PT78414B - Method for genetically modifying a plant cell - Google Patents

Description

Descrição detalhada do invento

São dadas as definições que se ! ! seguem para tirar ambiguidade ao intento ou objectivo da

sua utilização nas especificações e reivindicações.

T-DNA; Um segmento de DNA derivado do principio indutor de transformação (TIP) que é integrado no genoma de plantas. Tal como aqui é usado o termo inclui DNA originalmente derivado de qualquer estirpe de Agrobacterium indutora de tumores incluindo A. tumefaciens. e A. rhizogenes este último por vezes referido em trabalhos anteriores como R-DNA. Em adição, como aqui é usado o termo T-DNA inclui quaisquer alterações, modificações, mutações, inserções, edeleções naturais ou introduzidas por

-24-

técnicas laboratoriais, sendo o único requesito estrutural que estejam presentes quantidades suficientes das ex¹ tremidades direita e esquerda dos T-DNAs naturais de modo i a assegurar a função esperada de integração estável que

é característica de todo o T-DNA.

!

i gene vegetal; Como aqui é usado inclui elemen

, tos estruturais e reguladores de um gene vegetal sendo os i referidos elementos exógenos relativamente aos genes do ! próprio T-DNA. Como aqui é usado, um gene vegetal é aque^ f le em que o promotor (uma região do gene que permite e pode

regular a iniciação da transcrição e a iniciação da tradução) e o gene estrutural (a região que codifica uma protei na e que pode ou não conter um ou mais intrões) são intro- j

j duzidos no T-DNA obtido a partir de uma fonte vegetal. |

0 gene vegetal pode também incluir uma região 3’ não tra- j

l|

j: duzida que pode funcionar de modo a regular a terminação da

i, transcrição a processamento pós-transcrição do RNA.

Os elementos promotor e gene es trutural podem derivar dos mesmos genes pré-existentes ou de genes diferentes e podem derivar da mesma planta ou de plantas diferentes. Por exemplo, um gene vegetal poderá ser, como aqui é exemplificado, um gene vegetal com o seu próprio promator ou poderá ser uma contrução in vitro con ! tendo a região codificadora (com ou sem intrões) de um gene e o promotor de um outro derivado da mesma ou de diferentes espécies de plantas. A região codificadora de um gene vegetal, como aqui se define, pode incluir uma có- I pia de cDNA da porção estrutural de um gene vegetal. 0 promotor e regiões codificadoras podem também incluir segmentos obtidos por sintese quimica. 0 segmento codificador pode si próprio só ser uma composição de segmentos derivados de uma série de fontes, naturais ou sintéticas codificando uma proteína composta.

-25-

Tecido vegetal: inclui tecidos diferenciados ou não diferenciados de derivados de plantas superiores incluindo raízes, rebentos, pólen, sementes, tecido tumoral, tal como galhas em coroa e várias formas de agregados de cé} lulas vegetais em cultura, tais como embriões e calos.

!

célula vegetal: Como aqui é usado inclui células vegetais

i

I, in planta e células e protoplastos vegetais em cultura. j

i

' A produção de uma planta modifi

cada geneticamente expressando um gene vegetal introduzido via T-LNA combina os ensinamentos específicos da presente divulgação com uma variedade de técnicas e recursos conhe

¹ eidos na especialidade. Na maior parte dos casos, exis- |

I j

( tem recursos alternativos para cada fase do processo glo- j bal. A escolha dos recursos depende de variáveis tais como

r a escolha do TIP básico, espécie de planta a ser modificar'

da e da estratégia de regeneração desejada, todas elas apresentam passos com processos alternativos que os familiarizados com a matéria sabem seleccionar e usar para

il

conseguir um resultado desejado. Os aspectos fundamentais, do invento são a natureza e estrutura do gene vegetal e o

I seu método de inserção no T-DNA. Os restantes passos para • obter uma planta modificada geneticamente incluem transfej rência do T-DNÀ modificado para uma célula vegetal em que

o T-DNA modificado fique estavelmente integrado como parte

| do genoma da célula vegetal, técnicas para cultura in vij tro e evntual regeneração para plantas inteiras, o que j pode incluir passos de seleccão e detecção de cálulas

vegetais transformadas e passos de transferência do gene introduzido da estirpe originalmente transformada para cultivares comercialmente aceitáveis.

Uma característica fundamental do presente invento é a construção de T-DNA tendo inserido um gene vegetal, como definido supra. A localização

do local de inserção do gene vegetal não é critico desde

, que a função de transferência das sequências imediatamen te adjacentes às extremidades do T-DNA não sejam afectadas, uma vez que estas regiões parecem, segundo traba, lhos efectuados, ser essenciais para a inserção do T-DNA ; modificado no genoma da planta. Os locais de inserção

preferidos são aqueles que se situam em zonas que são

• mais activamente transcritas, em particular o gene tml e uma zona designada por "1,6" situada no fragmento Hind

! ΙΙΙ-f e estendendo-se até à região 13 do mapa, como se

μ

j; mostra na Fig. 2. Nenhum fenótipo foi ainda associado

i

i a este último produto de transcrição. 0 termo "1,6" é aqui usado para designar esta região do T-DNA activamente transcrita. 0 T-DNA é obtido de qualquer um dos pias.

! mídeos ΤΣΡ. 0 gene vegetal é inserido por técnicas

"Standard" bem conhecidas dos familiarizados com a matér ria. A orientação do gene vegetal inserido, em relação à direcção de transcrição e tradução dos genes endógenos

, do T-DNA não é crítica, qualquer uma das duas orientações I possíveis é funcional. Pode-se observar diferenças nas ! taxas de expressão quando um dado gene é inserido em dife

rentes locais dentro do T-DNA, possivelmente devido a fac. tores tais como a estrutura da cromatina. Foram obtidos níveis de expressão do gene da faseolina fácilmente deteç.

m táveis quando o gene foi inserido no local Sma I dentro do gene tml de pTi 159, um plasmídeo de A. Tumefaciens

í do tipo octopina.

i

i

! Um meio conveniente para inserção

de um gene vegetal no T-DNA envolve a utilização de vectoi res "vai-vem", como descrito supra, tendo um segmento de T-DNA (segmento esse em que se quer a inserção) incorporado num plasmídeo capaz de se replicar em E. coli. 0 segmento de T-DNA contem um local de restrição, de preferência em que seja único para o vector "vai-vem". 0 gene vegetal pode ser inserido neste local único no segmento

I

de T-DNA e o vector "vai-vem" ser transferido para células da estirpe de Agrobacterium apropriada, de preferência uma cujo T-DNA seja homologo do segmento de T-DNA do vector j "vai-vem". A estirpe de Agrobacterium transformada é crescida em condições que permitem a seleccão de um caso de recombinação homóloga dupla que resulta na substituição de um segmento pré-existente do plasmídeo Ti por um ! segmento de T-DNA do vector vai-vem.

Seguindo a estratégia acaba de descrever, o T-DNA modificado pode ser transferido para J células vegetais por qualquer técnica conhecida na especialidade. Por exemplo, esta transferência é mais convenientemente conseguida por infecção directa das plantas com a nova estirpe de Agrobacterium contendo um gene vegetal incorporado no seu T-DNA ou por co-cultura da i estirpe de Agrobacterium com células vegetais. A primeira técnica, infacção directa, resulta a seu tempo no apare cimento de uma massa tumoral ou galha em coroa no local da infecção. As células de galha em coroa podem ser subsequentemente crescidas em cultura e em circunstância apropriadas conhecidas dos familiarizados com a matéria, rege | neradas para plantas inteiras que contém o segmento de ι

T-DNA inserido. Usando o método de co-cultura, uma cerI

ta proporção de células vegetais são transformadas, ou seja têm T-DNA transferido e inserido no genoma da célula vegetal. Em ambos os casos; as células transformadas devem ser seleccionadas ou testadas para as distinguir das células não transformadas. A selecção é facilmente conseguida tendo uma marca seleccionável incorporada no T-DNA além do gene vegetal. Exemplos incluem a di-hidro folato reductase ou a neomicina fosfotransferase expressas sob o controle de um promotor da nopalina sintetase. Estas marcas são seleccionadas através do crescimento em meio contendo metotrexato ou canarmicina, respectivamente, ou os seus análogos. Em adição, o T-DNA tem mar

cas endógenas tais como o gene ou genes que controlam o crescimento independente de hormonas dos tumores induzidos por Ti em cultura, o gene ou genes que controlam a morfolo. gia anormal das raizes tumorais induzidas por Si e genes que controlam a resistência a compostos tóxicos tais como análogos de aminoácidos, sendo essa resistência dada por uma opina sintetase. Os métodos de rastreio bem conhecidos dos familiarizados com a matéria incluem ensaios para a produção de opinas, hibridação especifica com sequências de RNA ou de T-DNA caracteristicas ou ensaios imunológicos para proteínas especificas, incluindo ELISA (sigla para

"enzyme linked immunosorbent assay"), testes radioimunes e transferências "western¹’.

Uma alternativa para a estratégia dos vectores, vai-vem envolve a utilização de plasmídeos^ compreendendo T-DNA ou T-DNA modificado, no qual é inserido um gene vegetal, sendo os referidos plasmídeos capazes de replicação independente numa estirpe de Agrobacterium . Resultados recentos indicam que o T-DNA de tais plasmídeos pode ser transferido de uma estirpe de Agrobacterium para uma célula vegetal desde que a estirpe de Agrobacterium contenha certos genes actuando em trans cuja função é promover a transferência de T-DNA para uma célula vegetal.

