JPS6339587A - 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明；１組換え分子、その調製法、ｆＩ？ｆ物細胞へ
のその導入、去、およびゲノム中に外来１）ＮＡＡ配列
含んでいる植物紺１胞まｌこはそのｈｌ’ｉ物に関する
。

更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で発現さ
れるＩ）　Ｎ　Ａ配列に関する。本発明に係る組換えＤ
　Ｎ　Ａ分子は、植物の成長、栄養物としてのその品質
の改良、よｆこは有用な代謝物（例えばアルカロイドあ
るいはステロイドの面駆体）の生産、に有用なアミノ酸
やポリペプチドの如き生産物を暗号化している配列を有
することをその特徴としている。

以下に本明細書で使用する用語について説明する。

ｂｏｍザイト　特質的にｍｏｂ機能体が相互作用して自
律的ＤＮＡ転移移動を開始させろＤ　Ｎ　Ａ　９３域奥
異聞対　Ｔ　−Ｄ　ＮＡの末端を含むＤ　Ｎ　Ａ配列広
範囲宿主レプリコン　多種多様の宿主Ｅ（ＩＩ胞に転移
（トランスファー）され、保持され得ろＤＮＡ分子 カルス組織　未組織、未分化の細胞の塊クローニング　
無性生殖により、１個の生物またはＤ　Ｎ　Ａ配列から
一部の該生物またはＤ　Ｎ　Ａ配列を得ろ操作過程、ま
たは、よりわかり易く言えば、特定の生物またはその一
部を分離し、そのサブフラクンヨンを均質な集団として
増殖させる操作過程 クローニング媒体　宿主細胞中で複製し得るプラスミド
、ファージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列であって、
そのＤＮＡ配列は、例えば複製、外殻蛋白質の生産など
、そのＤＮＡの必須の生物学的機能、あるいはプロモー
ターまたは結合部位を付随的に失なうことなく、その場
所で正確にその配列を切断することのできる１個または
少数のエンドヌタレアーゼ認識部位を持っており、また
、それか導入された細胞（形質転換されｆこ細胞）を同
定１ｉｆｉ：認するのに（Ｔ用なマーカー（例えばテト
ラサイクリン耐性あるいはアンピンリン耐性）を持って
いることで特徴づけられる。クローニング媒体は、しば
しばベクターと乙１１手ばれる。

：呈優生　　ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するＤ
　Ｎ　Ａ配列 相互組込み体（コインテグレート）２個の環状ＤＮＡ分
子間の弔−により得られろ構造体トランスｔｌｌ？＋ｉ
性−他のレプリコンに物理的に結合していないＤ　Ｎ　
Ａ分子（レプリコン）か、その結合していない他のレプ
リコンにとって必要かつ欠落している拡散性物質を供給
することができる過程 接合（フンジュゲーション）　細胞同志の接触により、
１つのタイプの細菌から池のタイプの細菌にＤＮＡが転
ｆ３すること ｐ賎、ｊ　　ｔ！］同なり　Ｎ　Ａ配列間でａ伝物質か
交換すること 欠損置換　１個のＤＮＡ配列が除去され、その代りとし
て異なったＤＮＡ配列で置換されること５）（ｔｓ　　
ある細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得し、更にそれ
を維持すること ＤＮＡ配列またはＤＮＡセグメント　隣接するペントー
スの３°位と５゛位の炭素間の燐酸ジエステル結合によ
り互いに連結したヌクレオチド群の一直線の配列 二重乗換　相互組込み（コインテグレート）構造が２個
の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程は遺伝情報
を交換するのに利用されろ。このＤＮＡ環状体の一方は
、それによって組換えが生じ得る標的ＤＮＡと相同な２
つの領域を持っており、この２つの領域は、標的ＤＮＡ
と交換される非相同ＤＮＡ配列をはさんでいる。らし１
回目の交叉と２回目の交叉が同じＤＮＡ領域で起ると、
ｔ）七のＤＮＡ環状体が生成する。この２回目の交叉が
第２の相同領域で起ると、２つの環状体の間で遺伝子の
交換が起ることになる。

発現　構ａ逍伝子によりポリペプチドが生産されろ過程
。これは転写と翻訳の組合せである。

発現調節（コントロール）配列　構造遺伝子にｒ丁効に
結合された場合、それらの構造遺伝子の発現を調節し、
統制するヌクレオチド配列 Ｆ型プラスミド　Ｆ因子（Ｆはｆｅｒｔｉｌｉｔｙ（生
殖力））を持ったプラスミドであって、Ｆ因子を持たな
い宿主に該プラスミドのコピーを移入することのできる
プラスミド 遺伝子　２つの部分、即ち（１）遺伝子生産物のための
暗号配列および（２）その遺伝子が発現されるかどうか
を調節しているプロモーター領域内の配列、から構成さ
れているＤＮＡ配列 ゲノム　細胞またはウィルスの全Ｄ　Ｎ　Ａ　０これは
、まずポリペプチドを暗号化している構造遺伝子、更に
オペレーター、プロモーター、リボゾームの結合配列お
よび相互作用配列（たとえば５ｈｉｎｅ−Ｄ　ａ１ｇａ
ｒｎｏ配列）を含んでいる。

遺伝子型　ある生物に含まれている遺伝情報の全て Ａ上の２つ領域間の組換え ！塑プラスミド　Ｆとは５■なる不和合性グループの一
昨の自律転移性 不和合性　選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕ
ｒｅ）がないと、同一の細胞に２個のＤ　Ｎ　Ａが共存
し得ないこと 挿入　あるＤＮＡ配列を、別の分子のＤＮＡ配列内に付
加すること リーダー配列　５°末端から最初の構造遺伝子の先端に
至るまでのｍＲＮＡ上の領域。これには構造遺伝子の暗
号配列の翻訳を開始するのに重要な部位が含まれている
。

減数分裂　はじめの４ｎ個の染色体が、２回の連続した
分裂により生成した４個の細胞のそれぞれにＩｎ個ずつ
分布するようになる過程。この過程は有性生殖に於いて
重要である。

ｍｏｂ　（授動機能体）　　ｔｒａ機能体との組合せに
於いてのみＤＮＡの転移を促す一連の生成物。ｍｏｂは
ｂｏｍサイトを含んでいるプラスミドの移動を促すこと
ができる。

授動（モビリゼーション）別の細胞へ転移することので
さないＤＮＡ分子が、他のＤＮＡ分子の助けを借りて転
移する過程 授動ヘルパープラスミド　他のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ転移するための拡散性生成物を供給
することができろプラスミド非接合性組換えプラスミド
　細胞同志の接触により、それ自体では、もとの宿主細
胞から池の宿主細胞へ転移することができないＤＮＡ分
子。転移するには、他のＤＮＡ、例えばヘルパープラス
ミドによって供給される機能体が必要となる。

ヌクレオチド　糖部分（ペントース）、燐酸エステルお
よび含窒素異頃環塩基から構成されているＤＮＡまたは
ＲＮＡの単量体単位。この塩基は糖部分とグリコシド結
合で連結しており（ペントースのｌ°位の炭素）、この
塩基と糖とが結合した乙のがヌクレオシドである。ヌク
レオチドの特性はこの塩基によって決まる。ＤＮＡの４
個の塩基はアデニン（“Ａ”）、グアニン（“Ｇ”）、
ントシン（“Ｃ”）およびヂミン（“Ｔ”）である。ｎ
　Ｎ　Ａの４個の塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（“
Ｕ”）である。

表現形質　発育環境と遺伝子形質との相互関係によって
生成する個体の観察し得る特性プラスミド　それ自体が
宿主細胞中で複製される、完全な（無傷の）レプリコン
からなる非染色体性の２本鎖ＤＮＡ配列。このプラスミ
ドを単細胞生物に入れると、そのプラスミドのＤＮＡに
よって、その生物の性質が変わる、即ち形質転換される
。例えば、テトラサイクリン耐性（ＴＣＲ）のための遺
伝子を持ったプラスミドにより、本来はテトラサイクリ
ンに感受性のある細胞が耐性のある細胞に形質転換され
る。プラスミドによって形質転換された細胞を形質転換
体と呼ぶ。

ポリペプチド　隣接するアミノ酸どうしがα−アミノ基
とカルボキシル基とのペプチド結合により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域　遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤ　Ｎ　Ａ配列プロモーター配
列　ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列であり、ポリメ
ラーゼはそれより下流の配列の忠実な転写を促進ずろ。

べ［Ｉ換えＤ　Ｎ　Ａ分子または雑種（ハイブリッド）
ＤＮＡ　少なくとら２１Ｔ１ｇのヌクレオチド配列から
なり、その一方の配列は、自然界では通常第２の配９１
と共存しない、その様な配列からなる雑種のＤＮＡ配列 組換え　Ｄ　Ｎ　Ａ分子またはＤＮＡ分子の一部分の新
しい結合体を創製すること 世間領域　１）　Ｎ　Ａの別の領域に於ける配列と同し
Ｄ　Ｎ　Ａ配列を持っているＩ）　Ｎ　Ａ領域レプリコ
ン　ＤＮＡの複製開始サイトおよび複製を支配するのに
必要な機能を指定している遺伝子を持った自己複製遺伝
子単位 １１ｊｌ　ＩＱフラグメント　特定の標的Ｄ　Ｎ　Ａ配
列を認識する酵素による２本鎖開裂によって生じるＤＮ
Ａ分子 ＲＮＡポリメラーゼ　ＤＮＡのＲＮＡへの転写をつかさ
どる酵素 選択可能なマーカー遺伝子　あるＤＮＡ配列であって、
それがある細胞内で発現された時、そのＤＮＡ配クリを
含んでいない細胞より増殖しやすい右利性をその細胞に
与えるＤ　Ｎ　Ａ配列。通出な細胞を選択的増殖培地に
置くと、この２つのタイプの細胞を区別することができ
ろ。通常使用される選択可能なマーカー遺伝子は抗生物
質耐性を暗号化している遺伝子である。

単一乗換　２個の環状ＤＮＡ分子を組換えて、相互組込
みされた大きい環状体を形成さＵ・る操作過程 構造遺伝子　ポリペプチドを暗号化している遣（云子 ’ｒ’　−Ｄ　Ｎ　Ａ　　植物細胞ゲノムに安定に組込
まれることが見い出されている　Ｔ１プラスミドの部分
子−領域　植物細胞ゲノムへ転移するＤ　Ｎ　Ａ配列を
含んでいるＴｉプラスミドの部分 子ｉプラスミド　感受性植物に腫瘍（クラウンガル）を
誘発させるための遺伝情報を含んでいるＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株に存在する大
きいプラスミド クラウンガル腫瘍細胞は２つのＴ−ＤＮＡ配列、即ち左
Ｔ−ＤＮＡ（ＴＬ−ＤＮＡ）および右Ｔ−ＤＮ、Ａ（Ｔ
ｌ”ｔ−ＤＮＡ）を含有し得る。ＴＬ−ＤＮＡはツバリ
ン腫）α細胞のＴ　　ＤＮＡと共通している配列を持っ
ているかＴ　Ｒ−Ｄ　Ｎ　Ａは持っていない。

ｔｒａ　（転移機能（体））　プラスミドに暗号化され
ている拡散性の生成物、および＠Ｉ　泡量のＤＮＡ転移
の際に利用されろ作用部位の両者を指す。例えば２つの
細胞の間に橋を作るのに必要な生成物およびＩ）　Ｎ　
Ａ転移か開始する部位。

（工　構造遺伝子からｍ　ＲＮ　Ａが生産される過程、
または、塩括対（ベースペア）の形成により、ＤＮＡに
含まれている遺伝情報に基きそれに相捕的な塩基配列を
らつＲＮ　Ａ鎖が形成される過程聡’ｆｒ　ｋ血　　細
胞のＤ　Ｎ　Ａ　）ｌ７体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に
外来性ＤＮＡが導入されることによって生じる遺伝的（
１飾 別汲ｍ　ＲＮ　Ａ　からポリペプチドが生産される過程
、あるいは、ｍＲＮＡ分子に（７，在する遺伝子ＩＩＩ
報が、ポリペプチド合成において特定のアミノ酸の順序
を指定する過程 非分化表現形質　いかなる特異な部分らなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクター　異なった宿主細胞間を転移するように設計さ
れたＤ　Ｎ　Ａ分子 組換えＤＮＡ技術の進歩によって、微生物の遺伝子工学
に新たな展望が開けた。らし１個の体細胞から、完全な
生物を再生することができたら、これらの技術は多細胞
真核生物にまで広がるであろう。ある種の高等植物の細
胞は、優れた再生能力ををし、従って高等生物の遺伝子
工学にとってかっこうの材料となる。

植物の遺伝子工学の主たる問題点は、外米性ＤＮＡを植
物ゲノムに導入する為の系の利用性にある。この様な系
には、ダラム陰性土壌細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓが持っている腫瘍誘起（Ｔ
　ｉ）プラスミドがある。この微生物は、広範囲の双子
葉植物の損傷組織に、クラウンガル（ｃｒ。

Ｗｎｇａｌ１、冠状コブ）と呼ばれる腫瘍性形質転換を
引き起す原因となることがわかっている。この増随性の
腫瘍は、オパイン（ｏｐｉｎｅｓ）と呼ばれる′１゛ｉ
に特異な新しい代謝物を合成する。この形質転換は、分
子レベルでみると、Ｔｉ　プラスミドの実体のはっきり
わかっている’Ｉ”　−Ｄ　ＮＡ（転（多１）　Ｎ　Ａ
　）フラグメントか植物細胞ゲノムに転移して安定に組
込まれたことによって起る。換言すれば、クラウンガル
腫瘍は、その染色体ＤＮＡに、腫瘍セルラインをしたら
したＴｉプラスミド中のＤＮＡ配列と相同のＴ−ＤＮＡ
と呼ばれるＤＮＡセグメントを含んでいる。あらゆる場
合に於いて、このＩ゛−ＤＮＡは、連続した一連のＴｉ
プラスミドＤＮＡに相当しており、また、これと共直線
性である。

従ってこれはＴ−領域と呼ばれる。

Ｔｉプラスミドはクラウンガル細胞で合成されたオパイ
ンのタイプによって分類される。クラウンガル細胞でツ
バリン［Ｎ−α−（１，３−ジカルボキシプロビル）−
Ｌ−アルギニン］の合成を惹起させるＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ株はツバリン株と呼ばれ、オクトピン［Ｎ−
α−（Ｎｌ−カルボキンエチル）−１、−アルギニン］
を合成するものはオクトピン株と呼ばれる。これらが最
ら普通に用いられるＡ　ｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍ株で
ある。

植物の遺伝手術にＴ−ＤＮＡをベクターとして使用ずろ
試みがモデル実験で行なわれた。この実験では、インビ
ボにおいて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　Ｔａ２昧
のＴｉ　プラスミドからのＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａの右側境界
部の近くに１４ｋｂ細菌性トランスポツン（Ｌｒａｎｓ
ｐｏｓｏｎ）　Ｔｎ　７が挿入された。すると、このＴ
ｉプラスミドを持っているアゲロバクチリアによって惹
起される腫瘍中のツバリン合成が消滅した。更に、サウ
ザン・プロッティング・ハイブリダイゼーションの結果
、その様な挿入を行なわなければ正常であるＴ−ＤＮＡ
配列の一部分として、この腫瘍の染色体ＤＮＡ中に全Ｔ
　ｎ７が存在することがわかった（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅ
ｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｃ２８７（１９８０）、６５４−
６５６；　Ｈｏ１ｓｔｅｒｓら、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　
Ｇｅｎｅｔ、　　１８５’　（＋　９８２）　、２８３
−２８９）。この様に、２３ｋｂＴ−ＤＮＡに！４ｋｂ
ＤＮＡ７ラグメントを導入してし、２３ｋｂＴ−ＤＮＡ
の植物細胞ゲノムへの転移能力に変化は見られなかった
。

ツバリン株、ＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｉｕｍＴ　３７のＴ
ｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界部は非常に正確に調べ
られている。これは全ツバリンＴｉプラスミドの極く一
部、約２３ｋｂに過ぎない。更に、このＴ−ＤＮＡの境
界部は知られている：即ち、このＴ−ＤＮＡの境界部を
決めているヌクレオチド配列が調べられ、ツバリンＴｉ
プラスミドの同じ領域と比較された（Ｚａｍｂｒｙｓｋ
ｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　２０９　　（１９８０）、１３
８５−１３９１；Ｚａｍｂｒｙｓｋｉら、Ｊ、　Ｍｏ１
．　Ａｐｐ１、　Ｇｅｎｅｔ、　　＋　（１９８２）、
３６１−３７０　）。このＴ−領域の境界部が、Ｔ−Ｄ
ＮＡの植物細胞ゲノムへの組込みに最も関係している様
である。

ＤＮＡを植物細胞へ転移させる為のベクターとしてＴｉ
プラスミドを使用するには、転移したＤＮＡの境界部を
決めているＴ−ＤＮＡ配列を知ることが基本的に必要で
ある。そうすれば、外来性ＤＮＡをこの境界内に挿入し
、確実に植物細胞ゲノムへ転移させることができろ。更
に、この系を利用しようとすれば、形質転換された植物
細胞が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、正
常であるということが重要である。Ｔ−ＤＮＡ転移の後
、正常細胞を生産するには、Ｔ−ＤＮＡ自体によって暗
号化されている機能を知る必要がある。

