JPS60203195A - 植物遺伝子の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は植物遺伝子の発現に関する。

（従来技術） シャトルベクター Ｒｕｖｋｕｎと八ｕｓｕｂｅｌ　（１９８１）　Ｎａｔ
ｕｒｅ　２８９：８５−８８゜により開発されたシャト
ルベクターは外来遺伝物質を大プラスミド、ウィルスま
たはゲノムの選ばれた位置に挿入する方法を可能とする
。大プラスミド又はゲノムを扱う場合、２つの主要問題
がある。１つは大プラスミド各制限酵素の多くの部位を
有する。特定の部位特異的切断反応は再現性がなく、多
部位切断反応とそれに続く連結は変化させたくない多く
のフラグメントの順序、方向を混乱させる大きな難点を
生ずる。第二に大ＤＮＡプラスミドを用いた形質転換効
率は非常に低い。シャトルベクターは、しばしばインビ
１−口で、外来遺伝物質を小プラスミドに容易に挿入し
１次に通常インビボ技術により、大プラスミドに移すこ
とにより、これらの困難を打開することが可能であシャ
１〜ルヘククーは究極の受容細菌へ導入され得る１通常
プラスミドであるＤＮ八へ子より成る。

それは又、外来遺伝物質が挿入され得る受容ゲノムのフ
ラグメントのコピーと、これもまた受容ゲノムフラグメ
ントに挿入される選択形質をコードするＤＮＡセグメン
トを含む。選択形質（”マーカー″）ばトランスボソン
突然変＋１′４誘発または制限酵素とりガーゼにより容
易に挿入される。

該シャ１ニルベクターは究極受容細胞、典型的にはアグ
ロバクテリウム属の細菌、へ三組交雑（Ｒｕ　ｖ　ｋ　
ｕ　ｎと八ｕｓｕｂｅｌ　、前出）、二親交５：１４で
の自己可動性ヘククーの直接移送、アグロバクテリウム
細胞による外部Ｄ　Ｎへの直接取込ｔ７Ｊ（Ｍ、　ｌ１
ｏｌｓＬｅｒｓｅｔ、　ａｔ、（１９７Ｂ）　Ｍｏ１ｅ
ｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６３：１８１−１８
７の条件を用いる”形質転換”）、他の細菌細胞とアグ
ロバクテリウムのスフェロプラスト融合。

リポソーム包括ＤＮＡの取込み、またはインビトｌコで
パッケージ可能なウィルス上にあるシャトルベクターの
感染、により導入される。三組交雑はプラスミド可動と
接合移送に関する遺伝子を有する可動性プラスミドを有
する菌株とシャトルベクターを有する菌株との交雑を含
む。もしシャトルヘクターがプラスミド遺伝子により移
動可能ならば、そのシャトルヘクターは大ゲノム、例え
ばアグロバクテリウム菌株のＴｉまたはＲｉプラスミド
を有する受容細胞へ移される。

シャトルベクターが受容細胞へ導入された後。

マーカーのいずれか一方の側での１回の組換えを伴う二
重乗換えが期待される。この現象はマーカーを含むＤＮ
Ａセグメントを受容ゲノムへ移し。

挿入物を欠く相同セグメントと置換することになるだろ
う１元のシャ１〜ルヘククーを欠失した細胞を選択する
為に、そのシャトルベクターは究極受容細胞中で複製が
不可能であるか、受容細胞に既存の独立に選択可能なプ
ラスミドと不和合性でなければならない。この為の１つ
の共通的な手段はシャトルへフタ−と不和合性でかつ他
の薬剤耐性マーカーを有する他のプラスミドを第３の親
に備えることである。従って両薬剤剛性で選択すると。

生存細胞はその中でシャトルベクターのマーカーが受容
ゲノムと組換えを起こしたもののみである。

もしシャトルベクターが余分のマーカーを持っていれば
、シャトルベクターζ受容プラスミド間での１回の乗換
えの結果性しる完全なシャトルベクターが受容プラスミ
ドに組み込まれたものを有する細胞を選択し、排除でき
る。もし外来遺伝物質が選択しようとするマーカー内か
、近接した位置に挿入されていれば、同じ二重組換の結
果、それは受容プラスミドに組み込まれるであろう。相
同フラグメントのマーカー内または近接した位置でなく
、外来遺伝物質がマーカーから遠く離れて挿入されてい
る場合、外来遺伝物質とマーカーの間で組換えが起こり
、外来遺伝物質を移せない事も起こるだろう。

シャトルベクターはアグロバクテリウムのプラスミドの
操作に有用であることが証明されている。

参照　Ｄ、Ｊ、Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅｔ　旦、（１９
８１）　Ｃｅ１ｌ　２７　：１４３−１５３．　八、Ｊ
、Ｍ、Ｍａｔｚｋｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ
　（１９８１）Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ
、上：　３９−４９．およびＪ、Ｌｅｅｍａｎｓ旦旦、
　（１９８１）　Ｊ、Ｍａｌｅｃ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅ
ｎｅｔ、上：　１４９−１６４、ここではシャトルベク
ターを”中間ベクター（ｉｎＬｅｒｍｅｄｅａｔｅ　ｖ
ｅｃｔｏｒｓ）　″と呼んでいる。

アグロバクテリウム−概説 グラム陰性細菌、リゾビウム科のアグロバクテリウム属
に、アグロバクテリウム・チューメファシエンス（Ａ、
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）種とアグロバクテリウム・
リゾゲネス（Ａ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）種がある。こ
れらの種は夫々植物のクラウンゴール病２毛状根病（ｈ
ａｉｒｌｙ　ｒｏｏｔ　ｄｉｓｅａｓｅ　）の原因とな
る。クラウンゴールは未分化組織のｇ　（ｇａｌｌ）化
に特徴づけられる。毛根は感染組織での異常な根（ルー
ト）の誘導により特徴づけられる奇形腫である。両病に
おいて、異状な増殖植物組織は植物により正常には生産
されない通常オビンとして知られている１つまたはそれ
以上のアミノ酸誘導体を生産し。

これは感染細菌により異化される。既知のオビンは３族
に分類され、その典型的なメンバーはオクトピン、ツバ
リン、アグロピンである。巽常増殖組織の細胞は培養に
より増殖可能であり、また適当な条件下で形質転換した
表現型を保らつつ完全な植物に再生される。

アグロバクテリウムのヴイルレン１−株はアグロバクテ
リウム・チューメファシエンスではＴｉ　（腫瘍誘’Ａ
￥　；　Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）プラスミド、
アグロバクテリウム・リゾゲネスではＲｉ　（ルートＲ
Ａ４　；　ｒｏｏＬ−ｉｎｄｕｃｉｒ＋ｇ）プラスミド
と呼ばれる大プラスミドを有する。これらのプラスミド
を菌から消去すると病原性を失う。ＴｉプラスミドはＴ
−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）と呼ばれる。腫瘍では宿主植物
のゲノム中に組み込まれている。領域を含む。Ｔ　−’
Ｄ　Ｎ　Ａは数種の転写物をコードしている。突然変異
の研究からこれらのうちのいくつかは１ｌｊｌ＋瘍の増
殖の誘導に関与している事が示された。ｔｎ＋ｌ、ｔｎ
＋ｒおよびｔｍ４伝子の変異は夫々巨大腫瘍（タバコで
）。

ルート出現傾向、シュート誘発傾向を示す。Ｔ−Ｄ　Ｎ
　Ａはまた少なくとも１つのオピンシンセターゼ遺伝子
をコードし、Ｔｉプラスミドは、しはしば。

それが合成し得るオピンにより分類される。　各Ｔ−Ｄ
ＮＡ遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下にある。

このＴ−ＤＮＡプロモーターは真核生物のプロモーター
に構造が類似しており、形質転換植物細胞でのみ機能す
るらしい。ＴｉプラスミドはまたＴ−ＤＮＡ領域外にに
も遺伝子を担っている。これらの遺伝子はオビン異化１
発癌性、アゲロジン感受性、複製、細菌細胞への自己輸
送の機能に関与している。ＲｉプラスミドはＴｉプラス
ミドと類似の構造をとっている。植物細胞の形質転換に
関与する一連の遺伝子とＤＮＡ配列は以下形質転換誘導
因子（ＴＩＰ）として総合的に呼ぶ。

従ってＴＩＰの名称はＴｉおよびｌｌｉプラスミド両者
を包含する。ＴＩＰの取り込まれたセグメントを。

ここではＴ−ＤＮＡと称し、ＴｉプラスミドあるいはＲ
ｉプラスミドに由来している。最近の７グロパクテリウ
ム起因病の一般的総説はり、Ｊ、Ｍａｒｌｏ（１９８２
）　。

八ｄｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ、　１　：１３９−
１７８．　Ｌ、し１．Ｒｅａｍ　ａｎｄＭ、Ｐ、Ｇｏｒ
ｄｏｎ　（１９８２）　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１８　
：　８５４−８５９．および門、Ｗ、Ｂｅｖａｎ　ａｎ
ｄ　Ｍ、Ｄ、Ｃｂｉｌｔｏｎ　（１９８２）　、八ｎｎ
。

Ｒｅｂ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６　：　３５１−３８４：
　Ｇ、Ｋａｈｌ　ａｎｄ　Ｊ、Ｓｃｔ＋ｅｌｌ（１９８
２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂａ１ｏｌｏ　ｏｆ　Ｐｌ
ａｎｔ　Ｔｕｍｏｒｓに述べられている。

アグロバクテリウム−植物ｍｌ織の区東植物細胞は既知
の多くの方法によりアグロバクテリウムにより形質転換
され得る；例えば植物細胞とアグロバクテリウムとの共
存培養；植物の直接感染；植物プロトプラストとアグロ
バクテリウムスフェロプラストの融合；植物細胞プロト
プラストによるｍＭｔｌＮＡの取込みによる直接形質転
換；部分的に細胞壁を再生しているプロトプラストの完
全な細菌による形質転換；プロトプラストのＴ−ＤＮＡ
含有リポソームによる形質転換；Ｔ−ＤＮＡを保持する
ウィルスの利用；ミクロインジェクション等。どの方法
も遺伝子が確実に発現される限り充分であり、有糸分裂
および減数分裂を通じて安定に伝達される。

植物組織のアグロバクテリウムによる感染は熟練した技
術者には公知の単純な技術である。（例Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ
ｏｇｉｓｔｓ、ｅｄｓ、：Ｄ、Ｓ、Ｉｎｇｒａｎｍｓ　
ａｎｄ　Ｊ、Ｐ、Ｉ（ｅ１ｇｅｓｏｒ＋、　ｐｐ、２０
３−２０８参照）。植物は種々のどの方法によっても傷
つけられる１例えば刃で切る。針で穴をあける。あるい
は研磨剤で摺るなど。次いで傷口を腫瘍誘導細菌を含む
溶液で感染させる。完全な植物を感染させる他の方法は
ジャガイモの塊茎小片（Ｄ、に、Ａｎａｎｄａｎｄ　Ｇ
、Ｔ、１Ｉｅｒｂｅｒｌｅｉｎ　（１９７７）　Ａｍｅ
ｒ、Ｊ、１１ｏｔ、　６４　：　１５３−１５８）また
はタバコ茎の断片（Ｂｉｎｎｓ旦　旦、）などの組織の
小片を植えつけることである。ＲＢ　１ｍ。

後、腫瘍は植物ホルモンを含まない培地で組織培養され
得る。ホルモン非依存性増殖は形質転換植物組織の典型
であり、培養！ｌＪｌ織の増殖の通常の条件とは大いに
対照的である（八、Ｃ，Ｂｒａｕｎ　（１９５６）Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　１６　：　５３−５６　）。

アグロバクテリウムはまた単＾１【細胞および培養細胞
（Ｍａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）　Ｎａｔｕ
ｒｅ　η１ノ１２９−１３１　）およびｊｌｌｔしたタ
ハ゛コ葉肉プロトプラストを感染させ得る。後者の技術
では、新しい細胞壁を一部再生させる時間をおいて９次
いでアグロバクテリウム細胞を培養に加え、後、抗生物
質を添加し殺した。アグロバクテリウム・テユーメファ
シエンス細胞に接触し、Ｔｉプラスミドを保持した細胞
のみホルモンを含まない培地にプレートしたときカルス
を形成した。大部分のカルスはオピン同化に関する酵素
活性を有していた。他の研究者（Ｒ，Ｂ、ＩＩｏｒｓｃ
ｈ　ａｎｄ　Ｒ，Ｔ、Ｆｒａｌｅｙ　（１８Ｊａｎｕａ
ｒｙ１９８３　１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　）は共存培養により、形質転換し
ホルモン非依存性増殖するカルスを高頻度（１０％以上
）で得、カルスの９５％がオピンを作った。Ｍ、Ｒ，Ｄ
ａｖｅｙ　ａｔ　旦、（１９８０）ｉｎ　Ｉｎｇｒａｍ
　ａｎｄ　ｌｌｅｌｇｅｓｏｎ、前出、　ｐｐ、２０９
−２１９．はプロトプラスから再生した老細胞の感染に
ついて述べている。

植物プロトプラストはＴＩＰプラスミドの直接取込みに
より形質転換され得る。Ｍ、Ｒ，Ｄａｖｅｙ　ｅｔａｌ
、（１９８０）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、　１
８　：３０７−３１３．およびＭ、Ｒ，Ｄａｖｅｙ　ｅ
ｔ　ａｌ、　（１９８０）　ｉｎ　Ｉｎｇｒａｍ　ａｎ
ｄＩｌｅｌｇｅｓｏｎ、前出、はペチュニアのプロトプ
ラストをポリーＬ−α−オルニチン存在下でＴｉプラス
ミドで形質転換し、培養によりオビン合成とホルモン非
依存性増殖の表現型を示した。その後、ポリエチレング
リコールがＴｉ取込みを促進し、あるＴ−ＤＮＡ配列が
ゲノムに取り込まれることが示された。　（Ｊ、Ｄｒａ
ｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｐｌａｎｔ　ａｎ
ｄＦｕｊｉｗａｒａ＋　ｐｐ、５１５−５１６）　ｏ　
Ｆ、Ａ、Ｋｒｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　２９６　：　７２−７４
は同様の結果をポリエチレングリコール次いでカルシウ
ムショックによる方法で報告したが、彼らの結果では取
り込まれたＴ−ＤＮＡはＴｉプラスミド配列の近接部分
を含んでいた。

ＤＮＡを取り込まゼる他の方法にリポソームの使用があ
る。　ＤＮＡ含有リポソームの調製はＰａｐａｈａｄ　
ｊｏｐｏｕ　Ｉｏｓの米国特許第４　、０７８　、０５
２号と第４．２３５，８７１号にある。Ｔｉ−ＤＮＡを
リポソームによる導入する方法が報告されている（Ｔ、
　ＮａＢａ　ｔａｅｔａ＋、（１９８２）　ｉｎ　Ｆｕ
ｊｉｗａｒａ、前出、　ｐｐ、５０９−５１０およびＴ
、Ｎａｇａｔａ　（１９１３１）　Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇ
ｅｎｅｔ、　１８４　：　１６１−１６５　）。１１（
以の系に細胞壁を除去した植物と細菌の細胞の融合があ
る。この技術の例はＳ、　Ｉｌａｓｅｚａｗａｅｔ　ａ
ｌ、（１９８１）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、
　１Ｂ２：２０６−２１０によりＩｆ艮告されているア
ゲ只バクテリウムのスフェロプラストによるツルニチニ
チソウ（Ｖｉｎｃａ　）の形質転換である。植物プロト
プラストは細胞壁が不完全なアグロバクテリウム細胞を
取り込むことができる。　（Ｓ、ｌｌａｓｅｚａｗａ　
ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　１ｎＦｕｊ　ｉｗａｒａ＋
　前出、　ｐｐ、５１７−５１８）。

ｉ”　−Ｄ　Ｎ　Ａは２つのプロトプラストの融合によ
る再生した組織に移り、一方のみが形質転換される（Ｇ
、Ｊ、Ｗｕｌｌｅｍｓ　ａｔ　旦、（１９８０）　Ｔｈ
ｅｏｒ、八ｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、５６　：　２０３−２０８　）　、植物の
再生の項で詳しく述べるように、Ｔ−ＤＮＡは減数分裂
でも伝わり、単純なメンデル法則に従って子孫に伝達さ
れる。

アグロバクテリウム−植物の再生 正常な形態を有する分化植物組織がクラウンゴール腫瘍
から得られた。Ａ、Ｃ，Ｂｒａｕｎ　ａｎｄ　１１．’
ＮｙＷｏｏｄ（１９７６）　Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．八ｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７３　：　４９６−５００゜は
タバコ奇形種（ｔｅｒａＬｏｍａｓ　）を正常な植物に
つぎ木し、正常に見える開花し得るシュートを得た。

このシュート゛は培地におくと、オピン生成能と。

植物ホルモン非依存増殖能を保持した。選択された植物
では、これら腫瘍表現型は子孫に伝達されないようで、
多分減数分裂の間に消失した。（１ン。

Ｔｕｒｇｅｏｎ　ｅｔ　旦、（１９７６）　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳ峠７３　：　３５６２−３５６４　＞。自然に腫瘍
の性質を失った。あるいは奇形種の種から生じた植物は
、当初すべてのＴ−ＤＮＡを失ったように思われていた
（Ｆ、−Ｍ、Ｙａｒ＋Ｂ　ｅＬ　旦、（１９８０）　Ｉ
ｎ　Ｖｉ　ｔｒｏ　１６　：　８７−９２＋　Ｆ、Ｙａ
ｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ
、Ｇｅｎｅｔ。

