DK173104B1 - Vektorkombination, acceptor-Ti-plasmid, intermediær kloningsvektor, fremgangsmåde til fremstilling af et hybridt Ti-plasmid - Google Patents

Description

DK 173104 B1

Den foreliggende opfindelse angår en vektorkombination, et acceptor-Ti-plasmid, en intermediær kloningsvektor, en fremgangsmåde til fremstilling af et hybridt Ti-plasmid, en hybrid Ti-plasmidvektor, en Agrobacterium inde-5 holdende vektorkombinationen eller den hybride Ti-plasmidvektor samt en fremgangsmåde til fremstilling af en transformeret plantecelle og en fremgangsmåde til fremstilling af en plante, ved hvilke fremgangsmåder der anvendes en sådan Agrobacterium.

10 Nærmere betegnet vedrører opfindelsen DNA-sekvenser, som skal kopieres i passende værtsplanteceller. De omhandlede rekombinant-DNA-molekyler er karakteriseret ved sekvenser, som koder for produkter, f.eks. aminosyrer eller polypep- tider, som er nyttige til plantens vækst eller til forbedring 15 af dens kvalitet som næringsmiddel eller til dannelse af værdifulde metaboliter, f.eks. alkaloider eller steroid-pre-cursere.

I beskrivelsen anvendes følgende udtryk: 20 25 30 2 DK 173104 B1

O

bom-område: DNA-område, hvor mob-funktioner specielt vek selvirker og initierer autonom DNA-overføring.

Grænsesekvens: DNA-sekvens, som indeholder enderne af T- DNA'et.

Bred-vært-område replikon: Et DNA-molekule, som kan over- 5 -- føres og opretholdes i mange forskellige værtsceller.

Callus-væv: En masse af uorganiserede og udifferentierede celler.

Kloning: Tilvejebringelse af en population af organis- 10 - mer eller DNA-sekvenser afledt af en sådan organisme eller sekvens ved ukønnet formering, eller bedre isoleringen af en særlig organisme eller del deraf og formeringen af denne underfraktion som en homogen population.

Kloningsmiddel: Et plasmid, fag-DNA eller andre DNA-se kvenser, som kan kopieres i en værtscelle, karakteriseret ved et eller et mindre antal 20 endonucleasegenkendelsessteder, ved hvilke sådanne DNA-sekvenser kan spaltes på bestemme- lig måde uden dermed følgende tab af en væsentlig biologisk funktion ved DNA'et, f.eks. kopiering, produktion af coat-proteiner eller tab 25 af promotor- eller bindingssteder, og som indeholder en markør, som er egnet til anvendelse ved identificeringen af transformerede celler, f.eks. tetracyclinresistens eller ampicillinresistens. Et kloningsmiddel 30 kaldes ofte en vektor.

Kodningssekvens: DNA-sekvens, som bestemmer eller fast lægger aminosyresekvensen i et polypeptid.

35 3

O

DK 173104 B1

Kointegrat: Den struktur, som fremkommer ved en enkelt overkrydsning mellem to cirkulære DNA-moleky-ler.

5 Kopiementering in trans: Fremgangsmåde hvor et DNA-mole- kyle (replikon), som ikke er fysisk bundet til et andet replikon, kan danne eller tilvejebringe et diffunderbart stof, som det andet ubundne replikon mangler og kræver.

10 Konjugation: Fremgangsmåde hvor DNA overføres fra bakte rier af en type til bakterier af en anden type under celle-celle-kontakt.

Overkrydsning: Udveksling af genetisk materiale mellem homologe DNA-sekvenser.

15 Sletningssubstitution: Fjernelse og ombytning af en DNA- sekvens med en anden DNA-sekvens.

Differentiering; Fremgangsmåde hvor afkom af en celle opnår og opretholder specialisering med hensyn til struktur og funktion.

20 DNA-sekvens eller DNÅ-segment: En lineær række nucleoti- der, som er indbyrdes forbundet ved phospho-diesterbindinger mellem 3'- og 5'-carbonatomer-ne i nabostillede pentoseenheder.

Dobbelt-overkrydsning: Opløsning af en kointegrat struk- 25 tur i to cirkulære DNA-molekyler. Denne pro ces anvendes til udveksling af genetisk information. Det ene af de to cirkulære DNA-molekyler har to homologe områder med mål-DNA'et, hvorigennem rekombination kan forekomme. Dis- 30 se to områder omgiver en ikke-homolog DNA-se- kvens, som skal udskiftes med mål-DNA’et. Hvis denne anden overkrydsning foregår i samme DNA- 35 DK 173104 B1 4 område som den første, vil de oprindelige cirkulære DNA-molekyler dannes. Hvis denne anden overkrydsning forekommer i det andet homologe område, vil der foregå genetisk ud-5 veksling mellem de to cirkelområder.

Kopiering: Kopiering eller expression er den proces, som et strukturgen undergår til dannelse af et polypeptid. Kopiering er en kombination af transkription og translation.

10 Kopieringskontrolsekvens: En nucleotidsekvens, som kon trollerer og regulerer kopieringen af strukturgener, når den er operativt bundet til disse gener.

F-type plasmid: Plasmid som bærer F (fertilitet) faktoren, 15 som tillader overføringen af en kopi af plas- midet til en vært, som ikke bærer F-faktoren.

Gen: En DNA-sekvens bestående af to dele, (1) kod ningssekvensen for genproduktet og (2) sekvenserne i promotorområdet, som kontrollerer 20 hvorvidt genet kopieres eller ej.

Genom: Hele DNA-indholdet i en celle eller et virus.

Genomet omfatter bl.a. strukturgenerne, som koder for polypeptidet eller polypeptiderne samt operator-, promotor- og ribosombindlngs-25 og vekselvirkningssekvenser, herunder sekven ser såsom Shine-Dalgarno-sekvenserne.

Genotype: Den totale mængde genetisk information inde holdt i en organisme.

Homolog rekombination: Rekombination mellem to DNA-områder, 30 som indeholder homologe sekvenser.

I-type-plasmid: En gruppe selvoverførbare plasmider af en uforenelighedsgruppe, som er forskellig fra F.

Uforenelighed: To DNA-molekylers manglende evne til at 35 sameksistere i den samme celle i fraværelse af selektivt tryk.

Indsætning: Addition af en DNA-sekvens til DNA-sekvensen i et andet molekyle.

5 DK 173104 B1

Ledersekvens: Området i et mRNA-molekyle, som strækker sig fra 5'-enden til begyndelsen af det første strukturgen. Det omfatter også steder, som er vigtige for initiering af translation 5 af kodningssekvensen i strukturgenet,

Meiose: To på hinanden følgende delinger, som for mindsker begyndelsesantallet af kromosomer på 4 n til 1 n i hver af de fire produktcel ler. Denne proces er vigtig ved kønnet forme-10 ring.

mob (mobiliseringsfunktioner): Et sæt produkter, som kun i kombination med tra-funktioner fremmer DNA-overføring. Mob kan fremme overføring af plas-mider indeholdende et bom-sted.

15 Mobilisering: Proces hvor et DNA-molekyle, som ikke er i stand til at overføres til en anden celle, hjælpes til overføring ved hjælp af et andet DNA-molekyle.

Mobiliserlngshjælperplasmld: Et plasmid som kan tilveje- 20 bringe diffunderbare produkter, som et andet plasmid mangler for at kunne overføres til en anden værtscelle.

Nonkunjugativt rekombinantplasmid: Et DNA-molekyle, som ikke selv kan overføres fra værtscellen til 25 en anden værtscelle under celle-cellekontakt.

For at kunne overføres kræver det yderligere funktioner tilført af andet DNA, f.eks. af et eller flere hjælperplasmider.

Nucleotid: En monomer DNA-eller RNA-enhed, som består af 30 en sukkerdel (pentose), et phosphat og en nitrogenholdig heterocyclisk base. Basen er bundet til sukkerdelen over en glycosid-binding (l'-carbonatomet i pentosen), og denne kombination af base og sukker kaldes et 35 nucleosid. Basen karakteriserer nucleotidet.

De fire DNA-baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C") og thymin ("T"). De fire RNA-ba-ser er A, G, C og uracil ("U”).

DK 173104 B1 6

Phenotype: De observerbare karakteristika for et indi vid, som skyldes vekselvirkningen mellem genotypen og miljøet, hvori udviklingen foregår.

5 Plasmid: En ikke-kromosomal dobbeltstrenget DNA-sekvens indeholdende et intakt "replikon", således at plasmidet kopieres i en værtscelle. Når plasmidet anbringes i en éncellet organisme, ændres eller transformeres denne orga-10 nismes karakteristika som følge af plasmidets DNA. Eksempelvis transformerer et plasmid, som bærer genet for tetracyclinresistens

O

(Tc ), en celle, som før var følsom overfor tetracyclin til en celle, som er resistent 15 overfor tetracyclin. En celle, som er trans formeret ved hjælp af et plasmid, kaldes en "transformant".

Polypeptid: En lineær række aminosyrer, som er indbyrdes forbundet ved peptidbindinger mellem a-amino-20 og carboxygrupperne i naboaminosyrer.

Promotorområde: DNA-sekvenser, som ligger ovenfor (up stream) begyndelsen af kodningssekvensen, som regulerer transkriptionen af genet.

Promotorsekvens: Sekvens, hvortil RNA-polymerase bindes 25 og fremmer den sande transkription af "med strøms" -sekvenser.

Rekombinant DNA-molekyle eller hybrid-DNA: En hybrid-DNA- sekvens indeholdende mindst to nucleotidsekven-ser, hvor den første sekvens sædvanligvis ikke 30 findes i naturen sammen med den anden sekvens.

Rekombination: Dannelse af en ny forbindelse mellem DNA- molekyler eller dele af DNA-molekyler.

Homologiområde: Et DNA-område, som deler den samme DNA- sekvens som den, der findes i et andet DNA-35 område.

Replikon: Et selvkopierende genetisk element, som inde holder et sted for initiering af DNA-kopierlng og gener, som specificerer de funktioner, som er er nødvendige for kontrollering af kopieringen.

7 DK 173104 B1

Restriktionsfragment: Et DNA-molekyle, som er fremkom met ved dobbeltstrenget spaltning ved hjælp af et enzym, som genkender en specifik mål-DNA-sekvens.

RNA-polymerase. enzym, som bevirker transskription af DNA 5 til RNA.

Selekterbart markørgen: En DNA-sekvens, som efter kopiering giver denne celle en vækstfordel i forhold til celler, som ikke indeholder denne DNA-sekvens, når alle cellerne findes i et vækstmedium, som 10 kan adskille de to celletyper. Almindeligt an vendte selekterbare markørgener er sådanne, som koder for resistens overfor antibiotika.

Enkelt overkrydsningi Rekombination af 2 cirkulære DNA-mole-kyler til dannelse af en kointegrat større 15 cirkel.

Strukturgen; Et gen, som koder for et polypeptid.

T-DNA; Del af Ti-plasmidet, som det findes stabilt integreret i plantcellegenomet.

T-område: Del af Ti-plasmidet, som indeholder DNA-sekvenser-20 ne, der overføres til plantecellegenomet.

Ti-plasmid: Store plasmider, som findes i Agrobacterium tumefaciens stammer indeholdende den genetiske information for tumor (krongalle) induktion på følsomme planter.

25 TL-DNA og TR-DNA; Octopin krongalletumorceller kan indeholde 2 T-DNA-sekvenser, et venstre T-DNA, dvs.

TL-DNA, og et højre TR-DNA. TL-DNA indeholder sekvenser, som også findes sammen med T-DNA fra nopalintumorceller, hvilket derimod ikke er 30 tilfældet med TR-DNA.

tra (overføringsfunktioner): Såvel plasmidkodede diffunder-bare produkter som aktionssteder, der anvendes under DNA-overfØring mellem celler, f.eks. produkter, der er nødvendige for at danne en bro 35 mellem to celler og det sted, hvor DNA-overfø- ring initieres.

DK 173104 B1 8

Transskription: Dannelse af mRNA ud fra et strukturgen, eller processen, som involverer baseparing, hvorved den genetiske information indeholdt i DNA anvendes 5 til en komplementærsekvens af baser i en RNA- kæde.

Transformation: Genetisk modifikation fremkaldt ved inkorporering af exogent DNA til DNA-komplementet i en celle.

10 Translation: Dannelsen af et polypeptid ud fra mRNA, eller processen, hvor den genetiske information i et mRNA-molekyle styrer rækkefølgen af specifikke aminosyrer under syntesen af et polypep-15 tid.

Udifferentieret phenotype: Et homologt udseende af celler i et væv uden nogen specialiserede dele.

Vektor: Et DNA-molekyle udformet til overføring mellem forskellige værtceller.

20 Udviklingen af rekombinant DNA teknik har givet gensplejsningen af mikroorganismer et ansporende perspektiv. Disse teknikker kunne overføres til flercellede eukaryoter, hvis der kunne gendannes fuldstændige organismer ud fra enkelte somatiske celler. Cellerne fra nogle højere planter udviser 25 udmærkede regenereringsegenskaber og er derfor gode materialer til gensplejsning af højere organismer.

Et væsentligt problem ved gensplejsningen af planter er tilgængeligheden af et system til indføringen af exogent (fremmed) DNA i plantegenomet. Et sådant system tilvejebringes af 30 de tumorinducerende (Ti) plasmider, som bæres af den gramnegative jordbakterie Agrobacterium tumefaciens. Det er påvist, at denne organisme fremkalder en neoplastisk transformation, som kaldes "krongalle", i sårvæv hos et meget stort antal tokimbladede planter. De formerende neoplasmer synteti-35 serer hidtil ukendte, Ti-specificerede metaboliter, som kaldes opiner. Molekylbasis for denne transformering er over- DK 173104 B1 9 førslen og den stabile integrering af et veldefineret T-DNA (overført DNA) fragment af Ti-plasmidet i plantecellegeno-met. Med andre ord indeholder krongalletumorer i det kromosomale DNA et DNA-segment, som betegnes T-DNA'et, som er 5 homologt med DNA-sekvenserne i Ti-plasmidet, som anvendes til indføring af tumorlinien. I alle tilfælde svarer dette T-DNA til og er kolineært med et kontinuert stræk af Ti-plasmid DNA, som derfor kaldes T-området.

Ti-plasmider klassificeres i overensstemmelse med den type 10 opin, som dannes i krongalleceller. Agrobacteriumstammer, som inducerer syntesen af nopalin [N-a-(1,3-dicarboxyprop-yl) -L-arginin] i krongalleceller, kaldes nopalinstammer, og stammer, som inducerer syntesen af octopin [N-a-(N-l-carboxyethyl)-L-arginin], kaldes octopinstammer. Disse er 15 de mest almindeligt anvendte Agrobacteriumstammer.

Anvendelsen af T-DNA som en vektor til plantegenspiejsning er påvist ved hjælp af et modelforsøg, i hvilket 14 kb bak-terietransposonet Tn7 indsættes in vivo nær den højre grænse af T-DNA'et fra Ti-plasmidet fra stammen Agrobacterium T37.

20 Nopalinsyntese eliminerers i tumorerne provokeret med agro-bakterier, som bærer dette Ti-plasmid. Endvidere har Southern blotting hybridisering vist, at hele Tn7'et er til stede i det kromosomale DNA i disse tumorer, som en del af en ellers normal T-DNA-sekvens (Hernalsteens et al., 25 Nature 287 (1980), 654-656, Holsters et al., Mol. Gen.

Genet. 185 (1982), 283-289). Indføringen af dette 14 kb DNA-fragment i 23 kb T-DNA'et har således ikke ændret sidstnævntes evne til at kunne overføres til plantecellegenomet.

Grænserne for T-DNA'et fra Ti-plasmidet fra nopalinstam-30 men Agrobacterium T37 er bestemt meget nøjagtigt. Det udgør kun en del, omtrentlig 23 kb, af hele nopalin Ti-plasmidet. Endvidere kendes grænserne for T-DNA’et. Nucleotidsekven-serne, som fastlægger grænserne for T-DNA'et, er blevet bestemt og sammenlignet med det samme område i nopalin Ti-35 plasmidet (Zambryski et al.. Science 209 (1980), 1385-1391, Zambryski et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 361-370).

DK 173104 B1 10

Grænserne for T-området er højst sandsynligt involveret i integreringen af T-DNA'et i plantecellegenomet.