Os plasmídeos que contêm T-DNA e são capazes de se repli- i car independentemente numa estirpe de Agrobacterium são aqui designados por plasmídeos "sub-TLP". Ê possivel um espectro de variações em que os plasmídeos "sub-TLP" diferem na quantidade de T-DNA que contêm. Um dos extremos do espectro retem todo o T-DNA do plasmideo TIP e é por vezes designado um plasmideo "mini-TIP". No entanto outro extremo do espectro todo o DNA com excepção da quantidade mínima que rodeia as extremidades do T-DNA está removido sendo as porções restantes o mínimo necessário para se poder sar a transferência e integração na célula hospedeira. Tais plasmídeos são designados "mioro-TLP". Os pias-29-S")

mídeos sub-TIP são vantajosos por serem pequenos e relativamente fáceis de manipular directamente. Após o gene de- j

! sejado ter sido inserido, eles podem facilmente ser introduzido directamente numa célula vegetal contendo os genes

I

que actuam em trans que promovem a transferência de T-DNA. i A introdução numa estirpe de Agrobacterium é conseguida ·: convenientemente por transformação da estirpe de Agrobacterj ' ium_ ou por transferência conjugativa a partir de uma céluj la bacteriana dadora por técnicas bem conhecidas na especia

! 1idade. í

!

A regeneração é conseguida recor rendo a técnicas conhecidas. Um objectivo do passo de rege

¹ neração é a obtenção de uma planta inteira que cresce e se i! reproduz normalmente mas que retem o T-DNA integrado. As

técnicas de regeneração variam de acordo com princípios ji conhecidos na especialidade, dependendo da origem do T-DNA,

da natureza de quaisquer modificações nele efectuadas e das espécies de plantas transformadas. As células vegetais transformadas por um T-DNA do tipo Ri são facilmente regeneradas, usando técnicas bem conhecidas dos familiarizados com a matéria, sem experimentação excessiva. As células vegetais transformadas por T-DNA do tipo Ti podem ser regeneradas, nalguns casos, por manipulação apropriada dos

!i níveis de hormonas na cultura. De preferência, no entanJi to o tecido transformado com Ti é mais facilmente regenerato]

se o T-DNA foi mutado em um ou em ambos os genes Tmr e Tms.

A inactivação destes genes restitui o equilibrio hormonal I normal no tecido transformado e aumenta substancialmente

a facilidade de manipulação dos níveis hormonais dos tecidos em cultura, levando a uma planta com uma fisiologia hormonal mais normal que é facilmente regenerada. Nalguns casos as células tumorais são capazes de regenerar rebentos que possuem T-DNA integrado e que expressam genes do T-DNA, tais como nopalina sintetase, juntamente com um gene vegetal inserido. Os rebentos podem ser mantidos

-30-

vegetativameute por enxertia em plantas enraizadas e podem originar flores férteis. Os rebentos servem assim como material vegetal parental para plantas filhas normais T-DNA e expressando o gene vegetal nele inserido.

! 0 genótipo do tecido vegetal

transformado é muitas vezes escolhido pela facilidade com

l·

j, que as suas células podem crescer e regenerar em cultura in vitro. Se um cultivar de interesse agronómico for inaí dequado a estas manipulações transforma-se em primeiro lugar uma variedade mais apropriada. Após regeneração, o

j gene vegetal estranho recentemente introduzido é facilmen te transferido para o cultivar agronómico desejado por ί técnicas bem conhecidas dos especializados em m&tréria

! de cruzamento de plantas e genética de plantas. Cruzamentos sexuados de plantas transformadas com os cultivares

!'

( agronómicos dão um híbrido inicial. Estes híbridos podem antão ser retrocruzados com plantas com a base genética

!. desejada. A progénie é testada continuamente e seleccionada relativamente à presença contínua do T-DNA integrado ou relativamente ao novo fenótipo resultante da expressão do gene vegetal inserido. Deste modo, podem ser produzidas plantas tendo um genótipo essencialmente idêntico aos j

pais agronomicamente desejados com a adição de um gene ve- ί

j! getal inserido após uma série de ciclos de netrocruzamento ι selecção.

Exemplos

Os Exemplos seguintes utilizam muitas técnicas bem conhecidas e acessíveis aos familiarizados com biologia molecular e manipulação de ΤΣΡβ e Agrobacterium; tais métodos nem sempre são descritos detalhadamente· As enzimas são obtidas de fontes eomer-

ciais e são usadas de acordo com as recomendações do vende, dor ou seguindo variações conhecidas na especialidade. Reagentes, tampões e condições de cultura são também do co. nhecimento dos entendidos na matéria. Trabalhos de referên cia contendo tais técnicas "Standard" incluem os seguintes: R. Wu, ed. (1979) Meth. Enzymol. 68; J. H. Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics; R. Davis et al. (1980) Advanced Bacteriol Genetics; e R.F. Scheif e P.C. Vnesink j (1982) Praticai Methods in Molecular Bology.

!

í

Com excepção do plasmídeo Ilc, plasmídeos e apenas plasmídeos são precedidos de um "p", e.g., p. 3.8 ou pKS4. Células contendo plasmídeos são indi cadas através da identificação da célula e indicação paren- j térica do plasmídeo e.g., A. tumefaciens (pTi 159) ou K802 j (pKS4-KB) A Tabela 1 constitui um índice útil para identificação de plasmídeos e as suas inter-relações. A Tabela 2 apresenta um índice das estirpes depositadas. A Fig. 1 fornece uma comparação útil das construções descritas nos Exemplos 5»6 e 8.

Exemplo 1

A finalidade deste exemplo é ensinar a expressão de um gene eucariótico de DNA não T sob o controle do seu próprio promotor·

1.1 Preparação de derivados especiais de plasmídeos

Removeu-se um local de restrição do plasmídeo pBR322 por digestão com Eind III preenchendo as extremidades coesivas de cadeia simples com a DNA polimerase I, ligação de extremidades cerses, transformação em JE802, selecção da resistência à tetraciclina isolamento do plasmídeo a partir dos clones resistentes

--Jt 4Ί

ρηπτιτ,υ

-32à droga e caracterização com enzimas de restrição para confirmar a eliminação do local de restrição adequado.

0 plasmídeo foi designado ρ35θ (pBE322-Hind III).

1.2 Preparação de vectores "vai-vem"

p2O3 foi digerido com BamHI e o fragmento de T-DNA Baml7 (ver Fig. 2) foi isolado por electroforese em gel de agarose seguido de eluição do gel. Este fragmento foi misturado com e ligado a ρ35θ linearizado com BamHI e a reacção foi usada para transformar K802 . 0 plasmídeo isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina foi caracterizado por mapas de restrição com Smal e ligado através de extremidades cerses a adaptadores HindIII. Ápés as extremidades coesivas HindIII serem postas a descoberto por corte com HindIII e o plasmídeo linearizado tomado circular por ligação a si próprio, o plasmídeo foi usado para transformar E8O2. 0 plasmídeo isolado dos transfonaantes resistentes à ampicilina foi caracterizado por mapas de restrição e um plasmídeo tendo a estrutura apresentada na Fig. 3 foi designado p395, ρ37θ, a ser discutido mais sbaixo, foi também isolado neste ponto (Fig. 3) p395 foi digerido com BamHI e o fragmento de T-DNA Baml7» que tinha o seu local Smal convertido num local HindIII. foi isolado por electroforese ea gel de agarose seguido de eluição. Este fragmento Baml7 foi misturado com e ligado ao pHE29O linearizado com BglII. A mistura de reacção foi usada para transformar K802 e após selecção, os trans formantee foram usados para preparar plasmídeos que foram caracterizados por mapas de restrição. Os plasmídeos apropriados foram designados p490-8/14. p376, cuja derivação foi descrita atrás neste exemplo, verificou-se ter uma deleção de cerca de 0,8kpb para a direita de Smal. agora convertido na especialidade de Hi ndlll. Como foi feito atrás com p395 o fragmento de T-DNA BamHI correspondendo a Baml7 foi colocado e transferido para pHE29O

-33-

linearizado com BglII. Após transformação, selecção e iso, lamento e caracterização dos plasmídeos, o plasmídeo apropriado foi designado p458-l.

1.3 Inserção dos genes de resistência à canamicina e da faseolina

t 0 fragmento tendo o gene da faseolina foi purificado a partir da digestão com HindIII do ρΒ5-ΚΒ3»θ por electroforese em gel de agarose. Este fragmento foi misturado com e ligado ao p490-8/14 linearizado com HindIII. Os transf o imantes resistentes à canamicina de K802 foram usados para preparar plasmídeos a que foi feito os mapas de restrição. Foram isoladas duas construções: p499/6/7 tinha sequências de feijoeiro para a direita do gene de resistência à canamicina

' (Fig. 4) e p499/6/8 tinha a orientação oposta (Fig. 5)·

0 fragmento HindIII purificado j de pKS-£B3.8 tendo o gene da faseolina foi também misturado com e ligado ao p458-l linearizado com HindIII. Prepararam-se de novo plasmídeos a partir de transf o imantes de K802 resistentes a canamicina e feitos os seus mapas de restrição. De novo foram isoladas ambas as ori,1 entações: p496-2 (Fig. 6) e p496-l (Fig. 5) tendo respecí tivamente o gene da faseolina para a direita e para a esj querda do gene de resistência à canamicina.

1

i

I 1-4 Hecombinação homóloga dupla com plasmídeo Ti

I

! Os genes da faseolina e canamicina foram integrados em plasmídeos Ti contidos em células de Agrobacterium tumefaciens como descrito no Exemplo 14. Usaram-se dois plasmídeos como receptores: pTil59» um plasmídeo do tipo octopina; e pTiA66, uma estirpe derivado do plasmídeo A6 do tipe eetopima o qual possui um

! deos pTil59 contendo as construções definidos por p499/6/7»

. p499/6/8, p496-2 e p496-l, são designados respectivamente

por p529-8, p529-7» p-529-11 e p529-2. As mesmas cons1 truções em pTi A66 são designadas respectivamente por ' P538-6, p539-5, P539-2 e p539-l.