１７７　ニア０７−７１４．　Ｍ几ｃｍｍａｒｓ　ｃＬ
　ａｌ、（１９８０）　、１゜Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１
４４　：　３５３−３７６　）。　しかしホルモン（１
■／ｌカイネチン）処理後復帰した植物を用いた後の研
究で、減数分裂を経た植物は形質転換表現型に関するＴ
　−Ｄ　Ｎ　Ａ遺伝子は失っているがＴ−ＤＮＡの両端
に相同性のある配列を維持していた。（Ｆ、Ｙａｎｇ　
ａｎｄ　Ｒ，Ｉｌ、Ｓｉｍｐｓｏｎ　（１９８１）　Ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８　：　４１
５１−４１５５　）　、Ｇ、Ｊ。

Ｗｕｌｌｅｇ１５　Ｂ（旦、（１９８１）　Ｃｅ１ｌ　
２４　：　７１９−７２４．はさらにオピン同化に関す
る遺伝子は、その植物は雄性不稔であるが、減数分裂を
通して伝わること。

そしておそら＜Ｔ−ＤＮＡはそのままメンデル法則に従
って遺伝し得ることを示した。（Ｇ、ＩＱ（１１１ｅｍ
ｓ艮μ　虹、（１９８２）　ｉｎ　Ａ、Ｆｕｊｉｗａｒ
ａ、前出）　。１．０ｔｔｅｎａｔ　ａｌ、　（１９８
１）　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１８ズ３：　
２０９−２１３゜はシュートを生じる腫瘍生成に町（シ
ュート誘導）遺伝子壁でのＴｎ７）ランスボソン起因Ｔ
ｉプラスミド変異を用いた。これらのシュー１〜が植物
中で再生すると自己稔性花を生した。着生した種が発芽
した植物はＴ−ＤＮＡを有しオピンを生成した。瀘（ル
ート誘導）変異を用いた同様の実験で全Ｔ　−Ｄ　Ｎ八
が減数分裂を通して子孫に伝わり。

これら子孫で程度にバラツキがあるが、ツバリン遺伝子
が発現すること、また同時に伝達された酵母のアルコー
ル脱水素酵素Ｉ遺伝子は発現しないことが示された。　
（Ｋ、八、Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｃ
ｅｌｌ　３２：１０３３−１０４３　）　、　Ｔ−ＤＮ
Ａ配列を欠く再生組織はおそら＜ｌ１ｌｉＷに混在して
いた非形質転換細胞の子孫であるらしい。（Ｇ、Ｏｏｍ
ｓ　ｔｉＬ　ａｌ。

（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　３０　：　５８９−５９７　
）　、アグロバクテリウム・リゾゲネスによる形質転換
の結果化したルートは比較的容易に苗に再生することが
示された。

４３２−４３４　）　。

アグロハタテリウムーＴｌｌ’プラスミド」二の；立（
云了二ＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡ内に多数の遺伝子
が同定された約半ダースのオクトビンプラスミド′ｒ　
−Ｄ　Ｎ　Ａ転写物がマツピングされ（Ｓ、Ｂ、Ｇｅｌ
ν１ｎｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９　ニア６−８０．
　Ｌ、ｌす１１１ｍ１ｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｔ、（１９８
２）　ＥＭｒｌＯＪ。

１　：　１３９−１４６　＞　、またいくつかの機能が
明確にされた（Ｊ、’Ｌｅｅｍａｎｓ　ｅｔ　旦、（１
９８２）　ＩｉＭ［ｌＯＪ、±：１４７−１５２　）。

オクトピン型プラスミドの４つの遺伝子がｔｍｓ、　ｔ
ｍｒおよび」旦　を含む１−ランスボソン変異誘発によ
り充分明確になった。（Ｄ、Ｊ。

これらの遺伝子に変異をもつＴｉプラスミドはニコチニ
ア・タハカムの腫瘍カルスを刺激し、シュートを生じ、
ルートを生じ、そして正常より大きくなる。他の宿主で
は、これら遺伝子の変異は異なった表現型を誘導し得る
（ＣｈｉｌＬｏｎ、　Ｍ、Ｄ、八ｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｇｅｎｅｔ、　（１９８２）参照）。」懸と瀘　の表現
型は腫瘍に存在する植物ホルモンレベルの差異と相関い
ている。ザイトカイニン：オーキシン比の相違は培養で
非形質転換カルス組織でシュートまたはルート形成を誘
導した場合と類似している。（Ｄ、Ｅ。

＾ｋｉｙｏｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｐｒ
ｏｃ、ＮａＬｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ別：　４０７−４１１　）。差またはＡどちらか
一方のみの機能遺伝子を持つＴ−ＤＮＡ　（４１能する
」１のみの場合ではないが）は、明白な腫瘍増殖を刺激
し得る。シュートとルートの刺激は機能υ上により夫々
促進と阻害を受ける。（Ｌ、Ｗ、Ｒｅａｍ　ｅｔａｌ、
　（１９８３）　Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、八ｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ　８０　：　１６６０−１６６４　）。Ｔ−
ＤＮＡ遺伝子の変異が植物ゲノムへのＦ−ＤＮＡの挿入
に影響することはないようである（Ｊ、Ｌｅｅｍａｎｓ
　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）同上、Ｌ、Ｗ、。

Ｒｅａｍ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）同上）。オクトピ
ンシンセターゼをコードするＯＣＳ遺伝子はＩｌ、Ｄｅ
　Ｇｒｅｖｅｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｊ、Ｍｏ１
．八ｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、上：　４９９−５１１゜に
より塩基配列が決定された。これはイントロン（真核遺
伝子に共通して見られる介在配列で転写後ｍＲＮＡのプ
ロセッシングの間にメンセンジャー前駆体から除かれる
）を有していない。また真核の転写シグナル（ＴＡ”Ｆ
Ａ水ボツクスとポリアデニル化部位がある。オクトピン
シンセターゼを有する植物細胞はホモアルギニンを無毒
化するので、ＯＣＳ遺伝子は外来ＤＮＡによる形質転換
された植物細胞の有効な選択マーカーとなるだろう。

（Ｇ、Ｍ、Ｓ、Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ　ｅｔ　旦
、（１９８２）　ＰｌａｎｔＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、上：　
１３３−１４２　）。　ツバリンＴｉプラスミドはノパ
リンシンセクーゼ遺伝子（虱）をコードしており、虱　
はＡ、　Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

（１９Ｂ２）　Ｊ、Ｍｏ１．へｐｐ１．Ｇｅｎｅｔ、上
：　５６１−５７３．により配列が決定された。ＯＣ３
遺伝子と同様二　もイントロンがない。２つのポリアデ
ニン化部位の候補とＴＡＴＡボックスとなり得る配列が
ある。

匹りと対照的に」匹の上流にはＣＡＴボックスとして知
られる転写シグナルらしい配列がある。Ｊ。

Ｃ，ＭｃＰｈｅｒｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ｔｌＳｆｌ　１マフ　：　２６６６−２６７０
．はクラウンゴール組織のＴ　−Ｄ　ＮＡがコードする
ｍ　ＲＮ　Ａのインビ、トロ翻訳を報告した。

毛根Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａの転写もまた検出された（Ｌ。

會ｉ＋１ｍ１ｔｚｅｒ　ｅＬ　虹、（１９８２）　Ｍｏ
１．Ｇｃｎ、ＧｅｎｅＬ、１８６　：１６−２２　）。

機能的には毛根症候群は鴻の変異したＴｉプラスミドに
よりもたらされるクラウンゴール腫瘍と同等のようであ
る。（Ｆ、Ｆ、Ｗｌ＋ｉｔｅ　ａｎｄ　Ｅ。

Ｗ、　Ｎｅ５ｔｅｒ　（１９８０）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、　１旦：’７１０−７２０　）。

真核生物において、ＤＮＡのメチル化（特にシトシン残
基の）は転写不活性化と相関している。

比較的メチル化が少ない遺伝子はｍ　ＲＮ　Ａに転写さ
れる。Ｇｅ１ｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、±：　１５９−１７４
．はクラウンゴール腫瘍のＴ　−ＤＮＡは常に少なくと
もメチル化されていない１コピーが存在する事を見出し
た。同じゲノムがメチル化されている多くの他のＴ　−
Ｄ　ＮＡコピーを含むという事は１つ以上の過剰のＴ−
ＤＮＡのコピーは生物学的に不活性である事を示唆する
（Ｇ。

Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　３０
：５８９−５９７　も参照）。

ＴｉプラスミドはＴ−ＤＮＡ領域の外側にあり。

感染過程に必要な他の遺伝子をコートしている。

（ツバリンプラスミドについてはＭ、ＩＩｏｌｓｔｅｒ
ｓ旦　ａｌ、（１９８０）プラスミド３　：　２１２−
２３０．オクトピンプラスミドについては１１．Ｄｅ　
Ｇｒｅｖｅ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８１）プラスミド６　：　２３５−２４８＋　Ｄ
、Ｊ、Ｇａｒｆｉｎｋｅｌａｎｄ　Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅ
ｒ　（］９８０）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１４４　
：　７３２−７４３、およびＧ、Ｏｏｍｓ　（１９８０
）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１４４　：８２−９１参
照）。最も重要なのは一幻五遺伝子で、これが変異する
とＴｉプラスミドの発癌性を失わせる。

（これらの遺伝子座はビルレンスに関する言葉−リ工と
して知られている）。！遺伝子はトランスに作用し、異
なったプラスミド型で物理的に他のプラスミドに局在し
ているＴ−ＤＮＡでの植物細胞の形質転換を引き起こし
得る。（Ｊ、ｌｌｉｌｌｅ旧ｅｅ　ｅｔ　旦、（１９８
２）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１５０　：　３２７−
３３１．Ｍ、−Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　（１８Ｊａｎｕａ
ｒｙ　１９８３　）　１５ｔｈ　ＭｉａｍｉＷｉｎＬｅ
ｒ　Ｓｙｍｐ、）。　ツバリンＴｉＤＮＡはＴｉプラス
ミドからの切出し、または宿・主ゲノムへの取込みに関
与するらしく、Ｔ−ＤＮＡの左または右側の境界に極め
て隣接している約２５塩基対の順方向繰り返し配列（ｄ
ｉｒｅｃｔ　ｒｅｐｅａｔ　）を有する（Ｎ、’Ｓ。

Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ、　（１９Ｂ２）　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、へｃａｄ、ｓｃｉ、ｔｌｓＡ頚：　６３２２
−６３２６　）　、そして類似配列がオクトピンンＴ　
−Ｄ　Ｎ　Ａ境界に隣接した場所に見つかっている（Ｒ
，Ｂ、Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｃ
ｅ１ｌ　２９：１００５−１０１４）。オピン同化はオ
クトピンおよびツバリン型プラスミドの夫々」匹および
」匹遺転子により特徴づりられる。Ｔｉプラスミドはま
た複製開始点を含むそれ自身の増殖に必要な機能をもコ
ードしている。Ｔｉプラスミド転写物はＳ、Ｂ、Ｇｅ１
ｖｉｎ　ａｔ旦、（１９８１）プラスミド６　：　１７
−２９．により、アグロバクテリウム・チューメファシ
エンス細胞中に見出されており、彼らばＴ−ＤＮＡ領域
が非Ｔ−ＤＮＡ配列に沿って弱く転写されることを見つ
けた。Ｔｉプラスミドにより支配される性質はＭｅｒｌ
ｏ。

前出（特に第２表参照）およびＲｅａｍ　ａｎｄ　Ｇｏ
ｒｄｏｎ。

前出、によりまとめられている。

アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミドＤＮＡ種々のオ
クトピン型Ｔ１プラスミドは互いにほぼ１００％相同性
があることがＤＮＡハイブリダイゼーション（Ｔ、Ｃ，
Ｃｕｒｒｉｅｒ　ａｎｄ　Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅｒ　（１
９７６）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１２６　：　１５７
−１６５　）または制限酵素解析（Ｄ、５ｃｉａｋｙ　
ｅｔ　旦、（１９７８）プラスミド上＝２３８−２５３
　）により調べられた。　ツバリン型Ｔｉプラスミドは
互いに少なくとも６７％相同性がある（Ｃｕｒｒｉｅｒ
　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒｔ前出）、、種々のＲｉプラス
ミドは互いに非常に相同性があることが明らかとなった
（Ｐ、Ｃｏ５ｔａｎｔｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１
）プラスミド５　：　１７０−１８２　）　ｏ　Ｎ、Ｉ
ｌ、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ　ａｎｄ　Ｍ、−Ｄ。

Ｃｈｉｌｔｏｎ　（１９７８）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、１３６　：　１１７８−１１８３　。

はオクトピンおよびツバリン型Ｔｉプラスミドは比較的
狭い部分に互いに相同性があることを示した。

これらの相同性はＧ、Ｅｎｇｌｅｒ　ｅｔ　旦、（１９
８１）　Ｊ、Ｍｏ１Ｂｉｏ１．３５２　：　１８３−２
０８により詳しくマツプされた。

彼らは４つの類似領域の３つば更に３　（Ｔ−ＤＮＡに
またがる）、４　（いくつかの」匹」転子を含む）、お
よび９　（」匹遺転子を有する）の類似領域に細分化さ
れることを見出した。連結している相同領域は少なくと
もｔｒａｆｉ伝子（Ｔ転子ラスミドの他の細菌細胞への
接合伝達に関与する）と、複製および不和合性に関する
追転子とを含む。この領域はりゾヒアソシー科の別の属
であるリゾビウムの一種から分離された」巳プラスミド
（共生窒素固定に関与する）と相同性がある（１１．に
、Ｐｒａｋａｓｈ旦　旦、（１９８２）プラスミド７♂
２７１−２８０　）。４つの領域の順序は保存されてい
ないが、いずれも同一方向に配置している。Ｔ−ＤＮＡ
配列の一部はツバリンおよびオクトピンプラスミド間で
極めて良く保存されている（Ｍ、−り、　ＣＩ＋１ｌｔ
ｏｎ　ｅｔ　ａｔ。

（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２互：　１４７−１４９
．　＾、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ａｔ旦、（１９７８）　Ｎ
ａｔｕｒｅ　２７５　：　１５０−１５３　）　、　Ｒ
ｉプラスミドはそれらの間３およびオクトピン（Ｆ、Ｆ
、１１ｈｉｔｅａｎｄ　Ｅ、Ｉｎ、Ｎｅ５ｔｅｒ　（１
９８０）　Ｊ、ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、　１４４　：　７
１０−７２０）とツバリン　（Ｇ、１ン１ｓｕｌｅｏ　
ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）プラスミド７　：　４５−
５１　’）の両Ｔｉプラスミドとにかなり相同性がある
。その領域はおもに」展遺転子をコードしている領域で
ある。Ｒｉ　Ｔ　ＤＮＡはＴｉプラスミドの両型のＴ　
−１）−Ｎ　Ａに弱いながらも。

かなり相同性がある。（Ｌ、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ。

（１９８２）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１８６
　：　３］９３−３１９７　）　。未感染のニコチニア
・グラウカの植物ＤＮＡはｃＴ−ＤＮＡ　＜ｍ胞のＴ−
ＤＮＡ）と呼ばれる配列を含んでおり、Ｒｉ　Ｔ−ＤＮ
Ａの一部と相同性がある。　（Ｆ、Ｆ、Ｗｈｉｔｅ　ｅ
ｔ　ａｌ、　（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　３０１　：３
４８−３５０　＞。

Ｔｉ　（Ｍ、−Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｔ、（１
９７７）　Ｃｅ１ｌ　１１　：２６３−２７１　）また
はＩ？ｉ　（Ｍ、−Ｄ、Ｃ＋＋１ｌＬｏｎ　（１９８２
）　Ｎ、１ｔｕｒｅ２９５　：　４３２−４３４．　Ｆ
、Ｆ、Ｗｈｉｔｅ　ｅｔ　旦、　（１９８２）　Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａ１１．八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９　：　３１
９３−３１９７．　Ｌ、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ（１９Ｂ
２）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１１３６　：　
１６−２２　）プラスミドの一部分は腫瘍植物細胞のＤ
ＮＡに見出される。

転移したＤＮＡはＴ−ＤＮＡとして知られている。

Ｔ−ＤＮＡは核内（Ｍ、Ｐ、Ｎｕｔｉ　ｅｔ　ａｌ、（
１９８０）Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、　１８　：
　１−６　、　Ｌ、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ４０６
０−４０６４）の宿主Ｄ　Ｎ　Ａ　’（Ｍ、Ｆ、Ｔｈｏ
ｍａｓｈｏｗ　ｅｔ４５８−４６１　）に取り込まれる
。

Ｍ、Ｆ、ＴＩ＋ｏｍａｓｈｏｗ　ｅＬ　ａｌ、（１９８
０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７　：　６４４８−６
４５２．　およびＭ　、　Ｆ。

Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｃｅ
１ｌ　１９　：　７２９−７３９゜はオクトピン型Ｔｉ
プラスミドのＴ−ＤＮＡはＴ−ＤＮＡの左と右の夫々Ｔ
Ｌ−ＤＮＡおよびＴＲ−ＤＮＡの２つの別の場所に取り
込まれることを見出した。ＴＲおよびＴＬのコピー数は
変動し得る（Ｄ、Ｊ、Ｍｅｒｌｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９
８０）　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

１７７　：　６３７−６４３　）　、　Ｔ　−Ｄ　Ｎへ
の中芯（ｃｏｒｅ）は。

ツバリン１”　−Ｄ　Ｎ　Ａと相同性が高＜　（Ｃｈｉ
’１ｔｏｎ　ｅＬａｔ、（１９７Ｂ）　、前出、および
Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅＬ　旦。

