teknik tilvejebringer den foreliggende opfindelse midler og metoder, der muliggør produktion af transgene planter, der er morfologisk normale på grund af fraværet af T-DNA-gener, der kontrollerer neopla-10 stisk vækst. Desuden muliggør den foreliggende opfindelse for første gang en produktion af transgene planter, der eksprimerer et kimærisk gen.

Den foreliggende opfindelse angår en intermediær kloningsvek-15 tor, som består af: (a) et kloningsmiddelsegment (3') indeholdende en venstre grænsesekvens (1) og en højre grænsesekvens (2) af en T-region af et vildtype-Ti-plasmid, og (b) et DNA-segment, som er placeret mellem grænsesekven- 20 serne på en måde, som muliggør integrering deraf i plantegenomet, hvor DNA-segmentet i det væsentlige er frit for indre T-DNA-sekvenser af et vildtype-Ti-plasmid og ikke indeholder T-DNA-gener, som kontrollerer neoplastisk vækst, og indeholder mindst ét gen 25 af interesse, som omfatter: (i) en kodende sekvens og (ii) en promotorregion, som indeholder en anden promotorsekvens end den naturlige promotorsekvens for den kodende sekvens, og hvor promotorsekven- 30 sen regulerer transkription af downstream-se kvenser indeholdende den kodende sekvens til dannelse af et RNA i en celle af en plante.

Opfindelsen angår desuden 35 - en bakterie, som indeholder en intermediær kloningsvektor ifølge opfindelsen, fortrinsvis en Escherichia coli eller en Agrobacterium, en fremgangsmåde til transformering af en celle af en 12 DK 174310 B1 plante ved at anvende en Agrobacterium ifølge opfindelsen, en fremgangsmåde til fremstilling af en plante, omfattende følgende trin: (a) infektion af en plantecelle med en agrobacterium 5 ifølge opfindelsen og (b) dannelse af en plante ud fra de transformerede planteceller opnået i trin (a) , en celle af en plante, som stabilt integreret i sit genom indeholder et fremmed DNA, som er ejendommeligt ved, at: 10 (a) det i det væsentlige er frit for indre T-DNA-sekvenser af et vildtype-Ti-plasmid, (b) det ikke indeholder T-DNA-gener, som kontrollerer neoplastisk vækst, og (c) det indeholder mindst ét gen af interesse indehol- 15 dende: (i) en kodende sekvens og (ii) en promotorregion, som indeholder en anden promotorsekvens end den naturlige promotorse-kvens for den kodende sekvens, og hvor promotor- 20 sekvensen regulerer transkription af downstream- sekvenser indeholdende den kodende sekvens til dannelse af et RNA i cellen, en plante sammensat af celler ifølge opfindelsen, og frø af en plante ifølge opfindelsen, som er sammensat af 25 celler ifølge opfindelsen.

Den foreliggende opfindelse vedrører indføring af expressible gener i plantecellegenomer. Der tilvejebringes modificerede acceptor Ti-plasmider, som tillader indføring af vilkårlige 30 interessante gener i disse plasmider. Genet eller generne, som har interesse, og som skal indføres, er indeholdt i den intermediære kloningsvektor ifølge opfindelsen, som bærer et homologiområde med et tilsvarende område i acceptor Ti-plasmidet.

35 13 DK 174310 B1 interessante gener i disse plastnider. Genet eller generne, som har interesse, og som skal indføres, er indeholdt i den intermediaere kloningsvektor ifølge opfindelsen, som bærer et homologiområde med et tilsvarende område i acceptor Ti-5 plasmidet.

Indføringen af genet eller generne af interesse i acceptor Ti-plasmiderne opnås ved en enkelt overkrydsning, som finder sted indenfor de to homologe DNA-segmenter af accep-10 tor Ti-plasmidet, som findes i Agrobacterium, og den intermediaere kloningsvektor. Den intermediære kloningsvektor mobiliseres fra Escherichia coli, hvor den er propageret til Agrobacterium under anvendelse af hjælperplasmider.

Sådanne hjælperplasmider og deres funktioner til mobili-15 sering er kendt (Finnegan et al., Mol. Gon. Genet. 185 (1982), 344-351).

Resultatet af den enkelte overkrydsning i Agrobacterium er en hybrid Ti-plasmidvektor.

20

De dannede hybridplasmidvektorer båret i Agrobacterium (i det følgende betegnet vektorkomposition) kan anvendes direkte til inficering af planteceller, som derefter scree-nes for kopieringen af produktet eller produkterne af 25 genet eller generne, som har interesse. Denne fremgangsmåde til fremstilling af transformerede planteceller ved infektion af planteceller med vektorkompositionen, de transformerede planteceller samt planter dannet ud fra disse er også omfattet af opfindelsen. Denne metode kan 30 anvendes på en vilkårlig af de planteoverførbare plasmider fra Agrobacterium.

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen.

35

Fig. 1 viser en udføreIsesform for et acceptor Ti-plasmid, som er resultatet af en 14 DK 174310 B1 sletning af den indre del af T-området bortset fra grænsesekvenserne (1) og (2). Grænsesekvenserne er essentielle for integreringen af T-området i et planteceliegenom. Området (3) mellem 5 grænsesekvenserne (1) og (2) er det DNA-segment, som vil blive overført til planten. Acceptor Ti-plasmidet indeholder et DNA-segment (3) med en DNA-sekvens, som er homolog med i det mindste en del af DNA-sekvensen i en intermediær klonings-]_q vektor, som tillader integrering af den interme- diære kloningsvektor ved en enkelt overkrydsning.

' Ti-plasmid-området (4) koder for funktioner, som er essentielle for overføringen ved hjælp af Agrobacterium af T-området til plantecelle-15 genomer. Dette område betegnes som vir-området.

Fig. 2 viser en intermediær kloningsvektor ifølge opfindelsen, som skal indsættes ved en enkelt overkrydsning i acceptor Ti-plasmidet ifølge fig. 1. Den 20 indeholder et kloningsmiddel DNA-segment (3') med en DNA-sekvens, som er homolog med i det mindste en del af DNA-segmentet (3) i acceptor Ti-plas-raidet, som tillader den ønskede enkelte overkrydsning. Endvidere indeholder den intermedi-25 ®re kloningsvektor et gen eller en gruppe gener (5) som har interesse, og som har den naturlige promotorsekvens. Sædvanligvis kan plantegener anvendes i denne konstruktion, da de har stor sandsynlighed for at blive kopieret. Imidlertid kan 30 principielt ethvert naturligt gen af interesse indsættes. Den intermediære kloningsvektor kan også indeholde et selekterbart markørgen (6).

Dette gen bør indeholde en promotorsekvens, som tillader kopiering af genet i planteceller. Plan-35 teceller indeholdende dette markørgen bør have en selektiv vækstfordel i forhold til celler uden dette gen. På denne måde kan planteceller, som er 15 DK 174310 B1 blevet transformeret ved hjælp af DNA indeholdende dette markørgen, skelnes fra ikke-transformerede planteceller.

5 Fig. 3 illustrerer en anden udførelsesform for en intermediær kloningsvektor ifølge opfindelsen, som ligner den intermediære kloningsvektor ifølge fig. 2, og som skal indsættes ved en enkelt overkrydsning i acceptor Ti-plasmidet ifølge fig. 1.

10 Den indeholder kloningsmiddel DNA-segmentet (3'), en exogen promotorsekvens (8), som tillader reguleret kopiering af genet eller generne (7), som har interesse, og, om ønsket, et markørgen (6).

15 Fig. 4 illustrerer skematisk dannelsen af hybrid Ti-plasmidvektorer ud fra acceptor Ti-plasmidet ifølge fig. 1 og de intermediære kloningsvektorer ifølge fig. 2 og 3 ved en enkelt overkrydsning.

20

Fig. 5 illustrerer de trin, som indgår i den genetiske overføring af en intermediær kloningsvektor fra Escherichia coli til Agrobacterium indeholdende et acceptor Ti-plasmid. Det første trin er konjuge-25 ringen af Escherichia coli-stammen (1), som inde holder den intermediære kloningsvektor, til en anden Escherichia coli-stamme (2), som indeholder to hjælperplasmider for den senere konju-gering til Agrobacterium. Et hjælperplasmid inde-30 holder DNA-sekvenser, som er vigtige for plas- midoverføring (tra), og det andet hjælperplasmid indeholder sekvenser, som har betydning for mobiliseringen (mob). Når disse hjælperplasmider er indført ved konjugering i Escherichia coli-stamme 35 (1), vil den intermediære kloningsvektor inde holdt deri kunne overføres til andre bakterie- 16 DK 174310 B1 stammer. tra og mob hjælper-plasmiderne inde-^ holder.også antibiotiske resistentmarkører Abr og Ab , som er forskellige fra de markører, som v· i findes i den intermediære kloningsvektor (Ab ). Tilstedeværelsen af alle plasmiderne kan således kontrolleres på selektive medier. Der dannes en mobiliseringsstamme (3). Denne mobiliseringsstamme (3) konjugeres til en Agrobacterium tume-faciens-stamme (4), som indeholder acceptor Ti-plas-10 midet ifølge fig. 1, efterfulgt af selektion for en eller flere antibiotiske resistensmarkører fra den intermediære kloningsvektor. Da den intermediære kloningsvektor ikke kan kopiere i Agro-bacterium, kan den kun opretholdes, hvis den har ^ dannet et kointegrat med recipient acceptor Ti- plasmidet. Denne kointegratstruktur i Agrobacterium (5) er det færdige hybrid Ti-p.lasmid, som anvendes til at overføre DNA til plantecellegenomer.

O Π

Fig. 6 illustrerer dannelsen af et modelacceptor Ti-plasmid (A), som er analogt med det i fig. 1 viste. Her foretages en dobbelt overkrydsning mellem et Ti-plasmid og et andet plasmid, som indeholder en DNA-sekvens, som skal erstatte en del af det oprindelige Ti-plasmid. Nærmere betegnet indeholder det mindre plasmid grænsesekvenserne for T-området (1,2) i et kloningsmiddel (3).

En dobbelt overkrydsning resulterer i sletningen af den indre del T af T-området og ombytning deraf 30 med kloningsmidlet. Det dannede acceptor Ti-plas mid (A) kan overføre DNA indeholdt mellem grænsesekvenserne (1,2) til plantecellegenomer. Det dannede transformerede plante-DNA vil ikke danne tumorøst krongallevæv, da generne, som kontrollens rer neoplastisk vækst, er slettet i Ti-plasmidet (A). Ti-plasmid (A) er et meget generaliseret acceptor Ti-plasmid for en vilkårlig intermediær 17 DK 174310 B1 kloningsvektor med homologi med kloningsmidlet (3). Kloningsmidlet (3) kan være et konventionelt plasmid, såsom pBR322 (eller derivater deraf) .

5 Fig. 7 illustrerer skematisk de trin, som fører til dannelsen af en intermediær kloningsvektor i Escherichia coli-værtsceller. Et gen (5) , som har interesse omgivet af restriktionsendonucleasestedet Ri og et selekterbart makørgen (6) omgivet af lø restriktionsendonucleasestedet R2 indsættes i et; kloningsmiddel (3'), som indeholder enkeltrestriktionssteder for enzymerne Ri og R2. Alle tre molekyler nedbrydes med restriktionsenzymer RI og/eller R2 og ligateres eller bindes sammen under 15 anvendelse af DNA-ligase til dannelse af den intermediære kloningsvektor. Kloningsmidlet 3’ skal også indeholde yderligere DNA-sekvenser, som koder for antibiotisk resistens (Ab ) til anvendelse som en selekfcerbar markør for bakterielle ge- 20 ner. Genet (5), som har interesse, kan være under kontrol af dets naturlige promotor eller af en exogen promotor som vist i fig. 2 og fig.

3. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Fig- 8 illustrerer dannelsen af en anden ud 2 førelsesform af et acceptor Ti-plasmid (B) 3

Her foretages en dobbelt overkrydsning mellem et 4

Ti-plasmid og et kloningsmiddel (3), som indehol 5 der DNA-sekvenser (9) og (10) , som er homologe 6 til Ti-sekvenser lige udenfor grænsesekvenserne 7 henholdsvis (1) og (2). Dobbeltoverkrydsningen 8 medfører sletning af hele T-området T inklusive 9 grænsesekvenserne (1) og (2) og ombytning deraf 10 med kloningsmidlet (3). Ti-plasmid (B) er en 11 acceptor for intermediære kloningsvektorer, som indeholder det gen, som har interesse, klonet mellem grænsesekvenserne (1) og (2), jfr. fig. 9.

18 DK 174310 B1

Fig. 9 illustrerer en intermediær kloningsvektor ifølge opfindelsen, som skal indsættes ved en enkelt overkrydsning i acceptor Ti-plasmidet (B) ifølge j fig. 8. Det indeholder grænsesekvenserne (1) og 5 (2) , som er anbragt på siderne af genet eller generne (5), som har interesse. Den indeholder også en kloningsmiddelsekvens (3'), som er i det mindste delvis homolog .til kloningsmiddelsekvensen (3) i acceptor Ti-plasmidet (B) for at 10 tillade homolog rekombination mellem de to plas- mider.