I

1-5 Infacção de plantas

ι

I ·

í: Células de A. tumefaciens coni. ““

tendo os plasmídeos Ti das séries p529 e p539 foram usadas para infectar caules de girassóis por picada com uma agu¹ lha seguido de injecção das células bacterianas adequadas.

i:

l·

1-6. Detecção da faseolina

i'

As sequências da proteína fa, seolina foram detectadas em galhas por ELISAs como descrito no Exemplo 14. Todas as galhas testadas verificou-se conterem faseolina; o nível variava entre 20 ng e O ng por grama de peso húmido de tecido, sendo & média de 10 ng/g. A análise por transferência "western" dos géis desnaturantes contendo as proteínas (SDS-poliacrilamida)

I* mostrou bandas discretas de peso molecular aparente elevado! I no entanto significamtemente menor do que o da faseolina na tiva. 0 número exacto e tamanhos das bandas variou entre

as plantas hospedeiras indicando que são o resultado de processamento post—tradução especifico do hospedeiro.

As sequências do mRNA da faseoli na foram detectadas em galhas como descrito no Exemplo 12. Todas as galhas testados verificou-se conterem sequências da faseolina na fracção pol±(A)5+4 εμ- _o nível médio era de 0,005% áo RSA poli(A) total. Á análise por transferência "northem. de géis desnaturantes de DHA (metilmercá-

rio-agarose) mostraram uma banda discreta de alto peso mo- j lecular com o mesmo tamanho do mRNA da faseolina natural | (1.6kbp).

A faseolina foi mantida detecta da por ELISA em tecidos de rebentos derivados de células inl fectadas com um vector baseado em pTiA66· ^:

!

Os níveis de detecção da proteí- ί na faseolina e do mRNA da faseolina estavam significante e substancialmente acima dos níveis de fundo encontrados f

t

quando dos ensaios com galhas transformadas por células I de A. tumefaciens tendo pTi!59 e pTiA66 não modificados· ί

Exemplo 2

Este exemplo ensina a inserção do gene completo da faseolina em T-DNA análogo ao tratado no ‘bcemplo 1. Esta construção utiliza um vector "vai-vem" destinado a transportar sequências inseridas para um pias, mídeo Ti do tipo nopalina, pTiC58, na região do gene da nopalina sintetase.

2,1 Construção de um vector "vai-vem"

0 plasmídeo do tipo nopalina, pTiC58 (Fig. 8a) foi digerido com Smal e um fragmento codificador do gene da nopalina sintetase foi isolado por electroforese em gel de agarose. Este fragmento foi liga do por extremidades cerses a adaptadores BglII que foram então postos a descoberta por digestão com BglII, 0 fragmento de DNA resultante foi misturado com e liagdo ao ρΒΕ29θ linearizado com BglII (Fig· 10). A transformação de K802 foi seguida de seleeção com tetraciclina, isola►-ίΤ. t' ·

mento dos plasmídeos e execução dos mapas de restrição.

0 plasmídeo adequado foi designado pCF44A (Fig. 8b).

!'

Os quatro locais Clal foram reduzidos a um únj co local susceptível Ciai por ressecionamento seriado de pCF44A duas vezes. 0 plasmídeo foi digeri do com Xhol. religado a si próprio e usado para transformar K802. Após selecção com tetraciclina, isolamento dos

! plasmídeos e execução dos mapas de restrição, o plasmídeo

!

apropriado tendo uma deleção de um fragmento Xhol que transporta dois locais Clal foi digerido com Clal« religado a si próprio e usado para transformar K802. Após selecção, isolamento dos plasmídeos e execução dos mapas de restrição o plasmídeo apropriado tendo uma segunda deleção, desta vez do fragmento Clal que transporta todo o gene nos com excepção da extremidade 5', foi designado por pKS-nopIV (Figs. 9» 8, 8c).

2.2 Inserção dos genes can/feijoeiro

ι

pKS-KB3.8 (Fig. 11) foi digerido com Clal e o fragmento de 6,0kbp tendo os genes de resistência à canamicina e faseolina foram isolados por electroforese em gel de agarose. Este fragmento foi mis- ,

i turado com e ligado a pKS-nopIV linearizado com Clal e usado para transformar k802. Aos plasmídeos isolados

j a partir dos transformantes resistentes à canamicina e , tetraciclina e sensíveis à ampicilina foi feito os mapas ί de restrição e um tendo a estrutura mostrada na Fig. 8d

foi designado por pKS-nopIV-KB 3.8//5· Um clone semelhan te orientado com o gene da faseolina para a esquerda da resistência à canamicina foi encontrado e designado pKS-nopKB 3·8>^3·

A técnica de conjugação tri-parenteral (ver Fundamento e Exemplo 14) foi usada para transferir as construções para pTi 058, um plasmídeo Ti

*) ί do tipo nopalina. Os plasmídeos Ti C58-nopKBjáX3 β pC58-nop-KB^5, os resultados da conjugação de pKS-nopIVKB )

t

I; 5-8^3 e A^5» respectivamente, comp$iC58 foram caracteri- j zados através da execução de mapas de restrição e análise j

! por transferência Southern. As bactérias contendo um dos dois plasmídeos, tendo qualquer uma das orientações do !

v fragmento resistência à canamicina/gene da faseolina inserido nas sequências que vão da extremidade 5’ do gene

^!l nos às sequências ladenates 3' do gene nos, foram usadas j

j separadamente na infecção de caules de plantas de girassol j

através de picada seguido de injecção das bactérias. i

2.4 Detecção da expressão

A expressão do gene da faseolina foi detectada em tecidos de galhas de girassol por ELISAs, como no Exemplo 13.5·

Exemplo 3

ί

j Este exemplo ensina as manipulações de um gene da faseolina a principal proteína de reserva da semente do feijoeiro Phaseolus vulgaris I». preparatórias para ulteriores manipulações que inserem o gene da faseolina em vectohss descritos em vários outros exemplos.

I

3.1 Subclonagem de um gene da faseolina

Um clone genómico de faseolina , num Charon 24A AG-PVPhl77.4 (ou 177.4; S.M.Sun et al í

' (1981) Nature 289:37^41. J. L. Slightom et al (1983) |

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80; Fig. 14) foi digerido j

com BglII e BamHI. 0 fragmento de 3,8khph tendo o gene

! da faseolina e as suas sequências ladeantes, isolado por J electroforese em gel de agarose, foi misturado com e ligado ao pBR322 linearizado com BamHI (Fig.12)· A mistura j foi usada para transformar HB101 e seleccionadas as coió- j nias resistentes à ampicilina e sensíveis à tetraciclina. Aos plasmideos isoldaos a partir destes clones foram feitos mapas de restrição. Seleccionou-se um plasmídeo tendo a estrutura mostrada na Fig. 13 e designou-se AG-pPVPh

j| 3.8 (ou alternativamente, ρ3·8). A ligação dos locais

' BglII e BamHI uns com os outros inactiva ambos os locais.

h

Um outro subclone de 177.4 foi construído por digestão com Eco Hl, isolamento de um fragmento de 7,2 kph contendo extensas sequências ladenates 3*

ί e todo o gene da faseolina com excepção da extremidade 5’ e isolado após selecção com ampicilina dos transformantes í de HB101 e execução dos mapas de restrição. Um plasmídeo i tendo a inserção orientada de modo a o local HindIII do j pBH322 estar adjacente à extremidade 5’ do gene da faseo- ΐ

[ I

lina e distai em relação à região 3* não traduzida foi de. nomin&do AG-pPVPh7.2 (ou ρ7·2; Fig. 15; Sun et al. e

| Slightom et al. supra).

3.2 Clonagem e isolamento de um gene de resistência à canamicina

pBZ102 (HUL. Jorgenson et al. (1979) Mol· gen. Genet. 177:63-72)« um plasmídeo ColEl tendo uma cópia do transposão Tm5, foi digerido com BamHI

! e HincliII. misturado com pBR$22 previamente linearizado com aquelas duas enzimas e usado para transformar £802. i Aos plasmídeos, isolados a partir de transformantes seleccionados relativamente à resistência à ampicilina e canamicina foram feitos mapas de restrição e um deles a

vi jí estrutura apresentada na Fig. 16B foi designado pKS-4.

,, 5.3 Ligação do gene da faseolina e uma resistência à

t.

) canamicina__

p3.8 foi digerido com Ciai e

il

BamHI e um fragmento de 4,2kpb contendo o gene da faseolina e algumas sequências do pBR322 foi isolado por electroforese em gel de agarose. Este foi misturado com um fragmento Clal/BamHI de Tn$ tendo um gene de resistência à canamicina (neomicina fosfotransfera se II, NPTII) do

' pk$4 (Fig. 16) β pBB522 (Fig. 12) o qual tinha sido linearizado com Ciai. A mistura foi ligada e usada para trans formar £802. Após selecção das colónias resistentes à ampicilina e canamicina, isolaram-se os plasmídeos e fizeram-se mapas de restrição. Uma colónia tendo a estrutura mostrada na Fig. 11 foi designada p£S-KB5.8.

ρ7·2 foi digerido com EcoRI e BamHI e um fragmento de 5.0kpb tendo todo o gene da faseolina com excepção da extremidade 5* foi isolado por

, electroforese em gel de agarose. Este foi misturado com um fragmento HindlII/BaaHI de Tn$ tendo um gene de resistên cia à canamicina do p£S4 (Fig. 16) e pBR$22 (Fig. 12C) que tinha sido linearizado com HindIII. A mistura foi ligada e usada para transformar £802. Após selecção das colónias resistentes à ampicilina e canamicina os plasmídeos foram isolados e feitos os mapas de restrição. Uma colónia ten do a estrutura apresentada na Fig. 17 foi designada p£S4— -KB5. Em p£S4—EB, faltam à faseolina as sequências codificadoras da extremidade da terminação 5’ do gene e todas

ϊΆ', c

-40-

as regiões ladeantes 5’ (ver Fig. 14).

