JP2001029092A - 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 - Google Patents
植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、組換えＤＮＡ分子、その調製法、
植物細胞へのその導入法、およびゲノム中に外来ＤＮＡ
配列を含んでいる植物細胞またはその植物を提供するも
のである。 【効果】 本発明に係る組換えＤＮＡ分子は、植物の成
長、栄養物としてのその品質の改良、または有用な代謝
物(例えば、アルカロイドあるいはステロイドの前駆体)
の生産に有用である。
植物細胞へのその導入法、およびゲノム中に外来ＤＮＡ
配列を含んでいる植物細胞またはその植物を提供するも
のである。 【効果】 本発明に係る組換えＤＮＡ分子は、植物の成
長、栄養物としてのその品質の改良、または有用な代謝
物(例えば、アルカロイドあるいはステロイドの前駆体)
の生産に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換え分子、その調製
法、植物細胞へのその導入法、およびゲノム中に外来Ｄ
ＮＡ配列を含んでいる植物細胞またはその植物に関す
る。更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で発
現されるＤＮＡ配列に関する。本発明に係る組換えＤＮ
Ａ分子は、植物の成長、栄養物としてのその品質の改
良、または有用な代謝物 (例えばアルカロイドあるいは
ステロイドの前駆体) の生産、に有用なアミノ酸やポリ
ペプチドの如き生産物を暗号化している配列を有するこ
とをその特徴としている。
法、植物細胞へのその導入法、およびゲノム中に外来Ｄ
ＮＡ配列を含んでいる植物細胞またはその植物に関す
る。更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で発
現されるＤＮＡ配列に関する。本発明に係る組換えＤＮ
Ａ分子は、植物の成長、栄養物としてのその品質の改
良、または有用な代謝物 (例えばアルカロイドあるいは
ステロイドの前駆体) の生産、に有用なアミノ酸やポリ
ペプチドの如き生産物を暗号化している配列を有するこ
とをその特徴としている。
【０００２】以下に本明細書で使用する用語について説
明する。 bomサイト 特異的にmob 機能体が相互作用して自律的
ＤＮＡ転移移動を開始させるＤＮＡ領域 境界配列 Ｔ−ＤＮＡの末端を含むＤＮＡ配列 広範囲宿主レプリコン 多種多様の宿主細胞に転移(ト
ランスファ−)され、保持され得るＤＮＡ分子 カルス組織 未組織、未分化の細胞の塊 クロ−ニング 無性生殖により、１個の生物 またはＤ
ＮＡ配列から一群の該生物またはＤＮＡ配列を得る操作
過程、または、よりわかり易く言えば、特定の生物また
はその一部を分離し、そのサブフラクションを均質な集
団として増殖させる操作過程
明する。 bomサイト 特異的にmob 機能体が相互作用して自律的
ＤＮＡ転移移動を開始させるＤＮＡ領域 境界配列 Ｔ−ＤＮＡの末端を含むＤＮＡ配列 広範囲宿主レプリコン 多種多様の宿主細胞に転移(ト
ランスファ−)され、保持され得るＤＮＡ分子 カルス組織 未組織、未分化の細胞の塊 クロ−ニング 無性生殖により、１個の生物 またはＤ
ＮＡ配列から一群の該生物またはＤＮＡ配列を得る操作
過程、または、よりわかり易く言えば、特定の生物また
はその一部を分離し、そのサブフラクションを均質な集
団として増殖させる操作過程
【０００３】クロ−ニング媒体 宿主細胞中で複製し得
るプラスミド、フア−ジＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配
列であって、そのＤＮＡ配列は、例えば複製、外殻蛋白
質の生産など、そのＤＮＡの必須の生物学的機能、ある
いはプロモ−タ−または結合部位を付随的に失なうこと
なく、その場所で正確にその配列を切断することのでき
る１個または少数のエンドヌクレア−ゼ認識部位を持っ
ており、また、それが導入された細胞(形質転換された
細胞)を同定確認するのに有用なマ−カ−(例えばテトラ
サイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性)を持ってい
ることで特徴づけられる。クロ−ニング媒体は、しばし
ばベクタ−とも呼ばれる。 暗号配列 ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するＤＮ
Ａ配列 相互組込み体(コインテグレ−ト) ２個の環状ＤＮＡ分
子間の単一交叉により得られる構造体
るプラスミド、フア−ジＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配
列であって、そのＤＮＡ配列は、例えば複製、外殻蛋白
質の生産など、そのＤＮＡの必須の生物学的機能、ある
いはプロモ−タ−または結合部位を付随的に失なうこと
なく、その場所で正確にその配列を切断することのでき
る１個または少数のエンドヌクレア−ゼ認識部位を持っ
ており、また、それが導入された細胞(形質転換された
細胞)を同定確認するのに有用なマ−カ−(例えばテトラ
サイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性)を持ってい
ることで特徴づけられる。クロ−ニング媒体は、しばし
ばベクタ−とも呼ばれる。 暗号配列 ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するＤＮ
Ａ配列 相互組込み体(コインテグレ−ト) ２個の環状ＤＮＡ分
子間の単一交叉により得られる構造体
【０００４】トランス相補性 他のレプリコンに物理的
に結合していないＤＮＡ分子(レプリコン)が、その結合
していない他のレプリコンにとって必要かつ欠落してい
る拡散性物質を供給することができる過程 接合(コンジュゲ−ション) 細胞同志の接触により、１
つのタイプの細菌から他のタイプの細菌にＤＮＡが転移
すること 乗換え 相同なＤＮＡ配列間で遺伝物質が交換すること 欠損置換 １個のＤＮＡ配列が除去され、その代りとし
て異なったＤＮＡ配列で置換されること 分化 ある細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得し、更
にそれを維持すること ＤＮＡ配列またはＤＮＡセグメント 隣接するペント−
スの３' 位と５' 位の炭素間の燐酸ジエステル結合によ
り互いに連結したヌクレオチド群の一直線の配列
に結合していないＤＮＡ分子(レプリコン)が、その結合
していない他のレプリコンにとって必要かつ欠落してい
る拡散性物質を供給することができる過程 接合(コンジュゲ−ション) 細胞同志の接触により、１
つのタイプの細菌から他のタイプの細菌にＤＮＡが転移
すること 乗換え 相同なＤＮＡ配列間で遺伝物質が交換すること 欠損置換 １個のＤＮＡ配列が除去され、その代りとし
て異なったＤＮＡ配列で置換されること 分化 ある細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得し、更
にそれを維持すること ＤＮＡ配列またはＤＮＡセグメント 隣接するペント−
スの３' 位と５' 位の炭素間の燐酸ジエステル結合によ
り互いに連結したヌクレオチド群の一直線の配列
【０００５】二重乗換 相互組込み(コインテグレ−ト)
構造が２個の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程
は遺伝情報を交換するのに利用される。このＤＮＡ環状
体の一方は、それによって組換えが生じ得る標的ＤＮＡ
と相同な２つの領域を持っており、この２つの領域は、
標的ＤＮＡと交換される非相同ＤＮＡ配列をはさんでい
る。もし１回目の交叉と２回目の交叉が同じＤＮＡ領域
で起ると、もとのＤＮＡ環状体が生成する。この２回目
の交叉が第２の相同領域で起ると、２つの環状体の間で
遺伝子の交換が起ることになる。 発現 構造遺伝子によりポリペプチドが生産される過
程。これは転写と翻訳の組合せである。 発現調節(コントロ−ル)配列 構造遺伝子に有効に結合
された場合、それらの構造遺伝子の発現を調節し、統制
するヌクレオチド配列
構造が２個の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程
は遺伝情報を交換するのに利用される。このＤＮＡ環状
体の一方は、それによって組換えが生じ得る標的ＤＮＡ
と相同な２つの領域を持っており、この２つの領域は、
標的ＤＮＡと交換される非相同ＤＮＡ配列をはさんでい
る。もし１回目の交叉と２回目の交叉が同じＤＮＡ領域
で起ると、もとのＤＮＡ環状体が生成する。この２回目
の交叉が第２の相同領域で起ると、２つの環状体の間で
遺伝子の交換が起ることになる。 発現 構造遺伝子によりポリペプチドが生産される過
程。これは転写と翻訳の組合せである。 発現調節(コントロ−ル)配列 構造遺伝子に有効に結合
された場合、それらの構造遺伝子の発現を調節し、統制
するヌクレオチド配列
【０００６】Ｆ型プラスミド Ｆ因子(Ｆはfertility
(生殖力))を持ったプラスミドであって、Ｆ因子を持た
ない宿主に該プラスミドのコピ−を移入することのでき
るプラスミド 遺伝子 ２つの部分、即ち(１)遺伝子生産物のための暗
号配列および(２)その遺伝子が発現されるかどうかを調
節しているプロモ−タ−領域内の配列、から構成されて
いるＤＮＡ配列 ゲノム 細胞またはウイルスの全ＤＮＡ。これは、まず
ポリペプチドを暗号化している構造遺伝子、更にオペレ
−タ−、プロモ−タ−、リボゾ−ムの結合配列および相
互作用配列(たとえばＳhine‐Ｄalgarno配列)を含んで
いる。 遺伝子型 ある生物に含まれている遺伝情報の全て 相同的(性)組換え 相同配列を含んでいるＤＮＡ上の２
つ領域間の組換え
(生殖力))を持ったプラスミドであって、Ｆ因子を持た
ない宿主に該プラスミドのコピ−を移入することのでき
るプラスミド 遺伝子 ２つの部分、即ち(１)遺伝子生産物のための暗
号配列および(２)その遺伝子が発現されるかどうかを調
節しているプロモ−タ−領域内の配列、から構成されて
いるＤＮＡ配列 ゲノム 細胞またはウイルスの全ＤＮＡ。これは、まず
ポリペプチドを暗号化している構造遺伝子、更にオペレ
−タ−、プロモ−タ−、リボゾ−ムの結合配列および相
互作用配列(たとえばＳhine‐Ｄalgarno配列)を含んで
いる。 遺伝子型 ある生物に含まれている遺伝情報の全て 相同的(性)組換え 相同配列を含んでいるＤＮＡ上の２
つ領域間の組換え
【０００７】Ｉ型プラスミド Ｆとは異なる不和合性グ
ル−プの一群の自律転移性プラスミド 不和合性 選択圧(selective pressure)がないと、同一
の細胞に２個のＤＮＡが共存し得ないこと 挿入 あるＤＮＡ配列を、別の分子のＤＮＡ配列内に付
加すること リ−ダ−配列 ５' 未端から最初の構造遺伝子の先端に
至るまでの mＲＮＡ上の領域。これには構造遺伝子の暗
号配列の翻訳を開始するのに重要な部位が含まれてい
る。 減数分裂 はじめの４n 個の染色体が、２回の連続した
分裂により生成した４個の細胞のそれぞれに１n個ずつ
分布するようになる過程。この過程は有性生殖に於いて
重要である。
ル−プの一群の自律転移性プラスミド 不和合性 選択圧(selective pressure)がないと、同一
の細胞に２個のＤＮＡが共存し得ないこと 挿入 あるＤＮＡ配列を、別の分子のＤＮＡ配列内に付
加すること リ−ダ−配列 ５' 未端から最初の構造遺伝子の先端に
至るまでの mＲＮＡ上の領域。これには構造遺伝子の暗
号配列の翻訳を開始するのに重要な部位が含まれてい
る。 減数分裂 はじめの４n 個の染色体が、２回の連続した
分裂により生成した４個の細胞のそれぞれに１n個ずつ
分布するようになる過程。この過程は有性生殖に於いて
重要である。
【０００８】mob (授動機能体) tra 機能体との組合せ
に於いてのみＤＮＡの転移を促す一連の生成物。mobはb
om サイトを含んでいるプラスミドの移動を促すことが
できる。授動(モビリゼ−ション) 別の細胞へ転移する
ことのできないＤＮＡ分子が、他のＤＮＡ分子の助けを
借りて転移する過程 授動ヘルパ−プラスミド 他のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ転移するための拡散性生成物を供給
することができるプラスミド 非接合性組換えプラスミド 細胞同志の接触により、そ
れ自体では、もとの宿主細胞から他の宿主細胞へ転移す
ることができないＤＮＡ分子。転移するには、他のＤＮ
Ａ、例えばヘルパ−プラスミドによって供給される機能
体が必要となる。
に於いてのみＤＮＡの転移を促す一連の生成物。mobはb
om サイトを含んでいるプラスミドの移動を促すことが
できる。授動(モビリゼ−ション) 別の細胞へ転移する
ことのできないＤＮＡ分子が、他のＤＮＡ分子の助けを
借りて転移する過程 授動ヘルパ−プラスミド 他のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ転移するための拡散性生成物を供給
することができるプラスミド 非接合性組換えプラスミド 細胞同志の接触により、そ
れ自体では、もとの宿主細胞から他の宿主細胞へ転移す
ることができないＤＮＡ分子。転移するには、他のＤＮ
Ａ、例えばヘルパ−プラスミドによって供給される機能
体が必要となる。
【０００９】ヌクレオチド 糖部分(ペント−ス)、燐酸
エステルおよび含窒素異項環塩基から構成されているＤ
ＮＡまたはＲＮＡの単量体単位。この塩基は糖部分とグ
リコシド結合で連結しており(ペント−スの１' 位の炭
素)、この塩基と糖とが結合したものがヌクレオシドで
ある。ヌクレオチドの特性はこの塩基によって決まる。
ＤＮＡの４個の塩基はアデニン(“Ａ")、グアニン
(“Ｇ")、シトシン(“Ｃ")およびチミン(“Ｔ")であ
る。ＲＮＡの４個の塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル
(“Ｕ")である。 表現形質 発育環境と遺伝子形質との相互関係によって
生成する個体の観察し得る特性
エステルおよび含窒素異項環塩基から構成されているＤ
ＮＡまたはＲＮＡの単量体単位。この塩基は糖部分とグ
リコシド結合で連結しており(ペント−スの１' 位の炭
素)、この塩基と糖とが結合したものがヌクレオシドで
ある。ヌクレオチドの特性はこの塩基によって決まる。
ＤＮＡの４個の塩基はアデニン(“Ａ")、グアニン
(“Ｇ")、シトシン(“Ｃ")およびチミン(“Ｔ")であ
る。ＲＮＡの４個の塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル
(“Ｕ")である。 表現形質 発育環境と遺伝子形質との相互関係によって
生成する個体の観察し得る特性
【００１０】プラスミド それ自体が宿主細胞中で複製
される、完全な(無傷の)レプリコンからなる非染色体性
の２本鎖ＤＮＡ配列。このプラスミドを単細胞生物に入
れると、そのプラスミドのＤＮＡによって、その生物の
性質が変わる、即ち形質転換される。例えば、テトラサ
イクリン耐性(ＴcR )のための遺伝子を持ったプラスミ
ドにより、本来はテトラサイクリンに感受性のある細胞
が耐性のある細胞に形質転換される。プラスミドによっ
て形質転換された細胞を形質転換体と呼ぶ。 ポリペプチド 隣接するアミノ酸どうしがα−アミノ基
とカルボキシル基とのペプチド結合により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモ−タ−領域 遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤＮＡ配列 プロモ−タ−配列 ＲＮＡポリメラ−ゼが結合する配列
であり、ポリメラ−ゼはそれより下流の配列の忠実な転
写を促進する。
される、完全な(無傷の)レプリコンからなる非染色体性
の２本鎖ＤＮＡ配列。このプラスミドを単細胞生物に入
れると、そのプラスミドのＤＮＡによって、その生物の
性質が変わる、即ち形質転換される。例えば、テトラサ
イクリン耐性(ＴcR )のための遺伝子を持ったプラスミ
ドにより、本来はテトラサイクリンに感受性のある細胞
が耐性のある細胞に形質転換される。プラスミドによっ
て形質転換された細胞を形質転換体と呼ぶ。 ポリペプチド 隣接するアミノ酸どうしがα−アミノ基
とカルボキシル基とのペプチド結合により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモ−タ−領域 遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤＮＡ配列 プロモ−タ−配列 ＲＮＡポリメラ−ゼが結合する配列
であり、ポリメラ−ゼはそれより下流の配列の忠実な転
写を促進する。
【００１１】組換えＤＮＡ分子または雑種(ハイブリッ
ド)ＤＮＡ 少なくとも２個のヌクレオチド配列からな
り、その一方の配列は、自然界では通常第２の配列と共
存しない、その様な配列からなる雑種のＤＮＡ配列 組換え ＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の一部分の新しい
結合体を創製すること 相同領域 ＤＮＡの別の領域に於ける配列と同じＤＮＡ
配列を持っているＤＮＡ領域 レプリコン ＤＮＡの複製開始サイトおよび複製を支配
するのに必要な機能を指定している遺伝子を持った自己
複製遺伝子単位 制限フラグメント 特定の標的ＤＮＡ配列を認識する酵
素による２本鎖開裂によって生じるＤＮＡ分子 ＲＮＡポリメラ−ゼ ＤＮＡのＲＮＡへの転写をつかさ
どる酵素
ド)ＤＮＡ 少なくとも２個のヌクレオチド配列からな
り、その一方の配列は、自然界では通常第２の配列と共
存しない、その様な配列からなる雑種のＤＮＡ配列 組換え ＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の一部分の新しい
結合体を創製すること 相同領域 ＤＮＡの別の領域に於ける配列と同じＤＮＡ
配列を持っているＤＮＡ領域 レプリコン ＤＮＡの複製開始サイトおよび複製を支配
するのに必要な機能を指定している遺伝子を持った自己
複製遺伝子単位 制限フラグメント 特定の標的ＤＮＡ配列を認識する酵
素による２本鎖開裂によって生じるＤＮＡ分子 ＲＮＡポリメラ−ゼ ＤＮＡのＲＮＡへの転写をつかさ
どる酵素
【００１２】選択可能なマ−カ−遺伝子 あるＤＮＡ配
列であって、それがある細胞内で発現された時、そのＤ
ＮＡ配列を含んでいない細胞より増殖しやすい有利性を
その細胞に与えるＤＮＡ配列。細胞を適当な選択的増殖
培地に置くと、この２つのタイプの細胞を区別すること
ができる。通常使用される選択可能なマ−カ−遺伝子は
抗生物質耐性を暗号化している遺伝子である。 単一乗換 ２個の環状ＤＮＡ分子を組換えて、相互組込
みされた大きい環状体を形成させる操作過程 構造遺伝子 ポリペプチドを暗号化している遺伝子 Ｔ−ＤＮＡ 植物細胞ゲノムに安定に組込まれることが
見い出されているＴiプラスミドの部分 Ｔ−領域 植物細胞ゲノムへ転移するＤＮＡ配列を含ん
でいる Ｔiプラスミドの部分
列であって、それがある細胞内で発現された時、そのＤ
ＮＡ配列を含んでいない細胞より増殖しやすい有利性を
その細胞に与えるＤＮＡ配列。細胞を適当な選択的増殖
培地に置くと、この２つのタイプの細胞を区別すること
ができる。通常使用される選択可能なマ−カ−遺伝子は
抗生物質耐性を暗号化している遺伝子である。 単一乗換 ２個の環状ＤＮＡ分子を組換えて、相互組込
みされた大きい環状体を形成させる操作過程 構造遺伝子 ポリペプチドを暗号化している遺伝子 Ｔ−ＤＮＡ 植物細胞ゲノムに安定に組込まれることが
見い出されているＴiプラスミドの部分 Ｔ−領域 植物細胞ゲノムへ転移するＤＮＡ配列を含ん
でいる Ｔiプラスミドの部分
【００１３】Ｔi プラスミド 感受性植物に腫瘍 (クラ
ウンガル) を誘発させるための遺伝情報を含んでいるＡ
grobacterium tumefaciens株に存在する大きいプラスミ
ドＴＬ−ＤＮＡおよびＴＲ−ＤＮＡ オクトピンクラウ
ンガル腫瘍細胞は２つのＴ−ＤＮＡ配列、即ち左Ｔ−Ｄ
ＮＡ(ＴＬ−ＤＮＡ)および右Ｔ−ＤＮＡ(ＴＲ−ＤＮＡ)
を含有し得る。ＴＬ−ＤＮＡはノパリン腫瘍細胞のＴ−
ＤＮＡと共通している配列を持っているがＴＲ−ＤＮＡ
は持っていない。 tra (転移機能(体)) プラスミドに暗号化されている拡
散性の生成物、および細胞間のＤＮＡ転移の際に利用さ
れる作用部位の両者を指す。例えば２つの細胞の間に橋
を作るのに必要な生成物およびＤＮＡ転移が開始する部
位。 転写 構造遺伝子から mＲＮＡが生産される過程、また
は、塩基対(ベ−スペア)の形成により、ＤＮＡに含まれ
ている遺伝情報に基きそれに相補的な塩基配列をもつＲ
ＮＡ鎖が形成される過程
ウンガル) を誘発させるための遺伝情報を含んでいるＡ
grobacterium tumefaciens株に存在する大きいプラスミ
ドＴＬ−ＤＮＡおよびＴＲ−ＤＮＡ オクトピンクラウ
ンガル腫瘍細胞は２つのＴ−ＤＮＡ配列、即ち左Ｔ−Ｄ
ＮＡ(ＴＬ−ＤＮＡ)および右Ｔ−ＤＮＡ(ＴＲ−ＤＮＡ)
を含有し得る。ＴＬ−ＤＮＡはノパリン腫瘍細胞のＴ−
ＤＮＡと共通している配列を持っているがＴＲ−ＤＮＡ
は持っていない。 tra (転移機能(体)) プラスミドに暗号化されている拡
散性の生成物、および細胞間のＤＮＡ転移の際に利用さ
れる作用部位の両者を指す。例えば２つの細胞の間に橋
を作るのに必要な生成物およびＤＮＡ転移が開始する部
位。 転写 構造遺伝子から mＲＮＡが生産される過程、また
は、塩基対(ベ−スペア)の形成により、ＤＮＡに含まれ
ている遺伝情報に基きそれに相補的な塩基配列をもつＲ
ＮＡ鎖が形成される過程
【００１４】形質転換 細胞のＤＮＡ補体(complement)
に外来性ＤＮＡが導入されることによって生じる遺伝的
修飾 翻訳 mＲＮＡ からポリペプチドが生産される過程、あ
るいは、 mＲＮＡ分子に存在する遺伝情報が、ポリペプ
チド合成において特定のアミノ酸の順序を指定する過程 非分化表現形質 いかなる特異な部分もなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクタ− 異なった宿主細胞間を転移するように設計さ
れたＤＮＡ分子
に外来性ＤＮＡが導入されることによって生じる遺伝的
修飾 翻訳 mＲＮＡ からポリペプチドが生産される過程、あ
るいは、 mＲＮＡ分子に存在する遺伝情報が、ポリペプ
チド合成において特定のアミノ酸の順序を指定する過程 非分化表現形質 いかなる特異な部分もなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクタ− 異なった宿主細胞間を転移するように設計さ
れたＤＮＡ分子
【００１５】
【従来の技術】組換えＤＮＡ技術の進歩によって、微生
物の遺伝子工学に新たな展望が開けた。もし１個の体細
胞から、完全な生物を再生することができたら、これら
の技術は多細胞真核生物にまで広がるであろう。ある種
の高等植物の細胞は、優れた再生能力を有し、従って高
等生物の遺伝子工学にとってかっこうの材料となる。
物の遺伝子工学に新たな展望が開けた。もし１個の体細
胞から、完全な生物を再生することができたら、これら
の技術は多細胞真核生物にまで広がるであろう。ある種
の高等植物の細胞は、優れた再生能力を有し、従って高
等生物の遺伝子工学にとってかっこうの材料となる。
【００１６】植物の遺伝子工学の主たる問題点は、外来
性ＤＮＡを植物ゲノムに導入する為の系の利用性にあ
る。この様な系には、グラム陰性土壌細菌のＡgrobacte
rium tumefaciensが持っている腫瘍誘起(Ｔi)プラスミ
ドがある。この微生物は、広範囲の双子葉植物の損傷組
織に、クラウンガル(crowngall、冠状コブ)と呼ばれる
腫瘍性形質転換を引き起す原因となることがわかってい
る。この増殖性の腫瘍は、オパイン(opines)と呼ばれる
Ｔiに特異な新しい代謝物を合成する。この形質転換
は、分子レベルでみると、Ｔi プラスミドの実体のはっ
きりわかっているＴ−ＤＮＡ(転移ＤＮＡ)フラグメント
が植物細胞ゲノムに転移して安定に組込まれたことによ
って起る。換言すれば、クラウンガル腫瘍は、その染色
体ＤＮＡに、腫瘍セルラインをもたらした Ｔiプラスミ
ド中のＤＮＡ配列と相同のＴ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡ
セグメントを含んでいる。あらゆる場合に於いて、この
Ｔ−ＤＮＡは、連続した一連の ＴiプラスミドＤＮＡに
相当しており、また、これと共直線性である。従ってこ
れはＴ−領域と呼ばれる。
性ＤＮＡを植物ゲノムに導入する為の系の利用性にあ
る。この様な系には、グラム陰性土壌細菌のＡgrobacte
rium tumefaciensが持っている腫瘍誘起(Ｔi)プラスミ
ドがある。この微生物は、広範囲の双子葉植物の損傷組
織に、クラウンガル(crowngall、冠状コブ)と呼ばれる
腫瘍性形質転換を引き起す原因となることがわかってい
る。この増殖性の腫瘍は、オパイン(opines)と呼ばれる
Ｔiに特異な新しい代謝物を合成する。この形質転換
は、分子レベルでみると、Ｔi プラスミドの実体のはっ
きりわかっているＴ−ＤＮＡ(転移ＤＮＡ)フラグメント
が植物細胞ゲノムに転移して安定に組込まれたことによ
って起る。換言すれば、クラウンガル腫瘍は、その染色
体ＤＮＡに、腫瘍セルラインをもたらした Ｔiプラスミ
ド中のＤＮＡ配列と相同のＴ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡ
セグメントを含んでいる。あらゆる場合に於いて、この
Ｔ−ＤＮＡは、連続した一連の ＴiプラスミドＤＮＡに
相当しており、また、これと共直線性である。従ってこ
れはＴ−領域と呼ばれる。
【００１７】Ｔi プラスミドはクラウンガル細胞で合成
されたオパインのタイプによって分類される。クラウン
ガル細胞でノパリン[Ｎ−α−( １,３−ジカルボキシプ
ロピル )−Ｌ−アルギニン]の合成を惹起させるＡgroba
cterium株はノパリン株と呼ばれ、オクトピン[Ｎ−α−
( Ｎ−１−カルボキシエチル )−Ｌ−アルギニン]を合
成するものはオクトピン株と呼ばれる。これらが最も普
通に用いられるＡgrobacterium株である。
されたオパインのタイプによって分類される。クラウン
ガル細胞でノパリン[Ｎ−α−( １,３−ジカルボキシプ
ロピル )−Ｌ−アルギニン]の合成を惹起させるＡgroba
cterium株はノパリン株と呼ばれ、オクトピン[Ｎ−α−
( Ｎ−１−カルボキシエチル )−Ｌ−アルギニン]を合
成するものはオクトピン株と呼ばれる。これらが最も普
通に用いられるＡgrobacterium株である。
【００１８】植物の遺伝手術にＴ−ＤＮＡをベクタ−と
して使用する試みがモデル実験で行なわれた。この実験
では、インビボにおいて、Ａgrobacterium Ｔ３７株の
ＴiプラスミドからのＴ−ＤＮＡの右側境界部の近くに
１４kb 細菌性トランスポソン(transposon) Ｔn ７が挿
入された。すると、このＴiプラスミドを持っているア
グロバクテリアによって惹起される腫瘍中のノパリン合
成が消滅した。更に、サザーン・ブロッテイング・ハイ
ブリダイゼ−ションの結果、その様な挿入を行なわなけ
れば正常であるＴ−ＤＮＡ配列の一部分として、この腫
瘍の染色体ＤＮＡ中に全 Ｔn７が存在することがわかっ
た (Ｈernalsteensら、Ｎature２８７(１９８０) , ６
５４−６５６; Ｈolstersら、Ｍol．Ｇen．Ｇenet．１
８５ (１９８２) ,２８３−２８９) 。この様に、２３k