Fig. 10 illustrerer skematisk dannelsen af hybrid Ti-plasmidvektorer ud fra acceptor-15 Ti-plasmidet (B) ifølge fig. 8 og den tilsvarende intermediære kloningsvektor ifølge fig. 9. En enkelt overkrydsning indfører den intermediære kloningsvektor ifølge fig. 9 i acceptor Ti-plasmidet (B) ifølge f ig. 8 .

20

Opfindelsen forklares mere detaljeret under henvisning til fig. 11-20 på tegningen.

Fig. 11 illustrerer indsætningen af 5,2 kb HindIII-frag-25 mentet AcgB i pBR322 (se også Zambryski et al.,

Science 209 (1980), 1385-1391). Dette fragment AcgB indeholder de højre og venstre grænseområder af nopalin Ti-plasmidet. Denne kon pAcgB anvendes til dannelsen af acceptorplasmid pGV3850, som er et "A-30 lignende" acceptorplasmid som vist i fig. 6. Det er indlysende for en fagmand, at en klon, som er analog med klon pAcgB, kan dannes ved at anvende de klonede restriktionsfragmenter, som indeholder det venstre og højre grænseområde af et vild-type Ti-plasmid.

19 DK 174310 B1

Fig. 12 illustrerer T-området.af nopalin Ti-plasmid pGV3839.

Hindlll-restriktionsendonucleasestederne er betegnet med (H). Det muterede Hindlil-fragment 19 er betegnet {19'). Acetylphosphotransferasegenet, som 5 tilvejebringer kamamycin- eller neomycinresistens, er betegnet som apt og findes i det sorte område. Grænserne for T-området er angivet ved hjælp af pile. Nopalinsyntetasegenet er betegnet med nos.

Tallene refererer til størrelserne af restriktions-10 fragmenterne i overensstemmelse med Depicker et al.,

Plasmid 3 (1980), 193-211. Dannelsen af Ti-plasmi-det pGV3838 er beskrevet i eksempel 1 og i de to anførte litteratursteder.

25 Fig. 13 illustrerer dannelsen af acceptor Ti-plasmid pGV 3850.

Plasmidet pBR322-pAcgB (fig. 11) er vist på lineær form. pBR322-sekvenserne er vist ved det dobbelt-skraverede område, og ampicillinresistensgenet af pBR322 ved Ap^. En del af T-området af pGV3839, som 20 er vist i fig. 12, er vist her. Hindlll-fragmen terne (10) og (23), som indgår i homolog rekombination med pAcgB og apt-genet, er vist. Dobbeltoverkrydsninger fører til dannelsen af pGV3850 og et • andet replikon, som indeholder apt-genet, som går 25 tabt*

Fig. 14 viser skematisk dannelsen af den intermediære kloningsvektor pGV700, som er beskrevet detaljeret i eksempel 2. Der anvendes følgende forkortelser 3Q til at betegne restriktionsendonucleasesteder: B, BamHi, BG, Bglll, E, EcoRI, H, Hindlll, S, Sall, • Sm, Smal. Endvidere anvendes følgende forkortelser til at betegne antibiotisk resistens: Ap, ampicillin, Cm, chloramphenocol, Sm, streptomycin, Tc, tetracyc-35 lin. Tallene nederst på figuren, som.'referer til TL-DNA, angiver RNA-transkripterne for dette område (Willmitzer et al., EMBOJ. 1 (1982), 139-146).

20 DK 174310 B1 ^9· 15 illustrerer strukturen af den intermediate kloningsvektor pGV750. Dens fremstilling er beskrevet i eksempel 2. Restriktionsendonucleasestederne er anqivet med deres relative placeringer anført i ΞΙ tal som kilobasepar (kb). Pstl-steder er ikke angi-

R R

vet, men der findes tre i Km /Nm -området, og et i R

Cb -genet. De højre og venstre grænser er ligeledes , angivet. Bglll/BamHl- og Hpal/Smal-stederne, som anvendes ved dannelsen af pGV750, er angivet, men findes ikke i pGV750. Det grå område svarer til TL-DNA, det sorte område til Km^/Nm^-området, og det hvide område til tilstødende· Ti-plasmidsekven- ser, og linien til kloningsmidlet pBR325. Desuden

anvendes følgende forkortelser: Ocs, octopinsynte-15 r R

tase; Cm , chloramphenicolresistens; Cb , carbeni-

R R

cillinresistens (analog til ampicillin) og Km /Nm , kanamycinresis tens/neomycinresistens.

Fi9· 16 illustrerer dannelsen af den intermediære vektor 20 pGV745, som er beskrevet i detaljer i eksempel 3. pGV745 anvendes ved dannelsen af acceptorplasmidet pGV2260, som er et "B-lignende" acceptorplasmid, vist i fig. 8. Restriktionsendonucleasestederne er betegnet på følgende måde: B, BamHI; H, Hindlll; ^ # .og R, EcoRI. Ampicillinresistensgenet er betegnet som Ap . Det skraverede område betegner DNA, som er homologt med den venstre side af T-DNA-området i octopin-Ti-plasmidet, og det hvide område betegner DNA, som er homolog med den højre side af T-30 DNA-området af octopin-Ti-plasmidet. Den fysiske placering og beskrivelsen af udgangsplasmiderne PGV0219 og pGV0l20 er beskrevet i De Vos et al.,

Plasmid 6 (1981), 249-253.

35 Fig. 17 illustrerer dannelsen af acceptorplasmidet pGV2260.

Sletningssubstitutionen i pGV2217 er angivet som 21 DK 174310 B1 et sort område indeholdende acetylphosphotranfera-segenet (betegnet apt), som tilvejebringer neomycin-og kanamycinresistens. Den intermediære vektor pGV745 (fig. 16) er vist på lineær form. Den er åbnet på 5 Hindlll-stedet i pGV745 vist i fig. 16. pBR322-se- kvensen er angivet som et skraveret område, og ampi- n cillinresistensgenet er betegnet med Ap . Dobbelt-overkrydsninger fører til dannelsen af pGV2260 og tab af apt-genet. Restriktionsendonucleasestederne 10 betegnes på følgende måde: B, BamHI; H, Hindlll og R, EcoRI.

Fig. 18 illustrerer dannelsen af et plasmid pLGV2381 til kopieringen af gener, som ligger medstrøms eller 15 nedenfor promotoren i nopalinsyntetasegenet (nos).

Tallene 5' og 3' refererer til begyndelsen og slutningen for transkription, og ATG og TAA refererer til de kodoner, som anvendes til at starte og til· at afbryde translationen. Den tykke sorte linie 20 angiver nos-promotor-området, og det hvide område

O

angiver nos-kodningsområdet. Ap står for ampicillin-resistens, og Km betyder kanamycinresistens.

Fig. 19 illustrerer dannelsen af plasmidet pAGVlO indehol-25 dende den fuldstændige octopinsyntetasekodnings- sekvens (ocs) og indsættelsen deraf i plasmid pLGV2381 (se også fig. 18) bag ved nos-promotoren. De tykke • sorte linier refererer til promotorområderne, og de hvide områder refererer til ocs-kodningsområdet.

30 De øvrige betegnelser er som i fig. 18.

Fig. 20 illustrerer nucleotidsekvenserne omkring promotorområdet i nopalinsyntetasegenet (nos) og nucleotidsekvenserne omkring det samme område efter fu-35 sion med kodningsområdet i octopinsyntetasegenet.

Fusionspunktet er betegnet med en asterisk (*).

i 22 DK 174310 B1

Adskillige restriktionsendonucleasesteder er anført, BamHI, Hindlll og SacII. Tallene 5’ og 3' refererer j til begyndelsen og ophør for transkription. ATG

refererer til den første kodon, som anvendes 1 5 translationen, og TAA refererer til stopkodonen, som anvendes i translation. De lange pile angiver kodningsområderne for nopalingenet i hvidt og octo-pingenet i striber.

ΙΟ I det følgende forklares opfindelsen yderligere i detaljer under henvisning til tegningen.

Fig. 1 viser et simplificeret diagram af et acceptor Ti-plasmid. Dette acceptor Ti-plasmid indeholder de to græn-sesekvenser (1,2) eller områder af det tumorinducerende (Ti)-plasmid af vildtypen. Grænsesekvenserne er vigtige for integreringen af T-området i Ti-plasmider i et plante-cellegenom. De er med andre ord vigtige for integreringen af en vilkårlig DNA-sekvens (3) eller et vilkårligt T-om-2q råde i et plantecellegenom beliggende mellem disse sekvenser.

DNA-sekvensen (3) i acceptor Ti-plasmidet indeholder et DNA-segment, som er homologt med i det mindste en del af en DNA-sekvens (3*) i en intermediær kloningsvektor illu-25 streret i fig. 2 og 3. Denne homologi er nødvendig for kointegrering ved en enkelt overkrydsning (homolog rekombination) af den intermediære kloningsvektor ved acceptor Ti-plasmidet. Hyppigheden for opnåelse af kointegrater er i det væsentlige bestemt af længden af homologiområdet.

For at fremkalde en homolog rekombination med høj hyppig-j 0 hed anvendes sædvanligvis områderne fra 1-4 kb (Leemanns et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1981), 149-164).

Acceptor Ti-plasmidet indeholder endvidere sekvenser (4), 2^ som er vigtige for overføringen med Agrobacterium af T-området af Ti-plasmiderne til plantecellegenomer.

. I

i DK 174310 B1 23

Dannelsen af sådanne acceptor Ti-plasmider og deres kointegrering med intermediære kloningsvektorer illustreret i fig. 2 og 3 beskrives nærmere i. det følgende i forbindelse med omtalen af fig. 4.

5 I fig. 2 og 3 er vist simplificerede diagrammer for intermediære kloningsvektorer for kloningen af vilkårlige prokaryote eller eukaryote gener, som har interesse, og som skal udbredes eller kopieres, dvs. transkriberes under kon-10 trol af en promotor og translateres i planteceller. Disse intermediære kloningsvektorer indeholder et DNA-segment (31) fra et kloningsmiddel indeholdende en DNA-sekvens, som er homolog med mindst en del af DNA-segmentet (3) af acceptor Ti-plasmidet, hvilket muliggør en enkelt overkrydsning.

15 Endvidere indeholder de intermediære kloningsvektorer mindst et gen (5;7), som har interesse, og som indeholder enten den naturlige eller en exogen promotorsekvens. Promotor-sekvensen tillader kopiering af den eller de indsatte gensekvenser. Anvendelsen af en exogen promotorsekvens (skræ-20 dersyet promotor) kan være nyttige til styring af kopieringen af det eller de indsatte gener på reguleret måde.

Eksempler på forskellige former for regulering indbefat-·' ter følgende: (1) vævspecifik kopiering, dvs. blade, rødder, 25 stængler, blomster, (2) kopieringsniveau, dvs. højt eller lavt, og (3) inducerbar kopiering, dvs. ved hjælp af temperatur, lys eller tilsatte kemiske faktorer.

Eksempler på gener, som har interesse, for de intermediære 30 kloningsvektorer er DNA-fragmenter eller sekvenser med den genetiske information, som kontrollerer syntesen af produk-cer, såsom aminosyrer eller sukkerarter, til modificering af en plantes nærings- eller vækstpotential, eller produkter, som giver beskyttelse mod ydre patogene sygdomsfrem-35 kaldere, såsom resistens mod sygdomscrganismer eller belastende miljøfaktorer, eller produkter, som giver infor- 24 DK 174310 B1 mation om grundliggende planteprocesser, som skal modificeres ved genspiejsningsteknik.

Fig. 2 og 3 viser begge intermediære kloningsvektorer, som S kan indeholde selekterbare markørgener (6). Som eksempler på selekterbare markørgener kan nævnes sådanne, som indkoder resistens overfor antibiotika eller toksiske analoge forbindelser (f.eks. aminosyreanaloge) , eller gener , som kan afhjælpe en defekt i recipientværtscellen.

10

Fig. 4 illustrerer strukturerne, som indgår i dannelsen af hybrid Ti-rplasmidvektorer, og fig. 5 illustrerer de faktiske konjugationstrin, som indgår i isoleringen af Agrobacterium, der bærer hybrid Ti-plasmidvektorerne. Da IS den intermediære kloningsvektor er dannet i Escherichia j coli, er disse trin nødvendige for at overføre den inter mediære kloningsvektor til acceptor Ti-plasmidet i Agro-bacterium. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Den kendte overføringsproces, som anvendes til fremstil 2 ling af modificerede Ti-plasmider, hvori en del af T-om- 3 rådet er ombyttet med en ændret sekvens, omfatter mange 4 trin. Sædvanligvis gennemføres de fleste DNA rekombinant- 5 manipulationer i specielt udformede kloningsmidler, såsom 6 pBR322 (Bolivar, Gene 2 (1977), 75-93). Imidlertid kan 7 disse kloningsmidler ikke selv overføres til Agrobacterium.