Kendskab til T-DNA-sekvenserne, som fastlægger grænserne for det overførte DNA, er et grundlæggende krav for an-5 vendeisen af Ti-plasmidet som en vektor for overføring af DNA til planteceller. Fremmed DNA kan således indsættes indenfor disse grænser for at sikre dets overførsel til plantecellegenomet. Hvis man endvidere forventer at anvende dette system, er det vigtigt at de transformerede 10 planteceller er normale og ikke tumoragtige med hensyn til vækstegenskaber. Dannelsen af normale celler efter T-DNA-overføring kræver kendskab til funktionerne, som T-DNA'et selv koder for. T-området i Ti-plasmidet er således blevet underkastet intens genetisk analyse for at 15 bestemme de områder, som er ansvarlige for tumorphenotypen.

T-DNA'et koder for funktioner, som er ansvarlige for kron-gallephenotypen. Generne er blevet lokaliseret til specifikke områder i T-DNA'et (Leemans et al., EMBO J. 1 (1982), 147-152 og Willmitzer et al., EMBO J. 1 (1982), 139-146).

20 Generelt er der mindst fire gener, som kontrollerer den udifferentierede phenotype for tumorcallusvæv. Muntanter i disse gener kan enten føre til transformeret væv, som virker skudagtigt eller rodagtigt. Sidstnævnte resultater er særligt vigtige, hvis man ønsker at overføre DNA til 25 planter til kopiering i normalt plantevæv og ikke i tumorvæv.

Det har for nyligt vist sig, at et mutant Ti-plasmid inducerer transformerede skud, som er i stand til at regenerere til helt normale planter. Disse planter er frugtbare 30 og overføre endog T-DNA specifikke sekvenser ved meiose, dvs. at afkomsplanter stadig indeholder T-DNA-specifikke sekvenser (Otten et al.. Mol. Gen. Genet. 183 (1981), 209-213). Imidlertid indeholder det transformerede plantevæv i det kromosomale DNA et T-DNA, som har en meget 35 mindre størrelse som følge af dannelsen af en stor sletning, som fjernede området for T-DNA'et, som kontrollerede tu- 11 DK 173104 B1 o morphenotypen. Det vides ikke om sletningen foregik under den indledende transformering eller som en senere hændelse, der fører til skuddannelse.

5 Ti-plasmiderne er store (200 kb), og mange gener anbragt på forskellige steder på Ti-plasmidet er involveret i transformationen af planteceller. Det er derfor ikke muligt at konstruere en lille Ti-plasmidafledt kloningsvektor med entydige endonucleasegenkendelsessteder på passende 10 steder i T-området, og som har alle de funktioner, som er essentielle for T-DNA-overføring og stabil inkorporering i plantecellegenomet. En kendt måde til indføring af et valgt DNA-fragment i specifikke restriktionsenzymspaltningssteder i T-området i et Ti-plasmid er at 15 danne kloningsplasmider, som kan danne kopier i Agro- bacterium samt i Escherichia coli, og som indeholder et valgt restriktionsfragment af T-DNA'et. Sådanne kloningsplasmider betegnes "intermediære vektorer". Sådanne inter-mediære vektorer anvendes til at analysere funktionerne, 20 som indkodes af T-området (Leemans et al., J. Mol. Appl.

Genet. 1 (1981), 149-164).

Den foreliggende opfindelse angår følgende: 25 1) En vektorkombination bestående af: (i) et acceptor-Ti~plasmid, som i det væsentlige er frit for indre T-DNA-sekvenser og ikke er i stand til at fremkalde tumorer hos planter, omfattende: (a) de to grænsesekvenser (1, 2) af T-regionen af et 30 viIdtype-Ti-plasmid, (b) en DNA-sekvens (3) afledt af kloningsmiddel, placeret mellem de to grænsesekvenser, og (c) et DNA-segment (4) af et vildtype-Ti-plasmid in-35 deholdende DNA-sekvenser, som er essentielle for overføring med Agrobacterium af T-regionen af vildtype-Ti-plasmider i DK 173104 B1 12

O

plantecellegenomer, og (ii) en intermediær kloningsvektor, hvor denne klonings-vektor omfatter: (a) mindst ét gen af interesse (5) under kontrol af 5 en promotor, som er i stand til at styre genekspression i planter, og (b) et kloningsmiddelsegment (3') indeholdende en DNA-sekvens, som er homolog med DNA-sekvensen (b) i det nævnte acceptor-Ti-plasmid, som tillader en enkelt overkrydsning .

2) Acceptor-Ti-plasmidet pGV2260, DSM 2799.

15 3) Den intermediære kloningsvektor pGV750, DSM 2797.

4) En fremgangsmåde til fremstilling af et hybridt Ti-20 plasmid, omfattende fremstilling af en vektorkombination ifølge opfindelsen i en Agrobacterium og gennemførelse af en cointegrering mellem den intermediære kloningsvektor og acceptor-Ti-plasmidet ved en enkelt overkrydsning.

25 5) En hybrid Ti-plasmidvektor som kan fås ved cointegrering mellem enten et acceptor-Ti-plasmid, som ikke er i stand til at fremkalde tumorer hos planter og omfatter: (a) de to grænsesekvenser (1, 2) af T-regionen af et 30 vildtype-Ti-plasmid, (b) en DNA-sekvens (3) , som er fri for de oncogene funktioner af vildtype-T-DNA'et, afledt af et kloningsmiddel, placeret mellem de to grænsesekvenser, og indeholdende en DNA-sekvens, som er homolog med i det mindste en del af 3θ en DNA-sekvens i en intermediær kloningsvektor, som muliggør en enkelt overkrydsning, og 13 0 DK 173104 B1 (c) et DNA-segment (4) af et vildtype-Ti-plasmid indeholdende DNA-sekvenser, som er essentielle for overføring med Agrobacterium af T-regionen af vildtype-Ti-plasmider i plantecellegenomer, 5 og en intermediær kloningsvektor omfattende: (a) mindst ét gen af interesse (5) under kontrol af en promotor, som er i stand til at styre genekspression i planter, og (b) et kloningsmiddelsegment (3') indeholdende en DNA-sekvens, som er homolog med den ovennævnte DNA-sekvens (b) i acceptor-Ti-plasmidet, eller mellem et acceptor-Ti-plasmid omfattende: (A) et DNA-segment (4) af et vildtype-Ti-plasmid uden 15 T-regionen og uden de to grænsesekvenser af T-regionen og (B) en DNA-sekvens (3) afledt af et kloningsmiddel, og en intermediær kloningsvektor omfattende: (A' ) den venstre og højre grænsesekvens af en T-20 region af et vildtype-Ti-plasmid (1, 2), (B') et kloningsmiddel segment (3') placeret uden for de nævnte to grænsesekvenser, som er homologt med DNA-sekvensen (b) i det nævnte acceptor-Ti-plasmid, som mulig-25 gør en enkelt overkrydsning, og {C') en region, som i det væsentlige er fri for indre T-DNA-sekvenser af et vildtype-Ti-plasmid og indeholder mindst ét gen af interesse (5) under kontrol af en promotor, som er i stand til at styre genekspression i planter, 30 hvorved den nævnte region er placeret mellem de to grænsesekvenser på en måde, som muliggør dens integrering i plan-tegenomet, idet den nævnte hybride Ti-plasmidvektor i det mindste om-35 fatter: DK 173104 B1 14 (α) de to grænsesekvenser (1, 2) af T-regionen af et vildtype -T -plasmid, (β) ikke-oncogene DNA-sekvenser (3, 3') afledt af et klo ningsmiddel , 5 (γ) et DNA-segment (4) af vildtype-Ti-plasmidet indeholden de DNA-sekvenser, som er essentielle for overføring af T-regionen af vildtype-Ti-plasmider med Agrobacterium til plantecellegenomer, og ίο (δ) mindst ét gen af interesse (5) under kontrol af promotor, som er i stand til at styre genekspression i planter, og som er placeret mellem de to grænsesekvenser (1, 2).

15 6) En Agrobacterium indeholdende en vektorkombination eller en hybrid Ti-plasmidvektor ifølge opfindelsen.

7) En fremgangsmåde til fremstilling af en transformeret 20 plantecelle, omfattende infektion af planteceller med en Agrobacterium ifølge opfindelsen.

8} En fremgangsmåde til fremstilling af en plante, om-25 fattende følgende trin: (a) infektion af en plantecelle med en Agrobacterium ifølge opfindelsen, og (b) dannelse af en plante ud fra de transformerede planteceller opnået i trin (a).

30

Den foreliggende opfindelse vedrører indføring af expressible gener i plantecellegenomer. Herved tilvejebringes modificerede acceptor Ti-plasmider, som tillader indføringen af 35 vilkårlige interessante gener i disse plasmider. Genet eller generne, som har interesse, og som skal indføres, er in- 15 0 DK 173104 B1 deholdt i en hidtil ukendt intermediær kloningsvektor, som bærer et homologiområde med et tilsvarende område i acceptor Ti-plasmidet.

Indføringen af genet eller generne af interesse i acceptor 5

Ti-plasmiderne opnås ved en enkelt overkrydsning, som finder sted indenfor de to homologe DNA-segmenter af acceptor Ti- plasmidet, som findes i Agrobacterium og den intermediære kloningsvektor. Den intermediære kloningsvektor mobiliseres fra Escherichia coli, hvor den er propageret til Agrobac- 10 terium under anvendelse af hjælperplasmider. Sådanne hjæl- perplasmider og deres funktioner til mobilisering er kendt (Finnegan et al., Mol. Gen. Genet. 185 (1982), 344-351).

Resultatet af den enkelte overkrydsning i Agrobacterium er en hybrid Ti-piasmidvektor.

15

De dannede hybridplasmidvektorer båret i Agrobacterium (i det følgende betegnet vektorkomposition) kan anvendes direkte til inficering af planteceller, som derefter screenes for kopieringen af produktet eller produkterne af genet eller 20 generne, som har interesse. Denne metode kan anvendes på en vilkårlig af de planteoverførbare plasmider fra Agrobac-terium.

25 Vektorkombinationerne og de hybride Ti-plasmider adskiller sig fra de tidligere beskrevne (Leemans et al., J. Mol.

Appl. Genet. 1, 149-164 (1981), og Leemans, i Molecular

Biology of Plant Tumors, Academic Press, 537-545)ved, at de muliggør forenklet fremstilling af hybride Ti-plasmider ved en enkelt overkrydsning, og at de ikke indeholder T-DNA-gener, som kontrollerer neoplastisk vækst og fortrinsvis i det væsentlige er frie for indre T-DNA-sekvenser. Anvendelsen af de omhandlede vektorkombinationer fører til trans-35 formerede planteceller, som ikke indeholder T-DNA-gener, som kontrollerer neoplastisk vækst, eller i det væsentlige o DK 173104 B1 16 er frie for indre T-DNA-sekvenser. Dette er fordelagtigt, da disse transgene planter kan regenereres til morfologisk normale transgene planter. Med den foreliggende opfindelse er det for første gang muligt at udelade alle T-DNA-gener, 5 som kontrollerer neoplastisk vækst, eller endog alle indre T-DNA-sekvenser og stadig opnå vellykket overføring til og integrering af sekvenser lokaliseret mellem grænsesekvenserne i plantegenomet samt ekspression af et eller flere overførte gener af interesse. Forud for den foreliggende opfindelse kunne det ikke udelukkes, at en vis information, som er nødvendig for overføring og/eller integrering i plantegenomet, var lokaliseret i T-regionen.

15 Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen.

Fig. 1 viser en udførelsesform for et acceptor Ti-plas-mid ifølge opfindelsen, som er resultatet af en 20 sletning af den indre del af T-området bortset fra grænsesekvenserne (1) og (2). Grænsesekvenserne er essentielle for integreringen af T-området i et plantecellegenom. Området (3) mellem grænsesekvenserne (1) og (2) er det DNA-segment, 25 som vil blive overført til planten. Acceptor Ti- plasmidet indeholder et DNA-segment (3) med en DNA-sekvens, som er homolog med i det mindste en del af DNA-sekvensen i en intermediær kloningsvektor, som tillader integrering af den interme-30 diære kloningsvektor ved en enkelt overkrydsning.

35 DK 173104 B1 17

Ti-plasmid-området (4) koder for funktioner, som er essentielle for overføringen ved hjælp af Agrobacterium af T-området til plantecelle-genomer. Dette område betegnes som vir-området.

5 Fig. 2 viser en intermediær kloningsvektor ifølge opfindelsen, som skal indsættes ved en enkelt overkrydsning i acceptor Ti-plasmidet ifølge fig. 1. Den indeholder et kloningsmiddel DNA-segment (3') med en DNA-sekvens, som er homolog med i det mindste 10 en del af DNA-segmentet (3) i acceptor Ti-plas midet, som tillader den ønskede enkelte overkrydsning. Endvidere indeholder den intermedi-ære kloningsvektor et gen eller en gruppe gener (5) som har interesse, og som har den naturlige 15 promotorsekvens. Sædvanligvis kan plantegener an vendes i denne konstruktion, da de har stor sandsynlighed for at blive kopieret. Imidlertid kan principielt ethvert naturligt gen af interesse indsættes. Den intermediære kloningsvektor kan 20 også indeholde et selekterbart markørgen (6).

Dette gen bør indeholde en promotorsekvens, som tillader kopiering af genet i planteceller. Planteceller indeholdende dette markørgen bør have en selektiv vækstfordel i forhold til celler uden 25 dette gen. På denne måde kan planteceller, som er blevet transformeret ved hjælp af DNA indeholdende dette markørgen, skelnes fra ikke-transformerede planteceller.

Fig. 3 illustrerer en anden udførelsesform for en inter-30 mediær kloningsvektor ifølge opfindelsen, som ligner den intermediære kloningsvektor ifølge fig. 2, og som skal indsættes ved en enkelt overkrydsning i acceptor Ti-plasmidet ifølge fig. 1.

Den indeholder kloningsmiddel DNA-segmentet (3'), 35 en promotorsekvens (8), som tillader regu leret kopiering af genet eller generne (7), som har interesse, og, om ønsket, et markørgen (6).

DK 173104 B1 18

Fig. 4 illustrerer skematisk dannelsen af hybrid Ti- plasmidvektorer ifølge opfindelsen ud fra acceptor Ti-plasmidet ifølge fig. 1 og de intermediære kloningsvektorer ifølge fig. 2 og 3 ved en 5 enkelt overkrydsning.

Fig. 5 illustrerer de trin, som indgår i den genetiske overføring af en intermediær kloningsvektor fra Escherichia coli til Agrobacterium indeholdende et acceptor Ti-plasmid. Det første trin er konjuge-10 ringen af Escherichia coli-stammen (1), som inde holder den intermediære kloningsvektor, til en anden Escherichia coli-stamme (2), som indeholder to hjælperplasmider for den senere konju-gering til Agrobacterium. Et hjælperplasmid inde-15 holder DNA-sekvenser, som er vigtige for plas- midoverføring (tra), og det andet hjælperplasmid indeholder sekvenser, som har betydning for mobiliseringen (mob). Når disse hjælperplasmider er indført ved konjugering i Escherichia coli-stamme 20 (1), vil den intermediære kloningsvektor inde holdt deri kunne overføres til andre bakteriestammer. tra og mob hjælper-plasmiderne inde-, r holder også antibiotiske resistentmarkører Ab r 3 og Ab , som er forskellige fra de markører, som r1 25 findes i den intermediære kloningsvektor (Ab ).

Tilstedeværelsen af alle plasmiderne kan således kontrolleres på selektive medier. Der dannes en mobiliseringsstamme (3). Denne mobiliseringsstamme (3) konjugeres til en Agrobacterium tume-30 faciens-stamme (4), som indeholder acceptor Ti-plas midet ifølge fig. 1, efterfulgt af selektion for en eller flere antibiotiske resistensmarkører fra den intermediære kloningsvektor. Da den intermediære kloningsvektor ikke kan kopiere i Agro-35 bacterium, kan den kun opretholdes, hvis den har dannet et kointegrat med recipient acceptor Ti-plasmidet. Denne kointegratstruktur i Agrobacterium (5) er det færdige hybrid Ti-plasmid, som anvendes DK 173104 B1 19 til at overøfre DNA til plantecellegenomer.