（１９７８）前出）、腫瘍維持に必要で、１゛Ｌに見ら
れ、一般的に細胞当り１コピー存在し、そして展ｔｍｒ
および」１　遺伝子をコードする。他方、ＴＲはコピー
数は多い（Ｄ、Ｊ、Ｍｅｒｌｏ　ｅ’ｔ　ａｌ、　（１
９８０）前出）が、まったく不要である。（Ｍ、Ｄｅ　
Ｂｅｕｃｋｅｌ−ｅｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）　
Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｑｅｎｅｔ、、１８３　：２８３
−２８８、　’　Ｇ、Ｏｏｍｓ　’ｅＬ　旦、（１９８
２）　Ｃｅ１ｌ　３０　：　５８９−５９７　）　。Ｇ
、Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ、　’（１９８２）プラスミド
１：１５−２９によれば、１゛ＲがＴｉプラスミドから
欠失してもアグロバクテリウム・チューメファシェンス
はヴイルレンスを保っているが、′Ｉ″ＲがＴ　−Ｄ　
ＮＡ取込みに関与すると想定されている。Ｇ、Ｏｏｍｓ
ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　別：　５８９−
５９７により、Ｔ−ＤＮＡは植物ゲノムに取り込まれた
後、特に欠失するが、一般に安定であること、またＴ−
ＤＮＡ構成が異なる混成細胞を含むｌ１ｆｆｉ瘍は複数
の形質転換現象の結果であることが示された。ｏｃｓは
ＴＬに存在する。しかし、腫瘍増殖に関連する表現型を
失うことなく植物ゲノムから欠失させ得る。

組み込まれたＴＬの左端は順または逆向きの繰り返しＴ
−ＤＮＡ配列から成る。　（Ｒ，Ｂ、Ｓｉｍｐｓｏｎｅ
ｔ　ａｌ、（１９Ｂ２）　Ｃｅ１ｌ　２９：１００５−
１０１４　）。

オクトピン型腫瘍の状況とは対照的にツバリン１’　−
Ｄ　Ｎ　Ａは一連のフラグメントで宿主ゲノムに組み込
まれる。（Ｍ几ｅｍｍｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０
）　Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１４４　：　３５３−３７６＋　
Ｐ、Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅＬ旦、（１９８０）　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２０９：１３８５−１３９１　）　、順方
向繰り返し配列が観察された。奇形種から生じた植物の
Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａは挿入ＤＮＡの端のフラグメントにわ
ずかな修飾がある（［、ｅｍｍｅｒｓ　ｅ＋ユ　旦、・
前出）。右端と左端の間の結合部の配列の解析から多く
の順繰り返し配列と１つ逆繰り返し配列が明らかになっ
た。　後者は結合部にまたがっている（Ｚａｍｂｒｙｓ
ｋｉ　ｅｔ　＋＋１．　（１９８０）前出）。左側の結
合部は少なくとも７０塩基対（ｂｐ）が変動すること。

一方、右結合部はｌｂｐのめの変動である（Ｐ。

Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｊ
、Ｍｏ１ｅｃ、八ｐｐ１．ＧｅｎｅＬ。

１　：　３（ｉｆ−３７０）。繰り返し配列の結合部の
左および右端は１３０　ｂｐ以上のスペーサーにより分
断されている。このスペーサーの由来は不明であり。

あるＴ−１）ＮＡ配列を含んでいる。Ｔ−ＤＮＡは繰り
返し配列と低コピー数宿主配列の両者に組み込まれてい
る。

Ｎ、Ｓ、Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　６３２２−６３２６．は
ｒ’　−Ｄ　Ｎ　Ａの左端のすぐ外側のツバリンＴｉプ
ラスミド内に」旦部位を見出し、これはバクテリオファ
ージλで１０　Ｋｂｐ離れているまわりのＤＮＡで一般
組み換えを増大させる。Ｒ，Ｂ、Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅＬ
　ａｌ、（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　２９　：１００５〜
１０１４．はオクトピンＴｉゲラスミ１゛内に」配列を
見出さなかったが、配列を決定した領域の外側に存在す
る可能性を排除できない。Ｔｉプラスミドでの」の意義
は不明である。もしｃｈｉが機能を有しているとすれば
１３旦がＴ−ＤＮＡ内にないので、恐らく植物ではなく
アグロバクテリウム細胞内で用いられているだろう。

アグロハクケリウムーＴＩＰプラスミドの操イｔシャト
ルヘクターの項で詳しく述べるように。

変化さセたＤＮＡ配列をｉ’　Ｉ　Ｐプラスミドの望め
の場所に導入する技術が開発された。トランスボソンは
この技術で容易に挿入される。　（Ｄ、Ｊ。

Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅｔ　旦、（１９８１）　Ｃｅ１
ｌ　２７：１４３−１５３　）。

Ｊ、−Ｐ、１ｌｅｒｎａｌｓｔｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（
１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ　２８７：　６５４−６５６
．はＴｉプラスミドのＴ＝ＤＮＡに挿入されたＤＮＡ配
列（ここでは細菌のトランスボソン）が受容植物ゲノム
へ移され、取り込まれることを示した。種々の起源の多
くの外来ＤＮＡが挿入されたが、これまで、その遺伝子
は自身のプロモーターの支配下で発現したかった。これ
らの遺伝子には酵母のアルコール脱水素酵素（＾ｄｈ　
）　（Ｋ、Ａ。

Ｂａｒｔｏｎ　ｅＬ、旦、（１９８３）　）、）ウモロ
コシの八ｄｈｌ　（Ｊ、Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ’＋未発表
）とゼイン、吐乳類のインターフェロンとグロビン、吐
乳類のウィルス５ｖ４０　（Ｊ、Ｓｃｌ＋ｅｌｌ、未発
表）などがある。Ｍ、ｌ１ｏｌｓｔｅｒｓｅｔ　、Ｉｌ
、（１９８２）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１８
５　：　２８３−２８９゜によれば、Ｔ−ＤＮＡに挿入
された細菌のトランスボソン（Ｔｎ　７　）が植物ゲノ
ムに取り込まれた後。

完全な機能を存し、多分変化していない形で回収された
。

ＴＩＰプラスミド内で欠点を種々の方法で起せる。シャ
トルヘクターを標準の組み換えＤＮＡ技術でつくられた
欠失の導入に用いることができる。

（Ｃｏｈｅｎ　ａｎｄ　Ｂｏｙｅｒ　ＵＳ　Ｐａｔ、　
４，２３７＋２２４　）　ａ前もって決められた一方の
端の欠失はトランスボソンの誤った切出しによりつくる
ことができる。（８゜１５−２９　）　、　Ｊ、ｌｌ１
ｌｌｅ　ａｎｄ　Ｒ，５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏＬ　（１９
８１）プラスミド６　：　１５１−１５４．は前もって
決められた位置での両端を有する欠失は２つのトランス
ボソンを用いてつくれることを示した。この技術はまた
イソビボで”組み換えり、Ｎ　Ａ分子”の構築に用いら
れる。

ツバリンシンセターゼ遺伝子が、形質転換された植物細
胞を選択するのに用いられる薬剤耐性をコードするＤＮ
Ａセグメントの挿入に用いられた。

Ｍ、Ｂｅｖａｎ　（Ｍ、Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、（１８Ｊａｎｕａｒｙ１９８３）　１５ｔｈ　Ｍｉ
ａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ、、により報告された
；およびＪ、Ｌ、Ｍａｒｘ　（１９８３）　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２１９　：　８３０参照）とＲ，ＩＩｏｒｓｃｈ
　ｅｔ　旦、（（１８Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３　）１
５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ、、およ
びＭａｒｘ＋　前出、参照）、はＴｎ５のカナマイシン
耐性遺伝子（ネオマイシンフォスフメトランスフェラー
ゼ）をツバリンプロモーターの後に（その制御下に）挿
入した。

その作成には培養でカナマイシンおよびＧ４１８のよう
なアナグロ耐性になるよう植物細胞を形質転換する方法
がとられた。Ｊ、Ｓｃｌ＋ｅｌｌ　ａｔ　ａｌ、　（１
８Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３）　１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ
　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ、（Ｍａｒｘ。

前出、も参照）、は同様の作成法を報告し、そこではＴ
ｎ７のメトトレキセート耐性遺伝子（ジハイドロフル−
１レダクターゼ）がツバリンシンセターゼプロモーター
の後につながれた。形質転換細胞はメトトレキセ−１・
耐性であった。オクトピンシンセクーゼを有する植物細
胞は毒性化学物質、ホモアルギニンに耐性であり、　Ｇ
、Ｍ、Ｓ、ＶａｎＳｌｏＨｔｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　
（１９８２）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、上：　
１３３−１４２．はこの酵素を洗濯マーカーに用いるこ
とを１に案した。

門、−Ｄ、Ｃｔ＋１ｌＬｏｎ　リ□ａ１．　（１９８３
）　、前出、は八。

Ｄｅｆｒｅｍｅｕ　が”小Ｔｉ　（ｍｉｎｉ−Ｔｉ　）
プラスミド”を作成したと報告した。ツバリンＴ−ＤＮ
Ａにはまともには１ケ所の制限酵素」匣■の切断部位が
ある。この部位を欠く変異がつくられ、完全なツバリン
Ｔ−ＤＮＡを含むＭｌフラグメン１へがｊＰ−ＭＩ［さ
れた。このフラグメントはカナマイシン耐性遺伝子と共
にｐＲＫ２９０に挿入され、アグロバクテリウム・チュ
ーメファシエンス内で維持され、すべての非Ｔ−Ｄ’Ｎ
Ａ配列を欠く、プラスミドが得られた。それ自身では、
このプラスミドは植物細胞を形質転換できなかった。し
かし、オクトピンＴｉプラスミドを持つアゲ上１ハクテ
リウＪ、・チューメファシエンス株に入れると、オクト
ピンとツバリン両方を合成する腫瘍が誘導された。これ
はツバリンＴ１プラスミド機能の消失がオクトピンＴｉ
プラスミドにより相補されたこと、およびツバリン”小
Ｔｉ”は植物細胞を形質転換する能力があったごとを示
す。Ｃｈｉｌむｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　、前
出、はまた小ＴｉをＳｍａｌで切り、ツバリンシンセタ
ーゼ遺伝子とその左および右端以外はすべてのｉ゛−１
）　ＮＡを欠失した”ｆｄ　Ｔ　ｉ″　（ｍｉｃｒｏ−
Ｔｉ）を作成した。

この微ＴｉはＳｍａ　１部位を欠＜　ｐＲＫ２９０プラ
スミド誘４対に挿入され、小Ｔｉと同様にして用いられ
５匹敵する結果を得た。

Ｉｌ、１．ｏｒｚ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　ｉｎ　
Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　１９Ｂ２．
　ｅｄ　：＾、Ｆｕｊｉｗａｒａ、　ｐｐ、５１１−５
１２．はＤＮΔＮＡみと維持にＴ　Ｉ　Ｐ系が見掛は上
熱関係なプラスミドヘクターを作り、マーカーとしてツ
バリンシンセターゼ遺伝子を用いた。

ファセオリ４ζ遺伝子調節 一般に高等真核生物の遺伝子は高度に調節されている。

植物のような多細胞器官は多くの分化した組織を有し、
夫々は特有の遺伝子産物を要求する特有の機能を持つ。

そのような組織の１つに子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ　）
がある。豆果（ｌ＋４ｕｍｅｓ　）では子葉は１発芽の
間に必要となるまで、脂質、炭水化物、無機物および蛋
白質などを保存する種の貯蔵器官である。フォセオラス
・ブルガリスＬ、（フレンチビーン、インゲン豆（ｋｉ
ｄｎｙ　ｂｅａｎ）　、乾燥自互（ｎａｖｙ　ｂｅａｎ
　）　、緑豆ＣＢｒｅｅｎ　ｂｅａｎ）などの名でも知
られる）では、主要貯蔵蛋白質はファセオリンである。

この蛋白は極めて類似しかつ互いに等量の小数の分子種
から成る。ファセオリンは乾燥豆の主要な栄養価を担っ
ており、しばしば乾燥重量のｌＯ％以」二を占める。

ファセオリンはファセオラス・ブルガリスの生活環の間
で高度に調節されている。この蛋白は種がさやの中で生
ずる間でのみつくられ、そのレベルは遺伝的に決まった
合成のスケジュールに従い検出限界の低い値から種の蛋
白の半分を占めるまで、上昇する。そのピークではファ
セオリン合成は子葉細胞の蛋白合成の８０％以上にも達
する。他の時期には、また他の！＋Ｊｌ　＋にでは、フ
ァセオリン合或は検知できない。世界的な栄養源の重要
性に伴いファセオリンの調節の仕組めは、ファセオリン
の研究、その性質およびその調節に大いに興味をそそる
。

（以下余白） （発明の目的） ここに開示の発明は、植物遺伝子を導入し、そこで発現
する遺伝的に修飾された植物細胞を有する植物を提供す
る。さらに、この発明は、そのゲノムが植物遺伝子を含
む′ｒ−Ｄ　Ｎ　Ａを有する植物細胞を（ｌｉｔえた植
物組織を提供する。この植物遺伝子は植物細胞内で発現
する。またＴ　−Ｄ　ＮＡ（ここでは植物細胞内で発現
可能な挿入植物遺伝子を含むように修飾されたＴ−ＤＮ
Ａと定義される）を含め、複製し得るアグロバクテリウ
ム属細菌の新規な細菌株を提供する。さらに１本発明は
エセリシア・コリー（大腸菌）内で複製能を有し、Ｔ−
ＤＮＡを含み、さらにプラスミド内に含まれるＴ　−Ｄ
　Ｎ　Ａ内に挿入された植物遺伝子を含むような新規の
プラスミドを提供する。

ここに開示された実験的研究はＴ−ＤＮＡを介して導入
後植物細胞内で植物遺伝子が発現する。

即ち既知の方法によりＴ−ＤＮＡに植物遺伝子を挿入し
、その挿入物を含むＴ−ＤＮＡを植物細胞に導入するこ
とにより行ったものであるが、最初の例であると信する
。ここに開示された実験は。

また、イントロンを含む植物遺伝子がＴ　−１）　Ｎ　
Ａを介して導入された植物細胞内で発現した最初の例を
提供するものと信する。これらの結果は′Ｉ゛−ＤＮＡ
内で発現する既知のずべての遺伝子（Ｔ−ＤＮＡ内生遺
伝子であれ、挿入外来遺伝子であれ）は現在知られる限
りイントロンを含まないという事実から見れば、驚（べ
き事である。この結果は。

また、当業者がこれまで、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子外のプロモ
ーターが１”　−Ｄ　Ｎ　Ａ内へ挿入された場合。

植物内で発現を制御する機能を果たすという１例を示し
得なかったという事実から見ても、容易に想到されない
。

本発明は他の植物種または株から有用な植物遺伝子を導
入し、植物組織または全植物体を遺伝的に修飾するのに
有用である。このような有用植物遺伝子は貯蔵蛋白質、
レクチン、病気、昆虫および除草剤に対する耐性因子、
環境ストレスに対し耐性を与える因子などの遺伝子、さ
らに特異的芳香剤の遺伝子など、があるが、これらに限
らない。

本発明は豆類の主たる種の貯蔵蛋白質であるファセオリ
ン１責伝子をヒマＩノリやタハ：ｔの植物Ｘ、１ｌｉ−
＼の導入と発現により例示される。Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａを
介してλり人されノこ）１？１物遺（ｌ、子が９発現す
る植物細胞が一度得られれば、植物組織および全植物体
を当該分野におい−Ｃ既知の方法で、そごから再生させ
ｌ）る。再生した植物は次′いて通常の方法で増殖し。

う、り人さオ已二声転子は通常の植物改良技術により他
の植物・＼移される。例えばフ）・セオリン遺伝子の導
入２発現はアルファルファのような高程作物（ｆ　（ｌ
　ｒ　ａ　Ｂ　ｅ　ｃ、ｒ　ｏ　ｐ　）の蛋白含早、栄
養価の向−にに用いろことができる。本発明の他の用途
、即ら、他の植物種へ導入された他の遺伝子の性１１の
開拓、などは当業者にとっては容易なことであス。本発
明は本質的には、いかなる植物遺伝子をも、Ｔ−１）Ｎ
ＡＯｍ入が可能で安定に複製維持できる・いかなる植物
種へ導入する事に応用できる。一般にこれらの種に以下
のものがあるが、それに限定されない。　即ち、ヒマワ
リ　（コンボシテｃｏｍｐｏｓ　ｉ　Ｌｃａｃ科）・タ
バコ（ソラナノＳ　０１　ａ　ｎ　ａ　Ｃｅ　ａ　ｅ科
）、アルファルファ、大豆および他のマメ類（レグミノ
シＩｅＢｕｍ　！　ｎ０３（！ｉｌｅ科）および人：Ｘ
ｌじ）の野党：　ｇＨＱ几１：・）な（ディコチレｌ゛
ナウスｄｉｃｏＬｙｌｃｄｏｎｏｕｓ　）双子−ツ植物
である。

（発明の構成） 不明ｌ１１１書および特許請求の範囲での使用の意１ン
１と権利範囲に関する不明瞭さを除くために以下の定義
を行う。

ト駈−明＼Ａ：植物ゲ７１ムにｆ、ｌｌみ込ｒＥれる形
質転ｌｋ　Ｗ　ｍ因子（ＴＩＰ）由来のＩ）　ＮΔ上セ
グメントごごで用いるこの用語Ｃ；ｌアゲｌ、Ｉハクう
一すウＪ、・チューメファンコニンスおよびアゲ１：Ｊ
ハクテリウＪ、・リゾゲネスを含むアグロハクテリウノ
、のあらゆる胛搗誘λｑ株に木り′Ｉ的に由来するｌ）
ＮＡを含む。