8

Ved de kendte fremgangsmåder er dette problem løst på føl 9 gende måde: 10 a) pBR-kloningsmiddelsekvensen ombyttes med et andet bred- 11 vært-område-kloningsmiddel, såsom mini-Sa-plasmidet (Leemanns et al., Gene 19 (1982), 361-364), som også kan formere sig i Agrobacterium..Disse manipulationer gennemføres i Escherichia coli. Der dannes en intermediær kloningsvektor.

b) Konjugering af Escherichia coli-stammen, som bærer den intermediære kloningsvektor indeholdende det DNA, som har 25 DK 174310 B1 interesse, med en anden Escherichia coli-stamme, som bærer et hjælperplasmid, som ikke kan kopiere i Agrobacterium, men som kan formidler overføring af sig selv og andre DNA'er til Agrobacterium.

5 c) Konjugering af Escherichia coli dannet i trin b) med Agrobacterium indeholdende et Ti-plasmid. Hjælperplasmidet går tabt.

d) Da den intermediære kloningsvektor er i stand til at kopiere og eksistere i Agrobacterium som en separat repli- 10 kon, er konjuganterne dannet i trin c) en blanding af celler indeholde enten kointegratet mellem den intermediære kloningsvektor og Ti-plasmidet eller andre celler indeholdende den intermediære kloningsvektor og Ti-plasmidet, hvor der ikke er sket nogen kointegrering. For ude-15 lukkende at isolere kointegraterne, er det nødvendigt at gennemføre en anden konjugation til en anden Agrobacterium-stamme uden et Ti-plasmid. Denne overføring formidles ved hjælp af funktioner, som indkodes ved hjælp af Ti-plasmidet selv. Overføring af den intermediære kloningsvektor til 20 den anden Agrobacterium-starame gennemføres kun i form af et kointegrat med Ti-plasmidet.

e) Til dannelse af det endelige modificerede Ti-plasmid med den ønskede ombytning foretages en anden overkrydsning (Leemanns et al., J. Mol. Appl- Genet. 1 (1981), 149-164).

25

Den eneste anden kendte metode svarer stort set til den ovenfor beskrevne, idet der dog i trin d) indføres et andet plasmid, som ikke er foreneligt med den intermediære kloningsvektor, i Agrobacterium. I dette tilfælde kan kointe-30 grationen (enkelt overkrydsning) vælges, da alle de intermediære kloningsvektorer, der bliver tilbage som uafhængige replikoner, vil gå tabt. (Matzke et al., J. Mol. Appl. Genet.

1 (1981), 39-49).

35 En ny og yderst enkel fremgangsmåde til indføring af intermediære kloningsvektorer i acceptor Ti-plasmider i Agrobac- 26 DK 174310 B1 terium er baseret på erkendelsen af, at hjælperpiasmider fra Escherichia coli tillader direkte overføring af mange af de almindeligt anvendte kloningsplasmider, såsom pBR322, til Agrobacterium. Da ingen af disse plasmider kan kopiere 5 i Agrobacterium, vil kun de plasmider, som kan danne koin-tegrat med acceptor Ti-plasmidet, blive tilbage. Dette koin-tegrat anvendes endvidere direkte i Agrobacterium som en vektorkomposition til infektion af planteceller. På denne måde er det muligt at eliminere de ovenfor beskrevne trin 10 d) og e), hvilket i vid udstrækning forøger mulighederne for at anvende acceptor Ti-plasmider som vektorer for DNA-overførsel til plantecellegenomer ved både at formindske den tid, der kræves til dannelse af modificerede hybrid Tiplasmider, og ved at forøge fleksibiliteten af de mulige 15 konstruktioner.

Som vist i fig. 5 gennemføres indføringen af den interme-diære kloningsvektor i acceptor Ti-plasmidet således i to trin. Først foretages konjugering af en Escherichia coli-20 stamme (1), som bærer den intermediære kloningsvektor, til en anden Escherichia coli-stamme (2) , som bærer to plasmider, som hjælper til at mobilisere den intermediære kloningsvektor til Agrobacterium. Typiske og foretrukne eksempler på disse hjælperplasmider er R64drdll indehol-25 dende mob-funktioner og pGJ28 indeholdende tra-funktioner (Finnegan et al., Mol. Gen. Genet. 185 (1982), 344-351).

Et bom-sted (Warren et al., Nature 274 (1978), 259-261) på kloningsmidlet i den intermediære kloningsvektor erkendes ved hjælp af de funktioner, som indkodes ved hjælp af de 30 to andre plasmider, således at overføring kan finde sted.

Alle plasmider bør fortrinsvis indeholde antibiotikumresistensmarkører, for at deres tilstedeværelse kan påvises.

For det andet konjugeres den dannede Escherichia coli-stamme, dvs. den mobiliserede stamme (3), som bærer alle 35 tre plasmider, til Agrobacterium indeholdende et acceptor Ti-plasmid med et homologiområde med den inter- 27 DK 174310 B1 mediære kloningsvektor. En enkelt overkrydsning mellem den intermediære kloningsvektor og acceptor Ti-plasmidet kan påvises ved selektion for antibiotikaresistensmarkøren i den intermediære kloningsvektor.

5 Fig. 6 -illustrerer skematisk de DNA-molekuler, som anvendes til dannelse af acceptor Ti-plasmidet vist i fig.

1. Dette acceptor^Ti-plasmid betegnes (A) for at skelne det fra det andet acceptor Ti-plasmid (B) (fig. 8). Dannelsen kræver en dobbeltoverkrydsning mellem et'· Ti-plasmid 10 og et andet plasmid/ som bærer grænsesekvenserne (1) og (2) i et kloningsmiddel (3). Som vist i figuren ligger kloningsmiddelsekvensen (3) mellem grænsesekvensen (1) til venstre og (2) til højre. For at vise den korrekte polaritet af DNA-strengene, kan denne tegnes på en cir-15 kel. For at vise homologiområderne/ som anvendes ved dobbeltoverkrydsningen, er det imidlertid nødvendigt at bryde denne cirkel som vist. Dette er et vigtigt træk at forstå, og det anvendes også ved dannelsen af acceptor-Ti-plasmid (B) i fig. 8, dvs. hvis grænsesekvenserne (1) 20 og (2) blot indsættes i kloningsmiddelsekvensen (3), ville en dobbeltoverkrydsning danne et Ti-plasmid med et slettet T-område, men uden kloningsmiddelsekvensen mellem grænsesekvenserne (1) og (2). Som det også fremgår af fig. 6 bevirker dobbeltoverkrydsningen også et cirkulært 25 DNA-molekule, som indeholder det oprindelige T-område mellem grænsesekvenserne (1) og (2) . Da dette ikke er en replikon, vil det gå tabt. Genetisk udvælgelse for disse hændelser kan opnås f.eks. ved at selektere for tabet af en antibiotikumresistensmarkør indeholdt i T-området i 30 Ti-plasmidet og selektere for en antibiotikumresistens-markør indeholdt i kloningsmiddelsekvensen (3).

Fig. 7 viser skematisk dannelsen af en intermediær kloningsvektor ifølge fig. 2 og fig. 3. Et gen (5), som har' 25 interesse, og et selekterbart markørgen (6), begge omgivet af et restriktionsendonucleasested henholdsvis RI eller R2, 28 DK 174310 B1 indsættes i en kloningsmiddelsekvens (3'}, som indeholder entydige restriktionssteder for enzymer Ri og R2, ved nedbrydning og ligatering eller binding af alle molekyler.

Det dannede rekombinant DNA-molekyle anvendes til at trans- 5 formere Escherichia coli-værtsceller, og transformanterne

R

selekteres for antibiotikumresistensmarkøren {Ab ) i kloningsmiddelsekvensen (3'}.

Fig. 8 viser skematisk DNA-molekylerne, som anvendes til 10 dannelse af en anden udførelsesform for acceptor Ti-plasmid (B). Her foretages en dobbelt-overkrydsning mellem et Ti-plasmid og et plasmid, som indeholder kloningsmiddelsekvensen (3) mellem DNA-sekven-senne (9).og (10), som findes netop udenfor grænsesekven-, 15 serne (1) og (2). For at illustrere de homologe områder, som anvendes ved overkrydsningen, er det lille plasmid blevet brudt {som i fig. 6). Produktet fra den dobbelte overkrydsning er acceptor Ti-plasmid (B) og et andet cirkulært DNA-molekyle, som går tabt, indeholdende T-20 området fra det oprindelige Ti-plasmid plus DNA-sekven-serne (2), (10), (9) og (1). Genetisk selektion kan opnås som beskrevet i forbindelse med fig. 6.

Fig. 9 illustrerer skematisk en intermediær kloningsvektor, 25 som skal anvendes i kombination med acceptor Ti-plasmidet B ifølge fig. 8. Her indsættes det gen (5), som har interesse, mellem grænsesekvenserne (1) og (2), som er indeholdt i en kloningsmiddelsekvens (3‘). 1 2 3 4 5 6

Fig. 10 viser skematisk, hvorledes en enkelt overkryds 2 ning indfører den intermediære kloningsvektor ifølge 3 fig. 9 til acceptor Ti-plasmidet (B). I dette tilfælde 4 sikrer selektion for antibiotikumresistensmarkøren i 5 kloningsmiddelsekvensen {3’) i den intermediære klonings- 6 vektor, at man kan finde et hybrid Ti-plasmid, som er resultatet af en kointegration mellem de to plasmider. Et 29 DK 174310 B1 hybrid Ti-plasmid dannes med genet, som har interesse, anbragt mellem grænsesekvenserne (1) og (2) . Det således dannede hybridplasmid indeholder ikke i dets T-område en sekvens, som er en direkte gentagelse, som f.eks. sekvenserne (3) og 5 (31), i hybrid Ti-plasmidet ifølge fig. 4, hvorved man und går eventuelle instabilitetsproblemer med hybridvektoren eller med det transformerede DNA i plantecellegenomet som følge af intramolekulær rekombination.

10 Laboratorieforsøg viser endvidere, at det til dannelsen af den intermediære vektor i fig. 9 ikke er essentielt at have begge grænsesekvenser 1 og 2. Det er tilstrækkeligt men essentielt at have mindst den højre grænsesekvens (2) {se fig. 1 og fig. 9), for at opnås integration af den 15 ønskede DNA-sekvens i plantegenomet.

Kendsskab til restriktionsendonucleaseplanerne i Ti-plas-miderne i Agrobacterium, f.eks. nopalin eller octopin Tiplasmider (Depicker et al.. Plasmid 3 (1980), 193-211 og 20 De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 249-253), samt kendskabet til restriktionsfragmenterne, som indeholder T-DNA-grænse-områderne (Zambryski et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 361-370 og De Beuckeleer et al., Mol. Gen. Genet. 183 (1981), 283-288), gør det nu muligt at danne acceptor Ti-plasmider.

25 Der kræves blot, at man kan gennemføre konventionelle rekom-binant DNA-operationer og grundlæggende bakteriegenetiske manipulationer. Der tilvejebringes de beskrevne acceptor Ti-plasmider, som kan anvendes til dannelsen af hybrid Ti-plasmid-vektorer. Endvidere er disse acceptor Ti-plasmider 30 udformet til at udgøre en del af en fremgangsmåde til indføring af gener i plantecellegenomet.

De efterfølgende eksempler tjener til yderligere illustration af acceptor Ti-plasmiderne, de intermediære klonings-35 vektorer, hybrid Ti-plasmidvektorerne og vektorkomposi-tionerne og til at vise effektiviteten af vektorkomposi- i 30 DK 174310 B1 tionerne ved tilvejebringelse af transformerede planteceller og planter, som udviser kopiering af det eller de fremmede gener, som er integreret i plantecellegenomet.

5 Eksempel 1

Dannelse af acceptor Ti-plasmid pGV3850 (type A)

Udgangsstammer og -plasmider:

Agrobacterium tumefaciens (rifampicin-resistent stamme C58C1 og chloramphenicol-erythromycin-resistent stamme C58C1 afledt af vildtype Agrobacterium) .

Ti-plasmid = pGV3839

Plasmid ifølge fig. 11 = pAcgB

1ς

Ti-plasmidet pGV3839 dannes ud fra et nopalinpl'asmid pTiC58trac (pGV3100, Holsters et al., Plasmid 3 (1980), 212-230). Det indeholder en sletningssubstitutionsmutation nær centret af T-området. Smal-fragmentet 24 inden i Hindlll-fragment 19 (Depicker et al., Plasmid 3 (1980), 192-211) 20 er blevet ombyttet med et Hindll-fragment af pKC7 (Rao et al., Gene 7 (1979), 79-82), som indeholder apt (acetyl-jahosphotranferase) genet af Tn5. Dette gen koder for resistens overfor aminoglycosiderne neomycin og kanamycin.