従って、どの領域が腫瘍表現形質に関係しているか調べ
るために、ＴｉプラスミドのＴ−領域の徹底的な遺伝子
分析が行なわれた。

Ｔ−ＤＮＡは、クラウンガル表現形質の原因となる機能
体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡの特定
の領域に局在化している（Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯ
Ｊ、１（１９８２）、１４７−１５２　；　Ｗｉｌｌｍ
ｉｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、Ｉ（１９８２）、１３９−
１４６　）。一般に、腫瘍カルス組織の非分化表現形質
を支配している少なくと６４つの遺伝子が存在している
。これらの遺伝子の突然変異体（ミュータント）は、新
芽様のあるいは根の様な外観の形質転換組織を形成させ
ることかて謬る。この後者の成果は、腫瘍組織ではなく
正常植物組織中で発現させる為にＤＮＡを植物に転移し
！こいと、忠う場合には特に重要である。

最近、完全な正常ｔａ物に再生することができろ形質転
換新芽を誘導するＴｉプラスミド変異体がみつかった。

これらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分裂によって
ｌ’　　Ｄ　Ｎ　Ａ特異配列を伝達することさえした：
即ち、子孫の植物らＴ　−Ｄ　ＮΔ特５υ配列を含んで
いた（　０Ｌｔｅｎら、Ｍｏ１．　ＧｅｎＧｃｎｃｔ、
１８３（１９８＋）、２０９−２１３　）。

しかし、こ７）　１ｆ３質転換植物組織は、その染色体
ＤＮＡ中に、腫瘍表現形質を支配しているＴ−ＤＮＡ領
域か除去される大がかりな欠損（欠失）が発生したこと
により、著しく小さくなったＴ−ＤＮＡを含んでいた。

この欠損が当初の形質転換時に起ったのか、新芽の形成
を乙たらすその後の過程で起ったのかは不明である。

Ｔｉ　プラスミドは太きく（２００ｋｂ）、そのＴｉプ
ラスミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子が植
物の形質転換に関係している。従って、Ｔ−領域内の適
切な場所に特殊なエンドヌクレアーゼ認識サイトを有し
、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定に挿入
するのに必要な全ての機能を１１１つた′〕゛ｌプラス
ミド由来の小型のクローニングベクターを組み立てるこ
とは不可能である。

所望のＤ　Ｎ　ＡフラグメントをＴｉ　プラスミドのＴ
−領域の特定の制限酵素開裂サイトに導入ずろ為の既知
の方法の１つは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
（大腸菌）におけると同様、Ａ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍにおいても複製することができ、Ｔ−ＤＮＡの所望
の制限フラグメントを含んているクローニングプラスミ
ドを組み立てることである。この様なりローニングベク
ターは「中間へフタ−」と命名された。この様な中間ベ
クターは、Ｔ−領域によって暗号化されている機能を分
析するのに使用された（　Ｌｅｅｍａｎｓ　ら、Ｊ、　
Ｍｏ１．　　Ａｐｐｌｎ、　　Ｇｅｎｅｔ、　　ｌ　　
（，１９８１）、＋４９−１６４）。

本発明は、発現し得る遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入す
る方法に関するものである。本発明の１つの目的は所望
のあらゆる遺伝子（群）を導入することのできる改良さ
れたアクセプターＴ１プラスミドを提供することにある
。導入される所望の遺（云子（群）は、そのアクセプタ
ーＴｉ　プラスミドの相当する領域と相同の領域を持っ
た新規な中間クローニングベクター内に含まれている。

この中間クローニングベクターを提１ノ（すること乙本
発明の１的の１つである。

所望の遺伝子（ｎ）のアクセプターＴｉ　プラスミドへ
の導入は、ＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｉＵｍに保持されてい
るアクセプターＴｉプラスミドと中間クローニングベク
ターの２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一乗換
えによって達成される。この中間クローニングベクター
は、ヘルパープラスミドを使って、それが増殖するＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉからＡｇｒｏ−’＋ａｃ
ｔｅｒｉｕｍに侵動される。この様なヘルパープラスミ
ドおよび授動のための機能は知られている（Ｆ　ｉｎｎ
ｅｇａｎ　ら、Ｍｏ１．　　Ｇｅｎ、　　Ｇｅｎｅｔ、
　　ｌ　８５　　（１９８２）、３４４−３５１：　　
Ｆｉｇｕｒｓｋｉら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７６（
１９７９）：Ｄ　１ｔｔａら、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ１
、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ７７（１９８
０）、７３４７）。

Ａｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍての単一乗換えの結果、ノ
ーイブリッド１゛ｉ　プラスミドベクターか得られる。

この様なハイブリッドＴｉ　プラスミドら本発明の目的
の１つである。

Ａｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍに保持されたこのハイブリ
ッドプラスミドベクター（以降、ベクター組成物という
）を直接植物細胞の感染に使用し、次いて所望の遺伝子
生成物の発現についてスクリーニングする。植物細胞を
ベクター組成物で感染させて形質転換植物細胞を調製す
るこの方法、その形質転換されノミ植物細胞、およびそ
れから発生した植物を提供することら本発明の目的であ
る。この技法はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの植物転移
性のプラスミド全てに適用することができる。

以下に添付の図面について詳細に説明する。

第１図は、境界配列（１）および（２）を除き、Ｔ−領
域の内部部分を除去して得られる本発明のアクセプター
Ｔｉ　プラスミドの１態様を示している。

この境界配列は、Ｔ−領域をｈａ物細胞ゲノムに組込む
のに必須である。境界配列（１）と（２）の間の領域（
３）が、植物に転移されろであろうＤＮＡセグメントで
ある。このアクセプター’１’　ｉ　プラスミドは、中
間クローニングベクターを？）１−乗換えによって組込
ま１゛ことを可能にしている中間クローニングベクター
内のＤＮＡ配列の少なくとも一部と相同のＤＮＡ配列を
持ったＤＮＡセグメント（３）を含んでいる。Ｔｉ　プ
ラスミド領域（・１）は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
によってＴ−領域が植物細胞ゲノムに転移するのに必要
な機能を暗号化している。この領域は、ｖｉｒ−領域と
呼ばれる。

第２図は、単一乗換えによって第１図のアクセプターＴ
ｉプラスミドに挿入される本発明の中間クローニングベ
クターを示している。このベクターは、所望の単一乗換
えを可能にするアクセプター　’ｒ　ｉ　プラスミドの
ＤＮＡセグメント（３）の少なくとも一部と相同なりＮ
Ａ配列を持ったクローニング媒体ＤＮＡセグメント（３
′）を含んでいる。

更に、この中間クローニングベクターは、その天然のプ
ロモーター配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群（５）
を含んでいる。この組み立てに於いては、一般に植物の
遺伝子を使用することかできる。

それは、池のものに比較して発現され易いと思われるか
らである。しかし、原理的には、全ゆろ所望の遺伝子を
挿入することができる。この中間クローニングベクター
は選択マーカー遺伝子（６）を含んでいてもよい。この
遺伝子は、植物細胞中でこの遺伝子の発現を可能にする
プロモーター配列を含んでいなければならない。このマ
ーカー遺伝子を含んでいる植物細胞は、それを含んでい
ない細胞より、成長の選択有利性を持っていなければな
らない。何故なら、この様にして、このマーカー遺伝子
を含んでいるＤＮＡによって形質転換された植物細胞を
、非形質転換細胞と区別することができるからである。

第３図は、第２図の中間クローニングベクターと類似の
、第１図のアクセプターＴｉプラスミドに単一乗換えに
よって挿入される本発明に係る中間クローニングベクタ
ーのもう１つの態様を示している。これは、クローニン
グ媒体ＤＮＡセグメント（３°）、所望の遺伝子の統制
のとれた発現を可能にする外来性プロモーター配列（８
）、および、所望により、マーカー遺伝子（６）を含ん
でいる。

第・１図は、第１図のアクセプターＴｉプラスミドおよ
び第２図並びに第３図の中間クローニングベクターから
の、単一乗換えによる本発明に係るハイブリッドＴｉプ
ラスミドベクターの調製を示す模式図である。

第５図は、Ｅ、ｃｏｌｉからアクセプターＴｉプラスミ
ドを含んでいるＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの、中
間クローニングベクターの遺伝子転移に関する諸過程を
概略したものである。第１段階は、中間クローニングベ
クターを含んでいるＥ　、　ｃｏｌｉｔ！（１）と、そ
の後のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとの接合の為の２つ
のヘルパープラスミドを含んでいるもう１つのＥ、ｃ。

ｌｉ株との接合である。■方のヘルパープラスミドはプ
ラスミド転移に重要なりＮＡ配列Ｑｒａ）を含んでおり
、他方のヘルパープラスミドは摂動に重要な配列（ｍｏ
ｂ）を含んでいる。接合によってこれらのヘルパープラ
スミドがＥ、　ｃｏｌｉ株（＋）に導入されると、そこ
に含まれている中間クローニングベクターが他の細菌株
へ転移することができる様になる。ｔｒａおよびｍｏｂ
ヘルパープラスミドは、中間クローニングベクターが持
っている抗生物質耐性マーカー（Ａｂｒｌ）トハ異ナル
マーカー、Ａｂｒ２およびＡｂ　　をそれぞれ持ってい
る。従って、全てのプラスミドが存在するかどうかを選
択培地上でモニターすることができろ。こうして摂動昧
（３）か得られる。

この摂動株（３）を、第１図のアクセプターＴ１プラス
ミドを含んでいるＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）朱
（・１）と接合させ、中間クローニングベクターの抗生
物質耐性マーカーで選択する。中間クローニングベクタ
ーはＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｉｕｍ中で複製できないので
、受容アクセプターＴｉプラスミドと相互組込み体を形
成した場合にのみ、保持されることができろ。

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中のこの相互組込み構造体
（５）が、ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させるのに使
用される最終的なハイブリッドＴｉ　プラスミドである
。

第６図は、第１図に示したしのと同類のモデルアクセプ
ターＴｉ　プラスミド（タイプＡ）の組み立てを示して
いる。ここでは、’Ｉ”　ｉプラスミドと、このらとの
Ｔｉ　プラスミドの一部と置き換わるＤＮＡ配ソリを含
んでいろ別のプラスミドとの間で、二重乗換えが起る。

より具体的に述へると、小さい方のプラスミドはクロー
ニング媒体（３）の中に′Ｉ゛−領域の境界配列（１，
２）を含んでいる。二重乗換えの結果、Ｔ領域の内部の
Ｔ部分か除去され、代ってクローニング媒体で置き換え
られる。得られたアクセプターＴｉプラスミド（Ａ）は
、境界配列（１，２）の間に含まれているＤＮＡを植物
細胞ゲノムに転移させろことができる。得られた、形質
転換されたＤＮＡは、Ｔｉ　プラスミド（Ａ）では腫瘍
の増殖を支配している遺伝子か除去されているので腫瘍
性のクラウンガル組織をつくらない。

Ｔｉプラスミド（Ａ）は、クローニング媒体（３）と相
同性を有するあらゆる中間クローニングベクター用の極
めて普遍的なアクセプターＴｉプラスミドである。この
クローニング媒体（３）は通常のプラスミドでよく、例
えばｐＢＲ３２２またはその誘導体などによって置き換
えることができる。

第７図は、中間クローニングベクターをＥ、ｃｏｌｉ宿
主Ｅ（Ｉｔ胞中て？・ＩＩみ／こてろ工程を模式的に示
しｎ５のである。制限エンドヌクレアーゼザイト■しに
囲まれた所望の遺伝子（５）および制限エンドヌクレア
ーゼザイトＲ７で囲まれた選択し得るマーカー遺伝子（
６）を、酵素Ｒ，およびＲ７の為のそれぞれ１つの制限
サイトを含んでいるクローニング媒体（３°）に挿入す
る。３つの分子を全て制限酵素Ｒ０および／またはＲ２
で消化し、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション（結
紮）して中間クローニングベクターを形成させる。この
クローニング媒体（３′）は、細菌遺伝子学の選択マー
カーとして使用する抗生物質耐性（Ａｂｒｌ）を暗号化
しているもう１つのＤ　Ｎ　Ａ配列を含んでいなければ
ならない。所望の遺伝子（５）はその天然のプロモータ
ーまたは第２図および第３図に概説した外来性プロモー
ターの支配下にある。

第８図は本発明に係るアクセプターＴｉプラスミド（タ
イプＢ）のもう１つの具体的態様を組み立てるための模
式図である。この態様では、境界配列（１）および（２
）のすぐ外側のＴｉ配列に相同の、それぞれＤＮＡ配列
（９）および（１０）を含んでいろクローニング媒体と
Ｔｉ　プラスミドとの間で二重乗換えが起る。この二重
乗換えによって、境界配列（１）および（２）を含んで
いるＴ−領域Ｔ全体が削除され、それがクローニング媒
体（３）で置き換えられる。Ｔｉプラスミド（Ｂ）は、
境界配列（１）および（２）の間にクローンされた所望
の遺伝子を含有している中間クローニングベクターのた
めのアクセプターである（第９図参照）。

第９図は、第８図のアクセプター′Ｉ″ｉプラスミド（
Ｂ）に弔−乗換えによって挿入される本発明の中間クロ
ーニングベクターを例示している。これは、所望の遺伝
子（５）の両端に位置する境界配列（１）および（２）
を含んでいる。これはまた、２つのプラスミド間の相同
的組換えを可能にするため、アクセプターＴｉ　プラス
ミド（Ｉ３）中のクローニング媒体配列と少なくとも一
部が相同であるクローニング媒体配列（３′）をも含ん
でいる。

第１０図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミドおよ
びそれに対応する第９図の中間クローニングベクターか
ら、本発明のハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組
み立てを示す模式図である。

単一乗換えによって第９図の中間クローニング媒体配列
が第８図のアクセプターＴｉ　プラスミド（Ｂ）に導入
されろ。

第１１図〜第２０図は本発明をより具体的に例示するし
のである。

第１１図は、５．２ｋｂ　＋−１ｉｎｄ　ＩＩＩフラグ
メントＡｃｇＢ　のｐＢＲ３２２への挿入を示している
（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　　ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２０９
（１９８０）。

＋３８５−１３９１）。このフラグメント　ＡｃｇＢは
ツバリンＴｉ　プラスミドの左右の境界領域を含んでい
る。このクローンｐＡｃｇＢは、第６図に示した「八−
タイプ」のアクセプタープラスミド、ｐＧＶ３’８５０
の組み立てに使用される。野生型Ｔｉ　プラスミドの左
右の境界領域を含んでいるこのクローンされた制限フラ
グメントを使って、クローンｐＡＣｇＢと類似のクロー
ンを得ることができることは、当業者には容易に理解さ
れるはずである。

第１２図はツバリンＴｉプラスミドｐＧＶ３８３９のＴ
−領域を示している。［−ｒｉｎｄ　ＩＩＩ制限エンド
ヌクレアーゼサイトは（１−１”）で示しである。変異
したｊｌｉｎｄ　ｌｉｔフラグメント１９は（１９’）
で示しである。カナマイシンまたはネオマイシン耐性を
付与するアセデルポスホトランスフェラーゼ遺伝子はａ
ｐｔで表わし、これは黒くぬりつぶした部分に存在して
いる。Ｔ領域の境界は矢印で示しである。ツバリンシン
ターゼ（ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子はｎｏｓで表わした
。数値は、Ｄｅｐｉｃｋｅｒら（＋）ｌａｓｍｉｄ、３
（１９８０）、１９３−２１１）の方法による制限フラ
グメントの大きさを表わしている。ＴｉプラスミドｐＧ
Ｖ３８３９は、実施例！およびそこに挙げた２つの文献
に従って組み立てることができる。

第１３図は、アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立てを示している。プラスミドｐＢＲ３２２−
ｐＡｃｇＢ　（第２図）は、線状化した形で描いである
。ｐＢＲ３２２の配列は斜線を入れた領域て示し、ｐＢ
ｒｔ３２２のアンピノリン耐性遺伝子はＡｐ′ｔて示し
た。第１２図に示したｐＧＶ：３８３９の′■゛−領域
の一部かここに描かれている　＋　ｐＡｃｇＩ３　との
相同的組換えに関与する１１ｉｎｄ　ＩＩＩ　フラグメ
ント（１０）および（２３）およびａｐｔ遺伝子が含ま
れている。二重乗換えによってｐＧＶ３８５０および失
われたａｐｔ遺伝子を含むらう１つのレプリコンか組み
立てられる。

第１４図は、実施例２に詳細に記載した中間クローニン
グベクターｐＧＶ７００の組み立てを嘆式的に示したし
のである。制限エンドヌクレアーゼサイトを示すのに以
下の略号を用い１こ：　Ｂ＝。

ａｍｌ−１１、Ｂｇ　＝Ｂｇｌ　ＩＩ　、Ｅ＝ＥｃｏＲ
Ｉ、　ｔ［＝Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　、５＝Ｓａｌ　Ｉ％Ｓ
ｍ＝ＳｍａＴ０抗生物質耐性を示すのに以下の略号を用
いｒこ：Ａｐ−アンピシリン、Ｃｍ＝クロラムフェニコ
ール、Ｓｍ＝ストレプトマイシン、Ｔｃ−テトラサイク
リン。

