JPS62285791A - 被覆タンパクを有するウイルス抵抗性植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、　Ｅｌの詳、旧なｉ′月 （産業上の利用分野） 本発明は、ｉｆｆｆｆ玉子工学び植物農業分野に関する
。特に、ウィルス性被覆タンパクの合成を措示する植物
発現外来遺伝子を含をするべく植物の形質転換を行うこ
とによって、ウィルス抵抗性植物を生成する手段を提供
する。さらに、このような植物発現１１１ＮＡを運搬す
る植物形質転換原核プラスミドヘクター、およびこのよ
うなベクターによって形質転換された植物細胞も提供す
る。

（従来の技術） アグロバクテリウムの既論 ダラム陰性属のアグロバクテリウム（ハ皿−ｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　）のビルレント株は、　Ａ、ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ中にＴｉ　（腫瘍または、形質転換を引き起こ
す）プラスミド（ｐＴｉ）を、そしてＡ　、　　７　中
ニＲｉ（根を誘発する）プラスミド（ｐＲｉ）として知
られている大きなプラスミドを有する。これらはしばし
ば、それらが代謝したり、あるいは合成がひきおこされ
るオピンにより分類される。ＴｉおよびＲｉプラスミド
は２両者共、　Ｔ−ＤＮＡ　　（転移ＤＮＡ）として知
られている・ＤＮＡ配列を含有している。これは。

腫瘍中においては、宿主植物のゲノムへ組み込まれるこ
とがわかっている。いくつかのＴ−ＤＮＡ　ｉｌｌ伝子
転子構造上正準形の真核生物プロモーターと類イ以して
いるＴ−ＤＮＡプロモーターの調節下にある。

これらのプラスミドもまた。　Ｔ−ＤＮＡ令頁域外で、
遺伝子を運搬する。ＴｉおよびＲｉプラスミドは、数多
くの目的において２機能的に同等である。

蝕ぽ且Ｉ旦ｔｅｒ上胛−により引き起こされる疾患、植
物形質転換、遺伝子工学および遺伝子発現についての総
論は１次の文献を含み、もしくは次の文献中に見出され
る：　Ｍｅｒｌｏ　ＤＪ（１９８２）　Ａｄｖ、　Ｐｌ
ａｎｔＰａＬｈｏｌ、上：　１３９−１７８　　；　Ｒ
ｅａｍ　ＬＷおよびＧｏｒｄｏｎＭＰ（１９８２）　５
ｃｉｅｎｃｅ　２１８：８５４−８５９；　Ｂｅｖａｎ
　ＭＷおよびＣｈｉｌｔｏｎ　Ｍ−Ｄ（１９８２）八ｎ
ｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　！ｔシ：３５７−３８
４　；Ｋａｈｌ’Ｇおよび５ｃｈｅｌｌ　Ｊ（１９８２
）Ｍｏ土ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｊｇｚ−ｏｆ　Ｐｌａｎ
ｔ　Ｔｕｍｏｒｓ　　；　Ｂａｒｔｏｎ　ＫＡおよびＣ
ｈｉｌＬｏｎ　Ｍ−ＤＣ１９８３）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、　１０１　：５２７−５３９；Ｄｅｐｉｃ
ｋｅｒ　Ａら、　　　（１９８３）　　、　　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ　　Ｅｎ　　１ｎｅｅｒｉｎ　　　ｏｆ　　Ｐｌ
ａｎｔｓ：ａｎ　Ａ　ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｅｒｓ
　ｅｃｔｉｖｅ、　ｅｄｓ、　　：　Ｋｏｓｕｇｅ　Ｔ
ら、　ｐｐ、　　１４３−１７６；Ｃａｐｌａｎ　Ａら
、　　（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ２２２　　：　８
１５−８２１；ｌ１ａｌｌ　ＴＣら、ヨーロッパ特許出
願第１２６．５４６号；　Ｂ１ｎｎ５　ＡＮ（１９８４
）　０ｘｆｏｒｄ　５ｕｒｖｅｙｓＰｌａｎｔ　Ｍｏ１
．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、土：　１３０−１６０；　ｌ１
ａｌｌ　ＴＣ（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ　５ｕｒｖｅｙ
ｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　２　：　３
２９−３３８；Ｈｏｏｙｋａａｓ　ＰＪＪおよび５ｃｈ
ｉｌｐｅｒｏｏｒｔ　ＲＡ　（１９８５）、　　　Ｔｒ
ｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１０　：　３
０７−３０９；　Ｔｈｏｍａｓ　ＴＬおよび１（ａｌｌ
　ＴＣ（１９８５）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　　３　：　１
４９−１５３　；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＾およびＷｅｉｓ
ｓｂａｃｈ　Ｈ，ｅｄｓ、　（１９８６）Ｍｅｔｈ、　
Ｅｎｚｙｍｏｌ、Ｌｉ２　　（特に、　Ｒｏｇｅｒｓ　
ＳＧら、　ｐｐ。