bＴ−ＤＮＡに１４kbＤＮＡフラグメントを導入して
も、２３kbＴ−ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの転移能力に
変化は見られなかった。
して使用する試みがモデル実験で行なわれた。この実験
では、インビボにおいて、Ａgrobacterium Ｔ３７株の
ＴiプラスミドからのＴ−ＤＮＡの右側境界部の近くに
１４kb 細菌性トランスポソン(transposon) Ｔn ７が挿
入された。すると、このＴiプラスミドを持っているア
グロバクテリアによって惹起される腫瘍中のノパリン合
成が消滅した。更に、サザーン・ブロッテイング・ハイ
ブリダイゼ−ションの結果、その様な挿入を行なわなけ
れば正常であるＴ−ＤＮＡ配列の一部分として、この腫
瘍の染色体ＤＮＡ中に全 Ｔn７が存在することがわかっ
た (Ｈernalsteensら、Ｎature２８７(１９８０) , ６
５４−６５６; Ｈolstersら、Ｍol．Ｇen．Ｇenet．１
８５ (１９８２) ,２８３−２８９) 。この様に、２３k
bＴ−ＤＮＡに１４kbＤＮＡフラグメントを導入して
も、２３kbＴ−ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの転移能力に
変化は見られなかった。
【００１９】ノパリン株、ＡgrobacteriumＴ３７の Ｔi
プラスミドのＴ−ＤＮＡの境界部は非常に正確に調べら
れている。これは全ノパリン Ｔiプラスミドの極く一
部、約２３kbに過ぎない。更に、このＴ−ＤＮＡの境界
部は知られている: 即ち、このＴ−ＤＮＡの境界部を決
めているヌクレオチド配列が調べられ、ノパリン Ｔiプ
ラスミドの同じ領域と比較された (Ｚambryskiら、Ｓci
ence ２０９ ( １９８０), １３８５−１３９１;Ｚambr
yskiら、Ｊ. Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８２),３６
１−３７０ )。このＴ−領域の境界部が、Ｔ−ＤＮＡの
植物細胞ゲノムへの組込みに最も関係している様であ
る。
プラスミドのＴ−ＤＮＡの境界部は非常に正確に調べら
れている。これは全ノパリン Ｔiプラスミドの極く一
部、約２３kbに過ぎない。更に、このＴ−ＤＮＡの境界
部は知られている: 即ち、このＴ−ＤＮＡの境界部を決
めているヌクレオチド配列が調べられ、ノパリン Ｔiプ
ラスミドの同じ領域と比較された (Ｚambryskiら、Ｓci
ence ２０９ ( １９８０), １３８５−１３９１;Ｚambr
yskiら、Ｊ. Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８２),３６
１−３７０ )。このＴ−領域の境界部が、Ｔ−ＤＮＡの
植物細胞ゲノムへの組込みに最も関係している様であ
る。
【００２０】ＤＮＡを植物細胞へ転移させる為のベクタ
−として Ｔiプラスミドを使用するには、転移したＤＮ
Ａの境界部を決めているＴ−ＤＮＡ配列を知ることが基
本的に必要である。そうすれば、外来性ＤＮＡをこの境
界内に挿入し、確実に植物細胞ゲノムへ転移させること
ができる。更に、この系を利用しようとすれば、形質転
換された植物細胞が、その生育特性において腫瘍の性質
を持たず、正常であるということが重要である。Ｔ−Ｄ
ＮＡ転移の後、正常細胞を生産するには、Ｔ−ＤＮＡ自
体によって暗号化されている機能を知る必要がある。従
って、どの領域が腫瘍表現形質に関係しているか調べる
ために、Ｔi プラスミドのＴ−領域の撤底的な遺伝子分
析が行なわれた。
−として Ｔiプラスミドを使用するには、転移したＤＮ
Ａの境界部を決めているＴ−ＤＮＡ配列を知ることが基
本的に必要である。そうすれば、外来性ＤＮＡをこの境
界内に挿入し、確実に植物細胞ゲノムへ転移させること
ができる。更に、この系を利用しようとすれば、形質転
換された植物細胞が、その生育特性において腫瘍の性質
を持たず、正常であるということが重要である。Ｔ−Ｄ
ＮＡ転移の後、正常細胞を生産するには、Ｔ−ＤＮＡ自
体によって暗号化されている機能を知る必要がある。従
って、どの領域が腫瘍表現形質に関係しているか調べる
ために、Ｔi プラスミドのＴ−領域の撤底的な遺伝子分
析が行なわれた。
【００２１】Ｔ−ＤＮＡは、クラウンガル表現形質の原
因となる機能体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ−
ＤＮＡの特定の領域に局在化している( Ｌeemansら、Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．１(１９８２),１４７−１５２; Ｗillmitze
rら、ＥＭＢＯ Ｊ．１(１９８２),１３９−１４６ )。
一般に、腫瘍カルス組織の非分化表現形質を支配してい
る少なくとも４つの遺伝子が存在している。これらの遺
伝子の突然変異体 (ミュ−タント) は、新芽様のあるい
は根の様な外観の形質転換組織を形成させることができ
る。この後者の成果は、腫瘍組織ではなく正常植物組織
中で発現させる為にＤＮＡを植物に転移したいと思う場
合には特に重要である。
因となる機能体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ−
ＤＮＡの特定の領域に局在化している( Ｌeemansら、Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．１(１９８２),１４７−１５２; Ｗillmitze
rら、ＥＭＢＯ Ｊ．１(１９８２),１３９−１４６ )。
一般に、腫瘍カルス組織の非分化表現形質を支配してい
る少なくとも４つの遺伝子が存在している。これらの遺
伝子の突然変異体 (ミュ−タント) は、新芽様のあるい
は根の様な外観の形質転換組織を形成させることができ
る。この後者の成果は、腫瘍組織ではなく正常植物組織
中で発現させる為にＤＮＡを植物に転移したいと思う場
合には特に重要である。
【００２２】最近、完全な正常植物に再生することがで
きる形質転換新芽を誘導する Ｔiプラスミド変異体がみ
つかった。これらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分
裂によってＴ−ＤＮＡ特異配列を伝達することさえし
た: 即ち、子孫の植物もＴ−ＤＮＡ特異配列を含んでい
た ( Ｏtten ら、Ｍol．Ｇen．Ｇenet．１８３(１９８
１), ２０９−２１３ )。しかし、この形質転換植物組
織は、その染色体ＤＮＡ中に、腫瘍表現形質を支配して
いるＴ−ＤＮＡ領域が除去される大がかりな欠損(欠失)
が発生したことにより、著しく小さくなったＴ−ＤＮＡ
を含んでいた。この欠損が当初の形質転換時に起ったの
か、新芽の形成をもたらすその後の過程で起ったのかは
不明である。
きる形質転換新芽を誘導する Ｔiプラスミド変異体がみ
つかった。これらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分
裂によってＴ−ＤＮＡ特異配列を伝達することさえし
た: 即ち、子孫の植物もＴ−ＤＮＡ特異配列を含んでい
た ( Ｏtten ら、Ｍol．Ｇen．Ｇenet．１８３(１９８
１), ２０９−２１３ )。しかし、この形質転換植物組
織は、その染色体ＤＮＡ中に、腫瘍表現形質を支配して
いるＴ−ＤＮＡ領域が除去される大がかりな欠損(欠失)
が発生したことにより、著しく小さくなったＴ−ＤＮＡ
を含んでいた。この欠損が当初の形質転換時に起ったの
か、新芽の形成をもたらすその後の過程で起ったのかは
不明である。
【００２３】Ｔi プラスミドは大きく(２００kb)、その
Ｔi プラスミドの種々の場所に存在している多くの遺伝
子が植物の形質転換に関係している。従って、Ｔ−領域
内の適切な場所に特殊なエンドヌクレア−ゼ認識サイト
を有し、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定
に挿入するのに必要な全ての機能を持ったＴi プラスミ
ド由来の小型のクロ−ニングベクタ−を組み立てること
は不可能である。
Ｔi プラスミドの種々の場所に存在している多くの遺伝
子が植物の形質転換に関係している。従って、Ｔ−領域
内の適切な場所に特殊なエンドヌクレア−ゼ認識サイト
を有し、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定
に挿入するのに必要な全ての機能を持ったＴi プラスミ
ド由来の小型のクロ−ニングベクタ−を組み立てること
は不可能である。
【００２４】所望のＤＮＡフラグメントをＴi プラスミ
ドのＴ−領域の特定の制限酵素開裂サイトに導入する為
の既知の方法の１つは、Ｅscherichia coli (大腸菌)に
おけると同様、Ａgrobacteriumにおいても複製すること
ができ、Ｔ−ＤＮＡの所望の制限フラグメントを含んで
いるクロ−ニングプラスミドを組み立てることである。
この様なクロ−ニングベクタ−は「中間ベクタ−」と命
名された。この様な中間ベクタ−は、Ｔ−領域によって
暗号化されている機能を分析するのに使用された (Ｌee
mans ら、Ｊ．Ｍol．Ａppln．Ｇenet．１ ( １９８１),
１４９−１６４)。
ドのＴ−領域の特定の制限酵素開裂サイトに導入する為
の既知の方法の１つは、Ｅscherichia coli (大腸菌)に
おけると同様、Ａgrobacteriumにおいても複製すること
ができ、Ｔ−ＤＮＡの所望の制限フラグメントを含んで
いるクロ−ニングプラスミドを組み立てることである。
この様なクロ−ニングベクタ−は「中間ベクタ−」と命
名された。この様な中間ベクタ−は、Ｔ−領域によって
暗号化されている機能を分析するのに使用された (Ｌee
mans ら、Ｊ．Ｍol．Ａppln．Ｇenet．１ ( １９８１),
１４９−１６４)。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、発現し得る
遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入する方法に関するもので
ある。本発明の１つの目的は所望のあらゆる遺伝子(群)
を導入することのできる改良されたアクセプタ−Ｔi プ
ラスミドを提供することにある。導入される所望の遺伝
子(群)は、そのアクセプタ−Ｔi プラスミドの相当する
領域と相同の領域を持った新規な中間クロ−ニングベク
タ−内に含まれている。この中間クロ−ニングベクタ−
を提供することも本発明の目的の１つである。
遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入する方法に関するもので
ある。本発明の１つの目的は所望のあらゆる遺伝子(群)
を導入することのできる改良されたアクセプタ−Ｔi プ
ラスミドを提供することにある。導入される所望の遺伝
子(群)は、そのアクセプタ−Ｔi プラスミドの相当する
領域と相同の領域を持った新規な中間クロ−ニングベク
タ−内に含まれている。この中間クロ−ニングベクタ−
を提供することも本発明の目的の１つである。
【００２６】所望の遺伝子(群)のアクセプタ−Ｔi プラ
スミドへの導入は、Ａgrobacteriumに保持されているア
クセプタ−Ｔi プラスミドと中間クロ−ニングベクタ−
の２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一乗換えに
よって達成される。この中間クロ−ニングベクタ−は、
ヘルパ−プラスミドを使って、それが増殖するＥscheri
chia coli からＡgrobacteriumに授動される。この様な
ヘルパ−プラスミドおよび授動のための機能は知られて
いる (Ｆinnegan ら、Ｍol．Ｇen．Ｇenet．１８５ (１
９８２), ３４４−３５１; Ｆigurskiら、Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ７６(１９７９); Ｄittaら、
Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ７７(１９８０),
７３４７)。Ａgrobacteriumでの単一乗換えの結果、ハ
イブリッドＴi プラスミドベクタ−が得られる。この様
なハイブリッドＴi プラスミドも本発明の目的の１つで
ある。
スミドへの導入は、Ａgrobacteriumに保持されているア
クセプタ−Ｔi プラスミドと中間クロ−ニングベクタ−
の２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一乗換えに
よって達成される。この中間クロ−ニングベクタ−は、
ヘルパ−プラスミドを使って、それが増殖するＥscheri
chia coli からＡgrobacteriumに授動される。この様な
ヘルパ−プラスミドおよび授動のための機能は知られて
いる (Ｆinnegan ら、Ｍol．Ｇen．Ｇenet．１８５ (１
９８２), ３４４−３５１; Ｆigurskiら、Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ７６(１９７９); Ｄittaら、
Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ７７(１９８０),
７３４７)。Ａgrobacteriumでの単一乗換えの結果、ハ
イブリッドＴi プラスミドベクタ−が得られる。この様
なハイブリッドＴi プラスミドも本発明の目的の１つで
ある。
【００２７】Ａgrobacteriumに保持されたこのハイブリ
ッドプラスミドベクタ− (以降、ベクタ−組成物とい
う) を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所望の遺伝
子生成物の発現についてスクリ−ニングする。植物細胞
をベクタ−組成物で感染させて形質転換植物細胞を調製
するこの方法、その形質転換された植物細胞、およびそ
れから発生した植物を提供することも本発明の目的であ
る。この技法はＡgrobacteriumの植物転移性のプラスミ
ド全てに適用することができる。
ッドプラスミドベクタ− (以降、ベクタ−組成物とい
う) を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所望の遺伝
子生成物の発現についてスクリ−ニングする。植物細胞
をベクタ−組成物で感染させて形質転換植物細胞を調製
するこの方法、その形質転換された植物細胞、およびそ
れから発生した植物を提供することも本発明の目的であ
る。この技法はＡgrobacteriumの植物転移性のプラスミ
ド全てに適用することができる。
【００２８】以下に添付の図面について詳細に説明す
る。図１は、境界配列(１)および(２)を除き、Ｔ−領域
の内部部分を除去して得られる本発明のアクセプタ−Ｔ
iプラスミドの１態様を示している。この境界配列は、
Ｔ−領域を植物細胞ゲノムに組込むのに必須である。境
界配列(１)と(２)の間の領域(３)が、植物に転移される
であろうＤＮＡセグメントである。このアクセプタ−Ｔ
iプラスミドは、中間クロ−ニングベクタ−を単一乗換
えによって組込ますことを可能にしている中間クロ−ニ
ングベクタ−内のＤＮＡ配列の少なくとも一部と相同の
ＤＮＡ配列を持ったＤＮＡセグメント(３)を含んでい
る。Ｔiプラスミド領域(４)は、Ａgrobacteriumによっ
てＴ−領域が植物細胞ゲノムに転移するのに必要な機能
を暗号化している。この領域は、vir−領域と呼ばれる。
る。図１は、境界配列(１)および(２)を除き、Ｔ−領域
の内部部分を除去して得られる本発明のアクセプタ−Ｔ
iプラスミドの１態様を示している。この境界配列は、
Ｔ−領域を植物細胞ゲノムに組込むのに必須である。境
界配列(１)と(２)の間の領域(３)が、植物に転移される
であろうＤＮＡセグメントである。このアクセプタ−Ｔ
iプラスミドは、中間クロ−ニングベクタ−を単一乗換
えによって組込ますことを可能にしている中間クロ−ニ
ングベクタ−内のＤＮＡ配列の少なくとも一部と相同の
ＤＮＡ配列を持ったＤＮＡセグメント(３)を含んでい
る。Ｔiプラスミド領域(４)は、Ａgrobacteriumによっ
てＴ−領域が植物細胞ゲノムに転移するのに必要な機能
を暗号化している。この領域は、vir−領域と呼ばれる。
【００２９】図２は、単一乗換えによって図１のアクセ
プタ−Ｔi プラスミドに挿入される本発明の中間クロ−
ニングベクタ−を示している。このベクタ−は、所望の
単一乗換えを可能にするアクセプタ−Ｔi プラスミドの
ＤＮＡセグメント(３)の少なくとも一部と相同なＤＮＡ
配列を持ったクロ−ニング媒体ＤＮＡセグメント(３')
を含んでいる。更に、この中間クロ−ニングベクタ−
は、その天然のプロモ−タ−配列を備えた遺伝子あるい
は遺伝子群(５)を含んでいる。この組み立てに於いて
は、一般に植物の遺伝子を使用することができる。それ
は、他のものに比較して発現され易いと思われるからで
ある。しかし、原理的には、全ゆる所望の遺伝子を挿入
することができる。この中間クロ−ニングベクタ−は選
択マ−カ−遺伝子(６)を含んでいてもよい。この遺伝子
は、植物細胞中でこの遺伝子の発現を可能にするプロモ
−タ−配列を含んでいなければならない。このマ−カ−
遺伝子を含んでいる植物細胞は、それを含んでいない細
胞より、成長の選択有利性を持っていなければならな
い。何故なら、この様にして、このマ−カ−遺伝子を含
んでいるＤＮＡによって形質転換された植物細胞を、非
形質転換細胞と区別することができるからである。
プタ−Ｔi プラスミドに挿入される本発明の中間クロ−
ニングベクタ−を示している。このベクタ−は、所望の
単一乗換えを可能にするアクセプタ−Ｔi プラスミドの
ＤＮＡセグメント(３)の少なくとも一部と相同なＤＮＡ
配列を持ったクロ−ニング媒体ＤＮＡセグメント(３')
を含んでいる。更に、この中間クロ−ニングベクタ−
は、その天然のプロモ−タ−配列を備えた遺伝子あるい
は遺伝子群(５)を含んでいる。この組み立てに於いて
は、一般に植物の遺伝子を使用することができる。それ
は、他のものに比較して発現され易いと思われるからで
ある。しかし、原理的には、全ゆる所望の遺伝子を挿入
することができる。この中間クロ−ニングベクタ−は選
択マ−カ−遺伝子(６)を含んでいてもよい。この遺伝子
は、植物細胞中でこの遺伝子の発現を可能にするプロモ
−タ−配列を含んでいなければならない。このマ−カ−
遺伝子を含んでいる植物細胞は、それを含んでいない細
胞より、成長の選択有利性を持っていなければならな
い。何故なら、この様にして、このマ−カ−遺伝子を含
んでいるＤＮＡによって形質転換された植物細胞を、非
形質転換細胞と区別することができるからである。
【００３０】図３は、図２の中間クロ−ニングベクタ−
と類似の、図１のアクセプタ−Ｔiプラスミドに単一乗
換えによって挿入される本発明に係る中間クロ−ニング
ベクタ−のもう１つの態様を示している。これは、クロ
−ニング媒体ＤＮＡセグメント(３')、所望の遺伝子の
統制のとれた発現を可能にする外来性プロモ−タ−配列
(８)、および、所望により、マ−カ−遺伝子(６)を含ん
でいる。
と類似の、図１のアクセプタ−Ｔiプラスミドに単一乗
換えによって挿入される本発明に係る中間クロ−ニング
ベクタ−のもう１つの態様を示している。これは、クロ
−ニング媒体ＤＮＡセグメント(３')、所望の遺伝子の
統制のとれた発現を可能にする外来性プロモ−タ−配列
(８)、および、所望により、マ−カ−遺伝子(６)を含ん
でいる。
【００３１】図４は、図１のアクセプタ−Ｔi プラスミ
ドおよび図２並びに図３の中間クロ−ニングベクタ−か
らの、単一乗換えによる本発明に係るハイブリッドＴi
プラスミドベクタ−の調製を示す模式図である。
ドおよび図２並びに図３の中間クロ−ニングベクタ−か
らの、単一乗換えによる本発明に係るハイブリッドＴi
プラスミドベクタ−の調製を示す模式図である。
【００３２】図５は、Ｅ．coliからアクセプタ−Ｔi プ
ラスミドを含んでいるＡgrobacteriumへの、中間クロ−
ニングベクタ−の遺伝子転移に関する諸過程を概略した
ものである。第１段階は、中間クロ−ニングベクタ−を
含んでいるＥ．coli株(１)と、その後のＡgrobacterium
との接合の為の２つのヘルパ−プラスミドを含んでいる
もう１つのＥ．coli株との接合である。１方のヘルパ−
プラスミドはプラスミド転移に重要なＤＮＡ配列(tra)
を含んでおり、他方のヘルパ−プラスミドは授動に重要
な配列(mob) を含んでいる。接合によってこれらのヘル
パ−プラスミドがＥ．coli株(１)に導入されると、そこ
に含まれている中間クロ−ニングベクタ−が他の細菌株
へ転移することができる様になる。tra およびmob ヘル
パ−プラスミドは、中間クロ−ニングベクタ−が持って
いる抗生物質耐性マ−カ−(Ａbr1)とは異なるマ−カ
−、Ａbr2およびＡbr3 をそれぞれ持っている。従っ
て、全てのプラスミドが存在するかどうかを選択培地上
でモニタ−することができる。こうして授動株(３)が得
られる。
ラスミドを含んでいるＡgrobacteriumへの、中間クロ−
ニングベクタ−の遺伝子転移に関する諸過程を概略した
ものである。第１段階は、中間クロ−ニングベクタ−を
含んでいるＥ．coli株(１)と、その後のＡgrobacterium
との接合の為の２つのヘルパ−プラスミドを含んでいる
もう１つのＥ．coli株との接合である。１方のヘルパ−
プラスミドはプラスミド転移に重要なＤＮＡ配列(tra)
を含んでおり、他方のヘルパ−プラスミドは授動に重要
な配列(mob) を含んでいる。接合によってこれらのヘル
パ−プラスミドがＥ．coli株(１)に導入されると、そこ
に含まれている中間クロ−ニングベクタ−が他の細菌株
へ転移することができる様になる。tra およびmob ヘル
パ−プラスミドは、中間クロ−ニングベクタ−が持って
いる抗生物質耐性マ−カ−(Ａbr1)とは異なるマ−カ
−、Ａbr2およびＡbr3 をそれぞれ持っている。従っ
て、全てのプラスミドが存在するかどうかを選択培地上
でモニタ−することができる。こうして授動株(３)が得
られる。
【００３３】この授動株(３)を、図１のアクセプタ−Ｔ
i プラスミドを含んでいるＡ.tumefaciens 株(４)と接
合させ、中間クロ−ニングベクタ−の抗生物質耐性マ−
カ−で選択する。中間クロ−ニングベクタ−はＡgrobac
terium中で複製できないので、受容アクセプタ−Ｔiプ
ラスミドと相互組込み体を形成した場合にのみ、保持さ
れることができる。Ａgrobacterium中のこの相互組込み
構造体(５)が、ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させるの
に使用される最終的なハイブリッドＴiプラスミドであ
る。
i プラスミドを含んでいるＡ.tumefaciens 株(４)と接
合させ、中間クロ−ニングベクタ−の抗生物質耐性マ−
カ−で選択する。中間クロ−ニングベクタ−はＡgrobac
terium中で複製できないので、受容アクセプタ−Ｔiプ
ラスミドと相互組込み体を形成した場合にのみ、保持さ
れることができる。Ａgrobacterium中のこの相互組込み
構造体(５)が、ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させるの
に使用される最終的なハイブリッドＴiプラスミドであ
る。
【００３４】図６は、図１に示したものと同類のモデル
アクセプタ−Ｔiプラスミド(タイプＡ)の組み立てを示
している。ここでは、Ｔiプラスミドと、このもとのＴi
プラスミドの一部と置き換わるＤＮＡ配列を含んでいる
別のプラスミドとの間で、二重乗換えが起る。より具体
的に述べると、小さい方のプラスミドはクロ−ニング媒
体(３)の中にＴ−領域の境界配列(１, ２)を含んでい
る。二重乗換えの結果、Ｔ領域の内部のＴ部分が除去さ
れ、代ってクロ−ニング媒体で置き換えられる。得られ
たアクセプタ−Ｔiプラスミド(Ａ)は、境界配列(１,
２)の間に含まれているＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移
させることができる。得られた、形質転換されたＤＮＡ
は、Ｔiプラスミド(Ａ)では腫瘍の増殖を支配している
遺伝子が除去されているので腫瘍性のクラウンガル組織
をつくらない。Ｔiプラスミド(Ａ)は、クロ−ニング媒
体(３)と相同性を有するあらゆる中間クロ−ニングベク
タ−用の極めて普遍的なアクセプタ−Ｔiプラスミドで
ある。このクロ−ニング媒体(３)は通常のプラスミドで
よく、例えば pＢＲ３２２またはその誘導体などによっ
て置き換えることができる。
アクセプタ−Ｔiプラスミド(タイプＡ)の組み立てを示
している。ここでは、Ｔiプラスミドと、このもとのＴi
プラスミドの一部と置き換わるＤＮＡ配列を含んでいる
別のプラスミドとの間で、二重乗換えが起る。より具体
的に述べると、小さい方のプラスミドはクロ−ニング媒
体(３)の中にＴ−領域の境界配列(１, ２)を含んでい
る。二重乗換えの結果、Ｔ領域の内部のＴ部分が除去さ
れ、代ってクロ−ニング媒体で置き換えられる。得られ
たアクセプタ−Ｔiプラスミド(Ａ)は、境界配列(１,
２)の間に含まれているＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移
させることができる。得られた、形質転換されたＤＮＡ
は、Ｔiプラスミド(Ａ)では腫瘍の増殖を支配している
遺伝子が除去されているので腫瘍性のクラウンガル組織
をつくらない。Ｔiプラスミド(Ａ)は、クロ−ニング媒
体(３)と相同性を有するあらゆる中間クロ−ニングベク
タ−用の極めて普遍的なアクセプタ−Ｔiプラスミドで
ある。このクロ−ニング媒体(３)は通常のプラスミドで
よく、例えば pＢＲ３２２またはその誘導体などによっ
て置き換えることができる。
【００３５】図７は、中間クロ−ニングベクタ−をE.co
li宿主細胞中で組み立てる工程を模式的に示したもので
ある。制限エンドヌクレア−ゼサイトＲ1 に囲まれた所
望の遺伝子(５)および制限エンドヌクレア−ゼサイトＲ
2 で囲まれた選択し得るマ−カ−遺伝子(６)を、酵素Ｒ
1 およびＲ2 の為のそれぞれ１つの制限サイトを含んで
いるクロ−ニング媒体(３')に挿入する。３つの分子を
全て制限酵素Ｒ1 および／またはＲ2で消化し、ＤＮＡ
リガ−ゼを用いてライゲ−ション(結紮)して中間クロ−
ニングベクタ−を形成させる。このクローニング媒体
(３')は、細菌遺伝子学の選択マ−カ−として使用する
抗生物質耐性(Ａbr1) を暗号化しているもう１つのＤＮ
Ａ配列を含んでいなければならない。所望の遺伝子(５)
はその天然のプロモ−タ−または図２および図３に概説
した外来性プロモ−タ−の支配下にある。
li宿主細胞中で組み立てる工程を模式的に示したもので
ある。制限エンドヌクレア−ゼサイトＲ1 に囲まれた所
望の遺伝子(５)および制限エンドヌクレア−ゼサイトＲ
2 で囲まれた選択し得るマ−カ−遺伝子(６)を、酵素Ｒ
1 およびＲ2 の為のそれぞれ１つの制限サイトを含んで
いるクロ−ニング媒体(３')に挿入する。３つの分子を
全て制限酵素Ｒ1 および／またはＲ2で消化し、ＤＮＡ
リガ−ゼを用いてライゲ−ション(結紮)して中間クロ−
ニングベクタ−を形成させる。このクローニング媒体
(３')は、細菌遺伝子学の選択マ−カ−として使用する
抗生物質耐性(Ａbr1) を暗号化しているもう１つのＤＮ
Ａ配列を含んでいなければならない。所望の遺伝子(５)
はその天然のプロモ−タ−または図２および図３に概説
した外来性プロモ−タ−の支配下にある。