ＴＬ−ＤＮＡで示した図の下部の数値は、この領域のＲ
ＮＡ転写体を示している（Ｗ　ｉｌ　１ｍ１ｔｚｅｒら
、ＥＭＩ３０Ｊ、１（１９８２）、／３９−１４６）。

第１５図は中間クローニングベクターｐＧＶ７５０の構
造を示している。その組み立ては実施例２に記載した。

制限エンドヌクレアーゼサイトは、キロ塩基対（ｋｂ）
の数で表わしたその相対的位置で示した。Ｐｓｔｌ　　
サイトは示していないがＫｍＲ／ＮｍＲ領域に３つ、Ｃ
ｂＲ遺伝子に１つ存在する。

左右の境界領域も示しである。ｐＧＶ７５０　の組み立
てに使用されたＢｇｌ　ＩＩ／ＢａｍＨｌサイトおよび
Ｈｐａｌ／Ｓｍａｌサイトが示されているが、これはｐ
ＧＶ７５０　には存在しない。影をつけた領域はＴＬ−
ＤＮＡに、黒い領域はＫｍＲ／ＮｍＲ領域に、白ぬき部
分は隣接するＴｉプラスミド配列に、そして線はクロー
ニング媒体ｐＢＲ３２５にそれぞれ相当する。その他の
略号は以下の意味を有する：　０ｃｓ＝オクトビンシン
ターゼ、ＣｍＲ＝クロラムフェニコール耐性、ＣｂＲ＝
カルベニンリン（アンピンリン類似体）耐性、Ｋｍ　Ｒ
／Ｎｍ　Ｒ＝カナマインン耐耐性／ネオマイシン耐性第
１６図は実施例３に詳細に記載した中間ベクターｐＧＶ
７４５の組み立てを示している。ｐＧＶ７４５は、第８
図に示した「Ｂタイプ」アクセプタープラスミド、ｐＧ
Ｖ２２６０の組み立てに使用される。制限エンドヌクレ
アーゼサイトは以下の略号で示した：　Ｂ＝ＢａｍＨＩ
　、　Ｈ−４−ｆｉｎｄ　Ｉｌ１、Ｒ＝ＥｃｏＲＩ。ア
ンピシリン耐性遺伝子はΔｐＲで示した。斜線を施した
領域はオクトピンＴｉ　プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の
左側と相同のＤＮＡを、白ぬき領域はオクトピンＴｉプ
ラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の右側と相同のＤＮＡを示し
ている。

出発物質であるプラスミドｐＧＶＯ２１９およびｐＧＶ
Ｏ１２０についての物理的位置および記述は、ＤｅＶｏ
ｓらのＰｌａｓｍｉｄ　６（１９８１）、２４９−２５
３にみられる。

第１７図はアクセプタープラスミドｐＧＶ２２６０の組
み立てを示している。ｐＧＶ２２１７　中の欠損置換が
、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を付与する
アセデルポスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｔで表
わしである）を含んでいる黒色部分で示しである。中間
ベクターｐｃｖ７−ｔ５（第１６図参照）は線状化して
描いである。これは第１６図に示し７＝ｐＧＶ７４５の
ｌｌ１ｎｄ　ＩＩＩサイｌ−て開裂したちのてある。ｐ
Ｉ１３ｎ３２２の配列は斜線を施した部分で示し、アン
ピンリン耐性遺伝子はＡｐＲで示しである。二重乗換え
によって、ｐＧＶ２２６０がｔ、＋１み立てられ、ａｐ
ｔ遺伝子が失われる。制限エンドヌクレアーゼザイトは
以下の略号て示した：　Ｂ　＝　Ｂａ１１１１　、１！
　＝　Ｉ［ｉｎｄ　Ｉｌ１、ｆｌ＝ＥｃｏＲＩ。

第１８図は、ノパリンンンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）のプ
ロモーターの下流の遺伝子を発現するためのプラスミド
ｐＬＧＶ２３８＋の組み立てを示している。５′および
３゛はそれぞれ転写開始と転写終了を色味し、ΔＴＧお
よびＴＡΔは翻訳開始および翻訳終了に使われるコドン
を表わしている。

太線はｎｏｓプロモーター領域、白ぬき部分はｎｏｓ暗
号領域を示している。ＡｐＲはアンピノリン耐性、Ｋｍ
Ｒはカナマインン耐性を示している。

第１９図は、完全なオクトビンシンターゼ（ＯＣＳ）暗
号配列を含んでいるプラスミドｐＡＧＶ４０の組み立て
、およびプラスミドｐＬＧＶ２３８＋（第１８図参照）
中ｎｏｓプロモーターの後部へのその挿入を示している
。太線はプロモーター領域１域、白ぬきｉπ≦分はＯＣ
Ｓ暗号領域を示している。その他の記号は第１８図と同
しである。

第２０図は、ノパリンンンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子のプ
ロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列およびオクト
ビンシンターゼ遺伝子暗号領域と融合した後の同じ領域
の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合点は星印
（＊）で示した。いくつかの制限エンドヌクレアーゼサ
イト、即ち、Ｂ　ａｍ　ｌ−１１、ｌ１ｉｎｄ　ＩＩＩ
　、および５ａｃｌｌ　ら示しである。

５゛および３°は転写開始および終了を彦味する。

Ａ　Ｔ　Ｇは翻訳に使われる最初のコドン、ＴＡΔは翻
訳に使われる終了コドンを表わしている。白ゐきの大き
い矢印はツバリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢印
はオクトビン遺伝子を表わしている。

以下に本発明の詳細な説明する。

第１図にアクセプターＴｉ　プラスミドを簡単に図式化
して示した。このアクセプターＴｉ　プラスミドは、野
生型腫瘍誘起（Ｔｉ）プラスミドの２つの境界配列（１
，２）または領域を含んでいる。この境界配列は、Ｔｉ
プラスミドのＴ−領域を植物細胞ゲノムへ組込むのに必
須である。換言すれば、あらゆるＤ　Ｎ　Ａ配列（３）
またはＴ−領域を、これらの配列間に存在している植物
細胞ゲノムに組込むのにこの境界配列が絶対に必要であ
る。

このアクセプターＴｉ　プラスミドのＤＮＡ配列（３）
には、第２図および第３図に示した中間クローニングベ
クターのＤＮＡ配列（３゛）の少なくとし１部と相同の
ＤＮＡセグメントが含まれている。

この相同性は、中間クローニングベクターとアクセプタ
ーＴ１プラスミドが単一乗換え（相同性組換え）によっ
て…五組込みするのに必要である。

相互組込み体の得られる頻度は、基本的には相同領域の
長さできまる。相同性組換えを高頻度で起すには、通常
１〜４ｋｂの領域が使われる（　Ｌ　ｃｅｍａｎＳら、
Ｊ、〜ｆｏ１．　　Ａｐｐ１、　　ｃｅｎｅｔ、　　＋
　（１９８１）。

１４９−１６４）。

アクセプターＴ（プラスミドは更に、／Ｊｒｏｂａ−ｃ
ｔｅｒｉｕｍによってＴｉプラスミドのＴ−領域が植物
細胞ゲノムへ移動ずろのに必要な配列（４）を含んでい
る。

この様なアクセプターＴｉ　プラスミドの組み立ておよ
び第２図および第３図に示した中間クローニングベクタ
ーとのその相互組込みについて、第４図を参照しながら
以下に詳述する。

第２図および第３図に、発現しようとする、即ち、植物
細胞中でプロモーターの支配下に転写され、翻訳される
所望の原核性または真核性遺伝子をり凸−ンするための
中間クローニングベクターを簡略化した図で示した。こ
れらの中間クローニングベクターは、アクセプターＴｉ
プラスミドのＤＮＡセグメント（３）の少なくとも一部
と相同であり、従って単一乗換えを可能にするＤＮＡ配
列を含んでいるクローニング媒体からのＤ　Ｎ　Ａセグ
メント（３°）を含んでいる。さらに、この中間クロー
ニングベクターは、その天然のあるいは外来性のプロモ
ーター＾己列を含む少なくとも１つの所望の遺伝子（５
，７）を含んでいる。このプロモーター配列によって、
挿入された遺伝子配列の発現が可ｆ１セである。所望の
挿入遺伝子（群）の発現を調整するために、外来性のプ
ロモーター配列（仕立て上げたブロモ−クー）を使うこ
とら可能である。

調整の各種の例として、以下のらのを挙げることができ
る：（ｉ）組繊に特異な発現、即ち、葉、恨、茎、花な
ど、（ｉｉ）発現レベル、即し、発現の強弱、（ｉｉｉ
）誘導性発現、即ち、温度、光または添加された化学的
因子による発現など。

中間クローニングベクター用の所望の遺伝子の例として
は、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成をコントロール
して植物の栄養価や成長度を改良する遺伝情報を持った
ＤＮＡフラグメントまたは配列、外部から病原物質に対
する保護、例えば病原生物またはストレスとなる環境因
子に対する耐性、を付与する生産物の合成をコントロー
ルする遺伝情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列
、遺伝子工学によって改良しようとする植物の経本的な
過程に情報を与える生産物の合成をコントロールする遺
伝情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列なと。

第２図および第３図は、選択可能なマーカー逍（云子（
６）を含んでいろことらある中間クローニングベクター
を表わしている。選択可能なマーカー遺伝子としては、
例えば抗生物質またはｆ丁毒ノＩ類似物質（例えばアミ
ノ酸類縁体）を暗号化している遺伝子、受容宿主細胞の
欠損を補う遺伝子などが挙げられる。

第４図は、ハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組み
立てに関与する構成を示しており、第５図は、そのハイ
ブリッドＴｉ　プラスミドベクターを保持しているＡ　
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの分離に関与する実際の接合
工程を表わしている。この工程は、中間クローニングベ
クターがＥ、ｃｏｌｉ中で組み立てられるので、この中
間クローニングベクターをＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ中のアクセプタープラスミドに転移させるのに必要で
ある。

Ｔ−領域の一部が変更された配列で置換されている改良
Ｔｉプラスミドを調製するのに用いられる既知の転移手
法は多数の工程からなっている。

通常、大抵のＤ　Ｎ　Ａ組換え操作は、特別に設計され
たクローニング媒体、例えばｐＢ１１３２２（Ｉ３ｏ１
ｉｖｅｒ　、　Ｇｅｎｅ　２　　（１９７７）、７５−
９３）中で行なわれる。しかしこのクローニング媒体は
、それ自体Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｍに移動すること
ができない。この問題は、既知の方法では次の様にして
解決されている： ａ）　　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中でも複製し得る
別の広範囲宿主用クローニング媒体、例えばｍ１ｎｉ−
９ａプラスミド（Ｌ　ｅｅｍａｎｓら、Ｇｅｎｅ　ｌ　
９（＋　９８２）。

３Ｇ＋−３６４）でｐＢｆｌクローニング媒体配列を置
換する。この操作はＥ、ｃｏｌｉ中で行ない、中間クロ
ーニングベクターが得られろ。

ｂ）所望のＤ　Ｎ　／〜を含有している中間クローニン
グベクターを保持したＥ、ｃｏｌｉ株と、Ａ　ｇｒｏｂ
ａ−ｃｔｅｒｉｕｍ中では複製できないがそれ自体およ
び他のＤ　Ｎ　ＡのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転
移を仲介することのできるヘルパープラスミドを保持し
た別のＥ。

ｃｏｌｉ株との接合。

Ｃ）工程（ｂ）で得られるＥ、ｃｏｌｉとＴ１プラスミ
ドを含んでいるＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの接合。

ヘルパープラスミドは失われる。

ｄ）中間クローニングベクターは、独立し、゛；レプリ
コンとしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製し、存
在することができるので、工程（Ｃ）で得られた接合体
は、中間クローニングベクターとＴｉプラスミドとの相
互組込み体を含んでいる細胞、または中間クローニング
ベクターおよび相互組込みか起らなかったＴｉＴｉプラ
スミドんでいる別の細胞の混合物である。相互組込み体
だけを特異的に分離する為に、Ｔｉプラスミドのない別
のＡｇｒＯｂａＣｔ−ｅｒｉｕｍ株との接合をらう一度
行なわなければならない。この転移は、Ｔｉプラスミド
自体によって暗号化されている機能によって仲介される
。この第２のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株への中間ク
ローニングヘクターの転移は、Ｔｉプラスミドとの相互
組込み体の形でのみ行なわれる。

ｅ）所望の置換を行なった最終的な改良Ｔｉプラスミド
を得ろために、第２回目の乗換えが行なわれる（　１６
ｅｍａｎｓ　ら、Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐ１、　Ｇｅｎｅ
ｔ。

１　　（＋９８１）、１．１９−１６・１）。

僅かにもう１つの既知の方法は、上記工程（ｄ’）にお
いて、中間り［Ｊ−ニングベクターと」ツ合しない別の
プラスミドをΔｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍに導入するこ
とを除けば、上の方法とＪｌす本釣に同しである。この
場合、独立したレプリコンのままでいる中間クローニン
グベクターは全て失わイイろので、相Ｈ組込み（Ｉｌｉ
−乗換え）を選択することかできる（Ｍａｔｚｋｅら１
．１．　Ｍｏ１．　Ａｐｐ１、　　Ｇｃｎｅｔ、　　ｌ
　　（＋９８１　　）、３９−４９　）。

ここに本発明者らは、Ａ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕ＋
のアクセプターＴｉ　プラスミドに中間クローニングベ
クターを導入するｌｂの、新規な非常に簡素化された方
法を提供するものである。簡単に言えば、この方法は、
多くの通常使用されているクローニングプラスミド（例
えばｐＢＲ３２２）を皿Ａｇｒｏｂａｃ−ｔｅｒｉｕｍ
　ｌこす云移させるのに、Ｅ、ｃｏｌｉのヘルパープラ
スミドか役立つということを見い出した事実に基づいて
いる。これらのプラスミドは、いづれもＡ　ｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ中では複製できないので、アクセプター
’Ｉ’　ｉ　プラスミドと相互組込みし得る乙のノ゛二
けか保持されろことになる。さらに、本発明者らは、Ａ
ｇｒＯｂａＣ１ｅｒｉＵｍ中のこの相互組込み体を、ｈ
ｌｏ（物細胞への感染の７）の直接のベクターイ［［酸
物として使用ケるのである。この様にして、本発明者ら
は前記の工程（ｄ）および（ｅ）を省略した。これによ
って、改良ハイブリッドＴｉプラスミドを組み立てるの
に要する時間か減少し、可能な組み立てに柔軟性が増加
し、かくして、植物細胞ゲノムへＤＮＡを転移させる為
のベクターとしてこのアクセプター′Ｉ’　ｉプラスミ
ドを使用てきろ可能性が著しく高まったのである。

即ち、第５図に概略を示した様に、アクセプター］゛１
プラスミドへの中間クローニングベクターの導入は２工
程で行なわれる。先づ、中間クローニング媒体上−を持
ったＥ、　ｃｏｌｉ　１１（１）を、この中間クローニ
ングベクターのＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの摂動
を促す２つのプラスミドを持った別のＥ。

ｃｏｌｉ株（２）と接合させる。これらのヘルパープラ
スミドの代表的な、そして好ましい例は、ｍｏｂ機能を
含んだＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｔｒａ機能を含んだｐｃ
　Ｊ　２８である（Ｆ　ｉｎｎｅｇａｎら、Ｍｏ１．　
Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　１８５（＋９８２）、３４４−３５１）
。中間クローニング媒体上−のクローニング媒体上のｂ
ｏｍザイト（Ｗａｒｒｃｎら、Ｎａｔｕｒｅ２７４　（
１９７８）。

２５９−２６１）か他の２つのプラスミドによって暗号
化されている機能体によって認識され、転移できる様に
なる。全てのプラスミドは、その存在を検出ずろために
抗生物質耐性マーカーを含んでいるのが好ましい。次い
て、得られたＥ、ｃｏｌｉ休、即ち３つのプラスミド全
てを保持している摂動株（３）を、中間クローニングベ
クターと相同の領ｌ或を持っノこアクセプタ＝Ｔｉ　プ
ラスミドを保持しているＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｌｕｍ
と接合させる。中間クローニングベクターとアクセプタ
ーＴｉ　プラスミドとの単一乗換えが行なわれたかどう
かは、中間クローニングベクターの抗生物質耐性マーカ
ーについての選択によって検出てきる。

第６図は、第１図のアクセプターＴｉプラスミドの組み
立てに用いられたＤ＋マＡ分子を模式的に示したもので
ある。本明細書では、このプラスミドをアクセプターＴ
ｉ　プラスミド（タイプＡ）と呼び、他のアクセプター
Ｔｉ　プラスミド（タイプＢ）と区別することにする（
第８図参照）。この組み立てには、Ｔｉプラスミドと、
クローニング媒体（３）中に境界配列（１）および（２
）を持っているもう１つのプラスミドとの間に二重乗換
えが起ることが必要である。図に示した様に、クローニ
ング媒体配列（３）は左側の境界配列（１）と右側の境
界配列（２）との皿にある。このＤＮＡ鎖の正しい極性
を示すために、これを環上に描くことができる。