後者の菌株の場合、以前の研究者は時々Ｒ’−ＤＮＡと
呼んでいた。さらにここで用いる”Ｔ’　−Ｄ　ＮＡと
いう用語は自然発生または実験室内操作によるいかなる
変化、修飾、変異、挿入および脱落をも含む。唯一の構
造」−の要件は、自然に発生ずる′１゛−ＤＮＡの右端
および左端がすべての’ｌ’　−１）　ＮＡの１、′Ｉ
徴である安定な３．１［み込めという１す１持される機
能を面、実にするために充分量存在するということであ
る。

１１姐が四子：ごごでの使用は、植物遺伝子の（８造お
よび調節要素、つまりＩ’　−Ｄ　ＮΔ自Ｊ：Ｉの遺伝
゛ｒに対して外来である要素を含む。ごごで使用する植
物川伝ｒ−はｉ’　−１）　ＮＡ・＼植物起源のプト１
モーター（転写の開始と翻訳の開／ｒｉを提供し、調節
しうるｊ貫伝了の領域）と描造逍転子Ｂｔｉ自質をコー
１する。１つまたは複数の一インｌ−１：Ｊンを含むあ
るいは含まない、領域）との両者である。この１ｉｃｃ
　！ｌ勿ｉｒ＋伝転子転写の終了および転石後の１’？
　Ｎへフ′Ｉ：１セノノングを制御する機能をイｊしう
る；３°　−−１１＾ＩＩ　ｉｌ＜領域をも含めうろ。

プ１ニド〔−ターと１１，１造逍伝了要素は同一または
５°シなる既存の遺伝子に［１じｌ（するであろうし、
また同一または５ｒ１．なる）ｉσ動物源１１１来しう
る。例えば、　ｉｉ！（物遺伝了はそれ１月のプｌ」モ
ーターをある植物遺伝子、あるいは１つの遺伝子のコー
ＩＳ領域（イントロン存在または不在）と同一また＆Ｊ
他の）１υ物種由来の他のブＵＩモーターから成るイン
ビトロ４Ｍ成物でも良い。ここで定義する（ｂ物逍転子
のコード領域は植物遺伝子の構造遺伝ｒのｃＤＮＡコピ
ーを含む。プロモーターとコーｌ領域はまた自然にある
いは人為的に誘発された修飾をも含むであろうし、化学
的に合成されたセグメントを含めうる。コートするセグ
メントはそれ自ＪＡ１　自然発生または合成の、混成４
ｂｌ白質を二１−トする′ｆ５ｊ、数の起源に［１じＫ
する混成物てあっても、１、い。

％Ｑ勺＆１１１ＮＩ　：クラウンゴールのよ〕１な根２
−ぢ一１花’１５）　、種、腫瘍３．１１織、および肝
、カルスのよ）なｌｉ：４ｍ植物細胞の種々の形の集合
物を含む１７１４等埴゛１クツの。

あるいはそれに由来する舅（ヒ、未う）化Ｏバ、１１織
を含む。

市−？Ｊ　ＩＩＩ　＋昨＝４に培１ｉｆｊ物ｔｍ胞、培
養１１１ｆ吻Ｉｔロ胞お、ｌ、びプロトプラスト ”Ｉ’　−　Ｄ　ＮＡを介して導入された植物遺伝子を
発現する遺伝的修飾植物の生産＆Ｊ種々の技術を伴・）
現在知られている特定の知識と技術−Ｈに既知の］段を
合併したものである。多くの例において．別の手段が全
過程の各段階に存在する。手段の選択は基本的１”　Ｉ
　Ｐの選択、修飾される植物種および所望の再生方法の
ような要素に依存し、それらはいずれも当業者が望む結
果を達成するために選択し用い得る別のプロセス段階を
提供する。５本発明の基本的な特徴は植物遺伝子の性質
とｆＭ造であり。

そのＴ　−１）　Ｎ　Ａへの挿入方法である。遺伝的（
１１飾植吻を肖るために残っているステップは、植物細
胞へ（Ｉト飾”［’　−１’）　ＮＡを移送すること（
そこでは。

植物細胞の中で修飾１”　−Ｄ　Ｎ　Ａか植物細胞ゲノ
Ｊ、の一部として安定に組め込まれる）を含み、それに
は・インヒト１こ目、゛を孜および完全植物体への実際
の再生に関する技術がある。この技術は形質転換植物ｍ
ｌ胞の選択と検出に関するステップおよび最初の形質転
換株から商業的に認められうる培養体へ導入遺伝ｒ−を
移すステップを包含しうる。

本発明の基本的１１１色は先に定義した挿入植物遺伝子
をイｊするｉ”　−１）　ＮＡのＪ、ｌ、ｊ染である。

植物遺伝子−挿入部位の場ｊす目；ＪＴ−１）ＮＡ境界
のすく近くにある配列の移送代１１にが破壊されない限
り、これらの領域が従来の研究によれば、　４１１　ｆ
！ｉｌｉ　Ｔ−Ｄ　ＮＡの植物ゲノムへの挿入に必須で
あるの乙どこでも良い。好ましい挿入部位を最も粘）シ
こ転二９されている領域に位１σするものであり、　’
１．’ｌ’に−リ」遺伝子−１および、第２図に示すよ
うにｉＩ！！図区分１３にまたがる肛皿！ＩＩ　−ｆ断
片にある１．６　°゛と呼ばれる領域である。後者の転
互物に相関する表現形はない。

”１．６　”という用語はここではこの活発に転写され
るＴ”　−Ｄ　Ｎ　Ａの領域を意味する。ｉ”−１１Ｎ
Ａはいかなる′Ｉ″Ｉ　Ｉ）プラスミ１からも得られる
。植物遺伝子は当業者によく知られている標【１１゜技
術で挿入される。内生Ｔ−ＤＮΔΦ伝了の転ニワと翻訳
の方向に関して挿入植物遺伝子の方向はどしらでも良く
２つの可能な方向の一方は機能を果たず。ある遺伝子が
Ｔ　−Ｄ　ＮＡの異なった位置に挿入されるとクロマチ
ン構造のような因子のため１発現度の差が生しるであろ
う。ファセオリン遺伝子は−ｊ′グロハクテリウ１１・
千ｊ、−メファノエンスのオクトピン型プラスミ］であ
るｐ’ｌ’　ｉ　＋５９０）−リー↓司転子内のＣ１」
部位に挿入されると、容易に検出可能な発現レベルに達
する。

１１ｊ１吻ｊ責仏子をｉ゛−Ｄ　Ｎ　Ａに挿入する簡便
法に。

既述の７−１・トルヘクターがあり、これはエシェリヒ
ア・二Ｊ　ＩＪ−因で棲製可能なプラスミドへ取り込ま
れたｉ’−１）　ＮΔセグメント（ごごへ挿入を！！Ｊ
ｌ　？；１”するセグメント）を有する。この’ｌ’　
−］）　ＮΔセグメンＩ〜は好ましくはシャトルヘクタ
ー乙こ特異な１つの制限部位を（ｊする。植物遺伝子は
Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａセグメント内の特＋Ｊ′Ｉ：的部位に
挿入され１７る。そしてこのソート１ルヘクターし上ｉ
ｌ！！当な一７グし］ハクう一すウム株、好ましくはそ
れの有するＴ　−Ｌ）　Ｎ　Ａがう・中トルー、フタ−
のｉ’　−１）　Ｎ△セグメン１と相同性がある株の＄
１１１胞へ移される。形質転換されたアゲＩ−１ハクテ
リウ１１株を、Ｔｌプラスミドの既存のセグメントをソ
ート１ルヘクターのｉ”　−Ｄ　ＮΔセグメン１−で置
（矢する２重相同３，１１の換え現象を選り（する条（
’ｌヒト　Ｉ！Ｉｌり（？Ｉさ一已る。

こごでｉムベたカタ１に（追い（ＩＭ　ｆｉＱ＋　Ｔ　
−１）　ＮＡを当該分子Ｙで既知のどれかの技術により
植物イ１■胞に移すことができる。例えば、この移送は
Ｔ　−１）　ＮＡ内に取り込まれた植物遺伝子を含む新
規のアグロハクテリウＪ・株の持つプラスミ］゛の直接
感染、あるいはアグロバクテリウム株と稙吻ｔ、＋ｎ胞
の共存１１”１ｊｔにより最も容易に達成される。前者
の技術である直接感染はやがて感染部位に腫瘍体Ｊ−た
はクラウンゴールの出現をもたらす。クラウンゴール細
胞を次いで培養で増殖させ、そしてｌｊ′？−石に既知
の適当な環境下で挿入Ｔ　−Ｄ　ＮＡセグメントをｈ−
’Ｊる完全植物体に再生さ−Ｕる。共存１ｉ；　養の方
法により、植物Ｘ１１１胞のある部分が形り′１転模さ
れろ。即し細胞内にＴ−ＤＮＡが移り、（１６物細胞ゲ
ノｌ１、に挿入される。いずれにしても、形？°１動、
ＩＱ　Ｋ＋：＋　＋＋包を選１尺あるいは検索して未形
質転換細胞と区別しなりればならない。選択はｉ’　−
１）　ＮＡの中に（１１Ｃ物ｊ貫仏子と共に、取り込ま
れる選択マーカーを用いろ事により容易に達成される。

例として、ノパリンシンセターセ　プロモーター支配（
・で発現するシバ・ｒドロフＡレート　レダクターゼあ
るいはネオマイノン　ファスフォトランスフＪ−ラーセ
かある。これらのマーカーは夫々メトトＬバ１−セード
またはカナマイシンあるいはそれらの頬イ以物を含む培
地での増夕１ｔにより選択される。さらにＴ−ＤＮＡは
内生マーカー、例えばＴｉ−誘ＬＳ　ＩＩＩ　ｌ＆の培
養でホルモン非依存増殖を制御する遺伝子または遺伝子
群。

Ｒｉ−銹専腫瘍ルートの異常形態を制御する遺伝子また
は遺伝子群、およびアミノ酸類似物のような毒性化合物
に対する耐性（その耐性はオピンシンセターゼによりも
たらされる）を制御する遺伝子群を有する。当業者によ
く知られている検索法には、オピン生産の測定、特徴的
ＲＮＡまたは′ｒ−１）ＮΔ配列に対する特異的ハイブ
リダイゼーション、あるいはＥＬＩＳＡ（酵素連関免疫
吸着分析の略）、ラジオイムノアッセイ、および”ウェ
スタン”プロットなどの特異的蛋白質の免疫学的分析が
ある。

シャトルヘクター作戦の別の方法にＴ−ＤＮＡまたはそ
こに植物遺伝子を挿入した修飾’Ｆ−１）　ＮＡを含む
プラスミド、即らアグロバクテリウム枕内で独立に複製
し得るプラスミドの使用がある。

最近の資料により、アグロバクテリウム株がＴ−ＤＮＡ
の植物ｊ１■胞への移動を促進する機能をもつあるトラ
ンスに作用する遺伝子を有するならば。

そのようなプラスミドのＴ　−Ｄ　ＮＡがアゲ覧」バク
テリウム株から植物細胞へ移され得るということが示さ
れている。Ｔ−ＤＮＡを含め、アグロバクテリウム枕内
で独立に複製できるプラスミドをここでは”′す°ブー
ＴＩＰ″　（ｓｕｂ−ＴＩＰ　）プラスミドと呼ぶ。変
動範囲があり、そこでは、”サブ−ＴＩＰ”プラスミド
はそれらが含有する”「−１）　Ｎ　ＡＯ■に差がある
。その範囲の端は′Ｉ″Ｉ　ＰプラスミドからのＴ−Ｄ
ＮＡがすべて残っているもので。

特に”小ＴＩＰ″　（ｍｉｎｉ−ＴＩＰ）プラスミドと
呼ばれる。その範囲のもう一端は”ｒ”−１）　Ｎ　Ａ
境界のまわりのＤ　ＮＡの最小量を残してすべてが欠失
している。その残存部分は宿主細胞内で転移と組め込み
ができる必要最小型である。このようなプラスミドは”
　ｊｆ５”ｌ’　Ｉ　Ｐ　”　（ｍｉｃｒｏ−Ｔ１１’
　）と呼ばれる。

ザブーゴＩＰプラスミドは小さく、直接操作するのが比
較的容易であるという利点がある。希望する遺伝子を挿
入した後、Ｔ−１）ＮＡ転移を促進する１−ランスに作
用する遺伝子を含む植物１１１１胞へ直接容易にｍ人で
きる。アグロバクテリウム株への導入はアグロバクテリ
ウム株の形質転換か、供与１１ｔｌ菌細胞から接合伝達
という当業者によく知られている技術により簡便に達成
される。

再生は既知の技術で達成される。再生ステップの目的は
正常に、しかし組め込まれた”Ｉ’　−Ｄ　ＮＡを保持
し゛乙Ｊ曽殖および再生産する全植物体を得ることであ
る。再生の技術は、当該分野で既知の原理によれば、Ｔ
−ＤＮＡの起源、そこでの修飾の性質、および形質転換
された１１α物の種によりいくらか変動する。Ｒｉ−型
Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａで形質転換された植物細胞は、公知の
技術により何ら余分な実験なしに、容易に再生される。

Ｔｉ−型Ｔ　−Ｄ　ＮＡで形質転換された植物細胞は、
ある例では１８養のポルモンレヘルを適当に操作するご
とにより再生され得る。しかし、好ましくは、Ｔｉ−形
質転換組織は、もしゴーＤＮＡがＴｍｒとＴｍｓ逍伝遺
転子方または双方に変異を受けておれば２最も節単に再
生される。これらの遺伝子の不活性化は形質転換組織の
ポルモンハランスを正常に戻し、培養での組織のボルモ
ンレヘルを極めて容易に操作できるようになる結果２節
承に再生するようなより正常なホルモン生理を有する植
物をもたらす。数例においては、胛瘍細胞は、ノバリン
ノンセターゼのような組の込まれたＴ−ＤＮＡを持らが
っＴ　−ＤＮＡ遺伝子を発現するシー１〜．そしてまた
挿入植物遺伝子を発現するシュートを再生さ−Ｕること
ができる。このシュートは根を有する植物につぎ木する
事により栄養細胞で維持でき、稔性花を着生できる。シ
ュートはこのようにしてＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａを有し、そこ
へ挿入された植物遺伝子を発現する正常な子孫植物の親
植物体となる。

形質転換した植物ｆ、１１織の遺伝型Ｉ＋：、Ｌばしば
その細胞がインヒドロの培地で生前ｉｉＪで、再生可で
あるごとによって籠ｊｊ’ｒに選択される。農学上関心
のある栽培変種植物（ｃｕｌｔｉｖｄｒ）がこれらの操
作に不適応であるならば、もっと余地のある変化が最初
になされる。再生後、新しくＪ、ｒ′ｊ人された外来（
１！ｉ物遺伝子は、植物の育て方や顛物ｊ青伝学の当業
者に既知の技術により所望の農学上の栽培変種植物にた
やすく移入される。形質転換された植物のこれら農学上
の栽培変種植物との交配により最初の雑種が得られる。

これらの雑種は２次いで、所望の遺伝学的背景の植物と
戻り交雑されうる。子孫は、そしてＮｕｎ　の込まれた
Ｔ−ＤＮＡの連結した存在か、挿入された植物遺伝子の
発現の結果としての新しい表現型に対して、継続的に検
索されそして選択される。この方法では、何回もの戻し
交５“１（とｍ　ｔＪｉ：の後、挿入された植物遺伝子
と共に、農学」二望ましい親株に木質的に同一な遺伝型
をもって植物が生産されうる。

（実施例） 次の例は’ｌ’　Ｉ　Ｐおよびアゲｌ−１ハクテリウｌ
、のう）子生物学や操作の当業者によく知られかつ受Ｌ
Ｊ入れられうる多くの技術を利用している；そのような
方法は、いつも詳しく述べられているわレノではない。

酵素は市販のものから得られ、ヘンダーの助言もしくは
当該分野で既知の他の変法に従って使われる。試薬、緩
衝液や培地の条件はまた当該分野で知られている。その
ような標（ＩＩ８的技術についての参考研究には次のも
のがある：Ｉ１．Ｗｕ、ｃｄ（１９７９）　Ｍｅｔｈ、
　ｌＥｎｚｙｍｏｌ、ρ８　；　Ｊ、Ｉｌ、旧１１ｅｒ
　（１９７２）［ｉｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　；　Ｒ，Ｄａｖｉ
ｓ旦旦、（１９８０）組！匹蝉１３匹竺ｊ」↓Ｇ凱虱兵
ＬしとＩｌ、Ｆ、５ｃｈｌｅｉｆ　ａｎｄ　ｌ’、ｃ、
Ｗｎｅｓｉｎｋ　（１９８２）１’ｒａｃｔｉｃａｌ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ＋（↓；ｒｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、−プラスミドＩｌｃを除いて、プラスミド
は、プラスミドのめであるが２例えばｐ３，８かｐｌ（
Ｓ４のように表示には”ｐ”を前に置く。

プラスミドを含んだ細胞は同定された細胞とカッコ内に
示したプラスミドによって示されている。

例えば、アグロハタテリウム・チェーメファシェンス（
ｐＴｉ　１５り　）とかに’　８０２　（ｐＫＳ　４　
Ｋ１１）。表１は同定したプラスミドやそれらの関係す
ることに対して有益な指標（ｉｎｄｅｘ　）を供給する
。表２は、寄託菌の指標を供給する。第１図は実施例５
゜６と８中に述べられている横築の有益な比較を供給す
る。

尖施炭上 この例の目的はそれ自身の調節下で非Ｔ　−Ｄ　ＮＡの
真核遺伝子の発現を教示することである。

↓−１−−−位列、４（シラ遅−Ｖ−透Ａ体夙里製制限
部位は、１）ＮＡポリメラーゼ１でその粘着末端の一本
１１′１部分を充愼するＨｉｐｄｌｌｌで消化、その平
ｌ；↑末端を連結、　Ｋ　８０２を形質転換、テトラサ
イクリンｌ１ｌＩ］性で選択、その薬剤耐性クローンか
らプラ・スミｌ”　ｉｉ’＋、陣、そしてその・１冒ｊ
の制限部位の除去をも育認するため制限酵素での特性表
示によって。