【００３６】図８は本発明に係るアクセプタ−Ｔiプラ
スミド(タイプＢ)のもう１つの具体的態様を組み立てる
ための模式図である。この態様では、境界配列(１)およ
び(２)のすぐ外側のＴi配列に相同の、それぞれＤＮＡ
配列(９)および(１０)を含んでいるクロ−ニング媒体と
Ｔiプラスミドとの間で二重乗換えが起る。この二重乗
換えによって、境界配列(１)および(２)を含んでいるＴ
−領域Ｔ全体が削除され、それがクロ−ニング媒体(３)
で置き換えられる。Ｔi プラスミド(Ｂ)は、境界配列
(１)および(２)の間にクロ−ンされた所望の遺伝子を含
有している中間クロ−ニングベクタ−のためのアクセプ
タ−である(図９参照)。
スミド(タイプＢ)のもう１つの具体的態様を組み立てる
ための模式図である。この態様では、境界配列(１)およ
び(２)のすぐ外側のＴi配列に相同の、それぞれＤＮＡ
配列(９)および(１０)を含んでいるクロ−ニング媒体と
Ｔiプラスミドとの間で二重乗換えが起る。この二重乗
換えによって、境界配列(１)および(２)を含んでいるＴ
−領域Ｔ全体が削除され、それがクロ−ニング媒体(３)
で置き換えられる。Ｔi プラスミド(Ｂ)は、境界配列
(１)および(２)の間にクロ−ンされた所望の遺伝子を含
有している中間クロ−ニングベクタ−のためのアクセプ
タ−である(図９参照)。
【００３７】図９は、図８のアクセプタ−Ｔi プラスミ
ド(Ｂ)に単一乗換えによって挿入される本発明の中間ク
ロ−ニングベクタ−を例示している。これは、所望の遺
伝子(５)の両端に位置する境界配列(１)および(２)を含
んでいる。これはまた、２つのプラスミド間の相同的組
換えを可能にするため、アクセプタ−Ｔi プラスミド
(Ｂ)中のクロ−ニング媒体配列と少なくとも一部が相同
であるクロ−ニング媒体配列(３')をも含んでいる。
ド(Ｂ)に単一乗換えによって挿入される本発明の中間ク
ロ−ニングベクタ−を例示している。これは、所望の遺
伝子(５)の両端に位置する境界配列(１)および(２)を含
んでいる。これはまた、２つのプラスミド間の相同的組
換えを可能にするため、アクセプタ−Ｔi プラスミド
(Ｂ)中のクロ−ニング媒体配列と少なくとも一部が相同
であるクロ−ニング媒体配列(３')をも含んでいる。
【００３８】図１０は、図８のアクセプタ−Ｔi プラス
ミドおよびそれに対応する図９の中間クロ−ニングベク
タ−から、本発明のハイブリッドＴi プラスミドベクタ
−の組み立てを示す模式図である。単一乗換えによって
図９の中間クロ−ニングベクタ−が図８のアクセプタ−
Ｔi プラスミド(Ｂ)に導入される。
ミドおよびそれに対応する図９の中間クロ−ニングベク
タ−から、本発明のハイブリッドＴi プラスミドベクタ
−の組み立てを示す模式図である。単一乗換えによって
図９の中間クロ−ニングベクタ−が図８のアクセプタ−
Ｔi プラスミド(Ｂ)に導入される。
【００３９】図１１〜図２０は本発明をより具体的に例
示するものである。図１１は、５.２kb Ｈind III フラ
グメントＡcgＢ の pＢＲ３２２への挿入を示している
(Ｚambryski ら、Ｓcience ２０９(１９８０), １３８
５−１３９１)。このフラグメント ＡcgＢはノパリンＴ
i プラスミドの左右の境界領域を含んでいる。このクロ
−ンpＡcgＢは、図６に示した「Ａ−タイプ」のアクセプ
タ−プラスミド、pＧＶ３８５０の組み立てに使用され
る。野生型Ｔi プラスミドの左右の境界領域を含んでい
るこのクロ−ンされた制限フラグメントを使って、クロ
−ン pＡcgＢと類似のクロ−ンを得ることができること
は、当業者には容易に理解されるはずである。
示するものである。図１１は、５.２kb Ｈind III フラ
グメントＡcgＢ の pＢＲ３２２への挿入を示している
(Ｚambryski ら、Ｓcience ２０９(１９８０), １３８
５−１３９１)。このフラグメント ＡcgＢはノパリンＴ
i プラスミドの左右の境界領域を含んでいる。このクロ
−ンpＡcgＢは、図６に示した「Ａ−タイプ」のアクセプ
タ−プラスミド、pＧＶ３８５０の組み立てに使用され
る。野生型Ｔi プラスミドの左右の境界領域を含んでい
るこのクロ−ンされた制限フラグメントを使って、クロ
−ン pＡcgＢと類似のクロ−ンを得ることができること
は、当業者には容易に理解されるはずである。
【００４０】図１２はノパリンＴi プラスミド pＧＶ３
８３９のＴ−領域を示している。Ｈind III 制限エンド
ヌクレア−ゼサイトは(Ｈ)で示してある。変異したＨin
d III フラグメント１９は(１９') で示してある。カナ
マイシンまたはネオマイシン耐性を付与するアセチルホ
スホトランスフェラ−ゼ遺伝子は aptで表わし、これは
黒くぬりつぶした部分に存在している。Ｔ領域の境界は
矢印で示してある。ノパリンシンタ−ゼ(synthase)遺伝
子は nosで表わした。数値は、Ｄepickerら(plasmid,３
(１９８０),１９３−２１１)の方法による制限フラグメ
ントの大きさを表わしている。Ｔiプラスミド pＧＶ３
８３９は、実施例１およびそこに挙げた２つの文献に従
って組み立てることができる。
８３９のＴ−領域を示している。Ｈind III 制限エンド
ヌクレア−ゼサイトは(Ｈ)で示してある。変異したＨin
d III フラグメント１９は(１９') で示してある。カナ
マイシンまたはネオマイシン耐性を付与するアセチルホ
スホトランスフェラ−ゼ遺伝子は aptで表わし、これは
黒くぬりつぶした部分に存在している。Ｔ領域の境界は
矢印で示してある。ノパリンシンタ−ゼ(synthase)遺伝
子は nosで表わした。数値は、Ｄepickerら(plasmid,３
(１９８０),１９３−２１１)の方法による制限フラグメ
ントの大きさを表わしている。Ｔiプラスミド pＧＶ３
８３９は、実施例１およびそこに挙げた２つの文献に従
って組み立てることができる。
【００４１】図１３は、アクセプタ−Ｔiプラスミド p
ＧＶ３８５０の組み立てを示している。プラスミドpＢ
Ｒ３２２−pＡcgＢ(図１１)は、線状化した形で描いて
ある。pＢＲ３２２の配列は斜線を入れた領域で示し、p
ＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子は ＡpR で示し
た。図１２に示したpＧＶ３８３９のＴ−領域の一部が
ここに描かれている : pＡcgＢとの相同的組換えに関与
するＨind III フラグメント(１０)および(２３)および
apt遺伝子が含まれている。二重乗換えによってpＧＶ３
８５０および失われたapt遺伝子を含むもう１つのレプ
リコンが組み立てられる。
ＧＶ３８５０の組み立てを示している。プラスミドpＢ
Ｒ３２２−pＡcgＢ(図１１)は、線状化した形で描いて
ある。pＢＲ３２２の配列は斜線を入れた領域で示し、p
ＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子は ＡpR で示し
た。図１２に示したpＧＶ３８３９のＴ−領域の一部が
ここに描かれている : pＡcgＢとの相同的組換えに関与
するＨind III フラグメント(１０)および(２３)および
apt遺伝子が含まれている。二重乗換えによってpＧＶ３
８５０および失われたapt遺伝子を含むもう１つのレプ
リコンが組み立てられる。
【００４２】図１４は、実施例２に詳細に記載した中間
クロ−ニングベクタ− pＧＶ７００の組み立てを模式的
に示したものである。制限エンドヌクレア−ゼサイトを
示すのに以下の略号を用いた: Ｂ＝ＢamＨＩ、Ｂg ＝Ｂ
gl II、Ｅ＝ＥcoＲＩ、Ｈ＝Ｈind III、Ｓ＝ＳalＩ、Ｓ
m＝ＳmaＩ。抗生物質耐性を示すのに以下の略号を用い
た: Ａp＝アンピシリン、Ｃm＝クロラムフェニコ−ル、
Ｓm ＝ストレプトマイシン、Ｔc ＝テトラサイクリン。
ＴＬ−ＤＮＡで示した図の下部の数値は、この領域のＲ
ＮＡ転写体を示している(Ｗillmitzerら、ＥＭＢＯ Ｊ．
１(１９８２),１３９−１４６)。
クロ−ニングベクタ− pＧＶ７００の組み立てを模式的
に示したものである。制限エンドヌクレア−ゼサイトを
示すのに以下の略号を用いた: Ｂ＝ＢamＨＩ、Ｂg ＝Ｂ
gl II、Ｅ＝ＥcoＲＩ、Ｈ＝Ｈind III、Ｓ＝ＳalＩ、Ｓ
m＝ＳmaＩ。抗生物質耐性を示すのに以下の略号を用い
た: Ａp＝アンピシリン、Ｃm＝クロラムフェニコ−ル、
Ｓm ＝ストレプトマイシン、Ｔc ＝テトラサイクリン。
ＴＬ−ＤＮＡで示した図の下部の数値は、この領域のＲ
ＮＡ転写体を示している(Ｗillmitzerら、ＥＭＢＯ Ｊ．
１(１９８２),１３９−１４６)。
【００４３】図１５は中間クロ−ニングベクタ− pＧＶ
７５０の構造を示している。その組み立ては実施例２に
記載した。制限エンドヌクレア−ゼサイトは、キロ塩基
対(kb)の数で表わしたその相対的位置で示した。ＰstＩ
サイトは示していないがＫmR／ＮmR領域に３つ、ＣbR遺
伝子に１つ存在する。左右の境界領域も示してある。p
ＧＶ７５０ の組み立てに使用されたＢgl II／ＢamＨＩ
サイトおよびＨpaＩ／ＳmaＩサイトが示されているが、
これは pＧＶ７５０ には存在しない。影をつけた領域
はＴＬ−ＤＮＡに、黒い領域はＫmR／ＮmR領域に、白ぬ
き部分は隣接するＴi プラスミド配列に、そして線はク
ローニング媒体 pＢＲ３２５にそれぞれ相当する。その
他の略号は以下の意味を有する：Ｏcs＝オクトピンシン
タ−ゼ、ＣmR ＝クロラムフエニコ−ル耐性、ＣbR ＝カ
ルベニシリン(アンピシリン類似体)耐性、ＫmR／ＮmR＝
カナマイシン耐性／ネオマイシン耐性。
７５０の構造を示している。その組み立ては実施例２に
記載した。制限エンドヌクレア−ゼサイトは、キロ塩基
対(kb)の数で表わしたその相対的位置で示した。ＰstＩ
サイトは示していないがＫmR／ＮmR領域に３つ、ＣbR遺
伝子に１つ存在する。左右の境界領域も示してある。p
ＧＶ７５０ の組み立てに使用されたＢgl II／ＢamＨＩ
サイトおよびＨpaＩ／ＳmaＩサイトが示されているが、
これは pＧＶ７５０ には存在しない。影をつけた領域
はＴＬ−ＤＮＡに、黒い領域はＫmR／ＮmR領域に、白ぬ
き部分は隣接するＴi プラスミド配列に、そして線はク
ローニング媒体 pＢＲ３２５にそれぞれ相当する。その
他の略号は以下の意味を有する：Ｏcs＝オクトピンシン
タ−ゼ、ＣmR ＝クロラムフエニコ−ル耐性、ＣbR ＝カ
ルベニシリン(アンピシリン類似体)耐性、ＫmR／ＮmR＝
カナマイシン耐性／ネオマイシン耐性。
【００４４】図１６は実施例３に詳細に記載した中間ベ
クタ−pＧＶ７４５の組み立てを示している。pＧＶ７４
５は、図８に示した「Ｂタイプ」アクセプタ−プラスミ
ド、pＧＶ２２６０の組み立てに使用される。制限エン
ドヌクレア−ゼサイトは以下の略号で示した：Ｂ＝Ｂam
ＨＩ、Ｈ＝Ｈind III 、Ｒ＝ＥcoＲＩ。アンピシリン耐
性遺伝子は ＡpR で示した。斜線を施した領域はオクト
ピンＴi プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の左側と相同のＤ
ＮＡを、白ぬき領域はオクトピンＴi プラスミドのＴ−
ＤＮＡ領域の右側と相同のＤＮＡを示している。出発物
質であるプラスミド pＧＶ０２１９および pＧＶ０１２
０についての物理的位置および記述は、Ｄe ＶosらのＰ
lasmid ６(１９８１),２４９−２５３にみられる。
クタ−pＧＶ７４５の組み立てを示している。pＧＶ７４
５は、図８に示した「Ｂタイプ」アクセプタ−プラスミ
ド、pＧＶ２２６０の組み立てに使用される。制限エン
ドヌクレア−ゼサイトは以下の略号で示した：Ｂ＝Ｂam
ＨＩ、Ｈ＝Ｈind III 、Ｒ＝ＥcoＲＩ。アンピシリン耐
性遺伝子は ＡpR で示した。斜線を施した領域はオクト
ピンＴi プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の左側と相同のＤ
ＮＡを、白ぬき領域はオクトピンＴi プラスミドのＴ−
ＤＮＡ領域の右側と相同のＤＮＡを示している。出発物
質であるプラスミド pＧＶ０２１９および pＧＶ０１２
０についての物理的位置および記述は、Ｄe ＶosらのＰ
lasmid ６(１９８１),２４９−２５３にみられる。
【００４５】図１７はアクセプタ−プラスミドpＧＶ２
２６０の組み立てを示している。pＧＶ２２１７ 中の欠
損置換が、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を
付与するアセチルホスホトランスフェラ−ゼ遺伝子(apt
で表わしてある)を含んでいる黒色部分で示してある。
中間ベクタ− pＧＶ７４５(図１６参照)は線状化して描
いてある。これは図１６に示した pＧＶ７４５のＨind
III サイトで開裂したものである。pＢＲ３２２の配列
は斜線を施した部分で示し、アンピシリン耐性遺伝子は
ＡpR で示してある。二重乗換えによって、pＧＶ２２６
０が組み立てられ、apt 遺伝子が失われる。制限エンド
ヌクレア−ゼサイトは以下の略号で示した: Ｂ＝ＢamＨ
Ｉ、Ｈ＝Ｈind III 、 Ｒ＝ＥcoＲＩ。
２６０の組み立てを示している。pＧＶ２２１７ 中の欠
損置換が、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を
付与するアセチルホスホトランスフェラ−ゼ遺伝子(apt
で表わしてある)を含んでいる黒色部分で示してある。
中間ベクタ− pＧＶ７４５(図１６参照)は線状化して描
いてある。これは図１６に示した pＧＶ７４５のＨind
III サイトで開裂したものである。pＢＲ３２２の配列
は斜線を施した部分で示し、アンピシリン耐性遺伝子は
ＡpR で示してある。二重乗換えによって、pＧＶ２２６
０が組み立てられ、apt 遺伝子が失われる。制限エンド
ヌクレア−ゼサイトは以下の略号で示した: Ｂ＝ＢamＨ
Ｉ、Ｈ＝Ｈind III 、 Ｒ＝ＥcoＲＩ。
【００４６】図１８は、ノパリンシンタ−ゼ遺伝子(no
s) のプロモ−タ−の下流の遺伝子を発現するためのプ
ラスミドpＬＧＶ２３８１の組み立てを示している。５'
および３'はそれぞれ転写開始と転写終了を意味し、Ａ
ＴＧおよびＴＡＡは翻訳開始および翻訳終了に使われる
コドンを表わしている。太線は nosプロモ−タ−領域、
白ぬき部分は nos暗号領域を示している。ＡpR はアン
ピシリン耐性、ＫmR はカナマイシン耐性を示してい
る。
s) のプロモ−タ−の下流の遺伝子を発現するためのプ
ラスミドpＬＧＶ２３８１の組み立てを示している。５'
および３'はそれぞれ転写開始と転写終了を意味し、Ａ
ＴＧおよびＴＡＡは翻訳開始および翻訳終了に使われる
コドンを表わしている。太線は nosプロモ−タ−領域、
白ぬき部分は nos暗号領域を示している。ＡpR はアン
ピシリン耐性、ＫmR はカナマイシン耐性を示してい
る。
【００４７】図１９は、完全なオクトピンシンタ−ゼ(o
cs)暗号配列を含んでいるプラスミド pＡＧＶ４０の組
み立て、およびプラスミド pＬＧＶ２３８１(図１８参
照)中nosプロモ−タ−の後部へのその挿入を示してい
る。太線はプロモ−タ−領域、白ぬき部分はocs暗号領
域を示している。その他の記号は図１８と同じである。
cs)暗号配列を含んでいるプラスミド pＡＧＶ４０の組
み立て、およびプラスミド pＬＧＶ２３８１(図１８参
照)中nosプロモ−タ−の後部へのその挿入を示してい
る。太線はプロモ−タ−領域、白ぬき部分はocs暗号領
域を示している。その他の記号は図１８と同じである。
【００４８】図２０は、ノパリンシンタ−ゼ(nos)遺伝
子のプロモ−タ−領域の周囲のヌクレオチド配列および
オクトピンシンタ−ゼ遺伝子暗号領域と融合した後の同
じ領域の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合点
は星印(＊)で示した。いくつかの制限エンドヌクレア−
ゼサイト、即ち、ＢamＨＩ、ＨindIII、およびＳacIIも
示してある。５'および３'は転写開始および終了を意味
する。ＡＴＧは翻訳に使われる最初のコドン、ＴＡＡは
翻訳に使われる終了コドンを表わしている。白ぬきの大
きい矢印はノパリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢
印はオクトピン遺伝子を表わしている。
子のプロモ−タ−領域の周囲のヌクレオチド配列および
オクトピンシンタ−ゼ遺伝子暗号領域と融合した後の同
じ領域の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合点
は星印(＊)で示した。いくつかの制限エンドヌクレア−
ゼサイト、即ち、ＢamＨＩ、ＨindIII、およびＳacIIも
示してある。５'および３'は転写開始および終了を意味
する。ＡＴＧは翻訳に使われる最初のコドン、ＴＡＡは
翻訳に使われる終了コドンを表わしている。白ぬきの大
きい矢印はノパリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢
印はオクトピン遺伝子を表わしている。
【００４９】
【課題を解決するための手段】以下に本発明を詳細に説
明する。図１にアクセプタ−Ｔiプラスミドを簡単に図
式化して示した。このアクセプタ−Ｔiプラスミドは、
野生型腫瘍誘起(Ｔi)プラスミドの２つの境界配列(１,
２)または領域を含んでいる。この境界配列は、Ｔiプラ
スミドのＴ−領域を植物細胞ゲノムへ組込むのに必須で
ある。換言すれば、あらゆるＤＮＡ配列(３)またはＴ−
領域を、これらの配列間に存在している植物細胞ゲノム
に組込むのにこの境界配列が絶対に必要である。
明する。図１にアクセプタ−Ｔiプラスミドを簡単に図
式化して示した。このアクセプタ−Ｔiプラスミドは、
野生型腫瘍誘起(Ｔi)プラスミドの２つの境界配列(１,
２)または領域を含んでいる。この境界配列は、Ｔiプラ
スミドのＴ−領域を植物細胞ゲノムへ組込むのに必須で
ある。換言すれば、あらゆるＤＮＡ配列(３)またはＴ−
領域を、これらの配列間に存在している植物細胞ゲノム
に組込むのにこの境界配列が絶対に必要である。
【００５０】このアクセプタ−Ｔi プラスミドのＤＮＡ
配列(３)には、図２および図３に示した中間クロ−ニン
グベクタ−のＤＮＡ配列(３') の少なくとも１部と相同
のＤＮＡセグメントが含まれている。この相同性は、中
間クロ−ニングベクタ−とアクセプタ−Ｔi プラスミド
が単一乗換え(相同性組換え)によって相互組込みするの
に必要である。相互組込み体の得られる頻度は、基本的
には相同領域の長さできまる。相同性組換えを高頻度で
起すには、通常１〜４kb の領域が使われる(Ｌeemans
ら、Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８１),１４９−
１６４)。
配列(３)には、図２および図３に示した中間クロ−ニン
グベクタ−のＤＮＡ配列(３') の少なくとも１部と相同
のＤＮＡセグメントが含まれている。この相同性は、中
間クロ−ニングベクタ−とアクセプタ−Ｔi プラスミド
が単一乗換え(相同性組換え)によって相互組込みするの
に必要である。相互組込み体の得られる頻度は、基本的
には相同領域の長さできまる。相同性組換えを高頻度で
起すには、通常１〜４kb の領域が使われる(Ｌeemans
ら、Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８１),１４９−
１６４)。
【００５１】アクセプタ−Ｔi プラスミドは更に、Ａgr
obacterium によってＴi プラスミドのＴ−領域が植物
細胞ゲノムへ移動するのに必要な配列(４)を含んでい
る。この様なアクセプタ−Ｔi プラスミドの組み立てお
よび図２および図３に示した中間クロ−ニングベクタ−
とのその相互組込みについて、図４を参照しながら以下
に詳述する。図２および図３に、発現しようとする、即
ち、植物細胞中でプロモ−タ−の支配下に転写され、翻
訳される所望の原核性または真核性遺伝子をクロ−ンす
るための中間クロ−ニングベクタ−を簡略化した図で示
した。これらの中間クロ−ニングベクタ−は、アクセプ
タ−Ｔi プラスミドのＤＮＡセグメント(３)の少なくと
も一部と相同であり、従って単−乗換えを可能にするＤ
ＮＡ配列を含んでいるクロ−ニング媒体からのＤＮＡセ
グメント(３')を含んでいる。さらに、この中間クロ−
ニングベクタ−は、その天然のあるいは外来性のプロモ
−タ−配列を含む少なくとも１つの所望の遺伝子(５,
７)を含んでいる。このプロモ−タ−配列によって、挿
入された遺伝子配列の発現が可能である。所望の挿入遺
伝子(群)の発現を調整するために、外来性のプロモ−タ
−配列(仕立て上げたプロモ−タ−)を使うことも可能で
ある。調整の各種の例として、以下のものを挙げること
ができる: (i) 組織に特異な発現、即ち、葉、根、茎、
花など、(ii)発現レベル、即ち、発現の強弱、(iii) 誘
導性発現、即ち、温度、光または添加された化学的因子
による発現など。
obacterium によってＴi プラスミドのＴ−領域が植物
細胞ゲノムへ移動するのに必要な配列(４)を含んでい
る。この様なアクセプタ−Ｔi プラスミドの組み立てお
よび図２および図３に示した中間クロ−ニングベクタ−
とのその相互組込みについて、図４を参照しながら以下
に詳述する。図２および図３に、発現しようとする、即
ち、植物細胞中でプロモ−タ−の支配下に転写され、翻
訳される所望の原核性または真核性遺伝子をクロ−ンす
るための中間クロ−ニングベクタ−を簡略化した図で示
した。これらの中間クロ−ニングベクタ−は、アクセプ
タ−Ｔi プラスミドのＤＮＡセグメント(３)の少なくと
も一部と相同であり、従って単−乗換えを可能にするＤ
ＮＡ配列を含んでいるクロ−ニング媒体からのＤＮＡセ
グメント(３')を含んでいる。さらに、この中間クロ−
ニングベクタ−は、その天然のあるいは外来性のプロモ
−タ−配列を含む少なくとも１つの所望の遺伝子(５,
７)を含んでいる。このプロモ−タ−配列によって、挿
入された遺伝子配列の発現が可能である。所望の挿入遺
伝子(群)の発現を調整するために、外来性のプロモ−タ
−配列(仕立て上げたプロモ−タ−)を使うことも可能で
ある。調整の各種の例として、以下のものを挙げること
ができる: (i) 組織に特異な発現、即ち、葉、根、茎、
花など、(ii)発現レベル、即ち、発現の強弱、(iii) 誘
導性発現、即ち、温度、光または添加された化学的因子
による発現など。
【００５２】中間クロ−ニングベクタ−用の所望の遺伝
子の例としては、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成を
コントロ−ルして植物の栄養価や成長度を改良する遺伝
情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列、外部から
病原物質に対する保護、例えば病原生物またはストレス
となる環境因子に対する耐性、を付与する生産物の合成
をコントロ−ルする遺伝情報を持ったＤＮＡフラグメン
トまたは配列、遺伝子工学によって改良しようとする植
物の基本的な過程に情報を与える生産物の合成をコント
ロ−ルする遺伝情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは
配列など。
子の例としては、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成を
コントロ−ルして植物の栄養価や成長度を改良する遺伝
情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列、外部から
病原物質に対する保護、例えば病原生物またはストレス
となる環境因子に対する耐性、を付与する生産物の合成
をコントロ−ルする遺伝情報を持ったＤＮＡフラグメン
トまたは配列、遺伝子工学によって改良しようとする植
物の基本的な過程に情報を与える生産物の合成をコント
ロ−ルする遺伝情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは
配列など。
【００５３】図２および図３は、選択可能なマ−カ−遺
伝子(６)を含んでいることもある中間クロ−ニングベク
タ−を表わしている。選択可能なマ−カ−遺伝子として
は、例えば抗生物質または有毒な類似物質(例えばアミ
ノ酸類縁体)を暗号化している遺伝子、受容宿主細胞の
欠損を補う遺伝子などが挙げられる。
伝子(６)を含んでいることもある中間クロ−ニングベク
タ−を表わしている。選択可能なマ−カ−遺伝子として
は、例えば抗生物質または有毒な類似物質(例えばアミ
ノ酸類縁体)を暗号化している遺伝子、受容宿主細胞の
欠損を補う遺伝子などが挙げられる。
【００５４】図４は、ハイブリッドＴi プラスミドベク
タ−の組み立てに関与する構成を示しており、図５は、
そのハイブリッドＴi プラスミドベクタ−を保持してい
るＡgrobacteriumの分離に関与する実際の接合工程を表
わしている。この工程は、中間クロ−ニングベクタ−が
Ｅ.coli中で組み立てられるので、この中間クロ−ニン
グベクタ−をＡgrobacterium 中のアクセプタ−プラス
ミドに転移させるのに必要である。
タ−の組み立てに関与する構成を示しており、図５は、
そのハイブリッドＴi プラスミドベクタ−を保持してい
るＡgrobacteriumの分離に関与する実際の接合工程を表
わしている。この工程は、中間クロ−ニングベクタ−が
Ｅ.coli中で組み立てられるので、この中間クロ−ニン
グベクタ−をＡgrobacterium 中のアクセプタ−プラス
ミドに転移させるのに必要である。
【００５５】Ｔ−領域の一部が変更された配列で置換さ
れている改良Ｔi プラスミドを調製するのに用いられる
既知の転移手法は多数の工程からなっている。通常、大
抵のＤＮＡ組換え操作は、特別に設計されたクロ−ニン
グ媒体、例えば pＢＲ３２２(Ｂoliver, Ｇene ２(１９
７７), ７５−９３）中で行なわれる。しかしこのクロ
−ニング媒体は、それ自体Ａgrobacteriumに移動するこ
とができない。この問題は、既知の方法では次の様にし
て解決されている: a) Ａgrobacterium中でも複製し得る別の広範囲宿主用
クロ−ニング媒体、例えば mini‐Ｓa プラスミド (Ｌe
emans ら、Ｇene １９(１９８２),３６１−３６４)でp
ＢＲクロ−ニング媒体配列を置換する。この操作はＥ.c
oli 中で行ない、中間クロ−ニングベクタ−が得られ
る。 b) 所望のＤＮＡを含有している中間クロ−ニングベク
タ−を保持したＥ.coli 株と、Ａgrobacterium 中では
複製できないがそれ自体および他のＤＮＡのＡgrobacte
riumへの転移を仲介することのできるヘルパ−プラスミ
ドを保持した別のＥ.coli株との接合。 c) 工程(b)で得られるＥ.coliとＴi プラスミドを含ん
でいるＡgrobacteriumの接合。ヘルパ−プラスミドは失
われる。 d) 中間クロ−ニングベクタ−は、独立したレプリコン
としてＡgrobacterium中で複製し、存在することができ
るので、工程(c) で得られた接合体は、中間クロ−ニン
グベクタ−とＴi プラスミドとの相互組込み体を含んで
いる細胞、または中間クロ−ニングベクタ−および相互
組込みが起らなかったＴi プラスミドを含んでいる別の
細胞の混合物である。相互組込み体だけを特異的に分離
する為に、Ｔi プラスミドのない別のＡgrobacterium
株との接合をもう一度行なわなければならない。この転
移は、Ｔi プラスミド自体によって暗号化されている機
能によって仲介される。この第２のＡgrobacterium株へ
の中間クロ−ニングベクタ−の転移は、Ｔi プラスミド