６２７−６４０を参照されたい）；Ｐｉｉｈｌｅｒ　Ａ
、　ｅｄ、（１９８３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ−
ＰｌａｎｔＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　；および５ｃｈｉ
ｌｐｅｒｏｏｒｔ　ＲＡ（１９８４）　１ｎＥｆｆｉｃ
ｉｅｎｃ　　ｉｎ　　Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎ　　
（Ｐｒｏｃ、Ｌｏｔｈ　Ｃｏｎｇｒ。

Ｅｕｒ、　　八５ｓｏｃ、　　Ｒｅｓ、　　Ｐｌａｎｔ
　　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）、　　ｅｄｓ、　　：　　Ｌａ
ｎｇｅ　　Ｗら、　ｐｐ、　２５１−２８５゜ 植物細胞は、既知のいくつかの方法を用いて。

初Ｆ仝０旦り」痕Ｕ−により形質転換され得る。最近の
研究の総論では、　５ｙｏｎｏ　Ｋ（１９８４）　０ｘ
ｆｏｒｄ　５ｕｒｖｅｙｓＰｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｃｅ１
ｌ　Ｂｉｏ＋、上：　２１？−２１９を参照されたい。

担げ旦肋旦υ狂カリ−の植物組織への感染は、当業者に
既知の単純な方法である。典型的、には、植物に傷を付
けた後、バクテリアの懸濁液を植物に接種する。あるい
は２例えば１葉板（ｔｌｏｒｓｃｈ　ＲＢら、　（１９
８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７　：１２２９−１２３１
）により組織片に接種を行う。野生型の飴Ｕ且１ｓ達狂
頂」−を用いた誘導後。

腫瘍は、植物ホルモン非依存性成長が可能となる。

伝統的な接種および培養技術は、ホルモン非依存性成長
ができない無防備のＴ−ＤＮＡヘクターを使用するため
に、修正され得る（例えば、　Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　Ｐ
ら、　　（１９８４）ｉｎ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　
１ｎｅｅｒｉｎ　、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ。

ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　　６　、　ｅｄｓ、　：　
ｌ１ｏｌｌａｅｎｄｅｒ　ＡおよびＳｅｔｌｏｗ　Ｊ、
　ｐｐ、　２５３−２７８を参照されたい）。

八ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍはまた。単離細胞、培地中で
生長した細胞、カルス細胞、および単離プロトプラスト
を感染させることが可能である（例えば。

Ｆｒａｌｅｙ　ＲＴら（１９８４）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ
１．旧ｏ１．３　：　３７１３７８　　；　Ｆｒａｌｅ
ｙ　ＲＴおよびＨｏｒｓｃｈ　ＲＢ　（１９８３）　。

Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　　ｏｆ　Ｐｌ
ａｎｔｓ：ａｎ　Ａ　ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｅｒｓ　
ｅｃｔｉｖｅ、　ｅｄｓ、　：　Ｋｏｓｕｇｅ　Ｔら、
　ｐｐ、　１７７−１９４：Ｍｕｌｌｅｒ　Ａ　ら、　
　（１９８３）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、　１２３　：４５８−４６２）　、接種され
たカルス片の形質転換頻度は、オピンまたはオピン前駆
体の添加により上昇し得る（Ｃｅｌｌｏ　ＬＭおよび０
１ｓｅｎ　ＷＬ、米国特許第４．４５９，３５５号）。

クラウンゴール発生の宿主域は、虱遺転子のようなＴ−
ＤＮＡ−コード化機能によって影響を受は得る（Ｉｌｏ
ｅｋｅｍａ　Ａ　６　（１９８４）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、　１５８：３８３−３８５；）Ｉｏｅｋｅｍ
ａ　Ａ　；、ｙ　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、　３　：
　３０４３−３０４７　；　Ｂｕｃｈｈｏｌｚ　ＷＣお
よびＴｈｏｍａｓｓｈｏｗ、ＭＰ　、（１９８４）１３
０　：３２７−３３２；Ｙａｎｏｆｓｋｙ　Ｍ（１９８
５）門ｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

２０１：２３７−２４６）。」ｋ遺伝子もまた。宿主域
に影響を与える（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、前出）　。Ａｌ５
ｉｃｈ　ＲＬ、ヨーロッパ特許出願第１０８．５８０号
には、　Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからのＴ−ＤＮＡ
の緑藻細胞への転移およびそこにおけるｏｃｓおよびＴ
ｎ５カナマイシン抵抗遺伝子の発現が報告されている。

ｔｌｏｏｙｋａａｓ−ｖａｎ　５ｌｏ（ＨｔｅｒｅｎＧ
？’ｌＳ　ら、　　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３旦
ニア６３−７６４．および１１ｅｒｎａｌｓＬｅｅｎｓ
　Ｊ−Ｐら、　　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、　　３　
：３０３９−３０４１は１通常の腫瘍形成を伴うことの
ない知見−ｂａｃｔｅｒｉｕｍによる単子葉植物細胞の
形質転換について述べている。

形質転換された植物のＴ−ＤＮＡ　、無防備の（ｄｉｓ
ａｒｍｅｄ）Ｔ−ＤＮＡ　、および機能的外来遺伝子は
１通常は、優生的に密接に連鎖した。メンデルの法則で
外観的には変化せずに、減数分裂により子孫に伝達され
る（例えば、　ｌ１ｏｒｓｃｈ　ＲＢら、　（１９８４
）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：４９６−４９８；Ｔｅｐ
ｆｅｒ　Ｄ　（１９８４）　Ｃｅ１ｌ　　３７　：　９
５９−９６７；ＤｅＢＩｏｃｋ　Ｍ　ら、　　（１９８
４）　ＥＭＢＯＪ、　３　：　１６８１４６８９：ＷＢ
ｓｔｅｍｅｙｅｒ　Ａら、　　（１９８４）Ｍｏ１．　
Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１９４：５００−５０７；Ｗ
ａｌｌｒｏｔｈ　Ｍら、　　（１９８６）、　Ｍｏ１．
　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

２０２：６−１５を参照されたい）。２つの非結合Ｔ−
ｒｌＮＡは、単一細胞を形質転換させることが可能であ
り。

植物再生後、　Ｆ１世代において分離され得る（ｄｅＦ
ｒａｍｏｎｄ　ＡＪら、　　（１９８６）　Ｍｏ１．　
Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０２　：１２５−１３１）
。

ＴｉプラスミドＤＮへ Ｔ−ＤＮＡは、しばしば核の複数の部位において。

宿主ＤＮＡへ組み込まれる（すなわち、挿入される）。

側面に位置する植物ＤＮＡは、繰り返し、あるいは低コ
ピー数配列であり得る。組み込まれたＴ−ＤＮＡは、直
接もしくは逆方向直列配列において見出され、スペーサ
ーで分離され得る。Ｔ−ＤＮへもまた。