しかし、二重乗換えに使用される相同領域を示すために
は、この環を開裂させて図示した。これは理解を助けろ
為のやり方として重要であり、第８図に於けるアクセプ
ターＴｉ　プラスミド（Ｂ）の組み立てに於いて乙用い
られている。即ち、もし境界配列（１）および（２）が
、単にクローニング媒体配列（３）！Ｉ！ｌＬに挿入さ
れたのなら、二重乗換えによって、Ｔ−領域か削除され
てはいるがこの境界配７１１（１）および（２）の間の
クローニング媒体配列のなリＴｉ　プラスミドが得られ
ることになる。第６図に示しノ二様に、二重乗換えによ
って、境界配列（１）および（２）の間にもとのＴ−領
域を持った環状Ｄ　Ｎ　Ａ分子が生成する。これはレプ
リコンではないので消失する運命にある。この二重乗換
えか起ったかどうかは、例えばＴｉＴｉプラスミド−領
域内に含まれる抗生物質マーカーの欠落について選択し
たり、クローニング媒体配列（３）内の抗生物質耐性マ
ーカーについて選択したりして、遺伝子学的に選択する
ことができる。

第７図は、第２図および第３図の中間クローニングベク
ターの組み立てを示す模式図である。制限エンドヌクレ
アーゼサイトＲ１またはＲ７でそれぞれ囲まれた所望の
遺伝子（５）および選択可能なマーカー遺伝子（６）が
、酵素Ｒ３およびＲ２のｒ）の特異な制限サイトを含ん
でいるクローニング媒体配列（３°）に、これら全ての
分子の消化およびライゲーションによって挿入される。

得られた組換えＤＮＡ分子は、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞を
形質転換すルノに使用され、その形質転換体は、クロー
ニング媒体配列（３°）の抗生物質耐性マーカー（Ａｈ
”’）で選択される。

第８図は本発明のらう１つの態様、即ちアクセプター１
’　ｉプラスミド（Ｉ３）を組み立てるのに使用される
ＤＮＡ分子の模式図である。この場合は、境界配列（＋
）および（２）のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列（９）
および（１０）の間−にクローニング媒体配列（３）を
含んでいるプラスミドとＴｉ　プラスミドとの間で二重
乗換えが起る。乗換えに使用される相同領域を示す為に
、小さい方のプラスミドは開裂しである（第６図と同様
）。二重乗換えににる生成物は、アクセプターＴｉプラ
スミド（［３）と、もとのＴｉプラスミドからのＴ−領
域およびＤＮＡ配列（２）、（１０）、（９）および（
１）を含んでいる、消失するもう１つの環゛状ＤＮＡ分
子である。

遺伝子学的選択は第６図について記載したものと同様に
して行なうことができる。

第９図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミドＢと組
み合せて使用されろ中間クローニングベクターの模式図
である。ここでは、所望の遺伝子（５）は、クローニン
グ媒体配列（３゛）中に含まれている境界配列（１）お
よび（２）のｆ７ｊ７に挿入される。

第１０図は、単一乗換により第９図の中間クローニング
ベクターがどの様にしてアクセプターＴｉプラスミド（
Ｂ）に挿入されるかを模式的に示している。この場合、
中間クローニングベクターのクローニング媒体配列（３
°）の抗生物質耐性マーカーで選択すると、２つのプラ
スミドの間の相互組込みの結果としてのハイブリッドＴ
ｉプラスミドを確実に見つけることができる。こうして
境界配列（１）および（２）内に含まれている所望の遺
伝子を持ったハイブリッドＴｉプラスミドが得られる。

この様にして組み立てられたハイブリッドプラスミドは
、そのＴ−領域に、例えば第４図のハイブリッドＴｉプ
ラスミド中の配列（３）および（３°）の様な直接反復
の配列を含有しておらず、従って、分子内組換えの結果
として、ハイブリッドベクターまたは植物細胞ゲノム中
に導入されたＤＮＡか不安定になる可能性が避けられる
。

本発明者らの研究室で行なった実験結果から、第９図の
中間ベクターの組み立てには、境界配列１および２の両
者を所在する必要はないことがわかった（未発表）。し
かし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込むには、少
なくとも右側の境界配列（２）（第１図および第９図参
照）を有することが必要十分条件である。

ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｍのＴｉ　プラスミド、例え
ばツバリンまたはオクトピンＴｉプラスミドの制限エン
ドヌクレアーゼ地図についての知見（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ
ら、Ｐｌａｓｍｉｄ　３（ｌ　９８０）、Ｉ　９３−２
　Ｉｔ；Ｄｅ　Ｖｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ　６（１９８
１）、２４９−２５３）才３よびＴ−ＤＮＡ境界配列を
含んでいる制限フラグメントについての知見（Ｚ　ａｍ
ｂｒｙｓｋｉら、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ａｐｐ１、　ｃｅｎｅｔ、　　＋（１９Ｂ２）、３６１
−３７０；Ｄ　ｅ　Ｂ　ｅｕｃｋｅｌｅｅｒ　ら、Ｍｏ
１．　　Ｇｅｎ、　　Ｇｅｎｅｔ、１８３（１９８１）
、２８３−２８８）から、当業各であれば准れで乙、本
発明方法に従ってアクセプターＴｉプラスミドを組み立
てることができる。この他、通常の組換えＤＮＡ技術お
よび基礎的な細菌の遺伝子操作を実施できる能力が要求
されるに過ご゛ない。本発明は、ハイブリット′Ｉ’　
ｉ　ブラスミトヘクンーを１′１１み立てるの（こｒ１
効てめろことがわかっ）こ本川♀＋ｉ１．１″ｉに記載
しノニアクセプター′Ｉ゛１　プラスミドを呉（ｋ的に
提案している点てユニークなしので、Ｉ５ろ。更に、こ
れらのアクセプターＴｉ　プラスミドは、遺伝子をｈｌ
ｏ（物ｒ＋＋＋胞ケノムゲノ入４゛ろための方法の−ｊ
１りを４．１７成する様に設計された乙のである。

既述したアクセプターＴｉプラスミド、中間り［１−ニ
ンクヘクター、ハイブリッド′Ｉ゛１　ブラスミトヘク
ター」ｊよびヘクター組成物を更に例示し、ｈ白物細物
ケノ１、へ組込まれた外来性遺伝子の発現を示・（−杉
質転換ＷＩ物細胞および植物を提供するのにこのヘタタ
ー徂成物が有効であることを例証するために、以下に実
施例を挙げる。

求湾章ロー　アクセプターＴｉ　プラスミド　ｐＧＶ３
８５０（＝へタイプ）の組み立て 出発ト朱、ｒｊよびプラスミド： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｍ　ｔｕｍｅｌ’ａｃｉｅｎ
ｓ　（野性型Ａｇｒｏｂａ−ｃ［ｃｒｉｕｍ山来のリフ
ァンピシン耐性ｉ　ｃｓｓｃＩ　およびクロラムフェニ
コールーエリスロマインン耐性株Ｃ５８ＣＩ） ′Ｉ’　ｉ　　プラスミド−ｐＧＶ３８：３９第１１図
のプラスミド−ｐＡｃｇＢ Ｔｉ　プラスミドｐＧＶ３８３９はノパリンプラスミＦ
’　ｐＴｉ　Ｃ５８ｔｒａ　ｃ（ｐＧＶ３１００　；１
（ｏｌｓｔｅｒｓら、　　Ｐｌａｓｍｉｄ　３（１９８
０）、　　２１２−２３０）から組み立てる。これはＴ
−領域の中央近（に欠失置換突然変異体（ミュータント
）を含んでいる：即ち、［−ｆｉｎｄ　ＩＩＩ　フラグ
メント１９の内部のＳｍａ　Ｉフラグメント２４　（Ｄ
ｅｐｉｃｋｅｒら、Ｐｌａｓｍｉｄ　　３　　（＋９８
０）、＋９３−２１１）は、Ｔｎ５のａｐｔ（アセチル
ホスホトランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいる１）Ｋ
Ｃ７のｌ１ｉｎｄｌｌフラグメント　（Ｒａｏら、Ｇｅ
ｎｅ　７（１９７９，７９−８２）で置換されている。

この遺伝子はアミングリコシドネオマイシンおよびカナ
マイシンに対する耐性を暗号化している。ｐＧＶ３１１
１３９のＴ　−領域の制限地図を第１２図に示す。

プラスミドｐＡｃｇＢは、Ｔ−ＤＮＡの境界部だけを含
んでいる１）ＢＲ３２２中のＡｃｇＢの挿入体である（
第１１図参照）。この境界部はＴ−ＤＮＡの末端部とし
て定義され、これらの領域は、Ｔ−Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｄ　
ｈＴＩ物細胞ゲノムへの安定な組込みに役割を果たす。

このクローンの起源および分析について（土１詳しく３
己載されている（　ＺＨｍｂｒｙｓｋｉ　ら、５ｃｉｅ
ｎｃｅ２０９（ｌ　９８０）、＋３８５−１３９１）。

このクローンは、形質転換されたタバコＤＮＡからＴ−
ＤＮＡの部分を再分離することにより得られ１こ。ｐＡ
ｃｇＢは、Ｔ−Ｄ　Ｎ　Ａの左右の境界を含む様に縦列
に並んだ２つのＴ−ＤＮＡコピーの接合点を含んでいろ
。更に、ｐＡｃｇＢは、その逍伝情報か右側Ｔ−ＤＮＡ
境界のすぐ近くに位１ｕシているという理由でノパリン
ンンターゼ遺伝子を含んている。このプラスミドｐＡｃ
ｇＢは、「タイプＡｊ７クセプターＴｉ　　プラスミド
、　ｐＧＶ３８５０のｍみ立てに使用される。第６図は
関与する構造の概略を、第１３図はｐＧＶ３８５０を与
える二組乗換えに関与するＤＮＡ領域をより正確に示し
た乙のである。

上シ己のプラスミドｐＡｃｇＢは、そのＩ）１３Ｒ３２
２部分にＣｏ１Ｅ　ｌ−特異ｂｏｍザイトを持っており
、ヘルパープラスミドｆ１６４ｄｒｄｌｌおよびｐＧ、
１２８を使ってＩＥ：、ｃｏｌｉからＡ　ｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｐｍへ摂動することができる。Ｅ、ｃｏｌｉに
含まれているプラスミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｐｃ　
Ｊ　２８は、接合により、ｐＡｃｇ＋３を持ったＩＥ、
ｃｏｌｉ株に導入される。トランス接合体は、アンピシ
リン耐性（ｐＡｃｇＢのｐＢＲ３２２配列から）、スト
レプトマイノン耐性（Ｒ６４ｄｒｄ　ｌ　Ｉから）、お
よびカナマイシン耐性（ｐｃ　Ｊ　２８から）コロニー
として選択されろ。

３つのプラスミドの全てを保持しているＥ。

ｃｏｌｉ株を、リファンピシン耐性でありＴｉプラスミ
ドｐＧＶ３８３９を含んでいるＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ株０５８Ｃ１に接合さυ−る。ツバリンＴｉ　プ
ラスミドとの最初の単一乗換えを選択するのにｐ３Ｒ３
２２のアンピノリン耐性を利用−４−る。アンピノリン
耐性をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｍ中で安定させること
かできろ唯一の方法は、Ｔ−領域境界近くの［１］同領
域の１ってｐＧＶ３８３９と相同組換えにより乗換えを
することである。池の相同領域での２回口の乗換えによ
り、ｎｐし遺伝子（カナマイノン耐性）を含んているｐ
ＧＶ３８３９のＴ−領域の中央部がクローンｐＡｃｇ［
３のｒ）１３１Ｎ３２２配列で置換される。従って、第
２の組換え体はアンピシリン耐性、カナマイシン感受性
である。第２の組換え体を分離する確率を高めるために
、最初の組換え体（ｐＡｃｇ１３：・ｐＧＶ３８３９）
を保）１ｊシているりファンビシン耐性Ａｇｒｏｂａｃ
Ｌｅｒｉｕｍを、ｉ’　ｉプラスミドを持っていない第
２のクロラムフェニコール／エリスロマイシン耐性Ａ　
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株と接合させろ。この様にし
て、約６００コロニー中、ｌコロニーの割合で、アンピ
ンリン耐性、カナマイシン感受性のクロラムフェニコー
ル／エリエロマイシン耐性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｐＧ　Ｖ　３８５０を得ることができろ。

勿論、ｐＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラス
ミドを組み立てるのに使用することかできるその他のＴ
ｉプラスミドもある。Ｔ−領域の中央近くに選択し得る
マーカー遺伝子を持ったＴｉプラスミドは全て受容体と
して使用できろ。更に、左境界フラグメント−ｐＢｌｔ
３２２−右境界フラグメントの方向に、左右の境界フラ
グメントの中間にｐ１３１配列が位置する様に、ｐ１３
Ｒ３２２にＴ−領域境界フラグメントを挿入することに
にってｐＡｃｇＢ様のプラスミドを組み立てることかで
きろ。例えば、ツバリンＴｉプラスミドの左および右境
界フラグメントはそれぞれｌ−１ｉｎｄｌｌｌフラグメ
ント１０および２３である（　Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｐ
ｌａｓｍｉｄ　３（＋　９８０）、　　＋　９３−２１
１）。

単為乗換えによって、ｐＢＲ３２２またはその誘導体に
挿入されている所望の遺伝子を含んた中間クローニング
ベクターがｐｃｖ３ｉｓｏの改良されたＴ−ＤＮＡ領域
に導入される。唯一つ必要なことは、中間クローニング
ベクターのＥ、ｃｏｌｉからＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍへの転移を選択する７′ｔの手段として使用する為
に、導入されるＤＮＡが、既にｐＢＲ３２２に存在する
ものの他にもう１つの耐性マーカー遺伝子を含んでいる
ということである。

この耐性マーカーは、１）ＢＲ配列内に含まれていても
よく　（例えばｐＢＲ３２５のＣＩｎ１≧、またはｐＫ
Ｃ７のＫｍＲ）、植物細胞内で試験されるＤＮＡ内に含
まれていてもよい。更に、アクセプターＴｉプラスミド
ｐＧＶ３８５０におけるＡｐＲ遺伝子ｐＢＲ３２２は、
ＫｍＲの様な別の耐性マーカー遺伝子で置換してもよい
。この様にして、Ａｐｌ？であるｐ［３Ｒ３２２含有中
間クローニングベクターですら、このｐＧＶ３８５０タ
イプのアクセプターＴｉプラスミドに直接摂動すること
ができる。

ｐＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラスミドの
もう１つの利点は、形質転換された植物細胞で腫瘍をつ
くらないということである。ｐＧＶ３８５０の短かくな
ったＴ−ＤＮＡ領域は、依然としてノパリンンンターゼ
を暗号化している遺伝子を含んでいるので、ｐＧＶ３８
５０で形質転換された細胞は、ツバリンが存在するかど
うかを分析することにより、非形質転換細胞から簡単に
選り分けることができる。勿論、アクセプターＴｉプラ
スミドｐＧＶ３８５０に組込まれた中間クローニングベ
クターがマーカー遺伝子を含んでいたら、それも直接ス
クリーニング、即ち選別にかけることができる。

ｐＢＲ３２２配列を含んだ上記の中間クローニングベク
ターの単一乗換えによるアクセプターＴｉプラスミドへ
の挿入のほか、このアクセプターＴｉプラスミドは、「
ショットガン」タイプの実験に於いて、ｐＢＲ３２２ま
たはその誘導体中のクローンされたＤＮＡバンクの受容
体としても使用することができる。ＡｇｒＯｂａＣｔｅ
ｒｉＵｍ中の全てのハイブリッドプラスミドベクターは
、植物細胞の感染に使用することができ、次いで所望の
選択可能な遺伝子（群）の発現についてスクリーニング
される。

例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏している植物細胞に全
バンクを適用することにより、アミノ酸合成を暗号化し
ている遺伝子について簡単に選別することができる。

アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０は、２つの
特徴的な表現形質を持っている・即ち、（ｉ）腫瘍生成
能力がないこと、および（ｉｉ）もしＴ−ＤＮＡかも直
物細胞ゲノム内に転移したら、ツバリン合１戊１屯をイ
１ずろこと、である。　ｐＧＶ３８５０含ｆｉ　Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍて感染さＵ″た各種の植物組織の
これらの特徴を調べるために、種々の実験を行なった。

ａ）　ジャガイモおよびニンジンディスクを用いた試験 ジャガイモよｊよびニンジンの切片にアクセプターＴｉ
プラスミドｐＧＶ３８５０を接種すると、少Ｍの硬結組
織か生成する。この組織にツバリンが存在するかとうか
を試験した所、陽性であることがわかった。この突然変
異体が少量の硬結組織を生産しＩ）ることは興味あるこ
とである。しかし、それは、これらのディスクを低濃度
のオーキノンおよびサイトキニンの両者を含んでいる培
地で生育させた時だけ得られる。

ｂ）全もα物をアクセプターＴｉプラスミドＩ）ＧＶ３
８５０で接種 ホルモンを含まない滅菌寒天培地で生育しているタバコ
およびペチュニアの苗木にｐＧＶ３８５０を接種する。

数カ月後に少量の組織成長が観察されたたけである（通
；１＋′、２週間後に「野生をＡ腫ｊ口が検出されろ）
。この組織は７１；ルモンを含まない培地では生育しな
いが、オーキノンおよびサイトギニン含を培地での滅菌
組織培養ては、さらに増殖することができる。この組織
らツバリン陽性であることがわかった。