シソスミｌ”　ｐＨＲ３２２から除かれる。このプラス
ミドをｐ３５０　（ｐ旧ン３２２−…ぜけＩＩＩ　）　
と叶ふ。

１．２　シャトルヘクターのａｌ製 １１２０３は」凹Ｉ１１で消化され、そのｌ”　−Ｄ　
Ｎ　ＡＲａｍ　１７断片（第２図参照）はアガＬ、２−
スゲル電気泳動後ゲルからン容出さ・けることによって
’４’　萬１［された。この断片は」ａｍ　Ｉｆ　ｌで
線状化されたｐ３５０と混合され、そして連結され、そ
して反応物はに８０２に形質転換された。　アンピシリ
ン面］性形質転換株から争乱されたシソスミ１は制限地
図によっ−ご特徴づり、　Ｓｍａ　Ｉで消化し、そして
平滑末う：；；はｌ１ｉｎｄ　Ｉｌｌリンカ−に連結し
た。」ムｙＩ　Ｉｌｌオ′１１着末らｊｉｊはｌ１ｉｎ
ｄｌｌｌによる切断によって露出させ、その綿状プラス
ミドは連結によってそれ自身を円形にしてのち、そのプ
ラスミドはに８０２に形質転換された。

アンピンリン１川性形質転換株から分ア１１されたプラ
スミドは制限地域によって特徴づけられ、プラスミドの
もっている第３図に示されているような４１４造はｐ３
９５と名付げられた。ｐ３７６は、下で論議されている
が、またこの地点で単離された。（第３図） ｐ３９５はＢａｍ　Ｉｆ　Ｉで消化され、そしてそのＲ
ａｍ１７Ｔ−ＤＮＡ断片はそのＳｍａ１部位は、旦」す
Ｉｌに変換されたが、アガロースゲル電気泳動に続き、
請出された。このＢａｍ１７断片は−ＩＩＢＩＩ＋で綿
状化されたｐＲＫ２９０と混合され連結された。その反
応液はに８０２に形質転換し１選択後、形質転換株は、
制限地図によって１．５徴つりられだプラスミドを調製
するために使われた。この特定のシソスミ［は。

ｐ４９０−８／１４　と名イ」けられた。

１３７６は、その由来はこの例の中で＋、述されたがづ
見ｌ、今、肛筋ＩＩＩの特性に変換されたが、そごから
右に約０．８　Ｋｂｐの欠失のあるごとが見つけられた
。上のｐ　３　り５に対してなされたようにそのＢａｍ
１７に相当するＢａｍ　ＩＩ　１７Ｆ−Ｄ　Ｎへ〇ｉ片
は分離され１」旦ＩＩで綿状化されたｐＲＫ２９０に連
結された。形質転換選択、そしてプラスミド単離と特徴
づげの後その′固定のプラスミドはｐ４５Ｂ−１と名伺
ＬＪられた。

１．３　ノノザｌ／シ石ｕｌ髪ζフ１腺オリンｑ近伝子
の挿入 ファセオリン遺伝子を載せた断片は１ｌｉｎｄｌｌｌ消
化されたｐＫＳ−ＫＢ３．８からアガロースゲル電気泳
動によって調製されノこ。この断片は其匣１■で線状化
されたｐ４９０−８／１４　と混合され、連結された。

Ｋ２Ｏ２のカナマイシン而（性形質転換株は、それから
制限地図をつくられたプラスミドを調製するのに使われ
た。２つの１１４成体はｊｉｉ離された：　ｐ４９９／
（ｉ／７はカナマイシン曲＝１性の右に豆の（塩恭）配
列を持っていた（第４図）そしてｐ４９９／６／８は９
反対方向であった（第５図）。

精製されたファセオリン遺伝子を載せたｐＫＳ−Ｋｉｔ
　３．８のｌ１ｉｎｄｌｌｌ断片はまた。ル（回■で線
状化されたｐ４５８−１と混合され、連結された。プラ
スミドは。

再び、　Ｋ８（１２のカナマイシン両性形質転換株から
３１ム１製され、制限地図がつくられた。Ｆｌｉび両方
向が単離された：　ｐ４９６−２　（第６［ｍ）とｐ４
９Ｇ−１（第５図）ハ各々、カナマイシン面１性遺伝子
の右と左にファセオリンを持っていた。

±、４Ｔｉプラス迂悲幻吋［Ｌｌ順Ｉ因込−ファセオリ
ンとカナマイシン遺伝子は実施例１４に述べられている
ようにアグロバクテリウム　チューメファシエンス細胞
内に保持されているＴｉプラスミド内に組み込まれた。

２つのＴｉプラスミドは受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ
）として使われた：ｐＴｉ１５９はオフ１〜ピン型プラ
スミド−である；そし°ｉ：ｐ］’ｉＡ［ｉ６はアグロ
バクテリウムＩｓ　（挿入）配列の自然の挿入による機
能しない差遣転子をもっＡ６オク１−ピン型プラスミド
から由来する系統である。ｐ４９９／６／７．　ｐ４９
９／６／８．　ｐ４９６−２とｐ４９６−１で定義され
た構造を含むｐＴｉ１５９プラスミドは各々、　ｐ５２
９−８．　ｐ５２！］−７，ｐ５２９−１１　とｐ５２
９−２と名付けられた。　ｐＴｉ八〇へ内の同し４’ｉ
ｌ造は各々、　ｐ５３９−６．　ｐ５３９−５．　ｐ５
３９−２とｐ５３９−１と名イ・ＩＧノられた。

」−、−５−−−１１ｊ４　！ｊ哲μとｔδ架ｐ　５２
　！］と１＋　５３９系列のＴｉプラスミドを含むアグ
ロハクテリウＪ、・ナユーメファンエンス細胞は↑１で
刺し、　ｉ！ｉ定の細菌１１１１胞の注入によってヒマ
ワリ植物の幹に感染さゼるのに使われた。

！−，Ｇ−−７７−（？、！’−’Ｊ−７（７）４Ｑ％
ｌｌ　（ｄｅｌ、ｃｃｔｉｏｎ　）　−ファセオリンの
蛋白鎮は実施例１４中に述べられであるようにＥＬＩＳ
Ａｓによって、こふ（８ａｌｌ）に探知された。検査さ
れたすべてのこぶはファセオリンを含んでいることが見
つりられた；その晴は２組織の新鮮な０ｒｅｓｌ＋　）
　ｆｆ１ｉダラム当り２０ｎｇと（ｌｎｌ；の間で多様
であり、平均は約１０■／ｇである。蛋白変１１ケル（
ＳＤＳ−ポリアクリルアミＦ）のウェスタン・プロット
による解析は本来のファセオリンより意味深長にも小さ
いにもかかわらず外見の分子量は大きい分Ｆｉｌ［シた
ハンドを示した。正確なハンＦの数や大きさは宿主間で
多様であり。

それは宿主の特異な翻訳後の加工（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎ
ｇ）の結果である。

ファセオリンのメ、センジャーＲＮΔ鎮は実施例１２中
で述べられているように、ごふの中で探知された。検査
されたすべてのこぶは、ファセオリン（のＲＮＡ）鎖を
ポリ　（Δ）　５１４　ＲＮＡ両分、　に含まれている
ことがわがった；その晴は゛＋ｖ均全ポリ　（Δ）ＲＮ
Ａの約０．００５％である。変性したＤ　Ｎ　Ａゲル（
メチル　マー二１−ヨリーアカ゛ロース）のノーザン・
ブＩＩントによる解、ＩＪｉは、；ｔ、来のファセオリ
ンのメツセンツヤーｊンＮＡ　（１，６Ｋｂｐ）と同じ
大きさの大きい分子量の５７．１ｉｉｌｉ　したハント
を示した。

ファセオリンはまた。　ＩＥ　＋−Ｉ　Ｓ　Ａ　ＬＣＪ
：　−Ｊ　−（ｐＴｉ八６へヘクターによって感染され
た細胞に由来する５ｈｏｏｔ−ｔｉｓｓｕｅ中に探知さ
れた。

ファセオリン蛋白とファセオリンのメツセンツヤ−ＲＮ
Ａの信号の両方の探知される星は修ｆｉｉ、されていな
いｐＴｉ１５９を修飾されていないρＴｉＡ６Ｇをもつ
アグロバクテリウム・チューメファンコニンスにより形
質転換されたクラウンゴールを分析する時にめられる誤
差１・ｎ聞易」二に重要で実質的なものである。

丈」１舛フ− この例は、完全なファセオリン遺転子を実施例１中で教
えたものに１真似したＴ　−１）　Ｎ八に挿入すること
を教示する。この構成は■バリンのＴｉプラスミドであ
るｐ１’１ｃ５Ｂ中に、ツバリン合成遺伝子の領域内に
挿入された配列を連ふように設計されたシ中トルヘクク
ーを利用する。

Ｆ↓−１４りｌ−ユ火ヘククーの構成 ツバリン型プラスミドｐＴｉＣ５８（第８　ＩＰＩ　ａ
）はＳｍａ　Ｉで消化され、ツバリン合成遺伝子をコー
ドした断片はアガロースゲル電気泳動によって単＾ＩＩ
された。この１す１片はＢ、ｌ　Ｉ＋リンカ−に平滑末
端連結され、それはそれからＢｇｌ　Ｉ＋による消化に
よって露出させられた。その結果化じたＤＮＡ断片はＢ
、］　ＩＩで綿状化されたｐＨＫ２９０　（第１０図）
と混合され連結された。Ｋ２Ｏ２への形質転換後テトラ
ザイクリンによって選択され、プラスミＩ：のｉ’ｏ、
　ｆｆ１ｌ［され。

そして制限地図が作成された。その特定のプラスミドは
ｐｃＩ＋４４八（第８図ｂ）と名付りられた。

４つのＣ１ａ　１部位は連続にｐＣＦ４４Ａを２度再切
］υｉすることによって１つのり」−１感受性の部位に
変えられた。そのプラスミドはり旦−１で消化され。

それ自身で再連結され、そしてに８０２に形質転換され
た。選択後、プラスミドの単＾Ｕ、そして制限地図の作
成後、匣１断片（２つの財と１部位をイｊする）の欠失
した適当なプラスミ「はり史１で消化され、それ自身で
再連結され、そしてに８０２に形質転換された。選択、
プラスミド単離、そして制限地図作成の後、２度目の欠
失したプラスミド（このたびの且虹Ｉ断片は虱潰転子の
５°末端の他はすべてをもつ）をｐＭＳ　−ｎｏｐｌＶ
　（第９図、第８図、第８図Ｃ）と名イ（ｊりた。

２、　２　Ｋａｎ／ｂｅａｒｉ遺伝子の挿ｐＫＳ−ＫＢ
３．８　（第１１図）は巾−■により消化されカナマイ
シン耐性とファセオリンの遺伝子をもつ６．０Ｋｂｐの
断片がアガロースゲル電気泳動でｊ１’ｌ　乱された。

この断片はＣ１ａ　Ｉで綿状化されたｐｋｓ−ｎｏｐｌ
Ｖを混合され、ｊ！！！結され、そしてに８０２に形質
転換された。カナマイシンとテ１−ラザイクリンに対し
て１ｌｉＪ性でアンピンリン感受性の形質転換株から単
離されたプラスミドは制限地図を作成され、第８［ｇｌ
　ｂに示された構造をもつものはｐＫＳ−ｎｏｐｌＶ−
ＫＩ１３．８ｔ１５と名付げられた。ファセオリン遺伝
了をカナマイシン耐性の左に位置した類似り１１−ンは
見つけられ、　ｐＫｓ−ｎｏｐｌ（８３，８１１３と名
イマＪりられた。

２．３Ｔｉプラスミドへの転１わＵ１臥９惑３χ三親交
り（１技術（従来技術と実施例１４参照）はｐＴｉＣ５
８であるツバリン型Ｔｉプラスミ１゛へその構造を転移
するのに使われた。ｐｌ（Ｓ−ｎｏｐｌＶ−ＫＩ１３．
８１１３と１１５のｐＴｉＣ５Ｂとの交雑の結果できた
各々、Ｔ１プラスミドＣ５８−ｎｏｐ　Ｋ旧１３とｐＣ
５８−ｎｏｐ−に旧１５　は制限地図作成とザリ′ンブ
ロノト解析によって特徴づりられた。

その２つのプラスミドのいずれかを含む細菌（これらプ
ラスミドは二遺転子の５゛末端山来の配列と俣（ト）−
遺伝子の３゛側面の配列内に存在するカナマイシン／フ
ァセオリンの遺伝子の断片のいづれかの方向をもってい
る）は、その細菌を注入するごとによって、ヒマワリ植
物の幹に感染するのに別々に使われた。

一影ユ」−□発現していることの探知 ファセオリン遺伝子の発現は実施例１３．５中のように
ＥＬＩＳＡｓによりヒマワリのごふのｋｌＮ中に探知さ
れた。

大旌皿菱 この例はファセオリン、これは豆のｊ’、１４．ｐ　ｓ
　ｅ、ｏ　ｌ　−ｕ　ｓｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｌ、の多く
の種子貯蔵蛋白であるが、その遺伝子の操作、いろいろ
な別の実施例に述べられたヘクターヘファセオリン遺伝
子を１Φ入するだめの操作を教授する。

Ｌ　１　ファセ泪ユ！遺伝子の勺ブク１１−七４グＣｈ
ａｒｏｎ　２４八　八Ｇ−ＰＶＰｈ１７７．４　（ｏｒ
　１７７．４；Ｓ、Ｍ、Ｓｕｎ第１４図）中のファセオ
リンの遺伝的りｔコーンは傾辷■とｌｌａｍ　Ｉｔ　Ｉ
により消化された。ファセオリン遺伝子をもつ３．８ｋ
ｂｐの断片とそれに側面する配列は、アガロースゲル電
気泳動により’ｉ’−ｔ’＋Ｉｆされ。

それらは口ａｍ１１１で線状化されたｐ］３１ン３２２
（第１２Ｍ）と／ＸＹ合され、連結された。その混合物
は、　ＩＩＢＩＯＩに形質転換され、そして、アンピシ
リンに耐性でテトラザイクリンに感受性のコロニー（ｃ
ｏｌｏｎｉｅｓ）はｊハ択された。これらのコロニーが
ら単離されたブラスミｌ’は制限地図を作成された。第
１３図に示された＋ｉ’Ｔ　Ｌをもつプラスミドは選択
されＡＧ−ｐＰＶＰｌ＋３．８（もしくは、　ｐ３．８
）と名付Ｕられた。１１１とＲａｍ　Ｉｆ　１部位の相
互の連結は両部位を不活化する。

１７７．４の別のザブクローンはｕｃｏＲＩによる消化
によって構成され、広範囲にわたる３′側面の配列とフ
）・セオリン遺伝子の最５゛末端を除くすべてを含む７
．２ｋｂｐの断片の単離と１１旧０１の形質転換株のア
ンピシリン選択後１介離されたものは制限地図を作成さ
れた。ｐＢＲ３２２のハ凹見１部位がファセオリン遺伝
子の５゛末端に隣接し、３”の翻訳されない領域内末端
になった方向に挿入されたプラスミドは八Ｇ−ｐＰＶＰ
Ｉ＋７．２　と名イＮＪりられた。　（ｏｒｐ７．２．
第１５図：Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ、とＳＨＢｈｔｏｍ　ｅ
Ｌ　旦、・同」二）。

３．２　カナマイン７ｉ４性遺伝子のクローニン外と単
離 ｐｌ？Ｚ１０２　（１？、八、Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ　ａ
ｔ　旦、　（＋９７９）　Ｍｏｌ。

ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、匪；　６５−７２　）は、トラン
スポゾンｌ’ｎ５の写しくｃｏｐｙ）をもっているコリ
シンＥ１プラスミドであるが、それはハｍ１ｌｌと１ｌ
ｉｎｄｌｌｌにより消化され、以前に同し２つの酵素ム
こより線状化されたｐＢｌ１３２２と混合され、連結さ
れ、　Ｋ２Ｏ２に形質転換された。アンピシリンとカナ
マイシンの両方の耐性で選択された形質転換株から単離
されたプラスミドは制限地図を作成され、第１６図に示
される構造をもつものはｐＫＳ−４と名（＝Ｉ’　＆Ｊ
られた。

３．３　カナマイシン耐性とツバ木史ン遺転子上匁裡詩 ρ３．８はＣ１ａ　ＩとＢａｍ１ｌ＋により消化され、
そしてファセオリン遺伝子とあるｐＨｌ？３２２の配列
を含む４．２ｋｂρのｌｌｌｉ片は、アガロースゲル電
気泳動により、ｉ＠離された。これはｐＫＳ４（第１６
図）をｑ月＋Ｉで線状化されたρ［３１１３２２（第１
２図）由来のカナマイノン耐性（ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ１１　。

Ｎ　＋）　’ｌ川用）ｉｆｌ伝子転子つＴｎ５のＣ１ａ
　ｌ　／Ｉｌａｍ　ＩＩ　１１す１片と混合された。そ
の混合物は連結され、そしてに８０２に形質転換された
。アンピシリンとカナマイシンに１ｌｉｉｉ性の：］　
ｌ：に一の選択後、プラスミドは単離され、制御ｉＩＪ
地］７１を作成した。第１１図に見られる昂）Ｊ聞をも
つコ１．に一はｐＫＳ−旧１３．８　と名付りられた。