葉緑体を形質転換させ得る（Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ　Ｍら、
　（１９８５）ＥＭＢＯＪ、↓：　１３６７−１３７２
　；　Ｆｌａｖｅｌｌ　ＲＢ　（１９８５）Ｂｉｏａｓ
ｓａｙｓ　３　：　１７７−１７８による総論を参照さ
れたい）。

ＡＴＣＣ１５９５５，ｐＴｉ１５９５５に見出されるオ
クトピン型プラスミドのＴ−ＤＮＡの完全な配列につい
ては。

ｐＴｉＡｃｈ５のＴＬ領領域Ｇｉｅｌｅｎ　Ｊら、　（
１９８４）　ＥＭＢＯＪ。

３　：　８３５−８４６）と同様に報告されている（Ｂ
ａｒｋｅｒ　ＲＦら、　　（１９８３）　Ｐｌａｎｔ　
Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２　：３３５−３５０）。発表
されたＴ−ＤＮＡ遺伝子は、イントロンを含まない。

正卓形の真核生物プロモーター要素およびポリアデニレ
ーション部位に類似した配列が認められ得る。

オクトピンＴｉプラスミドは、オクトピンシンターゼ（
リソピンデヒドロゲナーゼ）をコードする旦遺転子を運
搬する。Ｋｏｎｃｚ　Ｃら、　（１９８３）ＥＭＢＯＪ
。

ニー：　１５９７−１６０３は１匹との機能的分析を提
供して。

いる。Ｄｈａｅｓｅ　Ｐら、　　（１９８３）ＥＭＢＯ
Ｊ、　　２　：　４１９−４２６゜は、“転写７”（Ｂ
ａｒｋｅｒ　Ｒら、　（前出）の０ＲＦ３）およびｏｃ
ｓによる種々のポリアデニレーション部位の利用を報告
している。Ｍｉ繊織中酵素オクトピンシンターゼの存在
は、アミノエチルシスティンのようなさまざまなアミノ
酸類似物の毒性効果から、このＭｉ織を保護し得る（Ｄ
ａｈｌ　Ｇ＾およびＴｅｍｐｅ　Ｊ（１９Ｂ３）　Ｔｈ
ｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、６６　：　２３３
−２３９；ＫｏｚｉｅｌＭＧら、　　（１９８４）　　
Ｊ、　　Ｍｏ１．　八ｐｐ１．　　Ｇｅｎｅｔ、　　　
２　　：　　５４９−５６２）。

ツバリンＴｉプラスミドは、ツバリンシンターゼ遺伝子
（ｎｏｓ　）をコードする（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　Ａ　ら
、　　（１９８２）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅ
ｎｅｔ、上：　５６１−５７３により配列決定された）
　。Ｓｈａｗ　ＣＨら、　　（１９８４）　Ｎｕｃｌ、
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１２　：　７８３１−７８４６．
は、赳シの機能的分析を提供している。ｔｍｓおよびｔ
ｍｒと同等な遺伝子は、ツバリン型プラスミド上におい
て確認されている（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　Ｌら、　　
（１９８３）　Ｃｅ１ｌ　３２　：　１０４５−１０５
６）。

Ｔ−ＤＮＡ　領域外のＴｉおよびＲｉプラスミド遺伝子
は。

■Ｌ遺伝子を含有しており、これは、変異すると無発病
性のＴｉプラスミドとなる。ｔｒａｎｓにおけるｖｉｒ
遺伝子機能は、異なったプラスミド型のＴ−ＤＮＡと共
に、植物細胞の形質転換をひきおこし得、これは、？Ｉ
Ｊ理的に他のプラスミド上に局在している。

このような配置は、二元システムとして知られ。

Ｔ−ＤＮＡを有するプラスミドは、一般的にミクロＴｉ
プロモーターとして知られている。この二元システムお
よびミクロＴｉプラスミドには１次のものが包含される
：　Ｈｏｅｋｅｍａ　Ａ　　ら、　　（１９８５）　Ｉ
’１ａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　　５　：　８５−８９；　Ｄｅｂｌａｅｒ
ｅ　Ｒら、　　（１９８５）　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３　：　４７７７−４７８８；
ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎ　Ｐ　ら。