Fig. 6 illustrerer dannelsen af et modelacceptor Ti-plasmid (A), som er analogt med det i fig. 1 viste. Her foretages en dobbelt overkrydsning 5 mellem et Ti-plasmid og et andet plasmid, som indeholder en DNA-sekvens, som skal erstatte en del af det oprindelige Ti-plasmid. Nærmere betegnet indeholder det mindre plasmid grænsesekvenserne for T-området (1,2) i et kloningsmiddel (3).

10 En dobbelt overkrydsning resulterer i sletningen af den indre del T af T-området og ombytning deraf med kloningsmidlet. Det dannede acceptor Ti-plasmid (A) kan overføre DNA indeholdt mellem grænsesekvenserne (1,2) til plantecellegenomer. Det 15 dannede transformerede plante-DNA vil ikke danne tumorøst krongallevæv, da generne, som kontrollerer neoplastisk vækst» er slettet i Ti-plasmidet (A). Ti-plasmid (A) er et meget generaliseret acceptor Ti-plasmid for en vilkårlig intermediær 20 kloningsvektor med homologi med kloningsmidlet (3).

Kloningsmidlet (3) kan være et konventionelt plasmid, såsom pBR322 (eller derivater deraf).

Fig. 7 illustrerer skematisk de trin, som fører til dannelsen af en intermediær kloningsvektor i Esche-25 richia coli-værtsceller. Et gen (5), som har in teresse* omgivet af restriktionsendonucleasestedet RI og et selekterbart makørgen (6) omgivet af restriktionsendonucleasestedet R2 indsættes i et kloningsmiddel (3')» som indeholder enkeltrestrik-30 tionssteder for enzymerne RI og R2. Alle tre molekyler nedbrydes med restriktionsenzymer RI og/eller R2 og ligateres eller bindes sammen under anvendelse af DNA-ligase til dannelse af den intermediære kloningsvektor. Kloningsmidlet 3' 35 skal også indeholde yderligere DNA-sekvenser, som koder for antibiotisk resistens (Abr ) til anvendelse som en selekterbar markør for bakterielle ge- 20 DK 173104 B1 ner. Genet (5), som har interesse, kan være under kontrol af dets naturlige promotor eller af en exogen promotor som vist i fig. 2 og fig.

3.

5 Fig. 8 illustrerer dannelsen af en anden udførelsesform af et acceptor Ti-plasmid (B) ifølge opfindelsen.

Her foretages en dobbelt overkrydsning mellem et Ti-plasmid og et kloningsmiddel (3), som indeholder DNA-sekvenser (9) og (10) , som er homologe 10 til Ti-sekvenser lige udenfor grænsesekvenserne henholdsvis (1) og (2). Dobbeltoverkrydsningen medfører sletning af hele T-området T inklusive grænsesekvenserne (1) og (2) og ombytning deraf med kloningsmidlet (3). Ti-plasmid (B) er en 15 acceptor for intermediære kloningsvektorer, som indeholder det gen, som har interesse, klonet mellem grænsesekvenserne (1) og (2), jfr. fig. 9.

Fig. 9 illustrerer en intermediær kloningsvektor ifølge opfindelsen, som skal indsættes ved en enkelt 20 overkrydsning i acceptor Ti-plasmidet (B) ifølge fig. 8. Det indeholder grænsesekvenserne (1) og (2), som er anbragt på siderne af genet eller generne (5), som har interesse. Den indeholder også en kloningsmiddelsekvens (3‘), som er i 25 det mindste delvis homolog til kloningsmiddel- sekvensen (3) i acceptor Ti-plasmidet (B) for at tillade homolog rekombination mellem de to plas-mider.

Fig. 10 illustrerer skematisk dannelsen af hybrid Ti-plas-30 midvektorer ifølge opfindelsen ud fra acceptor-

Ti-plasmidet (B) ifølge fig. 8 og den tilsvarende intermediære kloningsvektor ifølge fig. 9. En enkelt overkrydsning indfører den intermediære kloningsvektor ifølge fig. 9 i acceptor Ti-plasmidet (B) 35 ifølge fig. 8.

DK 173104 B1 21

Opfindelsen forklares mere detaljeret under henvisning tiæ fig. 11-20 på tegningen.

Fig. 11 illustrerer indsætningen af 5,2 kb Hindlll-frag-mentet AcgB i pBR322 (se også Zambryski et al.,

5 Science 209 (1980), 1385-1391). Dette fragment AcgB

indeholder de højre og venstre grænseområder af nopalin Ti-plasmidet. Denne kon pAcgB anvendes til dannelsen af acceptorplasmid pGV3850, som er et "A-lignende" acceptorplasmid som vist i fig. 6. Det er 10 indlysende for en fagmand, at en klon, som er analog med klon pAcgB, kan dannes ved at anvende de klonede restriktionsfragmenter, som indeholder det venstre og højre grænseområde af et vild-type Ti-plasmid.

15 Fig. 12 illustrerer T-området af nopalin Ti-plasmid pGV3839.

Hindlll-restriktionsendonucleasestederne er betegnet med (H). Det muterede Hindlll-fragment 19 er betegnet (19')· Acetylphosphotransferasegenet, som tilvejebringer kamamycin- eller neomycinresistens, 20 er betegnet som apt og findes i det sorte område.

Grænserne for T-området er angivet ved hjælp af pile. Nopalinsyntetasegenet er betegnet med nos.

Tallene refererer til størrelserne af restriktionsfragmenterne i overensstemmelse med Depicker et al., 25 Plasmid 3 (1980), 193-211. Dannelsen af Ti-plasmi det pGV3838 er beskrevet i eksempel 1 og i de to anførte litteratursteder.

Fig. 13 illustrerer dannelsen af acceptor Ti-plasmid pGV 3850. Plasmidet pBR322-pAcgB (fig. 11) er vist på lineær 30 form. pBR322-sekvenserne er vist ved det dobbelt- skraverede område, og ampicillinresistensgenet af pBR322 ved ApR. En del af T-området af pGV3839, som er vist i fig. 12, er vist her. Hindlll-fragmen-terne (10) og (23), som indgår i homolog rekombina-35 tion med pAcgB og apt-genet, er vist. Dobbeltover krydsninger fører til dannelsen af pGV3850 og et DK 173104 B1 22 andet replikon, som indeholder apt-genet, som går tabt.

Fig. 14 viser skematisk dannelsen af den intermediære kloningsvektor pGV700, som er beskrevet detaljeret 5 i eksempel 2. Der anvendes følgende forkortelser til at betegne restriktionsendonucleasesteder: B, BamHi, BG, Bglll, E, EcoRI, H, Hindlll, S, Sall, : Sm, Smal. Endvidere anvendes følgende forkortelser til at betegne antibiotisk resistens: Ap, ampicillin, 10 Cm, chloramphenocol, Sm, streptomycin, Tc, tetracyc- lin. Tallene nederst på figuren, som referer til TL-DNA, angiver RNA-transkripterne for dette område (Willmitzer et al., EMBOJ. 1 (1982), 139-146).

Fig. 15 illustrerer strukturen af den intermediære klonings-15 vektor pGV750. Dens fremstilling er beskrevet i eksempel 2. Restriktionsendonucleasestederne er angivet med deres relative placeringer anført i tal som kilobasepar (kb). Pstl-steder er ikke angi-vet, men der findes tre i Km /Nm -området, og et i

D

20 Cb -genet. De højre og venstre grænser er ligeledes angivet. Bglll/BamHI- og Hpal/Smal-stederne, som anvendes ved dannelsen af pGV750, er angivet, men findes ikke i pGV750. Det grå område svarer til TL-DNA, det sorte område til Km /Nm -området, og 25 det hvide område til tilstødende Ti-plasmidsekven- ser, og linien til kloningsmidlet pBR325. Desuden anvendes følgende forkortelser: Ocs, octopinsynte-

R R

tase; Cm , chloramphenicolresistens; Cb , carbeni-

R R

cillinresistens (analog til ampicillin) og Km /Nm , 30 kanamycinresistens/neomycinresistens.

Fig. 16 illustrerer dannelsen af den intermediære vektor pGV745, som er beskrevet i detaljer i eksempel 3. pGV745 anvendes ved dannelsen af acceptorplasmidet pGV2260, som er et "B-lignende" acceptorplasmid, 35 vist i fig. 8. Restriktionsendonucleasestederne er betegnet på følgende måde: B, BamHI; H, Hindlll, DK 173104 B1 23 og R, EcoRI. Ampicillinresistensgenet er betegnet p som Ap . Det skraverede område betegner DNA, som er homologt med den venstre side af T-DNA-området i octopin-Ti-plasmidet, og det hvide område beteg-5 ner DNA, som er homolog med den højre side af T- DNA-området af octopin-Ti-plasmidet. Den fysiske placering og beskrivelsen af udgangsplasmiderne pGV0219 og pGV0120 er beskrevet i De Vos et al.. Plasmid 6 (1981), 249-253.

10 Pig. 17 illustrerer dannelsen af acceptorplasmidet pGV2260.

Sletningssubstitutionen i pGV2217 er angivet som et sort område indeholdende acetylphosphotranfera-segenet (betegnet apt), som tilvejebringer neomycin-og kanamycinresistens. Den intermediære vektor pGV745 15 (fig. 16) er vist på lineær form. Den er åbnet på

Hindlll-stedet i pGV745 vist i fig. 16. pBR322-se-kvensen er angivet som et skraveret område, og ampi- p cillinresistensgenet er betegnet med Ap . Dobbelt-overkrydsninger fører til dannelsen af pGV2260 og 20 tab af apt-genet. Restriktionsendonucleasestederne betegnes på følgende måde: B, BamHI; H, Hindlll og R, EcoRI.

Fig. 18 illustrerer dannelsen af et plasmid pLGV2381 til kopieringen af gener, som ligger medstrøms eller 25 nedenfor promotoren i nopalinsyntetasegenet (nos).

Tallene 5' og 3' refererer til begyndelsen og slutningen for transkription, og ATG og TAA refererer til de kodoner, som anvendes til at starte og til at afbryde translationen. Den tykke sorte linie 30 angiver nos-promotor-området, og det hvide område

D

angiver nos-kodningsområdet. Ap står for ampicillin- t> resistens, og Km betyder kanamycinresistens.

Fig. 19 illustrerer dannelsen af plasmidet pAGVIO indehol-35 dende den fuldstændige octopinsyntetasekodnings- sekvens (ocs) og indsættelsen deraf i plasmid pLGV2381 (se også fig. 18) bag ved nos-promotoren. De tykke DK 173104 B1 24 sorte linier refererer til promotorområdene, og de hvide områder refererer til ocs-kodningsområdet.

De øvrige betegnelser er som i fig. 18.

Fig. 20 illustrerer nucleotidsekvenserne omkring promotor-5 området i nopalinsyntetasegenet (nos) og nucleo tidsekvenserne omkring det samme område efter fusion med kodningsområdet i octopinsyntetasegenet. Fusionspunktet er betegnet med en asterisk (*). Adskillige restriktionsendonucleasesteder er anført/ 10 BamHI, Hindlll og Sacll. Tallene 5' og 3' refererer til begyndelsen og ophør for transkription. ATG refererer til den første kodon, som anvendes i translationen, og TAA refererer til stopkodonen, som anvendes i translation. De lange pile angiver 15 kodningsområderne for nopalingenet i hvidt og octo- pingenet i striber.

I det følgende forklares opfindelsen yderligere i detaljer under henvisning til tegningen.

Fig. 1 viser et simplificeret diagram af et acceptor Ti-20 plasmid. Dette acceptor Ti-plasmid indeholder de to grænsesekvenser (1,2) eller områder af det tumorinducerende (Ti)-plasmid af vildtypen. Grænsesekvenserne er vigtige for integreringen af T-området i Ti-plasmider i et plante-cellegenom. De er med andre ord vigtige for integreringen 25 af en vilkårlig DNA-sekvens (3) eller et vilkårligt T-om- råde i et plantecellegenom beliggende mellem disse sekvenser.

DNA-sekvensen (3) i acceptor Ti-plasmidet indeholder et DNA-segment, som er homologt med i det mindste en del af en DNA-sekvens (3') i en intermediær kloningsvektor illu-30 streret i fig. 2 og 3. Denne homologi er nødvendig for kointegrering ved en enkelt overkrydsning (homolog rekombination) af den intermediære kloningsvektor ved acceptor Ti-plasmidet. Hyppigheden for opnåelse af kointegrater er i det væsentlige bestemt af længden af homologiområdet.

35 For at fremkalde en homolog rekombination med høj hyppig- 25 DK 173104 B1 hed anvendes sædvanligvis områderne fra 1-4 kb (Leemanns et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1981), 149-164).

Acceptor Ti-plasmidet indeholder endvidere sekvenser (4), 5 som er vigtige for overføringen med Agrobacterium af T-om-rådet af Ti-plasmiderne til plantecellegenomer.

Dannelsen af sådanne acceptor Ti-plasmider og deres kointegrering med intermediære kloningsvektorer illustreret 10 i fig. 2 og 3 beskrives nærmere i det følgende i forbindelse med omtalen af fig. 4.

I fig. 2 og 3 er vist simplificerede diagrammer for intermediære kloningsvektorer for kloningen af vilkårlige pro-15 karyote eller eukaryote gener, som har interesse, og som skal udbredes eller kopieres, dvs. transkriberes under kontrol af en promotor og translateres i planteceller. Disse intermediære kloningsvektorer indeholder et DNA-segment (3') fra et kloningsmiddel indeholdende en DNA-sekvens, som er 2o homolog med mindst en del af DNA-segmentet (3) af acceptor Ti-plasmidet, hvilket muliggør en enkelt overkrydsning. Endvidere indeholder de intermediære kloningsvektorer mindst et gen (5;7), som har interesse, og som indeholder den naturlige promotorsekvens. Promotorsekvensen tillader 25 kopiering af den eller de indsatte gensekvenser.

Eksempler på forskellige former for regulering indbefatter følgende: (1) vævspecifik kopiering, dvs. blade, rødder, stængler, blomster, (2) kopieringsniveau, dvs. højt eller 3Q lavt, og (3) inducerbar kopiering, dvs. ved hjælp af temperatur, lys eller tilsatte kemiske faktorer.

Eksempler på gener, som har interesse, for de intermediære kloningsvektorer er DNA-fragmenter eller sekvenser med den 35 genetiske information, som kontrollerer syntesen af produkter, såsom aminosyrer eller sukkerarter, til modificering DK 173104 B1 26 af en plantes nærings- eller vækstpotential, eller produkter, som giver beskyttelse mod ydre patogene sygdomsfremkaldere, såsom resistens mod sygdomsorganismer eller belastende miljøfaktorer, eller produkter, som giver infor-5 mation om grundliggende planteprocesser, som skal modificeres ved genspiejsningsteknik.

Fig. 2 og 3 viser begge intermediære kloningsvektorer, som kan indeholde selekterbare markørgener (6). Som eksempler på selekterbare markørgener kan nævnes sådanne, som ind-10 koder resistens overfor antibiotika eller toksiske analoge forbindelser (f.eks. aminosyreanaloge), eller gener, som kan afhjælpe en defekt i recipientværtscellen.

Fig. 4 illustrerer strukturerne, som indgår i dannelsen af hybrid Ti-plasmidvektorer, og fig. 5 illustrerer 15 de faktiske konjugationstrin, som indgår i isoleringen af Agrobacterium, der bærer hybrid Ti-plasmidvektorerne. Da den intermediære kloningsvektor er dannet i Escherichia coli, er disse trin nødvendige for at overføre den intermediære kloningsvektor til acceptor Ti-plasmidet i Agro-20 bacterium.

Den kendte overføringsproces, som anvendes til fremstilling af modificerede Ti-plasmider, hvori en del af T-om-rådet er ombyttet med en ændret sekvens, omfatter mange trin. Sædvanligvis gennemføres de fleste DNA rekombinant-25 manipulationer i specielt udformede kloningsmidler, såsom pBR322 (Bolivar, Gene 2 (1977), 75-93). Imidlertid kan disse kloningsmidler ikke selv overføres til Agrobacterium.

Ved de kendte fremgangsmåder er dette problem løst på følgende måde: 30 a) pBR-kloningsmiddelsekvensen ombyttes med et andet bred-vært-område-kloningsmiddel, såsom mini-Sa-plasmidet (Leemanns et al., Gene 19 (1982), 361-364), som også kan formere sig i Agrobacterium. Disse manipulationer gennemføres i Escherichia coli. Der dannes en intermediær kloningsvektor.