ｐ７．２は１区Ｒ１とＩｌａｍ　Ｉｔ　ｌにより消化さ
れ、そして、ファセオリン瑣転子の５゛末端を除くずベ
ーζをもつ３．０ｋｂｐの１ｖｉ片はアガロースケル電
気泳動により単離された。これはｐＫｓｔ（第１６図）
由来のカーノ゛マインン遺伝子と１ｌｉｎｄｌｌｌによ
りＨ７°ｉ）沃化されたｐＢＲ３２２（第１２図）をも
つＴｎ５の坦ｎｄ　ＩＩＩ　／　Ｂａｍ　ｊｌ　１１１
Ｊ７１！＋と混合された。その混合物は連結され、　Ｋ
２Ｏ２に形質転換された。アンピシリンとカナマイシン
に耐性のコロニーの選択後、プラスミドはＪｉｉ離され
制限地図を作成された。第１７図に示される構造をもつ
コロニーはｐＫＳ４−ＫＢ３と名イ＝１　ｃノられた。

ｐＫ３４４Ｂ内では、ファセオリンは遺伝子の最５”末
端をツー１−シている配列とすべての５′側面の領域を
失っている（第１４図を参照）。

去施炎↓ この実施例は遺伝イからインドＩＩンを除去する方法を
教授する。これは遺伝子的環境（（Ｈｅｎｏｍｉｃｅｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　）にｃｌ）Ｎ八を置くのと同しで
ある。

非加二Ｅ　（ｕｎｐｒｏｃｃｓｓｅｄ　）の転７ｊの５
′　と：（°　末端の両方のエクソン内に制限酵素部１
＋７．が見つし」ら４１゜るか１部位上に１．７異的変
異によってつくられる。

これらの部位は笛伝了−クリーンとｃｌ）Ｎへの両方に
存在する。う）在ずろイントロンを含むＩ）ＮΔは遺伝
子クローンから除去でき、２つの部位にわたるそれに相
当するイン１川コンのないｃＤＮ△り１．Ｊ−ンの１ｖ
ｉ片に置きかえられる。　その遊の操作もまた可能であ
る：インＩ−１：Ｊンを含む遺伝子配列をｃＤＮΔ環境
中に置かれうる。に）ろものはｊ貫伝的クローンの内部
断片をｃＤＮΔりじ１−ンの切断した相当する隙間に挿
入する。この後Ｈの方法るＪ類似しているが、イントロ
ンがその変換される１す’０’１を作るために選ばれる
酵素に感受性な部位を含むよりもしばしば、技ｆホｊ的
にはより国ｊｆｆである。ごの困Ｗｌｌは部分分解の条
件の注意深い選択とアガロースゲル電気泳動による所望
断片の１ｈ製により克服された。ごの戦略をさらにねっ
たものは、遺伝子内の個々のイントロンを他のイントロ
ンとエクソンとに影響を及ぼさないで操作すること、お
よび不都合な介在する制限部位が上述するようにイント
ロン内に存在するときの配列を段階的に交換することを
含む。

〜４−２−」−ニ乙ｙ＋４−妻受りＱ−イーンｌ−Ｉ−
＋　ン３ヒ含む断片のにルー頌へｔを又（閃 ファレオリンとその側面の配列のプラスミド′りｌコー
ンである１３．８を旺＋１　１とＳａｃ、　Ｉで各々部
分的にかつ完全に分解した。そして、　ｐＢＲ３２２ヘ
クターおよびそのイントロンの５°　と３゛末端の両方
を含む６．４ｋｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動に
まり単離した。匹ＤＮＡ３１（ファセオリンのｍ　ＲＮ
八から作成されたｃｌ）Ｎへのｐ　１１１１３２２プラ
スミドクローン）はＳａｃ　ＩとＥｃｏＲＩにより各々
部分的にかつ完全に分解され、そして最５゛と３゛末端
の配列を除く全ファセオリンｃＤＮＡを含む１．３３ｋ
ｂｐの断片はアガロースゲル電気泳動により単離された
。これらの２つの断片はいっしょに連結され。

１１旧Ｏ１に形質転換された。コしＪニーの選ＩＲ後、
菌の増殖、プラスミドの’＋′Ｌｉ？ｉｌ［をし、制限
地図作成の結果、欲しい構造をもつブラスミ１−である
ことを６宜Ｊ忍した。　− このプラスミドはｐ３．８−ｃ　Ｉ）ＮΔ（第２２図）
と名伺りられた。その全構造は第１８図に示しである。

４．２　ｐ３．８−二（セ寸（へ！弓史用−ｐ３．８−
　ｃ　Ｉ）　ＮΔは遺伝子１）ＮＡ源たとえばずへての
他の例で使われるｐ３．８に代用できるごとに注目する
。そして、そのようにしで使った時のｐ３．８−ｃＤＮ
ＡはインドＩ」ンを欠失しているものであるような違っ
た類領構造をη二しるだろう。もしくは、この戦略はす
でに作られた構造からイン！・１コンを除去するために
使うことができる。

月１例」− この例の目的はｐＴｉ１５９と他のオクトピン］′ｉプ
ラスミドの匠（芽”　ｓｈｏｏｔｉｎｇ”位置）からＬ
ｍｒ　（根”ｒｏｏｔｉｎｇ　”位置）を通って欠失し
たＴｉプラスミ１、を生ずることである。この誘導体は
これによって形質転換された細胞が完全な植物に再生す
るのに完全なｔｍｓと虱潰転子をもつｐＴｉ１５９によ
って形質転１桑された細胞よりも簡単であるので有用で
ある。

一即シー輿−を欠失したｐＴｉ１５９は２つの方法で最
後に換えられる：　Ｌｍｓ　ｕｒ不活化と外来遺伝子の
挿入。これらの２つの変換は”ｒ−１）ＮΔの違った位
置で設定されると、各々の変換は違ったシャトルヘクタ
ーにより独立に挿入される。変換によりできた各シャト
ルヘクターは別個にｉＦ（択され。

それはアゲＩＩハタチリウム中で選択できる少なくとも
２つのマーカーの使用を必要とする。いつものカナマイ
シンＭｌ性の池にこの実施例はｐ　ＩＩ　Ｒ３２５Ｆｌ
ｌ来のフロラＪ、フェニコール剛性を利用した。

５．１　クロラドフェニコールｉｔ　１１逍伝子り豆二
−−ンの構ＪＬ ｐ　Ｂ　１１３２５は１ｌｉｎｅｌｌにより消化され、
平滑末ＯＨ，：は肚皿Ｉｌｌリンカ−と連結された。そ
の結果として生したものはＩｔ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩに
より消化され再連結され５クロラムフ工ニコール面・１
性（りニー）ζｉＭ　ＩＪ（サレｐＭＳ−５と名（（Ｊ
りられた（第１９１図）。ごれは、５．出遺転子を含む
肛回１１１／坦」−１１す【片の起源として機能する。

９．２ｋｂｐの線状化ＤＮＡ断１１はｐ２ｆ１３Ｑ）１
１興（↓Ｉ１１完全分解とハｍ１１１部分分肪″から単
１も１（される（第３１し１）。

Ｃ７１ｍ　ｚｈ伝転子もつ断Ｊ“１はｐＫＳ−５から’
ｉ’−離され。

９．２ｋｂｐの線状化断片と混合され、連結され、旦、
友嗟に形質転換され、クロラドフェニコールＮ：ｉｌ　
性でｊ〆択され、　ｐＭＳ−ｏｃｔ、ｃａｍ２０３と名
イＮ１りられた（第２０図）。

ｐＫｓ−ｏｃｔ、ｃａｍ２０３はｐＴｉ１５！Ｊの多く
の′１゛Ｌ欠失変異体を構成するのに使われうるプラス
ミドクローンである。Ｔ　Ｌの右腕と、その右腕の左に
耐性遺伝子を含む。Ｔ　Ｌの多種の左腕は」４遣転子の
左（Ｉｌｉｎｄｎ１部位）に付着された。例えば、もし
、　ｐ１０２が付着されたら、欠失は５　、２　ｋ　ｂ
　ｐの長さになり、そして展とｔｍｒの全部を含む。も
し、　ｐｌ（１３が（４辛ｉされたら、欠失は３．２ｋ
ｂｐの長さにムリ、叩ミーの　・部とＬｍｒの全部を含
む。第２図を参照。

ｐＫＳ−ｏｃＬ、ｃａｍ２０３はｌ１ｉｎｄｌｌｌによ
り消化された。

ｐ１０２かｐ１０３は肛皿１１］により消化され、そし
て２．２ｋｂｐか２．０ｋｂｐのｉ’　−Ｄ　Ｎへの断
片は単８１１され、線状化されたｐＫＳ−ｏｃＬ、ｃａ
ｍ２０３と連結され、形質転換され。

それぞれノ１ニジたｐＫｓ−ｏｃＬ、ｄｅｌ　、１＋　
（第２図）またはｐｌ（Ｓ−ｏｃｔ、ｄｅｌ　、、ｌ　
（第２２図）を単離した。　これらの構造は、交’ａ：
（＜、によりアグロバクテリウム・チューメファシエン
スに移行し相同的＆Ｉｌ　ｉｔ換え（１１ｏｍｏ−１ｏ
１；ｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ）そして、
クロラムフェニコールｉ！ｉｉｌ性で選択した。あるい
は一つは確立した方法を用いて、プラスミドのもつ構造
をＢａｍ　ＩＩ　１で線状化し、そしてｐｌ（２９０の
Ｂｇｌ　１１部位に連結ずイ）ごとに３ＬっＣｐｌｉＫ
２９０にその＋ｊｌ造を挿入した。

（以下余白） 天財Ｕ」灸 Ｔｉプラスミドはこの例ではＬｍｒ中の卸し１部位から
ｔｍｌ中のＳｍａ　１部位の間のＴ−ＤＮＡを欠失する
ことによって変異される。改変することのできるＴｉプ
ラスミドはｐＴｉ１５９．　ｐＴｉＢ６　、　ｐＴｉＡ
６６および他のものを含む。この構成は第２３図に示さ
れる。

６、Ｉ　Ｃａｍ遺云子の単離 ｐＫＳ−５（第１９図）は１ｌｉｎｄＩ［ｌとＢｃｌＩ
ニより消化された。最も小さい断片が実施例５で教授し
たように、アガロースゲルで分離後、単離される。

６．２　欠失をもつＴ−ＤＮＡのｐＢＲ３２２クローン
■盪底 Ｔ−ＤＮＡの欠失の右手腕はｐ２０３のＳｍａ　１部位
にＢｇｌ　１１部位を挿入することによって構成される
（第２図参照）。ｐ２０３はＳｍａ　Ｉによって消化さ
れ。

Ｂｇｌ　ＩＩで消化され、再連結され、　Ｋ２Ｏ２に形
質転換された。別の構成ではＢａｍ１ｌｌリンカ−はＢ
ｇｌ　Ｉｔリンカ−の代わりをしそして適当な展］１１
部分分離物が単離される。その結果として生じるプラス
ミドはｐ２０３−８５１　１＋と名付けられ、そして１
■と１Ｉｉｎｄｌ［Ｉにより消化される。断片を含むそ
の大きなＪｌ　１１／１ｌｉｎｄｌｌｌヘクターは実施
例６．１に述べられているように単離されたクロラムフ
ェニコール耐性断片と連結された。クロラムフェニコー
ル耐性はに８０２への形質転換後に選択される。その結
果化じたプラスミドはｐ２ｆ（第２３図）と名付けられ
る。

６．３　Ｔ−ＤＮＡ　−クローンの左手腕の構成肛画■
部位はｐ２０２の１ｌｐａ　Ｉ部位に、展Ｉで消化しそ
してｌ１ｉｎｄｌｌｌリンカ−と連結することにより挿
入される。ｌ１ｉｎｄｎｌによる消化による粘着末端の
露出後肛回■末端をもつ２ｋｂｐ　１１匣Ｉ断片が単離
される。財剪■末端の１ｌｐａ　ｌ断片を財画■分解し
。

Ｋ２Ｏ２に形質転換する。欲しい断片を含むコロニーが
分離された後、特徴づけ、そのプラスミドはρ３ｅ　（
第２４図）と名付けられる。

６．４　Ｔ−ＤＮＡ欠失クローンの構成りローンの左手
腕は、電気泳動後、アガロースゲルから溶出させること
により、ｐ３ｅの１Ｉｉｎｄｌ［１分解の２ｋｂｐ断片
を精製することにより得られた。

ｐ２ｆはＨｉｎｄｌ［Ｉにより切断され、アルカリホス
ファターゼにより処理され、　２ｋｂｐ断片と混合され
、連結され、　Ｋ２Ｏ２に形質転換され、そしてクロラ
ムフェニコール耐性で選択される。プラスミドは個々の
コロニーから単離され、制限地回作成によって特徴づけ
られる。所望の縦並びの配置方向に２つの腕をもつプラ
スミドが選ばれ、　ｐＫＳ−ｏｃｔ、ｄｅｌ　ｍと名付
りられる。（第２５図） ｐＫＳ−ｏｃｔ、ｄｅｌ　ｍは、交雑によりアグロバク
テリウム・チューメファシエンスに移入され、相同的組
み換え体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔｓ　）は、クロラムフェニコールによる選択によっ
て選択される。ヒマワリとタバコの根や若枝（ｓｈｏｏ
ｔｓ）は。

他の例に述べられであるように植えられ、生した腫瘍は
オーピンに対して試験される。

実施例７ この例はｔｍｒとｔｍｌを欠失する構成を教授するもの
であり、実施例６の別法である。

７、　１　ＢｇＩ　ｎ部位をもつクロラムフェニコール
耐性の構成 ｐＢＩ＋３２５は１ｌｉｎｃＩＩにより消化され、平滑
末端はＢｇｌ　ＩＩリンカ−と連結され、ｌｎにより消
化され、再連結される（第２６図）。、クロラムフェニ
コ−ル耐性は、　Ｋ２Ｏ２かＧＭ３３の形質転換後２選
択される。その結果、生したプラスミド、　ｐＫＳ−６
は■Ｌ遺伝子をもつＢｇｌ　ＩＩ／Ｂｃｌ　ｎ断片の源
として機能する。

７、　２　Ｌｍｒ、　ｔｍｌ欠失クローンの構１′ｐ２
０３は１ｌｐａ　ＩとＳ、ｍａ　Ｉにより消化される。

平滑末端をＢ、ｌ　１１リンカ−と連結後、　ＢＢＩ　
ＩＩにより消化され、　Ｂｇｌ　ＩＩ粘着末端を露出し
再連結し、　Ｋ２Ｏ２に形質転換した。所望の構造が確
認され、ｐ２と名付けられる。（第２７図） ７．３Ｔ−ＤＮＡ欠失クローン（ｐＫＳ−ｏｃり鋭ＬＩ
ＩＩ　ａ　）の構成 虱潰転子をもつＢｇＩ　ｎ断片はｐＫＳ−６から単離さ
れ、　Ｂｉｌ　Ｉで切断されたｐ２に連結される。クロ
ラムフェニコール耐性はに８０２の形質転換後１選択さ
れる。その結果化じたプラスミドはｐＫＳ−ｏｃｔ、ｄ
ｅｌｌｌｌａ（第２８図）と名付けられ、実施例６□　
４に述べられているように試験される。

たけ、クロラムフェニコール遺伝子の挿入による虱の変
異の例を供給することである。この遺伝子はｐＭＳ−６
から耘ＶＩＩ　／Ｂｃｌ　ｎ断片として単離され、　ｐ
２０３のＢ、Ｉ　ＩＩ部位に変換される１ｌｐａ　Ｉ部
位に連結される。

に連結され、　Ｂｇｌ　ＩＩにより削られ、再連結され
る。

Ｋ２Ｏ２の形質転換後コロニーは選択され、　ＢｉＩ　
１１部位の挿入に対する制限地図作成によって検索され
る（第２９図）。

８．２ｃａｍｉｉ伝子の単離 ｐＫｓ−６は、　Ｂｇｌ　ＩＩとＵリーＩにより消化さ
れる。

もっとも小さい断片は、アガロースゲル電気泳動により
単離される。

８．３　変異したＴ−ＤＮＡのクローンの構成実施例８
．１からの修飾したｐ２０３はＢｇｌ　ＩＩにより消化
され、実施例８．２からの調製したｃａｍ遺伝子と連結
され、そしてに８０２に形質転換される。

クロラムフェニコール耐性で選択され、耐性形質転換株
から単離し、そして制限酵素地図作成による特徴づけの
後、そのプラスミドはｐＫＳ−ｏｃｔ、　ｔｍｒ（第３
０図）と名付けられる。

実施例９ この例での再生はＲｉ−ｂａｓｅｄ　Ｔ　Ｉ　Ｐプラス
ミドによって刺激されたニンジンの腫瘍を包含しＭ、　
−Ｄ。

Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｎａｔｕ
ｒｅ　２９５：　４３２〜４３４によって述べられてい
るように本質的に遂げられる。

９．１−１す反ｑ根彦Ｗ礪１ζζ ニンジンの円板状組織は水０．１ｍｆｆ当り約１０９の
細胞を植菌される。得られた末端の１．５ｃｍの部分に
対して１つが切りとられ、ホルモンを欠いた固体（１〜
１．５％寒天）　Ｍｏｎ１ｅｒ培地（Ｄ、Ａ、Ｔｅｐｆ
ｅｒａｎｄ　Ｊ、Ｃ，Ｔｅｍｐｅ　（１９８１）　Ｃ，
Ｒ，１ｌｅｂｄ、５ｅａｎｃ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、。