（１９８５）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．８ｉｏ１．　５　
：　１４９−１５４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ叶、米国特許第
４，５３６，４７５号Ｈｄｅ　ＦｒａｍｏｎｄＡＪら。

（１９８３）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、上：　２６２−
２６９；Ｈｏｅｋｅｍａ　Ａ　ら。

（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３　；１７９−１８
０；旧ｌｉｅ　Ｊら、　　（１９８４）Ｊ、　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、′￥￥８　：　７５４−７５６　：　Ｉ（
ｏｅｋｅｍａ　Ａ　ら。

（１９８４）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５８　
：　３８３−３８５：＾ｎＧ　ら。

（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、±：　２７７−２８４　；
　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＤＭ　、米国特許第４．５３６，
４７５号ＨＫｌｅｅ　ＨＪら、　　（１９８５）Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ、　　３　：　６３７−６４２）　；　
ｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄ　ＡＪ　ら。

（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ　、　
２０２：　１２５−１３１；Ｄａｈｌ　ＧＡら、ヨーロ
ッパ特許出願第１４０，５５６号；およびＢｅｖａｎ　
　Ｍ（１９８４）　　Ｎｕｃｌ、　　八ｃｉｄｓ　　Ｒ
ｅｓ、　　　４≦２　　：　　８７１１−８７２１　　
。

Ｔ−ＤＮＡは、植物細胞を形質転換するために、プラス
ミド上にある必要はない；染色体に局在しているＴ−Ｄ
ＮＡは、ａ能的であるＣＩＣｌ１ｏｅｋｅ　Ａ　ら、　
　（１９８４）口ＢＯＪ、　　３　：　２４８５−２４
９０）。Ｔ−ＤＮＡは、左および右縁に関連する（例え
ば、　Ｔ−ＤＮＡ　／植物ＤＮＡ連結に関連する）約２
５の塩基対の直接的な繰り返しを有する。これは、ｍヶ
ｌｙ口：ｅｒｉｕｍ−カ）らの重云手多、あるいは宿主
ゲノムへの組み込みのどちらかを包含し得る。Ｔｉプラ
スミド決定特性については、　Ｍｅｒｌｏ（：前出）（
特に５表■を参照）、および、　ＩｌｅａｍおよびＧｏ
ｒｄｏｎ　（前出）により総論が述べられている。

外米遺伝子１現 豆ファセオリンをコードする遺伝子は、転移され、ヒマ
ワリ腫揚中に発現される（Ｍｕｒａｉ　Ｎら、　（１９
８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２２　　：　４７６−４８
２）。このファセオリン遺伝子は、タバコの種子を発育
させる上で、高レベルで発現された（Ｓｅｎｇｕｐｔａ
−Ｇｏｐａｌａｎ　Ｃら、　（１９８５）　　Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔｌ、　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｔｌｓ
Ａ　　　８２　　：　　３３２０−３３２４）。同様な
結果が、相同遺伝子、大豆ｂａ　ｔａ　−コングリシニ
ンについても観察されている（ＢｅａｃｈｙＲＮら、　
　（１９８５）ＥＭＢＯＪ、±：　３０４７−３０５３
）。単子葉植物Ｚｅａ肌■からの、胚乳タンパクゼイン
の遺伝子は、ヒマワリのカルスＭｌ織中で転写される（
Ｍａｔｚｋｅ　ＭＡ　　ら、　　（１９８４）ＥＭＢＯ
Ｊ、　　３　：　１５２５−１５３１）。

豆ＲｕＢＰ−Ｃａｓｅ小サブユニット遺伝子の発現は９
形質転換されたペチュニア細胞中において光調節される
。この生成された豆の小サブユニットタンパクは２葉緑
体内で正しくプロセッシングされ、配列決定される（Ｂ
ｒｏｇｌｉｅ　Ｒら、　（１９８４）　５ｃｉｅｎｃｅ
２２４　　：　８３８−８４３）。この光誘導性を包含
する配列。