I fig. 12 er vist et restriktionskort for T-området af 25 pGV 3839.

Plasmidet pAcgB er en indsætningsdel af AcgB i pBR322, som kun indeholder grænserne af T-DNA’et (se fig. 11) . Grænserne er defineret som enderne af T-DNA'et, og disse 30 områder spiller en rolle for den stabile integrering af T-DNA’et i plantecellegenomet. Oprindelsen og analysen af denne klon er beskrevet i detaljer af Zambryski et al., Science 209 (1980), 1385-1391. Denne klon dannes ved at reisolere dele af T-DNA'et fra transformeret tobaks-DNA. pAcgB indeholder forbindelsesstedet for to T-DNA-kopier, som er anbragt efter hinanden, således at det indeholder 31 DK 174310 B1 de venstre og højre grænser af T-DNA'et. Desuden indeholder pAcgB nopalinsyntetasegenet, da disse genetiske informationskort ligger meget tæt ved den højre T-DNA-grænse. Plasmid pAcgB anvendes til dannelsen af et "A-5 lignende" acceptor Ti-plasmid, pGV3850. Fig. 6 viser de involverede strukturer, og fig. 13 viser mere nøjagtigt de DNA-områder, som er involveret i dobbeltoverkrydsning-gerne, der fører til pGV3850.

10 Det beskrevne plasmid pAcgB bærer et ColE1-specifikt bomområde i pBR322-delen og kan mobiliseres fra Escherichia coli til Agrobacterium ved anvendelse af hjælperplasmiderne R64drdll og pGJ28. Plasmiderne R64drdll og pGJ28 indeholdt i Escherichia coli indføres i Escherichia coli-stammen, 15 som bærer pAcgB, ved konjugation. Transkonjuganter selekteres som ampicillinresistente kolonier (fra pBR322-se-kvenserne i pAcgB), som streptomycinresistente kolonier (fra R64drdll) og som kanamycinresistente kolonier (fra pGJ28).

20

Escherichia coli-stammen, som bærer alle tre plasmider, konjugeres til Agrobacteriumstammen C58C1, som er rifam-picin-resistent, og som indeholder Ti-plasmidet PGV3839. Ampicillinresistenten hos pBR322 anvendes til at selektere 25 for den første enkelte overkrydsning med nopalin Ti'-plas-midet. Den eneste måde, hvorpå ampicillinresistenten kan stabiliseres i Agrobacterium, er en overkrydsning efter homolog rekombination med pGV3839 gennem et af homolog!-områderne nær grænserne for T-området. Ved en anden over-30 krydsning gennem det andet homologiområde ombyttes den centrale del af T-området i pGV3839 inklusive apt-genet (kanamycinresistens) med pBR322-sekvenserne i klonen pAcgB. Anden rekombinanter er således ampicillinresistente og kanamycinfølsomine. For at forøge sandsynligheden for iso-35 lering af en anden rekombinant, konjugeres den rifampi-cinresistente Agrobacterium, som bærer den første rekom- 32 DK 174310 B1 binant (pAcgB:pGV3839) med en anden chloramphenicol/erythro-mycin-resistent Agrobacteriumstamme uden et Ti-plasmid. På denne måde kan der opnås en chloramphenicol/erythromycin-resistent Agrobacterium pGV3850, som er ampicillinresistent 5 og kanamycinfølsom, med en hyppighed på ca. en ud af 600 kolonier.

Der findes naturligvis andre Ti-plasmider, som kan anvendes til acceptor Ti-plasmider af pGV3850-typen. Ethvert Ti-10 plasmid, som bærer et selekterbart markørgen nær centret i j T-området, kan anvendes som recipient. Endvidere kan et pAcgB-lignende plasmid dannes ved at indsætte T-område-grænsefragmenterne i pBR322 på en sådan måde, at pBR322-sekvenserne ligger mellem det venstre grænsefragment og 15 det højre grænsefragment i orienteringen venstre grænse-fragment-pBR322-højre grænsefragment. Eksempelvis er de venstre og højre grænsefragmenter af nopalin Ti-plasmidet henholdsvis HindIII-fragment 10 og 23 (Depicker et al.,

Plasmid 3 (1980), 193-211).

20

En enkelt overkrydsning vil indføre en intermediær kloningsvektor indeholdende et vilkårligt gen, som har interesse, som indsættes i pBR322 (eller derivater deraf) til det modificerede T-DNA-område i pGV3850. Det eneste 25 krav er, at DNA'et, som skal indføres, indeholder et yderligere resistensmarkørgen udover de, som allerede findes i pBR322 til anvendelse til selektering for overføringen af den intermediære kloningsvektor fra Escherichia coli til Agrobacterium. Denne resistenemarkør kah være inde- p 30 holdt enten i pBR-sekvenserne (såsom Cm for pBR325 p eller Km for pKC7) eller i det DNA, som skal afprøves i plantecellen. I acceptor Ti-plasmidet pGV3850 kan

O

endvidere Ap -genet pBR322 ombyttes med et andet resistens-

o R

markørgen, såsom Km . På denne måde kan selv pBR322-hol- p 35 dige intermediære kloningsvektorer, som er Ap / mobiliseres direkte til dette pGV3850-lignende acceptor Ti-plasmid.

33 DK 174310 B1

En yderligere fordel ved acceptor Ti-plasmidet af pGV3850-typen er, at det ikke danner tumorer i transformerede planteceller. Celler, som er blevet "transformeret" ved hjalp af pGV3850, kan let screenes fra ikke-transforme-5 rede celler ved at analysere for tilstedeværelsen af nopa-lin, da det afkortede T-DNA-område af pGV3850 stadig indeholder genet, som koder for nopalinsyntase. Hvis den inter-mediære kloningsvektor, som er kointegreret til acceptor Ti-plasmidet pGV3850, indeholder et markørgen, kan det ; X0 naturligvis også direkte screenes eller selekteres.

Foruden indsætning af definerede intermediære kloningsvektorer indeholdende en pBR322-sekvens ved en enkelt overkrydsning i acceptor Ti-plasmidet pGV3850, kan dette X5 acceptor Ti-plasmid også anvendes som recipient for klonede grupper af DNA i pBR322 eller derivater deraf i et forsøg af "shotgun"-typen. Den totale population af hybrid-plasmidvektorer i Agrobacterium kan anvendes til at inficere planteceller, hvorefter der screenes for kopiering 20 af et eller flere selekterbare gener, som har interesse.

Man kan f.eks. let selektere for gener, som koder for aminosyresyntese, ved at overføre den samlede gruppe til planteceller, som ikke danner den valgte aminosyre.

25 Acceptor Ti-plasmidet pGV3850 har to phenotypiske karakteristika: (1) Det kan ikke danne tumorer og (2) det er i stand til at syntetisere nopalin, hvis der sker T-DNA-overføring til plantecellegenomet. Der foretages således forskellige 30 forsøg for at kontrollere disse karakteristika i forskellige plantevæv inficeret med Agrobacterium-holdig pGV3850.

a) Forsøg med kartoffel- og gulerodsskiver.

Inokulering af kartoffel- og gulerodsskiver med acceptor 35 Ti-plasmidet pGV3850 bevirker dannelse af en lille mængde callus-væv. Dette væv testes for tilstedeværelsen af I .

34 DK 174310 B1 nopalin, og testen er positiv. Det er interessant, at denne mutant er i stand til at danne lidt callus-væv. Det kan imidlertid kun dannes, hvis skiverne dyrkes i medier, som indeholder lave koncentrationer af både auxiner og 5 cytoquininer.

b) Inokulering af hele planter med acceptor Ti-plasmid PGV3850.

Tobaks- og petuniakimplanter, som dyrkes på steril agar-10 medium (uden hormoner), inokuleres med pGV3850. Lidt vævs-vækst kan kun konstateres efter flere måneders forløb (normalt påvises "vildtype" tumorer efter 2 uger). Dette væv vokser ikke på hormonfri medier, men kan formeres yderligere som steril vævskultur på medier, som indeholder både 15 auxin og cytoquinin. Dette væv viser sig også at være nopa-lin-positivt.

c) Da pGV3850 "transformerede1' celler endvidere ikke er tumoragtige, kan disse celler regenere i normale planter, 20 som i genomet stadig indeholder det overførte DNA-segment. Normale planter kan fås ved dyrkning af de transformerede celler på konventionelle regenereringsmedier (se også eksempel 5) . 1 2 3 4 5 6 35

Por at vise anvendeligheden af pGV3850 som et acceptor- 2 plasmid gennemføres følgende forsøg. En intermediær klo 3 ningsvektor indeholdende oncogene funktioner af octopin 4 T-DNA'et i pBR325 rekombineres til Agrobacterium indehol 5 dende pGV3850. Det dannede hybrid Ti-plasmid i Agrobacte- 6 rium dannet ved en enkelt overkrydsning inokuleres til sårede tobaksplanter. Efter ca. to ugers forløb udvikles tumorvæv. Dette viser, at det tumorinducerende DNA er genindført i pGV3850 og er kopieret rigtigt i transformerede planteceller.

35 DK 174310 B1

Eksempel 2

Dannelse af intermediære kloningsvektorer pGV700 og PGV750_

En oversigt over konstruktionerne er vist skematisk i 5 fig- 14. HindIII-fragment 1, som repræsenterer den højre del af TL-DNA af octopin Ti-plasmidet B6S3, og som findes i pGV0201 (De Vos et al.. Plasmid 6 (1981), 249-253), indsættes først i HindiIl-stedet i bred-værts-område-vekto-ren pGVH22 (Leemanns et al., Gene 19 (1982), 361-364), 10 Rekombinantplasmidet pGV0201 indeholder Hindlll-fragmen-tet 1 indsat i det entydige Hindlll-sted i multikopivek-toren pBR322 (Bolivar et al.. Gene 2 (1977) 95-113). pGV0201 og pGV1122 DNA fremstilles som beskrevet af Betlach et al.,

Fed. Proc. 35 (1976), 2037-2043. 2 yg pGV0201 DNA nedbry-15 des fuldstændigt med 2:enheder Hindlll (alle restriktionsenzymer er fra firmaet Boehringer Mannheim) i 1 time ved 37°C i et slutrumfang på 20 yl, Inkuteringspufferen er beskrevet af O'Farrell et al., Mol. Gen. Genet 179 (1980), 421-435. 2 yg pGVll22 DNA nedbrydes fuldstændigt med Hindlll 2q under de samme betingelser.

0,1 yg Hindlll nedbrudt pGV0201 bindes til 0,05 yg Hindlll-nedbrudt pGV1122 med 0,02 enheder T4-ligase (Boehringer Mannheim) i et slutrumfang på 20 yl. Den anvendte inkuberings-puffer og betingelserne er anbefalet af producenten (brochure "T4 ligase", Boehringer Mannheim, august 1980, nr. 10.M.880.486). Der foretages transformering af ligateringsblandingen til kompetente Escherichia coli K514 hsr hsm+ celler (Colson et al., Genetics 52 (1965), 1043-1050) 30 som beskrevet af Dagert og Ehrlich, Gene 6 (1980), 23-28.

Celler anbringes på plader med LB-medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972), Cold Spring Harbor Laboratory, New York) tilsat strptomycin (20 yg/ml) og spectinomycin (50 yg/ml). Transformanfcer indeholdende 35 rekombinantplasmider screenes for tetracyclinfølsomhed (10 yg/ml) som følge af den indsatte inaktivering af genet, 36 DK 174310 B1 der koder for tetracyclinresistens (Leemanns et al.7 Gene 19 (1982), 361-364). Streptomycinresistente-og spectimycin- resistente samt tetracyclinfølsomme kolonier karakteriseres fysisk. Der foretages DNA=præpareringer i mikroskala 5 ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Klein et al.,

Plasmid 3 (1980), 88-91 Orienteringen af Hindlll-fragmen-tet 1 i Hindlll-stedet i pGVH22 bestemmes ved nedbrydning med Sall. Nedbrydning (der anvendes betingelser ifølge O'Farrell et al·., Mol. Gen. Genet. 179 (1980), 421-435) 10 af rekombinantplasmider giver 2 fragmenter efter agarosegel-elektroforese. X α-orienteringen er der fragmenter på 0,77 kb og 22,76 kb, hvorimod der i ^-orienteringen er fragmenter på 10,33 kb og 13,20 kb. Et rekombinantplasmid med a-orienteringen anvendes til efterfølgende kloning og beteg-15 nes pGV1168.

Et BglII-SalI-fragment indeholdende den venstre del af TL-DNA'et (inklusive den venstre grænsesekvens) indføres i pGVll68, spaltet med Bglll-SalX. Dette fragment er darinet fra 2o rekombinantplasmidet pGVOl53 (De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 249-253), som indeholder BamHI-fragment 8, fra T-området af pTiB6S3, indsat i vektoren pBR322. pGV0153 og pGV1168 DNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Betlach et al., (Fed. Proc. 35 (,976), 2037-2043). 10 ug 25 pGV0153 DNA nedbrydes fuldstændigt med 10 enheder Bglll og 10 enheder Sall i 1 time ved 37°C i et slutrumfang på 100 pi. Nedbrydningsblandingen sættes på en præparativ 0,8% agarose-gel. 2,14 kb BlgII-SalI-fragmentet udvindes fradenne gel ved elektroeluering som beskrevet af Allington et al., Anal.