35 b) Konjugering af Escherichia coli-stammen, som bærer den intermediære kloningsvektor indeholdende det DNA, som har DK 173104 B1 27 interesse, med en anden Escherichia coli-stamme, som bærer et hjælperplasmid, som ikke kan kopiere i Agrobacterium, men som kan formidler overføring af sig selv og andre DNA'er til Agrobacterium.

5 c) Konjugering af Escherichia coli dannet i trin b) med Agrobacterium indeholdende et Ti-plasmid. Hjælperplasmidet går tabt.

d) Da den interraediære kloningsvektor er i stand til at kopiere og eksistere i Agrobacterium som en separat repli- 10 kon, er konjuganterne dannet i trin c) en blanding af celler indeholde enten kointegratet mellem den intermedi-ære kloningsvektor og Ti-plasmidet eller andre celler indeholdende den intermediære kloningsvektor og Ti-plasmidet, hvor der ikke er sket nogen kointegrering. For ude-15 lukkende at isolere kointegraterne, er det nødvendigt at gennemføre en anden konjugation til en anden Agrobacterium-stamme uden et Ti-plasmid. Denne overføring formidles ved hjælp af funktioner, scan indkodes ved hjælp af Ti-plasmidet selv. Overføring af den intermediære kloningsvektor til 20 den anden Agrobacterium-stamme gennemføres kun i form af et kointegrat med Ti-plasmidet.

e) Til dannelse af det endelige modificerede Ti-plasmid med den ønskede ombytning foretages en anden overkrydsning (Leemanns et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1981) , 149-164).

25 Den eneste anden kendte metode svarer stort set til den ovenfor beskrevne, idet der dog i trin d) indføres et andet plasmid, som ikke er foreneligt med den intermediære kloningsvektor, i Agrobacterium. I dette tilfælde kan kointegrationen (enkelt overkrydsning) vælges, da alle de inter-30 mediære kloningsvektorer, der bliver tilbage som uafhængige replikoner, vil gå tabt. (Matzke et al., J. Mol. Appl. Genet.

1 (1981), 39-49).

Den foreliggende opfindelse omhandler en ny og yderst enkel fremgangsmåde til indføring af intermediære klonings-35 vektorer i acceptor Ti-plasmider i Agrobacterium. Kort sagt er denne fremgangsmåde baseret på erkendelsen af, at hjælperplasmider fra Escherichia coli tillader direkte » ' DK 173104 B1 28 overføring af mange af de almindeligt anvendte klonings-plasmider, såsom pBR322, til Agrobacterium. Da ingen af disse plasmide’r kan kopiere i Agrobacterium, vil kun de plasmider, som kan danne kointegrat med acceptor Ti-plas-5 midet, blive tilbage. Ifølge opfindelsen anvendes endvidere dette kointegrat i Agrobacterium direkte som en vektorkomposition til infektion af planteceller. På denne måde er det muligt at eliminere de ovenfor beskrevne trin d) og e), hvilket i vid udstrækning forøger mulighederne 10 for at anvende acceptor Ti-plasmider som vektorer for DNA-overførsel til plantecellegenomer ved både at formindske den tid, der kræves til dannelse af modificerede hybrid Ti-plasmider, og ved at forøge fleksibiliteten af de mulige kontruktioner.

15 Som vist i fig. 5 gennemføres indføringen af den interme-diære kloningsvektor i acceptor Ti-plasmidet således i to trin. Først foretages konjugering af en Escherichia coli-stamme (1), som bærer den intermediære kloningsvektor, til en anden Escherichia coli-stamme (2) , som bærer to plas-20 mider, som hjælper til at mobilisere den intermediære kloningsvektor til Agrobacterium. Typiske og foretrukne eksempler på disse hjælperplasmider er R64drdll indeholdende mob-funktioner og pGJ28 indeholdende tra-funktioner (Finnegan et al., Mol. Gen. Genet. 185 (1982), 344-351).

25 Et bom-sted (Warren et al., Nature 274 (1978), 259-261) på kloningsmidlet i den intermediære kloningsvektor erkendes ved hjælp af de funktioner, som indkodes ved hjælp af de to andre plasmider, således at overføring kan finde sted.

Alle plasmider bør fortrinsvis indeholde antibiotikumresi-30 stensmarkører, for at deres tilstedeværelse kan påvises.

For det andet konjugeres den dannede Escherichia coli-stamme, dvs. den mobiliserede stamme (3), som bærer alle tre plasmider, til Agrobacterium indeholdende et acceptor Ti-plasmid med et homologiområde med den inter-35 mediære kloningsvektor. En enkelt overkrydsning mellem den intermediære kloningsvektor og acceptor Ti-plasmidet kan påvises ved selektion for antibiotikaresistensmarkøren i den intermediære kloningsvektor.

DK 173104 B1 29

Fig. 6 illustrerer skematisk de DNA-molekuler, som anvendes til dannelse af acceptor Ti-plasmidet vist i fig.

1. Dette acceptor^Ti-plasmid betegnes (A) for at skelne det fra det andet acceptor Ti-plasmid (B) (fig. 8). Dan-5 nelsen kræver en dobbeltoverkrydsning mellem et Ti-plasmid og et andet plasmid, son» bærer grænsesekvenserne (1) og (2) i et kloningsmiddel (3). Scan vist i figuren ligger kloningsmiddelsekvensen (3) mellem grænsesekvensen (1) til venstre og (2) til højre. For at vise den korrekte 10 polaritet af DNA-strengene, kan denne tegnes på en cirkel. For at vise homologioraråderne, som anvendes ved dobbeltoverkrydsningen, er det imidlertid nødvendigt at bryde denne cirkel som vist. Dette er et vigtigt træk at forstå, og det anvendes også ved dannelsen af acceptor-15 Ti-plasmid (B) i fig. 8, dvs. hvis grænsesekvenserne (1) og (2) blot indsættes i kloningsmiddelsekvensen (3), ville en dobbeltoverkrydsning danne et Ti-plasmid med et slettet T-områdev men uden kloningsmiddelsekvensen mellem grænsesekvenserne (1) og (2). Som det også fremgår af 20 fig. 6 bevirker dobbeltoverkrydsningen også et cirkulært DNA-molekule, som indeholder det oprindelige T-område mellem grænsesekvenserne (1) og (2). Da dette ikke er en replikon, vil det gå tabt. Genetisk udvælgelse for disse hændelser kan opnås f.eks. ved at selektere for tabet af 25 en antibiotikumresistensmarkør indeholdt i T-området i Ti-plasmidet og selektere for en antibiotikumresistensmarkør indeholdt i kloningsmiddelsekvensen (3).

Fig. 7 viser skematisk dannelsen af en intermediær kloningsvektor ifølge fig. 2 og fig. 3. Et gen (5), som har 30 interesse, og et selekterbart markørgen (6), begge omgivet af et restriktionsendonucleasested henholdsvis RI eller R2, indsættes i en kloningsmiddelsekvens (3'), som indeholder entydigie restriktionssteder for enzymer Ri og R2, ved nedbrydning og ligatering eller binding af alle molekyler.

35 Det dannede rekombinant DNA-molekyle anvendes til at transformere Escherichia coli-værtsceller, og transformanterne p i selekteres for antibiotikumresistensmarkøren (Ab ) i kloningsmiddelsekvensen (3')· 30 DK 173104 B1

Fig. 8 viser skematisk DNA-molekulerne, som anvendes til dannelse af en anden udførelsesform for opfindelsen, dvs. acceptor Ti-plasmid (B). Her foretages en dobbelt-overkrydsning mellem et Ti-plasmid og et plasmid, som 5 indeholder kloningsmiddelsekvensen (3) mellem DNA-sekven-serne (9) og (10), som findes netop udenfor grænsesekvenserne (1) og (2). For at illustrere de homologe områder, som anvendes ved overkrydsningen, er det lille plasmid blevet brudt (som i fig. 6). Produktet fra den dobbelte 10 overkrydsning er acceptor Ti-plasmid (B) og et andet cirkulært DNA-molekyle, som går tabt, indeholdende T-området fra det oprindelige Ti-plasmid plus DNA-sekven-serne (2), (10) , (9) og (1). Genetisk selektion kan opnås som beskrevet i forbindelse med fig. 6.

15 Fig. 9 illustrerer skematisk en intermediær kloningsvektor, som skal anvendes i kombination med acceptor Ti-plasmidet B ifølge fig. 8. Her indsættes det gen (5), som har interesse, mellem grænsesekvenserne (1) og (2), som er indeholdt i en kloningsmiddelsekvens (31).

20 Fig. 10 viser skematisk, hvorledes en enkelt overkrydsning indfører den intermediære kloningsvektor ifølge fig. 9 til acceptor Ti-plasmidet (B). I dette tilfælde sikrer selektion for antibiotikumresistensmarkøren i kloningsmiddelsekvensen (3') i den intermediære klonings-25 vektor, at man kan finde et hybrid Ti-plasmid, som er resultatet af en kointegration mellem de to plasmider. Et hybrid Ti-plasmid dannes med genet, som har interesse, anbragt mellem grænsesekvenserne (1) og (2). Det således dannede hybridplasmid indeholder ikke i dets T-område en sekvens, 30 som er en direkte gentagelse, som f.eks. sekvenserne (3) og (3'), i hybrid Ti-plasmidet ifølge fig. 4, hvorved man undgår eventuelle instabilitetsproblemer med hybridvektoren eller med det transformerede DNA i plantecellegenomet som følge af intramolekulær rekombination.

35 Laboratorieforsøg viser endvidere, at det til dannelsen af den intermediære vektor i fig. 9 ikke er essentielt at have 31 DK 173104 B1 begge grænsesekvenser 1 og 2. Det er tilstrækkeligt men essentielt at have mindst den højre grænsesekvens (2) (se fig. 1 og fig. 9), for at opnås integration af den ønskede DNA-sekvens i plantegenomet.

5 Kendsskab til restriktionsendonucleaseplanerne i Ti-plas-miderne i Agrobacterium, f.eks. nopalin eller octopin Tiplasmider (Depicker et al., Plasmid 3 (1980), 193-211 og De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 249-253), samt kendskabet til restriktionsfragmenterne, som indeholder T-DNA-grænse-10 områderne (Zambryski et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 361-370 og De Beuckeleer et al., Mol. Gen. Genet. 183 (1981), 283-288), gør det nu muligt at danne acceptor Ti-plasmider i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Der kræves blot, at man kan gennemføre konventionelle 15 rekombinant DNA-operationer og grundlæggende bakteriegenetiske manipulationer. Den foreliggende opfindelse er enestående derved, at den specifikt tilvejebringer de beskrevne acceptor Ti-plasmider, som kan anvendes til dannelsen af hybrid Ti-plasmid-vektorer. Endvidere er disse 20 acceptor Ti-plasmider udformet til at udgøre en del af en fremgangsmåde til indføring af gener i plantecellegeno-met.

De efterfølgende eksempler tjener til yderligere illustration af acceptor Ti-plasmiderne, de intermediære klonings-25 vektorer, hybrid Ti-plasmidvektorerne og vektorkompositionerne og til at vise effektiviteten af vektorkompositionerne ved tilvejebringelse af transformerede planteceller og planter, som udviser kopiering af det eller de fremmede gener, som er integreret i plantecellegenomet.

30 Eksempel 1

Dannelse af acceptor Ti-plasmid PGV3850 (type A)

Udgangsstammer og -plasmider:

Agrobacterium tumefaciens (rifampicin-resistent stamme C58C1 og chloramphenicol-erythromycin-resistent stamme C58C1 af-35 ledt af viIdtype Agrobacterium).

DK 173104 B1 32

Ti-plasmid = pGV3839

Plasmid ifølge fig. 11 = pAcgB

Ti-plasmidet pGV3839 dannes ud fra et nopalinplasmid pTiC58trac (pGV3100, Holsters et al., Plasmid 3 (1980), 5 212-230). Det indeholder en sletningssubstitutionsmutation nær centret af T-området. Smal-fragmentet 24 inden i Hindlll-fragment 19 (Depicker et al., Plasmid 3 (1980), 192-211) er blevet ombyttet med et Hindll-fragment af pKC7 (Rao et al., Gene 7 (1979), 79-82), som indeholder apt (acetyl-10 £hosphotranferase) genet af Tn5. Dette gen koder for resistens overfor aminoglycosiderne neomycin og kanamycin.

I fig. 12 er vist et restriktionskort for T-området af PGV3839.

Plasmidet pAcgB er en indsætningsdel af AcgB i pBR322, 15 som kun indeholder grænserne af T-DNA'et (se fig. 11). Grænserne er defineret som enderne af T-DNA'et, og disse områder spiller en rolle for den stabile integrering af T-DNA'et i plantecellegenomet. Oprindelsen og analysen af denne klon er beskrevet i detaljer af Zambryski et al., 20 Science 209 (1980) , 1385-1391. Denne klon dannes ved at reisolere dele af T-DNA'et fra transformeret tobaks-DNA. pAcgB indeholder forbindelsesstedet for to T-DNA-kopier, som er anbragt efter hinanden, således at det indeholder de venstre og højre grænser af T-DNA'et. Desuden inde-25 holder pAcgB nopalinsyntetasegenet, da disse genetiske informationskort ligger meget tæt ved den højre T-DNA-grænse. Plasmid pAcgB anvendes til dannelsen af et "A-lignende" acceptor Ti-plasmid, pGV3850. Fig. 6 viser de involverede strukturer, og fig. 13 viser mere nøjagtigt 30 de DNA-områder, som er involveret i dobbeltoverkrydsning-gerne, der fører til pGV3850.

Det beskrevne plasmid pAcgB bærer et ColEl-specifikt bomområde i pBR322-delen og kan mobiliseres fra Escherichia coli til Agrobacterium ved anvendelse af hjælperplasmiderne 35 R64drdll og pGJ28. Plasmiderne R64drdll og pGJ28 indeholdt i Escherichia coli indføres i Escherichia coli-stammen, DK 173104 B1 33 som bærer pAcgB, ved konjugation. Transkonjuganter selekteres som ampicillinresistente kolonier (fra pBR322-se-kvenserne i pAcgB), som streptomycinresistente kolonier (fra R64drdll) og som kanamycinresistente kolonier (fra 5 pGJ28).

Escherichia coli-stammen, som bærer alle tre plasmider, konjugeres-til Agrobacteriumstammen C58C1, som er rifam-picin-resistent, og som indeholder Ti-plasmidet PGV3839.

Ampicillinresistenten hos pBR322 anvendes til at selektere 10 for den første enkelte overkrydsning med nopalin Ti-plasmidet. Den eneste måde, hvorpå ampicillinresistenten kan stabiliseres i Agrobacterium, er en overkrydsning efter homolog rekombination med pGV3839 gennem et af homologi-områderne nær grænserne for T-området. Ved en anden over-15 krydsning gennem det andet homologiområde ombyttes den centrale del af T-området i pGV3839 inklusive apt-genet (kanamycinresistens) med pBR322-sekvenserne i klonen pAcgB.

Anden rekombinanter er således ampicillinresistente og kanamycinfølsomme. For at forøge sandsynligheden for iso-20 lering af en anden rekombinant, konjugeres den rifampi-cinresistente Agrobacterium, som bærer den første rekombinant (pAcgB:pGV3839) med en anden chloramphenicol/erythro-mycin-resistent Agrobacteriumstamme uden et Ti-plasmid. På denne måde kan der opnås en chloramphenicol/erythromycin-25 resistent Agrobacterium pGV3850, som er ampicillinresistent og kanamycinfølsom, med en hyppighed på ca. en ud af 600 kolonier.

Der findes naturligvis andre Ti-plasmider, som kan anvendes til acceptor Ti-plasmider af pGV3850-typen. Ethvert Ti-30 plasmid, som bærer et selekterbart markørgen nær centret i T-området, kan anvendes som recipient. Endvidere kan et pAcgB-lignende plasmid dannes ved at indsætte T-område-grænsefragmenter'ne i pBR322 på en sådan måde, at pBR322-sekvenserne ligger mellem det venstre grænsefragment og 35 det højre grænsefragment i orienteringen venstre grænse-fragment-pBR322-højre grænsefragment. Eksempelvis er de venstre og højre grænsefragmenter af nopalin Ti-plasmidet 34 DK 173104 B1 henholdsvis HindIII-fraiment 10 og 23 (Depicker et al./

Plasmid 3 (1980) , 193-211) .