および最大発現に必要な配列は同定されている（Ｍｏｒ
ｅｌｌｉ　Ｇ　　ら、　　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ
　３１５　　：　２００−２０４　：Ｎａｇｙ　Ｆら、
　　（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、↓：　３０６３−３０
６８；Ｔｉｍｋ。

１’ＩＰら、　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１８　
：５７９−５８２）　、小麦クロロフィルａ　／　ｂ結
合タンパク遺伝子の発現は５形質転換されたタバコ植物
において、光調節され。

そして器官特異的である（Ｌａｍｐｐａ　Ｇら（１９８
５）Ｎａｔｕｒｅ　　３１６　ニア５Ｏ−７５２）　、
大豆ヒートショック遺伝子は、ヒマワリの組織中におい
て温度誘導性である（Ｓｃｈｉ５ｆｆｌ　ＦおよびＢａ
ｕｍａｎｎ　Ｇ　（１９８５）　ＥＭＢＯＪ。

↓：　１１１９−１１２４）。（Ｄｒｏｓｏ　ｈｉｌａ
　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒヒートショックプロモータ
ーも同様に、タバコ組織において機能的である（Ｓｐｅ
ｎａ　Ａら、　（１９８５）Ｅ？’ｌＢＱ　Ｊ。

土：　２７３９−２７４３）　）。

Ｔ−ＤＮＡプロモーターを有するキメラ゛転子封しプロ
モーターは、形質転換された植物細胞の選択に有用な薬
剤抵抗性構造遺伝子の発現を導くことができる。抵抗遺
伝子は、カナマイシン（Ｂｅｖａｎ　ＭＷら、　　（１
９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０４　：１８４−１８７；
ＦｒａｌｅｙＲＴら、　　（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０　：
４８０３−４８０７：Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌ
ａ　Ｌら、　　（１９８３）ＩＥｌ’１ｌｌＯＪ。

２　：　９８７−９９５）、　　メトトレキセート（Ｈ
ｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、　（前出））、ク
ロラムフェニコール（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌ
ａら、　　（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３　：２
０９−２１３）、ヒグロマイシンＢ　　（ｖａｎ　ｄｅ
ｎ　Ｅｌｚｅｎ　ＰＪＭ　ら、　　（１９８５）Ｐｌａ
ｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５　：　２９９−３０２
）に対してつくり出された。ｌｌｃｌｍｅｒ　Ｇら、　
　（１９８４）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　２　：　５
２０−５２７は、プロモーターとＥ、　　ｃｏｌｉ＜−
ターガラクトシダーゼ（ＩａｃＺ）へ配列融合された」
匹の構造遺伝子の５°−末端とを有する融合遺伝子とを
つくり出した。このスクリーニング可能なマーカーを用
いて形質転換された植物組織は、適切な色素産生基質上
で生育された場合、特徴的な色によって認められ得る。

坦虹構造遺伝子（これもまた、プロモーターに与えられ
た）と、ヒグロマイシンＢ抵抗性およびファセオリン抵
抗性のための構造遺伝子間の融合タンパクがつくり出さ
れた。これらは機能的である（Ｗａｌｄｒｏｎ　Ｃら、
　（１９８５）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　
　５　：１０３−１０８．　Ｍｕｒａｉ　Ｎら、　　（
１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２２　：　４７６−４
８２）。ｏｃｓ−から誘導されるグリフォセート遺伝子
が構築されている（Ｃｏｍａｉ　Ｌら、　　（１９８５
）　Ｎａｔｕｒｅ　３１７　ニア４１−７４４）。

オクトピンＴＬ遺伝子０ＲＦ２４および０ＲＦ２５のプ
ロモーターもまた。構造遺伝子の発現を誘導する（Ｖｅ
ｌｔｅｎ　Ｊ　ら、　　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、　
３　：　２７２３−２７３０；Ｖｅｌｔｅｎ　Ｊおよび
５ｃｈｅｌｌ　Ｊ　（１９８５）　Ｎｕｃｌ、へｃｉｄ
ｓ　Ｒｅｓ。