Ｃ）　さらに、　Ｉ］ＧＶ３８５０ｒ形質転換」細胞は
腫瘍性ではないので、これらの細胞は、転移したＤＮＡ
セグメントをそのゲノムに依然として保持している正常
な植物に再生ずろことができろ。この形質転換細胞を通
常の再生培地（実施例５を参照）で培養すると、正常植
物が得られよう。

ｐＧＶ３８５０の、アクセプタープラスミドとしての有
用性を証明する為に、以下の実験を行なった。ｐＢＲ３
２５中にオクトピンＴ　　ＤＮＡの腫瘍機能を含んでい
る中間クローニングベクターを、ｐＧＶ３８５０を保持
しているＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに組み込んだ。

単一乗換えによって得られたＡｇｒ’ｏ−ｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ中のハイブリッドＴｉプラスミドを、傷つけたタ
バコ植物に接種した。２週間後に腫瘍組織かあられれた
。このことは、腫瘍誘導ＤＮＡがｐＧＶ３８５０に再導
入され、形質転換植物細胞中で適切に発現されたことを
示している。

実施例２　中間クローニングベクターｒ）ＧＶ７００お
よびｐＧＶ７５０の組み立て この組み立ての概略を第１４図に模式的に示した。オク
トビンＴｉ　プラスミドＢ６Ｓ３の’Ｉ’　Ｌ　−Ｄ　
Ｎ　Ａの右側部分てあり、ｐＧＶＯ２０１（ＤｅＶｏｓ
ら、Ｐｌａｓｍｉｄ　６（１９８１）、２４９−２５３
）中に存在する１（ｉｎｄ　ＩＩＩ　フラグメント１を
、まず、広範囲宿主性ベクターｐＧ　Ｖ　Ｉ　１２２　
（Ｌｅｅｍａｎｓら、Ｇｅｎｅ　　１９（１９８２）、
３６１−３６１１）の１［１ｎｌｌＩＩＩＩザイトに挿
入する。組換えプラスミドｐＧＶＯ２０１は、多コピー
ベクターｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ　
　２（１９７７）、９５−１１３）の特異な［−（ｉｎ
ｄｌｌｌサイトに挿入された１１ｉｎｄ　ＩＩＩ　フラ
グメンｌ−１を含んでいる。ｐＧＶ０２０！およびＩ）
ＧＶ　Ｉ　１２２ＤＮＡは、ＢｅｔｌａＣｈらが記載し
ている方法で１４製されろ（Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃ、３５（＋　９７６）、２０３７−２０４３）
。

最終量２０μ！中、ｐＧＶＯ２０１ＤＮＡ　　２μｇを
、ｌ１ｉｎｄ　ＩＩＩ　２単位（全ての制限酵素はＢｏ
ｅｈ−ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入した）
を用いて、３７℃で１時間完全に１ｌｊｌ化した。イン
キュベーション緩衝液は０°Ｆ　ａｒｒｅｌ　ｌらによ
り記載されている（Ｍａｔ、Ｇｅｎ、ＧｅｎｅＬ　１７
９（１９８０）、４２１−４３５）。同じ条件下でｐＧ
ｖ　ｌ　ｌ　２２ＤＮＡ　２μｇをＨｉｎｄｌｌｌで完
全に消化した。

最終ｆｆ１２０μ、Ｍ中、Ｔ４リガーゼ（Ｂ　ｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　）　０　、０２単位を用
い、０．１μｇのＨｉｎｄｌ［＋消化ｐＧＶＯ２０１を
Ｈ４ｎｄｌｌ＋消化ｐＧＶ１１２２とライゲーション（
結紮）した。インキュベーション緩衝液および条件は、
製造業者の指示に従った（　Ｂｒｏｃｈｕｒｅ″Ｔ４リ
ガーゼ、Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　
　１９８０年８月、＃ＬＯ９Ｍ、８８０．４！ｌｉＧ　
）。ライゲーンヨン混合１；ル）コンギテントＥ、　ｃ
ｏｌｉ　Ｋ５１　＝ｉ　ｈｓｒ　　ｈｓｍ’細胞（Ｃｏ
ｌｓｏｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ５２（１９６５）、　Ｉ
　０４３−１０５０）への導入（形質転換）は、Ｄ　ａ
ｇｅｒｔお上びＥｈｒｌｉｃｈの方法（Ｇｅｎｅ　６（
１９８０）、２３−２８）に従って行なった。細胞を、
ストレプトマイシン（２０μｇ／ｍ［）およびスベクチ
ノマインン（５０μｇ／ｍｌ）を補足したＬＢ培地（Ｍ
ｉｌｌｅｒ。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９７２）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　ｌ−１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
ＮｅｗＹ　ｏｒｋ）に塗抹した。組換えプラスミドを含
有している形質転換体を、テトラサイクリン耐性を暗号
化している遺伝子への挿入によるその不活性化（Ｌ　ｅ
ｅｍａｎｓ　ら、Ｇｅｎｅ　　１９（１９８２）、３６
１−３６４）に基づき、テトラサイクリン感受性（１０
μｇ／ｍｌ）でスクリーニング（選り分け）した。スト
レプトマイシンおよびスペクヂノマイシンに耐性を示し
、テトラサイクリンに感受性を有ずろクローンを物理的
に同定した。マイクロスケールのＤＮＡ調製はＫ　１ｅ
ｉｎらの方法（Ｐ　ｌａｓｍｉｄ３　（１９８０）、８
８−９１：従ッテ実施した。　ｐＧＶＩＩ２２のＨｉｎ
ｄ　ｌｌ！サイト中のＩ（ｔｎｄｌｌｌ　フラグメント
１の配向は、Ｓａ目消化によって決定した。組換えプラ
スミドを消化しく０’　Ｆ　ａｒｒｅｌｌ　らの条件、
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｃｎｅｔ、　　１７９（１９８０）
、４２＋−４３５）、アガロースゲル電気泳動にかける
と２個のフラグメントが得られた。α−配向には０．７
７ｋｂおよび２２．７６ｋｂのフラグメント、β−配向
には、ＩＯ，３３ｋｂおよび＋３．２０ｋｂのフラグメ
ントがあった。α−配向の組換えプラスミドをその後の
クローニングに使用し、これをｐＧＶ１１６８と名付け
た。

ＴＬ−ＤＮＡの左側部分（左の境界配列を含んでいる）
を含有しているＢｇｌ　ｌｌ−９ａｌ　ｌフラグメント
をＢｇｌ　ｌｌ−５ａｌ　Ｉで開裂した［）ＧＶＩ！６
８に導入する。このフラグメントは、ベクターｐ’ＢＲ
３２２に挿入された、ｐＴｉＢ６Ｓ３　のＴ領域からの
、ＢａｍＨＩフラグメント８を含んている組換えプラス
ミドｐＧＶ　０１５３　　（Ｄｅ　Ｖｏｓら、Ｐｌａｓ
ｍｉｄ　６　　（１９８＋）、　　２４９−２５３）か
ら得られる。ｐＧＶＯ１５３およびｐＧＶ＋１６８ＤＮ
ＡはＢｅｔｌａｃｈらの方法で調製する（Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７−２０４３）。

ｐＧＶＯ１５３ＤＮＡ１０μｇを１０単位ノＢｇｌ＋＋
およびｌＯ単位の５ａｌＩを用い、最終量１００μ夕中
３７℃で１時間、完全に消化した。消化混合物をプレパ
ラティグ０．８％アガロースゲル上、ＡｌｌｉＡｌｌｌ
ｎらの方法（Ａｎａ！、　１３ｉｏｃｈｉｍ、　　８５
（１９７Ｂ）、１８８−１９６）で電気溶出し、ゲルか
ら２．１４ｋｂ　Ｂｌｇ　ｌｌ−９ａｌ　Ｉｆｌフラグ
メント回収した。ｐＧＶ　Ｉ　１６８ＤＮＡ　２μｇを
２単位のＢｇｌ　ＩＩおよび２単位の５ａｌｌで完全に
消化した。

最終虫２０μＬ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０，０２単位を
用いてＢｇｌ　ｌｌ−９ａｌ　ｌフラグメントＤＮＡ０
．Ｉｌを０．０２μｇのＢｇｌ　ｌｌｌ−５ａｌｔ消化
ｐｃＶ１１６８とライゲージジンした。このライゲーシ
ョン混合物をコンピテントＥ、　ｃｏｌｉＫ５１４ｈｓ
ｒ　　ｈｓｍ＋細胞（ＤａｇｅｒｔおよびＥ　ｒｈｌｔ
ｃｈ。

Ｇｅｎｅ　６（１９８０）、２３−２８）に導入した。

細胞をストレプトマイシン（２０μｇ／ｍｌ）およびス
ペクヂノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補足したＬＩ３
培地（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ　（１９７２）
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ−（ａｒｂｏｒＬｏｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　ＹｏｒＫ）に塗抹した。

ストレプトマイシン−およびスペクチノマイシンー耐性
形質転換体から、マイクロスケールＤＮＡプレパレーン
ヨン（Ｋ　Ｉｅｉｎら、Ｐ　ｌａｓｍｉｄ　３　（１９
８０）、８８−９１）を行なった。２．１４ｋｂＢｇｌ
　ｌｌ−５ａｌ　［フラグメントがＢｇｌ　ｌｌ−５ａ
ｌ　ｌ消化ｐｃｖｚｅｓに挿入されている組換えプラス
ミドをＢｇｌ　Ｉｆ−９ａｔ　Ｉ消化により同定した。

この消化で２．１４ｋｂおよび２１．８２ｋｂの２つの
フラグメントが得られた。これらの分子量（２，１４ｋ
ｂおよび２１．８２ｋｂ）に相当する消化パターンを持
ったプラスミドをｐＧＶ１１７１と名付け、さらにクロ
ーンするのに用いた。ｐＧＶ１１７１からの１２．６５
ｋｂフラグメントは、左右のＴ　Ｌ−ＤＮＡ境界配列（
Ｄｅ　Ｂｅｕｃｋｅｌｅｃｒら、ｉｎＰｒｏ−ｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ　ＩＶｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃ
ｏｎｒｅｒｅｎｃｅ　ｏｎＰｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｇｅ
ｎｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉａ、　Ｍ、　Ｒｉｄｅ’（ｅｄ
Ｘｉ　９７８）、　　１．　Ｎ、　Ｒ，Ａ、　、Ａｎｇ
ｒｅｓ、Ｉ　１５−１２６）および腫瘍性の増殖を可能
にする遺伝子（Ｌ　ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＩ３０　　Ｊ
、（１９８２）、１４７−１５２）を含んでいる。この
Ｉ（ｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントをブラスミｌ”　ｐｌ
’３Ｆ？３２５に挿入した（１１ｏ１ｉｖａｒ、　Ｇｅ
ｎｅ４（１９７８）、１２　ｌ　−１３Ｇ）。

ｐｃＶＩ＋７’ｌはよびｐＢＲ３２５はｌ３ｃｔｌａｃ
ｈらの方、去で調製しｆコ（Ｆｅｄ、　　Ｐｒｏｃ、　
　３５（１９７Ｇ）。

２０３７−２０１Ｉ３）。それぞれのＤ　Ｎ　Ａ２　Ｉ
ｔ　ｇを２　！ｌ’−ＩＭ−のＩＴｉｎｄ　Ｉｌｌを用
い、３７℃で１時間完全に消化した（インギュヘーンヨ
ン辺衝液はＯ′Ｆａｒｒｅｌｌら（こより１ｉ己’ｌ’
＆されている　（Ｍｏ１．　ＧｃｎＧｃｎｅＬ、　　Ｉ
　７９（１９８０）、　４２１−４３５））。

０１ＩｇのＨｉｎｄ　ＩＩＩ　ｌ消化したｐＧＶＩＩ７
１を、１１ｉｎｄｌｌｌて線状化した０、０５μｇのｐ
［３Ｒ３２５と、’Ｉ’　４　Ｄ　Ｉ’Ｊ　Ａリガーゼ
０．０２　単位を用いてライゲーションした。ライゲー
ション混合物によるコンビテン＋−Ｌ”：　、　ｃｏｌ
ｉ　Ｋ　５１４　ｈｓｒ　　ｈｓｍ　　の形質転換はＤ
　ａｇｅｒｔおよびＥｈｒｌｉｃｈの方法て行なった（
Ｇｅｎｅ　６（１９８０）、２３−２８）。細胞を、カ
ルへニンリン（１００μｇ／ｍｌ）を補足したＬＢ培地
（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ　　（１９７２）、
　　　Ｃｏ１ｄ　　　Ｓｐｒｉｎｇ　　　ｌ−１ａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ）に塗
抹した。カルヘニノリン耐性コロニーを、テトラザイ′
クリン曾性を暗号化している逍伝子に挿入することによ
るその不活性化に基づき、テトラザイクリン（１０μｇ
／′ｍｌ）感受性てスクリーニングした（　Ｂｏｌｉｖ
ａｒ、　Ｇｅｎｅｌｌ（＋９７８）、＋２ｌ−１３６）
。カルベニンリン耐性、テトラザイクリン感受性のコロ
ニーを、そのコロニーから調製したＤＮＡの制限酵素消
化により、マイクロスケール技法（Ｋ　１ｅｉｎら、Ｐ
ｌａｓｍｉｄ３（＋　９８０）、８８−９１）によって
物理的に特性化した。即ち、ＢａｍＨＩ消化により、４
つのｌ）Ｎへフラグメントが得られる・α配向の場合は
０９８ｋｂ、　４．７１ｋｂ、　　５．９８ｋｂおよび
７　、０２．ｋｂのフラグメントが得られ、β配向の場
合は０．９８ｋｂ、　、１．７１　ｋｂ、　　１．７１
ｋｂおよびＩ１、２０ｋｂのフラグ２メントが得られる
。こうして得られたα配向の組換えプラスミドはｐｃｖ
７ｏｏと名付けられ、更にその後の実験に用いられた。

ｐＧＶ７５０は、ｐＧＶ７００１：挿入サレタＴ　Ｌ−
領域の内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している３、４
９ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ−９ｍａＩフラグメントの代ゎりに
、カナマイノン耐性を暗号化している２、８１　ｋｂ　
Ｂ　ａｍｌ−＋　Ｉ　−１−１ｐ３　Ｉフラグメントを
挿入ずろことにより、ｐＧＶ７００から誘導される。カ
ナマイノン耐性を暗号化しているＢａｍＨＩ　−ｔｌ　
Ｉ）ａ　［フラグメントはλ　：’Ｉ’　ｎ　５　（Ｂ
　ｅｒｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

〕＼ｃａｄ、Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ７　２（１９７５）、
３　６　２　８　−３６３２　）から得られろ。λ：：
Ｔｎ５の調製はＭｉｌｌｃｒｉこより５己基哉されてい
る（　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｇ　ｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）、　Ｃ０ｂｌ　Ｓ
　ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　＋、、ａｂｏｒａＬｏｒｙ
、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。ｐＧ　Ｖ　７００１）Ｎ　Ａ
は［３ｅｔｌａｃｈらの方法で調製する（　Ｆｅｄ、　
Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７−２０４３）。

ｐＧＶ７００ＤＮＡ２μｇを２単位のｒ３ｇｌ　　［１
および２弔（ケのＳｍａｌ　　で完全に消化した。λ・
：Ｔｎ５ＤＮＡ２μｇを２単位のＢａｍ１ｌＩおよび２
単位のＩ（１）ａｌて完全に消化した。ｔμｇのＢａｍ
１−１１−　Ｈｐａｌ消化λ：：Ｔｎ５を、最終ｍ　ｌ
　Ｏｕ　Ｉｌ中、Ｔ　ｌｉ　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ０５単
（ケを用いて、０　、２　Ｉｔ　ｇのＢｇｌ　ＩＩ−Ｓ
　ｍａ　Ｉ　ｉ白化ｐＧＶ７００とライゲーションしＩ
こ（製造業者゛の指示する条件に従った）。このライゲ
ーション混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ５１４
ｈｓｒ　　ｈｓｍ　　細胞（ＤａｇｅｒｔおよびＥｒｈ
ｌｉｃｈ、　Ｇｅｎｅ６（１９８０）、２３−２８）に
導入した。細胞を、カルへニンリン（１００μｇ／ｍｌ
）およびカナマイシン（２５ｕ　ｇ／　ｍ１、）をｈｌ
ｉ足したＬ１３培地（Ｍｉｌｌｃｒ。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（！９７２）。

Ｃ０Ｉ（Ｉ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ−１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）上に塗抹した。マ
イクロスケール技法（Ｋｌｅｉｎら。

Ｐｌａｓｍｉｄ　３（１９８０）８８−９１）に従って
コ１％Ｉ製したＤＮＡの制限酵素分析により、Ｃｂ１７
およびＫｍＲコロニーを物理的に特性化した。このＤＮ
ＡをＢｇｌ　ＩＩ／Ｂａｍ１旧で二重消化すると、３．
９１ｋｂ、５．８９ｋｂおよび８．０９ｋｂの３つのフ
ラグメントが、ｌｌ１ｎｄ　ＩＩＩでｌ消化すると２．
６８ｋｂ、５９９ｋｂおよび９．２ｓｋｂの３つのフラ
グメントが得られる。この消化パターンを示すプラスミ
ドを１）ＧＶ７５０と名付け、第１５図に模式的に示し
た。

ｐＧＶ７００とｐＧＶ７５０は、オクトビンＴｉプラス
ミドｐＴｉＩ３６ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの左右の境界配列
を含む、２つの相異なる中間クローニングベクターであ
る。更に、これら２つのプラスミドではＴ−領域内の削
除の程１’Ａｌｈ＜異なっている。