との相互組込み体の形でのみ行なわれる。 e) 所望の置換を行なった最終的な改良Ｔi プラスミド
を得るために、第２回目の乗換えが行なわれる (Ｌeema
nsら、Ｊ. Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８１), １４
９−１６４)。
れている改良Ｔi プラスミドを調製するのに用いられる
既知の転移手法は多数の工程からなっている。通常、大
抵のＤＮＡ組換え操作は、特別に設計されたクロ−ニン
グ媒体、例えば pＢＲ３２２(Ｂoliver, Ｇene ２(１９
７７), ７５−９３）中で行なわれる。しかしこのクロ
−ニング媒体は、それ自体Ａgrobacteriumに移動するこ
とができない。この問題は、既知の方法では次の様にし
て解決されている: a) Ａgrobacterium中でも複製し得る別の広範囲宿主用
クロ−ニング媒体、例えば mini‐Ｓa プラスミド (Ｌe
emans ら、Ｇene １９(１９８２),３６１−３６４)でp
ＢＲクロ−ニング媒体配列を置換する。この操作はＥ.c
oli 中で行ない、中間クロ−ニングベクタ−が得られ
る。 b) 所望のＤＮＡを含有している中間クロ−ニングベク
タ−を保持したＥ.coli 株と、Ａgrobacterium 中では
複製できないがそれ自体および他のＤＮＡのＡgrobacte
riumへの転移を仲介することのできるヘルパ−プラスミ
ドを保持した別のＥ.coli株との接合。 c) 工程(b)で得られるＥ.coliとＴi プラスミドを含ん
でいるＡgrobacteriumの接合。ヘルパ−プラスミドは失
われる。 d) 中間クロ−ニングベクタ−は、独立したレプリコン
としてＡgrobacterium中で複製し、存在することができ
るので、工程(c) で得られた接合体は、中間クロ−ニン
グベクタ−とＴi プラスミドとの相互組込み体を含んで
いる細胞、または中間クロ−ニングベクタ−および相互
組込みが起らなかったＴi プラスミドを含んでいる別の
細胞の混合物である。相互組込み体だけを特異的に分離
する為に、Ｔi プラスミドのない別のＡgrobacterium
株との接合をもう一度行なわなければならない。この転
移は、Ｔi プラスミド自体によって暗号化されている機
能によって仲介される。この第２のＡgrobacterium株へ
の中間クロ−ニングベクタ−の転移は、Ｔi プラスミド
との相互組込み体の形でのみ行なわれる。 e) 所望の置換を行なった最終的な改良Ｔi プラスミド
を得るために、第２回目の乗換えが行なわれる (Ｌeema
nsら、Ｊ. Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８１), １４
９−１６４)。
【００５６】僅かにもう１つの既知の方法は、上記工程
(d)において、中間クロ−ニングベクタ−と適合しない
別のプラスミドをＡgrobacteriumに導入することを除け
ば、上の方法と基本的に同じである。この場合、独立し
たレプリコンのままでいる中間クロ−ニングベクタ−は
全て失われるので、相互組込み(単一乗換え)を選択する
ことができる(Ｍatzke ら、Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．
１ ( １９８１ ), ３９−４９ )。
(d)において、中間クロ−ニングベクタ−と適合しない
別のプラスミドをＡgrobacteriumに導入することを除け
ば、上の方法と基本的に同じである。この場合、独立し
たレプリコンのままでいる中間クロ−ニングベクタ−は
全て失われるので、相互組込み(単一乗換え)を選択する
ことができる(Ｍatzke ら、Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．
１ ( １９８１ ), ３９−４９ )。
【００５７】ここに本発明者らは、Ａgrobacteriumのア
クセプタ−Ｔi プラスミドに中間クロ−ニングベクタ−
を導入する為の、新規な非常に簡素化された方法を提供
するものである。簡単に言えば、この方法は、多くの通
常使用されているクロ−ニングプラスミド(例えば pＢ
Ｒ３２２)を直接 Ａgrobac‐terium に転移させるの
に、Ｅ．coli のヘルパ−プラスミドが役立つというこ
とを見い出した事実に基づいている。これらのプラスミ
ドは、いづれもＡgrobacterium 中では複製できないの
で、アクセプタ−Ｔi プラスミドと相互組込みし得るも
のだけが保持されることになる。さらに、本発明者ら
は、Ａgrobacterium中のこの相互組込み体を、植物細胞
への感染の為の直接のベクタ−組成物として使用するの
である。この様にして、本発明者らは前記の工程(d)お
よび(e)を省略した。これによって、改良ハイブリッド
Ｔi プラスミドを組み立てるのに要する時間が減少し、
可能な組み立てに柔軟性が増加し、かくして、植物細胞
ゲノムへＤＮＡを転移させる為のベクタ−としてこのア
クセプタ−Ｔi プラスミドを使用できる可能性が著しく
高まったのである。
クセプタ−Ｔi プラスミドに中間クロ−ニングベクタ−
を導入する為の、新規な非常に簡素化された方法を提供
するものである。簡単に言えば、この方法は、多くの通
常使用されているクロ−ニングプラスミド(例えば pＢ
Ｒ３２２)を直接 Ａgrobac‐terium に転移させるの
に、Ｅ．coli のヘルパ−プラスミドが役立つというこ
とを見い出した事実に基づいている。これらのプラスミ
ドは、いづれもＡgrobacterium 中では複製できないの
で、アクセプタ−Ｔi プラスミドと相互組込みし得るも
のだけが保持されることになる。さらに、本発明者ら
は、Ａgrobacterium中のこの相互組込み体を、植物細胞
への感染の為の直接のベクタ−組成物として使用するの
である。この様にして、本発明者らは前記の工程(d)お
よび(e)を省略した。これによって、改良ハイブリッド
Ｔi プラスミドを組み立てるのに要する時間が減少し、
可能な組み立てに柔軟性が増加し、かくして、植物細胞
ゲノムへＤＮＡを転移させる為のベクタ−としてこのア
クセプタ−Ｔi プラスミドを使用できる可能性が著しく
高まったのである。
【００５８】即ち、図５に概略を示した様に、アクセプ
タ−Ｔi プラスミドへの中間クロ−ニングベクタ−の導
入は２工程で行なわれる。先づ、中間クロ−ニングベク
タ−を持ったＥ．coli 株(1)を、この中間クロ−ニング
ベクタ−のＡgrobacteriumへの授動を促す２つのプラス
ミドを持った別の Ｅ． coli株(２)と接合させる。これ
らのヘルパ−プラスミドの代表的な、そして好ましい例
は、mob 機能を含んだＲ６４drd １１および tra機能を
含んだ pＧＪ２８である(Ｆinneganら、Ｍol．Ｇen．Ｇ
enet．１８５(１９８２),３４４−３５１)。中間クロ−
ニングベクタ−のクロ−ニング媒体上のbomサイト(Ｗar
renら、Ｎature２７４(１９７８),２５９−２６１) が
他の２つのプラスミドによって暗号化されている機能体
によって認識され、転移できる様になる。全てのプラス
ミドは、その存在を検出するために抗生物質耐性マ−カ
−を含んでいるのが好ましい。次いで、得られたＥ．co
li株、即ち３つのプラスミド全てを保持している授動株
(３)を、中間クロ−ニングベクタ−と相同の領域を持っ
たアクセプタ−Ｔi プラスミドを保持しているＡgrobac
teriumと接合させる。中間クロ−ニングベクタ−とアク
セプタ−Ｔi プラスミドとの単一乗換えが行なわれたか
どうかは、中間クロ−ニングベクタ−の抗生物質耐性マ
−カ−についての選択によって検出できる。
タ−Ｔi プラスミドへの中間クロ−ニングベクタ−の導
入は２工程で行なわれる。先づ、中間クロ−ニングベク
タ−を持ったＥ．coli 株(1)を、この中間クロ−ニング
ベクタ−のＡgrobacteriumへの授動を促す２つのプラス
ミドを持った別の Ｅ． coli株(２)と接合させる。これ
らのヘルパ−プラスミドの代表的な、そして好ましい例
は、mob 機能を含んだＲ６４drd １１および tra機能を
含んだ pＧＪ２８である(Ｆinneganら、Ｍol．Ｇen．Ｇ
enet．１８５(１９８２),３４４−３５１)。中間クロ−
ニングベクタ−のクロ−ニング媒体上のbomサイト(Ｗar
renら、Ｎature２７４(１９７８),２５９−２６１) が
他の２つのプラスミドによって暗号化されている機能体
によって認識され、転移できる様になる。全てのプラス
ミドは、その存在を検出するために抗生物質耐性マ−カ
−を含んでいるのが好ましい。次いで、得られたＥ．co
li株、即ち３つのプラスミド全てを保持している授動株
(３)を、中間クロ−ニングベクタ−と相同の領域を持っ
たアクセプタ−Ｔi プラスミドを保持しているＡgrobac
teriumと接合させる。中間クロ−ニングベクタ−とアク
セプタ−Ｔi プラスミドとの単一乗換えが行なわれたか
どうかは、中間クロ−ニングベクタ−の抗生物質耐性マ
−カ−についての選択によって検出できる。
【００５９】図６は、図１のアクセプタ−Ｔiプラスミ
ドの組み立てに用いられたＤＮＡ分子を模式的に示した
ものである。本明細書では、このプラスミドをアクセプ
タ−Ｔiプラスミド(タイプＡ)と呼び、他のアクセプタ
−Ｔiプラスミド(タイプＢ)と区別することにする(図８
参照)。この組み立てには、Ｔiプラスミドと、クロ−ニ
ング媒体(３)中に境界配列(１)および(２)を持っている
もう１つのプラスミドとの間に二重乗換えが起ることが
必要である。図に示した様に、クロ−ニング媒体配列
(３)は左側の境界配列(１)と右側の境界配列(２)との間
にある。このＤＮＡ鎖の正しい極性を示すために、これ
を環上に描くことができる。しかし、二重乗換えに使用
される相同領域を示すためには、この環を開裂させて図
示した。これは理解を助ける為のやり方として重要であ
り、図８に於けるアクセプタ−Ｔiプラスミド(Ｂ)の組
み立てに於いても用いられている。即ち、もし境界配列
(１)および(２)が、単にクロ−ニング媒体配列(３)内に
挿入されたのなら、二重乗換えによって、Ｔ−領域が削
除されてはいるがこの境界配列(１)および(２)の間のク
ロ−ニング媒体配列のないＴi プラスミドが得られるこ
とになる。図６に示した様に、二重乗換えによって、境
界配列(１)および(２)の間にもとのＴ−領域を持った環
状ＤＮＡ分子が生成する。これはレプリコンではないの
で消失する運命にある。この二重乗換えが起ったかどう
かは、例えばＴi プラスミドのＴ−領域内に含まれる抗
生物質マ−カ−の欠落について選択したり、クロ−ニン
グ媒体配列(３)内の抗生物質耐性マ−カ−について選択
したりして、遺伝子学的に選択することができる。
ドの組み立てに用いられたＤＮＡ分子を模式的に示した
ものである。本明細書では、このプラスミドをアクセプ
タ−Ｔiプラスミド(タイプＡ)と呼び、他のアクセプタ
−Ｔiプラスミド(タイプＢ)と区別することにする(図８
参照)。この組み立てには、Ｔiプラスミドと、クロ−ニ
ング媒体(３)中に境界配列(１)および(２)を持っている
もう１つのプラスミドとの間に二重乗換えが起ることが
必要である。図に示した様に、クロ−ニング媒体配列
(３)は左側の境界配列(１)と右側の境界配列(２)との間
にある。このＤＮＡ鎖の正しい極性を示すために、これ
を環上に描くことができる。しかし、二重乗換えに使用
される相同領域を示すためには、この環を開裂させて図
示した。これは理解を助ける為のやり方として重要であ
り、図８に於けるアクセプタ−Ｔiプラスミド(Ｂ)の組
み立てに於いても用いられている。即ち、もし境界配列
(１)および(２)が、単にクロ−ニング媒体配列(３)内に
挿入されたのなら、二重乗換えによって、Ｔ−領域が削
除されてはいるがこの境界配列(１)および(２)の間のク
ロ−ニング媒体配列のないＴi プラスミドが得られるこ
とになる。図６に示した様に、二重乗換えによって、境
界配列(１)および(２)の間にもとのＴ−領域を持った環
状ＤＮＡ分子が生成する。これはレプリコンではないの
で消失する運命にある。この二重乗換えが起ったかどう
かは、例えばＴi プラスミドのＴ−領域内に含まれる抗
生物質マ−カ−の欠落について選択したり、クロ−ニン
グ媒体配列(３)内の抗生物質耐性マ−カ−について選択
したりして、遺伝子学的に選択することができる。
【００６０】図７は、図２および図３の中間クロ−ニン
グベクタ−の組み立てを示す模式図である。制限エンド
ヌクレア−ゼサイトＲ1またはＲ2でそれぞれ囲まれた所
望の遺伝子(５)および選択可能なマ−カ−遺伝子(６)
が、酵素Ｒ1およびＲ2の為の特異な制限サイトを含んで
いるクロ−ニング媒体配列(３') に、これら全ての分子
の消化およびライゲ−ションによって挿入される。得ら
れた組換えＤＮＡ分子は、Ｅ.coli 宿主細胞を形質転換
するのに使用され、その形質転換体は、クロ−ニング媒
体配列(３')の抗生物質耐性マ−カ−(ＡbR1)で選択され
る。
グベクタ−の組み立てを示す模式図である。制限エンド
ヌクレア−ゼサイトＲ1またはＲ2でそれぞれ囲まれた所
望の遺伝子(５)および選択可能なマ−カ−遺伝子(６)
が、酵素Ｒ1およびＲ2の為の特異な制限サイトを含んで
いるクロ−ニング媒体配列(３') に、これら全ての分子
の消化およびライゲ−ションによって挿入される。得ら
れた組換えＤＮＡ分子は、Ｅ.coli 宿主細胞を形質転換
するのに使用され、その形質転換体は、クロ−ニング媒
体配列(３')の抗生物質耐性マ−カ−(ＡbR1)で選択され
る。
【００６１】図８は本発明のもう１つの態様、即ちアク
セプタ−Ｔi プラスミド(Ｂ)を組み立てるのに使用され
るＤＮＡ分子の模式図である。この場合は、境界配列
(１)および(２)のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列(９)お
よび(１０)の間にクロ−ニング媒体配列(３)を含んでい
るプラスミドとＴiプラスミドとの間で二重乗換えが起
る。乗換えに使用される相同領域を示す為に、小さい方
のプラスミドは開裂してある(図６と同様)。二重乗換え
による生成物は、アクセプタ−Ｔiプラスミド(Ｂ)と、
もとのＴiプラスミドからのＴ-領域およびＤＮＡ配列
(２)、(１０)、(９)および(１)を含んでいる、消失する
もう１つの環状ＤＮＡ分子である。遺伝子学的選択は図
６について記載したものと同様にして行なうことができ
る。
セプタ−Ｔi プラスミド(Ｂ)を組み立てるのに使用され
るＤＮＡ分子の模式図である。この場合は、境界配列
(１)および(２)のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列(９)お
よび(１０)の間にクロ−ニング媒体配列(３)を含んでい
るプラスミドとＴiプラスミドとの間で二重乗換えが起
る。乗換えに使用される相同領域を示す為に、小さい方
のプラスミドは開裂してある(図６と同様)。二重乗換え
による生成物は、アクセプタ−Ｔiプラスミド(Ｂ)と、
もとのＴiプラスミドからのＴ-領域およびＤＮＡ配列
(２)、(１０)、(９)および(１)を含んでいる、消失する
もう１つの環状ＤＮＡ分子である。遺伝子学的選択は図
６について記載したものと同様にして行なうことができ
る。
【００６２】図９は、図８のアクセプタ−Ｔi プラスミ
ドＢと組み合せて使用される中間クロ−ニングベクタ−
の模式図である。ここでは、所望の遺伝子(５)は、クロ
−ニング媒体配列(３') 中に含まれている境界配列(１)
および(２)の間に挿入される。
ドＢと組み合せて使用される中間クロ−ニングベクタ−
の模式図である。ここでは、所望の遺伝子(５)は、クロ
−ニング媒体配列(３') 中に含まれている境界配列(１)
および(２)の間に挿入される。
【００６３】図１０は、単一乗換えにより図９の中間ク
ロ−ニングベクタ−がどの様にしてアクセプタ−Ｔiプ
ラスミド(Ｂ)に挿入されるかを模式的に示している。こ
の場合、中間クロ−ニングベクタ−のクロ−ニング媒体
配列(３')の抗生物質耐性マ−カ−で選択すると、２つ
のプラスミドの間の相互組込みの結果としてのハイブリ
ッドＴiプラスミドを確実に見つけることができる。こ
うして境界配列(１)および(２)内に含まれている所望の
遺伝子を持ったハイブリッドＴiプラスミドが得られ
る。この様にして組み立てられたハイブリッドプラスミ
ドは、そのＴ−領域に、例えば図４のハイブリッドＴi
プラスミド中の配列(３)および(３')の様な直接反復の
配列を含有しておらず、従って、分子内組換えの結果と
して、ハイブリッドベクタ−または植物細胞ゲノム中に
導入されたＤＮＡが不安定になる可能性が避けられる。
ロ−ニングベクタ−がどの様にしてアクセプタ−Ｔiプ
ラスミド(Ｂ)に挿入されるかを模式的に示している。こ
の場合、中間クロ−ニングベクタ−のクロ−ニング媒体
配列(３')の抗生物質耐性マ−カ−で選択すると、２つ
のプラスミドの間の相互組込みの結果としてのハイブリ
ッドＴiプラスミドを確実に見つけることができる。こ
うして境界配列(１)および(２)内に含まれている所望の
遺伝子を持ったハイブリッドＴiプラスミドが得られ
る。この様にして組み立てられたハイブリッドプラスミ
ドは、そのＴ−領域に、例えば図４のハイブリッドＴi
プラスミド中の配列(３)および(３')の様な直接反復の
配列を含有しておらず、従って、分子内組換えの結果と
して、ハイブリッドベクタ−または植物細胞ゲノム中に
導入されたＤＮＡが不安定になる可能性が避けられる。
【００６４】本発明者らの研究室で行なった実験結果か
ら、図９の中間ベクタ−の組み立てには、境界配列１お
よび２の両者を所有する必要はないことがわかった(未
発表)。しかし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込
むには、少なくとも右側の境界配列(２)(図１および図
９参照)を有することが必要十分条件である。
ら、図９の中間ベクタ−の組み立てには、境界配列１お
よび２の両者を所有する必要はないことがわかった(未
発表)。しかし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込
むには、少なくとも右側の境界配列(２)(図１および図
９参照)を有することが必要十分条件である。
【００６５】ＡgrobacteriumのＴiプラスミド、例えば
ノパリンまたはオクトピンＴiプラスミドの制限エンド
ヌクレア−ゼ地図についての知見(Ｄepickerら、Ｐlasm
id ３(１９８０),１９３−２１1;Ｄe Ｖosら,Ｐlasmid
６(１９８１),２４９−２５３)およびＴ−ＤＮＡ境界配
列を含んでいる制限フラグメントについての知見 (Ｚam
bryskiら、Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８２),３
６１−３７０; Ｄe Ｂeuckeleerら、Ｍol．Ｇen．Ｇene
t. １８３(１９８１),２８３−２８８)から、当業者で
あれば誰れでも、本発明方法に従ってアクセプタ−Ｔi
プラスミドを組み立てることができる。この他、通常の
組換えＤＮＡ技術および基礎的な細菌の遺伝子操作を実
施できる能力が要求されるに過ぎない。本発明は、ハイ
ブリッドＴi プラスミドベクタ−を組み立てるのに有効
であることがわかった本明細書に記載したアクセプタ−
Ｔi プラスミドを具体的に提案している点でユニ−クな
ものである。更に、これらのアクセプタ−Ｔi プラスミ
ドは、遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入するための方法の
一部を構成する様に設計されたものである。
ノパリンまたはオクトピンＴiプラスミドの制限エンド
ヌクレア−ゼ地図についての知見(Ｄepickerら、Ｐlasm
id ３(１９８０),１９３−２１1;Ｄe Ｖosら,Ｐlasmid
６(１９８１),２４９−２５３)およびＴ−ＤＮＡ境界配
列を含んでいる制限フラグメントについての知見 (Ｚam
bryskiら、Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８２),３
６１−３７０; Ｄe Ｂeuckeleerら、Ｍol．Ｇen．Ｇene
t. １８３(１９８１),２８３−２８８)から、当業者で
あれば誰れでも、本発明方法に従ってアクセプタ−Ｔi
プラスミドを組み立てることができる。この他、通常の
組換えＤＮＡ技術および基礎的な細菌の遺伝子操作を実
施できる能力が要求されるに過ぎない。本発明は、ハイ
ブリッドＴi プラスミドベクタ−を組み立てるのに有効
であることがわかった本明細書に記載したアクセプタ−
Ｔi プラスミドを具体的に提案している点でユニ−クな
ものである。更に、これらのアクセプタ−Ｔi プラスミ
ドは、遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入するための方法の
一部を構成する様に設計されたものである。
【００６６】
【実施例】既述したアクセプタ−Ｔi プラスミド、中間
クロ−ニングベクタ−、ハイブリッドＴi プラスミドベ
クタ−およびベクタ−組成物を更に例示し、植物細胞ゲ
ノムへ組込まれた外来性遺伝子の発現を示す形質転換植
物細胞および植物を提供するのにこのベクタ−組成物が
有効であることを例証するために、以下に実施例を挙げ
る。
クロ−ニングベクタ−、ハイブリッドＴi プラスミドベ
クタ−およびベクタ−組成物を更に例示し、植物細胞ゲ
ノムへ組込まれた外来性遺伝子の発現を示す形質転換植
物細胞および植物を提供するのにこのベクタ−組成物が
有効であることを例証するために、以下に実施例を挙げ
る。
【００６７】実施例１ アクセプタ−ＴiプラスミドpＧ
Ｖ３８５０(Ａタイプ)の組み立て 出発株およびプラスミド：Ａgrobacterium tumefaciens
(野性型Ａgrobacterium 由来のリファンピシン耐性株
Ｃ５８Ｃ１ およびクロラムフェニコ−ル−エリスロマ
イシン耐性株Ｃ５８Ｃ１) Ｔi プラスミド＝ pＧＶ３８３９ 図１１のプラスミド＝ pＡcgＢ Ｔi プラスミド pＧＶ３８３９はノパリンプラスミド p
Ｔi Ｃ５８trac (pＧＶ３１００ ; Ｈolstersら, Ｐlas
mid ３(１９８０), ２１２−２３０) から組み立てる。
これはＴ−領域の中央近くに欠失置換突然変異体(ミュ
−タント)を含んでいる: 即ち、Ｈind III フラグメン
ト１９の内部の SmaＩフラグメント２４(Ｄepickerら、
Ｐlasmid ３ (１９８０), １９３−２１１)は、Ｔn５
の apt(アセチルホスホトランスフェラ−ゼ) 遺伝子を
含んでいる pＫＣ７のＨindII フラグメント (Ｒao ら,
Ｇene ７(１９７９, ７９−８２)で置換されている。
この遺伝子はアミノグリコシドネオマイシンおよびカナ
マイシンに対する耐性を暗号化している。pＧＶ３８３
９のＴ−領域の制限地図を図１２に示す。
Ｖ３８５０(Ａタイプ)の組み立て 出発株およびプラスミド：Ａgrobacterium tumefaciens
(野性型Ａgrobacterium 由来のリファンピシン耐性株
Ｃ５８Ｃ１ およびクロラムフェニコ−ル−エリスロマ
イシン耐性株Ｃ５８Ｃ１) Ｔi プラスミド＝ pＧＶ３８３９ 図１１のプラスミド＝ pＡcgＢ Ｔi プラスミド pＧＶ３８３９はノパリンプラスミド p
Ｔi Ｃ５８trac (pＧＶ３１００ ; Ｈolstersら, Ｐlas
mid ３(１９８０), ２１２−２３０) から組み立てる。
これはＴ−領域の中央近くに欠失置換突然変異体(ミュ
−タント)を含んでいる: 即ち、Ｈind III フラグメン
ト１９の内部の SmaＩフラグメント２４(Ｄepickerら、
Ｐlasmid ３ (１９８０), １９３−２１１)は、Ｔn５
の apt(アセチルホスホトランスフェラ−ゼ) 遺伝子を
含んでいる pＫＣ７のＨindII フラグメント (Ｒao ら,
Ｇene ７(１９７９, ７９−８２)で置換されている。
この遺伝子はアミノグリコシドネオマイシンおよびカナ
マイシンに対する耐性を暗号化している。pＧＶ３８３
９のＴ−領域の制限地図を図１２に示す。
【００６８】プラスミド pＡcgＢは、Ｔ−ＤＮＡの境界
部だけを含んでいる pＢＲ３２２中のＡcgＢの挿入体で
ある(図１１参照)。この境界部はＴ−ＤＮＡの末端部と
して定義され、これらの領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞
ゲノムへの安定な組込みに役割を果たす。このクロ−ン
の起源および分析については詳しく記載されている(Ｚa
mbryski ら、Ｓcience ２０９ (１９８０), １３８５−
１３９１)。このクロ−ンは、形質転換されたタバコＤ
ＮＡからＴ−ＤＮＡの部分を再分離することにより得ら
れた。 pＡcgＢは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界を含む様に
縦列に並んだ２つのＴ−ＤＮＡコピ−の接合点を含んで
いる。更に、 pＡcgＢは、その遺伝情報が右側Ｔ−ＤＮ
Ａ境界のすぐ近くに位置しているという理由でノパリン
シンタ−ゼ遺伝子を含んでいる。このプラスミド pＡcg
Ｂは、「タイプＡ」アクセプタ−Ｔi プラスミド、 pＧＶ
３８５０の組み立てに使用される。図６は関与する構造
の概略を、図１３は pＧＶ３８５０を与える二重乗換え
に関与するＤＮＡ領域をより正確に示したものである。
部だけを含んでいる pＢＲ３２２中のＡcgＢの挿入体で
ある(図１１参照)。この境界部はＴ−ＤＮＡの末端部と
して定義され、これらの領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞
ゲノムへの安定な組込みに役割を果たす。このクロ−ン
の起源および分析については詳しく記載されている(Ｚa
mbryski ら、Ｓcience ２０９ (１９８０), １３８５−
１３９１)。このクロ−ンは、形質転換されたタバコＤ
ＮＡからＴ−ＤＮＡの部分を再分離することにより得ら
れた。 pＡcgＢは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界を含む様に
縦列に並んだ２つのＴ−ＤＮＡコピ−の接合点を含んで
いる。更に、 pＡcgＢは、その遺伝情報が右側Ｔ−ＤＮ
Ａ境界のすぐ近くに位置しているという理由でノパリン
シンタ−ゼ遺伝子を含んでいる。このプラスミド pＡcg
Ｂは、「タイプＡ」アクセプタ−Ｔi プラスミド、 pＧＶ
３８５０の組み立てに使用される。図６は関与する構造
の概略を、図１３は pＧＶ３８５０を与える二重乗換え
に関与するＤＮＡ領域をより正確に示したものである。
【００６９】上記のプラスミドpＡcgＢは、そのpＢＲ３
２２部分にＣolＥ１−特異 bomサイトを持っており、ヘ
ルパ−プラスミドＲ６４drd１１およびpＧＪ２８を使っ
てＥ.coli からＡgrobacteriumへ授動することができ
る。Ｅ.coli に含まれているプラスミドＲ６４drd １１
および pＧＪ２８は、接合により、pＡcgＢを持ったＥ.
coli 株に導入される。トランス接合体は、アンピシリ
ン耐性(pＡcgＢのpＢＲ３２２配列から)、ストレプトマ
イシン耐性(Ｒ６４drd １１から)、およびカナマイシン
耐性( pＧＪ２８から)コロニ−として選択される。
２２部分にＣolＥ１−特異 bomサイトを持っており、ヘ
ルパ−プラスミドＲ６４drd１１およびpＧＪ２８を使っ
てＥ.coli からＡgrobacteriumへ授動することができ
る。Ｅ.coli に含まれているプラスミドＲ６４drd １１
および pＧＪ２８は、接合により、pＡcgＢを持ったＥ.