30 Biochim. 85 (1978), 188-196. 2 ug pGV1168 DNA nedbrydes fuldstændigt med 2 enheder Bglll og 2 enheder Sall. 0,1 ug BglII-SalI-f ragment DNA bindes til 0,02 ug BglHI-Sall-nedbrudt pGVH68 med 0,02 enheder T4 DNA-ligase i et slutrumfang på 20 μΐ. Ligateringsblandingen transforme-35 res til kompetente Escherichia coli K514 hsr"' hsm+ celler (Dagert og Ehrlich, Gene 6 (1980) 23-28). Cellerne anbrin- 37 DK 174310 B1 ges på plader med LB-medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972), Cold Spring Harbor Laboratory,

New York), som er tilsat streptomycin (20 ug/ml) og spec- tinomycin (50 yg/ml).

5

Der fremstilles DNA-præparater i mikroskala (Klein et al.. Plasmid 3 (1980), 88-91) ud fra streptomycinresistente og spectinomycinresistente transformanter. Rekombinant-plasmider, hvori 2,14-kb-BglII-SalI-fragmentet er indsat 10 i Bglll-Sall-nedbrudt pGV1168,.-identificeres ved Bglll-Sall-nedbrydning, og der fås to fragmenter på henholdsvis 2.,14 kb og 21,82 kb. Et plasmid med et nedbrydningsmønster svarende til disse molekylvægte (2,14 kb og 21,82 kb) anvendes til yderligere kloning og betegnes pGV1171. Et 12,65-kb-frag-15 ment fra pGVH71 indeholder de højre og venstre TL-DNA ' grænsesekvenser (De Beuckeleer et al., in Proceedings IVth International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, Μ.

Ridé (ed.) (1978), I.N.R.A., Angers, 115-126), samt gener, som tillader oncogen formering (Leemanns et al-, EMBO J.

20 (1982), 147-152). Dette Hindlll-fragment indsættes i plas- midet pBR325 (Bolivat, Gene 4 (1978), 121-136). pGV1171 og pBR325 fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Betlach et al. , Fed. Proc. 35 (1976), 2037-2043· 2 ug af hver DNA nedbrydes fuldstændigt med to enheder HindiII i 25 1 time ved 37°C (inkuberingspuffer beskrevet af O1Farrell et al., Mol. Gen. Genet. 179 (1980), 421-435)- 0,1 ug Hindlll-nedbrudt pGVH71 bindes til 0,05 ug pBR32f> lineariseret med HindllT, med 0,02 enheder T4 DNA-ligase. Transformering af ligateringsblandingen til kompetente Escherichia coli K514 hsr hsm celler udføres som beskrevet af Dagert og Ehrlich,

Gene 6 (1980), 23-28. Cellerne anbringes på plader med LB-medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972),

Cold Spring Harbor Laboratory, New York), som er tilsat carbenicillin (100 ug/ml). Carbenicillinresistente kloner 35 screenes for følsomhed overfor tetracyclin (10 ug/ml), som følge af indsat inaktivering af genet, som koder for tetra- 38 DK 174310 B1 cyclinresistens (Bolivar, Gene 4 (1978) 121-136). Carbeni-cillinresistente og tetracyclinfølsomme kloner karakteriseres typisk ved restriktionsenzymnedbrydning af DNA fremstillet ud fra disse kloner ved anvendelse af mikroskala-5 teknikken (Klein et al., Plasmid 3 (1980), 88-91). BamHl-nedbrydning giver 4 DNA-fragmenter: i α-orienteringen dannes fragmenter på 0,98 kb, 4,71 kb, 5,98 kb og 7,02 kb, hvorimod β-orienteringen giver fragmenter 0,98 kb, 4,71 kb, 1,71 kb og 11,20 kb. Der fås et rekombinantplasmid, som ; 10 betegnes pGV700, svarende til α-orienteringen, og dette plasmid anvendes til yderligere forsøg.

pGV750 er af ledt af pGV700 ved at-ombytte et 2,81 kb BamHI-Hpal-fragment, som koder for kanamycinresistens, med et 15 3,49 kb-Bglll-Smal-fragment, som koder for funktioner, der er vigtige for oncogenisiteten, inde i TL-området indsat 1 pGV700. BamHI-Hpal-fragmentet, som koder for kanamycinresistens, fås fra Tn5 (Berg et al-, Proc.Natl. Acad.

Sci USA 72 (1975), 3628-3632). Fremstilling af λ:: Tn5 20 foretages som beskrevet af Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972), Cold Spring Harbor Laboratory, New York· pGV70Q DNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Betlach et al. , (Fed. Proc. 35 (1976), 2037-2043).

2 yg pGV700 DNA nedbrydes fuldstændigt med 2 enheder Bgll 25 og 2 enheder Smal. 2 yg λ:: Tn5 DNA nedbrydes fuldstændigt med 2 enheder BamHI og 2 enheder Hpal. 1 yg BamHI-Hpal nedbrudt λ:: Tn5 bindes til 0,2 yg Bglll-Smal-nedbrudt pGV700 med 0,5 enheder T4 DNA-ligase i et slutrumfang på 10 yl (der anvendes de af producenten anbefalede betingelser).

3q Liqateringsblandingen transformeres til kompetente Escherichia coli K514 hsr hsm+ celler (Dagert og Ehrlich, Gene 6 (1980) 23-28). Cellerne anbringes på plader med LB-medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972) , Cold Spring Harbor Laboratory, New York), som er tilsat carbeni-cillin (100 yg/ml) og kanamycin (25 yg/ml). Cb og Km klo- 39 DK 174310 B1 ner karakteriseres fysisk ved restriktionsenzymanalyse af DNA fremstillet i overensstemmelse med mikroskala-teknikken (Klein et al., Plasmid 3 (1980), 88-91). Bglll/

BamHI dobbeltnedbrydninger af dette DNA fås 3 fragmenter 5 på 3,94 kb, 5,89 kb og 8,09 kb, hvorimod HindiIl-nedbrydninger giver 3 fragmenter på 2,68 kb, 5,99 kb og 9,25 kb.

Et plasmid, som viser disse nedbrydningsmønstre, betegnes pGV750 og er illustreret skematisk i fig. 17.

pGV700 og pGV750 er to forskellige intermediære klonings-10 vektorer, som indeholder de venstre og højre grænsesekvenser af TL-DNA af octopin Ti-plasmidet pTIB6S3.

Endvidere er det indre T**område slettet i forskellige udstrækninger i hver af de to plasmider. pGV700 indeholder et afkortet T-område med genetisk information for octo-15 pinsyntetase (transkript 3) og 3 andre produkter, 4, 6a og 6b (se Willmitzer et al., EMBO J. 1 (1982), 139-146, angående en beskrivelse af T-områdeprodukter). Kombinationen af disse tre produkter (4, 6a og 6b) vil fremkalde skuddannelse i transformerede planter. pGV750 indeholder 20 endnu mindre af T-området, dvs. kun octopinsyntetasegenet. Informationen for produkterne 4, 6a og 6b er blevet ombyttet med antibiotikumresistensmarkørgenet, som koder for kanamycin- (neomycin-)resistens.

pGV700 og pGV75Q er eksempler på intermediære kloningsvek-25 torer, som kan anvendes ved acceptor Ti-plasmider af B-typen (se fig. 8 og eksempel 3 nedenfor). Disse vektorer er delvis analoge med den vektor, som er vist i fig. 9, bortset fra at de ikke indeholder et gen, som har interesse. Et gen, som har interesse, kan let indsættes i 30 disse vektorer, da de indeholder enkeltrestriktionsendo-nucleasesteder for kloning indenfor de modificerede T-områder (se fig. 14 og 15).

40 DK 174310 B1

Eksempel 3

Dannelse af acceptor Ti-plasmid pGV2260 (type B)

Udgangsstammer og -plasmider:

Agrobacterium tumefaciens (rifampicinresistent.stamme C58C1 5 og erythromycin-chloramphenicol-resistent stamme C58C1 afledt af vildtype Agrobacterium) .

Ti-plasmid - pGV2217

Intermediær vektor (fig. 16) = pGV745

Dannelsen af Ti-plasmidet pGV2217 er beskrevet detaljeret 10 af Leemans: et al., EMBOJ 1 (1982), 147-152'· Det-inde holder en sletningssubstitutionsmutation af-hele TL-områ-det i octopin Ti-plasmidet: BamHI-fragmenterne 8, 30b, j 28, 17a og det venstre 3,76 kb BamHI-EcoRI-fragment af

BamHI-fragmentet 2 (De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 249-253) 15 er blevet ombyttet med et EcoRI-BamHI-fragment af pKC7 (Rao & Rogers, Gene 7 (1979), 79-82), som indeholder apt (acetylphosphotransferase)-genet af Tn5. Dette gen koder for resistens overfor aminoglycosiderne neomycin og kana-mycin. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Dannelsen af den intermediære vektor pGV745 er vist skema 2 tisk i fig. 16 og beskrives på følgende måde. Rekombinant- 3 plasmidet pGV713 afledes af octopin Ti-plasmidsubklonen 4 pGV0219 (De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 249-253), som 5 indeholder HindIII-fragmenter 14, 18c, 22e og 38c i a- 6 orientering. pGV0219 DNA nedbrydes fuldstændigt med BamHI, 7 hvorefter der foretages binding under betingelser, som frem 8 mer selvbinding af plasmidet (slutkoncentration af DNA ; 9 i ligateringsblanding < 1 ug DNA/ml). Transformanter 10 selekteres for ampicillinresistens og karakteriseres 11 fysisk ved hjælp af restriktionsenzymnedbrydning. En 12 klon, som ikke længere indeholder 6,5 kb BamHI-fragmentet 13 i pGV0219, isoleres og betegnes pGV713. Denne klon pGV713 14 anvendes til efterfølgende kloning (se nedenfor). Rekombi- 15 nantplasmidet pGV738 afledes af pGV0120 (De Vos et al., 16

Plasmid 6 (1981), 249-253), som indeholder BamHI-fragmen-t 2. pGV0120 DNA nedbrydes med EcoRI og selvbindes (som ovenfor ved dannelsen af pGV713) . Transformanter selekte- i DK 174310 B1 j 41 res for ampicillinresistens og analyseres ved restriktionsenzymnedbrydning. En klon, hvori EcoRI-fragmenter 20, 12 og et 2,95 kb EcoRI-fragment indeholdende dele af EcoRl-fragment 19a og dele af pBR322 er slettede, anvendes 5 til yderligere kloning og betegnes pGV738. Dette plasmid indeholder stadig et 5,65 kb EcoRI-BamHI-fragment fra den højre del af BamHI-fragment 2 (De Vos et al.,

Plasmid 6 (1981), 249-253).

Derefter nedbrydes pGV713 DMA med Hindlll og BamHI, og ned-10 brydningsblandingen anbringes på en præparativ agarosegel.

Efter elektroforese renses 2,30 kb Hindlll-BamHI-fragmentet indeholdt i pGV713 ved elektroeluering (som beskrevet af Allington et al., Anal. Biochem. 85 (1975), 188-196). Dette fragment bindes til pGV738, som er nedbrudt 15 fuldstændigt med Hindlll og BamHI. Effter transformering karakteriseres ampicillinresistente kloner fysisk ved hjælp af restriktionsenzymnedbrydning. Por eksempel skulle EcoRI-BamHI-nedbrydning give 2 fragmenter på henholdsvis 3,98 kb (= vektordel) og 7,95 kb (= indsat del). Et re-20 kombinantplasmid med disse egenskaber betegnes pGV745 og anvendes som intermediær vektor til dannelsen af acceptor Ti-plasmidet pGV2260.

Plasmidet pGV745 indeholder et ColEl-specifikt bom-sted i pBR322-delen og kan mobiliseres fra Escherichia coli 25 til Agrobacterium ved anvendelse af hjælperplasmiderne R64drdll og pGJ28, som beskrevet i eksempel 1 (dannelse af acceptor Ti-plasmid pGV3850).

pGV745 mobiliseres til Agrobacterium-stamme C58C1, som er rifampicinresistent og indeholder Ti-plasmidet pGV2217 .

30 Den første overkrydsning selekteres ved anvendelse af ampicillinresistensen hos pBR322 på samme måde som beskrevet i eksempel 1 (dannelsen af acceptor Ti-plasmidet pGV3850).Ved en anden overkrydsning ombyttes sletnings-substitutionsmutationen i pGV2217 med pBR322-sekvenserne 35 af plasmidet pGV745. Anden rekombinanter udtages ved direkte screening for de ampicillinresistente transkonjuganter, 42 DK 174310 B1 som dannes ved kointegrering af pGV745 med pGV2217, for tab af kanamycinresistens. På denne måde fås en rifarapi-cin Agrobacterium-stamme C58C1/ som indeholder pGV2260 (ampicillinresistent, kanamycinfølsom) .