Ｐａｒｉｓ　２９５：１５３−１５６　）に置かれ、暗
所で２５℃〜２７℃で生育される。細胞による汚染のな
い培地は。

２〜３週間ごとに移され、ホルモンと寒天を欠いたＭｏ
ｎ１ｅｒ培地にさらに植えて培養される。

９．２　根の植物への再生 実施例９．１に述べられているように培養された根組織
は０．３６μＭ　２．４−Ｄ　と０．７２／ｊＭ　Ｋｉ
ｎｅｔｉｎで補われた固体（０，８％寒天）　Ｍｏｎ１
ｅｒ培地に置かれる。４週間後、その結果、生しだカル
ス組織はホルモンを欠いている液体Ｍｏｎ１ｅｒ培地中
に置かれる。

１ケ月間、２２℃〜２５℃でシェイカ−（１５０ｒｐｍ
）で保温の間、カルスは懸濁培地に分離し幼胚は分化し
、ホルモンを欠いたＭｏｎ１ｅｒ培地を含むペトリ皿に
置いた時、苗木に育つ。これらの苗木は、培地中で育ち
９段階的に減少した湿度の空気にさらすことにより”強
くした（ｈａｒｄｅｎｉｎｇ　）　”後、温室か庭園（
フィールドプロット）中の土壌に移される。

９．３　ジー毛状の根のベクターの１・ｊ用機能するｔ
ｍｒ遺伝子をもたないＴｉを基礎にしたベクターは、実
施例９．１と９．２に述べられているようにＲｉを基礎
にしたベクターの代わりに使われる。適当な欠失の構成
は実施例６．７と８に述べられている。

実施例１Ｏ この実施例での再生は、Ｔｉに基づ＜ＴＩＰプラスミド
によって刺激されたタバコの腫瘍を含む。

本質的にに、八、Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８
３）　Ｃｅ１ｌ　３２：１０３３〜１０４３によって述
べられているように遂げられる。

１０．１　クラウンゴールの感染 タバコ組織ば、初め八、Ｃ，Ｂｒａｕｎ　（１９５，６
）　Ｃａｎｅ。

Ｒｅｓ、１６：５３−５６に述べられているように、転
化した茎断片を利用する方法を使って形質転換される。

茎は７％の商品化されているクロロソクスと８０％エタ
ノールで表面を殺菌され、殺菌した蒸留水ですすぎ、ｌ
ｃｎ＋切片に切り、ホルモンを欠いた寒天固体ＭＳ培地
（Ｔ、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｆ、ｓｋｏｏｇ　
（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ、１５　：４
１３−４９１　）を含むペトリ皿中に基底部におく。植
菌は、注射針で茎の切られた基底表面にさし、細菌を注
入することにより遂げられる。茎は２５℃で１日当り１
６時間明所で培養される。育ったカルス（ｃａｌｌｉ　
）は茎切片の上部表面から除かれ０．２■／ｍ７！のカ
ルベニシリンを含みホルモンを欠いた固体ＭＳ培地に置
かれ、１ケ月のうち、３回２時々、新しいＭＳ−カルへ
ニソリン培地に移され、培地に細胞が浮遊しているがど
うかを確かめるため、試験される。無菌組織は上述され
ているような培地条件（２５°Ｃ，１６ｈｒ、　：８ｈ
ｒ、明所：暗所）の下で補足のない固体ＭＳ培地で維持
される。

１０．２　形　転換された組腹９穐壇 クローンは、八、Ｂ１ｎｎ５　ａｎｄ　Ｆ、Ｍｅｉｎｓ
　（１９７９）Ｐｌａｎｔａ　１４５：　３６５−３６
９により述べられているように形質転換された無菌組織
から得られる。　カルス（ｃａｌｌｉ　）は、２．３日
間、２５℃で０．０２ｎｗ／６ナフタレン酢酸（ＮＡＡ
）のある液体ＭＳ中での培養によって細胞懸濁液に変え
られるが、ぞの間１３５ｒｐ…で振とうされ、５４３と
２１３μｍのステンレス製の網を通って濾過される。通
過した濾過液は濃縮され、０．５％の溶解された寒天、
２．０■／ｐＮＡＡ、０．３　喀／＃キネチンと０．４
　ｇ　／　ｊ！　Ｄｉｒｃ。

イーストエキスを含むＭＳ培地の５　ｍｌに約８×１０
’細胞／ｍｌの濃度でブレーティングされる。

約１鰭の直径に達したコロニーはメス先端で採集され、
２．０ｍｇ／６　ＮＡＡと０．３ｎｖ／／キネチンを含
む固体ＭＳ培地に置き、そして生育される。

その結果として生じたカルス（ｃａｌｌｉ　）は個々に
分裂し、そして形質転換された表現型を検査される。

１０．３　植物の再生 形質転換されたクローンは、０．３■／βキネチンを含
む固体ＭＳ培地に置かれ、実施例１０．１に述べられた
ように培養される。形成している芽は１／ｌＯ強度のＭ
Ｓ培地塩、０．４ｍｇ／ｊＨのサイアミンを含み、シュ
ークロースとホルモンを欠いており、７．０のｐｌ＋で
ある固体（１，０％寒天）培地にそれらを置くことによ
り、根づかせられる。根づかされた苗木（ｐｌａｎｔｌ
ｅｔ）は、培地中で生育され。

実施例９．２に述べられているように強＜　（ｈａｒｄ
ｅｒ）され、温室か庭園（ｆｉｅｌｄ　ｐｌｏｔ）のど
ちらかの中で土壌に移される。

１０．４　°１　されるベクター 実施例１０．１．１０．２と１０．３に述べられている
方法ハ機能するｔｍｒ遺伝子を欠いたＴ１に基づいたベ
クターに適当である。適当な欠失の構成は実施例６゜７
と８の中で述べられている。これらの方法も。

Ｒ４に基づいたベクターとともに使われた時、有効であ
る。実施例１０．１の中で転化した茎断片の感染に対し
て述べられている方法は、しばしばＴＩＰ形質転換植物
細胞系列の確立に役立つ。

実施例１１ フォセオリンは、　Ｐｌ＋ａｓｅｏｌｉｓ烈１ｇａｒｉ
ｓの豊富な貯蔵蛋白（全種子蛋白の約５０％）である。

機能するフォセオリン遺伝子のアルファルファ植物への
移入とフォセオリンメノセンジャーＲＮＡの貯蔵される
フォセオリンの翻訳は、それが貯蔵蛋白合成を葉材に、
家畜飼料として使われるべく導入するので重要な経済的
価値をもつ。アルファルファは、フォセオリン遺伝子の
移入と発現に対し１価値ある植物である。というのも、
それが家畜飼料としての受容体（ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ
）であり、それが速く育ち　＋７ゾビウムとの共生をと
おして窒素固定が可能であり、クラウンゴール感染に感
受性であり、そして一つの細胞かプロトプラストからア
ルファルファ植物への再生が可能“であるからである。

この例は発現しうるフォセオリン遺伝子の完全なアルフ
ァルファ植物への導入を教授する。

１１．１　シャトルベクターの１ｒ′ アルフアルフア植物は以後述べられるように。

遺伝学的に巧みに処理したアグロバクテリウムのプラス
ミドを含むクラウンゴール組織から再生される。初段階
で我々は２機能するフォセオリン遺伝子を組み換えたＬ
ｍｒ−と展−のＴ−ＤＮＡ変異体を含む”シャトルベク
ター”を構成する。

この構成は順番に下流に機能するネオマイシンボスホＩ
−ランスフェラーゼ（ＮＰＴ　ＩＩ）の構造遺伝子（カ
ナマイシン耐性）をもつツバリン合成酵素のプロモータ
ーと組み換えられる（ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ｂｙＭ、−Ｄ
、ＣＩ＋１ｌｔｏｎ、　ｅｔ　旦、（１８Ｊａｎｕａｒ
ｙ　１９８３　）１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ
　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ；Ｊ、Ｌ、Ｍａｒｘ　（１９８３
）Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３　）１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ
　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ。

参照）。このタイプ構成は、実施例１に説明されている
。

１１．２　アグロバクテリウムと！む■」既が□□□蔓
入 ”シャトルベクター”はそれから決まりの技術で（実施
例１４　）　ｐＴｉ１５９５５のようなＴｉプラスミド
を含むアグロバクテリウムのある株に形質転換される。

組み換えプラスミドを含むハタテリアは選択され、そし
て細胞壁を再生されているアルファルファとともに一緒
に培養される（Ｍａｒｔｏｎ　ｅｔａｌ、（１９７９）
　Ｎａｔｕｒｅ　２７７：　１２９−１３１；　Ｇ、Ｊ
、Ｗｕｌｌｅｍｓｅｔ　ａｌ、（１９８１）　Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７８：４３
４４−４３４８；　ａｎｄ　ＩＩ、［１，ＩＩｏｒｓｃ
ｂ　ａｎｄ　１１．Ｔ、Ｆｒａｌｅｙ　（１８Ｊａｎｕ
ａｒｙ　１９８３）　１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔ
ｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　）。

細胞は、培地で生育され、その結果として生じたカルス
組織はノーザンブロソティング（実施例１２）による特
定のｍ−ＲＮＡの存在やＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験による特定
の蛋白の存在を検査される（Ｊ、Ｌ。

Ｍａｒｘ　（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　２１氾８３
０；　Ｒ，Ｂ、）Ｉｏｒｓｃｈ　ａｎｄＲ，Ｔ、Ｆｒａ
ｌｅｙ　（１８Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３　）１５ｔｈ
　ＭｉａｍｉＷｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ参照）
。

１１．３　植物の再生 アルファルファ植物は、それからＡ、Ｖ、Ｐ、　Ｄｏｓ
ＳａｎＬｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）　Ｚ、　Ｐｆ
ｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏ＋。

９９：　２６１−２７０；　Ｔｊ、ＭｃＣｏｙ　ａｎｄ
　Ｅ、Ｔ、Ｂｉｎｇｈａｍ　（１９７７）Ｐｌａｎｔ　
Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔｅｒｓ　１０：　５９−６６；　ａｎ
ｄ　Ｘ、Ａ、Ｗａｌｋｅｒ旦　旦、（１９７９）　Ｐｌ
ａｎｔ　Ｓｃｉ、ＬｅｔＬｅｒｓ　１６：　２３−３０
により以前より使用されている方法に似た方法でカルス
組織から再生される。これらの再生された植物はそれか
ら新しい商業的多様性に対して基礎を形成している慣習
的な植物を生育する技術によって繁殖させられる。

去８ｍ（＋ｌＩ　１２ すべての実施例において、ＲＮＡが抽出され。

分画され９次の処理によって探知される。

１２、ｌＲＮＡ抽出 この処理はＳｉｌｆｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ封：　２７２５−２７３
１の修正したものであった。

ＣｓＣｌ遠心分離に対するＬｉＣＬ沈澱の代用はＭｕｒ
ｒａｙｅｔ　ａｌ、（１９８１）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｅｖｏ
ｌ、　１’７：　３１−４２により述べられていた。沈
澱するための２Ｍ尿素を加えた２Ｍ塩化リチウムの使用
はＲｈｏｄｅｓ　（１９７５）　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｍ、２虹８０８Ｂ−８０９７から引
用された。

組織はポリトロンかグラウンドガラスボモゲナイザーを
使って４％のバラーアミノサリシル酸。

１％トリーイソプロピルナフタレンスルボン酸。

１０ｍＭジチオスレイトール（新鮮に作られたもの）と
１０ｍＭ　Ｎａ−メタビザルファイト（新鮮に作られた
もの）を含む冷却した５０ｍＭ　トリス−塩ｆｆ１（ｐ
Ｈ８，０）の４−５倍量中で均質化された。オクタツー
ルは泡立ちを抑制するのに必要とされるものとして使わ
れる。１％の８−ヒドロキシキノリンを含むトリス飽和
されたフェノールの等■が均一化物に加えられ、それか
ら振とうされ、乳状にし、そして２００００−３０００
０ｇで４”ｃ、１５分間、遠心分離された。

水の上層はクロロホルム／オクタツール（２４：　１　
）で１度、抽出され２上のように遠心分離される。

濃縮された塩化リチウム−尿素溶液はそれから各々、２
Ｍの最終濃度になるように加えられ、その混合液は数時
間、２０°Ｃで放置された。そのＲＮ’Ａ沈澱物は、そ
れから遠心分離で落とされ、２Ｍ塩化リチウムにより、
ペレットを分散するため、洗われた。その沈澱物はそれ
から７０％エタノール−０，３Ｍ酢酸ナトリウムにより
洗われ、透明な溶液になるように充分な殺菌水に溶かさ
れた。エタノールをｚ（＠量刑えられ、そしてその混合
液は２時間水上に置かれ、その後、雑多な多＄７Ｍをと
り除くため遠心分離された。ＲＮＡ沈澱物はそれから再
生され、そして水か殺菌した塩を含まないポリ　（Ｕ）
緩衝液に再溶解された。

（以下余白） １２．２　ポリ　（Ｕ）／セファデックス　りロマトグ
ラフィー ２つのポリ　（Ｕ）セファデックス　（商標：Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ、　Ｉｎｃ、、Ｕｐｐｓａｌａ、　５ｉｖｅ
ｄｅｎ　）緩衝液を用いた。一つは無塩で２０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＯ５を含
んでいる。もう一つは一つ目の緩衝液に０．１Ｍの塩化
ナトリウムを加えたものである。Ａ４２６において、良
好な会合を起こすために。

２ｘ貯蔵緩衝液を作る必要がある。そして一部分に塩を
加えることが必要である。最終濃度に合わゼでから、緩
衝液をオートクレーブにかける。

ポリ　（Ｕ）セファデックスは、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより得た。

１００μｇの期待されるポリ　（Ａ）ＲＮＡについて１
ｇのポリ（Ｕ）セファデックスを用いた。ポリ　（Ｕ）
セファデックスを。

無塩のポリ−（Ｕ）緩衝液に水和し、ジャケットをつけ
たカラムに流し込む。温度を６０℃に上げ。

カラムを無塩緩衝液で２６０１−におけるベースライン
が平滑になるまで洗った。最終的には、カラムを塩を含
むポリ　（Ｕ）緩衝液で４０°Ｃで平衡化する。

濃度が５００μｇ／ｍｊ！以下のＲＮＡを無塩緩衝液中
で６５℃、５分間加熱した。その後、冷却し。

塩化ナトリウムを０．１Ｍの濃度になるように加えた。

それから光学濃度が安定なベースラインまで落ちるまで
、流速１　ｍ６／ｍｉｎ、以下で流したカラムにＲＮＡ
を移す。それから、カラム温度を６０℃まで上げ、ＲＮ
Ａを無塩ポリ　（Ｕ）緩衝液で溶出させた。ＲＮＡは普
通３倍のカラム容量で洗い出される。溶出したＲＮＡを
用いやずい容量まで２級ブタノールで濃縮し、　１０ｍ
Ｍになるように塩化ナトリウムを加えた後、２倍容量の
エタノールを加え沈澱させる。エタノール沈澱物を水に
溶かし。

Ｎ１１４−酢酸塩を０．１Ｍになるよう加える。そして
エタノールで再び沈澱させる。最終的にＲＮΔを殺菌水
に再溶解し、−７０℃において保存する。

用いる方法はＴｈｏｍａｓ（１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａＬ、＾ｃａｄ　。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：　５２０１およびｌｌｏｆｆ
ｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、　２５６：２５９７によるものである。

２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐｌ＋　６．８〜７．０）
を含む０．７５〜１．５％のアガロースゲルを固めた。

もし高分子の集合したバンドが現れたら、６％あるいは
２．２Ｍのボルトアルデヒド（３６％の貯蔵溶液を用い
る）を加えて、実験をやり直した。ホルムアルデヒドを
アガロースに６５℃まで冷やしてから加えた。ホルムア
ルデヒドを加えると臭化エチヂウムにより発見が困難に
なる。泳動緩衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐｎ　
６．８〜７．０）である。

電気泳動に先だち、ＲＮＡを最終濃度６％ホルムアルデ
ヒド、５０％ホルムアルデヒド、　２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液および５ｍＭ　ＥＤＴＡの変性緩衝液で処
理した。ＲＮＡを緩衝液中６０℃で１０〜２０分間保温
した。保温は、停止緩衝液の添加に停止した。２０μｌ
のサンプルについて、４μ／　５０％グリセロール、　
１０ｍＭ　ＪＥＤＴ＾、５ｍＭリン酸ナトリウムそして
ブロムフェノールブルーを加えた。

浸水した電気泳動を用いる。ゲルを浸す前に。

ＲＮＡをロードした。そして１２５ｍＡで５分間ゲルの
中に入れた。

それからゲルを水に浸し、電流を３０ｍへ（夜通し）あ
るいは５０ｍＡ（６〜８時間）に下げる。緩衝液を循環
させ、低温室で電気泳動を行った。

１２．４　”ノーザン”プロ・）ト もし、特異的なＲＮＡを発見するためにプロットするゲ
ルならば、染色しなかった。しかし分離したマーカーの
レーンは染色に用いた。　染色は０、１Ｍ酢酸ナトリウ
ム中、５μｇ／　ｍｊ！臭化ブロマイドで行い１脱染は
０．１Ｍ酢酸ナトリウム中、数時間行った。染色の前に
、５〜１０分間、　６０〜７０℃の水で処理すると視認
が容易になった。

プロットするゲルを１５分間、１０ｘ標準サリンクエン
酸（ＳＳＣ）　−３％ホルムアルデヒドに浸した。

もし、大きなＲＮＡ分子がゲルから溶出しなければ、そ
のときは処理の前にＲＮＡに切れ目をいれるために５０
ｍＭ水酸化ナトリウム中、　１０〜３０分間処理した。

もし、基礎処理を用いたのなら、プロットする前にゲル
を中和し、　５ＳＣ−ホルムアルデヒドに浸すべきであ
る。　ＲＮ、Ａのニトロセルロースへの転移は標準方向
により行った。