coli 株に導入される。トランス接合体は、アンピシリ
ン耐性(pＡcgＢのpＢＲ３２２配列から)、ストレプトマ
イシン耐性(Ｒ６４drd １１から)、およびカナマイシン
耐性( pＧＪ２８から)コロニ−として選択される。
【００７０】３つのプラスミドの全てを保持している
Ｅ．coli株を、リファンピシン耐性でありＴi プラスミ
ド pＧＶ３８３９を含んでいるＡgrobacterium株 Ｃ５
８Ｃ１に接合させる。ノパリンＴi プラスミドとの最初
の単一乗換えを選択するのにpＢＲ３２２のアンピシリ
ン耐性を利用する。アンピシリン耐性をＡgrobacterium
中で安定させることができる唯一の方法は、Ｔ−領域境
界近くの相同領域の１つで pＧＶ３８３９と相同組換え
により乗換えをすることである。他の相同領域での２回
目の乗換えにより、apt 遺伝子(カナマイシン耐性)を含
んでいる pＧＶ３８３９のＴ−領域の中央部がクロ−ン
pＡcgＢの pＢＲ３２２配列で置換される。従って、第
２の組換え体はアンピシリン耐性、カナマイシン感受性
である。第２の組換え体を分離する確率を高めるため
に、最初の組換え体(pＡcgＢ::pＧＶ３８３９)を保持し
ているリファンピシン耐性Ａgrobacteriumを、Ｔi プラ
スミドを持っていない第２のクロラムフェニコ−ル／エ
リスロマイシン耐性Ａgrobacterium株と接合させる。こ
の様にして、約６００コロニ−中、１コロニ−の割合
で、アンピシリン耐性、カナマイシン感受性のクロラム
フェニコ−ル／エリスロマイシン耐性Ａgrobacterium p
ＧＶ３８５０を得ることができる。
Ｅ．coli株を、リファンピシン耐性でありＴi プラスミ
ド pＧＶ３８３９を含んでいるＡgrobacterium株 Ｃ５
８Ｃ１に接合させる。ノパリンＴi プラスミドとの最初
の単一乗換えを選択するのにpＢＲ３２２のアンピシリ
ン耐性を利用する。アンピシリン耐性をＡgrobacterium
中で安定させることができる唯一の方法は、Ｔ−領域境
界近くの相同領域の１つで pＧＶ３８３９と相同組換え
により乗換えをすることである。他の相同領域での２回
目の乗換えにより、apt 遺伝子(カナマイシン耐性)を含
んでいる pＧＶ３８３９のＴ−領域の中央部がクロ−ン
pＡcgＢの pＢＲ３２２配列で置換される。従って、第
２の組換え体はアンピシリン耐性、カナマイシン感受性
である。第２の組換え体を分離する確率を高めるため
に、最初の組換え体(pＡcgＢ::pＧＶ３８３９)を保持し
ているリファンピシン耐性Ａgrobacteriumを、Ｔi プラ
スミドを持っていない第２のクロラムフェニコ−ル／エ
リスロマイシン耐性Ａgrobacterium株と接合させる。こ
の様にして、約６００コロニ−中、１コロニ−の割合
で、アンピシリン耐性、カナマイシン感受性のクロラム
フェニコ−ル／エリスロマイシン耐性Ａgrobacterium p
ＧＶ３８５０を得ることができる。
【００７１】勿論、pＧＶ３８５０タイプのアクセプタ
−Ｔiプラスミドを組み立てるのに使用することができ
るその他のＴiプラスミドもある。Ｔ−領域の中央近く
に選択し得るマ−カ−遺伝子を持ったＴi プラスミドは
全て受容体として使用できる。更に、左境界フラグメン
ト− pＢＲ３２２−右境界フラグメントの方向に、左右
の境界フラグメントの中間に pＢＲ配列が位置する様
に、 pＢＲ３２２にＴ−領域境界フラグメントを挿入す
ることによって pＡcgＢ様のプラスミドを組み立てるこ
とができる。例えば、ノパリンＴi プラスミドの左およ
び右境界フラグメントはそれぞれＨind III フラグメン
ト１０および２３である ( Ｄepicker ら、Ｐlasmid ３
(１９８０), １９３−２１１)。
−Ｔiプラスミドを組み立てるのに使用することができ
るその他のＴiプラスミドもある。Ｔ−領域の中央近く
に選択し得るマ−カ−遺伝子を持ったＴi プラスミドは
全て受容体として使用できる。更に、左境界フラグメン
ト− pＢＲ３２２−右境界フラグメントの方向に、左右
の境界フラグメントの中間に pＢＲ配列が位置する様
に、 pＢＲ３２２にＴ−領域境界フラグメントを挿入す
ることによって pＡcgＢ様のプラスミドを組み立てるこ
とができる。例えば、ノパリンＴi プラスミドの左およ
び右境界フラグメントはそれぞれＨind III フラグメン
ト１０および２３である ( Ｄepicker ら、Ｐlasmid ３
(１９８０), １９３−２１１)。
【００７２】単一乗換えによって、 pＢＲ３２２または
その誘導体に挿入されている所望の遺伝子を含んだ中間
クロ−ニングベクタ−が pＧＶ３８５０の改良されたＴ
−ＤＮＡ領域に導入される。唯一つ必要なことは、中間
クロ−ニングベクタ−のＥ.coliからＡgrobacteriumへ
の転移を選択する為の手段として使用する為に、導入さ
れるＤＮＡが、既にpＢＲ３２２に存在するものの他に
もう１つの耐性マ−カ−遺伝子を含んでいるということ
である。この耐性マ−カ−は、 pＢＲ配列内に含まれて
いてもよく(例えば pＢＲ３２５のＣmR、または pＫＣ
７のＫmR)、植物細胞内で試験されるＤＮＡ内に含まれ
ていてもよい。更に、アクセプターＴiプラスミド pＧ
Ｖ３８５０における ＡpR 遺伝子 pＢＲ３２２は、ＫmR
の様な別の耐性マーカー遺伝子で置換してもよい。こ
の様にして、ＡpR であるpＢＲ３２２含有中間クロ−ニ
ングベクタ−ですら、この pＧＶ３８５０タイプのアク
セプタ−Ｔi プラスミドに直接授動することができる。
その誘導体に挿入されている所望の遺伝子を含んだ中間
クロ−ニングベクタ−が pＧＶ３８５０の改良されたＴ
−ＤＮＡ領域に導入される。唯一つ必要なことは、中間
クロ−ニングベクタ−のＥ.coliからＡgrobacteriumへ
の転移を選択する為の手段として使用する為に、導入さ
れるＤＮＡが、既にpＢＲ３２２に存在するものの他に
もう１つの耐性マ−カ−遺伝子を含んでいるということ
である。この耐性マ−カ−は、 pＢＲ配列内に含まれて
いてもよく(例えば pＢＲ３２５のＣmR、または pＫＣ
７のＫmR)、植物細胞内で試験されるＤＮＡ内に含まれ
ていてもよい。更に、アクセプターＴiプラスミド pＧ
Ｖ３８５０における ＡpR 遺伝子 pＢＲ３２２は、ＫmR
の様な別の耐性マーカー遺伝子で置換してもよい。こ
の様にして、ＡpR であるpＢＲ３２２含有中間クロ−ニ
ングベクタ−ですら、この pＧＶ３８５０タイプのアク
セプタ−Ｔi プラスミドに直接授動することができる。
【００７３】pＧＶ ３８５０タイプのアクセプタ−Ｔi
プラスミドのもう１つの利点は、形質転換された植物細
胞で腫瘍をつくらないということである。 pＧＶ３８５
０の短かくなったＴ−ＤＮＡ領域は、依然としてノパリ
ンシンタ−ゼを暗号化している遺伝子を含んでいるの
で、pＧＶ３８５０で形質転換された細胞は、ノパリン
が存在するかどうかを分析することにより、非形質転換
細胞から簡単に選り分けることができる。勿論、アクセ
プタ−Ｔiプラスミド pＧＶ３８５０に組込まれた中間
クロ−ニングベクタ−がマ−カ−遺伝子を含んでいた
ら、それも直接スクリ−ニング、即ち選別にかけること
ができる。
プラスミドのもう１つの利点は、形質転換された植物細
胞で腫瘍をつくらないということである。 pＧＶ３８５
０の短かくなったＴ−ＤＮＡ領域は、依然としてノパリ
ンシンタ−ゼを暗号化している遺伝子を含んでいるの
で、pＧＶ３８５０で形質転換された細胞は、ノパリン
が存在するかどうかを分析することにより、非形質転換
細胞から簡単に選り分けることができる。勿論、アクセ
プタ−Ｔiプラスミド pＧＶ３８５０に組込まれた中間
クロ−ニングベクタ−がマ−カ−遺伝子を含んでいた
ら、それも直接スクリ−ニング、即ち選別にかけること
ができる。
【００７４】pＢＲ３２２配列を含んだ上記の中間クロ
−ニングベクタ−の単一乗換えによるアクセプタ− Ｔi
プラスミドへの挿入のほか、このアクセプタ−Ｔiプラ
スミドは、「ショットガン」タイプの実験に於いて、pＢ
Ｒ３２２またはその誘導体中のクロ−ンされたＤＮＡバ
ンクの受容体としても使用することができる。Ａgrobac
terium中の全てのハイブリッドプラスミドベクタ−は、
植物細胞の感染に使用することができ、次いで所望の選
択可能な遺伝子(群)の発現についてスクリ−ニングされ
る。例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏している植物細胞
に全バンクを適用することにより、アミノ酸合成を暗号
化している遺伝子について簡単に選別することができ
る。
−ニングベクタ−の単一乗換えによるアクセプタ− Ｔi
プラスミドへの挿入のほか、このアクセプタ−Ｔiプラ
スミドは、「ショットガン」タイプの実験に於いて、pＢ
Ｒ３２２またはその誘導体中のクロ−ンされたＤＮＡバ
ンクの受容体としても使用することができる。Ａgrobac
terium中の全てのハイブリッドプラスミドベクタ−は、
植物細胞の感染に使用することができ、次いで所望の選
択可能な遺伝子(群)の発現についてスクリ−ニングされ
る。例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏している植物細胞
に全バンクを適用することにより、アミノ酸合成を暗号
化している遺伝子について簡単に選別することができ
る。
【００７５】アクセプタ−Ｔi プラスミド pＧＶ３８５
０は、２つの特徴的な表現形質を持っている：即ち、
(i)腫瘍生成能力がないこと、および(ii)もしＴ−ＤＮ
Ａが植物細胞ゲノム内に転移したら、ノパリン合成能を
有すること、である。 pＧＶ３８５０含有Ａgrobacteri
umで感染させた各種の植物組織のこれらの特徴を調べる
ために、種々の実験を行なった。
０は、２つの特徴的な表現形質を持っている：即ち、
(i)腫瘍生成能力がないこと、および(ii)もしＴ−ＤＮ
Ａが植物細胞ゲノム内に転移したら、ノパリン合成能を
有すること、である。 pＧＶ３８５０含有Ａgrobacteri
umで感染させた各種の植物組織のこれらの特徴を調べる
ために、種々の実験を行なった。
【００７６】a）ジャガイモおよびニンジンディスクを
用いた試験 ジャガイモおよびニンジンの切片にアクセプタ−Ｔiプ
ラスミドpＧＶ３８５０を接種すると、少量の硬結組織
が生成する。この組織にノパリンが存在するかどうかを
試験した所、陽性であることがわかった。この突然変異
体が少量の硬結組織を生産し得ることは興味あることで
ある。しかし、それは、これらのディスクを低濃度のオ
−キシンおよびサイトキニンの両者を含んでいる培地で
生育させた時だけ得られる。
用いた試験 ジャガイモおよびニンジンの切片にアクセプタ−Ｔiプ
ラスミドpＧＶ３８５０を接種すると、少量の硬結組織
が生成する。この組織にノパリンが存在するかどうかを
試験した所、陽性であることがわかった。この突然変異
体が少量の硬結組織を生産し得ることは興味あることで
ある。しかし、それは、これらのディスクを低濃度のオ
−キシンおよびサイトキニンの両者を含んでいる培地で
生育させた時だけ得られる。
【００７７】b）全植物をアクセプタ−Ｔi プラスミド
pＧＶ３８５０で接種 ホルモンを含まない滅菌寒天培地で生育しているタバコ
およびペチュニアの苗木に pＧＶ３８５０を接種する。
数カ月後に少量の組織成長が観察されただけである(通
常、２週間後に「野生型」腫瘍が検出される)。この組織
はホルモンを含まない培地では生育しないが、オ−キシ
ンおよびサイトキニン含有培地での滅菌組織培養では、
さらに増殖することができる。この組織もノパリン陽性
であることがわかった。
pＧＶ３８５０で接種 ホルモンを含まない滅菌寒天培地で生育しているタバコ
およびペチュニアの苗木に pＧＶ３８５０を接種する。
数カ月後に少量の組織成長が観察されただけである(通
常、２週間後に「野生型」腫瘍が検出される)。この組織
はホルモンを含まない培地では生育しないが、オ−キシ
ンおよびサイトキニン含有培地での滅菌組織培養では、
さらに増殖することができる。この組織もノパリン陽性
であることがわかった。
【００７８】c）さらに、 pＧＶ３８５０「形質転換」細
胞は腫瘍性ではないので、これらの細胞は、転移したＤ
ＮＡセグメントをそのゲノムに依然として保持している
正常な植物に再生することができる。この形質転換細胞
を通常の再生培地(実施例５を参照)で培養すると、正常
植物が得られよう。
胞は腫瘍性ではないので、これらの細胞は、転移したＤ
ＮＡセグメントをそのゲノムに依然として保持している
正常な植物に再生することができる。この形質転換細胞
を通常の再生培地(実施例５を参照)で培養すると、正常
植物が得られよう。
【００７９】pＧＶ３８５０の、アクセプタ−プラスミ
ドとしての有用性を証明する為に、以下の実験を行なっ
た。 pＢＲ３２５中にオクトピンＴ−ＤＮＡの腫瘍機能
を含んでいる中間クロ−ニングベクタ−を、pＧＶ３８
５０を保持しているＡgrobacteriumに組み込んだ。単一
乗換えによって得られたＡgrobacterium 中のハイブリ
ッドＴi プラスミドを、傷つけたタバコ植物に接種し
た。２週間後に腫瘍組織があらわれた。このことは、腫
瘍誘導ＤＮＡが pＧＶ３８５０に再導入され、形質転換
植物細胞中で適切に発現されたことを示している。
ドとしての有用性を証明する為に、以下の実験を行なっ
た。 pＢＲ３２５中にオクトピンＴ−ＤＮＡの腫瘍機能
を含んでいる中間クロ−ニングベクタ−を、pＧＶ３８
５０を保持しているＡgrobacteriumに組み込んだ。単一
乗換えによって得られたＡgrobacterium 中のハイブリ
ッドＴi プラスミドを、傷つけたタバコ植物に接種し
た。２週間後に腫瘍組織があらわれた。このことは、腫
瘍誘導ＤＮＡが pＧＶ３８５０に再導入され、形質転換
植物細胞中で適切に発現されたことを示している。
【００８０】実施例２ 中間クロ−ニングベクタ− pＧ
Ｖ７００および pＧＶ７５０の組み立て この組み立ての概略を図１４に模式的に示した。オクト
ピンＴi プラスミドＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの右側部分
であり、 pＧＶ０２０１ (Ｄe Ｖosら、Ｐlasmid ６(１
９８１),２４９−２５３)中に存在するＨind III フラ
グメント１を、まず、広範囲宿主性ベクタ− pＧＶ１１
２２ (Ｌeemansら、Ｇene １９(１９８２), ３６１−３
６４) のＨind III サイトに挿入する。組換えプラスミ
ドpＧＶ０２０１は、多コピ−ベクタ− pＢＲ３２２ (
Ｂolivarら, Ｇene ２(１９７７),９５−１１３) の特
異なＨind III サイトに挿入されたＨind III フラグメ
ント１を含んでいる。 pＧＶ０２０１および pＧＶ１１
２２ＤＮＡは、Ｂetlachらが記載している方法で調製さ
れる (Ｆed．Ｐroc．３５(１９７６), ２０３７−２０
４３)。最終量２０μl中、 pＧＶ０２０１ＤＮＡ ２μg
を、Ｈind III ２単位 (全ての制限酵素はＢoehringer
Ｍannheim から購入した)を用いて、３７℃で１時間完
全に消化した。インキュベ−ション緩衝液はＯ'Ｆarrel
l らにより記載されている ( Ｍol．Ｇen．Ｇenet １７
９(１９８０),４２１−４３５)。同じ条件下で pＧＶ１
１２２ ＤＮＡ ２μgをＨind III で完全に消化した。
Ｖ７００および pＧＶ７５０の組み立て この組み立ての概略を図１４に模式的に示した。オクト
ピンＴi プラスミドＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの右側部分
であり、 pＧＶ０２０１ (Ｄe Ｖosら、Ｐlasmid ６(１
９８１),２４９−２５３)中に存在するＨind III フラ
グメント１を、まず、広範囲宿主性ベクタ− pＧＶ１１
２２ (Ｌeemansら、Ｇene １９(１９８２), ３６１−３
６４) のＨind III サイトに挿入する。組換えプラスミ
ドpＧＶ０２０１は、多コピ−ベクタ− pＢＲ３２２ (
Ｂolivarら, Ｇene ２(１９７７),９５−１１３) の特
異なＨind III サイトに挿入されたＨind III フラグメ
ント１を含んでいる。 pＧＶ０２０１および pＧＶ１１
２２ＤＮＡは、Ｂetlachらが記載している方法で調製さ
れる (Ｆed．Ｐroc．３５(１９７６), ２０３７−２０
４３)。最終量２０μl中、 pＧＶ０２０１ＤＮＡ ２μg
を、Ｈind III ２単位 (全ての制限酵素はＢoehringer
Ｍannheim から購入した)を用いて、３７℃で１時間完
全に消化した。インキュベ−ション緩衝液はＯ'Ｆarrel
l らにより記載されている ( Ｍol．Ｇen．Ｇenet １７
９(１９８０),４２１−４３５)。同じ条件下で pＧＶ１
１２２ ＤＮＡ ２μgをＨind III で完全に消化した。
【００８１】最終量２０μl中、Ｔ４リガ−ゼ(Ｂoehrin
gerＭannheim ) ０.０２単位を用い、０.１μg の Ｈin
d III 消化 pＧＶ０２０１をＨind III 消化 pＧＶ１１
２２とライゲ−ション(結紮)した。インキュベ−ション
緩衝液および条件は、製造業者の指示に従った ( Ｂroc
hure "Ｔ４リガ−ゼ"、Ｂoehringer Ｍannheim,１９８
０年８月、＃１０.Ｍ．８８０．４８６ )。ライゲ−シ
ヨン混合物のコンピテントＥ．coli Ｋ５１４ hsr- hsm
+ 細胞(Ｃolsonら、Ｇenetics５２(１９６５),１０４３
−１０５０)への導入(形質転換)は、ＤagertおよびＥhr
lich の方法 (Ｇene ６(１９８０),２３−２８) に従っ
て行なった。細胞を、ストレプトマイシン(２０μg／m
l) およびスペクチノマイシン(５０μg／ml) を補足し
たＬＢ培地 (Ｍiller, Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇ
enetics (１９７２), Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaborat
ory, ＮewＹork)に塗抹した。組換えプラスミドを含有
している形質転換体を、テトラサイクリン耐性を暗号化
している遺伝子への挿入によるその不活性化 ( Ｌeeman
s ら、Ｇene １９(１９８２), ３６１−３６４)に基づ
き、テトラサイクリン感受性(１０μg／ml)でスクリ−
ニング(選り分け)した。ストレプトマイシンおよびスペ
クチノマイシンに耐性を示し、テトラサイクリンに感受
性を有するクロ−ンを物理的に同定した。マイクロスケ
−ルのＤＮＡ調製はＫleinらの方法(Plasmid３(１９８
０),８８−９１)に従って実施した。 pＧＶ１１２２の
Ｈind III サイト中のＨind III フラグメント１の配向
は、ＳalＩ消化によって決定した。組換えプラスミドを
消化し (Ｏ'Ｆarrell らの条件、Ｍol．Ｇen．Ｇenet．
１７９(１９８０), ４２１−４３５) 、アガロ−スゲル
電気泳動にかけると２個のフラグメントが得られた。α
−配向には ０.７７kbおよび２２.７６kbのフラグメン
ト、β−配向には、１０.３３kbおよび１３.２０kbのフ
ラグメントがあった。α−配向の組換えプラスミドをそ
の後のクロ−ニングに使用し、これを pＧＶ１１６８と
名付けた。
gerＭannheim ) ０.０２単位を用い、０.１μg の Ｈin
d III 消化 pＧＶ０２０１をＨind III 消化 pＧＶ１１
２２とライゲ−ション(結紮)した。インキュベ−ション
緩衝液および条件は、製造業者の指示に従った ( Ｂroc
hure "Ｔ４リガ−ゼ"、Ｂoehringer Ｍannheim,１９８
０年８月、＃１０.Ｍ．８８０．４８６ )。ライゲ−シ
ヨン混合物のコンピテントＥ．coli Ｋ５１４ hsr- hsm
+ 細胞(Ｃolsonら、Ｇenetics５２(１９６５),１０４３
−１０５０)への導入(形質転換)は、ＤagertおよびＥhr
lich の方法 (Ｇene ６(１９８０),２３−２８) に従っ
て行なった。細胞を、ストレプトマイシン(２０μg／m
l) およびスペクチノマイシン(５０μg／ml) を補足し
たＬＢ培地 (Ｍiller, Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇ
enetics (１９７２), Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaborat
ory, ＮewＹork)に塗抹した。組換えプラスミドを含有
している形質転換体を、テトラサイクリン耐性を暗号化
している遺伝子への挿入によるその不活性化 ( Ｌeeman
s ら、Ｇene １９(１９８２), ３６１−３６４)に基づ
き、テトラサイクリン感受性(１０μg／ml)でスクリ−
ニング(選り分け)した。ストレプトマイシンおよびスペ
クチノマイシンに耐性を示し、テトラサイクリンに感受
性を有するクロ−ンを物理的に同定した。マイクロスケ
−ルのＤＮＡ調製はＫleinらの方法(Plasmid３(１９８
０),８８−９１)に従って実施した。 pＧＶ１１２２の
Ｈind III サイト中のＨind III フラグメント１の配向
は、ＳalＩ消化によって決定した。組換えプラスミドを
消化し (Ｏ'Ｆarrell らの条件、Ｍol．Ｇen．Ｇenet．
１７９(１９８０), ４２１−４３５) 、アガロ−スゲル
電気泳動にかけると２個のフラグメントが得られた。α
−配向には ０.７７kbおよび２２.７６kbのフラグメン
ト、β−配向には、１０.３３kbおよび１３.２０kbのフ
ラグメントがあった。α−配向の組換えプラスミドをそ
の後のクロ−ニングに使用し、これを pＧＶ１１６８と
名付けた。
【００８２】ＴＬ−ＤＮＡの左側部分 (左の境界配列を
含んでいる) を含有しているＢgl II−Ｓal I フラグメ
ントをＢgl II−Ｓal I で開裂した pＧＶ１１６８に導
入する。このフラグメントは、ベクタ− pＢＲ３２２に
挿入された、 pＴiＢ６Ｓ３のＴ領域からの、ＢamＨＩ
フラグメント８を含んでいる組換えプラスミド pＧＶ０
１５３ (Ｄe Ｖosら、Ｐlasmid ６ (１９８１), ２４
９−２５３)から得られる。 pＧＶ０１５３および pＧ
Ｖ１１６８ＤＮＡはＢetlachらの方法で調製する( Ｆe
d．Ｐroc．３５(１９７６),２０３７−２０４３)。 pＧ
Ｖ０１５３ＤＮＡ１０μgを１０単位の Ｂgl IIおよび
１０単位のＳalＩを用い、最終量１００μl中３７℃で
１時間、完全に消化した。消化混合物をプレパラティブ
０.８％アガロ−スゲル上、Ａllingtonらの方法(Ａna
l．Ｂiochim．８５(１９７８),１８８−１９６)で電気
溶出し、ゲルから２.１４kb Ｂlg II−Ｓal IIフラグメ
ントを回収した。 pＧＶ１１６８ＤＮＡ ２μgを２単位
のＢgl IIおよび２単位のＳalＩで完全に消化した。最
終量２０μl中、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼ０.０２単位を用い
てＢgl II−Ｓal IフラグメントＤＮＡ０.１μgを０.０
２μgのＢgl III−ＳalI消化 pＧＶ１１６８とライゲ−
ションした。このライゲーション混合物をコンピテント
Ｅ.coli Ｋ５１４ hsr- hsm+ 細胞(ＤagertおよびＥrhl
ich,Ｇene ６(１９８０),２３−２８)に導入した。細胞
をストレプトマイシン (２０μg／ml)およびスペクチノ
マイシン (５０μg／ml)を補足したＬＢ培地 ( Ｍille
r, Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics (１９７
２), Cold Ｓpring Ｈarbor Ｌoboratory, Ｎew Ｙor
Ｋ)に塗抹した。
含んでいる) を含有しているＢgl II−Ｓal I フラグメ
ントをＢgl II−Ｓal I で開裂した pＧＶ１１６８に導
入する。このフラグメントは、ベクタ− pＢＲ３２２に
挿入された、 pＴiＢ６Ｓ３のＴ領域からの、ＢamＨＩ
フラグメント８を含んでいる組換えプラスミド pＧＶ０
１５３ (Ｄe Ｖosら、Ｐlasmid ６ (１９８１), ２４
９−２５３)から得られる。 pＧＶ０１５３および pＧ
Ｖ１１６８ＤＮＡはＢetlachらの方法で調製する( Ｆe
d．Ｐroc．３５(１９７６),２０３７−２０４３)。 pＧ
Ｖ０１５３ＤＮＡ１０μgを１０単位の Ｂgl IIおよび
１０単位のＳalＩを用い、最終量１００μl中３７℃で
１時間、完全に消化した。消化混合物をプレパラティブ
０.８％アガロ−スゲル上、Ａllingtonらの方法(Ａna
l．Ｂiochim．８５(１９７８),１８８−１９６)で電気
溶出し、ゲルから２.１４kb Ｂlg II−Ｓal IIフラグメ
ントを回収した。 pＧＶ１１６８ＤＮＡ ２μgを２単位
のＢgl IIおよび２単位のＳalＩで完全に消化した。最
終量２０μl中、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼ０.０２単位を用い
てＢgl II−Ｓal IフラグメントＤＮＡ０.１μgを０.０
２μgのＢgl III−ＳalI消化 pＧＶ１１６８とライゲ−
ションした。このライゲーション混合物をコンピテント
Ｅ.coli Ｋ５１４ hsr- hsm+ 細胞(ＤagertおよびＥrhl
ich,Ｇene ６(１９８０),２３−２８)に導入した。細胞
をストレプトマイシン (２０μg／ml)およびスペクチノ
マイシン (５０μg／ml)を補足したＬＢ培地 ( Ｍille
r, Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics (１９７
２), Cold Ｓpring Ｈarbor Ｌoboratory, Ｎew Ｙor
Ｋ)に塗抹した。
【００８３】ストレプトマイシン−およびスペクチノマ
イシン−耐性形質転換体から、マイクロスケ−ルＤＮＡ
プレパレ−ション (Ｋleinら、Ｐlasmid ３(１９８０),
８８−９１) を行なった。２.１４kb Ｂgl II−Ｓal I
フラグメントがＢgl II−Ｓal I消化 pＧＶ１１６８に
挿入されている組換えプラスミドをＢgl II−Ｓal I消
化により同定した。この消化で２.１４kbおよび２１.８
２kbの２つのフラグメントが得られた。これらの分子量
(２.１４kbおよび２１.８２kb)に相当する消化パタ−
ンを持ったプラスミドを pＧＶ１１７１と名付け、さら
にクロ−ンするのに用いた。pＧＶ１１７１からの１２.
６５kb フラグメントは、左右のＴＬ−ＤＮＡ境界配列
(Ｄe Ｂeuckeleerら、in Ｐroceedings IVth Internati
onal Ｃonference on Ｐlant Ｐathogenic Ｂacteria,
Ｍ.Ｒide'(ed.)(１９７８), Ｉ．Ｎ．Ｒ．Ａ., Ａngre
s,１１５−１２６) および腫瘍性の増殖を可能にする遺
伝子(Ｌeemansら,ＥＭＢＯ Ｊ．(１９８２),１４７−１
５２) を含んでいる。このＨind III フラグメントをプ
ラスミド pＢＲ３２５に挿入した ( Ｂolivar,Ｇene４
(１９７８),１２１−１３６)。pＧＶ１１７１および p
ＢＲ３２５はＢetlachらの方法で調製した(Ｆed．Ｐro
c．３５(１９７６),２０３７−２０４３)。それぞれの
ＤＮＡ２μgを２単位のＨind III を用い、３７℃で１
時間完全に消化した(インキュベ−ション緩衝液はＯ'Ｆ
arrellらにより記載されている(Ｍol．Ｇen．Ｇenet．
１７９(１９８０), ４２１−４３５))。０.１μgのＨin
d III消化した pＧＶ１１７１を、Ｈind III で線状化
した０.０５μgの pＢＲ３２５と、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼ
０.０２ 単位を用いてライゲーションした。ライゲ−シ
ョン混合物によるコンピテントＥ．coli Ｋ５１４ hsr-
hsm+ の形質転換はＤagertおよびＥhrlichの方法で行
なった (Ｇene ６(１９８０),２３−２８)。細胞を、カ
ルベニシリン(１００μg／ml) を補足したＬＢ培地 (
Ｍiller, Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics (１
９７２), Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory, Ｎew
Ｙork)に塗抹した。カルベニシリン耐性コロニ−を、テ
トラサイクリン耐性を暗号化している遺伝子に挿入する
ことによるその不活性化に基づき、テトラサイクリン
(１０μg／ml)感受性でスクリ−ニングした (Ｂolivar,
Ｇene４(１９７８),１２１−１３６)。カルベニシリン
耐性、テトラサイクリン感受性のコロニ−を、そのコロ
ニ−から調製したＤＮＡの制限酵素消化により、マイク
ロスケ−ル技法(Ｋleinら,Ｐlasmid ３(１９８０),８８
−９１)によって物理的に特性化した。即ち、ＢamＨＩ
消化により、４つのＤＮＡフラグメントが得られる：α
配向の場合は０.９８kb、４.７１kb、５.９８kbおよび
７.０２kb のフラグメントが得られ、β配向の場合は
０.９８kb、４.７１kb、１.７１kb および１１.２０kb
のフラグメントが得られる。こうして得られたα配向の
組換えプラスミドは pＧＶ７００と名付けられ、更にそ
の後の実験に用いられた。
イシン−耐性形質転換体から、マイクロスケ−ルＤＮＡ
プレパレ−ション (Ｋleinら、Ｐlasmid ３(１９８０),
８８−９１) を行なった。２.１４kb Ｂgl II−Ｓal I
フラグメントがＢgl II−Ｓal I消化 pＧＶ１１６８に
挿入されている組換えプラスミドをＢgl II−Ｓal I消
化により同定した。この消化で２.１４kbおよび２１.８
２kbの２つのフラグメントが得られた。これらの分子量
(２.１４kbおよび２１.８２kb)に相当する消化パタ−
ンを持ったプラスミドを pＧＶ１１７１と名付け、さら
にクロ−ンするのに用いた。pＧＶ１１７１からの１２.
６５kb フラグメントは、左右のＴＬ−ＤＮＡ境界配列
(Ｄe Ｂeuckeleerら、in Ｐroceedings IVth Internati
onal Ｃonference on Ｐlant Ｐathogenic Ｂacteria,
Ｍ.Ｒide'(ed.)(１９７８), Ｉ．Ｎ．Ｒ．Ａ., Ａngre
s,１１５−１２６) および腫瘍性の増殖を可能にする遺
伝子(Ｌeemansら,ＥＭＢＯ Ｊ．(１９８２),１４７−１
５２) を含んでいる。このＨind III フラグメントをプ
ラスミド pＢＲ３２５に挿入した ( Ｂolivar,Ｇene４
(１９７８),１２１−１３６)。pＧＶ１１７１および p
ＢＲ３２５はＢetlachらの方法で調製した(Ｆed．Ｐro
c．３５(１９７６),２０３７−２０４３)。それぞれの
ＤＮＡ２μgを２単位のＨind III を用い、３７℃で１
時間完全に消化した(インキュベ−ション緩衝液はＯ'Ｆ
arrellらにより記載されている(Ｍol．Ｇen．Ｇenet．
１７９(１９８０), ４２１−４３５))。０.１μgのＨin
d III消化した pＧＶ１１７１を、Ｈind III で線状化
した０.０５μgの pＢＲ３２５と、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼ
０.０２ 単位を用いてライゲーションした。ライゲ−シ
ョン混合物によるコンピテントＥ．coli Ｋ５１４ hsr-
hsm+ の形質転換はＤagertおよびＥhrlichの方法で行
なった (Ｇene ６(１９８０),２３−２８)。細胞を、カ
ルベニシリン(１００μg／ml) を補足したＬＢ培地 (
Ｍiller, Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics (１
９７２), Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory, Ｎew
Ｙork)に塗抹した。カルベニシリン耐性コロニ−を、テ
トラサイクリン耐性を暗号化している遺伝子に挿入する
ことによるその不活性化に基づき、テトラサイクリン
(１０μg／ml)感受性でスクリ−ニングした (Ｂolivar,
Ｇene４(１９７８),１２１−１３６)。カルベニシリン
耐性、テトラサイクリン感受性のコロニ−を、そのコロ
ニ−から調製したＤＮＡの制限酵素消化により、マイク
ロスケ−ル技法(Ｋleinら,Ｐlasmid ３(１９８０),８８
−９１)によって物理的に特性化した。即ち、ＢamＨＩ
消化により、４つのＤＮＡフラグメントが得られる：α
配向の場合は０.９８kb、４.７１kb、５.９８kbおよび
７.０２kb のフラグメントが得られ、β配向の場合は
０.９８kb、４.７１kb、１.７１kb および１１.２０kb
のフラグメントが得られる。こうして得られたα配向の
組換えプラスミドは pＧＶ７００と名付けられ、更にそ
の後の実験に用いられた。
【００８４】pＧＶ７５０は、pＧＶ７００に挿入された
ＴＬ−領域の内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している
３.４９kb ＢglII−ＳmaＩフラグメントの代わりに、カ
ナマイシン耐性を暗号化している２.８１kb ＢamＨＩ−
ＨpaＩフラグメントを挿入することにより、pＧＶ７０
０から誘導される。カナマイシン耐性を暗号化している
ＢamＨＩ−ＨpaＩフラグメントはλ::Ｔn５(Ｂergら、
Ｐroc.Ｎatl．Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ７２(１９７５),３
６２８−３６３２ ) から得られる。λ::Ｔn５の調製は
Ｍillerにより記載されている(Ｅxperiments in Ｍolec
ular Ｇenetics(１９７２),Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌa
boratory,Ｎew Ｙork)。pＧＶ７００ＤＮＡはＢetlach
らの方法で調製する (Ｆed．Ｐroc．３５(１９７６),
２０３７−２０４３)。pＧＶ７００ ＤＮＡ ２μgを２
単位のＢglIIおよび２単位のＳmaＩで完全に消化した。
λ::Ｔn５ＤＮＡ２μgを２単位のＢamＨＩおよび２単位
のＨpaＩで完全に消化した。１μgのＢamＨＩ−ＨpaＩ
消化λ::Ｔn５を、最終量１０μl中、Ｔ４ ＤＮＡリガ
−ゼ０.５単位を用いて、０.２μgのＢglII−ＳmaＩ消
化 pＧＶ７００とライゲ−ションした(製造業者の指示
する条件に従った)。このライゲーション混合物をコン
ピテントＥ.coli Ｋ５１４ hsr- hsm+ 細胞(Ｄagertお
よびＥrhlich, Ｇene ６(１９８０), ２３−２８)に導
入した。細胞を、カルベニシリン(１００μg／ml) およ
びカナマイシン(２５μg／ml)を補足したＬＢ培地(Ｍil
ler,Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics(１９７
２),Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,Ｎew Ｙork)
上に塗抹した。マイクロスケール技法(Ｋleinら, Ｐlas
mid ３(１９８０), ８８−９１)に従って調製したＤＮ
Ａの制限酵素分析により、ＣbR およびＫmR コロニーを
物理的に特性化した。このＤＮＡをＢglII／ＢamＨＩで
二重消化すると、３.９４kb、５.８９kbおよび８.０９kb
の３つのフラグメントが、Ｈind III で消化すると２.