S

Dette Ti-plasmid pGV2260 vil blive anvendt som et accep-torplasmid {type B) for intermediære kloningsvektorer af pGV700- eller pGV750-typen. De er sammensat af (1) et DNA-fragment, som bærer ampicillinresistensgenet, 10 kopieringsområdet og bom-stedet i pBR322, (2) et DNA-fragment indeholdende de venstre og højre grænsesekvenser af ; TL-DNA'et og en yderligere resistensmarkør Ud over de, som allerede findes i pBR322, som vil tillade gentisk selektion for overførslen af den intermediære klonings-15 vektor fra Escherichia coli til Agrobacterium samt for dets kointegrering i acceptor Ti-plasmidet pGV2260.

Det har eksempelvis været muligt at vise, at Agrobacterium, som indeholder et kointegrat mellem pGV2260 og pGV700, 20 kan overføre de forventede DNA-sekvenser (de sekvenser, som findes mellem T-DNA-grænserne) til plantecellegeno-mer. De transformerede planteceller udviser den forventede phenotype, dvs. tumorer, som danner skud, forudsat at pGV700 indeholder den genetiske information for tre 25 produkter (4, 6a, 6b, jfr. Willmitzer et al., EMBO J. 1 (1982), 139-146). På denne måde er det vist, at et acceptor Ti-plasmid af B-typen er i stand til at overføre DNA til planteceller, når det anvendes som et kointegrat med en intermediær kloningsvektor af den type, som er illu- · 30 streret i fig. 9, og som er beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 4

Dannelse af en intermediær kloningsvektor indeholdende et gen, som skal kopieres i planter

Hidtil har indsættelsen af hele gener i mere- eller mindre tilfælde stillinger i T-området i Ti-plasmider ikke bevirket kopiering af den fremmede sekvens efter overføring til 43 DK 174310 B1 plantegenomet. Kodningsområdet for et eller flere vilkårlige fremmede interessante gener kan bindes til transkriptions-initierings- og -termineringssignaler, som vides at være funktionelle i plantecellen. Anvendeligheden af denne frem-5 gangsmåde demonstreres ved forsøg, som involverer de DNA-sekvenser, som koder for nopalinsyntasegenet. Hele sekvensen af dette gen og den nøjagtige start og afbrydelse af tran-skriptionen er kendt (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet.

1 (1982), 561-574). Proteinkodningsområdet af et'vilkårligt 10 fremmed gen kan indsættes i nabostilling til nos-promotoren.

Som et eksempel på en fremmed gensekvens indsættes kodnings-området for octopinsynt asegenet (De Greve et al. , J. Mol.

Appl. Genet. 1 (1982), 499-512) i nabostilling til nos-pro-motoren. Denne konstruktion mobiliseres til et acceptor Ti-15 plasmid og anvendes til inficering af planter. Det dannede turmorvæv afprøves for nærværelse af octopin, og prøven er positiv.

Dannelsen af den intermedia»re kloningsvektor indeholdende 20 den uvirkelige nopalinpromotor: octopinsyntasestruktur-genet er vist og beskrevet i fig. 18-20.

Kort sagt konstrueres restriktionsfragmentet HindIII-23 indeholdende nos-genet in vitro til fjernelse af største-25 parten af nos-kodningssekvensen og under bibeholdelse af nos-promotoren i nabostilling til restriktionsendonuclease-stedet BamHI (fig. 18). 10 ug pGV0422 (et pBR322-derivat bærende HindIII-23-fragmentet, som indeholder det fuldstændige nos-gen, (Depicker et al., Plasmid (1980), 193-211) ned-30 brydes med Sau3A, og 350 bp-fragmentet, som bærer nospromotoren, isoleres fra en præparativ 5%'s polyacrylamidgel. Promotorfragmentet bindes til Bglll-spaltet pKC7 (Rao et al., Gene 7 (1979), 79-82), som forinden er behandlet med bakteriel basephosphatase (BAP) til fjernelse 35 af 5'-terminale phosphatgrupper. 20 ug af det dannede plasmid (pLGV13) nedbrydes med Bglll og behandles med 7 enheder Bal31 exonuclease (Biolabs, New England) i 4-10 minutter i 400 ul 12 mM MgCl2, 12 mM CalCl2, 0,6 M NaCl, 44 DK 174310 B1 1 mM EDTA og 20 mM Tris-HCl, pH-værdi 8,0, ved 30°C.

I løbet af dette tidsrum fjernes ca. 20-50 bp DNA. De Bal31-behandlede molekyler nedbrydes med BamHI og inkuberes med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase og alle fire des-5 oxynucleosidtriphosphater (i 10 mM hver) til udfyldning i enderne. Plasmiderne screenes for et regenereret BamHI-sted afledt af bindingen af en udfyldt BamHI-ende og enden af Bal31-sletningen. Størrelsen af BamHI-SacII-fragmentet af adskillige kandidater bedømmes i en 6%’s i 10 urinstof-polyacrylamidgel, og nucleotidsekvenserne for kandidaterne med størrelser mellem 200-280 nucleoti-der bestemmes. Klonen pLGV81 indeholdende SacII-BamHI-fragmentet på 203 bp indeholdende promotoren anvendes til at ombytte SacII-BamHI-fragmentet i nos-genet i 15 pGV0422. Den færdige promotorvektor betegnes pLGV2381.

Alle rekombinantplasmiderne selekteres ved transformering i af Escherichia coli-stamme HBL01.

Plasmidvektoren indeholdende den dannede nos-promotor nedbrydes med BamHI, og kodnincjssekvensen for ocs, som 20 er indeholdt i et BamHI-fragment, indsættes på dette sted. ocs-kodningssekvensen fremstilles også in vitro til omgivelse med BamHI-restriktionsendonucleasestedet som beskrevet i fig. 19. 10 ug BamHI-fragment 17a af octopin Ti-plasmidet B6S3 (De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 249-253) 25 nedbrydes med BamHI og Smal, og fragmentet indeholdende ocs-kodningssekvensen isoleres fra en 1% agarosegel og bindes til det store BamHI-PvuII-fragment af pBR322. 20 ug af det dannede plasmid pAGV828 nedbrydes med BamHI, behandles med exonucleasen Bal31 som beskrevet i fig. 18, hvor-30 efter den nedbrydes med Hindlll, og enderne udfyldes og bindes til sig selv. Størrelserne af 8al31-sletningerne bestemmes i en 6% polyacrylamidgel. Nucleotidsekvenserne for flere kandidater bestemmes, og en kandidat med kun 7 bp tilbage af den 5'-ikketranslaterede ledersekvens væl-35 ges til yderligere anvendelse (pOCSA). For at omgive OCS-sekvensen med BamHl-steder, udfyldes Clal-Rsal-fragmentet, hvorpå det subklones til Ball-stedet af pLC236 (Remaut et al.# Gene 15 (1981), 81-93). Det dannede plasmid pAGV40 45 DK 174310 B1 nedbrydes med BamHI, og fragmentet, som bærer ocs-sekven-sen, isoleres ved elektroeluering fra en præparativ 1%'s agarosegel og bindes til pLGV2381, som tidligere er spaltet med BamHI, og behandles med BAP (bakteriebasephospha-5 tase). Indsætningen af ocs-sekvensen i pLGV2381 opnås i begge orienteringer (pNO-1 og pNO-2).

Nucleotidsekvenserne, som viser det nøjagtige forbindelsessted i nos:ocs-fusionen, er vist i fig. 20.

Endvidere anvendes plasmidvektoren indeholdende den· danne-10 de nos-pcomotor til indføring af DNA fra plasmidet R67, som koder for enzymet dihydrofolatreduktase. Kodningssekvensen indeholde dihydrofolatreduktasegenet findes på et BamHI-fragment som beskrevet af O'Hare et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527-1531, og det kan 15 således let indsættes i nos-promotorvektoren indeholdende BamHI-stedet i nabostilling til promotorområdet som beskrevet ovenfor. Dette gen er et eksempel på et selekter-bart markørgen (se f.eks. fig. 2, 3, 4, 5 og 7), da det ved kopiering tilvejebringer resistens mod antibiotikumet 20 methotrexat. Når denne intermediære kloningsvektor mobiliseres til en Agrobacterium·indeholdende et vildtype nopalinacceptor Ti-plasmid, indtræder der en enkelt overkrydsning, og der dannes en hybrid Ti-plasmidvektor. Vektorkompositionen anvendes til inficering af planter. Det 25 dannede tumorvæv er i stand til vedvarende vækst i nærværelse af 0,5 ug/ml methotrexat.

Dannelsen af de intermediære kloningsvektorer indeholdende ocs- og dihydrofolatreduktasekodningsområderne bagved den ovenfor beskrevne nos-promotor og deres overføring 30 og kopiering i transformerede planteceller efter kointegrering med Ti-plasmidet af Agrobacterium er bevis for at fremmede gener kan overføres og kopieres i planteceller.

46 DK 174310 B1

Eksempel 5

Isolering af planteceller og planter indeholdende det eller de ønskede gener indsat i kromosomerne Der fremstilles planteceller og hele planter transformeret 5 med non-oncogene acceptor Ti-plasmidderivater (f.eks.

pGV3850) under anvendelse af en af følgende tre fremgangsmåder: (1) Inokulering in vivo af hele planter efterfulgt af dyrkning in vitro på medier, som tillader regenerering af skud.

10 (2) Koinficering in vivo af hele planter i nærværelse af andre Agrobacteria-stammer, som direkte inducerer skud I ved sårstedet.

(3) Kokultivering in vitro af enkelte plantecelleproto-plaster.

i , 15 Hver af disse metoder beskrives nærmere i det følgende.

Den første metode er baseret på en modifikation af de metoder, der sædvanligvis anvendes til at fremkalde infektion af helt plantevæv med vildtype Agrobacterium-stammer, som resulterer i dannelsen af krongallevæv. Da pGV3850 er et 20 ikke-tumorproducerende (nononcogent) Agrobacterium-deri-vat, konstateres der ikke tumorvækst ved infektionsstedet.

Hvis det inficerede væv imidlertid fjernes og dyrkes i vævskulturer, kan der let opnås transformeret væv. Efter en begyndelsesdyrkningsperiode (for simpelthen at forøge 25 massen af vævet) dyrkes sårstedsvæv under betingelser, som tillader dannelse af skud. Såvel ikke-transformerede som' pGV3850-transformerede celler vil danne skud. De transformerede skud kan let adskilles ved simpel analyse for tilstedeværelsen af nopalin. 1

Der er fremstillet pGV38S0-transformeret calli og skud afledt af afskårne tobakskimplanter af Nicotioina tabacum Wisconsin 38 under anvendelse af følgende procedure (alle trin gennemføres under sterile betingelser i et aftræk med laminar strømning).

i 47 DK 174310 B1 (1) Der anvendes 6-uger gamle tobaksfrøplanter, som j dyrkes i små krukker (diameter 10 cm, højde 10 cm) på j fast Murashige & Skoog (MS) medium (Murashige og Skoog,

Physiol. Plant. 15 (1962) 473-497) indeholdende 0,8% agar.

5 (2) De yngste topblade fjernes med en skalpel og kastes bort.

(3) Såroverflader inokuleres med en spatel eller tandstikker indeholdende Agrobacterium afledt fra en frisk pladekultur dyrket under selektive betingelser (f.eks. til 10 den rifampicinresistente, ampicillinresistente Agrobac-terium-stamme indeholdende Ti-plasmid pGV3850 anvendes YEB-medium indeholdende 100 ug/ml rifampicin og 100 yg/ml carbenicillin. YEB-medium; 5 g/1 Bacto kødekstrakt, 1 g/1 Bacto gærekstrakt, 5 g/1 pepton, 5 g/1 saccharose, 2 x 10-3 15 M MgS04, pH-værdi 7,2 og 15 g/1 agar. Der inokuleres mindst 8 planter for hver pGV3850-konstruktion.

(4) Der inkuberes i 2 uger, der bør ikke være noget respons eller kun ganske svag respons på inokulationsstedet. Undertiden optræder meget små calli.

20 (5) En tynd sektion med en tykkelse på mindre 1 mm fjer nes fra såroverfladen. Denne sektion af den sårede overfalde inkuberes på en plade indeholdende Linsmaier & Skoog (LS) agar-medium (Linsmaier og Skoog, Physiol. Plant.

18 (1965) 100-127) med auxiner og cytoquininer (1 mg/1 NAA, 25 0,2 mg/1 BAP) og 1% saccharose.

(6) Efter ca. 6 ugers forløb skal callus være tilstrækkelig stor, diameter mindst ca. 5 mm, til at en portion kan testes for tilstedeværelse af nopalin. Ikke alle sårcalli danner nopalin. Ca. en ud af fire planter danner nopalin- 30 positivt sårcallus.