Exemplo 4

1

Este exemplo ensina um método paira remoção de intrões de um gene. Isto é o mesmo que

! colocar um cDNA num ambiente genómico. Locais de enzimas de restrição encontram-se, ou são criados por mutagénese

;! específica de local, em exões em ambas as extremidades 5’ e 3’ do produto de transcrição não processado. Estes locais existem em clones genómicos e cDNA. 0 DNÀ contendo intrões pode ser removido a partir de um clone genómico e substituído pelo correspondente fragmento de clone de cDBJi sem intrões abrangendo os dois locais. Ϊ também possivel

jj a operação reversa: sequências genómicas contendo intrões > podem ser colocadas num ambiente de cDNA. Insere-se um

fragmento interno do clone genómico num hiato correspondente criado nua clone de cDNA. Esta última estratégia é análoga, apesar de muitas vezes tecnicamente mais dificil pois os intrões podem conter locais susceptívds às enzimas escolhidas para criar o fragmento de troca. Esta dificuldade pode ser ultrapassada por selecção cuidadosa das condições de digestão parcial e por purificação do fragmento desejado por electroforese em gel de agarose.

ί Outras elaborações desta estratégia incluem a manipulação 1 de intrões individuais dentro de um gene deixando outros i intrões e exões sem serem afectados e a troca gradual de ι sequências quando existem nos intrões locais de restrição

Ί

inconvenientes como se discutiu atrás.

! 4.1 Substituição de um fragmento contendo os intrões da ί faseolina cem cDNl

ρ3·8, um clone de plasmídee

do geme da faseolina e as suas sequências ladeantes, foi

-41-

•y

' digerido respectivamente parcial e completamente com EcoRI ^! e Saci e um fragmento de 6,4 kpb contendo o vector pBR322

e ambas as extremidades 5* θ 3' do gene, foi isolado por electroforese em gel de agarose. pcDNA 31, um clone do plasmideo pBR322 de cDNA feito a partir de mRNA de faseolina foi digerido espectivamente parcial e completamente com Saci e EcoRI e um fragmento de 1,33 kpb contendo todo o cDNA de faseolina com excepção das sequências nos terminais das extremidades 5* e 3* foi isolado por electrofore: se em gel de agarose. Estes dois fragmentos foram ligados

um ao outro e usados para transformar HB1O1. Após selecção de colónias, crescimento das células e isolamento, de plasmídeos, a execução de mapas de restrição permitiu iden tificar um plasmideo tendo a estrutura desejada. Este plasmideo foi designado p3.8-cDNA (Fig. 22). Toda a construção está esquematizada na Fig. 18.

ι 4.2 Utilização de p3.8-cDNA

E de notar que p3»8-cDNA pode substituir a fonte de DNA genómico, p.e. ρ3·8, usado em ί todos os outros Exemplos e que quando assim é usado resulta em construção análogas diferindo apenas por não terem. Como alternativa, esta estratégia pode ser usada para remover intrões das construções já efectuadas.

í

Exemplo 5

0 fim deste exemplo é a produção de um plasmideo Ti com uma deleção desde o tms (locus de "rebentamento") até tmr (locus de "produção de raizes") de pTi 159 e outros plasmifeos Ti do tipo octopina. Este derivado é útil porque as células transformadas per ele são mais facilmente regeneradas em plantas inteiras do

-42-

que as transformadas por pTil59 com genes tms e tmr intactos.

0 pTil59 com delecção em tms - tmr é finalmente modificado de duas maneiras: a inactivação de tms - tmr e a inserção de um gene estranho. Caso estas duas modificações estejam situadas em diferentes pontos do T-DNA, cada modificação é inserida independéntemente por vectores "vai-vem" diferentes. Cada modificação dependente de vector "vai-vem" é seleccionada independentemente o que necessitará da utilização de pelo menos duas marcas seleccionáveis em Agrobacterium. Além da habitual resistência à canamicina este exemplo utiliza uma resistência ao cloranfenicol derivado de pBR325·

5.1 Construção de um clone do gene de resistência ao cloranfenicol

pBR325 é digerido com HincII e ligado por extremidades cerses a adaptadores HindIII.

A preparação resultante é digerida com HindIII. religada, seleccionada quanto a resistência ao cloranfenicol (cam) e designada pKS-6 que servirá como uma fonte do fragmento HindlIlXBclI que contem o gene cam (Fig. 19) ·

5.2 Construção de um clone de T-DNA em pBR322 com uma delecção e um gene cam

Um fragmento de DNA linear de 9.2Kpb j | é isolado a partir do produto da digestão completa com i

j HindIII e parcial com BamHI de p203 (Fig. 31)· Este frag- | I mento tendo o gene cam é isolado a partir de pKB-5, misturado com o fragmento linear de 9,2 Epb, ligado, usado para transformar E.coli. seleccionado quanto à resistência ao cloranfenicol e designado pXS-oct. Cam 203 (Fig. 20).

pKS-oct. Cam 203 é um clone de plasmídeo que pode agora ser usado para construir uma série de mutantes de pTil59 com deleção TL. Contem o bra ço direito de TL e um gene de resistência para a esquerda do braço direito. Vários braços esquerdos de TL podem ser ligados à esquerda do gene cam (local HindIII). Por exemplo, se se ligar pl02 à delecção é de 5*2 Kpb e inclui tms e tmr na totalidade. Se se ligar pl03 a deleção é de 3,2 Kpb e inclui parte de tms e tmr total. Ver Fig. 2.

pKS-oct. Cam 203 é digerido com HindIII. pl02 ou pl03 é digerido com HindIII e o fragmento

• de T-DNA com 2,2 Kpb ou 2,0 Kpb é isolado e ligado ao pKS-oct. Cam 203 linearizado, usado para transformar e isolado dando pKS-oct. delll (Fig. 2) ou pKS-oct. deli

jj (Fig. 22) respectivamente. Estas construções são transj feridas para A. tumefaciens por conjugação, recombinação homólogos e selecção quanto à resistência ao cloranfenicol. Como alternativa pode-se transferir as construções

•i para pHK290 usando métodos estabelecidos por linearização i da construção tendo os plasmídeos com BamHI e ligação ao

local BglII de pEK290.

” I

I

Exemplo 6

I

J

, 0 plasmídeo Ti é mutado neste exem- i

pio por deleção do T-DNA entre o local Hpal em tmr até ao local Smal em tml. Os plasmídeos Ti que podem ser modifii cados incluem pTil59, pTiB6, pTiA66 e outros. Esta constru ι ção está esquematizada na Fig. 23.

6.1 Isolamento do gene cam

pKS-5 (Fig. 19) é digerido com Hind III e Bell. O fragmento menor é isolado após separação num gel de agarose como ensinado no Exemplo 5«

6.2 Construção de um clone de T-DNA com uma delecção em pBK322

0 braço direito da deleção de T-DNA constrói-se por inserção dos locais BglII nos locais Smal de p2O3 (ver Fig. 2). p2O3 é digerido com Smal« ligado a adaptadores BglII. digerido com BglII« religado e usado para transformar KSO2. Numa construção alternativa, os adaptadores BamHI são substituídos por adaptadores BglII e isolados os produtos adequados da digestão parcial com BamHI. 0 plasmídeo resultante é designado p2O3-BglII e

é digerido com BglII e HindIII. 0 fragmento grande BglII/ /HindIII contendo o vector é ligado a um fragmento de resistência ao cloranfenicol cujo isolamento foi descrito no Exemplo 6.1. A pós transformação de K802 selecciona-se quanto a resistência ao cloranfenicol. 0 plasmídeo resultante é resultante é designado p2f (Fig. 23).

6.3 Construção do braço esquerdo do clone de T-DNA com deleção

Locais HindIII são inseridos no local Hpal de p2O2 por digestão 'com Hpal e ligação com adaptadores HindIII. Após postas a descoberta as extremidades coesivas HindIII« por digestão com esta enzima de restrição isola-se o fragmento Hpal de Kpb que tem agora extremidades HindIII. 0 fragmento Hpal com extremidades HindIII digerido com HindIII é usado para transformar KBO2. Após isolamento e caracterização de uma colónia contendo

a construção desejada, o plasmídeo é designado p3e (Fig. 24).

i 6.4 Construção do clone de T-DNA com delecção

í

I 0 braço esquerdo do clone é

obtido por purificação de um fragmento de 2kpb produto da digestão com HindIII de p32 através de eluição de um gel

> de agarose após electroforese. p2f é cortado com HindIII ΐ tratado com fosfatase alcalina, misturado com o fragmento de 2kpb, ligado, usado para transfonnar K802 e selecciona^

i, do quanto à resistência ao cloranfenicol. Os plasmídeos são isolados a partir de colónias individuais e caracteri zados por mapas de restrição. Um plasmídeo tendo os dois

Ij braços na orientação tandem desejada é escolhido e designa ; do pKS-oct. delIII (fig.25).

!i

pKS-Oct.delIII é transferido

ι para A. tumefaciens por conjugação e os recombinantes homó logos são seleccionados por seleccçáo com cloranfenicol. Haizes e rebentos de gitassol e de tabaco são incubados como descrito noutros Exemplos e os tumores produzidos são testados quanto a opinas.

Exeaplo 7

Este exemplo ensina uma constru ção com delecção de tmr e tal que constitui uma alternativa à ensinada no Exemplo 6.

7.1 Construção de um fragmento de resistência ao cloranfenicol com um local BglII

pBR325 é digerido com HincII, ligado por extremidades cerses a adaptadores BglII. digerido com BglII e religado (Fig. 26). Após transformação de £802 ou GM33 selecciona-se a resistência ao cloranfenicol. 0 plasmídeo resultante, pKS-6 serve como fonte de obtenção do fragmento BglII/Bcll tendo o gene cam.

7.2 Construção do clone com delecção tmr e tml

p2O3 é digeriso com Hpal e Smal. Após ligação das extremidades cerses aadaptadores BglII, digere-se com BglII para expor as extremidades coesivas BglII. religa-se e usa-se para transformar £802. A cons trução desejada é identificada e designada p2 (Fig. 27).

7.3 Construção do clone de T-DNA com deleção (pKS-oct.

delllla)

0 fragmento BglIITtendo o gene cam é isolado a partir de pKS-6 e ligado a p2 cortado com BglII, Após transformação de £802 selecciona-se a resistência ao cloranfenicol. 0 plasmídeo resultante é designado pKS- J -oct.delllla (Fig. 28) e é testado como descrito no Exemplo 6.4.