En enkelt overkrydsning vil indføre en intermediær kloningsvektor indeholdende et vilkårligt gen, som har 5 interesse, som indsættes i pBR322 (eller derivater deraf) til det modificerede T-DNA-område i pGV3850. Det eneste krav er, at DNA'et, som skal indføres, indeholder et yderligere resistenSmarkørgen udover de, som allerede findes i pBR322 til anvendelse til selektering for overføringen 10 af den intermediære kloningsvektor fra Escherichia coli til Agrobacterium. Denne resistenemarkør kan være inde- p holdt enten i pBR-sekvenserne (såsom Cm for pBR325 p eller Km for pKC7) eller i det DNA, som skal afprøves i plantecellen. I acceptor Ti-plasmidet pGV3850 kan

O

15 endvidere Ap -genet pBR322 ombyttes med et andet resistens-

D

markørgen, såsom Km . På denne måde kan selv pBR322-hol- p dige intermediære kloningsvektorer, som er Ap »mobiliseres direkte til dette pGV3850-lignende acceptor Ti-plasmid.

En yderligere fordel ved acceptor Ti-plasmidet af pGV3850-20 typen er, at det ikke danner tumorer i transformerede planteceller. Celler, som er blevet "transformeret" ved hjælp af pGV3850, kan let screenes fra ikke-transforme-rede celler ved at analysere for tilstedeværelsen af nopa-lin, da det afkortede T-DNA-område af pGV3850 stadig inde-25 holder genet, som koder for nopalinsyntase. Hvis den intermediære kloningsvektor, som er kointegreret til acceptor Ti-plasmidet pGV3850, indeholder et markørgen, kan det naturligvis også direkte screenes eller selekteres.

Foruden indsætning af definerede intermediære klonings-30 vektorer indeholdende en pBR322-sekvens ved en enkelt overkrydsning i acceptor Ti-plasmidet pGV3850, kan dette acceptor Ti-plasmid også anvendes som recipient for klonede grupper af DNA i pBR322 eller derivater deraf i et forsøg af "shotgun"-typen. Den totale population af hybrid-35 plasmidvektorer i Agrobacterium kan anvendes til at inficere planteceller, hvorefter der screenes for kopiering DK 173104 B1 35 af et eller flere selekterbare gener, som har interesse.

Man kan f.eks. let selektere for gener, som koder for aminosyresyntese, ved at overføre den samlede gruppe til planteceller, som ikke danner den valgte aminosyre.

5 Acceptor Ti-plasmidet pGV3850 har to phenotypiske karakteristika; (1) Det kan ikke danne tumorer og (2) det er i stand til at syntetisere nopalin, hvis der sker T-DNA-overføring til plantecellegenomet. Der foretages således forskellige 10 forsøg for at kontrollere disse karakteristika i forskellige plantevæv inficeret med Agrobacterium-holdig pGV3850.

a) Forsøg med kartoffel- og gulerodsskiver.

Inokulering af kartoffel- og gulerodsskiver med acceptor Ti-plasmidet pGV3850 bevirker dannelse af en lille mængde 15 callus-væv. Dette væg testes for tilstedeværelsen af nopalin, og testen er positiv. Det er interessant, at denne mutant er i stand til at danne lidt callus-væv. Det kan imidlertid kun dannes, hvis skiverne dyrkes i medier, som indeholder lave koncentrationer af både auxiner og 20 cytoquininer.

b) Inokulering af hele planter med acceptor Ti-plasmid pGV3850.

Tobaks- og petuniakimplanter, som dyrkes på steril agarmedium (uden hormoner), inokuleres med pGV3850. Lidt vævs-25 vækst kan kun konstateres efter flere måneders forløb (normalt påvises "vildtype" tumorer efter 2 uger). Dette væv vokser ikke på hormonfri medier, men kan formeres yderligere som steril vævskultur på medier, som indeholder både auxin og cytoquinin. Dette væv viser sig også at være nopa-30 lin-positivt.

c) Da pGV3850 "transformerede" celler endvidere ikke er tumoragtige, kan disse celler regenere i normale planter, som i genomet stadig indeholder det overførte DNA-segment. Normale planter kan fås ved dyrkning af de transformerede 35 celler på konventionelle regenereringsmedier (se også eksem- pel 5).

DK 173104 B1 36

For at vise anvendeligheden af pGV3850 som et acceptor-plasmid gennemføres følgende forsøg. En intermediær kloningsvektor indeholdende oncogene funktioner af octopin 5 T-DNA'et i pBR325 rekombineres til Agrobacterium indeholdende pGV3850. Det dannede hybrid Ti-plasmid i Agrobacte-rium dannet ved en enkelt overkrydsning inokuleres til sårede tobaksplanter. Efter ca. to ugers forløb udvikles tumorvæv. Dette viser, at det tumorinducerende DNA er gen-10 indført i pGV3850 og er kopieret rigtigt i transformerede planteceller.

Eksempel 2

Dannelse af intermediære kloningsvektorer pGV700 og pGV7 5 0_ 15 En oversigt over konstruktionerne er vist skematisk i fig. 14. HindiIl-fragment 1, som repræsenterer den højre del af TL-DNA af octopin Ti-plasmidet B6S3, og som findes i pGV0201 (De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 249-253), indsættes først i Hindlll-stedet i bred-værts-område-vekto-20 ren pGVH22 (Leemanns et al., Gene 19 (1982), 361-364). Rekombinantplasmidet pGV0201 indeholder Hindlll-fragmen-tet 1 indsat i det entydige Hindlll-sted i multikopivek-toren pBR322 (Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95-113). pGV0201 og pGV1122 DNA fremstilles som beskrevet af Betlach et al., 25 Fed. Proc. 35 (1976), 2037-2043. 2 ug pGV0201 DNA nedbrydes fuldstændigt med 2:enheder Hindlll (alle restriktionsenzymer er fra firmaet Boehringer Mannheim) i 1 time ved 37°C i et slutrumfang på 20 pi. Inkuteringspufferen er beskrevet af O’Farrell et al., Mol. Gen. Genet 179 (1980), 30 421-435. 2 ug pGVH22 DNA nedbrydes fuldstændigt med Hindlll under de samme betingelser.

0,1 ug Hindlll nedbrudt pGV0201 bindes til 0,05 ug Hindlll-nedbrudt pGV1122 med 0,02 enheder T4-ligase (Boehringer Mannheim) i et slutrumfang på 20 μΐ. Den anvendte inkuberings-35 puffer og betingelserne er anbefalet af producenten (brochure "T4 ligase", Boehringer Mannheim, august 1980, DK 173104 B1 37 nr. 10.M.880.486). Der foretages transformering af ligateringsblandingen til kompetente Escherichia coli K514 hsr” hsm+ celler (Colson et al., Genetics 52 (1965), 1043-1050) som beskrevet af Dagert og Ehrlich, Gene 6 (1980), 23-28.

5 Celler anbringes på plader med LB-medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972) , Cold Spring Harbor Laboratory, New York) tilsat strptomycin (20 yg/ml) ,og spectinomycin (50 yg/ml). Transformanter indeholdende rekombinantplasmider screenes for tetracyclinfølsomhed 10 (10 yg/ml) som følge af den indsatte inaktivering af genet, der koder for tetracyclinresistens (Leemanns et al., Gene 19 (1982), 361-364). Streptomycinresistente og spectimycin-resistente samt tetracyclinfølsomme kolonier karakteriseres fysisk. Der foretages DNA-præpareringer i mikroskala 15 ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Klein et al.,

Plasmid 3 (1980), 88-91 Orienteringen af Hindlll-fragmen-tet 1 i Hindlll-stedet i pGV1122 bestemmes ved nedbrydning med Sall. Nedbrydning (der anvendes betingelser ifølge O'Farrell et al., Mol. Gen. Genet. 179 (1980), 421-435) 20 af rekombinantplasmider giver 2 fragmenter efter agarosegel-elektroforese. I α-orienteringen er der fragmenter på 0,77 kb og 22,76 kb, hvorimod der i β-orienteringen er fragmenter på 10,33 kb og 13,20 kb. Et rekombinantplasmid med a-orienteringen anvendes til efterfølgende kloning og beteg-25 nes pGV1168.

Et Bglll-Sall-fragment indeholdende den venstre del af TL-DNA’et (inklusive den venstre grænsesekvens) indføres i pGVll68, spaltet med Bglll-Sall. Dette fragment er dannet fra rekombinantplasmidet pGV0153 (De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 30 249-253), som indeholder BamHI-fragment 8, fra T-området af pTiB6S3, indsat i vektoren pBR322. pGV0153 og pGVH68 DNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Betlach et al., (Fed. Proc. 35 (,976), 2037-2043). 10 yg pGV0153 DNA nedbrydes fuldstændigt med 10 enheder Bglll og 35 10 enheder Sall i 1 time ved 37°C i et slutrumfang på 100 yl.

Nedbrydningsblandingen sættes på en præparativ 0,8% agarose-gel. 2,14 kb BlgXI-Sall-fragmentet udvindes fra denne gel ved elektroeluering som beskrevet af Allington et al., Anal.

DK 173104 B1 38

Biochim. 85 (1978), 188-196. 2 yg pGV1168 DNA nedbrydes fuldstændigt med 2 enheder BgflI og 2 enheder Sall. 0,1 yg BglII-SalI-fragment DNA bindes til 0,02 yg Bgllll-Sall-nedbrudt pGV1168 med 0,02 enheder T4 DNA-ligase i et 5 slutrumfang på 20 yl. Ligateringsblandingen transformeres til kompetente Escherichia coli K514 hsr hsm+ celler (Dagert og Ehrlich, Gene 6 (1980) 23-28) . Cellerne anbringes på plader med LB-medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972) , Cold Spring Harbor Laboratory, 10 New York), som er tilsat streptomycin (20 yg/ml) og spec-tinomycin (50 yg/ml).

Der fremstilles DNA-præparater i mikroskala (Klein et al., Plasmid 3 (1980), 88-91) ud fra streptomycinresistente og spectinomycinresistente transformanter. Rekombinant-15 plasmider, hvori 2,14-kb-BglII-SalI-fragmentet er indsat i Bglll-Sall-nedbrudt pGV1168, identificeres ved Bglll-Sall-nedbrydning, og der fås to fragmenter på henholdsvis 2,14 kb og 21,82 kb. Et plasmid med et nedbrydningsmønster svarende til disse molekylvægte (2,14 kb og 21,82 kb) anvendes til 20 yderligere kloning og betegnes pGV1171. Et 12,65-kb-fragment fra pGV1171 indeholder de højre og venstre TL-DNA grænsesekvenser (De Beuckeleer et al., in Proceedings IVth International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, Μ.

Ridé (ed.) (1978), I.N.R.A., Angers, 115-126), samt gener, 25 som tillader oncogen formering (Leemanns et al., EMBO J.

(1982), 147-152). Dette Hindlll-fragment indsættes i plas-midet pBR325 (Bolivat, Gene 4 (1978), 121-136). pGV1171 og pBR325 fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Betlach et al., Fed. Proc. 35 (1976), 2037-2043. 2 yg af 30 hver DNA nedbrydes fuldstændigt med to enheder Hindlll i 1 time ved 37°C (inkuberingspuffer beskrevet af O'Farrell et al., Mol. Gen. Genet. 179 (1980), 421-435). 0,1 yg Hindlll-nedbrudt pGV1171 bindes til 0,05 yg pBR32!% linearis.eret med HindllL med 0,02 enheder T4 DNA-ligase. Transformering af 35 ligateringsblandingen til kompetente Escherichia coli K514 hsr” hsm celler udføres som beskrevet af Dagert og Ehrlich,

Gene 6 (1980), 23-28. Cellerne anbringes på plader med LB-medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972), DK 173104 B1 39

Cold Spring Harbor Laboratory, New York), som er tilsat carbenicillin (100 yg/ml). Carbenicillinresistente kloner screenes for følsomhed overfor tetracyclin (10 yg/ml), som følge af indsat inaktivering af genet, som koder for tetra-5 cyclinresistens (Bolivar, Gene 4 (1978) 121-136). Carbenicillinresistente og tetracyclinfølsomme kloner karakteriseres typisk ved restriktionsenzymnedbrydning af DNA fremstillet ud fra disse kloner ved anvendelse af mikroskala-teknikken (Klein et al., Plasmid 3 (1980), 88-91). BamHI-10 nedbrydning giver 4 DNA-fragmenter: i α-orienteringen dannes fragmenter på 0,98 kb, 4,71 kb, 5,98 kb og 7,02 kb, hvorimod β-orienteringen giver fragmenter 0,98 kb, 4,71 kb, 1,71 kb og 11,20 kb. Der fås et rekombinantplasmid, som betegnes pGV700, svarende til α-orienteringen, og dette 15 plasmid anvendes til yderligere forsøg.

PGV750 er afledt af pGV700 ved at ombytte et 2,81 kb BamHI-Hpal-fragment, som koder for kanamycinresistens, med et 3,49 kb-BglII-Smal-fragment, som koder for funktioner, der er vigtige for oncogenisiteten, inde i TL-området indsat 20 i pGV700. BamHI-Hpal-fragmentet, som koder for kanamycinresistens, fås fra 1:: Tn5 (Berg et al., Proc.Natl. Acad.

Sci USA 72 (1975), 3628-3632). Fremstilling af λ:: Tn5 foretages som beskrevet af Hiller, Experiments in Molecular Genetics (1972), Cold Spring Harbor Laboratory, New York-25 pGV700 DNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Betlach et al. , (Fed. Proc. 35 (1976), 2037-2043).

2 yg pGV700 DNA nedbrydes fuldstændigt med 2 enheder Bgll og 2 enheder Smal. 2 yg Xs* Tn5 DNA nedbrydes fuldstændigt med 2 enheder BamHI og 2 enheder Hpal. 1 yg BamHI-Hpal ned-30 brudt X:: Tn5 bindes til 0,2 yg Bglll-Smal-nedbrudt pGV700 med 0,5 enheder T4 DNA-ligaSe i et slutrumfang på 10 yl (der anvendes de af producenten anbefalede betingelser). Ligateringsblandingen transformeres til kompetente Escherichia coli K514 hsr hsm+ celler (Dagert og Ehrlich, Gene 35 6 (1980) 23-28). Cellerne anbringes på plader med LB-medium (Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972), Cold

Spring Harbor Laboratory, New York), som er tilsat carbeni-

R R

cillin (100 yg/ml) og kanamycin (25 yg/ml). Cb og Km klo- DK 173104 B1 40 ner karakteriseres fysisk ved restriktionsenzyraanalyse af DNA fremstillet i overensstemmelse med mikroskala-teknikken (Klein et al., Plasmid 3 (1980), 88-91). Bglll/

BamHI dobbeltnedbrydninger af dette DNA fås 3 fragmenter 5 på 3,94 kb, 5,89 kb og 8,09 kb, hvorimod Hindlll-nedbryd-ninger giver 3 fragmenter på 2,68 kb, 5,99 kb og 9,25 kb.

Et plasmid, som viser disse nedbrydningsmønstre, betegnes pGV750 og er illustreret skematisk i fig. 17.

pGV700 og pGV750 er to forskellige intermediære klonings-10 vektorer, som indeholder de venstre og højre grænsesekvenser af TL-DNA af octopin Ti-plasmidet pTIB6S3.

Endvidere er det indre T-område slettet i forskellige udstrækninger i hver af de to plasmider. pGV700 indeholder et afkortet T-område med genetisk information for octo-15 pinsyntetase (transkript 3) og 3 andre produkter, 4, 6a og 6b (se Willmitzer et al., EMBO J. 1 (1982), 139-146, angående en beskrivelse af T-områdeprodukter). Kombinationen af disse tre produkter (4, 6a og 6b) vil fremkalde skuddannelse i transformerede planter. pGV750 indeholder 20 endnu mindre af T-området, dvs. kun octopinsyntetasegenet. Informationen for produkterne 4, 6a og 6b er blevet ombyttet med antibiotikumresistensmarkørgenet, som koder for kanamycin- (neomycin-)resistens.

pGV700 og pGV750 er eksempler på intermediære kloningsvek-25 torer, som kan anvendes ved acceptor Ti-plasmider af B-typen (se fig. 8 og eksempel 3 nedenfor). Disse vektorer er delvis analoge med den vektor, som er vist i fig. 9, bortset fra at de ikke indeholder et gen, som har interesse. Et gen, som har interesse, kan let indsættes i 30 disse vektorer, da de indeholder enkeltrestriktionsendo-nucleasesteder for kloning indenfor de modificerede T-områder (se fig. 14 og 15) .