ｐＧＶ７００は、オクトピンノンターゼ（トランスクリ
プト３）およびその他３つの生成物、即ら４．６ａおよ
び６ｂ（’１’−領域の生成物についてはＷｉｌｌｍｉ
ｔｚｃｒ　ら、ＥＮＢＯＪ　、　　ｌ　　（１９８２）
　。

＋３９−１４６参ｊｊＱ　）のための遺伝情報を持った
縮小Ｔ−領領域含んでいる。この３つの生成物（４，６
ａおよび６ｂ）の組み合せが形質転換された植物の新芽
形成を促す。ｐＧＶ７５０はもつと小さいＴ−領域、即
ちオクトビンシンターゼ遺伝子だけを含んでいる。生成
物４．６ａおよび６ｂの為の情報は、カナマイシン（ネ
オマイシン）耐性を暗号化している抗生物質耐性マーカ
ー遺伝子によって置換されてしまっている。

ｐＧＶ７００およびｐＧＶ７５０は、Ｂタイプのアクセ
プターＴｉプラスミド（第８図および後記実施例３参照
）と共に使用し得る中間クローニングベクターの例であ
る。これらのベクターは、それらが所望の遺伝子を含ん
でいないことを除けば、第９図に示したしのと部分的に
類似している。これらのベクターは、その改良］゛−領
域内にクローンする為の１個の制限エンドヌクレアーゼ
サイトを含んでいるので、所望の遺伝子を簡単にそれら
のベクターに挿入することができる（第１４図および第
１５図参照）。

実施例３　アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ２２６０
（タイプＢ）の組み立て 出発株およびプラスミド： Ａｇｒｏｂａｃｃｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ　（野生型Ａ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから誘導さ
れる、リファンピシン耐性株０５８Ｃ１およびエリスロ
マイシン−クロラムフェニコール耐性株０５８ＣＩ） Ｔｉプラスミド＝ｐＧＶ２２１７ 中間ベクター（第１６図）−ｐＧＶ７４５ＴＩプラスミ
ドｐＧＶ２２１７の組み立てについては詳細に記載され
ている（　Ｌ　ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９
８２）、１４７−１５２）。これは、オクトビンＴｉプ
ラスミドの全ＴＬ−領域の欠失置換突然変異体を含んで
いる：即ち、ＢａｍＨＩフラグメント８．３０ｂ、２８
．１７ａおよびＢａｍＨＩフラグメント２の左の３．７
６ｋｂ　Ｂａｍｔｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲ［フラグメント（
ＤｃＶｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ　６（１９８１）、２４
９−２５３）が、Ｔｎ５のａｐｔ（アセチルホスホトラ
ンスフェラーゼ）遺伝子を含んでいろｐＫＣ７のＥ　ｃ
ｏＲＩ　−Ｂ　ａｍｌ（１フラグメント（Ｒａｏ　＆　
Ｒｏｇｅｒｓ、Ｇｅｎｅ　７（１９７９）、　７９−８
２）で置き換えられている。この遺伝子はアミノグリコ
シド、ネオマイシンおよびカナマイシンに対する耐性を
暗号化している。

中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立てを第１６図に模式
的に示した。これについて以下に詳述する。組換えプラ
スミドｐＧＶ７１３を、α配向でＨｉｎｄ１１１フラグ
メント１４．１８ｃ、２２ｅおよび３８ｃを含む、オク
トビンＴｉプラスミドサブクローンｐＧＶ　Ｏ２１９（
Ｄｅ　Ｖｏｓら、Ｐ　ｌａｓｍｉｄ　６　（１９８１）
、２４１−２５３）から誘導した。ｐＧｖ０２１９ＤＮ
ＡをＢａｍＨＩで完全に消化し、次いで自己結紮（セル
フライゲーション）に有利な条件下でライゲーションし
た（ライゲーション混合物中のＤＮＡの最終濃度＜　１
ａｇＤＮＡ／ｍ１２）。アンピシリン耐性で形質転換体
を選別し、制限酵素による消化で物理的に特性化した。

こうしてｐＧＶＯ２＋９に存在する６　、　５　ｋｂ　
ＢａｍＨ１フラグメントはもはや含んでいないクローン
を分離し、これをｐＧＶ７ｔ３と名付け、その後のクロ
ーニングに使用した（以下の記載参照）。ＢａｍＨＩフ
ラグメント２蚕含んでいるｐＧＶ　Ｏ＋　２０（Ｄｅ　
Ｖｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ　６（１９８１）、　２４９
−２５３）から組換えプラスミドｐＧＶ７３８を誘導し
た。ｐｃｖ。

１２０　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＧＶ７１３の
場合と同様にして自己結紮させた。形質転換体をアンピ
シリン耐性によって選別し、制限酵素消化により分析し
た。ＥｃｏＲ［フラグメント２０．１２およびＥｃｏＲ
Ｉフラグメント１９ａの一部とｐＢ１１３２２の一部を
含んでいる２、９５ｋｂ　ＥｃｏＲ１フラグメントが全
て除去されたクローンをｐＱＶ７３８と名付け、更にそ
の後のクローニングに利用した。このプラスミドは、依
然としてＢａｍ［（！フラグメント２の右側部分からの
５．６５ｋｂＥｃｏｌｔ　ｌ　−［３３ｍ１ｌ　Ｉフラ
グメン）・を含んている（ＤＯＶｏｓら、Ｐｌａｓｍｉ
ｄ　　６（１９８１）、　　２４９−２５３）。

次いてｐＧＶ７１３Ｉ）ＮＡをｌ１ｉｎｄｌｌｌおよび
ＢａｍＨＩで消化し、消化物をプレパラティブアカ［Ｉ
−スゲルにかけた。電気泳動の後、ｐＧＶ７１３内に含
まれている２、３０ｋｂ　１ｌｉｎｄ　ＩＩＩ−ｌｌｌ
−１３ａフラグメントを電気溶出で純化した（Ａｌｌｉ
ｎｇｔ。

ｎ：′）、Ａｎａ！、　Ｉ３ｉｏｃｈｅｍ、　８５（１
９７５）、　　ｌ　８８−１９６）。このフラグメント
をＩ（ｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　１．ｔ；よびＢａｍ１ｌｌて完
全に消化したｐＧＶ７３８とライケー７ヨンしｆこ。形
質転換後、アンピンリン耐性コロニーを、制限酵素消化
により物理的に特性化する。例えば、”Ｅ、　ｃｏｌｔ
　Ｉ−Ｂ　ａｍ）（Ｉ消化により、そ１ｔぞれ３．９８
ｋｂ（−ベクタ一部分）と７．９５ｋｂ（＝挿入部分）
の２つのフラグメントが得られるはずである。この特性
を持った組換えプラスミドはｐＧＶ７４５と命名され、
アクセプターＴｉグラスミｉ”ｐＧＶ２２６０を組み立
てろための中間ベクターとして使用された。

プラスミドｐＧＶ７４５はｐＢＲ３２２部分にＣｏＩＥ
Ｉ持児的ｂｏｍザイトサイＩ？−ｒており、実を泡例１
に記載した揉に（アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３
８５０の組み立てについて）、ヘルパープラスミドｆ１
６４ｄｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８を使ってＥ。

ｃｏｌｉからＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ摂動させ
ることができる。

ｐＧＶ７４５を、リファンピシン耐性でありＴｉプラス
ミドｐＧＶ２２１．７を含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｃ
ｒｉｕｍ株Ｃ５８ＣＩに摂動さ仕た。最初の乗り換えは
、°実施例１（アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８
５０の組み立て）に記載した方法と同じ方法で、ｐＢＲ
３２２のアンピンリン耐性を使って選択した。２回目の
乗り換えにより、ｐＧＶ２２１７に存在する欠失置換突
然変異体がプラスミドｐＧＶ７４５のｐ１３Ｒ３２２配
列によって置換される。ｐＧＶ　７４５（７）ｐＧＶ　
２２１７との相互組込みの結果得られるアンピシリン耐
性トランス接合体を、カナマイノン耐性の欠落により直
接選別することにより第２の組換え体を得た。この様に
して、ｐＧＶ２２６０（アンピシリン耐性、カナマイシ
ン感受性）を含んでいるリファンピシンＡ　ｇｒｏｂａ
ｃｔｃｒｉｕｍ抹Ｃ５８Ｃｌを得た。

コｆニア）　Ｔ　ｉプラスミドｐＧＶ２２６０ｉ、ｉ、
ｐＧＶ７００−一またはｐＧＶ７５０−タイプの中間ク
ローニノゲベ′ツター用のアクセプタープラスｌ’（Ｂ
タイプ）として（重用されるらのである。これらは、（
ｉ）アンピノリン耐性遺伝子、復製起源およびｐ■３１
１３２２つｂｏｍザイサイを持ったＤＮＡフラグメント
、（ｉｉ）ＴＬ−ＤＮＡの左イｉの境界配列のすく外側
に（−γ置するＤＮＡ配列および、中間クローニングヘ
クターのＥ、ｃｏｌｉからＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
への転移・止びにそのアクセプターＴｉプラスミドｐＧ
Ｖ２２６０への相互組込みを遺伝学的に選別し得る、ｐ
１３ｒｔ３２２に既に存在している耐性マーカーとは別
の、もう１つの耐性マーカーを含んでいるＤＮＡフラグ
メント、て（１カ成されている。

例えば、本発明者らは、ｐＧＶ２２６０とｐｃｖ７　ｆ
）　ｔ）との間の相互ｍ込み体を持ってぃろＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍは、所望のＤＮＡ配クリ（’ｌ’−Ｄ
ＮＡ境界の間に含まれている）を植物細胞ゲノムへ転移
させ得ることを立証した。この形質転換された植物細胞
は、もしｐＧＶ７００が３つの生産物のための遺伝情報
（４，６ａ、　Ｇｂ；　Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒら、ＩＥ
ＭＢＯＪ、１（１９８２）、１３９−１４６）を含んで
いろ場合は、期待される表現形質、即ち新芽を生じる腫
瘍を示す。この様に、本発明者らは、Ｂタイプのアクセ
プターＴｉプラスミドは、第９図に示し、更に実施例２
に記載したタイプの中間クローニングヘクターとの相互
組込み体として使用すると、ＤＮＡを植物細胞に転移さ
せることができることを証明した。

ｉｌｌ±、植物に発現させようとする遺伝子を含んだ中
間クローニングベクターの組み立て本発明が完成される
まで、ＴｉプラスミドのＴ−領域内の、多かれ少なかれ
でたらめな位置に全遺伝子を挿入しても、その外来性の
配列が植物ゲノムへ転移した後発現されるということは
なかった。本発明方法に従えば、所望の外来性遺伝子（
群）の暗号領域を、植物細胞中で機能することが知られ
ている転写開始および終了信号に連結することができる
。この方Ｃ去の有用性は、ノバリンノンターゼ遺伝子を
フサ帰化しているＤ　Ｎ　Ａ配列か関与する、本発明の
実験によって例証される。この遺伝子の全配列および正
確な転写開始および終了は既知である（Ｄ　ｅｐ−ｉｃ
ｋｅｒら１．Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ａｐｐ１、　Ｇｅｎｅ
ｔ、＋（＋　９８２）、５６１−５７４）。本発明によ
れば外来性遺伝子の蛋白質暗号化領域はｎｏｓプロモー
ターの隣りに挿入することかできる。外来性遺伝子配列
の例として、オクトピンシンターゼ遺伝子の暗号領域（
Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅら１．Ｊ、Ｍｏ１Ａｐｐ１．　Ｇｅｎ
ｅｔ、　　１（１９８２）、　４９９−５１２）をｎｏ
ｓプロモーターに隣接させて挿入する。この構造物はア
クセプターＴ１プラスミド内に摂動され、植物を感染さ
せるのに使用される。生成した腫瘍組織にオクトピンが
存在するかどうかを分析した所、陽性であることがわか
った。

キメラツバリンプロモーターを含有している中間クロー
ニングベクターの組み立て：オクトビンシンターゼ構造
遺伝子を第１８図〜第２０図に示簡単に言えば、ｎｏｓ
遺伝子を含んでいる制限フラグメントｌ１ｉｎｄ　１Ｉ
ｌ−２３をインビトロで処理してｎｏｓ暗号配列の大部
分を除去する一方、制限エンドヌクレアーゼサイトＢａ
ｍｔｌ＋に隣接しているｎｏｓプロモーターは保持する
（第１８図）。ｌＯμｇの　ｐＧＶＯ４２２（完全なｎ
ｏｓ遺伝子を含むｌ１ｉｎｄ　ｌｌｌ−２３７ラグメン
トを持ったｐ［３Ｒ３２２誘導体；　Ｄｅｐｉｃｋｅｒ
ら、　Ｐ　ｌａｓｍｉｄ　（１９８０）、１９３−２１
１）を５ａｕ３Ａで消化し、ｎＯＳプ・ロモーターを含
んだ３５０ｂｐのフラグメントをプレバラティグ５％ポ
リアクリルアミドゲルで分離する。このプロモーターフ
ラプメントを、５°−末端燐酸エステル基を除去するた
めに予め細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処
理した、Ｂｇｌ　ＩＩ−切断ｐＫＣ７（Ｒａｏら、Ｇｅ
ｎｅ７（１９７９）、７　Ｌ−８２）に結合させろ。得
られたプラスミド（ｐＬＧＶ　ｌ　３）２０μｇをＢｇ
ｌ　ＩＩで消化し、４００μｊＪの１２　ｍＭ　ＭｇＣ
Ｉｔ、１２ｍＭｃａｃｌ２．０．６Ｍ　ＮａＣ１、１ｍ
Ｍ　ＥＤＴΔおよび２０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，
０）中、３０℃でＢａ１３１エキソヌクレアーゼ（Ｂｉ
ｏｌａｂｓ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ）７単位を用い
て４〜ｌＯ分間処理する。この間、約２０〜５０ｂｐの
ＤＮＡが除去される。このＢａ１３１−処理分子をＢａ
ｍ＋１１で消化した後、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎ
ｏｗフラグメントと４つのデオキシヌクレオシドトリホ
スフェート（それぞれＩＯｍＭ）と共にインキュベート
して、その末端を満たす。充填されたＢａｍ１−１１末
端とＢａ１３１除去末端とのライゲーションから得られ
る再生ＢａｍＨＩサイトを持ったプラスミドを選別する
。いくつかの候補のＢａｍ）［ｒ　−Ｓａｃ　ＩＩフラ
グメントのサイズを６％尿素−ポリアクリルアミドゲル
中で見積り、サイズが２００〜２８０ヌクレオヂドの範
囲にある候補のヌクレオシド配列を決定する。

プロモーターを持った２０３ｂｐの５ａｃｌｌ−Ｂａｎ
ＨＩフラグメントを含んでいるクローンＩＩ）ＬＧＶ８
１を、ｐＧＶＯ４２２の　ｎｏｓ遺伝子中のＳａｃＩＩ
−ＢａｍＨＩ　　フラグメントと置換ずろのに使用する
　この最終プロモーターベクターはｐＬＧＶ２３８１と
呼ばれる。全ての組換えプラスミドはＥ、　ｃｏｌｉｔ
ｌｒ−１１３１０１の形質転換により選択する。

この様に処理したｎｏｓプロモータを含んでいるプラス
ミドベクターをＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩフラグ
メントに含まれているＯＣＳの暗号配列をこのサイトに
挿入する。このＯＣＳ暗号配列も、インビトロで処理し
、第１９図に示した様に、Ｂａｍ１−１１制限エンドヌ
クレアーゼザイトで囲まれる様にする。オクトピンＴｉ
　プラスミドＢ６Ｓ３の　Ｂａｎ１−Ｉ　Ｉフラグメン
ト１７ａｌ　Ｏμｇ　（Ｄｅ　Ｖｏｓら。

Ｐｌａｓｍｉｄ　６（１９８１）、２４９−２５３）を
ＢａｍＨｌおよびＳｍａｒで消化し、０ＣＳ−暗号配列
を含むフラグメントを１％アガロースゲルから分離し、
ｐＢ１３２２の大きいＢａｍＨｌ　−Ｐｖｕｌ　Ｉフラ
グメントに結合させる；得られたプラスミド、ｐＡＧＶ
８２８（２０μｇ）をＢａｍＨＩで消化し、第１８図に
示した様にエキソヌクレアーゼＢａ１３１で処理し、次
いでＨｉｎｄｌｌｌで消化し、末端を充填し、自己結合
させる。［３ａ１３１除去体のサイズは６％ポリアクリ
ルアミドゲル中で見積る。いくつかの候補のヌクレオチ
ド配列を決定し、５゛−非翻訳リーダー配列の残り７　
ｂｐｆ上けを持ったべＮｌｉを選択して以下の操作に付
す（ｐＯｃｓへ）。ＯＣＳ配列をＢａｍＨｌサイトて囲
むために、Ｃｌａｌ　−１１ｓａｒフラグメントを充填
し、ｐＬ　Ｃ２３Ｇ　（ｆｌｅｍａｕｔら、Ｇｃｎｅｌ
　５（Ｉ　９８　Ｉ）、８１−９３）のＢａ１ｌザイト
（こサブクローンする。得られ）゛ニブラスミドｐＡＧ
Ｖ４０をＢａｍｔｆｌて消化し、ｏｃｓ配列を持ったフ
ラグメントをプレバラティグ１％アガロースケルから電
気溶出により分離し、予めＬ３ａｍＨ［で消化し＋３Ａ
Ｐ（細菌性アルカリポスファクーゼ）で処理したｐＬＧ
Ｖ２３８１に結合させる。