-47-

Exemplo 8

I

ί

‘ 0 fim desta construção é dar um

ι exemplo da mutação do Locus tmr apenas no local Hpa por ! inserção de gene de resistência ao cloranfenicol. Este I gene é isolado como o fragmento BglII/BçlI ajartir de

pKS-6 e é ligado ao local Hpal de p2O5 esse local ser i transformado num local BglII.

I

(

i 8.1 Conversão do local Hpa num local BglII

I

p2O5 é digerido com Hpa. ligado a adaptadores BglII, cortado com BglII e religado. Após transformação de K802, as colónias são seleccionadas e

ι testadas por mapas de restrição quanto à inserção dos Ιοί cais BglII (Fig. 29).

8.2 Isolamento do gene cam

₍ pKs-6 é digerido com BglII e Bell.

0 fragmento menor é isolado por electroforese em gel de agarose.

8.5 Construção do clone de T-DNA mutado

0 p205 modificado do Exemplo 8.1 é digerido com BglII, ligado ao gene cam purificado do Exemplo 8.2 e usado para transformar K802. Selecciona-se quanto à resistência ao cloranfenicol e após isolamento dos transformantes resistentes e caracterização por mapas de restrição, o plasmídeo é designado pKS-oct. tmr (Fig. 3).

-48-

Exemplo 9

A regeneração neste exemplo envol_ ί ve tumores de cenoura induzidos por um plasmídeo TIP baseado em Ri e efectua-se basicamente como descrito por D. -D. Chilton et al. (1982) Nature 295:432-434. !

[

9.1 Infecção com raizes em cabeleira ;

Discos de cenoura são inoculados com cerca de IO⁷ bactérias em 0,1 ml de água. Segmentos ! com um a 1,5 cm das extremidades das raizes obtidas são i cortados, colocados em meio Monier sólido (1-1,5% de agar)j sem hormonas (D.A. Tepfer e J.C. Tempe (1981) C.R. Held. Seanc. Acad. Sei., Paris 295:153-156) e crescidos então I 25°C e 27°C na escuridão. As culturas não contaminados por bactérias são transferidas todas as 2 a 3 semanas e são subcultivadas em meio Monier sem hormonas e agar.

9.2 Regeneração de raizes em plantas

0 tecido de raiz cultivado descri, to no Exemplo 9.1 é colocado em meio Monier solidificado j (0,8% de agar) suplementado com 2,4-D 0,36pM e cinetina 0,72pM. Após 4 semanas, o tecido de caule resultante é colocado em meio Monier liquido sem hormonas. Durante a

j incubação de um mês entre 22 e 25°C num agitador (150 rpm)

ί o caule dissocia-se para dar uma cultura em suspensão a

1 partir da qual se diferenciam embriões, os<quais quando í colocados ém caixas de Petri contendo meio Monier sem ,j hormonas, se desenvolvem para dar plântulas. Estas plânj tuias crescem em cultura e após "endurecimento" por expo'I sição a a atmosferas com progressivo decréscimo de humidade, são transferidas para o solo numa estufa ou num can teiro.

I

-49-

9.3 Utilização de vectores não indutores de raizes em cabeleira

Vectores baseados em Ti não têm genes tmr funcionais são usados em vez dos vectores baseados em Ri como descrito nos Exemplos 9.1 e 9.2. A construção de deleções adequadas até descrito nos Exemplos 6,7 e 8.

Exemplo 10

A regeneração neste exemplo envolve tumores de tabaco induzidos por um plasmídeo TIP baseado em Ti e efectua-se essencialmente como descrito por K.A. Barton et al. (1983) Cell 32:1033-1043.

10.1 Infecção com galhas em coroa

Tecido de tabaco é transformado jj usando uma abordagem que utiliza segmentos de caule invertidos pela primeira vez descritos por A.C. Braun A (1956) Canc. Res. 16:55-56· Os caules são esterilizados

na superfície com uma solução com uma solução com 7% de | Chlorox comercial e 80% de etanol, lavados com água desj tilada estéril, cortados em segmentos de 1 cm, aoLocados

com a extremidade basal para cima em caixas de Petri contendo meio MS solidificado com agar (T. Murashige e

.! P· Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:475-497) sem hormonas.

i "

I À inoculação é feita por picada da superfície basal do 1 caul com uma agulha de seringa e injecção das bactérias.

.•r» «-A," -- -.AtóJ»· · · »/*·’7>ν-

Os caules são cultivados a 25°C com 16 horas de luz por dia. Os caules que se desenvolvem são removidos da superfície superior dos segmentos de caules são colocados em

!'

jj meio MS solidificado contendo 0,2 mg/ml de carbenicilina ii e sem hormonas, são transferidos para meio fresco MS com li carbenicilina três vezes com intervalos com cerca de um

!’ I

mês e são testados para averiguar se as culturas possuem !

·, bactérias. Os tecidos axénicos são mantidos em meio MS ι ii sólido sem suplementos nas condições de cultura descritas j |i atrás (25°C; 16 hr; 8 hr de luz; escuridão). '

' i

10.2 Cultura dos tecidos transformados }

I

Obtem-se clones a partir de te- j

eidos axénicos transformados como descrito por A. Binns J e F. Mains (1979) Planta 145:565-569. Os caules são con- ;

1' vertidos em suspensões de células por cultura em meio MS liquido tendo 0,02 mg/1 de naftalenoácido acético (líAA) a 25°C durante 2 ou 3 dias com agitação a 135 rpm { e filtração sequenciada através de filtros de aço inoxi. dável com poro de 543 ® 213 xm. 0 filtrado passado é conj centrado, colocado em 5 ml de meio MS contendo 0,5% de [

í agar fundido, 2,0 mg/1 de NAA, 0,3 mg/1 de cinetina e }

^! 0,4 g/1 de extracto de levedura. Lifco a uma densidade ί

de cerca de 8 x 10° células/ml. As colónias que atingem {

- um diâmetro de cerca de 1 mm são repicadas, colocadas e !

j crescidas em meio MS sólido tendo 2,0 mg/1 de NAA e 0,3 !

i mg/1 de cinetina. Os caules resultantes são divididos em I pedaços e testados relativamente aos fenótipos transformados.

10.3 Regeneração de plantas j

Os clones transformados são coloI cados em meio MS solidificado tendo 0,3 mg/1 de cinetina ; ! e cultivados como descrito no Exemplo 10.1 Os rebentos I que se formam são enraizados colocando-os num meio sólido

I

(1,0% de agar) contendo 1/10 do conteúdo de sais do meio MS, 0,4 mg/ml de tiamina, sem sucrose e sem hormonas e

j; tendo um pH de 7,0. As plântulas com raízes são crescij das em cultura, "endurecidas" como descrito no Exemplo 9.2

e transferidas para o solo numa estufa ou num canteiro.

10.4 Vectores usados

_: !

Os métodos descritos nos Exemplos 10.1, 10.2 e 10.3 são adequados à utilização de vactores

• baseados em Ti sem os genes tmr funcionais. A construção |

' de deleção apropriadas está descrita nos Exemplos 6, 7 e

8. Estes métodos são também eficazes quando usados com ¹ vectores baseados em Ri. 0 método descrito no Exemplo

₍ 10.1 para infecção de segmentos de caule é muitas vezes ί

|| útil para o estabelecimento de linhas celulares vegetais

transformadas com TIP.

Exemplo 11

t

, A faseolina é a proteína de reser ,

va mais abundante (aproximadamente da proteína total

' da semente) de Phaseolis vulgaris. A transferência do genej ! funcional da faseolina para plantas de alfafa e tradução j

a do m-RNA da faseolina para faseolina de reserva tem um '·

j valor económico significativamente uma vez que introduz i

j sintese de proteínas de reserva em material foliar a ser usado como forragem. A alfafa é uma planta importante

-52-

para a transferência e expressão do gene da faseolina devi do à sua aceitação como ferrugem para gado, ao seu rápido crescimento, à sua capacidade para fixar azoto através de simbiose Rhizobial, à sua susceptibilidade à infecção por galhas em coroa e à sua capacidade para regenerar plantas de alfafa a partir de células isoladas ou protoplastos. Este exemplo ensina a introdução de um gene da faseolina expressível em plantas inteiras de alfafa.

11.1 Construção do vector "vai-vem"

Plantas de alfafa são regeneradas a partir de tecido de galha em coroa contendo plasmídeo de Agrobacterium geneticamente modificados como a seguir se descreve. No primeiro passo constrói-se um vector "vai-vem" contendo um T-DNA mutante tmr~ e tms~ ligado a um gene funcional da faseolina. Esta construção é, por I

I

sua vez ligada a um promotor da nopalina sintetase o qual | tem um gene estrutural funcional da neomicina fosfotrans- j ferase (NTPII) (resistência à canamicina) a jusante (divuli gado por M.-D. Chilton et al (18 de Janeiro de 1985) 15° i Simpósio de Inverno de Miami; ver também J. L. Marx (1983)! Science 219:850 e R. Horsch et al (18 de Janeiro 1983)

15° Simpósio de Inverno de Miami). Este tipo de construção está ilustrado no Exemplo 1.

i

11.2 Transferência para Agrobacterium e células vegetais j

í

i

0 "vector vai-vem" é então usado j para transformar por técnicas convencionais (Exemplos 14) j uma estirpe de Agrobacterium contendo um plasmídeo Ti como seja o pTi 15955· As bactérias contendo plasmídeos recombinentes são seleccionados e co-cultivadas com protoplastos de alfafa os quais regeneram paredes celulares (Marton et al (1979) Nature 277: 129-131; G. J. Wullems et al

-53-

ί (1981) Proc. Nat. Acad. Sei USA 78:4344-4348; e R. B.