41 DK 173104 B1

Eksempel 3

Dannelse af acceptor Ti-plasmid pGV2260 (type B)

Udgangsstammer og -plasmider:

Agrobacterium tumefaciens (rifampicinresistent stamme C58C1 5 og erythromycin-chloramphenicol-resistent stamme C58C1 afledt af vildtype Agrobacterium).

Ti-plasmid = pGV2217

Intermediær vektor (fig. 16) = pGV745

Dannelsen af Ti-plasmidet pGV2217 er beskrevet detaljeret 10 af Leemans: et al., EMBO J 1 (1982), 147-152- Det inde holder en sletningssubstitutionsmutation af hele TL-områ-det i octopin Ti-plasmidets BamHI-fragmenterne 8, 30b, 28, 17a og det venstre 3,76 kb BamHI-EcoRI-fragment af BamHI-fragmentet 2 (De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 249-253) 15 er blevet ombyttet med et EcoRI-BamHI-fragment af pKC7 (Rao & Rogers, Gene 7 (1979), 79-82), som indeholder apt (acetylphosphotransferase)-genet af Tn5. Dette gen koder for resistens overfor aminoglycosiderne neomycin og kana-mycin.

20 Dannelsen af den intermediære vektor pGV745 er vist skematisk i fig. 16 og beskrives på følgende måde. Rekombinant-plasmidet pGV713 afledes af octopin Ti-plasmidsubklonen PGV0219 (De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 249-253), som indeholder Hindlll-fragmenter 14, 18c, 22e og 38c i a-25 orientering. pGV0219 DNA nedbrydes fuldstændigt med BamHI, hvorefter der foretages binding under betingelser, som fremmer selvbinding af plasmidet (slutkoncentration af DNA i ligateringsblanding < 1 yg DNA/ml). Transformanter selekteres for ampicillinresistens og karakteriseres 30 fysisk ved hjælp af restriktionsenzymnedbrydning. En klon, som ikke længere indeholder 6,5 kb BamHI-fragmentet i pGV0219, isoleres og betegnes pGV713. Denne klon pGV713 anvendes til efterfølgende kloning (se nedenfor). Rekombi-nantplasmidet pGV738 afledes af pGV0120 (De Vos et al., 35 Plasmid 6 (1981), 249-253), som indeholder BamHI-fragmen-t 2. pGV0120 DNA nedbrydes med E.coRI og selvbindes (som ovenfor ved dannelsen af pGV713). Transformanter selekte- DK 173104 B1 42 res for ampicillinresistens og analyseres ved restriktionsenzymnedbrydning. En klon, hvori EcoRI-fragmenter 20, 12 og et 2,95 kb EcoRI-fragment indeholdende dele af EcoRI -fragment 19a og dele af pBR322 er slettede, anvendes 5 til yderligere kloning og betegnes pGV738. Dette plasmid indeholder stadig et 5,65 kb EcoRI-BamHI-fragment fra den højre del af BamHI-fragment 2 (De Vos et al.,

Plasmid 6 (1981), 249-253).

Derefter nedbrydes pGV713 DNA med Hindlll og BamHI, og ned-10 brydningsblandingen anbringes på en præparativ agarosegel. Efter elektroforese renses 2,30 kb Hindlll-BamHI-frag-mentet indeholdt i pGV713 ved elektroeluering (som beskrevet af Allington et al., Anal. Biochem. 85 (1975), 188-196). Dette fragment bindes til pGV738, som er nedbrudt 15 fuldstændigt med Hindlll og BamHI. Effter transformering karakteriseres ampicillinresistente kloner fysisk ved hjælp af restriktionsenzymnedbrydning. For eksempel skulle EcoRI-BamHI-nedbrydning give 2 fragmenter på henholdsvis 3,98 kb (= vektordel) og 7,95 kb (= indsat del). Et re-20 kombinantplasmid med disse egenskaber betegnes pGV745 og anvendes som intermediær vektor til dannelsen af acceptor Ti-plasmidet pGV2260.

Plasmidet pGV745 indeholder et ColEl-specifikt bom-sted i pBR322-delen og kan mobiliseres fra Escherichia coli 25 til Agrobacterium ved anvendelse af hjælperplasmiderne R64drdll og pGJ28, som beskrevet i eksempel 1 (dannelse af acceptor Ti-plasmid pGV3850).

pGV745 mobiliseres til Agrobacterium-stamme C58C1, som er rifampicinresistent og indeholder Ti-plasmidet pGV2217.

30 Den første overkrydsning selekteres ved anvendelse af ampicillinresistensen hos pBR322 på samme måde som beskrevet i eksempel 1 (dannelsen af acceptor Ti-plasmidet pGV3850).Ved en anden overkrydsning ombyttes sletningssubstitutionsmutationen i pGV2217 med pBR322-sekvenserne 35 af plasmidet pGV745. Anden rekombinanter udtages ved direkte screening for de ampicillinresistente transkonjuganter, 43 DK 173104 B1 som dannes ved kointegrering af pGV745 med pGV2217, for tab af kanamycinresistens. På denne måde fås en rifampi-cin Agrobacterium-stamme C58C1, som indeholder pGV2260 (ampicillinresistent, kanamycinfølsom).

5 Dette Ti-plasmid pGV2260 vil blive anvendt som et accep-torplasmid (type B) for intermediære kloningsvektorer af pGV700- eller pGV750-typen. De er sammensat af (1) et DNA-fragment, som bærer ampicillinresistensgenet, kopieringsområdet og bom-stedet i pBR322, (2) et DNA-frag-10 ment indeholdende de venstre og højre grænsesekvenser af TL-DNA'et og en yderligere resistensmarkør ud over de, som allerede findes i pBR322, som vil tillade gentisk selektion for overførslen af den intermediære kloningsvektor fra Escherichia coli til Agrobacterium samt for 15 dets kointegrering i acceptor Ti-plasmidet pGV2260.

Det har eksempelvis været muligt at vise, at Agrobacterium, som indeholder et kointegrat mellem pGV2260 og pGV700, kan overføre de forventede DNA-sekvenser (de sekvenser, som findes mellem T-DNA-grænserne) til plantecellegeno-20 mer. De transformerede planteceller udviser den forventede phenotype, dvs. tumorer, som danner skud, forudsat at pGV700 indeholder den genetiske information for tre produkter (4, 6a, 6b, jfr. Willmitzer et al., EMBO J. 1 (1982), 139-146). På denne måde er det vist, at et accep-25 tor Ti-plasmid af B-typen er i stand til at overføre DNA til planteceller, når det anvendes som et kointegrat med en intermediær kloningsvektor af den type, som er illustreret i fig. 9, og som er beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 4 30 Dannelse af en intermediær kloningsvektor indeholdende et gen, som skal kopieres 1 planter

Hidtil har indsættelsen af hele gener i mere eller mindre tilfælde stillinger i T-området i Ti-plasmider ikke bevirket kopiering af den fremmede sekvens efter overføring til 35 plantegenomet. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan DK 173104 B1 44 kodningsområdet for et eller flere vilkårlige fremmede interessante gener bindes til transkriptionsinitierings-og -termineringssignaler, som vides at være funktionelle i plantecellen. Anvendeligheden af denne fremgangsmåde 5 demonstreres ifølge den foreliggende opfindelse ved forsøg, som involverer de DNA-sekvenser, som koder for nopalinsyntasegenet. Hele sekvensen af dette gen og den nøjagtige start og afbrydelse af transkriptionen er kendt (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 561-574).

.10 Ifølge den foreliggende opfindelse kan proteinkodningsområdet af et vilkårligt fremmed gen indsættes i nabo-stilling til nos-promotoren. Som et eksempel på en fremmed gensekvens indsættes kodningsområdet for octopin-syntasegenet (De Greve et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 15 (1982), 499-512) i nabostilling til nos-promotoren. Denne konstruktion mobiliseres til et acceptor Ti-plasmid og anvendes til inficering af planter. Det dannede tumorvæv afprøves for nærværelse af octopin, og prøven er positiv.

Dannelsen af den intermediære kloningsvektor indeholdende 20 den uvirkelige nopalinpromotor: octopinsyntasestruktur-genet er vist og beskrevet i fig. 18-20.

Kort sagt konstrueres restriktionsfragmentet HindIII-23 indeholdende nos-genet in vitro til fjernelse af størsteparten af nos-kodningssekvensen og under bibeholdelse af 25 nos-promotoren i nabostilling til restriktionsendonuclease-stedet BamHI (fig. 18). 10 pg pGVQ422 (et pBR322-derivat bærende HindIII-23-fragmentet, som indeholder det fuldstændige nos-gen, (Depicker et al., Plasmid (1980), 193-211) nedbrydes med Sau3A, og 350 bp-fragmentet, som bærer nos-30 promotoren, isoleres fra en præparativ 5%'s polyacrylamid-gel. Promotorfragmentet bindes til Bglll-spaltet pKC7 (Rao et al., Gene 7 (1979), 79-82), som forinden er behandlet med bakteriel basephosphatase (BAP) til fjernelse af 5'-terminale phosphatgrupper. 20 yg af det dannede 35 plasmid (pLGV13) nedbrydes med Bglll og behandles med 7 enheder Bal31 exonuclease (Biolabs, New England) i 4-10 minutter i 400 μΐ 12 mM MgCl2, 12 mM CalCl2, 0,6 M NaCl, 45 DK 173104 B1 1 itvM EDTA og 20 xnM Tris-HCl, pH-værdi 8,0, ved 30°C.

I løbet af dette tidsrum fjernes ca. 20-50 bp DNA. De Bal31-behandlede molekyler nedbrydes med BamHI og inkuberes med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase og alle fire des-5 oxynucleosidtriphosphater (i 10 mM hver) til udfyldning i enderne. Plasmiderne screenes for et regenereret BamHI-sted afledt af bindingen af en udfyldt BamHI-ende og enden af Bal31-sletningen. Størrelsen af BamHI-SacII-fragmentet af adskillige kandidater bedømmes i en 6%'s 10 urinstof-polyacrylamidgel, og nucleotidsekvenserne for kandidaterne med størrelser mellem 200-280 nucleoti-der bestemmes. Klonen pLGV81 indeholdende SacII-BamHI-fragmentet på 203 bp indeholdénde promotoren anvendes til at ombytte SacII-BamHI-fragmentet i nos-genet i 15 pGV0422. Den færdige promotorvektor betegnes pLGV2381.

Alle rekombinantplasmiderne selekteres ved transformering af Escherichia coli-stamme HB101.

Plasmidvektoren indeholdende den dannede nos-promotor nedbrydes med BamHI, og kodningssekvensen for ocs, som 20 er indeholdt i et BamHI-fragment, indsættes på dette sted. ocs-kodningssekvensen fremstilles også in vitro til omgivelse med BamHI-restriktionsendonucleasestedet som beskrevet i fig. 19. 10 yg BamHI-fragment 17a af octopin Ti-plasmidet B6S3 (De Vos et al., Plasmid 6 (1981), 249-253) 25 nedbrydes med BamHI og Smal, og fragmentet indeholdende ocs-kodningssekvensen isoleres fra en 1% agarosegel og bindes til det store BamHI-PvuII-fragment af pBR322. 20 yg af det dannede plasmid pAGV828 nedbrydes med BamHI, behandles med exonucleasen Bal31 som beskrevet i fig. 18, hvor-30 efter den nedbrydes med Hindlll, og enderne udfyldes og bindes til sig selv. Størrelserne af Bal31-sletningerne bestemmes i en 6% polyacrylamidgel. Nucleotidsekvenserne for flere kandidater bestemmes, og en kandidat med kun 7 bp tilbage af den 5'-ikketranslaterede ledersekvens væl-35 ges til yderligere anvendelse (pOCSå). For at omgive OCS-sekvensen med BamHI-steder, udfyldes Clal-Rsal-fragmentet, hvorpå det subklones til Ball-stedet af pLC236 (Remaut et al., Gene 15 (1981), 81-93). Det dannede plasmid pAGV40 DK 173104 B1 46 nedbrydes med BamHI, og fragmentet, som bærer ocs-sekven-sen, isoleres ved elektroeluering fra en præparativ 1%’s agarosegel og bindes til pLGV2381, som tidligere er spaltet med BamHI, og behandles med BAP (bakteriebasephospha-5 tase). Indsætningen af ocs-sekvensen i pLGV2381 opnås i begge orienteringer (pNO-1 og pNO-2).

Nucleotidsekvenserne, som viser det nøjagtige forbindelsessted i nosrocs-fusionen, er vist i fig. 20.

Endvidere anvendes plasmidvektoren indeholdende den danne-10 de nos-promotor til indføring af DNA fra plasmidet R67, som koder for enzymet dihydrofolatreduktase. Kodningssekvensen indeholde dihydrofolatreduktasegenet findes på et BamHI-fragment som beskrevet af O'Hare et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527-1531, og det kan 15 således let indsættes i nos-promotorvektoren indeholdende BamHI-stedet i nabostilling til promotorområdet som beskrevet ovenfor. Dette gen er et eksempel på et selekter-bart markørgen (se f.eks. fig. 2, 3, 4, 5 og 7), da det ved kopiering tilvejebringer resistens mod antibiotikumet 20 methotrexat. Når denne intermediære kloningsvektor mobiliseres til en Agrobacterium indeholdende et vildtype nopalinacceptor Ti-plasmid, indtræder der en enkelt overkrydsning, og der dannes en hybrid Ti-plasmidvektor. Vektorkompositionen anvendes til inficering af planter. Det 25 dannede tumorvæv er i stand til vedvarende vækst i nærværelse af 0,5 yg/ml methotrexat.

Dannelsen af de intermediære kloningsvektorer indeholdende ocs- og dihydrofolatreduktasekodningsområderne bagved den ovenfor beskrevne nos-proraotor og deres overføring 30 og kopiering i transformerede planteceller efter kointegrering med Ti-plasmidet af Agrobacterium er bevis for at fremmede gener kan overføres og kopieres i planteceller ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

47 DK 173104 B1

Eksempel 5

Isolering af planteceller og planter Indeholdende det eller de ønskede gener indsat i kromosomerne Der fremstilles planteceller og hele planter transformeret 5 med non-oncogene acceptor Ti-plasmidderivater (f.eks.

pGV3850) under anvendelse af en af følgende tre fremgangsmåders {1) Inokulering in vivo af hele planter efterfulgt af dyrkning in vitro på medier, som tillader regenerering af skud.

10 (2) Koinficering in vivo af hele planter i nærværelse af andre Agrobacteria-stammer, som direkte inducerer skud ved sårstedet.

(3) Kokultivering in vitro af enkelte plantecelleproto-plaster.

15 Hver af disse metoder beskrives nærmere i det følgende.

Den første metode er baseret på en modifikation af de metoder, der sædvanligvis anvendes til at fremkalde infektion af helt plantevæv med vildtype Agrobacterium-stammer, som resulterer i dannelsen af krongallevæv. Da pGV3850 er et 20 ikke-tumorproducerende (nononcogent) Agrobacterium-deri-vat, konstateres der ikke tumorvækst ved infektionsstedet.

Hvis det inficerede væv imidlertid fjernes og dyrkes i vævskulturer, kan der let opnås transformeret væv. Efter en begyndelsesdyrkningsperiode (for simpelthen at forøge 25 massen af vævet) dyrkes sårstedsvæv under betingelser, som tillader dannelse af skud. Såvel ikke-transformerede som pGV3850-transformerede celler vil danne skud. De transformerede skud kan let adskilles ved simpel analyse for tilstedeværelsen af nopalin.

30 Der er fremstillet pGV3850-transformeret calli og skud afledt af afskårne tobakskimplanter af Nicotioina tabacum Wisconsin 38 under anvendelse af følgende procedure (alle trin gennemføres under sterile betingelser i et aftræk med laminar strømning).

DK 173104 B1 48 (1) Der anvendes 6-uger gamle tobaksfrøplanter, som dyrkes i små krukker (diameter 10 cm, højde 10 cm) på fast Murashige & Skoog (MS) medium (Murashige og Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962) 473-497) indeholdende 0,8% agar.

5 (2) De yngste topblade fjernes med en skalpel og kastes bort.