６８kb、５.９９kbおよび９.２５kb の３つのフラグメ
ントが得られる。この消化パタ−ンを示すプラスミドを
pＧＶ７５０と名付け、図１５に模式的に示した。
ＴＬ−領域の内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している
３.４９kb ＢglII−ＳmaＩフラグメントの代わりに、カ
ナマイシン耐性を暗号化している２.８１kb ＢamＨＩ−
ＨpaＩフラグメントを挿入することにより、pＧＶ７０
０から誘導される。カナマイシン耐性を暗号化している
ＢamＨＩ−ＨpaＩフラグメントはλ::Ｔn５(Ｂergら、
Ｐroc.Ｎatl．Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ７２(１９７５),３
６２８−３６３２ ) から得られる。λ::Ｔn５の調製は
Ｍillerにより記載されている(Ｅxperiments in Ｍolec
ular Ｇenetics(１９７２),Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌa
boratory,Ｎew Ｙork)。pＧＶ７００ＤＮＡはＢetlach
らの方法で調製する (Ｆed．Ｐroc．３５(１９７６),
２０３７−２０４３)。pＧＶ７００ ＤＮＡ ２μgを２
単位のＢglIIおよび２単位のＳmaＩで完全に消化した。
λ::Ｔn５ＤＮＡ２μgを２単位のＢamＨＩおよび２単位
のＨpaＩで完全に消化した。１μgのＢamＨＩ−ＨpaＩ
消化λ::Ｔn５を、最終量１０μl中、Ｔ４ ＤＮＡリガ
−ゼ０.５単位を用いて、０.２μgのＢglII−ＳmaＩ消
化 pＧＶ７００とライゲ−ションした(製造業者の指示
する条件に従った)。このライゲーション混合物をコン
ピテントＥ.coli Ｋ５１４ hsr- hsm+ 細胞(Ｄagertお
よびＥrhlich, Ｇene ６(１９８０), ２３−２８)に導
入した。細胞を、カルベニシリン(１００μg／ml) およ
びカナマイシン(２５μg／ml)を補足したＬＢ培地(Ｍil
ler,Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics(１９７
２),Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,Ｎew Ｙork)
上に塗抹した。マイクロスケール技法(Ｋleinら, Ｐlas
mid ３(１９８０), ８８−９１)に従って調製したＤＮ
Ａの制限酵素分析により、ＣbR およびＫmR コロニーを
物理的に特性化した。このＤＮＡをＢglII／ＢamＨＩで
二重消化すると、３.９４kb、５.８９kbおよび８.０９kb
の３つのフラグメントが、Ｈind III で消化すると２.
６８kb、５.９９kbおよび９.２５kb の３つのフラグメ
ントが得られる。この消化パタ−ンを示すプラスミドを
pＧＶ７５０と名付け、図１５に模式的に示した。
【００８５】pＧＶ７００と pＧＶ７５０は、オクトピ
ンＴi プラスミド pＴiＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの左右
の境界配列を含む、２つの相異なる中間クロ−ニングベ
クタ−である。更に、これら２つのプラスミドではＴ−
領域内の削除の程度が異なっている。pＧＶ７００は、
オクトピンシンタ−ゼ (トランスクリプト３) およびそ
の他３つの生成物、即ち４, ６aおよび６b (Ｔ−領域の
生成物についてはＷillmitzerら，ＥＮＢＯ Ｊ．１（１
９８２），１３９−１４６参照) のための遺伝情報を持
った縮小Ｔ−領域を含んでいる。この３つの生成物(４,
６aおよび６b)の組み合せが形質転換された植物の新芽
形成を促す。pＧＶ７５０はもっと小さいＴ−領域、即
ちオクトピンシンタ−ゼ遺伝子だけを含んでいる。生成
物４，６aおよび６bの為の情報は、カナマイシン(ネオ
マイシン)耐性を暗号化している抗生物質耐性マ−カ−
遺伝子によって置換されてしまっている。
ンＴi プラスミド pＴiＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの左右
の境界配列を含む、２つの相異なる中間クロ−ニングベ
クタ−である。更に、これら２つのプラスミドではＴ−
領域内の削除の程度が異なっている。pＧＶ７００は、
オクトピンシンタ−ゼ (トランスクリプト３) およびそ
の他３つの生成物、即ち４, ６aおよび６b (Ｔ−領域の
生成物についてはＷillmitzerら，ＥＮＢＯ Ｊ．１（１
９８２），１３９−１４６参照) のための遺伝情報を持
った縮小Ｔ−領域を含んでいる。この３つの生成物(４,
６aおよび６b)の組み合せが形質転換された植物の新芽
形成を促す。pＧＶ７５０はもっと小さいＴ−領域、即
ちオクトピンシンタ−ゼ遺伝子だけを含んでいる。生成
物４，６aおよび６bの為の情報は、カナマイシン(ネオ
マイシン)耐性を暗号化している抗生物質耐性マ−カ−
遺伝子によって置換されてしまっている。
【００８６】pＧＶ７００およびpＧＶ７５０は、Ｂタイ
プのアクセプターＴiプラスミド(図８および後記実施例
３参照)と共に使用し得る中間クローニングベクターの
例である。これらのベクターは、それらが所望の遺伝子
を含んでいないことを除けば、図９に示したものと部分
的に類似している。これらのベクターは、その改良Ｔ−
領域内にクローンする為の１個の制限エンドヌクレアー
ゼサイトを含んでいるので、所望の遺伝子を簡単にそれ
らのベクターに挿入することができる(図１４および図
１５参照)。
プのアクセプターＴiプラスミド(図８および後記実施例
３参照)と共に使用し得る中間クローニングベクターの
例である。これらのベクターは、それらが所望の遺伝子
を含んでいないことを除けば、図９に示したものと部分
的に類似している。これらのベクターは、その改良Ｔ−
領域内にクローンする為の１個の制限エンドヌクレアー
ゼサイトを含んでいるので、所望の遺伝子を簡単にそれ
らのベクターに挿入することができる(図１４および図
１５参照)。
【００８７】実施例３ アクセプターＴiプラスミドpＧ
Ｖ２２６０(タイプＢ)の組み立て 出発株およびプラスミド： Ａgrobacterium tumefaciens (野生型Ａgrobacterium
から誘導される、リファンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１およ
びエリスロマイシン−クロラムフェニコール耐性株Ｃ５
８Ｃ１) Ｔiプラスミド＝pＧＶ２２１７ 中間ベクター(図１６)＝pＧＶ７４５
Ｖ２２６０(タイプＢ)の組み立て 出発株およびプラスミド： Ａgrobacterium tumefaciens (野生型Ａgrobacterium
から誘導される、リファンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１およ
びエリスロマイシン−クロラムフェニコール耐性株Ｃ５
８Ｃ１) Ｔiプラスミド＝pＧＶ２２１７ 中間ベクター(図１６)＝pＧＶ７４５
【００８８】ＴiプラスミドpＧＶ２２１７の組み立てに
ついては詳細に記載されている(Ｌeemansら、ＥＭＢＯ
Ｊ．１ (１９８２), １４７−１５２)。これは、オクト
ピンＴiプラスミドの全ＴＬ−領域の欠失置換突然変異
体を含んでいる: 即ち、ＢamＨＩフラグメント８、３０
b、２８、１７aおよびＢamＨＩフラグメント２の左の
３.７６kb ＢamＨＩ−ＥcoＲＩフラグメント(Ｄe Ｖos
ら、Ｐlasmid ６ (１９８１), ２４９−２５３)が、Ｔn
５のapt(アセチルホスホトランスフェラーゼ)遺伝子を
含んでいるpＫＣ７のＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメント
(Ｒao ＆ Ｒogers,Ｇene ７ (１９７９), ７９−８２)
で置き換えられている。この遺伝子はアミノグリコシ
ド、ネオマイシンおよびカナマイシンに対する耐性を暗
号化している。
ついては詳細に記載されている(Ｌeemansら、ＥＭＢＯ
Ｊ．１ (１９８２), １４７−１５２)。これは、オクト
ピンＴiプラスミドの全ＴＬ−領域の欠失置換突然変異
体を含んでいる: 即ち、ＢamＨＩフラグメント８、３０
b、２８、１７aおよびＢamＨＩフラグメント２の左の
３.７６kb ＢamＨＩ−ＥcoＲＩフラグメント(Ｄe Ｖos
ら、Ｐlasmid ６ (１９８１), ２４９−２５３)が、Ｔn
５のapt(アセチルホスホトランスフェラーゼ)遺伝子を
含んでいるpＫＣ７のＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメント
(Ｒao ＆ Ｒogers,Ｇene ７ (１９７９), ７９−８２)
で置き換えられている。この遺伝子はアミノグリコシ
ド、ネオマイシンおよびカナマイシンに対する耐性を暗
号化している。
【００８９】中間ベクターpＧＶ７４５の組み立てを図
１６に模式的に示した。これについて以下に詳述する。
組換えプラスミドpＧＶ７１３を、α配向でＨind IIIフ
ラグメント１４、１８c、２２eおよび３８cを含む、オ
クトピンＴiプラスミドサブクローンpＧＶ０２１９(Ｄe
Ｖosら、Ｐlasmid ６(１９８１), ２４９−２５３)か
ら誘導した。pＧＶ０２１９ＤＮＡをＢamＨＩで完全に
消化し、次いで自己結紮(セルフライゲーション)に有利
な条件下でライゲーションした(ライゲーション混合物
中のＤＮＡの最終濃度＜１μg ＤＮＡ／ml)。アンピシ
リン耐性で形質転換体を選別し、制限酵素による消化で
物理的に特性化した。こうしてpＧＶ０２１９に存在す
る６.５kb ＢamＨＩフラグメントをもはや含んでいない
クローンを分離し、これをpＧＶ７１３と名付け、その
後のクローニングに使用した(以下の記載参照)。ＢamＨ
Ｉフラグメント２を含んでいるpＧＶ０１２０(Ｄe Ｖos
ら、Ｐlasmid ６(１９８１), ２４９−２５３)から組換
えプラスミドpＧＶ７３８を誘導した。pＧＶ０１２０
ＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、pＧＶ７１３の場合と同様
にして自己結紮させた。形質転換体をアンピシリン耐性
によって選別し、制限酵素消化により分析した。ＥcoＲ
Ｉフラグメント２０、１２およびＥcoＲＩフラグメント
１９a の一部とpＢＲ３２２の一部を含んでいる２.９５
kb ＥcoＲＩフラグメントが全て除去されたクローンをp
ＧＶ７３８と名付け、更にその後のクローニングに利用
した。このプラスミドは、依然としてＢamＨＩフラグメ
ント２の右側部分からの５.６５kb ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ
フラグメントを含んでいる(Ｄe Ｖosら、Ｐlasmid ６
(１９８１), ２４９−２５３)。
１６に模式的に示した。これについて以下に詳述する。
組換えプラスミドpＧＶ７１３を、α配向でＨind IIIフ
ラグメント１４、１８c、２２eおよび３８cを含む、オ
クトピンＴiプラスミドサブクローンpＧＶ０２１９(Ｄe
Ｖosら、Ｐlasmid ６(１９８１), ２４９−２５３)か
ら誘導した。pＧＶ０２１９ＤＮＡをＢamＨＩで完全に
消化し、次いで自己結紮(セルフライゲーション)に有利
な条件下でライゲーションした(ライゲーション混合物
中のＤＮＡの最終濃度＜１μg ＤＮＡ／ml)。アンピシ
リン耐性で形質転換体を選別し、制限酵素による消化で
物理的に特性化した。こうしてpＧＶ０２１９に存在す
る６.５kb ＢamＨＩフラグメントをもはや含んでいない
クローンを分離し、これをpＧＶ７１３と名付け、その
後のクローニングに使用した(以下の記載参照)。ＢamＨ
Ｉフラグメント２を含んでいるpＧＶ０１２０(Ｄe Ｖos
ら、Ｐlasmid ６(１９８１), ２４９−２５３)から組換
えプラスミドpＧＶ７３８を誘導した。pＧＶ０１２０
ＤＮＡをＥcoＲＩで消化し、pＧＶ７１３の場合と同様
にして自己結紮させた。形質転換体をアンピシリン耐性
によって選別し、制限酵素消化により分析した。ＥcoＲ
Ｉフラグメント２０、１２およびＥcoＲＩフラグメント
１９a の一部とpＢＲ３２２の一部を含んでいる２.９５
kb ＥcoＲＩフラグメントが全て除去されたクローンをp
ＧＶ７３８と名付け、更にその後のクローニングに利用
した。このプラスミドは、依然としてＢamＨＩフラグメ
ント２の右側部分からの５.６５kb ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ
フラグメントを含んでいる(Ｄe Ｖosら、Ｐlasmid ６
(１９８１), ２４９−２５３)。
【００９０】次いでpＧＶ７１３ ＤＮＡをＨind IIIお
よびＢamＨＩで消化し、消化物をプレパラティブアガロ
ースゲルにかけた。電気泳動の後、pＧＶ７１３内に含
まれている２.３０kb Ｈind III−ＢamＨＩフラグメン
トを電気溶出で純化した(Ａllingtonら、Ａnal．Ｂioch
em．８５(１９７５), １８８−１９６)。このフラグメ
ントをＨind IIIおよびＢamＨＩで完全に消化したpＧＶ
７３８とライゲーションした。形質転換後、アンピシリ
ン耐性コロニーを、制限酵素消化により物理的に特性化
する。例えば、ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ消化により、それぞ
れ３.９８kb(＝ベクター部分)と７.９５kb(＝挿入部分)
の２つのフラグメントが得られるはずである。この特性
を持った組換えプラスミドはpＧＶ７４５と命名され、
アクセプターＴiプラスミドpＧＶ２２６０を組み立てる
ための中間ベクターとして使用された。
よびＢamＨＩで消化し、消化物をプレパラティブアガロ
ースゲルにかけた。電気泳動の後、pＧＶ７１３内に含
まれている２.３０kb Ｈind III−ＢamＨＩフラグメン
トを電気溶出で純化した(Ａllingtonら、Ａnal．Ｂioch
em．８５(１９７５), １８８−１９６)。このフラグメ
ントをＨind IIIおよびＢamＨＩで完全に消化したpＧＶ
７３８とライゲーションした。形質転換後、アンピシリ
ン耐性コロニーを、制限酵素消化により物理的に特性化
する。例えば、ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ消化により、それぞ
れ３.９８kb(＝ベクター部分)と７.９５kb(＝挿入部分)
の２つのフラグメントが得られるはずである。この特性
を持った組換えプラスミドはpＧＶ７４５と命名され、
アクセプターＴiプラスミドpＧＶ２２６０を組み立てる
ための中間ベクターとして使用された。
【００９１】プラスミド pＧＶ７４５は pＢＲ３２２部
分にＣol Ｅ１特異的 bomサイトを持っており、実施例
１に記載した様に(アクセプターＴiプラスミドpＧＶ３
８５０の組み立てについて)、ヘルパープラスミドＲ６
４drd１１およびpＧＪ２８を使ってＥ．coliからＡgrob
acteriumへ授動させることができる。
分にＣol Ｅ１特異的 bomサイトを持っており、実施例
１に記載した様に(アクセプターＴiプラスミドpＧＶ３
８５０の組み立てについて)、ヘルパープラスミドＲ６
４drd１１およびpＧＪ２８を使ってＥ．coliからＡgrob
acteriumへ授動させることができる。
【００９２】pＧＶ７４５を、リファンピシン耐性であ
りＴiプラスミドpＧＶ２２１７を含んでいるＡgrobacte
rium株Ｃ５８Ｃ１に授動させた。最初の乗り換えは、実
施例１(アクセプターＴiプラスミドpＧＶ３８５０の組
み立て)に記載した方法と同じ方法で、pＢＲ３２２のア
ンピシリン耐性を使って選択した。２回目の乗り換えに
より、pＧＶ２２１７に存在する欠失置換突然変異体が
プラスミドpＧＶ７４５のpＢＲ３２２配列によって置換
される。pＧＶ７４５のpＧＶ２２１７との相互組込みの
結果得られるアンピシリン耐性トランス接合体を、カナ
マイシン耐性の欠落により直接選別することにより第２
の組換え体を得た。この様にして、pＧＶ２２６０(アン
ピシリン耐性、カナマイシン感受性)を含んでいるリフ
ァンピシンＡgrobacterium株Ｃ５８Ｃ１を得た。
りＴiプラスミドpＧＶ２２１７を含んでいるＡgrobacte
rium株Ｃ５８Ｃ１に授動させた。最初の乗り換えは、実
施例１(アクセプターＴiプラスミドpＧＶ３８５０の組
み立て)に記載した方法と同じ方法で、pＢＲ３２２のア
ンピシリン耐性を使って選択した。２回目の乗り換えに
より、pＧＶ２２１７に存在する欠失置換突然変異体が
プラスミドpＧＶ７４５のpＢＲ３２２配列によって置換
される。pＧＶ７４５のpＧＶ２２１７との相互組込みの
結果得られるアンピシリン耐性トランス接合体を、カナ
マイシン耐性の欠落により直接選別することにより第２
の組換え体を得た。この様にして、pＧＶ２２６０(アン
ピシリン耐性、カナマイシン感受性)を含んでいるリフ
ァンピシンＡgrobacterium株Ｃ５８Ｃ１を得た。
【００９３】このＴiプラスミドpＧＶ２２６０は、pＧ
Ｖ７００−またはpＧＶ７５０−タイプの中間クローニ
ングベクター用のアクセプタープラスミド(Ｂタイプ)と
して使用されるものである。これらは、(i)アンピシリ
ン耐性遺伝子、複製起源およびpＢＲ３２２のbomサイト
を持ったＤＮＡフラグメント、(ii)ＴＬ−ＤＮＡの左右
の境界配列のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列および、中
間クローニングベクターのＥ．coliからＡgrobacterium
への転移並びにそのアクセプターＴiプラスミドpＧＶ２
２６０への相互組込みを遺伝学的に選別し得る、pＢＲ
３２２に既に存在している耐性マーカーとは別の、もう
１つの耐性マーカーを含んでいるＤＮＡフラグメント、
で構成されている。
Ｖ７００−またはpＧＶ７５０−タイプの中間クローニ
ングベクター用のアクセプタープラスミド(Ｂタイプ)と
して使用されるものである。これらは、(i)アンピシリ
ン耐性遺伝子、複製起源およびpＢＲ３２２のbomサイト
を持ったＤＮＡフラグメント、(ii)ＴＬ−ＤＮＡの左右
の境界配列のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列および、中
間クローニングベクターのＥ．coliからＡgrobacterium
への転移並びにそのアクセプターＴiプラスミドpＧＶ２
２６０への相互組込みを遺伝学的に選別し得る、pＢＲ
３２２に既に存在している耐性マーカーとは別の、もう
１つの耐性マーカーを含んでいるＤＮＡフラグメント、
で構成されている。
【００９４】例えば、本発明者らは、pＧＶ２２６０とp
ＧＶ７００との間の相互組込み体を持っているＡgrobac
teriumは、所望のＤＮＡ配列(Ｔ−ＤＮＡ境界の間に含
まれている)を植物細胞ゲノムへ転移させ得ることを立
証した。この形質転換された植物細胞は、もしpＧＶ７
００が３つの生産物のための遺伝情報(４、６a、６b;Ｗ
illmitzerら、ＥＭＢＯ Ｊ．１(１９８２), １３９−１
４６)を含んでいる場合は、期待される表現形質、即ち
新芽を生じる腫瘍を示す。この様に、本発明者らは、Ｂ
タイプのアクセプターＴiプラスミドは、図９に示し、
更に実施例２に記載したタイプの中間クローニングベク
ターとの相互組込み体として使用すると、ＤＮＡを植物
細胞に転移させることができることを証明した。
ＧＶ７００との間の相互組込み体を持っているＡgrobac
teriumは、所望のＤＮＡ配列(Ｔ−ＤＮＡ境界の間に含
まれている)を植物細胞ゲノムへ転移させ得ることを立
証した。この形質転換された植物細胞は、もしpＧＶ７
００が３つの生産物のための遺伝情報(４、６a、６b;Ｗ
illmitzerら、ＥＭＢＯ Ｊ．１(１９８２), １３９−１
４６)を含んでいる場合は、期待される表現形質、即ち
新芽を生じる腫瘍を示す。この様に、本発明者らは、Ｂ
タイプのアクセプターＴiプラスミドは、図９に示し、
更に実施例２に記載したタイプの中間クローニングベク
ターとの相互組込み体として使用すると、ＤＮＡを植物
細胞に転移させることができることを証明した。
【００９５】実施例４ 植物に発現させようとする遺伝
子を含んだ中間クローニングベクターの組み立て 本発明が完成されるまで、ＴiプラスミドのＴ−領域内
の、多かれ少なかれでたらめな位置に全遺伝子を挿入し
ても、その外来性の配列が植物ゲノムへ転移した後発現
されるということはなかった。本発明方法に従えば、所
望の外来性遺伝子(群)の暗号領域を、植物細胞中で機能
することが知られている転写開始および終了信号に連結
することができる。この方法の有用性は、ノパリンシン
ターゼ遺伝子を暗号化しているＤＮＡ配列が関与する、
本発明の実験によって例証される。この遺伝子の全配列
および正確な転写開始および終了は既知である(Ｄepick
erら、Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８２), ５６
１−５７４)。本発明によれば外来性遺伝子の蛋白質暗
号化領域は nosプロモーターの隣りに挿入することがで
きる。外来性遺伝子配列の例として、オクトピンシンタ
ーゼ遺伝子の暗号領域(Ｄe Ｇreveら、Ｊ．Ｍol．Ａpp
l．Ｇenet．１(１９８２), ４９９−５１２)をnosプロ
モーターに隣接させて挿入する。この構造物はアクセプ
ター Ｔiプラスミド内に授動され、植物を感染させるの
に使用される。生成した腫瘍組織にオクトピンが存在す
るかどうかを分析した所、陽性であることがわかった。
子を含んだ中間クローニングベクターの組み立て 本発明が完成されるまで、ＴiプラスミドのＴ−領域内
の、多かれ少なかれでたらめな位置に全遺伝子を挿入し
ても、その外来性の配列が植物ゲノムへ転移した後発現
されるということはなかった。本発明方法に従えば、所
望の外来性遺伝子(群)の暗号領域を、植物細胞中で機能
することが知られている転写開始および終了信号に連結
することができる。この方法の有用性は、ノパリンシン
ターゼ遺伝子を暗号化しているＤＮＡ配列が関与する、
本発明の実験によって例証される。この遺伝子の全配列
および正確な転写開始および終了は既知である(Ｄepick
erら、Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８２), ５６
１−５７４)。本発明によれば外来性遺伝子の蛋白質暗
号化領域は nosプロモーターの隣りに挿入することがで
きる。外来性遺伝子配列の例として、オクトピンシンタ
ーゼ遺伝子の暗号領域(Ｄe Ｇreveら、Ｊ．Ｍol．Ａpp
l．Ｇenet．１(１９８２), ４９９−５１２)をnosプロ
モーターに隣接させて挿入する。この構造物はアクセプ
ター Ｔiプラスミド内に授動され、植物を感染させるの
に使用される。生成した腫瘍組織にオクトピンが存在す
るかどうかを分析した所、陽性であることがわかった。
【００９６】キメラノパリンプロモ−タ−を含有してい
る中間クロ−ニングベクタ−の組み立て: オクトピンシ
ンタ−ゼ構造遺伝子を図１８〜図２０に示す。
る中間クロ−ニングベクタ−の組み立て: オクトピンシ
ンタ−ゼ構造遺伝子を図１８〜図２０に示す。
【００９７】簡単に言えば、 nos遺伝子を含んでいる制
限フラグメントＨind III−２３ をインビトロで処理し
て nos暗号配列の大部分を除去する一方、制限エンドヌ
クレア−ゼサイトＢamＨＩに隣接している nosプロモ−
タ−は保持する (図１８)。１０μg の pＧＶ０４２２
(完全な nos 遺伝子を含むＨind III−２３ フラグメン
トを持った pＢＲ３２２誘導体; Ｄepickerら, Ｐlasmi
d (１９８０), １９３−２１１)をＳau ３Ａで消化し、
nosプロモ−タ−を含んだ３５０bp のフラグメントを
プレパラティブ５％ポリアクリルアミドゲルで分離す
る。このプロモ−タ−フラグメントを、５'−末端燐酸
エステル基を除去するために予め細菌性アルカリホスフ
ァタ−ゼ(ＢＡＰ)で処理した、Ｂgl II−切断 pＫＣ７
(Ｒao ら、Ｇene７(１９７９),７９−８２) に結合させ
る。得られたプラスミド(pＬＧＶ１３)２０μgをＢgl I
Iで消化し、４００μlの１２mＭ ＭgＣl2、１２mＭ Ｃa
Ｃl2、０.６Ｍ ＮaＣl、１mＭ ＥＤＴＡおよび２０mＭ
トリス−ＨＣl(pＨ８.０)中、３０℃でＢal３１エキソ
ヌクレア−ゼ(Ｂiolabs, Ｎew Ｅngland)７単位を用い
て４〜１０分間処理する。この間、約２０〜５０bpのＤ
ＮＡが除去される。このＢal３１−処理分子をＢamＨＩ
で消化した後、ＤＮＡポリメラ−ゼのＫlenowフラグメ
ントと４つのデオキシヌクレオシドトリホスフェ−ト
(それぞれ１０mＭ)と共にインキュベ−トして、その末
端を満たす。充填されたＢamＨＩ末端とＢal３１除去末
端とのライゲ−ションから得られる再生ＢamＨＩサイト
を持ったプラスミドを選別する。いくつかの候補のＢam
ＨＩ−Ｓac II フラグメントのサイズを６％尿素−ポリ
アクリルアミドゲル中で見積り、サイズが２００〜２８
０ヌクレオチドの範囲にある候補のヌクレオチド配列を
決定する。プロモ−タ−を持った２０３bp の ＳacII−
ＢamＨＩフラグメントを含んでいるクロ−ン pＬＧＶ８
１を、 pＧＶ０４２２の nos 遺伝子中のＳac II−Ｂa
mＨＩ フラグメントと置換するのに使用する: この最終
プロモ−タ−ベクタ−は pＬＧＶ２３８１と呼ばれる。
全ての組換えプラスミドはＥ.coli株ＨＢ１０１の形質
転換により選択する。
限フラグメントＨind III−２３ をインビトロで処理し
て nos暗号配列の大部分を除去する一方、制限エンドヌ
クレア−ゼサイトＢamＨＩに隣接している nosプロモ−
タ−は保持する (図１８)。１０μg の pＧＶ０４２２
(完全な nos 遺伝子を含むＨind III−２３ フラグメン
トを持った pＢＲ３２２誘導体; Ｄepickerら, Ｐlasmi
d (１９８０), １９３−２１１)をＳau ３Ａで消化し、
nosプロモ−タ−を含んだ３５０bp のフラグメントを
プレパラティブ５％ポリアクリルアミドゲルで分離す
る。このプロモ−タ−フラグメントを、５'−末端燐酸
エステル基を除去するために予め細菌性アルカリホスフ
ァタ−ゼ(ＢＡＰ)で処理した、Ｂgl II−切断 pＫＣ７
(Ｒao ら、Ｇene７(１９７９),７９−８２) に結合させ
る。得られたプラスミド(pＬＧＶ１３)２０μgをＢgl I
Iで消化し、４００μlの１２mＭ ＭgＣl2、１２mＭ Ｃa
Ｃl2、０.６Ｍ ＮaＣl、１mＭ ＥＤＴＡおよび２０mＭ
トリス−ＨＣl(pＨ８.０)中、３０℃でＢal３１エキソ
ヌクレア−ゼ(Ｂiolabs, Ｎew Ｅngland)７単位を用い
て４〜１０分間処理する。この間、約２０〜５０bpのＤ
ＮＡが除去される。このＢal３１−処理分子をＢamＨＩ
で消化した後、ＤＮＡポリメラ−ゼのＫlenowフラグメ
ントと４つのデオキシヌクレオシドトリホスフェ−ト
(それぞれ１０mＭ)と共にインキュベ−トして、その末
端を満たす。充填されたＢamＨＩ末端とＢal３１除去末
端とのライゲ−ションから得られる再生ＢamＨＩサイト
を持ったプラスミドを選別する。いくつかの候補のＢam
ＨＩ−Ｓac II フラグメントのサイズを６％尿素−ポリ
アクリルアミドゲル中で見積り、サイズが２００〜２８
０ヌクレオチドの範囲にある候補のヌクレオチド配列を
決定する。プロモ−タ−を持った２０３bp の ＳacII−
ＢamＨＩフラグメントを含んでいるクロ−ン pＬＧＶ８
１を、 pＧＶ０４２２の nos 遺伝子中のＳac II−Ｂa
mＨＩ フラグメントと置換するのに使用する: この最終
プロモ−タ−ベクタ−は pＬＧＶ２３８１と呼ばれる。
全ての組換えプラスミドはＥ.coli株ＨＢ１０１の形質
転換により選択する。
【００９８】この様に処理した nosプロモ−タを含んで
いるプラスミドベクタ−をＢamＨＩで消化し、ＢamＨＩ
フラグメントに含まれている ocsの暗号配列をこのサイ
トに挿入する。この ocs暗号配列も、インビトロで処理
し、図１９に示した様に、ＢamＨＩ制限エンドヌクレア
−ゼサイトで囲まれる様にする。オクトピンＴi プラス
ミドＢ６Ｓ３の ＢamＨＩフラグメント１７a １０μg
(Ｄe Ｖos ら, Ｐlasmid ６(１９８１),２４９−２５
３)をＢamＨＩおよびＳmaＩで消化し、ocs‐暗号配列を
含むフラグメントを１％アガロ−スゲルから分離し、 p
ＢＲ３２２の大きいＢamＨＩ−ＰvuIIフラグメントに結
合させる ; 得られたプラスミド、 pＡＧＶ８２８(２０
μg)をＢamＨＩで消化し、図１８に示した様にエキソヌ
クレア−ゼＢal３１で処理し、次いでＨindIIIで消化
し、末端を充填し、自己結合させる。Ｂal３１除去体の
サイズは６％ポリアクリルアミドゲル中で見積る。いく
つかの候補のヌクレオチド配列を決定し、５'−非翻訳
リ−ダ−配列の残り７bpだけを持った候補を選択して以
下の操作に付す( pＯＣＳΔ)。ocs 配列をＢamＨＩサイ
トで囲むために、ＣlaＩ−ＲsaＩフラグメントを充填
し、pＬＣ２３６(Ｒemautら、Ｇene １５(１９８１),
８１−９３) のＢalＩサイトにサブクロ−ンする。得ら
れたプラスミド pＡＧＶ４０をＢamＨＩで消化し、ocs
配列を持ったフラグメントをプレパラティブ１％アガロ
−スゲルから電気溶出により分離し、予めＢamＨＩで消
化しＢＡＰ(細菌性アルカリホスファタ−ゼ)で処理した
pＬＧＶ２３８１に結合させる。ocs 配列の pＬＧＶ２
３８１への挿入により、両方の配向のものが得られる(p
ＮＯ−１および pＮＯ−２)。
いるプラスミドベクタ−をＢamＨＩで消化し、ＢamＨＩ
フラグメントに含まれている ocsの暗号配列をこのサイ
トに挿入する。この ocs暗号配列も、インビトロで処理
し、図１９に示した様に、ＢamＨＩ制限エンドヌクレア
−ゼサイトで囲まれる様にする。オクトピンＴi プラス
ミドＢ６Ｓ３の ＢamＨＩフラグメント１７a １０μg
(Ｄe Ｖos ら, Ｐlasmid ６(１９８１),２４９−２５
３)をＢamＨＩおよびＳmaＩで消化し、ocs‐暗号配列を
含むフラグメントを１％アガロ−スゲルから分離し、 p
ＢＲ３２２の大きいＢamＨＩ−ＰvuIIフラグメントに結
合させる ; 得られたプラスミド、 pＡＧＶ８２８(２０
μg)をＢamＨＩで消化し、図１８に示した様にエキソヌ
クレア−ゼＢal３１で処理し、次いでＨindIIIで消化
し、末端を充填し、自己結合させる。Ｂal３１除去体の
サイズは６％ポリアクリルアミドゲル中で見積る。いく
つかの候補のヌクレオチド配列を決定し、５'−非翻訳
リ−ダ−配列の残り７bpだけを持った候補を選択して以
下の操作に付す( pＯＣＳΔ)。ocs 配列をＢamＨＩサイ
トで囲むために、ＣlaＩ−ＲsaＩフラグメントを充填
し、pＬＣ２３６(Ｒemautら、Ｇene １５(１９８１),
８１−９３) のＢalＩサイトにサブクロ−ンする。得ら
れたプラスミド pＡＧＶ４０をＢamＨＩで消化し、ocs
配列を持ったフラグメントをプレパラティブ１％アガロ
−スゲルから電気溶出により分離し、予めＢamＨＩで消
化しＢＡＰ(細菌性アルカリホスファタ−ゼ)で処理した
pＬＧＶ２３８１に結合させる。ocs 配列の pＬＧＶ２
３８１への挿入により、両方の配向のものが得られる(p
ＮＯ−１および pＮＯ−２)。
【００９９】nos : ocs 融合の正確な接合点を示すヌク
レオチド配列を図２０に示す。
レオチド配列を図２０に示す。
【０１００】更に、処理した nosプロモ−タ−を含有し
ているプラスミドベクタ−は、酵素ジヒドロフオレ−ト
レダクタ−ゼを暗号化しているプラスミドＲ６７からの
ＤＮＡを挿入するのに使用される。ジヒドロフオレ−ト
レダクタ−ゼ遺伝子を含んでいる暗号配列は、ＢamＨＩ
に含まれており(Ｏ'Ｈareら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓ
ci．ＵＳＡ ７８ (１９８１),１５２７−１５３１)、
従って既述した様に、プロモ−タ−領域に隣接するＢam
ＨＩサイトを含んでいる nosプロモ−タ−ベクタ−に容
易に挿入される。この遺伝子は、発現されると抗生物質
メトトレキセ−トに対する耐性を付与するので、選択可
能なマ−カ−遺伝子の１つの例である(図２, ３, ４,
５および７参照)。この中間クロ−ニングベクタ−が野
生型ノパリンアクセプタ−Ｔi プラスミドを含んでいる
Ａgrobacteriumに授動されると、単一乗換えが起り、ハ
イブリッドＴi プラスミドベクタ−が得られる。このベ
クタ−組成物を、植物の感染に使用する。得られた腫瘍
組織は、０.５μg／mlのメトトレキセ−トの存在下で継
続して生長し得ることがわかった。
ているプラスミドベクタ−は、酵素ジヒドロフオレ−ト
レダクタ−ゼを暗号化しているプラスミドＲ６７からの
ＤＮＡを挿入するのに使用される。ジヒドロフオレ−ト
レダクタ−ゼ遺伝子を含んでいる暗号配列は、ＢamＨＩ
に含まれており(Ｏ'Ｈareら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓ
ci．ＵＳＡ ７８ (１９８１),１５２７−１５３１)、
従って既述した様に、プロモ−タ−領域に隣接するＢam
ＨＩサイトを含んでいる nosプロモ−タ−ベクタ−に容
易に挿入される。この遺伝子は、発現されると抗生物質
メトトレキセ−トに対する耐性を付与するので、選択可
能なマ−カ−遺伝子の１つの例である(図２, ３, ４,
５および７参照)。この中間クロ−ニングベクタ−が野
生型ノパリンアクセプタ−Ｔi プラスミドを含んでいる
Ａgrobacteriumに授動されると、単一乗換えが起り、ハ
イブリッドＴi プラスミドベクタ−が得られる。このベ
クタ−組成物を、植物の感染に使用する。得られた腫瘍
組織は、０.５μg／mlのメトトレキセ−トの存在下で継
続して生長し得ることがわかった。
【０１０１】ocs および上記のnos プロモ−タ−の後の
ジヒドロフオレ−トレダクタ−ゼ暗号領域を含んでいる
中間クロ−ニングベクタ−を組み立て、Ａgro‐bacteri
umのＴi プラスミドと相互組込みした後、形質転換植物
細胞に転移、発現させることにより、本発明方法によっ
て外来性遺伝子を植物細胞に転移し、発現させることが
できるということが証明される。
ジヒドロフオレ−トレダクタ−ゼ暗号領域を含んでいる
中間クロ−ニングベクタ−を組み立て、Ａgro‐bacteri
umのＴi プラスミドと相互組込みした後、形質転換植物
細胞に転移、発現させることにより、本発明方法によっ
て外来性遺伝子を植物細胞に転移し、発現させることが
できるということが証明される。
【０１０２】実施例５ 染色体中に所望の挿入遺伝子を
含む植物細胞および植物の分離本発明者らは、以下の３
つの方法のいづれかを使って、非腫瘍性アクセプタ−Ｔ
i プラスミド誘導体( 例えば pＧＶ３８５０)で形質転
換された植物細胞および全植物を得た。 (１) インビボでの全植物の接種、次いで新芽の再生が
可能な培地上、インビトロでの培養、(２)損傷部位で直
接新芽の生成を促す他のＡgrobacteria株の存在下、イ
ンビボにおける全植物の相互感染、(３)インビトロでの
単一植物細胞プロトプラストの共生培養。これらの方法
について以下に詳述する。
含む植物細胞および植物の分離本発明者らは、以下の３
つの方法のいづれかを使って、非腫瘍性アクセプタ−Ｔ
i プラスミド誘導体( 例えば pＧＶ３８５０)で形質転
換された植物細胞および全植物を得た。 (１) インビボでの全植物の接種、次いで新芽の再生が
可能な培地上、インビトロでの培養、(２)損傷部位で直
接新芽の生成を促す他のＡgrobacteria株の存在下、イ
ンビボにおける全植物の相互感染、(３)インビトロでの
単一植物細胞プロトプラストの共生培養。これらの方法
について以下に詳述する。
【０１０３】最初の方法は、クラウンガル組織の生産を
もたらす全植物組織の野生型Ａgrobacterium株による感
染体を得る為に通常使用される方法を改良したものであ
る。pＧＶ３８５０は腫瘍を形成しないＡgrobacterium
誘導体であるので、感染部位において腫瘍の増殖はみら
れない。しかし感染した組織を取り除き、組織培養で増
殖させると、形質転換された組織を容易に得ることがで
きる。初期培養期間(単に組織の量を増やすため)の後、
損傷部位組織を新芽形成が可能な条件下で増殖させる。
非形質転換細胞および pＧＶ３８５０−形質転換細胞の
両者が新芽を発生する。形質転換新芽は、ノパリンの存
在をみる簡単な分析により容易に区別することができ
る。
もたらす全植物組織の野生型Ａgrobacterium株による感
染体を得る為に通常使用される方法を改良したものであ
る。pＧＶ３８５０は腫瘍を形成しないＡgrobacterium
誘導体であるので、感染部位において腫瘍の増殖はみら
れない。しかし感染した組織を取り除き、組織培養で増
殖させると、形質転換された組織を容易に得ることがで
きる。初期培養期間(単に組織の量を増やすため)の後、
損傷部位組織を新芽形成が可能な条件下で増殖させる。
非形質転換細胞および pＧＶ３８５０−形質転換細胞の
両者が新芽を発生する。形質転換新芽は、ノパリンの存
在をみる簡単な分析により容易に区別することができ
る。
【０１０４】本発明者らは、次のプロトコ−ルに従っ
て、Ｎicotiana tabacum Ｗisconsin３８の頭部を切断
したタバコの苗木から、pＧＶ３８５０−形質転換カル
スおよび新芽を得た(全ての操作はラミナ−フロ−フ−
ド中、無菌条件下で行なった)。 (１)小さなびん(直径１０cm、高さ１０cm)の中で、０.