Horsch e R.T. Fraley (18 de Janeiro de 1983) 15° Simpósio de Inverno de Miami). ·

_t ί

As células são crescidas em cul- J tura e o tecido de caule resultante é testado relativamen j te à presença do mRNA apropriado por transferência j

,· Northem (Exemplo 12) e presença de proteínas apropriadas por testes de ELISA (ver J. L. Marx (1983) Science 219: I

i 83θ; R. B. Horsch e R.T. Rraley (18 de Janeiro de 1983) ' '' 15° Simpósio de Inverno de Miami). j

' í

; i

11.3 Regeneração de plantas

Plantas de alfafa são então

regeneradas a partir do tecido de caule por métodos seme ₍ í lhantes aos préviamente usados por A.V.P. Dos Santos et i

al (1980) Z. Pflanzenphysiol. 2^:261-270; T. J. McCoy e Ε. T. Bingham (1977) Plant Sei Letters 10:59-66; e K.A Walker et al (1979) Plant Sei. Letters 16:23-30. Estas í plantas regeneradas são então propagadas por técnicas con b

I vencionais de cruzamento de plantas constituindo a base ί Ί de novas variedades comerciais.

Exemplo 12

Em todos os Exemplos, extraiu•i

-se RNA, fraccionou-se e detectou-se pelos processos que '! se seguem.

!!

! 12.1 Extracção de RNA

!

Este processo foi uma modificação de Silflow et al. (1981) Biochemistry 13:2725-2731.

A substituição de centrifugação era CsCl por precipitação

! com LiCl foi descrita por Murray et al (1981) J. Mol. ί

I Evol. 17 : 31-42. A utilização de LiCl 2M mais ureia !

2M para precipitar foi tirada de Rhodes (1975) ^J· Biol. j

Chem. 2^ : 8088-8097. i

I

|l 0 tecido foi homogeneizado usan- !

do um homogeneizador de polytron ou de vidro moído em 4-5 j

j, volumes de Tris-HCl 50 mM (pH8,0) contendo 4% de ácido

ι ;

p-amino salicilico, 1% de ácido tri-isopropilnaftalenossulfónico, ditiotreitol lOmM (feito na altura) e Na-metabissulfito (feito na altura). Um octanol foi usado ! na quantidade necessária para controlar a formação de es- i puma. Um volume igual de fenol saturado com Tris contendo 1% de 8-hidroxiquinolina foi adicionado ao homogenato o qual foi então agitado para emulsionar e centrifugado a 2O.OOO-3O.OOO g durante 15 minutos a 4°C. A fase supe;· rior aquosa foi extraída uma vez com clorofórmio/octanol (24:1) e centrifugada como atrás. Adicionou-se então uma solução concentrada de LiCl-ureia para uma concentra- J

ção final de 2M de cada e a mistura foi deixada em repou- ί

so a 20°C durante várias horas. 0 precipitado de RNA j

i| foi então centrifugado e lavado com LiCl 2M para disper- ΐ

! sar o sedimento. 0 precipitado foi então lavado com 7θ%

'· de etanol Na-acetato 0,3M e dissolvido em água estéril

suficiente para dar uma solução limpida. Adicionou-se meio volume de etanol e a mistura foi colocada em gelo j

ί durante V2 hora após o que foi centrifugada para remover I vários polissacáridos. 0 precipitado de RNA foi então j

recuperado e redissolvido em água ou em tampão poli(U) j

sem sal e estéril.

í

' ι

I

1 j

! 12.2 Cromatografia em poli(U) sephadex i

I |

Usaram-se dois tampões poli-u j

Sephadex (marca registada:Pharmacia, Inc., Uppsala,

Sweden); o primeiro sem sal contendo Tris 20 mH, EDTA

AH»

lmM e 0,1% de SDS e o segundo com NaCl O,1M adicionado ao primeiro. Para obter uma leitura correcta a A^q, deve-se fazer um tampão "stock” 2 x e o sal adicionado a uma porção dele após ajustamento das concentrações fi nais os tampões são autoclavados.

Poli(U) Sephadex foi adquirido aos laboratórios Bethesda Research e 1 g de poli(U)

Sephadex foi usado por cada 100 pg de RNA poli(A). 0

poli(U) Sephadex foi hidratado em tampão poli U sem sal e vertido para uma coluna eom camisa. A temperatura foi subida até 60°C e a coluna foi lavada com tampão sem sal até a linha de base a 260mm ser direita. Finalmente a coluna foi equilibrada com o tampão poli(U) contendo sal a 40°C. 0 RNA a uma concentração de menos de 5θθ jag/ml

foi então aquecido em tampão sem sal a 65°C durante 5 minutos, após o que foi arrefecida em gelo e adicionado NaCl a uma concentração de O,1M. 0 RNA foi então colocado na coluna que correu a não mais de 1 ml/min até a densidade óptica ter atingido uma linha de base estável. A temperatura da coluna foi então levantada até 60°C e o

j RNA eluído com tampão poli(U) sem sal. 0 RNA normalmente é eluido em três volumes de coluna. 0 RNA eluido foi en! tão concentrado com butanol secundário para um volume con veniente após adição de NaCl para 10 mM e precipitado com 2 volumes de etanol. 0 precqitado do etanol foi dissolvido

j em água e NH^-acetato adicionado para O,1M, seguido de re-precipitação com etanol. Finalmente o RNA foi redissojL , vido em água estéril e guardado a -70°C.

J 12.3 Géis de RNA em formaldeído e transferências "Northern¹'

0 método usado foi seguido pelo de Thomas (1980) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77:5201 e Hoffman et al (1981) J. Biol. Chem 256:2557-56-

I

t

• ( I

Géis de 0,75-1,5% He agarose contendo Na-fosfato 20 mM (pH6 ,8-7,0) foram montados.

Se apareciam bandas de agregados de alto peso molecular as experiências eram então repetidas com a adição aos géis de 6% ou 2 ,2M de formaldeído (utilização da solução "stock" a 36%)· θ formaldeído faz com que a visualização com brometo de etídio seja muito dificil. 0 tampão de electroforese era Na-fosfato lOmM (pH 6,8-7,0).

Antes da electroforese o RNA

foi tratado com um também desnaturante tendo as concentra ções finais de 6% de formaldeído, 5θ% He formamida, tampão Na-fosfato 20mM e EDTA 5mM. 0 RNA foi incubado no tampão a 60°C durante 10-20 minutos. A incubação terminou com a adição de tampão de paragem. Para uma amostra de 20jil adicionou-se 4 jil de gliceral a 5%, EDTA 10 mM, Na-fosfato 5 mM e azul de bromofenol.

Usou-se electroforese submersa.

0 RNA foi aplicado antes do gel ser submerso e deixado entrar no gel a 125 mA durante 5 minutos. Os géis foram então submersos e a corrente reduzida para 30 mA (durante a noite) ou 50mA (6-8 horas). 0 tampão foi recirculado e a electroforese feita numa câmara fria.

,{ 12.4 Transferências "Northern"

'i

'ΐ Se o gel é usado para transferên

! cia para detectar um RNA específico não é corado; usa-se

uma faixa separada com marcadores para corar. A coloração é feita com 5 Jig/ml de brometo de etídio em Na-acetaί to O,1M e a descoloração faz-se durante várias horas em Na-acetato O,1M. Tratamento em água a 60-70°C durante

5-10 minutos antes da coloração ajuda a visualização.

—Η

-57Um gel a ser transferido é embebido durante 15 minutos em citrato salino "Standard”

()3SC) lOx - 3% de formaldeído. Se as moléculas grandes de ENA não são eluídas do gel então um tratamento prévio em NaOH 5θπιΜ durante 10-30 minutos ajuda a quebrar o ENA Caso se use tratamento com uma base, o gel é neutralizado e embebido em SSC-formaldeido antes da transferência. A transferência do ENA para nitrocelulose, foi feita por métodos "Standard”.

Pré-hibridação foi feita a 42°C '

durante um mínimo de 4 horas em 50% de formamida, 10% de ' sulfato de dextran, SSC 5x, solução de Denhardt 5x,

100|ig/ml de DNA veículo desnaturado, 20 jig/ml de poli(A), Nafosfato 40 mH (pH 6,8-7,0) e 0,2% de SDS. A hibridação foita através da adição da sonda ao mesmo tampão com incubação durante a noite. A sonda não foi usada a mais de aproximadamente 5x10^ cpm/ml.

i

Após hibridação, a nitrocelulose 5 foi lavada uma série de vezes a 42°C com SSC 2x , Na-fos- j fato 25 mM, EDTA 5mM e Na-pirofosfato 2 mM seguido de uma lavagem final durante 20 minutos a 64°C em SSE lx. Os me ' lhores resultados foram obtidos no caso de o filtro não ser seco antes da autoradiografia e a sonda removida por lavagem abundante em EDTA lmM a 64°C.

ί Exemplo 13 '

i Transferência "Western", para j

detectar antigénios após electroforese em gel de poliacri j lamida com SDS, foram feitas basicamente como descrito por

I

E.P. Legocki e D.P.S. Verma (1981) Analyt. Biochnem. .111: :385-392

li

Testes micro-ELISA (enzyme-linked immuno-sorbant assay) foram feitos usando placas do tipo Immulon-2 com 96 poços através dos passos que seguem:

13.1 Ligação do anticorpo às placas

No dia 1 os poços foram revesti^ 1

I

dos com uma diluição 1:1000 de anticorpo (Ig G de coelho ' antifaseolina) em tampão de revestimento 200 pl/poço in- _| cubado a 37°θ durante 2-4 horas. As placas foram cober- i tas com Saran Wrap. As placas f<ram então lavadas três vezes com tampão fosfato salino - Tween (PBS-Tween) ;

deixando um intervalo de 5 minutos entre cada lavagem. Adicionou-se à solução de lavagem 1% de albumina de soro bovino (BSA) e, após adição ao poço, deixada permanecer durante 20 minutos antes de ser rejeitada. Repetiu-se mais cinco vezes a lavagem com PBS-Tween.