(3) Såroverflader inokuleres med en spatel eller tandstikker indeholdende Agrobacterium afledt fra en frisk pladekultur dyrket under selektive betingelser (f.eks. til 10 den rifampicinresistente, ampicillinresistente Agrobac-terium-stamme indeholdende Ti-plasmid pGV3850 anvendes YEB-medium indeholdende 100 yg/ml rifampicin og 100 yg/ml carbenicillin. YEB-medium: 5 g/1 Bacto kødekstrakt, 1 g/1 Bacto gærekstrakt, 5 g/1 pepton, 5 g/1 saccharose, 2 x 10 ^ 15 M MgSO^, pH-værdi 7,2 og 15 g/1 agar. Der inokuleres mindst 8 planter for hver pGV3850-konstruktion.

(4) Der inkuberes i 2 uger, der bør ikke være noget respons eller kun ganske svag respons på inokulationsstedet. Undertiden optræder meget små calli.

20 (5) En tynd sektion med en tykkelse på mindre 1 mm fjer nes fra såroverfladen. Denne sektion af den sårede overfalde inkuberes på en plade indeholdende Linsmaier & Skoog (LS) agar-medium (Linsmaier og Skoog, Physiol. Plant.

18 (1965) 100-127) med auxiner og cytoquininer (1 mg/1 NAA, 25 0,2 mg/1 BAP) og 1% saccharose.

(6) Efter ca. 6 ugers forløb skal callus være tilstrækkelig stor, diameter mindst ca. 5 mm, til at en portion kan testes for tilstedeværelse af nopalin. Ikke alle sårcalli danner nopalin. Ca. en ud af fire planter danner nopalin- 30 positivt sårcallus.

(7) Nopalin-positivt calli overføres til agarplader indeholdende regenereringsmediet: LS-medium som ovenfor + 1% saccharose og 1 mg/1 BAP cytoquinin.

(8) Skud af god størrelse (1 cm høje) fremkommer efter 35 ca. 4-6 uger. Skuddene overføres til friske agarplader indeholdende LS-medium + 1% saccharose uden hormoner til yderligere vækst og roddannelse.

(9) Skuddene dyrkes i 1 eller 2 uger, således at en del (1 eller 2 små blade) kan fjernes til afprøvning for til- DK 173104 B1 49 stedeværelse af nopalin.

(10) Nopalin-positive skud overføres til større beholdere (10 cm beholdere som ovenfor) indeholdende MS-medium som i (1) til yderligere vækst.

5 N.B. Alle plantedyrkningsmedier til inficerede væv indeholder 500 yg/ml af antibiotikumet cefotaxim ("Claforan®") som en selektion mod Agrobacterium indeholdende pGV3850.

Dette lægemiddel virker udmærket til forhindring af vækst af alle Agrobacterier (også sådanne, som er carbenicillin-10 resistente).

En anden metode til tilvejebringelse af transformeret væv og skudvæv er udviklet af ansøgerne. Denne fremgangsmåde er baseret på erkendelsen af, at visse mutant Ti-plasmidstamraer af Agrobacterium inducerer krongalletumo-15 rer, som danner skud. Sådanne skudinducerende (shi) mutanter kortlægger et særligt område af T-DNA'et (overført DNA-segment) i Ti-plasmiderne af Agrobacterium tumefaciens (Leemanns et al., EMBO J. 1 (1982) 147-152 og Joos et al..

Cell 32 (1983) 1057-1067). Ofte er de inducerede skud 20 . sammensat af helt normale ikke-transformerede celler. Det er derfor blevet forsøgt at inokulere planter med en blanding af to forskellige Agrobacterier, en som bærer en octopin Ti-plasmidskudmutant og en anden, som bærer pGV3850.

På denne måde er der en god chance for, at octopinskud-25 mutanten kan inducerer skud, som er blevet transformeret ned pGV3850. Planter er blevet inokuleret med Agro-bacterium indeholdende Ti-plasmid pGV3850 og et octopin-skudinducerende Ti-plasmid i forholdet 5:1. På denne måde er det lykkedes at fremstille pGV3850-transforroerede skud.

30 Disse skud kan let screenes ved at analysere for tilstedeværelse af nopalin. Ved denne fremgangsmåde undgår man alle arbejdskrævende vævsdyrkningsmetoder. De nopalin-positive skud overføres til medier, som indeholder simple salte og sukkerarter med vilkårlige vækstregulerende 35 hormoner, som tillader yderligere vækst. Når skuddene har nået en tilstrækkelig størrelse, kan de let overføres til jord og dyrkes. Denne koinfektionsfremgangsmåde er 5° DK 173104 B1 særlig nyttig til transformering af plantearter, som ikke let kan dyrkes i vævskulturer. Der kan således dannes en hel række agronomisk og økonomisk betydningsfyIde planter, såsom bælgplanter, medicinalplanter og prydplanter, ved 5 hjælp af Agrobacterium.

Den tredje fremgangsmåde muliggør isoleringen af Nicotiana tabacum protoplaster og selektionen af hormonuafhængige T-DNA-transformerede cellekloner efter kokultivering af protoplastafledte celler med oncogene Agrobacteriumstam-10 mer. En analog teknik kan anvendes til selekteringen af transformerede celler, når der anvendes andre dominante selektive markører, såsom antibiotikaresistente gener dannet på en sådan måde, at de kopieres i højere planteceller ( se eksempel 3).

15 I dette tilfælde skal selektionsbetingelserne imidlertid være optimaliserede i hvert enkelt tilfælde (koncentration af selektionsmidlet, tid mellem transformering og selektion, koncentration af de protoplastafledte celler eller cellekolonier i selektionsmediet). Hvis det ikke 20 er muligt at foretage selektion for de transformerede celler, f.eks. på grund af anvendelse af avirulente T-DNA-mutanter, såsom f.eks. pGV3850 eller pGV2217 (Leemans et al., EMBO J. 1 (1982), 147-152), er det muligt at dyrke cellerne efter genetisk transformation på 25 auxin- og cytoquinin-holdigt medium, f.eks. Murashige og

Skoog-medium (Murashige og Skoog, Physiol. Plant 15 (1962), 473-497) med 2 mg/1 NAA (α-naphthaleneddikesyre) og 0,3 ml/1 kinetin, og at identificere de transformerede kolonier ved hjælp af deres opinindhold. På denne måde kan der efter 30 elektroforetisk analyse for agropin- og mannopinsyntese (metode se Leemans et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1981), 149-164) finde ca. 660 kolonier dannet efter infektion med pGV2217, en Nicotiana tabacum SRl-cellelinie, som syntesi-terer det TR-kodede opin mannopin (N2-(1-mannityl)-glutamin). 35 Der dannes et stort antal skud efter inkubering af callus-stykker af denne cellelinie på regenereringsmedium (Murashige og Skoog-medium med BAP (6-benzylaminopurin) (1 mg/1) DK 173104 B1 51 som eneste plantevækstregulator). Alle de analyserede 20 skud er stadig i stand til at syntetisere mannopin.

Efter overføring til hormonfrit Murashige og Skogg-medium vokser skuddene som morfologisk normale tobaks-5 planter, der stadig indeholder mannopin.

Protoplastisoleringen og transformeringen beskrevet her for Nicotiana tabacum kan også anvendes for Nicotiana plum-baginifolia.

2. Eksperimentelle fremgangsmåder 10 2.1 Skuddyrkningsbetingelser

Kulturer af Nicotiana tabacum-skud holdes i 250 ml glasbeholdere på hormonfrit Murashige og Skoog-medium (Murashige og Skoog, Physiol. Plant 15 (1962), 473-497) under sterile betingelser i et dyrkningsrum (16 ti-15 mers dag, 1500 lux hvidt fluoroscerende lys ("ACEC LF 58 W/2 4300°K Economy"), 24°C, 70% relativ fugtighed). Fem uger gamle skudkulturer anvendes til protoplastisolering.

2.2 Protoplastisolering 20 Der anvendes aceptisk teknik til alle trinene under protoplastisoleringen og dyrkningen. Protoplasterne isoleres ved hjælp af en blandet enzymfremgangsmåde.

Alle blade, bortset fra meget unge blade mindre end 2 cm, kan anvendes til protoplastisolering. Bladene 25 skæres i strimler med en bredde på ca. 2-3 mm med en skarp kniv. 2-3 g bladmateriale inkuberes i 18 timer ved 24°C i 50 ml emzymblånding i mørket uden omrøring. Enzymblandingen består af 0,5% cellulase Ono-zuka R-10 og 0,2% macerozyme Onozuka R-10 i hormon-30 frit K3-medium (Nagy og Maliga, Z. Pflanzenphysiol.

78 (1976), 453-455). Blandingen sterilfiltreres gennem en 0,22 ym poremembran, og blandingen kan opbevares i mindst 6 måneder ved -20°C uden kendeligt tab af aktivitet.

DK 173104 B1 52 2.3 Protoplastdyrkning

Efter 18 timers inkubering omrøres blandinge forsigtigt til frigørelse af protoplasterne. Derefter filtreres blandingen gennem en 50 ym sigte, og fil-5 tratet overføres til 10 ml centrifugerør. Efter centrifugering i 6 minutter ved 60-80 g i en rotor med en svingende kurve danner protoplasterne et mørkt grønt flydende bånd. Væsken under protoplasterne og resterne, som danner en pellet, fjernes 10 under anvendelse et kapillarrør forbundet med en peristaltisk pumpe. Protoplasterne hældes sammen i et rør og vaskes to gange med dyrkningsmedium. Dyrkningsmediet er K3-medet (Nagy og Maliga, Z.

Pflanzenphysiol. 78 (1976), 453-455) med NAA (0,1 mg/1) 15 og kinetin (0,2 mg/1) som vækstregulatorer. Mediet indstilles på pH-værdien 5,6 og steriliseres gennem en 0,22 ym filtermembran. Efter den anden vask tælles protoplasterne under anvendelse af et Thoma hemacytometer (fra firmaet "Assistant", Frankrig), 2 0 og cy toplas terne resuspenderes i. dyrkningsmedium i en slutkoncentration på 10 . protoplaster/ml. Protoplasterne dyrkes i et rumfang på 10 ml pr. vævsdyrkningskvalitetpetriskål med. en diameter på 9 cm. Skålene forsegles med "Parafilm"® og inkuberes i 25 24 timer i mørket og derefter i dæmpet lys (500- 1000 1uj$ ved 24°C.

2.4 Transformation ved ko-dyrkning Protoplastkulturerne inficeres 5 dage efter isoleringen. Agrobacterlumkulturer dyrkes i 18 timer i fly- 30 dende LB-medium (Miller, Experiments in Molecular

Genetics (1972), Cold Spring Harbor Laboratory, New

York), og resuspenderes i K3-dyrkningsmedium med en 9 tæthed på 2 x 10 celler/ml. 50 yl af denne suspension sættes til planteprotoplastkulturerne, og efter 35 forsegling med "Parafilm"® inkuberes kulturerne under samme betingelser som beskrevet ovenfor under 2.3. ·

Efter 48 timers forløb overføres kulturerne til 10 ml centrifugerør og" centrifugeres i en rotor med svin- DK 173104 B1 53 gende kurv ved 60-80 g i 6 minutter. Det flydende bånd og pellet hældes sammen og resuspenderes i 10 ml K3-medium (Nagy og Maliga, Z. Pflanzenphysiol.

78 (1976), 453-455) tilsat et antibiotikum (carbeni-5 cillin 1000 yg/ml eller cefotaxim 500 yg/ml).

Efter to ugers inkubering centrifugeres de proto-plastafledte mikrocalli, hvorpå de resuspenderes i K3-medium (Nagy og Haliga, Z, Pflanzenphysiol. 78 (1976), 453-455) med den samme vækstregulator og 10 samme antibiotikumkoncentrationer som før men med en saccharosekoncentration på 0,3 M i stedet for 0,4 M. Celletætheden i dette medium indstilles på ca. 25 x 103 mikro-calli pr. ml.

Efter to ugers yderligere inkubering under de samme 15 betingelser overføres calli til K3-medium med de sam me antibiotikumkoncentrationer som før, men med et formindsket saccharoseindhold (0,2 M) og formindsket indhold af vækstregulatorer (NAA 0,01 ml/1 og kinetin 0,02 mg/1).

20 Efter inkubering i yderligere 2 eller 3 uger kan de formodede transformanter erkendes ved deres lysegrønne og kompakte udseende og bedre vækst. Disse kolonier overføres derpå til hormonfrit Linsmaier og Skoog-medium (Linsmaier og Skoog, Physiol. Plant. 18 (1965), 25 100-127), som er størknet med 0,6% agar, og som indeholder reducerede antibiotikumkoncentrationer (carbenicillin 500 yg/ml eller cefotaxim 250 yg/ml).

Opintest kan gennemføres på de formodede transformanter, som vokser på dette hormonfri medium, når de 30 har nået en diameter på 3-4 mm. Halvdelen af hver en kelt koloni anvendes til påvisningen af octopin og nopalin (Aerts et al.. Plant Sci. Lett. 17 (1979), 43-50) eller agropin og mannopin (Leemans et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1981), 149-164). Denne test 35 muliggør bekræftelse af den transformerede natur af DK 173104 B1 54 disse kolonier selekteret på hormonfrit medium.

Derefter kan de selekterede kolonier dyrkes på antibiotikumfrit medium.

2.5 Ko-dyrkning uden selektion på hormonfrit medium 5 Når det ikke er muligt at foretage selektion for trans formerede celler (f.eks. fordi der anvendes avirulente T-DNA-mutanter), eller når det ikke er nødvendigt, fordi der findes en dominant selekterbar markør, såsom et antibiotikumresistent gen, i T-DNA'et, kan 10 behandlingen af de protoplastafledte celler simpli ficeres (hormonreduktionstrinene er ikke længere nødvendige) . Protoplasterne behandles som beskrevet ovenfor frem til infektionstrinnet. 48 timer efter tilsætningen af bakterierne centrifugeres de proto-15 plastafledte celler (6 minutter, 60-80 g), hvorpå de resuspenderes i medium AG (Caboche, Planta 149 (1980), 7-18), som er i stand til at understøtte cellevækst ved meget lav tæthed. Cellerne tælles under anvendelse af et Fuchs-Rosenthal-tællekammer (fra 20 "Assistant", Frankrig), og cellerne resuspenderes i den tæthed, som kræves til det efterfølgende arbejde.

Hvis kolonierne skal behandles individuelt til opin-test giver plader med lav celletæthed (100 proto-plastafledte celler og cellekolonier pr. ml) kolonier 25 med store celle efter 1 måneds inkubering. Hvis det er muligt at foretage lægemiddelselektion for de transformerede celler inkuberes cellerne ved en højere tæthed (103-104/ml), og det anvendte selektionsmiddel sættes til mediet i en koncentration og på et 30 tidspunkt, som skal optimeres for hver type selek tion .

2.6 Regenerering af hele planter fra callusvæv

Normale planter fås let ud fra callusvæv (f.eks. enten afledt fra protoplattransformation eller fra helplan-35 teinokulation (se 2.7). Callusvævet dyrkes på Mura- shige og Skoog-medium indeholdende 1 mg/ml BAP. Dette medium inducerer skuddannelse efter 1-2 måneder. Disse DK 173104 B1 55 skud kan overføres til et medium uden hormoner, således at der dannes rødder og en fuldstændig plante.

2.7 Tumorinfektion på tobaksklmplanter

Tobaksfrø (f.eks. cultivar Wisconsin 38) overflade-5 steriliseres ved behandling med 70%'s denatureret ethanol/f^O i 2 minutter efterfulgt af 10%'s kommercielt blegemiddel og 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), hvorefter der yderligere skylles fem gange med sterilt vand. De sterile frø udsås i store testrør 10 (25 mm brede) indeholdende saltene fra Murashige og

Skoog-medium størknet med 0,7% agar og dækket med po-lycarbonattoppe. Derefter inkuberes rørene i et dyrkningsrum (12.000 lux, 16 timers lys/8 timers mørke, 70%'s relativ fugtighed, 24°C)- Efter 4-6 15 ugers forløb er planterne klar til anvendelse. De forbliver optimale i mindst yderligere en måned.

Kimplanterne skal have en højde på mindst 3 cm og have 4 eller flere blade. Derpå gennemskæres planterne transversalt gennem den yngste internode med en ny 20 steril skalpel. Den øverste del af planten fjernes fra røret, og bakterier fra en agarpladekultur anbringes på såroverfladen med en flamberet mikrospa-tel.

Tumorer fremkommer efter 2 uger for vildtypens ved-25 kommende og efter et længere tidsrum for nogle af de attenuerede mutantstammer. Denne metode anvendes til at inokulere tobak (Nicotiana tabacum), Nicotians plumbaginifolia og Petunia hybrida.