ｏｃｓ配列のｐＬＧＶ２３８１への挿入により、両方の
配向のらのが得られる（ｐＮｏ−１およびＩＩ）ＮＯ−
２）。

ｎｏｓ　：　ｏｃｓ融合の正確な接合点を示すヌクレオ
チド配列を第２０図に示す。

更に、処理したｎｏｓプロモーターを含有しているプラ
スミドベクターは、酵素ジヒドロフオレートレダクター
ゼを暗号化しているプラスミドＲ６７からのＤ　Ｎ　Ａ
を挿入ずろのに使用されろっ／ヒドロフオレー）・レダ
クターセ遺伝子を含んでいろ暗号配列は、Ｂａｍ１−１
１に含まイｔでおり　（０’ＩＩａｒｃら、Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔ１、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ
　　７３（１９８１）、１５２７−１５３１）、従って
既述した様に、プロモーター領域に隣接する１３ａｍＨ
Ｉサイトを含んでいろｎｏｓプロモーターベクターに容
易に挿入される。この遺伝子は、発現されろと抗生物質
メトトレキセートに対する耐性を付与するので、選択可
能なマーカー遺伝子の１つの例である（第２．３．４．
５および７図参照）。この中間クローニングベクターか
５！Ｆ生型ツバリンアクセプターＴｉ　プラスミドを含
んでいるノ＼ｇｒＯｂａｃｔｅｒｉｕｍに摂動されると
、単一乗換えか起り、ハイブリッドＴｉ　プラスミドベ
クターが得られる。このヘクター組成物を、植物の感染
に使用する。得られた腫瘍組織は、０．５μｇ／ｍｌの
メトトレキセートの存在下で継続して生長し得ることが
わかった。

ＯＣＳおよび上記のｎｏｓプロモーターの後のジヒドロ
フオレートレダクターゼ暗号領域を含んでいる中間クロ
ーニングベクターを組み立て、Ａｇｒｏ−ｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍのＴｉプラスミドと相互組込みした後、形質転換
植物細胞に転移、発現させることにより、本発明方法に
よって外来性遺伝子を植物細胞に転移し、発現させるこ
とがてきるということか証明される。

及奄汽ｉ　染色体中に挿入所望の遺伝子を含むにα物細
胞およびＶ（物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれかを使って、
非腫瘍性アクセプターＴＩプラスミド誘導体（例えばｐ
ＧＶ３８５０）で形質転換された植物細胞および全植物
を得た。

（１）　　インビボでの全植物の接種、次いで新芽の再
生が可能な培地上、インビトロての培１’ｔ、（２）損
傷部位で直接新芽の生成を促す他のＡｇｒＯｂａＣｔｃ
ｒｉａ株の存在下、インヒポにおける全植物の相互感染
、 （３）インビトロでの単−植物細胞プロトブラストの共
生培養。

これらの方法について以下に詳述する。

最初の方法は、クラウンガル組織の生産をもたらす全植
物組織の野生型Ａ　ｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ株による
感染体を得る為に通常使用される方法を改良したもので
ある。ｐＧＶ３８５０は腫瘍を形成しないＡ　ｇｒｏｂ
ａｃＬｅｒｉｕｍ誘導体であるので、感染部位において
腫瘍の増殖はみられない。しかし感染した＜ｎ織を取り
除き、組織培養で増殖させろと、形質転換された組織を
容易に得ることができる。初期培養期間（単に組織の１
を増やすため）の後、損傷部位組織を新芽形成が可能な
条件下で増殖させる。

非形質転換細胞およびｐＧＶ３８５０−形質転換細胞の
両者が新芽を発生ずる。形質転換新芽は、ツバリンの存
在をみる簡単な分析により容易に区別することができる
。

本発明者らは、次のプロトコールに従って、Ｎ１ｃｏｔ
ｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ＷｉＳＣＯｎＳ！ｎ　３８
の頭部を切断したタバコの苗木から、ｐＧＶ３８５０−
形質転換カルスよｊよび新芽を得た（全ての操作はラミ
ナーフローフード中、５１１（菌条件下で行なった）。

（１）小さなびん（直径１０ｃｍ、高さＩＯｃｍ）の中
で、０．８％の寒天を含む固形のＭｕｒａｓｈｉｇｅ　
＆Ｓｋｏｏｇ（Ｍ　Ｓ　）培地（Ｍ　ｕｒａｓｈ　ｉｇ
ｅおよびＳｋｏｏｇ。

ｒ’ｈｙｓｉｏ１．　Ｐｌａｎｔ、　　Ｉ　５（１９６
２）、　４７３−４９７）で生育さ仕た６周令のタバコ
の市水を使用する。

（２）外科用メスで最乙若い頭頂の葉を切り取って捨て
る （３）選択的条件（例えばＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０を含んでいろリファンピンン耐性、アンピシリン耐性
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の場合は、１００μｇ／
ｍｌのりファンピシンと１００μｇ　／　ｍ　Ｉのカル
ベニシリンを含んでいるＹＥＢ培地を使用する：ＹＥＢ
培地＝５ｇ／、Ｍ　Ｂａｃｔｏビーフエキス、１ｇ／４
　Ｂａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／４ペプトン、５ｇ／４
シュクロース、２　Ｘ　１０−３Ｍ　ＭｇＳ　Ｏ４。

ｐＨ７，２，１５ｇ／４寒天）で増殖させた新鮮な平板
培養からのＡ　ｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍを、スパーチ
ルまたはつまようじで損傷表面に接種する。各ｐＧＶ３
８５０組み立て物を、少なくとも８本の苗木に接種する
。

（＝１）２週間インキュベートする。接種部位にほとん
どあるいは全く反応が表われないはずであるが、時４組
に小さいカルス（ｃａｌｌｉ）が観察されろ。

（５）損傷表面から厚さ１ｍｍ以下の薄い切片を切り取
る。損傷表面を、オーキシンおよびサイトキニン（１ｍ
ｇ／ｊ２．ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｊ２．ＢへＰ）および
１％シュクロースを添加したＬ　ｉｎｓｍａｉｅｒ　＆
Ｓ　ｋｏｏｇ（ＬＳ）寒天培地（Ｌ　ｉｎｓｍａｉｅｒ
　ａｎｄ　Ｓ　ｋｏｏｇ、　Ｉ）ｈｙｓｉｏ１、　Ｐｌ
ａｎｔ、　　１８（＋　９６５）、１００−１２７）を
含む平板上で培養する。

（６）約６週間後、カルスはその一部をとってツバリン
の存在を試験するのに十分なだけの大きさになる（少な
くとも直径が約５ｍｍになる）。全ての損傷カルスがツ
バリンを生産する訳ではない。７１本の植物の内約１本
がツバリン陽性損傷カルスをつくる。

（７）ツバリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平板に
移す：上記のＬＳ培地＋１％シュクロースおよび１　ｍ
ｇ／克ＢＡＰサイトキニン（８）約４〜６週間後に良好
なサイズの新芽（高さ１ｃｍ）が出る。更に成長させ、
根を形成させるために、この新芽を、ホルモンを含まな
いＬＳＳ培地＋１ンンユクロース含有している新しい寒
天平板に移す。

（９）ツバリンの存在を試験するのに、その一部（１〜
２枚の小さな葉）を切り取れる様に、この新芽を１〜２
週間成長させる。

（１０）ツバリン陽性の新芽を、（１）と同じＭＳ培地
を入れたやや大きい容器（上記と同じｌｏｃｍのびん）
に移し、更に成長させる。

注）感染させた組織のための全ての植物培養培地には、
ｐＧＶ３８５０含有Ａ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対
する選択的毒物として、抗生物質セフオタキシム（ｃｅ
ｆｏｔａｘｉｍｅ、　Ｃ１ａｆｏｒａｎ　Ｒ、ヘキスト
）５００　μｇ／ｍｌが含まれている。この薬物は、全
てのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（カルベニシリン耐性
のものを含む）の生長をよく阻止する。

本発明者らの研究室で、形質転換された新芽を出す♀■
織を得る別の方法が開発された。この方法は、ＡｇｒＯ
ｂａＣｔｅｒｉｕｍのある種のミューラントＴｉプラス
ミド株が、新芽を出すクラウンガル腫瘍を生成させると
いうことを観察したことに基いて開発された。この様な
新芽−誘起（ｓｈ　Ｄに関する突然変異は、Ａ、　ｔｕ
ｍｅｒａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ（転
移ＤＮＡセグメント）の特定の領域に位置している（Ｌ
　ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、ｌ（＋９８２）、１４
７−１５２；　　Ｊｏｏｓら、　　Ｃｅ１ｌ　　３２（
１９８３）、１０５７−１０６７）。誘起された新芽は
完全に正常な非形質転換細胞で構成されていることが多
い。従って本発明者らは、２つの異なったＡ　ｇｒｏ−
ｂａｃｔｅｒｉａ、即ちｌ−）はオクトピンＴｉプラス
ミド放出（ｓｈｏｏｔｅｒ）ミュータントを持ったもの
、もう１つはｐＧＶ３８５０を持ったもの、の混合物で
植物を接種した。この様にすることは、オクトピン放出
ミューチージョンが、ｐＧＶ３８５０で形質転換された
根を誘起することが出来るよい機会を与えろ。Ｔｉプラ
スミドｐＧＶ３８５０およびオクトピン新芽誘起Ｔｉプ
ラスミドを５１の割合で含んているＡ　ｇｒｏｂａｃＬ
ｅｒｉｕｍを（置物に接種した。こうすることによりｐ
ＧＶ３８５０−形質転換新生を得た。この新生は、ツバ
リンの（７（ＩＥについて分析することにより、容易に
進刑することかできる。この方法は、精功な組織培養法
を必要とｊ−ない。ツバリン陽性新芽を、更に成長させ
ろために、Ｌ：ｃ調節ホルモンと共に単純な塩類と蔗Ｒ
’７を含んだ培地に移す。新芽が十分な大きさに達した
後、容易に繁殖のχ）の土壌に移すことができろ。

この共感染法は、簡単に組織培養しにくい種類の植物を
形質転換するのに特に有用である。従って、あらゆる範
囲の農学的にあるいは経済的に重要な植物、例えば豆科
植物、薬用植物および装飾植物をＡｇｒｏｂａｃ＋ｅｒ
ｉｕｍて処置することかできよう。

第３の方法は、Ｎ　１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ＋
＋＋ブａ　ｌ−プラストの単離およびホルモン−非依存
性のＴ−ＤＮＡ−形質転換細胞クローンの選択を、その
プロ）・プラスト−由来細胞と腫瘍性Ａ　ｇｒｏｂａｃ
Ｌｃｒｉｕｍ株との共培養後に実施し得るしのである。

他の優勢な選択マーカー、例えば高等植物細胞で発現さ
れる様に組み立てられた抗生物質耐性Ｊｊｉ伝子を使用
すれば（実施例３参照）、形質転換細胞を選択ずろのに
類似の方法を使用することができる。しかｊ−この場合
は、それぞれのケースについて選択の最適条件をみつけ
る必要がある（選択剤の濃度、形質転換と選択の間の時
間、選択培地中のプロトプラスト−由来細胞または細胞
コロニーの濃度など）。

形質転換細胞の選択かでさない場合、例えばｐＧＶ３８
５０またはｐＧ　Ｖ　２２１７　（Ｌｅｅｍａｎｓら、
ＥＭＢＯＪ、Ｉ　　ａ９ｓ２）、ｚ７−＋ｓ２）の様な
非１１工性のＴ−ＤＮＡミュータントを用いたために選
択が不可能な場合は、遺伝学的形質転換の後に細胞をオ
ーキシン−およびサイトキニンー含何培地（例えば２ｍ
ｇ／ｊ２．のＮ　Ａ　Ａ　（α−ナフタレン酢酸）およ
びｏ、３ｍｇ／、ｅのカイネチンを含むＭｕｒａｓｂｉ
ｇｃおよびＳ　ｋｏｏｇ培地（Ｍ　ｕｒａｓｈ　ｉｇｅ
およびＳ　ｋｏｏｇ、　Ｐ　ｈｙｓｉｏ１、　　Ｐｌａ
ｎｔ　　１５（１９６２）、　　４　７３　−４９７）
）で培養し、形質転換コロニーをそのオパイン（ｏｐｉ
ｎｅ）含有量で同定することができろ。この様にして、
アグロビン（ａｇｒｏｐｉｎｅ）およびマノビン（ｍａ
ｎｎ。

ｐ　ｉ　ｎｅ）合成の電気泳動分析（方法についてはＬ
　ｃｃｍａｎｓら、　　Ｊ、　Ｍｏ１．　　Ａｐｐ１、
　　Ｇｅｎｅｔ、　　ｌ　（１９８１）。

１・１９〜１６４参照）の後、約６６０コロニーか、ｐ
ＧＶ２２＋７で感染後に得られ、ＴＲ−暗号化オパイン
・マノビン（Ｎ２−（１−マニヂル）−グルタミン）を
ｈＩｉ１２オる　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　　％ａｂａｃｕ
ｍ　　ＳＲ１セルラインであることがわかった。このセ
ルラインのカルス切片を再生培地（唯一の植物成長調節
剤としてＢΔＰ（６−ペンノルアミツブリン）（Ｉｍｇ
／Ｊｌ）を含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏ
ｇ培地）上で培養すると、数多くの新芽か形成した。分
析；７た２０の新ノ４；の全てが、依然としてマノビン
を合成することろくできた。ホルモンを含まないＭｕｒ
ａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　　Ｓ　ｋｏｏｇ培地に移した後
、これらの新芽は、依然としてマノビンを含ｆｆ１１、
形態学的に正常なタバコ植物に成長した。

Ｎ、　＋、ａｂａｃｕｍについて次に記載するプロトプ
ラストの分離および形質転換法は、Ｎ、　ｐｌｕｍｂａ
ｇｉｎｉ−「ｏｌｉａにら用いることができる。

２　実験手；５１ミ ２．１　新芽培養条件 培養室内の無菌条件下（１日１６時間、＋５００ルツク
スの白色蛍光（“ＡＣＥＣＬＦ　　５８Ｗ／２４３００
°Ｋ　　Ｅｃｏｎｏｍｙ”）、２４°Ｃ１相対湿度７０
％）、２５０Ｊ’、のガラスびんに入れたホルモン不含
のＭｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ培地（Ｍ　
ａｒａｓｈ　ｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏ１
、　Ｐｌａｎｔ　　ｌ　５（１９６２）。

４７３−４９７）上でＮ　１ｃｏＬｉａｎａ　　ｔａｂ
ａｃｕｍの新芽培養を維持する。５週令の新生培養をプ
ロトプラストの分離に使用ずろ。

２．２．プロトプラストの分離 プロトプラストの分離および培養における全ての工程は
無菌操作で行なう。混合酵素法によりプロトプラストを
分離する。長さ２ｃｍ以下の非常に若い葉を除く、全て
の葉をプロトプラストの分離に使用することができる。

鋭利な外科用のメスで、葉を幅約２−３ｍｍの細長い小
片に切断する。この葉材料２〜３ｇを、酵素混合物５０
ｍ兇中１暗所で、２４℃にて１８時時間置培養する。こ
の酵素混合物は、ホルモン不含のに３培地中、０．５％
セルラーゼ０ｎｏｚｕｋａ　　Ｒ−１０および０．２％
マーｃｏザイム０ｎｏｚｕｋａｌｔ　−１０からｆエラ
でいろ（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、　Ｚ、　Ｐｆｌ
ａｒ＋ｚｃｎＩ）ｈｙｓｉｏ１、　　７８（１９７６）
、　４５３−４５５）。この１昆合物は、０．２２μｍ
細孔欣を通して１過減菌し、顕著な活性の低下をきたす
ことなく、−２０°Ｃて少くと６６力月間貯蔵すること
ができろ。

２．３．プロトプラスト培養 １８時間培養した後、プロトプラストを放出するために
混合物を（コやかに攪拌する。次いでこの、昆合物を５
０μｍのふるいを通してシ濾過し、シ戸液をＩＯｎ＋４
の遠心管に序オ。振動ハヶッローターに入れて６０〜８
０ｇで６分間遠心分離すると、プロトプラストか暗緑色
の１７遊バンド（帯）を形成する。プロトプラストの下
層の液およびペレット状の残骸を、蛇動ポンプに連結し
た毛細管を使って取り除く。プロトプラストを１つの遠
心管に集め、培養培地で２回洗浄する。この培養培地は
、ＮＡＡ（ｏ、＋ｍｇ／ｌ）およびカイネチン（０，２
ｉｇ／克）を成長調節剤として含有するに３培地である
（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、　Ｚ、　Ｐｆｌａｎｚ
ｅｎｐｈｙｓｉｏｌ。