８％の寒天を含む固形のＭurashige ＆ Ｓkoog(ＭＳ)
培地 (Ｍurashige および Ｓkoog,Ｐhysiol．Ｐlant．
１５(１９６２), ４７３−４９７) で生育させた６周令
のタバコの苗木を使用する。 (２)外科用メスで最も若い頭頂の葉を切り取って捨て
る。 (３)選択的条件 (例えばＴi プラスミド pＧＶ３８５０
を含んでいるリファンピシン耐性、アンピシリン耐性Ａ
grobacterium株の場合は、１００μg／mlのリファンピ
シンと１００μg／mlのカルベニシリンを含んでいるＹ
ＥＢ培地を使用する; ＹＥＢ培地＝５g／Ｌ Ｂacto ビ
−フエキス、１g／Ｌ Ｂacto 酵母エキス、５g／Ｌ ペ
プトン、５g／Ｌ シュクロ−ス、２×１０-3 Ｍ ＭgＳ
Ｏ4 , pＨ７.２, １５g／Ｌ 寒天)で増殖させた新鮮な
平板培養からのＡgrobacteriumを、スパ−テルまたはつ
まようじで損傷表面に接種する。各 pＧＶ３８５０組み
立て物を、少なくとも８本の苗木に接種する。 (４)２週間インキュベ−トする。接種部位にほとんどあ
るいは全く反応が表われないはずであるが、時々非常に
小さいカルス(calli)が観察される。 (５)損傷表面から厚さ１mm以下の薄い切片を切り取る。
損傷表面を、オ−キシンおよびサイトキニン(１mg／Ｌ
ＮＡＡ、０.２mg／Ｌ ＢＡＰ)および１％シュクロ−ス
を添加したＬinsmaier ＆ Ｓkoog(ＬＳ)寒天培地(Ｌins
maier and Ｓkoog,Ｐhysiol．Ｐlant．１８ (１９６
５),１００−１２７)を含む平板上で培養する。 (６)約６週間後、カルスはその一部をとってノパリンの
存在を試験するのに十分なだけの大きさになる(少なく
とも直径が約５mmになる)。全ての損傷カルスがノパリ
ンを生産する訳ではない。４本の植物の内約１本がノパ
リン陽性損傷カルスをつくる。 (７)ノパリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平板に移
す: 上記のＬＳ培地＋１％シュクロ−スおよび１mg／Ｌ
ＢＡＰサイトキニン (８)約４〜６週間後に良好なサイズの新芽(高さ１cm)が
出る。更に成長させ、根を形成させるために、この新芽
を、ホルモンを含まないＬＳ培地＋１％シュクロ−スを
含有している新しい寒天平板に移す。 (９)ノパリンの存在を試験するのに、その一部(１〜２
枚の小さな葉)を切り取れる様に、この新芽を１〜２週
間成長させる。 (１０)ノパリン陽性の新芽を、(１)と同じＭＳ培地を入
れたやや大きい容器(上記と同じ１０cmのびん)に移し、
更に成長させる。 注) 感染させた組織のための全ての植物培養培地には、
pＧＶ３８５０含有Ａgrobacteriumに対する選択的毒物
として、抗生物質セフオタキシム(cefotaxime、Ｃlafor
anR 、ヘキスト)５００μg／mlが含まれている。この薬
物は、全てのＡgrobacterium(カルベニシリン耐性のも
のを含む)の生長をよく阻止する。
て、Ｎicotiana tabacum Ｗisconsin３８の頭部を切断
したタバコの苗木から、pＧＶ３８５０−形質転換カル
スおよび新芽を得た(全ての操作はラミナ−フロ−フ−
ド中、無菌条件下で行なった)。 (１)小さなびん(直径１０cm、高さ１０cm)の中で、０.
８％の寒天を含む固形のＭurashige ＆ Ｓkoog(ＭＳ)
培地 (Ｍurashige および Ｓkoog,Ｐhysiol．Ｐlant．
１５(１９６２), ４７３−４９７) で生育させた６周令
のタバコの苗木を使用する。 (２)外科用メスで最も若い頭頂の葉を切り取って捨て
る。 (３)選択的条件 (例えばＴi プラスミド pＧＶ３８５０
を含んでいるリファンピシン耐性、アンピシリン耐性Ａ
grobacterium株の場合は、１００μg／mlのリファンピ
シンと１００μg／mlのカルベニシリンを含んでいるＹ
ＥＢ培地を使用する; ＹＥＢ培地＝５g／Ｌ Ｂacto ビ
−フエキス、１g／Ｌ Ｂacto 酵母エキス、５g／Ｌ ペ
プトン、５g／Ｌ シュクロ−ス、２×１０-3 Ｍ ＭgＳ
Ｏ4 , pＨ７.２, １５g／Ｌ 寒天)で増殖させた新鮮な
平板培養からのＡgrobacteriumを、スパ−テルまたはつ
まようじで損傷表面に接種する。各 pＧＶ３８５０組み
立て物を、少なくとも８本の苗木に接種する。 (４)２週間インキュベ−トする。接種部位にほとんどあ
るいは全く反応が表われないはずであるが、時々非常に
小さいカルス(calli)が観察される。 (５)損傷表面から厚さ１mm以下の薄い切片を切り取る。
損傷表面を、オ−キシンおよびサイトキニン(１mg／Ｌ
ＮＡＡ、０.２mg／Ｌ ＢＡＰ)および１％シュクロ−ス
を添加したＬinsmaier ＆ Ｓkoog(ＬＳ)寒天培地(Ｌins
maier and Ｓkoog,Ｐhysiol．Ｐlant．１８ (１９６
５),１００−１２７)を含む平板上で培養する。 (６)約６週間後、カルスはその一部をとってノパリンの
存在を試験するのに十分なだけの大きさになる(少なく
とも直径が約５mmになる)。全ての損傷カルスがノパリ
ンを生産する訳ではない。４本の植物の内約１本がノパ
リン陽性損傷カルスをつくる。 (７)ノパリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平板に移
す: 上記のＬＳ培地＋１％シュクロ−スおよび１mg／Ｌ
ＢＡＰサイトキニン (８)約４〜６週間後に良好なサイズの新芽(高さ１cm)が
出る。更に成長させ、根を形成させるために、この新芽
を、ホルモンを含まないＬＳ培地＋１％シュクロ−スを
含有している新しい寒天平板に移す。 (９)ノパリンの存在を試験するのに、その一部(１〜２
枚の小さな葉)を切り取れる様に、この新芽を１〜２週
間成長させる。 (１０)ノパリン陽性の新芽を、(１)と同じＭＳ培地を入
れたやや大きい容器(上記と同じ１０cmのびん)に移し、
更に成長させる。 注) 感染させた組織のための全ての植物培養培地には、
pＧＶ３８５０含有Ａgrobacteriumに対する選択的毒物
として、抗生物質セフオタキシム(cefotaxime、Ｃlafor
anR 、ヘキスト)５００μg／mlが含まれている。この薬
物は、全てのＡgrobacterium(カルベニシリン耐性のも
のを含む)の生長をよく阻止する。
【０１０５】本発明者らの研究室で、形質転換された新
芽を出す組織を得る別の方法が開発された。この方法
は、Ａgrobacteriumのある種のミュ−タントＴiプラス
ミド株が、新芽を出すクラウンガル腫瘍を生成させると
いうことを観察したことに基いて開発された。この様な
新芽−誘起(shi)に関する突然変異は、Ａ．tumefaciens
のＴiプラスミドのＴ−ＤＮＡ(転移ＤＮＡセグメント)
の特定の領域に位置している(Ｌeemansら, ＥＭＢＯ
Ｊ．１(１９８２), １４７−１５２; Ｊoosら, Ｃell
３２(１９８３), １０５７−１０６７)。誘起された新
芽は完全に正常な非形質転換細胞で構成されていること
が多い。従って本発明者らは、２つの異なったＡgrobac
teria、即ち１つはオクトピンＴiプラスミド放出(shoot
er)ミュ−タントを持ったもの、もう１つはpＧＶ３８５
０を持ったもの、の混合物で植物を接種した。この様に
することは、オクトピン放出ミュ−テ−ションが、pＧ
Ｖ３８５０で形質転換された根を誘起することが出来る
よい機会を与える。ＴiプラスミドpＧＶ３８５０および
オクトピン新芽誘起Ｔiプラスミドを５:１の割合で含ん
でいるＡgrobacteriumを植物に接種した。こうすること
によりpＧＶ３８５０−形質転換新芽を得た。この新芽
は、ノパリンの存在について分析することにより、容易
に選別することができる。この方法は、精功な組織培養
法を必要としない。ノパリン陽性新芽を、更に成長させ
るために、長調節ホルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含
んだ培地に移す。新芽が十分な大きさに達した後、容易
に繁殖の為の土壌に移すことができる。この共感染法
は、簡単に組織培養しにくい種類の植物を形質転換する
のに特に有用である。従って、あらゆる範囲の農学的に
あるいは経済的に重要な植物、例えば豆科植物、薬用植
物および装飾植物をＡgrobacteriumで処置することがで
きよう。
芽を出す組織を得る別の方法が開発された。この方法
は、Ａgrobacteriumのある種のミュ−タントＴiプラス
ミド株が、新芽を出すクラウンガル腫瘍を生成させると
いうことを観察したことに基いて開発された。この様な
新芽−誘起(shi)に関する突然変異は、Ａ．tumefaciens
のＴiプラスミドのＴ−ＤＮＡ(転移ＤＮＡセグメント)
の特定の領域に位置している(Ｌeemansら, ＥＭＢＯ
Ｊ．１(１９８２), １４７−１５２; Ｊoosら, Ｃell
３２(１９８３), １０５７−１０６７)。誘起された新
芽は完全に正常な非形質転換細胞で構成されていること
が多い。従って本発明者らは、２つの異なったＡgrobac
teria、即ち１つはオクトピンＴiプラスミド放出(shoot
er)ミュ−タントを持ったもの、もう１つはpＧＶ３８５
０を持ったもの、の混合物で植物を接種した。この様に
することは、オクトピン放出ミュ−テ−ションが、pＧ
Ｖ３８５０で形質転換された根を誘起することが出来る
よい機会を与える。ＴiプラスミドpＧＶ３８５０および
オクトピン新芽誘起Ｔiプラスミドを５:１の割合で含ん
でいるＡgrobacteriumを植物に接種した。こうすること
によりpＧＶ３８５０−形質転換新芽を得た。この新芽
は、ノパリンの存在について分析することにより、容易
に選別することができる。この方法は、精功な組織培養
法を必要としない。ノパリン陽性新芽を、更に成長させ
るために、長調節ホルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含
んだ培地に移す。新芽が十分な大きさに達した後、容易
に繁殖の為の土壌に移すことができる。この共感染法
は、簡単に組織培養しにくい種類の植物を形質転換する
のに特に有用である。従って、あらゆる範囲の農学的に
あるいは経済的に重要な植物、例えば豆科植物、薬用植
物および装飾植物をＡgrobacteriumで処置することがで
きよう。
【０１０６】第３の方法は、Ｎicotiana tabacumプロト
プラストの単離およびホルモン−非依存性のＴ−ＤＮＡ
−形質転換細胞クロ−ンの選択を、そのプロトプラスト
−由来細胞と腫瘍性Ａgrobacterium株との共培養後に実
施し得るものである。他の優勢な選択マ−カ−、例えば
高等植物細胞で発現される様に組み立てられた抗生物質
耐性遺伝子を使用すれば(実施例３参照)、形質転換細胞
を選択するのに類似の方法を使用することができる。し
かしこの場合は、それぞれのケ−スについて選択の最適
条件をみつける必要がある(選択剤の濃度、形質転換と
選択の間の時間、選択培地中のプロトプラスト−由来細
胞または細胞コロニ−の濃度など)。形質転換細胞の選択
ができない場合、例えばpＧＶ３８５０またはpＧＶ２２
１７(Ｌeemansら, ＥＭＢＯ Ｊ．１(１９８２),１４７
−１５２)の様な非毒性のＴ−ＤＮＡミュ−タントを用
いたために選択が不可能な場合は、遺伝学的形質転換の
後に細胞をオ−キシン−およびサイトキニン−含有培地
(例えば２mg／Ｌ のＮＡＡ(α−ナフタレン酢酸)および
０.３mg／Ｌのカイネチンを含むＭurashigeおよびＳkoo
g培地(ＭurashigeおよびＳkoog, Ｐhysiol．Ｐlant １
５(１９６２),４７３−４９７))で培養し、形質転換コ
ロニ−をそのオパイン(opine)含有量で同定することが
できる。この様にして、アグロピン(agropine)およびマ
ノピン(mannopine)合成の電気泳動分析(方法については
Ｌeemansら, Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８１),
１４９−１６４参照)の後、約６６０コロニ−が、pＧＶ
２２１７で感染後に得られ、ＴＲ−暗号化オパイン・マ
ノピン(Ｎ2−(１−マニチル)−グルタミン)を合成する
Ｎicotiana tabacum ＳＲ１セルラインであることがわ
かった。このセルラインのカルス切片を再生培地(唯一
の植物成長調節剤としてＢＡＰ(６−ベンジルアミノプ
リン)(１mg／Ｌ)を含む Ｍurashige and Ｓkoog培地)上
で培養すると、数多くの新芽が形成した。分析した２０
の新芽の全てが、依然としてマノピンを合成することが
できた。ホルモンを含まないＭurashige and Ｓkoog培
地に移した後、これらの新芽は、依然としてマノピンを
含有し、形態学的に正常なタバコ植物に成長した。
プラストの単離およびホルモン−非依存性のＴ−ＤＮＡ
−形質転換細胞クロ−ンの選択を、そのプロトプラスト
−由来細胞と腫瘍性Ａgrobacterium株との共培養後に実
施し得るものである。他の優勢な選択マ−カ−、例えば
高等植物細胞で発現される様に組み立てられた抗生物質
耐性遺伝子を使用すれば(実施例３参照)、形質転換細胞
を選択するのに類似の方法を使用することができる。し
かしこの場合は、それぞれのケ−スについて選択の最適
条件をみつける必要がある(選択剤の濃度、形質転換と
選択の間の時間、選択培地中のプロトプラスト−由来細
胞または細胞コロニ−の濃度など)。形質転換細胞の選択
ができない場合、例えばpＧＶ３８５０またはpＧＶ２２
１７(Ｌeemansら, ＥＭＢＯ Ｊ．１(１９８２),１４７
−１５２)の様な非毒性のＴ−ＤＮＡミュ−タントを用
いたために選択が不可能な場合は、遺伝学的形質転換の
後に細胞をオ−キシン−およびサイトキニン−含有培地
(例えば２mg／Ｌ のＮＡＡ(α−ナフタレン酢酸)および
０.３mg／Ｌのカイネチンを含むＭurashigeおよびＳkoo
g培地(ＭurashigeおよびＳkoog, Ｐhysiol．Ｐlant １
５(１９６２),４７３−４９７))で培養し、形質転換コ
ロニ−をそのオパイン(opine)含有量で同定することが
できる。この様にして、アグロピン(agropine)およびマ
ノピン(mannopine)合成の電気泳動分析(方法については
Ｌeemansら, Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８１),
１４９−１６４参照)の後、約６６０コロニ−が、pＧＶ
２２１７で感染後に得られ、ＴＲ−暗号化オパイン・マ
ノピン(Ｎ2−(１−マニチル)−グルタミン)を合成する
Ｎicotiana tabacum ＳＲ１セルラインであることがわ
かった。このセルラインのカルス切片を再生培地(唯一
の植物成長調節剤としてＢＡＰ(６−ベンジルアミノプ
リン)(１mg／Ｌ)を含む Ｍurashige and Ｓkoog培地)上
で培養すると、数多くの新芽が形成した。分析した２０
の新芽の全てが、依然としてマノピンを合成することが
できた。ホルモンを含まないＭurashige and Ｓkoog培
地に移した後、これらの新芽は、依然としてマノピンを
含有し、形態学的に正常なタバコ植物に成長した。
【０１０７】Ｎ.tabacumについて次に記載するプロトプ
ラストの分離および形質転換法は、Ｎ.plumbaginifolia
にも用いることができる。
ラストの分離および形質転換法は、Ｎ.plumbaginifolia
にも用いることができる。
【０１０８】２．実験手法 ２.１．新芽培養条件 培養室内の無菌条件下(１日１６時間、１５００ルック
スの白色蛍光("ＡＣＥＣ ＬＦ ５８Ｗ/２４３００゜Ｋ
Ｅconomy")、２４℃、相対湿度７０％)、２５０ml のガ
ラスびんに入れたホルモン不含のＭurashige and Ｓkoo
g培地(ＭurashigeおよびＳkoog, Ｐhysiol．Ｐlant １
５(１９６２), ４７３−４９７)上でＮicotiana tabac
umの新芽培養を維持する。５週令の新芽培養をプロトプ
ラストの分離に使用する。
スの白色蛍光("ＡＣＥＣ ＬＦ ５８Ｗ/２４３００゜Ｋ
Ｅconomy")、２４℃、相対湿度７０％)、２５０ml のガ
ラスびんに入れたホルモン不含のＭurashige and Ｓkoo
g培地(ＭurashigeおよびＳkoog, Ｐhysiol．Ｐlant １
５(１９６２), ４７３−４９７)上でＮicotiana tabac
umの新芽培養を維持する。５週令の新芽培養をプロトプ
ラストの分離に使用する。
【０１０９】２.２．プロトプラストの分離 プロトプラストの分離および培養における全ての工程は
無菌操作で行なう。混合酵素法によりプロトプラストを
分離する。長さ２cm以下の非常に若い葉を除く、全ての
葉をプロトプラストの分離に使用することができる。鋭
利な外科用のメスで、葉を幅約２−３mmの細長い小片に
切断する。この葉材料２〜３gを、酵素混合物５０ml
中、暗所で、２４℃にて１８時間静置培養する。この酵
素混合物は、ホルモン不含のＫ３培地中、０.５％セル
ラ−ゼＯnozuka Ｒ−１０および０.２％マセロザイムＯ
nozukaＲ−１０からなっている(ＮagyおよびＭaliga,
Ｚ．Ｐflanzenphysiol．７８(１９７６), ４５３−４５
５)。この混合物は、０.２２μm細孔膜を通して濾過減
菌し、顕著な活性の低下をきたすことなく、−２０℃で
少くとも６ヵ月間貯蔵することができる。
無菌操作で行なう。混合酵素法によりプロトプラストを
分離する。長さ２cm以下の非常に若い葉を除く、全ての
葉をプロトプラストの分離に使用することができる。鋭
利な外科用のメスで、葉を幅約２−３mmの細長い小片に
切断する。この葉材料２〜３gを、酵素混合物５０ml
中、暗所で、２４℃にて１８時間静置培養する。この酵
素混合物は、ホルモン不含のＫ３培地中、０.５％セル
ラ−ゼＯnozuka Ｒ−１０および０.２％マセロザイムＯ
nozukaＲ−１０からなっている(ＮagyおよびＭaliga,
Ｚ．Ｐflanzenphysiol．７８(１９７６), ４５３−４５
５)。この混合物は、０.２２μm細孔膜を通して濾過減
菌し、顕著な活性の低下をきたすことなく、−２０℃で
少くとも６ヵ月間貯蔵することができる。
【０１１０】２.３．プロトプラスト培養 １８時間培養した後、プロトプラストを放出するために
混合物を穏やかに撹拌する。次いでこの混合物を５０μ
mのふるいを通して濾過し、濾液を１０mlの遠心管に移
す。振動バケツロ−タ−に入れて６０〜８０gで６分間
遠心分離すると、プロトプラストが暗緑色の浮遊バンド
(帯)を形成する。プロトプラストの下層の液およびペレ
ット状の残骸を、蠕動ポンプに連結した毛細管を使って
取り除く。プロトプラストを１つの遠心管に集め、培養
培地で２回洗浄する。この培養培地は、ＮＡＡ(０.１mg
／Ｌ)およびカイネチン(０.２mg／Ｌ)を成長調節剤とし
て含有するＫ３培地である(ＮagyおよびＭaliga, Ｚ．
Ｐflanzenphysiol．７８ (１９７６), ４５３−４５
５)。この培地はpＨ５.６に調節し、０.２２μmの濾過
膜を通して減菌する。２回目の洗浄の後、Ｔhoma血球計
算器(“Ａssistant", 西ドイツから入手)を用いてプロ
トプラストを計測し、最終密度１０5プロトプラスト/ml
となる様に培養培地に懸濁する。直径９cmの組織培養
用良質ペトリ皿当たり１０ml の容量でプロトプラスト
を培養する。このペトリ皿をParafilmR でシ−ルし、２
４℃で、暗所次いでかすかな光(５００〜１０００ルッ
クス)を当てて２４時間培養する。
混合物を穏やかに撹拌する。次いでこの混合物を５０μ
mのふるいを通して濾過し、濾液を１０mlの遠心管に移
す。振動バケツロ−タ−に入れて６０〜８０gで６分間
遠心分離すると、プロトプラストが暗緑色の浮遊バンド
(帯)を形成する。プロトプラストの下層の液およびペレ
ット状の残骸を、蠕動ポンプに連結した毛細管を使って
取り除く。プロトプラストを１つの遠心管に集め、培養
培地で２回洗浄する。この培養培地は、ＮＡＡ(０.１mg
／Ｌ)およびカイネチン(０.２mg／Ｌ)を成長調節剤とし
て含有するＫ３培地である(ＮagyおよびＭaliga, Ｚ．
Ｐflanzenphysiol．７８ (１９７６), ４５３−４５
５)。この培地はpＨ５.６に調節し、０.２２μmの濾過
膜を通して減菌する。２回目の洗浄の後、Ｔhoma血球計
算器(“Ａssistant", 西ドイツから入手)を用いてプロ
トプラストを計測し、最終密度１０5プロトプラスト/ml
となる様に培養培地に懸濁する。直径９cmの組織培養
用良質ペトリ皿当たり１０ml の容量でプロトプラスト
を培養する。このペトリ皿をParafilmR でシ−ルし、２
４℃で、暗所次いでかすかな光(５００〜１０００ルッ
クス)を当てて２４時間培養する。
【０１１１】２.４．共生培養による形質転換 分離５日後にプロトプラスト培養株を感染させる。Ａgr
obacteriumを液体ＬＢ培地(Ｍiller，Ｅxperiments in
Ｍolecular Ｇenetics(１９７２), ＣoldＳpring
Ｈarbor Ｌaboratory，Ｎew Ｙork)中で１８時間培養
後、２×１０9細胞/ml の密度となる様にＫ３培養培地
に再懸濁する。この懸濁液５０μl を植物プロトプラス
ト培養株に加え、ParafilmR でシ−ルした後、この培養
株を２.３.と同じ条件下で培養する。４８時間後に培養
株を１０ml の遠心管に移し、振動バケツロ−タ−に入
れ、６０〜８０gで６分間遠心分離する。浮遊バンドお
よびペレットを集め、抗生物質(カルベニシリン１００
０μg/ml またはセフォタキシム５００μg/ml )を補足
したＫ３培地(ＮagyおよびＭaliga, Ｚ．Ｐflanzen phy
siol．７８(１９７６), ４５３−４５５)１０ml に再懸
濁する。
obacteriumを液体ＬＢ培地(Ｍiller，Ｅxperiments in
Ｍolecular Ｇenetics(１９７２), ＣoldＳpring
Ｈarbor Ｌaboratory，Ｎew Ｙork)中で１８時間培養
後、２×１０9細胞/ml の密度となる様にＫ３培養培地
に再懸濁する。この懸濁液５０μl を植物プロトプラス
ト培養株に加え、ParafilmR でシ−ルした後、この培養
株を２.３.と同じ条件下で培養する。４８時間後に培養
株を１０ml の遠心管に移し、振動バケツロ−タ−に入
れ、６０〜８０gで６分間遠心分離する。浮遊バンドお
よびペレットを集め、抗生物質(カルベニシリン１００
０μg/ml またはセフォタキシム５００μg/ml )を補足
したＫ３培地(ＮagyおよびＭaliga, Ｚ．Ｐflanzen phy
siol．７８(１９７６), ４５３−４５５)１０ml に再懸
濁する。
【０１１２】培養２週間後、プロトプラスト−由来マイ
クロカルスを遠心分離し、前記と同濃度の成長調節剤お
よび抗生物質を含むがシュクロ−スに関しては０.４Ｍ
の代りに０.３Ｍ含むＫ３培地(ＮagyおよびＭaliga,
Ｚ．Ｐflanzenphysiol．７８(１９７６), ４５３−４５
５)に再懸濁する。この培地の細胞密度は約２５×１０ 3
マイクロカルス/ml に調節する。同じ条件下で更に２週
間培養した後、カルスを、前記と同濃度の抗生物質を含
むが、より低濃度のシュクロ−ス(０.２Ｍ)と成長調節
剤(ＮＡＡ０.０１mg／Ｌ 、カイネチン０.０２mg／Ｌ)
を含むＫ３培地に移す。更に２〜３週間培養後、形質転
換体と推定されるものは、その淡緑色の密な外観、およ
びより良好な成長度から認識することができる。これら
のコロニ−を、より低濃度の抗生物質(カルベニシリン
５００μg/ml またはセフオタキシム２５０μg/ml )を
含むがホルモン不含の０.６％寒天固形培地(Ｌinsmaier
およびＳkoog, Ｐhysiol．Ｐlant．１８(１９６５), １
００−１２７)に移す。形質転換体と推定されるものが
直径約３−４mmに達した時、ホルモン不含の培地で生育
しているそれらにオパイン試験を施すことができる。各
コロニ−の半分を、オクトピンおよびノパリン（Ａerts
ら, Ｐlant Ｓci．Ｌett．１７(１９７９),４３−５
０）またはアグロピンおよびマノピン(Ｌeemansら,
Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８１), １４９−１
６４)の検出に使用する。この試験により、ホルモン不
含の培地で選択されたコロニ−の形質転換された性質を
確認することができる。その後、選択されたコロニ−を
抗生物質不含の培地で培養することができる。
クロカルスを遠心分離し、前記と同濃度の成長調節剤お
よび抗生物質を含むがシュクロ−スに関しては０.４Ｍ
の代りに０.３Ｍ含むＫ３培地(ＮagyおよびＭaliga,
Ｚ．Ｐflanzenphysiol．７８(１９７６), ４５３−４５
５)に再懸濁する。この培地の細胞密度は約２５×１０ 3
マイクロカルス/ml に調節する。同じ条件下で更に２週
間培養した後、カルスを、前記と同濃度の抗生物質を含
むが、より低濃度のシュクロ−ス(０.２Ｍ)と成長調節
剤(ＮＡＡ０.０１mg／Ｌ 、カイネチン０.０２mg／Ｌ)
を含むＫ３培地に移す。更に２〜３週間培養後、形質転
換体と推定されるものは、その淡緑色の密な外観、およ
びより良好な成長度から認識することができる。これら
のコロニ−を、より低濃度の抗生物質(カルベニシリン
５００μg/ml またはセフオタキシム２５０μg/ml )を
含むがホルモン不含の０.６％寒天固形培地(Ｌinsmaier