(7) Nopalin-positivt calli overføres til agarplader indeholdende regenereringsmediet: LS-medium som ovenfor + 1% saccharose og 1 mg/1 BAP cytoquinin.

(8) Skud af god størrelse (1 cm høje) fremkommer efter 35 ca. 4-6 uger. Skuddene overføres til friske -agarplader indeholdende LS-medium + 1% saccharose uden hormoner til yderligere vækst og roddannelse.

(9) Skuddene dyrkes i 1 eller 2 uger, således at en del (1 eller 2 små blade) kan fjernes til afprøvning for til- 48 DK 174310 B1 stedeværelse af nopalin.

(10) Nopalin-positive skud overføres til større beholdere (10 cm beholdere som ovenfor) indeholdende MS-medium som i (1) til yderligere vækst.

5 N.B. Alle plantedyrkningsmedier til inficerede væv indeholder 500 ug/ml af antibiotikumet cefotaxim ("Claforan®") som en selektion mod Agrobacterium indeholdende pGV3850.

Dette lægemiddel virker udmærket til forhindring af vækst af alle Agrobacterier (også sådanne/ som er carbenicillin-10 resistente).

En anden metode til tilvejebringelse af transformeret væv og skudvæv er udviklet af ansøgerne. Denne fremgangs- måde er baseret på erkendelsen af, at visse mutant Ti-plasmidstammer af Agrobacterium inducerer krongalletumo-15 rer, som danner skud. Sådanne skudinducerende (shi) mutanter kortlægger et særligt område af T-DNA'et (overført DNA-segment) i Ti-plasmiderne af Agrobacterium tumefaciens (Leemanns et al., EMBO J. 1 (1982) 147-152 og Joos et al.,

Cell 32 (1983) 1057-1067). Ofte er de inducerede skud 20. sammensat af helt normale ikke-transformerede celler. Det er derfor blevet forsøgt at inokulere planter med en blanding af to forskellige Agrobacterier, en som bærer en octo-pin Ti-plasmidskudmutant og en anden, som bærer pGV385Q.

På denne måde er der en god chance for, at octopinskud-25 mutanten kan inducerer skud, som er blevet transformeret med pGV3850. Planter er blevet inokuleret med Agro-bacterium indeholdende Ti-plasmid pGV3850 og et octopin*-skudinducerende Ti-plasmid i forholdet 5:1. På denne måde er det lykkedes at fremstille pGV3850-transformerede skud.

30 Disse skud kan let screenes ved at analysere for tilstedeværelse af nopalin. Ved denne fremgangsmåde undgår man alle arbejdskrævende vævsdyrkningsmetoder. De nopalin-positive skud overføres til medier, som indeholder simple salte og sukkerarter med vilkårlige vækstregulerende 35 hormoner, som tillader yderligere vækst. Når skuddene har nået en tilstrækkelig størrelse, kan de let overføres til jord og dyrkes. Denne koinfektionsfremgangsmåde er i 49 DK 174310 B1 særlig nyttig til transformering af plantearter, som ikke let kan dyrkes i vævskulturer. Der kan således dannes en hel række agronomisk og økonomisk betydningsfyIde planter, såsom bælgplanter, medicinalplanter og prydplanter, ved 5 hjælp af Agrobacterium.

Den tredje fremgangsmåde muliggør isoleringen af Nicotiana tabacum protoplaster og selektionen af hormonuafhængige T-DNA-transformerede cellekloner efter kokultivering af protoplastafledte celler med oncogene Agrobacteriumstam-10 mer. En analog teknik kan anvendes til selekteringen af transformerede celler, når der anvendes andre dominante selektive markører, såsom antibiotikaresistente gener dannet på en sådan måde, at de kopieres i højere planteceller ( se eksempel 3).

15 I dette tilfælde skal selektionsbetingelserne imidlertid være optimaliserede i hvert enkelt tilfælde (koncentration af selektionsmidlet, tid mellem transformering og selektion, koncentration af de protoplastafledte celler eller cellekolonier i selektionsmediet). Hvis det ikke 20 er muligt at foretage selektion for de transformerede celler, f.eks. på grund af anvendelse af avirulente T-DNA-mutanter, såsom f.eks. pGV3850 eller pGV2217 (Leemans et al., EMBO J. 1 (1982), 147-152), er det muligt at dyrke cellerne efter genetisk transformation på 25 auxin- og cytoquinin-holdigt medium, f.eks. Murashige og

Skoog-medium (Murashige og Skoog, Physiol. Plant 15 (1962), 473-497) med 2 mg/1 NAA (α-naphthaleneddikesyre) og 0,3 ml/1 kinetin, og at identificere de transformerede kolonier ved hjælp af deres opinindhold. På denne måde kan der efter 30 elektroforetisk analyse for agropin- og mannopinsyntese (metode se Leemans et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1981), 149-164) finde ca. 660 kolonier dannet efter infektion med pGV2217, en Nicotiana tabacum SRl-cellelinie, som syntesi- 2 terer det TR-kodede opin mannopin (N -(1-mannityl)-glutamin).

35 Der dannes et stort antal skud efter inkubering af callus-stykker af denne cellelinie på regenereringsmedium (Murashige og Skoog-medium med BAP (6-benzylaminopurin) (1 mg/1) 50 DK 174310 B1 som eneste plantevækstregulator). Alle de analyserede 20 skud er stadig i stand til at syntetisere mannopin'.

Efter overføring til hormonfrit Murashige og Skogg-medium vokser skuddene som morfologisk normale tobaks-5 planter, der stadig indeholder mannopin.

Protoplastisoleringen og transformeringen beskrevet her ;for Nicotiana tabacum kan også anvendes for Nicotiana plum-baginifolia.

2. Eksperimentelle fremgangsmåder 10 2.1 Skuddyrkningsbetingelser

Kulturer af Nicotiana tabacum-skud holdes i 250 ml glasbeholdere på hormonfrit Murashige og Skoog-medium (Murashige og Skoog, Physiol. Plant 15 (1962), 473-497) under sterile betingelser i et dyrkningsrum (16 ti-15 niers dag, 1500 lux hvidt fluoroscerende lys ("ACEC LF 58 W/2 4300°K Economy"), 24°C, 70% relativ fugtighed). Fem uger gamle skudkulturer anvendes til protoplastisolering.

2.2 Protoplastisolering 20 Der anvendes aceptisk teknik til alle trinene under protoplastisoleringen og dyrkningen. Protoplasterne isoleres ved hjælp af en blandet enzymfremgangsmåde.

Alle blade, bortset fra meget unge blade mindre end 2 cm, kan anvendes til protoplastisolering. Bladene 25 skæres i strimler med en bredde på ca. 2-3 mm med en skarp kniv. 2-3 g bladmateriale inkuberes i 18 timer ved 2 4°C i 50 ml emzymblanding i mørket uden omrøring. Enzymblandingen består af 0,5% cellulase Ono-zuka R-10 og 0,2% macerozyme Onozuka R-10 i hormon-30 frit K3-medium (Nagy og Maliga, Z. Pflanzenphysiol.

78 (1976), 453-455). Blandingen sterilfiltreres gennem en 0,22 pm poremembran, og blandingen kan opbevares i mindst 6 måneder ved -20°c uden kendeligt tab af aktivitet.

51 DK 174310 B1 2.3 Protoplastdyrkning

Efter 18 timers inkubering omrøres blandingen forsigtigt til frigørelse af protoplasterne. Derefter filtreres blandingen gennem en 50 ym sigte, og fil-5 tratet overføres til 10 ml centrifugerør- Efter centrifugering i 6 minutter ved 60-80 g i en rotor med en svingende kurve danner protoplasterne et mørkt grønt flydende bånd. Væsken under protoplasterne og resterne, som danner en pellet, fjernes 10 under anvendelse et kapillarrør forbundet med en peristaltisk pumpe. Protoplasterne hældes sammen i et rør og vaskes to gange med dyrkningsmedium. Dyrkningsmediet er K3-medet (Nagy og Maliga, Z.

Pflanzenphysiol. 78 (1976), 453-455) med NAA (0,1 mg/1) 15 og kinetin (0,2 mg/1) som vækstregulatorer. Mediet indstilles på pH-værdien 5,6 og steriliseres gennem en 0,22 ym filtermembran.· Efter den anden vask tælles protoplasterne under anvendelse af et Thoma hemacytometer (fra firmaet "Assistant", Frankrig), 20 og cytoplasterne resuspenderes i dyrkningsmedium c i en slutkoncentration på 10 protoplaster/ml. Protoplasterne dyrkes i et rumfang på 10 ml pr. vævs-dyrkningskvalitetpetriskål med^en diameter på 9 cm.

Skålene forsegles med "Parafilm"® og inkuberes i 25 24 timer i mørket og derefter i dæmpet lys (500- 1000 lurt ved 24°C.

2.4 Transformation ved ko-dyrkning

Protoplastkulturerne inficeres 5 dage efter isoleringen. Agrobacteriumkulturer dyrkes i 18 timer i fly-30 dende LB-medium (Miller, Experiments in Molecular

Genetics (1972) , Cold Spring Harbor Laboratory, New

York), og resuspenderes i K3-dyrkningsmedium med en g tæthed på 2 x 10 celler/ml. 50 yl af denne suspension sættes til planteprotoplastkulturerne, og efter 35 forsegling med "Parafilm"® inkuberes kulturerne under samme betingelser som beskrevet ovenfor under 2.3.

Efter 48 timers forløb overføres kulturerne til 10 ml centrifugerør og’ centrifugeres i en rotor med svin- 52 DK 174310 B1 gende kurv ved 60-80 g i 6 minutter. Det flydende bånd og pellet hældes sammen og resuspenderes i 10 ml K3-medium (Nagy og Maliga, Z. Pflanzenphysiol. i 78 (1976), 453-455) tilsat et antibiotikum (carbeni- 5 ciliin 1000 yg/ml eller cefotaxim 500 yg/ml).

Efter to ugers inkubering centrifugeres de proto-plastafledte mikrocalli, hvorpå de resuspenderes i K3-medium (Nagy og Maliga, Z, Pflanzenphysiol. 78 (1976), 453-455) med den samme vækstregulator og 10 samme antibiotikumkoncentrationer som før men'med en saccharosekoncentration på 0,3 M i stedet for 0,4 M. Celletætheden i dette medium indstilles på ca. 25 x 10^ mikro-calli pr. ml.

Efter to ugers yderligere inkubering under de samme 15 betingelser overføres calli til K3-medium med de sam me antibiotikumkoncentrationer som før, men med et formindsket saccharoseindhold (0,2 M) og formindsket indhold af vækstregulatorer (NAA 0,01 ml/1 og kinetin 0,02 mg/1).

20 Efter inkubering i yderligere 2 eller 3 uger kan de formodede transformanter erkendes ved deres lysegrønne og kompakte udseende og bedre vækst. Disse kolonier overføres derpå til hormonfrit Linsmaier og Skoog-medium (Linsmaier og Skoog, Physiol. Plant. 18 (1965), 25 100-127), som er størknet med 0,6% agar, og som indeholder reducerede antibiotikumkoncentrationer : (carbenicillin 500 yg/ml eller cefotaxim 250 yg/ml).

Opintest kan gennemføres på de formodede transformanter, som vokser på dette hormonfri medium, når de 30 har nået en diameter på 3-4 mm. Halvdelen af hver en kelt koloni anvendes til påvisningen af octopin og nopalin (Aerts et al.. Plant Sci. Lett. 17 (1979), 43-50) eller agropin og mannopin (Leemans et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1981), 149-164). Denne test 35 muliggør bekræftelse af den transformerede natur af 53 DK 174310 B1 disse kolonier selekteret på hormonfrit medium.

Derefter kan de selekterede kolonier dyrkes på antibiotikumfrit medium.

2.5 Ko-dyrkning uden selektion på hormonfrit medium 5 Når det ikke er muligt at foretage selektion for trans formerede celler (f.eks. fordi der anvendes avirulente T-DNA-mutanter>, eller når det ikke er nødvendigt, fordi der findes en dominant selekterbar markør, såsom et antibiotikumresistent gen, i T-DNA'et, kan 10 behandlingen af de protoplastafledte celler simpli ficeres {hormonreduktionstrinene er ikke længere nødvendige) . Protoplasterne behandles som beskrevet ovenfor frem til infektionstrinnet. 48 timer efter tilsætningen af bakterierne centrifugeres de proto-15 plastafledte celler (6 minutter, 60-80 g), hvorpå de resuspenderes i medium AG (Caboche, Planta 149 (1980), 7-18), som er i stand til at understøtte cellevækst ved meget lav tæthed. Cellerne tælles under anvendelse af et Fuchs-Rosenthal-tællekammer (fra 20 "Assistant", Frankrig), og cellerne resuspenderes i den tæthed, som kræves til det efterfølgende arbejde.