７８（１９７Ｇ）、　、１５３−・１５５）。この培地
はｐＩＩ　５　、６に調節し、０．２２μｍのシ濾過ｉ
反を通して減菌する。２回目の洗浄の後、Ｔ　ｈｏｍａ
血球１什算器（“Ａｓ５ｉｓｔａｎｔ”、西ドイツから
入手）を用いてプロ！・プラストを計測し、最終密度１
０５プロトプラスト／ｍｉ−となる様に培養培地に懸濁
する。直径９ｃｍの組織培養用良質ペトリ皿当たりｌＯ
ｍ乏の容量でプロトプラストを培養する。このペトリ皿
をＰａｒａｆｉｌｍＲてシールし、２４°Ｃで、暗所法
いてかすかな光（５００〜＋０００ルツクス）を当てて
２４時間培養する。

２．４．共生培養による形質転換 分離５日後にプロトプラスト培養株を感染さ什る。Ａ　
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを液体ＬＩ３培地（Ｍｉｌｌ
ｅｒ。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）、　　　Ｃｏ１ｄ
　　　　Ｓｐｒｉｎｇ　　　　）［ａｒｂｏｒ　　　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｎ　ｅｗ　　Ｙ　ｏｒｋ）中で１８時間培養後、２ＸＩ
Ｏ’細胞／ｍａｌの密度となる様にに３培養培地に再懸
濁する。この懸濁液５０μ児をｈａ物プロトプラスト培
養株に加え、Ｐ　ａｒａｆ　ｉｌｍＲでシールした後、
二の培養株を２．３．と同じ条件下で培養する。・１８
時間後に培養株をｌ　ＯＪの遠心管に移し、振動バケツ
ローターに入れ、６０〜８０ｇで６分間遠心分離する。

浮遊バンドおよびペレットを集め、抗生物質（カルへニ
ンリン１０００μｇ／Ｊまたはセフォタキシム５００　
μｇ／ｍｊ２．）をＮｌｉ足したＫ　３培地（Ｎａｇｙ
およびＭａｌｉｇａ、　Ｚ、　Ｐｆｌａｎｚｃｎ　ｐｈ
ｙｓｉｏ１７８（１９７６）、４５３−４５５）ＩＯｍ
Ｊｌに再懸濁する。

培養２週間後、プロトプラスト−由来マイクロカルスを
遠心分離し、面記と同濃度の成長、調節剤および抗生物
質を含むがンユクローースに関しては０　、４　Ｍの代
りに０．３Ｍ含むに３培地（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇ
ａ、　Ｚ、　ＰＮａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏ１、　７８（
Ｌ　９７６）、４５３−４５５）に再懸濁する。二の培
地の細胞宮邸は約２５ｘ１０３マイクロカルス／ｍＲ。

に調節する。同じ条件下で更に２迩間培ｊ％した後、カ
ルスを、面記と同濃度の抗生物質を含むが、より低コ度
のンユクロース（０，２〜１）と成長１凋節剤（Ｎ１ヘ
ノ＼ｏ、０１ｍｇ／児、カイ不チ：、ｚ０．０２ｍｇ／
４）を含むに３培地に移す。更に２〜３週間培養後、形
質転換体と推定されるものは、その淡緑色の密な外観、
およびより良好な成長度から認識ずろことができる。こ
れらのコロニーを、より低濃度の抗生物質（カルベニシ
リン５００μｇ／ｍ　ｉまたはで）オタキシム２５０μ
ｇ／Ｊ）を含むがホルモン不含の０．６％寒天固形培地
（Ｌ　ｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋ。

ｏｇ、　ｒ’ｈｙｓｉｏ１．　Ｐｌａｎｔ、　　１８（
１９６５＞、　　ｌ　００−　＋　２７）に移す。形質
転換体と推定されるらのが直径的３−４　ｍｍに達した
時、ホルモン不含の培地で生育しているそれらにオパイ
ン試験を唯すことができる。各コロニーの半分を、才り
トピンおよびツバリン（Ａｅｒｔｓら、Ｐｌａｎｔ　　
Ｓｃｉ、　　Ｌｅｔｔ。

１７（１９７９）、　４３−５０）または７グロピンお
よびマノピン（Ｌ　ｅｅｍａｎｓら、Ｊ、　Ｍｏ１．　
Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、＋（＋９８１）、１４９−１６４）の検出
に使用する。この試験により、ホルモン不含の培地で選
択されたコロニーの形質転換された性質を確認すること
ができる。その後、選択されたコロニーを抗生物質不含
の培地で培養することがてき２．５　ホルモン不含培地
」二の選択なしのノー生培養 形質転換細胞の／ｂの選択ができない（例えば無ｉｉ；
＝（ｆｌ：Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａミュータントを使ったため
）場合、またはそれが必要でない場合（抗生物質耐性遺
伝子の様な優勢な選択し得るマーカーがＴ　　ＤＮ／〜
にａ在している為）、プロトプラスト−由来細胞の処理
を簡略化することかできる（ホルモン減少工程はらはや
必要でない）。感染段階まで、プロトプラストを既述し
た様に処理する。細菌を加えて４８時間後にプロトプラ
スト−由来細胞を遠心分離しく６分、６０６０−８Ｏ、
非常に低密度で細胞の成長を推持することがてきるＡＧ
培地（Ｃａｂ。

ｃｈｅ、　Ｐｌａｎｔａ　＋　４９（１９８０）、　　
７−１８）に再懸濁する。Ｆ　ｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔ
ｈａｌ計数チエインバー（“Ａｓ５ｉｓｔａｎｔ”、西
ドイツより入手）を使って計測し、以下の操作に必要な
密度になる様に再懸濁する。

オパイン試験のためにコロニーを個々に操作しなければ
ならない場合は、低細胞密度（１ｍｌ当たり１００プロ
トプラスト−由来；ｉｌｌ胞および細胞コロニー）てれ
［′［えつ（トると、１力月のＦ＆養て大ごい；ｌｉｔ
胞コロニーが得られる。形質転換細胞を薬物で選択でき
ろ場合ｉよ、９１１）胞を高密度（ｌ　Ｏ’　−１０’
、／ｍＪｌ）で培ｆ％し、各タイプの選択に最適な時期
伎び濃：ｌ−Ｌ・、その使用する選択剤を培地に添加す
／）。

２．６．カルス組織から全に！′（物の再生カルス組織
から正常ｔｔｌ’ｌ物を容易に得ることができろ（例え
ばプロトプラスト形質転換から、または全植物接種から
（２，７参ｊｊｊ（）得られる）。カルス組織を、Ｉ　
ｍｇ／ｍ　ｆｌの１３ＡＩ’を含んでいろＮｉｕｒａｓ
ｈｉｇｃａｎｄ　　Ｓ　ｋｏｏｇ培地で増殖させる・こ
の培地は１〜２力月後に新芽を形成させろ。この新芽を
ホルモン不含の培地に移し、恨を形成させ、完全ｔｊ、
　ｔｉｎ物をつくら什ることがてきる。

２．７．タバコ苗木への腫瘍の誘導 タバコの種子（例えば裁培品種Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　３
８）の表面を７０％変性エタノール／　Ｉ−１！Ｏで２
分間、次いで１０％の市販の標白剤と０．１％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で処理して滅菌し、更に滅菌
水で５回洗ａ卜する。この滅菌した種子を、Ｍｕｒａｓ
ｈｉｇｅ　　ａｎｄ　　Ｓｋｏｏｇ（０，７％寒天）培
地の塩類を含む大型試験管（幅２５ｍｍ、ポリカーボネ
ー１−製のキップ付）にまく。次いてこの試験管を培ｊ
ｔ室（１２，０００ルツクス、１６時間照射／８時間非
照射、７０％相対湿度、２・１°Ｃ）に入れて培養する
。４〜６週間経つと植物は使用できる状態になる。少な
くともその後１カ月間は最適の状態をイイ（：持する。

苗木は少なくとも高さ３ｃｍになり、４枚またはそれ以
上の葉を持つはずである。新しい外科用メスで植物の最
も若い面間を通して横に頭部を切断する。植物の」二の
部分を試験管から取り除き、火にかけたスパーチルで平
板寒天培健から細菌を損傷表面に塗抹する。野生型の場
合は２週間後に、ある種の変性ミュータント株の場合は
もっと後に腫瘍が現れる。この方法は、タバコ（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ　　Ｌａｂａｃｕｍ）、Ｎ　１ｃｏＬｉａ
ｎａ　　ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａおよびびＰ　
ｅｔｕｎｉａ　　ｈｙｂｒｉｄａを接種するのに使われ
る。

以」二述べた如く、本発明は、野生型Ｔｉプラスミドの
Ｔ−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブリッドＴｉプ
ラスミドを保持しているＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
で、初めて植物を形質転換することを可能ならしめたし
のである。Ｔｉプラスミドから植物細胞へのＤ　Ｎ　Ａ
の転移に及ぼすＴ−領域の腫瘍機能の影響は知られてい
ないので、それでも所望の遺伝子を含んでいる改良Ｔ−
領領域植物細胞への転移が起ることは驚くべきことであ
る。、二の転移ＤＮＡは植物細胞ゲノムに相互組込みさ
れ、安定に保持される。更に、選択した所望の遺伝子は
、その遺伝子が適当なプロモーター配列を含んでいろか
、あるいは含む様に組み立てられろと発現することがで
きる。所望の遺伝子を含んでいる中間クローニングベク
ターと、特別に設計されたアクセプターＴｉプラスミド
との間で単一乗換えを行わせるという本発明の概念（ア
イディア）は、植物細胞の形質転換の為のハイブリッド
Ｔｉプラスミドベクターの組み立てを著しく簡単なもの
にずろらのである。この特別に設計されたアクセプター
Ｔｉプラスミドは、所望の遺伝子（これは中間クローニ
ングベクターの一部と同じであるかまたはこれに関連１
−でいるクローニング媒体中に挿入されている）が単一
乗換えによって（目五組込み体を形成ずろことができる
様に、通常のクローニング媒体のＤ　Ｎ　、＝〜上セグ
メント含んでいる。このクローニング媒体の２つのセグ
メントが、組換えの為に必要な相同領域を提供する。

本発明方法によって調製された微生物、中間クローニン
グベクター、アクセプターＴｉプラスミド、およびハイ
ブリッドプラスミドベクターは、１９８３年１２月２１
日、Ｇｅｒｍａｎ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ　　Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＤＳＭＸＧｏｅｔｔｉｎ
ｇｅｎ）に寄託され、確認された以下の培養株で例示さ
れる：（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　Ｋ
　１２１−ＩＢ　Ｉ　ＯＩ中の中間ベクタープラスミド
ｐＡｃｇＢ。

（２）カルベニシリン耐性アクセプターＴｉプラスミド
ｐＧＶ３８５０を保有しているＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｔｅｎｓ　　Ｃ５８Ｃｌ　　
リファンピシン耐性株、 （３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ　　Ｋ　１
２株に５１４（Ｌｈｒ　　ｌｃｕ　　ｔｈｉ　　ｌａｃ
　　ｈｓｄＲ）中の中間ベクタープラスミドｐＧＶ７０
０、 （４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　Ｋ　ｌ
　２株に５１４（（３）と同じ）中の中間ベクタープラ
スミドｐＧＶ７５０、 （５）カルベニシリン耐性アクセプターＴｉプラスミド
ｐＧＶ２２６０を保有しているＡ　ｇｒｏｂａｃＬｃｒ
ｉｕｍ　　ｔｕｍｃｆａｃｉｅｎｓ　　Ｃ５８Ｃ１リフ
ァンピシン耐性株、 （６）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　Ｋ　ｌ
　２　　ＨＢ　１０１中の、ツバリンプロモーター支配
下のオクトビンシンターゼ暗号領域を保有している中間
ベクタープラスミドｐＮｏ−１、 （７）中間ベクターのＡ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ
の摂動に使用された株＝摂動プラスミドｐＧＪ　２８お
よびＲ６４ｄｒｄｌ　１（Ｖａｎ　　Ｈａｕｔｅら、Ｅ
ＭＢＯＪ。

２（＋　９８３）、４１１−４１８）を保有しているＧ
Ｊ２３．ＧＪ２３はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
ｉ　　Ｋ　１２、ＪＣ２９２６，ＡＢ＋　１５７のｒｅ
ｃＡ誘導体である（Ｈｏｗａｒｄ　−Ｆ　１ａｎｄｅｒ
ｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　４９（＋　９６４）、２３
７−２４６）。

これらの培養株の受理番号は、それぞれ２７９２（１）
、２７９８（２）、２７９６（３）、２７９７（４）、
２７９９（５）、２８３３（６）、および２７９３（７
）である。

本発明の態様を色々と記述したが、その基本的な構成を
変化させれば本発明に係る方法および組成物を利用する
その他の態様が得られることは言うまでもない。

【図面の簡単な説明】

第１図はアクセプターＴｉプラスミドの模式図、第２図
および第３図はアクセプターＴｉプラスミドに挿入され
る中間クローニングベクターの模式図、第４図はハイブ
リッドＴｉプラスミドベクターの調製法を示す模式図、
第５図は中間クローニング媒体中−の遺伝子転移過程の
概略を示す模式図、第６図はＡタイプのアクセプターＴ
ｉプラスミドの組み立てを示す模式図、第７図は中間ク
ローニングベクターの組み立てを示す模式図、第８図は
ＢタイプのアクセプターＴｉプラスミドの組み立てを示
す模式図、第９図はＢタイプのアクセプターＴｉプラス
ミドに挿入される中間クローニングベクターの模式図、
第１Ｏ図はハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組み
立てを示す模式図、第１１図は５　、２　ｋｂＨ１ｎｄ
ｌｌｌフラグメントＡｃｇＢのｐＩ３Ｒ３２２への挿入
を示す模式図、第１２図はツバリンＴｉプラスミドＩ）
ＧＶ３８３９のＴ−領域を示す模式図、第１３図はアク
セプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０の組み立てを示
す模式図、第１４図は中間クローニングベクターｐｃ　
Ｖ　７００の組み立てを示す模式図、第１５図は中間ク
ローニングベクターｐＧＶ７５０の構造を示す模式図、
第１６図は中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立てを示す
模式図、第１７図はアクセプタープラスミドｐＧＶ２２
６０の組み立てを示す模式図、第１８図はプラスミドｐ
ＬＧｖ２３８１の組み立てを示す模式図、第１９図はプ
ラスミドｐＡ、ＧＶ１０の組み立て、およびその、プラ
スミドｐＬＧＶ２３８！への挿入を示す模式図、第２０
図はオクトピンンンターゼ遺伝子暗合化領域と融合する
前後の、ツバ”、１ノノノンーセ、ａ伝子のブ［ｌモー
ター領域の１℃団のヌクし・オチｌ−配列を示すｉ芭弐
ＴＣうろ。 払、Ｉ”Ｆ　ＩＩ：　：項六　７２ｒ２！ス・ブラ；’
　ｊ’　・７　セルノ３，７１、・ツァ・フエルデルン
ク・デア・ ヴイノセ／ノヤフテン・ニー・ファウ 代　理　人　弁理士　青山　葆　）ｋ１名Ｆｉｇ、４ ■　　　　Ｆｉｇ、５ Ｒ１Ｒ２ Ｆｉｇ、７ ・１ｑ、１０ Ｆｉｇ、　１２ Ｆｉｇ、　Ｄ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも、（ｉ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領
   域の２つの境界配列（１）および（２）、（ｉｉ）クロ
   ーニング媒体由来の非腫瘍性ＤＮＡセグメント（３）お
   よび（３’）、 （ｉｉｉ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにより、野生型
   ＴｉプラスミドのＴ−領域を植物細胞ゲノム中に転移さ
   せるのに必須であるＤＮＡ配列を含んでいる野生型Ｔｉ
   プラスミドのセグメント（４）、および （ｉｖ）２つの境界配列（１）および（２）の間に設置
   された少なくとも１つの所望の遺伝子（５）を含んでい
   るハイブリッドＴｉプラスミドベクターを保持している
   Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで植物細胞を感染させるこ
   とからなる形質転換植物細胞の調製法。 ２、少なくとも、（ｉ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領
   域の２つの境界配列（１）および（２）、（ｉｉ）クロ
   ーニング媒体由来の非腫瘍性ＤＮＡセグメント（３）お
   よび（３’）、 （ｉｉｉ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにより、野生型
   ＴｉプラスミドのＴ−領域を植物細胞ゲノム中に転移さ
   せるのに必須であるＤＮＡ配列を含んでいる野生型Ｔｉ
   プラスミドのセグメント（４）、および （ｉｖ）２つの境界配列（１）および（２）の間に設置
   された少なくとも１つの所望の遺伝子（５）を含んでい
   るハイブリッドＴｉプラスミドベクターの２つの境界配
   列（１）および（２）の間に設置されたＤＮＡセグメン
   トを、そのゲノム中に組込んで含有している形質転換植
   物細胞。 ３、少なくとも、（ｉ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領
   域の２つの境界配列（１）および（２）、（ｉｉ）クロ
   ーニング媒体由来の非腫瘍性ＤＮＡセグメント（３）お
   よび（３’）、 （ｉｉｉ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにより、野生型
   ＴｉプラスミドのＴ−領域を植物細胞ゲノム中に転移さ
   せるのに必須であるＤＮＡ配列を含んでいる野生型Ｔｉ
   プラスミドのセグメント（４）、および （ｉｖ）２つの境界配列（１）および（２）の間に設置
   された少なくとも１つの所望の遺伝子（５）を含んでい
   るハイブリッドＴｉプラスミドベクターの２つの境界配
   列（１）および（２）の間に設置されたＤＮＡセグメン
   トを、そのゲノム中に組込んで含有している形質転換植
   物細胞から生成した植物。