１３　：　６９８１−６９９８ＨＧｅｌｖｉｎ　ＳＢ　
ら、　　（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　１９９　：２４０−２４８；　Ｃｏｍａ
ｉ　ｌ　ら、　　（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１７：
７４１−７４４）。

ノ直多プロモーターを　するキメラ゛４ｊ　−７’。

キメラＲｕＢＩ’−Ｃａｓｅ小すブユニット／カナマイ
シン抵抗性タンパクは９葉緑体内へ転移された（Ｖａｎ
ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋ　Ｇら、　　（１９８５）　Ｎａ
ｔｕｒｅ　３１３　：３５８−３６３）　。

この遺伝子のプロモーターは、クロラムフェニコールお
よびカナマイシン抵抗性遺伝子に対するカルスにおいて
光誘導性発現を与えろ（ｌｌｅｒｒｅｒａＥｓｔｒｅｌ
ｌａ　Ｌら、　　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１０
　＋１１５−１２０　；Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ　Ｄ　ら、
　　（１９８５）旧ｏｔｅｃｈｎｏ１．３　：　２４１
−２４６）。

カルコンシンターゼプロモーターもまた。カナマイシン
抵抗性遺伝子の光誘導性発現を誘導した（Ｋａｕｌｅｎ
　１１ら、　（１９８６）　ＥＭＢＯＪ、　５　：　１
−８）。クロロフィル土／互結合タンパクプロモーター
は、監およびカナマイシン抵抗性構造遺伝子を発現する
のに用いられてきた（Ｊｏｎｅｓ　ＪＤＧら、　（１９
８５）　ＦＭ［ｌＯＪ。

↓：　２４１１−２４１８　；　Ｓｉｍｐｓｏｎ　Ｊ　
ら、　　（１９８５）　ＥＭＢＯＪ。

↓：　２７２３−２７２９）。

ウィルス性プロモーターを有するキＶ！Ｊ！ｌ旺カリフ
ラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）プロモーターの制
御下におけるカナマイシン抵抗性遺伝子は、　Ｔ−ＤＮ
Ａにより形質転換された植物細胞中において発現された
（Ｋｏｚｉｅｌ　ＭＧ　ら、　　（１９８４）　Ｊ、　
Ｍｏｌ。

八ｐｐ１．　Ｇｅｎｅｔ、　２　：　５４９−５６２）
。ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの背後のメソトレキセ
ート抵抗遺伝子は、メソトレキセート抵抗性与えた（Ｂ
ｒｉｓｓｏｎ　Ｎ　ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３１
０：５１１−５１４）　、タバコモザイクウィルス被覆
タンパクは、　ＣａＭＶプロモーターの制御下で。

形質転換されたタバコ組織中に発現されている（Ｂｅｖ
ａｎ　ＭＷら、　　（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、↓：　
１９２１−１９２６）。

０ｄｅｌｌ　ＪＴら、　　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ
　　３１３：８１０−８１２．　　は。

転写に必要なＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの配列を地
図化した。

植′４のＡ　ｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍを　いないイ　転
植物細胞中へのＤＮＡの直接的な転移については。