Afsluttende bemærkninger.

30 Den foreliggende opfindelse muliggør for første gang transformering af planter med Agrobacterium indeholdende en hybrid Ti-plasmidvektor, som mangler de oncogene funktioner i T-området i vildtype Ti-plasmider. Da indflydelsen DK 173104 B1 56 af de oncogene funktioner af T-området på overførslen af DNA fra Ti-plasmidet til planteceller ikke var kendt, er det overraskende, at der ikke desto mindre optræder overførsel af det modificerede T-område indeholdende 5 et eller flere interessante gener til planteceller. Der foregår kointegrering og stabil opretholdelse af dette overførte DNA i plantecellegenomet. Endvidere kan der opnås kopiering af det eller de valgte interessante gener, forudsat at genet eller generne enten indeholder - eller 10 er konstrueret til at indeholde - egnede promotorsekvenser. Gennemførelsen af en enkelt overkrydsning mellem en intermediær kloningsvektor indeholdende det eller de valgte interessante gener med et særligt udformet acceptor Ti-plasmid forenkler i vid udstrækning dannelsen af en 15 vilkårlig hybrid Ti-plasmidvektor, som er nyttig til transformeringen af planteceller. De særligt udformede acceptor Ti-plasmider indeholder DNA-segmentet af et konventionelt kloningsmiddel, således at et eller flere vilkårlige interessante gener (som er blevet indsat i det 20 samme eller et beslægtet kloningsmiddel som del af en intermediær kloningsvektor) kan danne et kointegrat ved en enkelt overkrydsning. De to segmenter i kloningsmidlet eller -midlerne tilvejebringer de nødvendige homologi-områder for rekombination.

25 Mikroorganismer og intermediære kloningsvektorer, acceptor

Ti-plasmider og hybridplasmidvektorer fremstillet ved frem- · gangsmåden ifølge opfindelsen er eksemplificeret ved kulturer deponeret i den tyske samling af mikroorganismer (DSM), Gottingen, 21. december 1983 og identificeret der på føl-30 gende måde: (1) Intermediær vektorplasmid pAcgB i Escherichia coli K12 HB101, (2) Agrobacterium tumefaciens C58C1 rifampicin-resistent stamme bærende carbenicillinresistent acceptor Ti-plasmid 35 pGV3850, (3) Intermediær vektorplasmid pGV700 i Escherichia coli K12 stamme K514 (thr leu thi lac hsdR), DK 173104 B1 57

O

(4) Intermediær vektorplasmid pGV750 i Escherichia coli K12 stamme K514 (som ovenfor under (3)).

(5) Agrobacterium tumefaciens C58C1 rifampicin-resistent stamme bærende carbenicillinresistent acceptor Ti-plas- 5 mid pGV2260, (6) Intermediær vektorplasmid pNO-1 bærende octopinsyn-tasekodningsområdet under kontrol af nopalinpromotoren i Escherichia coli K12 HB101.

(7) Stamme anvendt til immobilisering af intermediære vek-10 torer til Agrobacterium = GJ23 bærende mobiliseringsplas- mider pGJ28 og R64drdll (Van Haute et al.r EMBO J. 2 (1983), 411-418). GJ23 er Escherichia coli K12, JC2926 et recA-derivat af AB1157 (Howard-Flanders et al.. Genetics 49 (1964), 237-246).

15

Disse kulturer har fået følgende deponeringsnumre: 2792 (1), 2798 (2), 2796 (3), 2797 (4), 2799 (5), 2833 (6) og 2793 (7).

Deponeringerne er foretaget i overensstemmelse med Budapest-20 -traktaten.

25 30 35

Claims (42)

1. Vektorkombination bestående af: (i) et acceptor-Ti-plasmid, som i det væsentlige er frit for indre T-DNA-sekvenser og ikke er i stand til at 5 fremkalde tumorer hos planter, omfattende: (a) de to grænsesekvenser (1, 2) af T-regionen af et vildtype-Ti-plasmid, (b) en DNA-sekvens (3) afledt af kloningsmiddel, placeret mellem de to grænsesekvenser, og 10 (c) et DNA-segment (4) af et vildtype-Ti-plasmid in deholdende DNA-sekvenser, som er essentielle for overføring med Agrobacterium af T-regionen af vildtype-Ti-plasmider i plantecellegenomer, og (ii) en intermediær kloningsvektor, hvor denne klonings- 15 vektor omfatter: (a) mindst ét gen af interesse (5) under kontrol af en promotor, som er i stand til at styre genekspression i planter, og (b) et kloningsmiddelsegment (3') indeholdende en 20 DNA-sekvens, som er homolog med DNA-sekvensen (b) i det nævnte acceptor-Ti-plasmid, som tillader en enkelt over-1 krydsning.

2. Vektorkombination ifølge krav 1, kendeteg-25 net ved, at den intermediære kloningsvektor yderligere indeholder mindst ét selekterbart markørgen, som støder op til genet eller generne af interesse (5).

3. Vektorkombination ifølge krav 1, kendeteg-30 net ved, at genet eller generne af interesse (5) indeholdt i den intermediære kloningsvektor er under kontrol af sin (deres) naturlige promotor. DK 173104 B1

4. Vektorkombination ifølge krav 1, kendetegnet ved, at genet eller generne af interesse (5) indeholdt i den intermediære kloningsvektor er under kontrol af en promotor, som er exogen i forhold til genet eller gener- 5 ne af interesse.

5. Vektorkombination bestående af (i) et acceptor-Ti-plasmid, som ikke er i stand til at fremkalde tumorer hos planter og er frit for grænse- 10 sekvenser og indre T-DNA-sekvenser af et vildtype-Ti- plasmid, omfattendes (a) et DNA-segment (4) af et vildtype-Ti-plasmid uden T-regionen og uden de to grænsesekvenser af T-regionen og (b) en DNA-sekvens (3) afledt af et kloningsmiddel, 15 og (ii) en intermediær kloningsvektor omfattende: (c) den venstre og højre grænsesekvens af en T-region af et vildtype-Ti-plasmid (1, 2), (d) et kloningsmiddelsegment (3') placeret uden for 20 de to grænsesekvenser, som er homologt med DNA-sekvensen (b) i det nævnte acceptor-Ti-plasmid, som muliggør en enkelt overkrydsning, og (e) en region, som i det væsentlige er fri for indre T-DNA-sekvenser af et vildtype-Ti-plasmid og indeholder 25 mindst et gen af interesse (5) under kontrol af en promotor, som er i stand til at styre genekspression i planter, hvorved den nævnte region er placeret mellem de to grænse -sekvenser på en måde, som muliggør dens integrering i plan-tegenomet. 30

6. Vektorkombination ifølge krav 5, hvori acceptor-Ti-plasmidet er pGV2260, DSM 2799. DK 173104 B1

7. Vektorkombination ifølge krav 5 eller 6, hvori den intermediære kloningsvektor yderligere indeholder mindst ét selekterbart markørgen, som støder op til genet eller ge- 5 nerne af interesse (5).

8. Vektorkombination ifølge krav 9, hvori det selek-terbare markørgen koder for resistens mod et antibiotikum.

9. Vektorkombination ifølge krav 5 eller 6, hvori den intermediære kloningsvektor er pGV750, DSM 2797.

10. Vektorkombination ifølge krav 5 eller 6, hvori den intermediære kloningsvektor yderligere er karakterise- 15 ret ved, at genet eller generne af interesse (5) er under kontrol af sin (deres) naturlige promotor.

11. Vektorkombination ifølge krav 5 eller 6, hvori den intermediære kloningsvektor yderligere er karakterise- 20 ret ved, at genet eller generne af interesse (5) er under kontrol af promotor, som er exogen i forhold til genet eller generne af interesse.

12. Vektorkombination ifølge krav 11, hvori promotor- 25 sekvensen giver vævsspecifik regulering af transkription af de nævnte downstream-sekvenser, fortrinsvis i blade, rødder, stilk eller blomster af en plante indeholdende cellen.

13. Vektorkombination ifølge krav 11, hvori promotor- 30 sekvensen giver inducerbar regulering af transkription af de nævnte downstream-sekvenser, fortrinsvis ved hjælp af temperatur, lys eller tilsatte kemiske faktorer. DK 173104 B1

14. Vektorkombination ifølge krav 11, hvori promotorsekvensen er promotorsekvensen af et opin-syntase-gen af Agrobacterium-T-DNA, fortrinsvis promotorsekvensen af nopa- 5 lin-syntase-genet.

15. Vektorkombination ifølge ethvert af kravene 5-14, hvori genet af interesse kontrollerer syntesen af produkter som aminosyrer eller sukkerarter. 10

16. Vektorkombination ifølge ethvert af kravene 5-14, hvori genet af interesse er et strukturelt gen.

17. Vektorkombination ifølge ethvert af kravene 5-14, 15 hvori genet af interesse kontrollerer syntesen af produkter, som giver beskyttelse mod eksterne patogene agenser, såsom resistens mod sygdotnsfremkaldende organismer eller stressfremkaldende miljøfaktorer.

18. Acceptor-Ti-plasmidet pGV2260, DSM 2799.

19. Den intermediære kloningsvektor pGV750, DSM 2797.

20. Fremgangsmåde til fremstilling af et hybridt Ti- 25 plasmid, omfattende fremstilling af en vektorkombination ifølge ethvert af kravene 1-4 i en Agrobacterium og gennemførelse af en cointegrering mellem den intermediære kloningsvektor og acceptor-Ti-plasmidet ved en enkelt overkrydsning. 30

21. Fremgangsmåde til fremstilling af et hybridt Ti-plasmid, omfattende fremstilling af en vektorkombination DK 173104 B1 ifølge ethvert af kravene 5-17 i en Agrobacterium og gennemførelse af en cointegrering mellem den intermediære kloningsvektor og acceptor-Ti-plasmidet ved en enkelt overkrydsning . 5

22. Hybrid Ti-plasmidvektor som kan fås ved cointegrering mellem enten et acceptor-Ti-plasmid, som ikke er i stand til at fremkalde tumorer hos planter og omfatter: (a) de to graensesekvenser (1, 2) af T-regionen af et 10 vildtype-Ti-plasmid, (b) en DNA-sekvens (3) , som er fri for de oncogene funktioner af vildtype-T-DNA'et, afledt af et kloningsmiddel, placeret mellem de to grænsesekvenser, og indeholdende fen DNA-sekvens, som er homolog med i det mindste en del af 15 en DNA-sekvens i en intermediær kloningsvektor, som mulig-* gør en enkelt overkrydsning, og (c) et DNA-segment (4) af et vildtype-Ti-plasmid indeholdende DNA-sekvenser, som er essentielle for overføring med Agrobacterium af T-regionen af vildtype-Ti-plasmider i 20 ^plantecellegenomer, r og en intermediær kloningsvektor omfattende: (a) mindst ét gen af interesse (5) under kontrol af en promotor, som er i stand til at styre genekspression i planter, og 25 (b) et kloningsmiddelsegment (3') indeholdende en DNA-sekvens, som er homolog med den ovennævnte DNA-sekvens (b) i acceptor-Ti-plasmidet, eller mellem et acceptor-Ti-plasmid omfattende: (A) et DNA-segment (4) af et vildtype-Ti-plasmid uden

23. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge krav 22, som desuden indeholder mindst ét selekterbart markørgen, som stø-30 der op til genet eller generne af interesse (5). DK 173104 B1

24. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge krav 23, hvori det selekterbare markørgen koder for resistens mod et antibiotikum.

25. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge krav 24, hvori det selekterbare markørgen koder for resistens mod methotrexat.

26. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge krav 23, hvori det selekterbare markørgen er et opin-syntase-gen af Agrobacte- 10 rium-T-DNA, fortrinsvis nopalin-syntase-genet eller octo-pin-syntase-genet.

27. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge ethvert af kravene 22-26, kendetegnet ved, at genet eller generne af 15 interesse (5) er under kontrol af sin (deres) naturlige promotor.

28. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge ethvert af kravene 22-26, kendetegnet ved, at genet eller generne af 20 interesse (5) er under kontrol af en promotor, som er exo-gen i forhold til genet eller generne af interesse.

29. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge krav 28, hvori promotorsekvensen giver vævsspecifik regulering af tran- 25 skription af de nævnte downstream-sekvenser, fortrinsvis i blade, rødder, stlik eller blomster af en plante indeholdende cellen.

30. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge krav 28, hvori 30 promotorsekvensen giver inducerbar regulering af transkrip- tion af de nævnte downstream-sekvenser, fortrinsvis ved hjælp af temperatur, lys eller tilsatte kemiske faktorer. DK 173104 B1

30 T-regionen og uden de to grænsesekvenser af T-regionen og (B) en DNA-sekvens (3) afledt af et kloningsmiddel, og en intermediær kloningsvektor omfattende: DK 173104 B1 (A') den venstre og højre grænsesekvens af en Τ'-region af et vildtype-Ti-plasmid (1, 2), (Bf> et kloningsmiddelsegment (3') placeret uden for de nævnte to grænsesekvenser, som er homologt med DNA-. i 5 sekvensen (b) i det nævnte acceptor-Ti-plasmid, som muliggør en enkelt overkrydsning, og (C') en region, som i det væsentlige er fri for indre S T-DNA-sekvenser af et vildtype-Ti-plasmid og indeholder mindst ét gen af interesse (5) under kontrol af en promo-10 tor, som er i stand til at styre genekspression i planter, hvorved den nævnte region er placeret mellem de to grænse-sekvenser på en måde, som muliggør dens integrering i plan-tegenomet, idet den nævnte hybride Ti-plasmidvektor i det mindste om-15 fatter: (a) de to grænsesekvenser (1, 2) af T-regionen af et vildtype-T-plasmid, (β) ikke-oncogene DNA-sekvenser (3, 3') afledt af et klo-ningsmiddel, 20 (γ) et DNA-segment (4) af vildtype-Ti-plasmidet indeholden de DNA-sekvenser, som er essentielle for overføring af T-regionen af vildtype-Ti-plasmider med Agrobacterium til plantecellegenomer, og (δ) mindst ét gen af interesse (5) under kontrol af promo-25 tor, som er i stand til at styre genekspression i planter, og som er placeret mellem de to grænsesekvenser (l, 2) .

31. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge krav 28, hvori promotorsekvensen er promotorsekvensen af et opin-syntase-gen af Agrobacterium-T-DNA, fortrinsvis promotorsekvensen 5 af nopalin-syntase-genet.

32. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge ethvert af kravene 22-31, hvori genet af interesse kontrollerer syntesen af produkter som aminosyrer eller sukkerarter. 10

33. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge ethvert af kravene 22-31, hvori genet af interesse er et strukturelt gen,

34. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølget ethvert af krave- 15 ne 22-31, hvori genet af interesse kontrollerer syntesen af produkter, som giver beskyttelse mod externe patogene agenser, såsom resistens mod sygdoms fremkaldende organismer eller stressfremkaldende miljøfaktorer.

35. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge ethvert af kravene 22-31, hvori genet af interesse er et selekterbart markørgen.

36. Hybrid Ti-plasmidvektor ifølge krav 35, hvori ge- 25 net af interesse er et antibiotiumresistensgen.

37. Agrobacterium indeholdende en vektorkombination ifølge ethvert af kravene 1-17.

38. Agrobacterium indeholdende en hybrid Ti- plasmidvektor ifølge ethvert af kravene 22-36. DK 173104 B1

39. Fremgangsmåde til fremstilling af en transformeret plantecelle, omfattende infektion af planteceller med en Agrobacterium indeholdende en vektorkombination ifølge krav 3 7 . 5

40. Fremgangsmåde til fremstilling af en transformeret plantecelle, omfattende infektion af planteceller med en Agrobacterium indeholdende en hybrid Ti-plasmidvektor ifølge krav 38. 10

41. Fremgangsmåde til fremstilling af en plante, omfattende følgende trin: (a) infektion af en plantecelle med en Agrobacterium ifølge krav 37, og 15 (b) dannelse af en plante ud fra de transformerede plante celler opnået i trin (a).

42. Fremgangsmåde til fremstilling af en plante, omfattende følgende trin: 20 (a) infektion af en plantecelle med en Agrobacterium ifølge krav 38, og (b) dannelse af en plante ud fra de transformerede planteceller opnået i trin (a) . 25