í

I

í

13.2 Homogeneização de tecidos I

í

0 tecido foi cortado em pequenos j pedaços e depois homogeneizado com um "polytron" usando 1 g de tecido/ml de tampão fosfato salino-Tween - 2% de polivinilpirrolidona - 40 (PBS - Tween - 2% PVP-40) . Todas as amostras guardadas em gelo antes e após trituração e obtidas curvas padrão de faseolina. Uma curva padrão foi feita com homogenatos de tecido e outra curva foi também feita em tampão para testar a recuperação de faseolina quando triturada no tecido. Após centrifugação das amostras homogeneizadas, 100 jal de cada amostra foi colocado num poço e deixado durante a noite a 4°C. Para evitar erros foram feitos duplicados de cada amostra. As placas foram seladas durante a incubação·

s?«9BawwjMg«

}ίικτι ' V

-5913· 3 Enzima de ligação

• Após incubação durante a noite,

t o antigénio foi rejeitado e os poços lavados cinco vezes | com PBS - Tween deixando um intervalo de 5 minutos entre { cada lavagem.

ί

í

ι

Um conjugado (IgG de coelho antifaseolina ligado a fosfatase alcalina) foi então diluída a 1:3000 em PBS-Tween - 2% PVP contendo 0,2% de BSA e

; 15θ pl foi adicionado a cada poço; seguiu-se incubação

> ll durante 3-6 horas a 37°C. Após incubação o conjugado foi I ' rejeitado e os poços foram lavados cinco vezes com PBS( -Tween, deixando cinco minutos entre cada lavagem como

!' ι

, anteriormente. j

I

j 13.4 Teste

h

Imediatamente antes de ser feito

I o teste, um comprimido de 5 mg de fosfato de p-nitrofenilo (adquirido à Sigma e guardado congelado no escuro) foi adicionado a cada 10 ml de substrato e agitado com vortex

até dissolução do comprimido. Adicionou-se rapidamente

> 200 jil da solução à temperatura ambiente a cada poço. A ij reacção foi medida a vários tempos, eg. t=o, 10, 20, 40,

60, 9θ θ 120 minutos, usando um leitor Uynatech Micro! -ELISA. Quando o fosfato de p-nitrofenilo, que é incolor,e' j hidrolisado pela fosfatase alcalina para dar fosfato inorj gânico e p-nitrofenol, este último composto dá à solução ' uma cor amarela a qual pode ser lida no espectrofotómetro ι a 410 nm. 0 limite inferior de detecção é inferior a 0,1 I ng.

I

E-fc_

Exemplo 14

Conjugações tri-parentais foram geralmente conseguidas como descrito abaixo; são também aceitáveis outras variações conhecidas dos familiarizados com a matéria. E.coli K802 ("vector vai-vem" baseado em pRK29O) foi conjugada com E.coli (pRK2O13) e com uma estirpe de A. tumefaciens resistente à estreptimicina. O pSK2O13 foi transferido para a estirpe portadora do vector "vai-vem" e mobilizado o "vai-vem" para transferência para Agrobacterium. 0 crescimento num meio contendp estreptomicina e a droga a que o "vector vai-vem" é resistente, muitas vezes canamicina ou cloranfenicol, resultou na selecção de células de Agrobacterium contendo sequências do "vector "vai-vem". Uma conjugação destas células com Ξ. coli (pPHlJl) resultou na transferência de pPHlJl para as células de Agrobacterium. Os vactores "vai-vem" pPHlJl e o baseado em pRK 29θ não podem coesistir durante muito tempo na mesma célula. 0 crescimento em gentamicina, à qual pPHlJl tem um gene de resistência, resulta na selecção de células tendo perdido as sequências pRK29O. As únicas células resistentes à estreptomicina gentamicina e canamicina ou cloranfenicol são aqueles que têm plasmídeos Ti que sofreram recombinação homóloga dupla com o "vector vai-vem" e têm agora a construção desejada.

ra

o

•H

β

xd

p

β

φ ε ο ο - ra ra ο <ϋ ε

ο β βΌ «υ β β ·Η Φ C0 «Ρ

φ β Ctí ο

! I

ί[

ί!

ΐί

. ai

ai

&)

\Ω

ai

Εη

Ε

Ο

ο

ai

-ρ

•Η

Φ

ai

Ό

α Φ

-ρ

β

Φ bO

ω ·κ Φ <Μ Ρ

Cm ai < β

	CO		οο	Γιί	ο-4	ο-4
				«	Α	Α
	•	co	Α	ΓΟ	ΟΙ	Ο^
ο-Ι	σι	*—*	σ»	CS1	<Μ	ΟΙ

ΙΛ

CM

I

Ο	Φ Ο Χ--
ο WP
Ό •Η Ν	ο β
β	ο
Ό	Ό
Ο	Φ
β	m
	β

φ

&

•Η

-Ρ

«0

W

Φ

•Η

β

XD

-Ρ

Ο

Φ

«

Ο

φ

X)

Ε

«D · Φ υ ι—I -Ρ P«W

CM

00 =»

ι

«Λ

Μ

2

I

νο

CM CM <Μ

(Μ «Μ

«Μ ΙΛ ΙΛ

γο νη

3 3 • ·

ΓΟ ΓΟ

2

I

ιζ>

ΙΛ

ΙΛ

00

<Μ

ΓΟ

Ρ*

Α

Ο Ό Ρχ

ί*1 ο-4 ο-4

σι νο ο-4 ΟΙ

CM

ΓΟ

ΓΟ »~4 ,-Μ ΓΟ ιΛ Ρ*

κο

I

<✓>

-62('

ra

p

ra

Eh

ra

o

•H

β

*TO

P

β

V

8

O

o

r 05

ra o

ra e

•ri -ri

ϋ β GO <ra tí

β «I

ra CQ P

ra 3 04 o

E

O

o

ra

p

•H

ra

P

ra

xi

ra ra ρ β β 3 Φ bO m ·η ra ρ β

Ρα3 < β

ra

ra

3

Ο 3 rH Ο Ρ

Ε

ra ra •3 X •HW

2 α]

ρ η

•Η

β

XD

Ρ

Ο ·

ra υ « ρ

* φ

ο

φ *

3 Φ

ra-rt ra ρ rH «ο ρ w

	οίϊΛ
	ι	g-ró	• ΝΛ Ο Ο I
	ra ra	S X,racora “ροή	β ο-
	ra 3	Ρ
ο	Ε
	ο	Ο βΟΗ	Ο ο-
β	ο «ra	Φι—lhO	εο ··
ra	m	ra bo—'β	ΟΊ>-
β	·* 3	ρ <	ι-Η Ο-
•Η	ε γΗ	β'Λ,β
ε	8 Ο	ο ra ·	• rt
•Η	Φ X	pro f-w	«—ι
<-Ι	> Φ	ω ·η·η	ra ·η
Φ	I	β οκ ·	Ο
	•Η Φ	ra β >	Ρ 03
ra	Λ 3	β«υ	Φ ·
β	>	Ρ ΡΡ5β	3
ra	= Ο	ω 5=>	ra ra
Ρ	Ρ	-·πρ -	ρ ο
	β 30 ra ra	Ρ<
ο	ο βσ> φ ·η	•Η ·
xi	ρ bor\j β ra ra	Ο Ρ
ra	ο	W βφ	Ρ
ω	Φ Ο 04 ΦτΙβ	• ra
3	> ε	Ρ3 ΟΕπ	ο a

o

> ι «.f ·— vo OC ·—< 0.0 I O I O CO C V, o» I I XNO «/> εχχ σ» S£ 2 *r α ·αα

° § Ρ R		ffl°8	Ό ra	·· I
Ο ra rH	ra	ÉH ·Η	ο	ra ra	ra
ra ra ra	•Η	ra ,χ	««:	β β	β
> β ο	O	Ρ ra	•	•Η	•ri
ra ο	β	β	ο	Ρ ο	ι—t
O bOr-1	<ra	Ο 3	ο	ο «ra	ra
	β	σ' ω β	Ρ ο	P
β ra ε	ra	nj ·η	Ρ	ο β	o
ro ρ 3	Ρ	Ρ	Ζ—\	Ο Φ	β
Ν ρ	ra	Μ ·	σ'	ra
•Η Ο 8	β	04 W		ο β	o
rH pro	ra	ρ ·	OOJ	Ρ·Η	P
-η ra ν	β	ρ	rH ΙΓ'	•Η	ri
Ρ β ·ιΗ	Ρ	φ		ρ ra	P
Ο ro rH		3 θ	*“rH	Β
ε β·κ	ra	ρ	•ri I	ο 3 ral	O
Ρ Ρ	β	rt ·γΗ	X CO	3 ε	3
β -ο	ra	> β	ra ífr	ε ρ|
β= ε	Ρ	•Η Φ	β kO	ο ο	o
« ε		Ρ Ρ	•ri rH	φ ο ε	ra
ρ ra ra	ο	ra ο	rH ··	3 φ	3
> 3	σ'	tora	ra ω	Ή φ	SH
ο ι σ’	<\ι	3ρ	W í>-	Β< Η	8
3 ·Η		•ο ο	•	ra ra	ra
ra ra ral		β β	04 C	ra ·η β	ra
ra > β		Ο bC	• ω	rH EH 3	rH
3= P|	Ρ	Ο<	P P	P PP	P

< Ο rl —« ο ν c <-· ι σι •Γ , r-« OO CM

Ο « 9έ ’Μ· δ ο.αααα

Ο

ΟΙ

<Μ

S

ΙΛ

C

ο

<J

<\Ι

<*»

«Μ

Ο

«-4

a

ο.

<ο

«ο

09

CM

09

Μ

Ο

ιη

ιη

σ»

ιη

ω

ο

Ή

β

*β

-ρ

β

φ

S

ο

ο

- 03

0) Ο β ε •Η ·Η Ο β β Ό <Φ β β Ή Φ W «β

φ β « ο

η

ο

CM

§

Ο

α>

•σ

ν»

ο

ο

ι

to

CL

CO

•

ro

ιχ>

*"Ο

Ο.