プレハイブリダイゼーションを４２℃で最低４時間、５
０％ホルムアルデヒド、　１０％硫酸デキストラン、５
ｘ　ＳＳＣ，５ｘデンハート、　１００　ｐ　ｇ／　ｍ
ｅ変性キャリヤーＤＮＡ、２０＃ｇ／　ｍｊ！ポリ　（
Ａ）。

４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８〜７．０　）　
、　０．２％ＳＯ３中で行った。ハイブリダイゼーショ
ンをプローブを同じ緩衝液に加え、−晩保温して行った
。

プローブはだいたい、５　ＸＩＯ５ｃｐｍ／　ｍｌ１以
上の濃度で用いた。

ハイブリダイゼーション後、ニトロセルロースを、４２
℃で２　ｘ　ＳＳＣ，２５ｍＭリン酸ナトリウム。

５ｍＭＥＤＴ八、２ｍＭ八日２ン酸ナトリウム溶液を用
いて何度も洗った。最後に、６４℃で２０分間、１ｘｓ
ＳＣで洗った。

もし、オートラジオグラフィーに際して、フィルターが
乾燥していなくてまた。プローブが１ｍＭＥＤＴ＾によ
り６４℃で広範囲に洗ったことで除かれているのなら、
最上の結果が得られた。

実施例１３ ”ウェスタン”プロット（ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気電気移動後原を発見するために行う）は５本質的
にはＲ，Ｐ、Ｌｅｇｏｃｋｉ　ａｎｄ　Ｄ、Ｐ、Ｓ、Ｖ
ｅｒｍａ（１９８１）＾ｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
旦旦３８５−３９２に示されているのと同様に行った。

マイクロ−Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉ
ｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂａｎｔ　ａｓｓａｙ
　）を９６個のウェル（ｗｅｌｌ）をもつＩｍｍｕｌｏ
ｎ−２型プレートを用いて次に示すステップにより行っ
た。

■３．１　プレー１−への抗体の結合 −日月、ウェルをコーティング緩緩を段で１：１０００
に希釈した抗体（ウサギ抗ファセオリンＩｇＧ）でコー
ト　（ｃｏａｔ）　シた。２００μｎ／ｗｅｌｌで３７
℃で２〜４時間、保温した。プレートをサランラップで
おおった。それから、プレートをリン酸緩衝液すリンー
ツイーン（ＰＢＳ−Ｔｉｙｅｅｎ　）で３回洗った。各
々の洗いのステップは５分間あけた。それから。

１％のボバインセーラムアルブミン（ＢＳ＾）を洗いの
ために加え、２０分間放置してから、捨てた。

洗いはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて５回以上３行った。

組織を小片に切ってからポリ１−ロンにより、１ｇｌ１
１の組織／ｍβリン酸緩衝液サリす−ツイーンー２％ポ
リビニル、ピロリドン−４０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２
％ＰＶＰ−４０＞の条件でホモジェナイズした。すべて
のサンプルは破砕の前後およびファセオリン標準曲線の
作成の前後は水中で保存した。組織のボモジェネートで
標準曲線を作成した。そして２組織に依存するファセオ
リンの回収をチェックするために緩衝液で標準曲線を作
った。ホモジェナイズしたサンプルを遠心分離した後、
各々のサンプルのうち１００μｌをウェルに入れ、４℃
で一晩。

放置した。失敗を避けるために各々のサンプルについて
２個、同じことをした。保温中、プレートはシールした
。

１３．３　酵素の結合 一晩、保温後、抗原を捨てウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
で５回洗う１各々の洗いの間に５分間の間隔を置いた。

結合物（ウサギ抗ファセオリンＩｇＧ　アルカリフォス
ファターゼ結合）をＴ’ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２％ｐｖｐ
（０，２％ＢＳＡを含ム）テ１：３０００ニ希釈し、１
５゜μｌを各ウェルに加えた。そして３７℃で３〜６時
間、保温した。保温後、結合物を捨て、ウェルをＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎで５回洗う、各々切洗いの間に５分間の間
隔を置く。

１３．４　分析 分析を始める直前に、ｐ−ニトロフェニルフォスフエイ
トの５■の錠剤（Ｓｉ’ｇｍａより得た。そして暗所で
凍結保存）を、１０ｍｎの基質に加え１錠剤が溶解する
まで攪拌する。２００μｌの室？Ａ溶液をずばやく各ウ
ェルに加える。反応を種々の時間（たとえばｔ　＝０．
１０．２０．４０．６０．９０．１２０分）において、
　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏ−ＥＬＩＳＡ　ｒｅａ
ｄｅｒを用いて測定した。

ｐ−ニトロフェニルフォスフエイト（無色）がアルカリ
フォスファターゼにより無機リン酸とｐ−二トロフェノ
ールに加水分解されるとｐ−二トロフェノールが溶液に
黄色を与えた。それは４１０ｎｍにおけるスペクトロメ
トリカリ−に読むことができた。検出できる最小量は０
．１ｎｇより小であった。

実施例１４ 三組交雑は、一般的に次に示すように行われた。

専門家に知られた他の変法も用いることができる。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ２Ｏ２（ｐＲＫ２９０に基礎をおく
シャトルベクター）を」０匹旦（ｐｌ？に２０１３　）
およびストレプトマイシンに耐性なアグロバクテリウム
・チューメファシエンス株と交雑した。ｐＲＫ２０１３
は、シャトルベクターをもつ株に移り、アグロバクテリ
ウムへ移入するためのシャトルベクターを作った。

ストレプトマイシンおよびシャトルベクターが耐性であ
る薬剤（だいたい、カナマイシンか、クロラムフェニコ
ール）の両方を含む培地で成育するものの中からシャト
ルベクター配列を有するアグロバクテリウムの細胞を選
択した。これらの細胞トＥ、　ｃｏｌｉ　（ｐＰＩＩ　
ＩＪＩ　）との交雑によりアグロバクテリウム細胞にｐ
ＰＩＩ　ＩＪＩが移った。ｐｉｌｌ　ＩＪＩ　とｐＲＫ
２９０に基礎を置くシャトルベクターは同一細胞内に長
時間、共在することができない。ゲンタマイシン（ｐＰ
ＩＩ　ＩＪＩが耐性遺伝子をもつ）を含む培地で成育さ
せれば、　ｐＲＫ２９０配列の欠落した細胞を選択する
ことができた。ストレプトマイシンおよびゲンタマイシ
ンおよびカナマイシンあるいはクロラムフェニコールに
耐性な細胞のみがシャトルベクターと二重相同部位組み
換えをおこしたＴ１プラスミドを持ら、望みの構成をも
っている。

（以下余白） 明；Ｆｌｌｌ　１！シの浄、１）（内容に変更なし）表
２

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例１１．１２および１４のプラス
ミドを比較した説明図、第２図はｐＴｉ１５９５５の１
′−ＤＮＡ領域を示す説明図、第３図はｐ３９５とｐ３
７６の作成を示す説明図、第４図はｐ４９９／６／７の
構造を示す説明図、第５図ばｐ４９９／６／８の構造を
示す説明図、第６図はｐ４９６−２の構造を示す説明図
、第７図はｐ４９６−１の構造を示す説明図、第８図は
各プラスミドの構造を示す説明図、第９図はｐＫＳ−ｎ
ｏｐ■の構造を示す説明図、第１Ｏ図はｐＲＫ２９０の
構造を示す説明図、第１１図はｐＫＳ−ＫＢ３．８の構
造を示す説明図、第１２図はｐＢＲ３２２の構造を示す
説明図、第１３図はｐ３．８の構造を示す説明図、第１
４図はファセオリン遺伝子の構造を示す説明図、第１５
図はＡＧ−ｐＰν薊２（ｐ７．２）の構造を示す説明図
、第１６図はｐＫＳ−４の構造を示す説明図、第１７図
はｐＫＳＩＩＫＢの構造を示す説明図、第１８図はｐ３
．８−ｃＤＮＡの作成と構造を示す説明図、第１９図は
ｐＫＳ−５の作成を示す説明図、第２０図はｐＭＳ−ｏ
ｃｔ、ｃａｍ　２０３の作成を示す説明図、第２１図は
ｐＫＳ−ｏｃＬ、ｄｅｌ　ＩＩの構造を示す説明図、第
２２図はｐＫＳ−ｏｃｔ、ｄｅｌ　Ｔの構造を示す説明
図、第２３図ｐ２ｆの作成方法を示す説明図、第２４図
はｐ３ｅの作成方法を示す説明図、第２５図はｐＫＳ−
ｏｃｔ、ｄｅｌ　ｍの作成方法を示゛す説明図、第２６
図はｐＭＳ−６の作成方法を示す説明図、第２７図はｐ
２の作成方法を示す説明図、第２８図はｐＭＳ−ｏｃｔ
、ｄｅｌｌｌｌａの作成方法を示す説明図、第２９図は
ｐ２０３の１ｌｐａ　１部位のＢｇｌ　１１部位への変
換方法を示す説明図、第３０図はｐＭＳ−ｏｃｔ、　ｔ
ｍｒの構造を示す説明図。 第３１図はｐ２０３の構造を示す説明図である。 以」二 代理人　弁理士　山本秀策 競＝＝〜へへ寸 Ｂａｍ　ＨＩ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　７ エ　− の　Ω　δ　亡 ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　１０ ＦＩＧ、１ｌ ｐＢＲ３２２ ＦＩＯ，１２ ＦＩＧ　１３ ＦＩＧ、　２１ ＦＩＧ、　２２ ヒ　工 工目 第１頁の続き ［相］Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号＠発
明者　シェリー　エル、スラ　アメリカ合衆■イトム　
タナ　ドライブ ＠発明者　デニス　ダブリュ、サ　アメリカ合衆巨ット
ン　ランド、アル△ １　ライスコンシン　５３７１４　マジソン、し０１０ Ｉ　ライスコンシン　５３５５８　マツクファー；ン　
アベニュー　５６１１ 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 植物遺伝子の発現 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国　コｉ」ラド　８０３０１−２２
４４ボールダー、ミソチェル　レーン　３３７５名称　
アグリジエネテイクス　リリーチコーポレーション 代表者　ゾール　ジェイ、ハンセン 国籍　アメリカ合衆国 ４、代理人　〒５３０ 住所　大阪ＴＯｆ大阪市北区西天満４丁目３番１７月５
、補正命令の日イ」（発送１」）昭和５９年７月３１日
６、補正により増加する発明の数−〇 の対象 −の出願人の４１ｉ１ （２）委任状 （３）明細書の発明の詳細な説明の憫 ８、補正の内容 ＋ｌ）願占および委任状Ｑこついては別＆ＩＣのとおり
（２）明細書第１０２頁から１Ｏｃｉ頁の表１および１
０７頁の表２の浄書・別紙のとおり　（内容に変更なし
）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物のプロモーターと植物の構造遺伝子とを含む植
   物遺伝子の挿入されたＴ−ＤＮＡを有し。 該プロモーターは植物の構造遺伝子の５゛末端に隣接し
   、そして、該植物の構造遺伝子は植物のプロモーターか
   ら転写方向に下流に存在するＤＮＡシャトルベクター。 ２、前記挿入された植物の構造遺伝子がイントロンを含
   む特許請求の範囲第１項に記載のベクタ０ ３、前記植物遺伝子はＴ−ＤＮＡのｔｍｌ遺伝子内のあ
   る部位において挿入される特許請求の範囲第１項に記載
   のベクター。 ４、前記植物のプロモーターと前記植物の遺伝子は異な
   る遺伝子に由来し、そして機能する混成植物遺伝子を形
   成するために結合された特許請求の範囲第１項に記載の
   ベクター。 ５、前記植物の構造遺伝子はｃ、ＤＮＡを含有する特許
   請求の範囲第１項に記載のベクター。 ６、前記Ｔ−ＤＮＡは修正されており、その修正はｔｍ
   ｓかｔｍｒ中の変異を含む特許請求の範囲第１項に記載
   のベクター。 ７、植物のプロモーターと植物の構造遺伝子とを含む植
   物遺伝子の挿入されたＴ−ＤＮＡを有し。 該プロモーターは植物の構造遺伝子の５°末端に隣接し
   、そして、該植物の構造遺伝子は植物のプロモーターか
   ら転写方向に下流に存在するＤＮＡシャトルベクターを
   含みかつ複製する細菌株。 ８、前記挿入された植物の構造遺伝子がイントロンを含
   む特許請求の範囲第７項に記載の細菌株。 ９、前記植物遺伝子はＴ−ＤＮＡの田し遺伝子内のある
   部位において挿入される特許請求の範囲第７項に記載の
   細菌株。 １０、前記植物のプロモーターと前記植物の遺伝子は異
   なる遺伝子に由来し、そして機能する混成植物遺伝子を
   形成するために結合された特許請求の範囲第７項に記載
   の細菌株。 １１、前記植物の構造遺伝子はｃＤＮＡを含有する特許
   請求の範囲第７項に記載の細菌株。 １２、前記Ｔ−ＤＮＡは修正されており、その修正は田
   とかｔｍｒ中の変異を含む特許請求の範囲第７項に記載
   の細菌株。 １３、アグロバクテリウム・チューメファシエンスもし
   くはアグロバクテリウム・リゾゲネスを含む特許請求の
   範囲第７項に記載の細菌株。 １４、前記ＤＮＡヘクターがグループ　ｐ５２９−２゜
   ｐ５２９−８．　ｐ５３９−５．　ｐ５３９−９．　ｐ
   Ｃ５Ｂ−ｎｏｐ−ＫＢ１３もしくはｐＣ５Ｂ−ｎｏｐ−
   ＫＢｌ１５から選択される特許請求の範囲第７項に記載
   の細菌株。 １５、１ａｌ植物プロモーターと植物の構造遺伝子とを
   有する植物の遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入する工程、それ
   によってＴ−ＤＮＡと植物の遺伝子との結合を形成し、
   該植物のプロモーターは該植物の構造遺伝子の５゛末端
   に隣接し、そして、その植物の構造遺伝子は植物のプロ
   モーターから転写方向に下流にある；そして。 （ｂｌ　Ｔ　−Ｄ　Ｎへ／植物遺伝子結合物を植物細胞
   に移入する工程 を包含する植物細胞壁を遺伝学的に修飾する方法。 １６、前記工程（ｂｌの実行後に、さらに、（Ｃ）前記
   Ｔ−ＤＮＡ／植物遺伝子結合物を含んだ植物細胞中での
   一前記植物の構造遺伝子の発現を検知する工程を包含す
   る特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７、前記構造遺伝子は１つかそれ以上のイントロンを
   有する特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 １８、前記植物の遺伝子は種子貯蔵蛋白をコードしてい
   る特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 １９、前記植物の遺伝子はファセオリンをコートしてい
   る特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２０、前記Ｔ−ＤＮＡ／植物遺伝子の結合物はシャトル
   ベクターの部分として前記工程（ｂｌに先立って維持さ
   れ、そして複製される特許請求の範囲第１５項に記載の
   方法。 ２１、前記植物の遺伝子は田しか”１．６”領域中のオ
   クトビン型Ｔ−ＤＮＡ中に挿入される特許請求の範囲第
   １５項に記載の方法。 ２２、前記細胞はディコチレドナウス植物由来である特
   許請求の範囲第１５項に記載の方法。 ２３、前記ディコチレドナウス植物はコンボジテかレグ
   ミノセの−員である特許請求の範囲第２２項に記載の方
   法。 ２４、　（ａｌ植物ブロモ−クーと植物の構造遺伝子と
   を有する植物の遺伝子を１’　−Ｄ　Ｎ　Ａに挿入する
   工程、それによってＴ−ＤＮＡと植物の遺伝子との結合
   を形成し、該植物のプロモーターは該植物の構造遺伝子
   の５゛末端に隣接し、そして、その植物の構造遺伝子は
   植物のプロモーターから転写方向に下流にある；そして
   、（ｂ）Ｔ−ＤＮ八へ植物遺伝子結合物を植物細胞に移
   入する工程 を包含する植物細胞壁を遺伝学的に修飾する方法により
   作られる植物、植物組織または植物細胞。 ２５、前記工程（ｂｌの実行後に、さらに、（Ｃ）前記
   Ｔ−ＤＮＡ／植物遺伝子結合物を含んだ植物細胞中での
   前記植物の構造遺伝子の発現を検知する工程を包含する
   特許請求の範囲第２４項に記載の植物。 植物組織または植物細胞。 ２６、前記構造遺伝子は１つかそれ以上のイントロンを
   有する特許請求の範囲第２４項に記載の植物。 植物組織または植物細胞。 ２７、前記植物の遺伝子は種子貯蔵蛋白をコードしてい
   る特許請求の範囲第２４項に記載の植物、植物組織また
   は植物細胞。 ２８、前記植物の遺伝子はファセオリンをコードしてい
   る特許請求の範囲第２４項に記載の植物、植物組織また
   は植物細胞。 ２９、前記’Ｉ”　−Ｄ　Ｎ　Ａ　／植物遺伝子の結合
   物はシャトルベクターの部分として前記工程ｆｂｌに先
   立って維持され、そして複製される特許請求の範囲第２
   ４項に記載の植物、植物組織または植物細胞。 ３０、前記植物の遺伝子はＬｍｌか”１．（ｉ”領域中
   のオクトピン型Ｔ−ＤＮＡ中に挿入される特許請求の範
   囲第２４項に記載の植物、植物組織または植物細胞。 ３１、前記細胞はディコチレドナウス植物由来である特
   許請求の範囲第２４項に記載の植物、植物組織または植
   物細胞。 ３２、前記ディコチレドナウス植物はコンポジテかレグ
   ミノセの一員である特許請求の範囲第３１項に記載の植
   物、植物組繊または植物細胞。 （以下余白）