およびＳkoog, Ｐhysiol．Ｐlant．１８(１９６５), １
００−１２７)に移す。形質転換体と推定されるものが
直径約３−４mmに達した時、ホルモン不含の培地で生育
しているそれらにオパイン試験を施すことができる。各
コロニ−の半分を、オクトピンおよびノパリン（Ａerts
ら, Ｐlant Ｓci．Ｌett．１７(１９７９),４３−５
０）またはアグロピンおよびマノピン(Ｌeemansら,
Ｊ．Ｍol．Ａppl．Ｇenet．１(１９８１), １４９−１
６４)の検出に使用する。この試験により、ホルモン不
含の培地で選択されたコロニ−の形質転換された性質を
確認することができる。その後、選択されたコロニ−を
抗生物質不含の培地で培養することができる。
【０１１３】２.５．ホルモン不含培地上の選択なしの
共生培養 形質転換細胞の為の選択ができない(例えば無毒性Ｔ−
ＤＮＡミュ−タントを使ったため)場合、またはそれが
必要でない場合(抗生物質耐性遺伝子の様な優勢な選択
し得るマ−カ−がＴ−ＤＮＡに存在している為)、プロ
トプラスト−由来細胞の処理を簡略化することができる
(ホルモン減少工程はもはや必要でない)。感染段階ま
で、プロトプラストを既述した様に処理する。細菌を加
えて４８時間後にプロトプラスト−由来細胞を遠心分離
し(６分、６０−８０g)、非常に低密度で細胞の成長を
維持することができるＡＧ培地(Ｃaboche, Ｐlanta １
４９(１９８０), ７−１８)に再懸濁する。Ｆuchs‐Ｒo
senthal 計数チエインバ−(“Ａssistant", 西ドイツよ
り入手)を使って計測し、以下の操作に必要な密度にな
る様に再懸濁する。オパイン試験のためにコロニ−を個
々に操作しなければならない場合は、低細胞密度(１ml
当たり１００プロトプラスト−由来細胞および細胞コロ
ニ−)で植えつけると、１ヵ月の培養で大きい細胞コロ
ニ−が得られる。形質転換細胞を薬物で選択できる場合
は、細胞を高密度(１０3-１０4／ml)で培養し、各タイ
プの選択に最適な時期及び濃度で、その使用する選択剤
を培地に添加する。
共生培養 形質転換細胞の為の選択ができない(例えば無毒性Ｔ−
ＤＮＡミュ−タントを使ったため)場合、またはそれが
必要でない場合(抗生物質耐性遺伝子の様な優勢な選択
し得るマ−カ−がＴ−ＤＮＡに存在している為)、プロ
トプラスト−由来細胞の処理を簡略化することができる
(ホルモン減少工程はもはや必要でない)。感染段階ま
で、プロトプラストを既述した様に処理する。細菌を加
えて４８時間後にプロトプラスト−由来細胞を遠心分離
し(６分、６０−８０g)、非常に低密度で細胞の成長を
維持することができるＡＧ培地(Ｃaboche, Ｐlanta １
４９(１９８０), ７−１８)に再懸濁する。Ｆuchs‐Ｒo
senthal 計数チエインバ−(“Ａssistant", 西ドイツよ
り入手)を使って計測し、以下の操作に必要な密度にな
る様に再懸濁する。オパイン試験のためにコロニ−を個
々に操作しなければならない場合は、低細胞密度(１ml
当たり１００プロトプラスト−由来細胞および細胞コロ
ニ−)で植えつけると、１ヵ月の培養で大きい細胞コロ
ニ−が得られる。形質転換細胞を薬物で選択できる場合
は、細胞を高密度(１０3-１０4／ml)で培養し、各タイ
プの選択に最適な時期及び濃度で、その使用する選択剤
を培地に添加する。
【０１１４】２.６．カルス組織から全植物の再生 カルス組織から正常植物を容易に得ることができる(例
えばプロトプラスト形質転換から、または全植物接種か
ら(２.７参照)得られる)。カルス組織を、１mg/ml のＢ
ＡＰを含んでいるＭurashige and Ｓkoog培地で増殖さ
せる: この培地は１〜２ヵ月後に新芽を形成させる。こ
の新芽をホルモン不含の培地に移し、根を形成させ、完
全な植物をつくらせることができる。
えばプロトプラスト形質転換から、または全植物接種か
ら(２.７参照)得られる)。カルス組織を、１mg/ml のＢ
ＡＰを含んでいるＭurashige and Ｓkoog培地で増殖さ
せる: この培地は１〜２ヵ月後に新芽を形成させる。こ
の新芽をホルモン不含の培地に移し、根を形成させ、完
全な植物をつくらせることができる。
【０１１５】２.７．タバコ苗木への腫瘍の誘導 タバコの種子(例えば裁培品種Ｗisconsin ３８)の表面
を７０％変性エタノ−ル／Ｈ2Ｏで２分間、次いで１０
％の市販の標白剤と０.１％ドデシル硫酸ナトリウム(Ｓ
ＤＳ)で処理して滅菌し、更に滅菌水で５回洗浄する。
この滅菌した種子を、Ｍurashige and Ｓkoog(０.７
％寒天)培地の塩類を含む大型試験管(幅２５mm、ポリカ
−ボネ−ト製のキップ付)にまく。次いでこの試験管を
培養室(１２,０００ルックス、１６時間照射／８時間非
照射、７０％相対湿度、２４℃)に入れて培養する。４
〜６週間経つと植物は使用できる状態になる。少なくと
もその後１ヵ月間は最適の状態を維持する。苗木は少な
くとも高さ３cmになり、４枚またはそれ以上の葉を持つ
はずである。新しい外科用メスで植物の最も若い節間を
通して横に頭部を切断する。植物の上の部分を試験管か
ら取り除き、火にかけたスパ−テルで平板寒天培養から
細菌を損傷表面に塗抹する。野生型の場合は２週間後
に、ある種の変性ミュ−タント株の場合はもっと後に腫
瘍が現れる。この方法は、タバコ(Ｎicotiana tabacu
m)、Ｎicotiana plumbaginifoliaおよびびＰetunia h
ybridaを接種するのに使われる。
を７０％変性エタノ−ル／Ｈ2Ｏで２分間、次いで１０
％の市販の標白剤と０.１％ドデシル硫酸ナトリウム(Ｓ
ＤＳ)で処理して滅菌し、更に滅菌水で５回洗浄する。
この滅菌した種子を、Ｍurashige and Ｓkoog(０.７
％寒天)培地の塩類を含む大型試験管(幅２５mm、ポリカ
−ボネ−ト製のキップ付)にまく。次いでこの試験管を
培養室(１２,０００ルックス、１６時間照射／８時間非
照射、７０％相対湿度、２４℃)に入れて培養する。４
〜６週間経つと植物は使用できる状態になる。少なくと
もその後１ヵ月間は最適の状態を維持する。苗木は少な
くとも高さ３cmになり、４枚またはそれ以上の葉を持つ
はずである。新しい外科用メスで植物の最も若い節間を
通して横に頭部を切断する。植物の上の部分を試験管か
ら取り除き、火にかけたスパ−テルで平板寒天培養から
細菌を損傷表面に塗抹する。野生型の場合は２週間後
に、ある種の変性ミュ−タント株の場合はもっと後に腫
瘍が現れる。この方法は、タバコ(Ｎicotiana tabacu
m)、Ｎicotiana plumbaginifoliaおよびびＰetunia h
ybridaを接種するのに使われる。
【０１１６】以上述べた如く、本発明は、野生型Ｔiプ
ラスミドのＴ−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブリ
ッドＴiプラスミドを保持しているＡgrobacteriumで、
初めて植物を形質転換することを可能ならしめたもので
ある。Ｔiプラスミドから植物細胞へのＤＮＡの転移に
及ぼすＴ−領域の腫瘍機能の影響は知られていないの
で、それでも所望の遺伝子を含んでいる改良Ｔ−領域の
植物細胞への転移が起ることは驚くべきことである。こ
の転移ＤＮＡは植物細胞ゲノムに相互組込みされ、安定
に保持される。更に、選択した所望の遺伝子は、その遺
伝子が適当なプロモ−タ−配列を含んでいるか、あるい
は含む様に組み立てられると発現することができる。所
望の遺伝子を含んでいる中間クロ−ニングベクタ−と、
特別に設計されたアクセプタ−Ｔiプラスミドとの間で
単一乗換えを行わせるという本発明の概念(アイディア)
は、植物細胞の形質転換の為のハイブリッドＴiプラス
ミドベクタ−の組み立てを著しく簡単なものにするもの
である。この特別に設計されたアクセプタ−Ｔiプラス
ミドは、所望の遺伝子(これは中間クロ−ニングベクタ
−の一部と同じであるかまたはこれに関連しているクロ
−ニング媒体中に挿入されている)が単一乗換えによっ
て相互組込み体を形成することができる様に、通常のク
ロ−ニング媒体のＤＮＡセグメントを含んでいる。この
クロ−ニング媒体の２つのセグメントが、組換えの為に
必要な相同領域を提供する。
ラスミドのＴ−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブリ
ッドＴiプラスミドを保持しているＡgrobacteriumで、
初めて植物を形質転換することを可能ならしめたもので
ある。Ｔiプラスミドから植物細胞へのＤＮＡの転移に
及ぼすＴ−領域の腫瘍機能の影響は知られていないの
で、それでも所望の遺伝子を含んでいる改良Ｔ−領域の
植物細胞への転移が起ることは驚くべきことである。こ
の転移ＤＮＡは植物細胞ゲノムに相互組込みされ、安定
に保持される。更に、選択した所望の遺伝子は、その遺
伝子が適当なプロモ−タ−配列を含んでいるか、あるい
は含む様に組み立てられると発現することができる。所
望の遺伝子を含んでいる中間クロ−ニングベクタ−と、
特別に設計されたアクセプタ−Ｔiプラスミドとの間で
単一乗換えを行わせるという本発明の概念(アイディア)
は、植物細胞の形質転換の為のハイブリッドＴiプラス
ミドベクタ−の組み立てを著しく簡単なものにするもの
である。この特別に設計されたアクセプタ−Ｔiプラス
ミドは、所望の遺伝子(これは中間クロ−ニングベクタ
−の一部と同じであるかまたはこれに関連しているクロ
−ニング媒体中に挿入されている)が単一乗換えによっ
て相互組込み体を形成することができる様に、通常のク
ロ−ニング媒体のＤＮＡセグメントを含んでいる。この
クロ−ニング媒体の２つのセグメントが、組換えの為に
必要な相同領域を提供する。
【０１１７】本発明方法によって調製された微生物、中
間クロ−ニングベクタ−、アクセプタ−Ｔiプラスミ
ド、およびハイブリッドプラスミドベクタ−は、１９８
３年１２月２１日、Ｇerman Ｃollectionof Ｍicroor
ganisms(ＤＳＭ)(Ｇoettingen)に寄託され、確認された
以下の培養株で例示される: (１)Ｅscherichia coli Ｋ１２ＨＢ１０１中の中間ベ
クタ−プラスミドpＡcgＢ、(２)カルベニシリン耐性ア
クセプタ−ＴiプラスミドpＧＶ３８５０を保有している
Ａgrobacterium tumefaciens Ｃ５８Ｃ１ リフアン
ピシン耐性株、(３)Ｅscherichia coli Ｋ１２株Ｋ５
１４(thr leu thi lac hsdＲ)中の中間ベクタ−プ
ラスミドpＧＶ７００、(４)Ｅscherichia coli Ｋ１
２株Ｋ５１４((３)と同じ)中の中間ベクタ−プラスミド
pＧＶ７５０、(５)カルベニシリン耐性アクセプタ−Ｔi
プラスミドpＧＶ２２６０を保有しているＡgrobacteriu
m tumefaciens Ｃ５８Ｃ１ リフアンピシン耐性株、
(６)Ｅscherichia coli Ｋ１２ ＨＢ１０１中の、ノ
パリンプロモ−タ−支配下のオクトピンシンタ−ゼ暗号
領域を保有している中間ベクタ−プラスミドpＮＯ−
１、(７)中間ベクタ−のＡgrobacteriumへの授動に使用
された株＝授動プラスミドpＧＪ２８およびＲ６４drd１
１(Ｖan Ｈauteら、ＥＭＢＯ Ｊ．２(１９８３),４１
１−４１８)を保有しているＧＪ２３; ＧＪ２３はＥsch
erichia coli Ｋ１２, ＪＣ２９２６, ＡＢ１１５７
のrecＡ誘導体である(Ｈoward−Ｆlandersら、Ｇenetic
s ４９(１９６４), ２３７−２４６)。これらの培養株
の受理番号は、それぞれ２７９２(１)、２７９８(２)、
２７９６(３)、２７９７(４)、２７９９(５)、２８３３
(６)、および２７９３(７)である。
間クロ−ニングベクタ−、アクセプタ−Ｔiプラスミ
ド、およびハイブリッドプラスミドベクタ−は、１９８
３年１２月２１日、Ｇerman Ｃollectionof Ｍicroor
ganisms(ＤＳＭ)(Ｇoettingen)に寄託され、確認された
以下の培養株で例示される: (１)Ｅscherichia coli Ｋ１２ＨＢ１０１中の中間ベ
クタ−プラスミドpＡcgＢ、(２)カルベニシリン耐性ア
クセプタ−ＴiプラスミドpＧＶ３８５０を保有している
Ａgrobacterium tumefaciens Ｃ５８Ｃ１ リフアン
ピシン耐性株、(３)Ｅscherichia coli Ｋ１２株Ｋ５
１４(thr leu thi lac hsdＲ)中の中間ベクタ−プ
ラスミドpＧＶ７００、(４)Ｅscherichia coli Ｋ１
２株Ｋ５１４((３)と同じ)中の中間ベクタ−プラスミド
pＧＶ７５０、(５)カルベニシリン耐性アクセプタ−Ｔi
プラスミドpＧＶ２２６０を保有しているＡgrobacteriu
m tumefaciens Ｃ５８Ｃ１ リフアンピシン耐性株、
(６)Ｅscherichia coli Ｋ１２ ＨＢ１０１中の、ノ
パリンプロモ−タ−支配下のオクトピンシンタ−ゼ暗号
領域を保有している中間ベクタ−プラスミドpＮＯ−
１、(７)中間ベクタ−のＡgrobacteriumへの授動に使用
された株＝授動プラスミドpＧＪ２８およびＲ６４drd１
１(Ｖan Ｈauteら、ＥＭＢＯ Ｊ．２(１９８３),４１
１−４１８)を保有しているＧＪ２３; ＧＪ２３はＥsch
erichia coli Ｋ１２, ＪＣ２９２６, ＡＢ１１５７
のrecＡ誘導体である(Ｈoward−Ｆlandersら、Ｇenetic
s ４９(１９６４), ２３７−２４６)。これらの培養株
の受理番号は、それぞれ２７９２(１)、２７９８(２)、
２７９６(３)、２７９７(４)、２７９９(５)、２８３３
(６)、および２７９３(７)である。
【０１１８】本発明の態様を色々と記述したが、その基
本的な構成を変化させれば本発明に係る方法および組成
物を利用するその他の態様が得られることは言うまでも
ない。
本的な構成を変化させれば本発明に係る方法および組成
物を利用するその他の態様が得られることは言うまでも
ない。
【図１】 アクセプタ−Ｔiプラスミドの模式図であ
る。
る。
【図２】 アクセプタ−Ｔiプラスミドに挿入される中
間クロ−ニングベクタ−の模式図である。
間クロ−ニングベクタ−の模式図である。
【図３】 アクセプタ−Ｔiプラスミドに挿入される中
間クロ−ニングベクタ−の模式図である。
間クロ−ニングベクタ−の模式図である。
【図４】 ハイブリッドＴiプラスミドベクタ−の調製
法を示す模式図である。
法を示す模式図である。
【図５】 中間クロ−ニングベクタ−の遺伝子転移過程
の概略を示す模式図である。
の概略を示す模式図である。
【図６】 Ａタイプのアクセプタ−Ｔiプラスミドの組
み立てを示す模式図である。
み立てを示す模式図である。
【図７】 中間クロ−ニングベクタ−の組み立てを示す
模式図である。
模式図である。
【図８】 Ｂタイプのアクセプタ−Ｔiプラスミドの組
み立てを示す模式図である。
み立てを示す模式図である。
【図９】 Ｂタイプのアクセプタ−Ｔiプラスミドに挿
入される中間クロ−ニングベクタ−の模式図である。
入される中間クロ−ニングベクタ−の模式図である。
【図１０】 ハイブリッドＴiプラスミドベクタ−の組
み立てを示す模式図である。
み立てを示す模式図である。
【図１１】 ５.２kb ＨindIIIフラグメントＡcgＢのp
ＢＲ３２２への挿入を示す模式図である。
ＢＲ３２２への挿入を示す模式図である。
【図１２】 ノパリンＴiプラスミドpＧＶ３８３９のＴ
−領域を示す模式図である。
−領域を示す模式図である。
【図１３】 アクセプタ−ＴiプラスミドpＧＶ３８５０
の組み立てを示す模式図である。
の組み立てを示す模式図である。
【図１４】 中間クロ−ニングベクタ−pＧＶ７００の
組み立てを示す模式図である。
組み立てを示す模式図である。
【図１５】 中間クロ−ニングベクタ−pＧＶ７５０の
構造を示す模式図である。
構造を示す模式図である。
【図１６】 中間ベクタ−pＧＶ７４５の組み立てを示
す模式図である。
す模式図である。
【図１７】 アクセプタ−プラスミドpＧＶ２２６０の
組み立てを示す模式図である。
組み立てを示す模式図である。
【図１８】 プラスミドpＬＧＶ２３８１の組み立てを
示す模式図である。
示す模式図である。
【図１９】 プラスミドpＡＧＶ１０の組み立て、およ
びその、プラスミドpＬＧＶ２３８１への挿入を示す模
式図である。
びその、プラスミドpＬＧＶ２３８１への挿入を示す模
式図である。
【図２０】 オクトピンシンタ−ゼ遺伝子暗合化領域と
融合する前後のノパリンシンタ−ゼ遺伝子のプロモ−タ
−領域の周囲のヌクレオチド配列を示す模式図である。
融合する前後のノパリンシンタ−ゼ遺伝子のプロモ−タ
−領域の周囲のヌクレオチド配列を示す模式図である。
フロントページの続き (71)出願人 390040420 Ｂｅｒｌｉｎ，ＢＲＤ (72)発明者 ジャン・ピエール・エー・ツェー・ヘルナ ルシュテーンズ ベルギー国ブリュッセル、ベー−1150番 (72)発明者 マーク・チャールズ・ヴァン・モンタギュ ー ベルギー国ブリュッセル、ベー−1050番 (72)発明者 ルイス・ラファエル・ヘレーラ・エストレ ラ ベルギー国ジェント、ベー−9000番 (72)発明者 ジャン・ジョセフ・アウグスト・リーマン ズ ベルギー国ボンハイデン、ベー−2920番
Claims (17)
- 【請求項１】 (ａ)野生型Ｔiプラスミドの内部Ｔ−Ｄ
ＮＡ配列の腫瘍の増殖を支配するＴ−ＤＮＡ遺伝子を含
まず、かつ(ｂ) (ｉ)暗号配列、および(ii)該暗号配列
の天然のプロモーター配列以外の外来性のプロモーター
配列を含むプロモーター領域であって、該プロモーター
配列は、該暗号配列を含む下流配列の転写を調整して植
物細胞中でＲＮＡを生成させるプロモーター領域、を含
む少なくとも１つの所望の遺伝子を含んでいる、ことを
特徴とする外来ＤＮＡをゲノム中に安定に組込んで含ん
でいる植物細胞。 - 【請求項２】 所望の遺伝子が構造遺伝子であり、ＲＮ
Ａがリーダー配列を含むmＲＮＡである請求項１に記載
の細胞。 - 【請求項３】 該プロモーター領域がＡgrobacterium
Ｔ−ＤＮＡのオパインシンターゼ遺伝子のプロモーター
領域である請求項１に記載の細胞。 - 【請求項４】 該プロモーター領域がノパリシンターゼ
のプロモーター領域である請求項３に記載の植物細胞。 - 【請求項５】 プロモーター配列が、下流配列の転写の
組織特異的な調整を付与するものである請求項１または
２に記載の細胞。 - 【請求項６】 組織特異的な調整が、該細胞を含む植物
の葉、根、茎または花における調整である請求項５に記
載の細胞。 - 【請求項７】 プロモーター配列が、下流配列の転写の
誘導性の調整を付与するものである請求項１または２に
記載の細胞。 - 【請求項８】 誘導性の調整が、温度、光または添加さ
れた化学的因子による調整である請求項７に記載の細
胞。 - 【請求項９】 所望の遺伝子が、植物細胞の生産物の合
成をコントロールするものである請求項１〜８のいずれ
かに記載の細胞。 - 【請求項１０】 生産物が、アミノ酸または糖類である
請求項７に記載の細胞。 - 【請求項１１】 所望の遺伝子が、外部からの病原物質
に対する保護を付与する生産物の合成をコントロールす
るものである請求項１〜８のいずれかに記載の細胞。 - 【請求項１２】 外部からの病原物質に対する保護が、
病原生物またはストレスとなる環境因子に対する耐性で
ある請求項１１に記載の細胞。 - 【請求項１３】 所望の遺伝子が、選択可能なマーカー
遺伝子である請求項１〜８のいずれかに記載の植物細
胞。 - 【請求項１４】 所望の遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子
である請求項１３に記載の細胞。 - 【請求項１５】 外来ＤＮＡが、植物細胞中で発現する
選択可能なマーカー遺伝子をさらに含んでいる請求項１
〜１４のいずれかに記載の植物細胞。 - 【請求項１６】 選択可能なマーカー遺伝子が、抗生物
質に対する耐性をコードしているものである請求項１５
に記載の細胞。 - 【請求項１７】 選択可能なマーカー遺伝子が、メトト
レキセートに対する耐性をコードしているものである請
求項１６に記載の細胞。
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|---|---|---|---|
| AT83100255-5 | 1983-01-13 | ||
| EP83100255 | 1983-01-13 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP2000186437A Pending JP2001029092A (ja) | 1983-01-13 | 2000-06-21 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
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| JP62129585A Expired - Lifetime JP2769539B2 (ja) | 1983-01-13 | 1987-05-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP63103749A Expired - Fee Related JP2726267B2 (ja) | 1983-01-13 | 1988-04-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
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|---|---|
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| DK (1) | DK173104B1 (ja) |
| IL (1) | IL70610A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JPS60500438A (ja) * | 1983-01-17 | 1985-04-04 | モンサント カンパニ− | 植物細胞を形質転換するためのプラスミド |
| SU1582990A3 (ru) * | 1983-01-17 | 1990-07-30 | Монсанто Компани (Фирма) | Способ получени трасформированных клеток двудольных растений |
| WO1984002913A1 (en) * | 1983-01-17 | 1984-08-02 | Monsanto Co | Chimeric genes suitable for expression in plant cells |
| NL8300699A (nl) * | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
| NZ207766A (en) * | 1983-04-15 | 1987-03-06 | Lubrizol Genetics Inc | Plant structural gene expression |
| NZ209338A (en) * | 1983-09-14 | 1988-02-12 | Lubrizol Genetics Inc | Plasmid for the transformation of a plant cell |
| US4658082A (en) * | 1984-07-25 | 1987-04-14 | Atlantic Richfield Company | Method for producing intact plants containing foreign DNA |
| BR8600161A (pt) * | 1985-01-18 | 1986-09-23 | Plant Genetic Systems Nv | Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio |
| US5180873A (en) * | 1985-04-16 | 1993-01-19 | Dna Plant Technology Corporation | Transformation of plants to introduce closely linked markers |
| EP0267159A3 (de) * | 1986-11-07 | 1990-05-02 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen |
| EP2077275A3 (en) | 1998-06-02 | 2009-08-12 | Nihon University | IgA nephropathy-related DNA |
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| JP2023040705A (ja) | 2021-09-10 | 2023-03-23 | 住友ゴム工業株式会社 | トランス型ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換生物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
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