η

to σ» co

• CM CM

• 4> Ρ·* V. V0 3 tO 44 Λ. *Ο ν as

1

»—·

«

LO

LO

LO

!

t—«

LO

LO

LO

LO

1

σ»

σ»

σι

σι

1

σ»

OO

VO

LO

LO

LO

oa

CM

•

•

•

4—4

4—4

1

O

ro

r«.

•r—

4F·

•F·

•r—

E5

ro

CM

r>*

CL

r*

►-

3-“

3—

r-

O

o

CM

ro

CL

a—"4

a—4

CX

cx

CL

CL

o

CM

O

O

•

CL

rH ·

r4

Λ

44

44

A

Λ

*

o

OL

CL

CM

CM

ro

CM

CM

CM

CM

CM

.

*P

a

CM

CM

«c

-CM

CM

CM

CM

CM

!

-_J

ro

LO

«

44

«n

as

ro

ro

«O

CO

CO

CO

•ΓΊ

o

lo

«L-

«4-

ac

oe

ca

oe

oe

ae

oe

oe

o

Φ

CM

ae

CM

CM

ta

oo

o

co

oo

aa

oo

oo

CM

fe

CL

CL

O.

CL

cx

cx

CX

CL

CL

CL

CL

CL

CL

u-

. 44

01

σι

1

cO

•o

CM

β

P

jg

«

-P

?Λ

o»

o

β

S>

ro

«»>

»L-

CM

M

Φ

•H

f-H

01

0»

w

Pm

A

o

Ό

44 *

CO

r~» .

ro

eo

OO

lo

M·

co —1

CO

r-í

<D

§

CM

CM

4-.

CM

r—4

f4

4—4

ac

as

CM

CM CO

CM

φ

,Ω

Λ

E-t

£ §

I

β

03

β

β Ο Ο «Η

Ρ<

β ε

χ} φ •Η X Ν ί£)

Ο ^C β Λ Ρη "β

β

Η

β

φ

-Ρ

ο ·

β ο PQ -ρ

- φ

ο

φ ··

•d Φ

£& 03-Η β -Ρ .-Η 03

pq w

ΛΙ

·»

cm

							ΙΑ	ΙΟ		to
							·»►
							tO	tO		»
•										to
CM	.Ω .	to	ro ;					r·^	CO
								p».		« -
tO	to	to	to	CO		co	Μ ’	to	to	«—· co

•

4J t*.

44 «*»

« #

W

^4

·—1

1

1

•

CM

ro

Ol

O

O

ro

»4

o»

α

CL

<

*x

3C

•

•

♦

O

σι

4-»

44

44

o

flO

u

U

u

1

1

•

* 1

oo

oo

CM

CM

co

CM

CO

ro

«·.

H-

tfr.

tt-

01

•

•

•

O

o

O

O

O

CM

CM

CM

CM

CM

co

ro

co

r*

4"M

CM

CM

*£

CL

CX

CL

CL

α

CL

Ω>

OL

CL

CL

CX

CX

CL

CL

I

-64-

m

o

•rl

P

XC

-P

tí

Φ

S

O

o

*) |

I

II !

i

t

• ro ra o Q3 S

•rl *rl

Ο β tíO «U C! P -rl 0» M

<4-1

0) 2 CC O

!!

Tabela ld

un

m

0

P

I 2 03 bO 4-> -rl tí&4 Φ

0) 03

s^c

p4 03

s*

ra

0

O 2 r-l O P4

a ο Φ

x) X

•rl W N

3 o xí C o

P o Pu XJ

03

•rl

P

XD

P

O

03

pq

o Φ x) x-i B ra of ·—ι PU

Φ

&

τΊ

+»

O

W

in

O

un

m

eu

uo

px

m

cu

	1	1
	CO	eo
	un	m
	μ-
ΙΛ	ο.	cx
σ>
co	—	«k
α	co	eo
	•	•
	m	co
o	eo	co
σι	ϋ	àé
CM	|	1
3 O.	m	vo
ϋ cu	£

px «o

un

CM

in

ou

»·

in

•—4 *>X CO		CM -	px ·>. «O	co Χχ UO	CM	px	co	»“4 »—X
1	1	1	>X	'X.	1	1	1	1	•
O	*o	uO	ou	Ol	ou	ou	ou	ou	σι
o»	Ol	σ»	OU	ou	CM	CM	CM	CM	co
			xr	•Μ-	IA	IA	UA	IA	m
<x	Ck	eu	A	α.	CL	CU	CU	CU	Ck

-65Plasmídeo, Bactéria, Produzida ou usa Apresentada Referências, Comentários,

Estirpe, etc. da no Exemplo na figura Feita com ou Sinónimos

	•	,
	r—(,	φ
	col	φ
'«0		ra
	ρ|	Φ
β	φ|	Α=>
Ή	•
O	β *—ι	ο
β	3 ν	ω
<Φ	ω «	Φ
Ρ	[>	«Η
ra	• ΚΛ	Ό
Ή	ε ··	•Η
m	•σ'	β
φ	ω οο	φ
Ρ	CVJ	Ρ
		ο
»»	4- Φ	C0
β|	• β	/3
C0	IX- β
o|co	Ο-Ρ	Φ

β φ ·Η X) o

ι—I 0$

Φ

P

β

O

«H

fb ·“I

I CO ο σ'

«Sj fi

β

O S Ρ Φ o

Φ o > "d

o

tz

uj|

	σ»	to
Ο		m
ζ	cm|
		1
•	φ
ο	δ	CM
	o	··.
«ο		^1
«ο
σι	co	ω
	r».	c
	cn	0«
	t-4	o
•σ.
ο
ο	·— I	co
ae	*”l	r*>
		m
•	-»-»1
co co	«1
• r“t
A «-·	u	u
		«o
•Λθ|	>	>
— Hl
<—Γ	r—	PM
ol ·	3	3
ul·-	co	GO
ro
•—	•	•
ui|co	u.	U.

ω

o

u

aí

φ

P

β

Φ

r4

£

H

&

Φ

			ra
			«s
	co	r»
			Φ
CM	to	to	β	a	00
1		\	Φ		u>
tO σι	Ol Ol	σι σι	4j£>		<->
	V	.τ-	«c	03
Q.	CL	α.	n-	tf	o»
			CM	«H
» «O	* «O	«. to	c		«k Λ
<Ç	«o <	to <	o l_	CM c*>	Ot CM
	Ι-		ie JS	oc co	g
o.	Ο.	o.	o	&	o.

CM

cm

*>

ro

CM

rro

CM

ro

σι

CM tO CO

^- CM rl CO

o

&

•H

£

CM

«M

I

O»

en

tn

(X

				CM
tn	to			e
1	1			o
o»	o»		•	u	UI
*5	ro	tn	r·*	<o
tn	tn	O	r*	JC	o
cx	A	t-	r*	o	o

O CM

5 8

ac

CM

CM

ro

s

>n

CM

ro

s

Tabela 2

NRRL 8-15372	A.tumefac1ens/p529-2
NRRL 8-15373	A.tumefac1ens/p529-8
NRRL B-15374	A.tumefaclens/p539-5
NRRL B-1537S	A.tumefacíens/pS39-9
NRRL 8-15377	A. tumefaciens/pC58-nop-KB#3
NRRL B-15378	A. tumef aciens/pC58-nop-KBf5
NRRL 8-15381	E.coli. K802/pKS-05-KB3.0
NRRL B-15382	E.coli K802/pKS-nopIV-KB3.8f3
NRRL B-15383	E.coli K802/pKS-nopIV-KB3.8f5
NRRL 8-15379	A.tumefactens/p529-ll
NRRL B-15384	E.coli K802/p499/6/7
NRRL B-15385	E.coli K802/P499/6/8
NRRL B-15386	E.coli K802/p490/6/2
NRRL 8-15388	E.coli. K802/p490/6/l
NRRL 8-15389	E.coli K802/P395
NRRL 8-15390	E.coli K802/p376

ftiM. k.i.·'

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1*. - Método para modificar genéticamente uma célula vegetal, caracterizado por se efectuar os passos de:

   (a) inserção de um gene vegetal compreendendo um promotor vegetal e um gene estrutural vegetal em T-DNA, for mando assim uma combinação T-DNA/gene vegetal, estando o promotor vegetal adjacente à extremidade 5' do gene estrutural vegetal e estando o gene estrutural vegetal a jusante do promotor vegetal na direcção da transcrição; e

   (b) transferência da combinação T-DNA/gene vegetal para uma célula vegetal.
2. 2*. - Método de acordo com a reivindi cação 1, caracterizado por compreender ainda, após a execu ção do passo (b), o passo de:

   (c) detecção da expressão do gene estrutural vegetal numa célula vegetal contendo a combinação T-DNA/gene vegetal.
3. 3^a. - Método de acordo com a reivindi cação 1, caracterizado por o gene estrutural conter um ou mais intrões.

   44. - Método de acordo com a reivindi. cação 1, caracterizado por o gene vegetal codificar uma proteína acumulada em sementes.

   5^a. - Método de acordo com a reivind_i cação 1, caracterizado por o gene vegetal codificar faseolina.

   64. - Método de acordo com a reivindi. cação 1, caracterizado por a combinação T-DNA/gene vegetal

   -68ser mantida e replicada antes do passo (b) como parte de um

   vector "vai-vem” ("shuttle vector").

   í

   i 7*. - Método de acordo com a reivindij cação 1, caracterizado por o gene vegetal ser inserido em i T-DNA do tipo octopina na região tml ou ”1,6”.

   j· 8*. - Método de acordo com a reivindijj cação 1, caracterizado por a célula ser de uma planta dicolj tiledónea.

   il
4. 4

   : 9*.- Método de acordo com a reivindi'í cação 8, caracterizado por a planta dicotiledónea ser um !l membro das Compositeae ou das Leguminoseae.

   (r

   10*. - Planta, tecido vegetal ou célula vegetal, sempre que produzidas de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 1-9·