Hvis kolonierne skal behandles individuelt til opin-test giver plader med lav celletæthed (100 protoplastaf ledte celler og cellekolonier pr. ml) kolonier 25 med store celle efter 1 måneds inkubering. Hvis det er muligt at foretage lægemiddelselektion for de transformerede celler inkuberes cellerne ved en højere tæthed (10^-10^/ml), og det anvendte selektionsmiddel sættes til mediet i en koncentration og på et 30 tidspunkt, som skal optimeres for hver type selek tion .

2.6 Regenerering af hele planter fra callusvæv

Normale planter fås let ud fra callusvæv (f.eks. enten afledt fra protoplattransformation eller fra helplan-35 teinokulation (se 2.7). Callusvævet dyrkes på Mura- shige og Skoog-medium indeholdende 1 mg/ml BAP. Dette medium inducerer skuddannelse efter 1-2 måneder. Disse 54 DK 174310 B1 skud kan overføres til et medium uden hormoner, således at der dannes rødder og en fuldstændig plante.

2.7 Tumorinfektion på tobakskimplanter

Tobaksfrø (f.eks. cultivar Wisconsin 38) overflade-5 steriliseres ved behandling med 70%'s denatureret ethanol/i^O i 2 minutter efterfulgt af 10%'s kommercielt blegemiddel og 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), hvorefter der yderligere skylles fem gange med sterilt vand. De sterile frø udsås i store testrør 10 (25 mm brede) indeholdende saltene fra Murashige og

Skoog-medium størknet med 0,7% agar og dækket med po-lycarbonattoppe. Derefter inkuberes rørene i et dyrkningsrum (12.000 lux, 16 timers lys/8 timers mørke, 70%'s relativ fugtighed, 24°C). Efter 4-6 15 ugers forløb er planterne klar til anvendelse. De forbliver optimale i mindst yderligere en måned.

Kimplanterne skal have en højde på mindst 3 cm og have 4 eller flere blade. Derpå gennemskæres planterne transversalt gennem den yngste internode med en ny 20 steril skalpel. Den øverste del af planten fjernes fra røret, og bakterier fra en agarpladekultur anbringes på såroverfladen med en flamberet mikrospa-tel.

Tumorer fremkommer efter 2 uger for vildtypens ved-25 kommende og efter et længere tidsrum for nogle af de attenuerede mutantstammer. Denne metode anvendes til at inokulere tobak (Nicofciana tabacum), Nicoti-ana plumbaginifolia og Petunia hybrida.

Afsluttende bemærkninger.

30 Den foreliggende opfindelse muliggør for første gang transformering af planter med Agrobacterium indeholdende en hybrid Ti-plasmidvektor, som mangler de oncogene funktioner i T-området i vildtype Ti-plasmider. Da indflydelsen 55 DK 174310 B1 af de oncogene funktioner af T-området på overførslen af DNA fra Ti-plasmidet til planteceller ikke var kendt, er det overraskende, at der ikke desto mindre optræder overførsel af det modificerede T-område indeholdende 5 et eller flere interessante gener til planteceller. Der foregår kointegrering og stabil opretholdelse af dette overførte DNA i plantecellegenomet. Endvidere kan der opnås kopiering af det eller de valgte interessante gener, forudsat at genet eller generne enten indeholder - eller 10 er konstrueret til at indeholde - egnede promotorsekvenser. Gennemførelsen af en enkelt overkrydsning mellem en intermediær kloningsvektor indeholdende det eller de valgte interessante gener med et særligt udformet acceptor Ti-plasmid forenkler i vid udstrækning dannelsen af en 15 vilkårlig hybrid Ti-plasmidvektor, som er nyttig til transformeringen af planteceller. De. særligt udformede acceptor Ti-plasmider indeholder DNA-segmentet af et konventionelt kloningsmiddel, således at et eller flere vilkårlige interessante gener (som er blevet indsat i det 20 samme eller et beslægtet kloningsmiddel som del af en intermediær kloningsvektor) kan danne et kointegrat ved en enkelt overkrydsning. De to segmenter i kloningsmidlet eller -midlerne tilvejebringer de nødvendige homologi-områder for rekombination. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Mikroorganismer og intermediære kloningsvektorer, acceptor 2

Ti-plasmider og hybridplasmidvektorer fremstillet ved frem 3 gangsmåden ifølge opfindelsen er eksemplificeret ved kultu 4 rer deponeret i den tyske samling af mikroorganismer (DSM), 5

Gottingen, 21. december 1983 og identificeret der på føl- 6 gende måde: 7 (1) Intermediær vektorplasmid pAcgB i Escherichia coli K12 8 HB101, 9 (2) Agrobacterium tumefaciens C58C1 rifampicin-resistent 10 stamme bærende carbenicillinresistent acceptor Ti-plasmid 11 pGV3850, (3) Intermediær vektorplasmid pGV700 i Escherichia coli K12 stamme K514 (thr leu thi lac hsdR), DK 174310 B1 56- (4) Intermediær vektorplasmid pGV750 i Escherichia coli K12 stajnme K514 (som ovenfor under (3)).

(5) Agrobacterium tumefaciens C58C1 rifampicin-resistent stamme bærende carbenicillinresistent acceptor Ti-plas- 5 mid pGV2260, (6) Intermediær vektorplasmid pNO-1 bærende octopinsyn-tasekodningsområdet under kontrol af nopalinpromotoren i Escherichia coli K12 HB101.

(7) Stamme anvendt til immobilisering af intermediære vek-10 torer til Agrobacterium = GJ23 bærende mobiliseringsplas- mider pGJ28 og R64drdll (Van Haute et al., EMBO J. 2 (1983), 411-418). GJ23 er Escherichia coli K12, JC2926 et recA-derivat af AB1157 (Howard-Flanders et al. , Genetics 49 (1964), 237-246).

15 Disse kulturer har fået følgende deponeringsnumre: 2792 (1), 2798 (2), 2796 (3), 2797 (4),.2799 (5), 2833 (6) og 2793 (7). 1

Claims (33)

57 DK 174310 B1

1. Intermediær kloningsvektor, som består af: (a) et kloningsmiddel segment {3'} indeholdende en venstre grænsesekvens (1) og en højre grænsesekvens (2) af 5 en T-region af et vildtype-Ti-plasmid, og (b) et DNA-segment, som er placeret mellem grænsesekvenserne på en måde, som muliggør integrering deraf i plantegenomet, hvor DNA-segmentet i det væsentlige er frit for indre T-DNA-sekvenser af et vildtype-Ti- 10 plasmid og ikke indeholder T-DNA-gener, som kontrol lerer neoplastisk vækst, og indeholder mindst ét gen af interesse, som omfatter: (i) en kodende sekvens og (ii) en promotorregion, som indeholder en anden pro-15 motorsekvens end den naturlige promotorsekvens for den kodende sekvens, og hvor promo tor sekvensen regulerer transkription af downstream-sekvenser indeholdende den kodende sekvens til dannelse af et RNA i en celle af en plante.

2. Kloningsvektor ifølge krav 1, hvor genet af inte resse er et strukturelt gen, og det nævnte RNA er et mRNA indeholdende en leder-sekvens.

3. Kloningsvektor ifølge krav l eller 2, hvori promotorsekvensen giver vævsspecifik regulering af transkription 25 af downstream-sekvenserne, fortrinsvis i blade, rødder, stilk eller blomster af en plante indeholdende celler med vektoren.

4. Kloningsvektor ifølge krav 1 eller 2, hvori promotoren giver inducerbar regulering af transkription af down- 30 stream-sekvenserne, fortrinsvis ved hjælp af temperatur, lys eller tilsatte kemiske faktorer.

5. Kloningsvektor ifølge krav 1 eller 2, hvori promotorsekvensen er promotorsekvensen af et opin-syntasegen af Agrobacterium-T-DNA, fortrinsvis promotorsekvensen af nopa- 35 lin-syntase-genet.

6. Kloningsvektor ifølge ethvert af kravene 1 til 5, 58 DK 174310 B1 hvori genet af interesse kontrollerer syntesen af sådanne produkter som aminosyrer eller sukkerarter.

7. Kloningsvektor ifølge ethvert af kravene 1 til 5, I hvori genet af interesse kontrollerer syntesen af produkter, 5 som giver beskyttelse mod eksterne patogene agenser, såsom resistens mod sygdomsfremkaldende organismer eller stressfremkaldende miljøfaktorer.

8. Kloningsvektor ifølge ethvert af kravene 1 til 5, hvori genet af interesse er et selekterbart markørgen.

9. Kloningsvektor ifølge krav 8, hvori genet af inte resse er et antibiotikumresistensgen.

10. Kloningsvektor ifølge ethvert af kravene 1 til 7, hvori DNA-segementet yderligere indeholder et selekterbart markørgen, som kan eksprimeres i plantecellen.

11. Kloningsvektor ifølge krav 10, hvori det selekter- bare markørgen koder for resistens mod et antibiotikum.

12. Kloningsvektor ifølge krav 11, hvori det selekter-bare markørgen koder for resistens mod methotrexat.

13. Kloningsvektor ifølge krav 10, hvori det selekter- 20 bare markørgen er et opin-syntase-gen af Agrobacterium T- DNA, fortrinsvis nopalin-syntase-genet eller octopin-syntase-genet.

14. Bakterie, som indeholder en intermediær kloningsvektor ifølge ethvert af kravene 1 til 13.

15. Bakterie ifølge krav 14, som er en Escherichia col i.

16. Bakterie ifølge krav 14, som er en Agrobacterium.

17. Fremgangsmåde til transformering af en celle af en plante ved at anvende en Agrobacterium ifølge krav 16.

18. Fremgangsmåde til fremstilling af en plante, omfattende følgende trin: (a) infektion af en plantecelle med en Agrobacterium ifølge krav 16 og (b) dannelse af en plante ud fra de transformerede 35 planteceller opnået i trin (a).

19. Celle af en plante, som stabilt integreret i sit 59 DK 174310 B1 genom indeholder et fremmed DNA, aom erkendeteg- i net ved, at: (a) det i det væsentlige er frit for indre T-DNA-sekvenser af et vildtype-Ti-plasmid, 5 (b) det ikke indeholder T-DNA-gener, som kontrollerer neoplastisk vækst, og (c) det indeholder mindst ét gen af interesse indeholdende : (i) en kodende sekvens og 10 (ii) en promotorregion, som indeholder en anden promotorsekvens end den naturlige promotorsekvens for den kodende sekvens, og hvor promotorsekvensen regulerer transkription af downstream-sekvenser indeholdende den kodende sekvens til 15 dannelse af et RNA i cellen.

20. Celle ifølge krav 19, hvor genet af interesse er et strukturelt gen, og det nævnte RNA er et mRNA indeholdende en leder-sekvens.

21. Celle ifølge krav 19 eller 20, hvori promotorse-20 kvensen giver vævsspecifik regulering af transkription af downstream-sekvenserne, fortrinsvis i blade, rødder, stilk eller blomster af en plante indeholdende cellen.

22. Celle ifølge krav 19 eller 20, hvori promotoren giver inducerbar regulering af transkription af downstreamse- 25 kvenserne, fortrinsvis ved hjælp af temperatur, lys eller tilsatte kemiske faktorer.

23. Celle ifølge krav 19 eller 20, hvori promotorsekvensen er promotorsekvensen af et opin-syntase-gen af Agro-bacterium-T-DNA, fortrinsvis promotorsekvensen af nopalinsyn- 30 tase-genet.

24. Celle ifølge ethvert af kravene 19 til 23, hvori genet af interesse kontrollerer syntesen af sådanne produkter som aminosyrer eller sukkerarter.

25. Celle ifølge ethvert af kravene 19 til 23, hvori 35 genet af interesse kontrollerer syntesen af produkter, som giver beskyttelse mod eksterne patogene agenser, såsom resi- 60 DK 174310 B1 stens mod sygdomsfremkaldende organismer eller stressfremkaldende miljøfaktorer.

26. Celle ifølge ethvert af kravene 19 til 23, hvori genet af interesse er et selekterbart markørgen.

27. Celle ifølge krav 26, hvori genet af interesse er et antibiotikumresistensgen.

28. Celle ifølge ethvert af kravene 19 til 25, hvori det fremmede DNA yderligere indeholder et selekterbart markørgen, som eksprimeres i cellen.

29. Celle ifølge krav 28, hvori det selekterbare markørgen koder for resistens mod et antibiotikum.

30. Celle ifølge krav 29, hvori det selekterbare markørgen koder for resistens mod methotrexat.

31. Celle ifølge krav 28, hvori det selekterbare 15 markørgen er et opin-syntase-gen af Agrobacterium T-DNA, fortrinsvis nopalin-syntase-genet eller octopin-syntase-genet.

32. Plante sammensat af celler ifølge ethvert af kravene 19 til 31.

33. Frø af plante ifølge krav 32, som er sammensat af celler ifølge ethvert af kravene 19 til 31.