最近総説が出されている（Ｊｏｎｅｓ　ＭＧに（１９８
５）　Ｎａｔｕｒｅ３１７　：５７９−５８０；Ｐｏｔ
ｒｙｋｕｓ　Ｉ　　ら、　　（１９８５）　Ｐｌａｎｔ
　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｔｒ、　３　：　１１７−１２８；
Ｈｏｗｅ　Ｃ（１９８５）　ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅＪ工
：　３８！３９．　Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　Ｊおよび５
ａｕｌ　ＭＷ（１９８６）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、　　１１８：６５９−６６８；Ｐｏｗｅｒ　ＪＢら
、　　（１９８６）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
１１８　：５７８−５９４）　、　双子葉および単子葉
植物細胞のいずれもが、コあるいはＣａＭＶプロモータ
ーのどちらかの制御下において、カナマイシン選択性マ
ーカーにより、直接的に形質転換され得る（Ｐａｓｚｋ
ｏｗｓｋｉ　Ｊら、　（１９８４）ＥＭＲＯＪ、　　３
　：　２７１７−２７２２；Ｇａｒｄｎｅｒ　ＲＣら、
　　（１９８４）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　　２　：　３−８；１ｌａｉｎ　Ｒ
ら。

（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　　
旦：　１６１−１６８　；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　［ら、　
　（１９８５）　Ｍｏｉ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　
１９９　　：１８３−１８８；Ｌｏｒｚ　ＩＩら、　　
（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

１９９　：１７８−１８２；Ｓ旧１１ｉｔｏ　ＲＤら、
　　（１９８５）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

３　：　１０９９−１１０３；Ｍｅｙｅｒ　Ｐ　ら、　
　（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、２０１　：５１３−５１８）　、異なった
ＤＮＡ分子は、植物細胞中へ共形質転換され得る；混合
物中のひとつのＤＮＡが１選択可能なマーカーを運搬す
るというのは有利なことである（Ｐｅｅｒｂｏｌｔｅ　
Ｒら、　　（１９８５）ＰＩａｎｔＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、
　５　：　２３５−２４６）。このような形質転換され
た細胞から再生された植物の子孫は、単一の優生のメン
デルの特性として、この形質転換ハイブリッド遺伝子を
受は継ぐ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、＋　（前出）。

ＣａＭＶは、植物形質転換ベクターとして有用であるこ
とか証明されている（Ｂｒｉｓｓｏｎ　Ｎら、　（１９
８４）Ｎａｔｕｒｅ　　３１０：５１１−５１４　；　
Ｂｒ１ｓｓｏｎ　Ｎおよび１ｊｏｈｎ　Ｔ（１９８６）
　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　１１８　：　６５
９−６６８）　、チャヒキ（Ｂｒｏｍｅｇｒａｓｓ）モ
ザイクウィルス（ＢＭＷ）　、　ＲＮＡウィルスもまた
。外来構造遺伝子を発現するために、植物中で使用され
得る（Ｆｒｅｎｃｈ　Ｒら、　（１９８６）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　　２３１　：　１２９４−１２９７）。

エレクトロポレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）ン去は、一時的な発現システムにおける植物細胞
中へ。

キメラ遺伝子を導入するために有用であることが証明さ
れている（Ｆｒｏｍｍ　Ｍ　ら、　　（１９８５）　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８２　：　５８２４
−５８２８）。そして、トウモロコシ細胞の安定した形
質転換のためにも有用であることが証明されている（Ｐ
ｒｏ＋＋＋ｍ　ＭＥら、　（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　
３１９ニア９ｌ−７９３）。

細胞は、膜で囲まれたＤＮＡを取り入れ得る。ＤＮＡ（
ｐＴｉ　ＤＮＡを包含する）は、リポソームにより（例
えばＤｅｓｈａｙｅｓ　Ａら、　　（１９８５）　ＥＭ
ＢＯＪ、　４　：　２７３１−２７３７）　、あるいは
植物とバクテリア細胞のそれぞれの細胞壁を除去した後
、それらを融合することによって（例えば、　Ｉｌａｍ
　Ｒら、　（１９８４）　ｒ’１ａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲｅ
ｐｔ、　　３　：　６Ｏ−６４）忠犬され得る。植物プ
ロトプラストは、細胞壁で区画されたｍ的虹肛旦り細胞
を取り込むことができる。Ｔ−ＤＮＡは、融合された葉
緑体から再生された組織へ転移され得る。

ＤＮＡは、微５に？主人（マイクロインジエクンヨン）
により、植物ゲノム中へ安定して組み込まれ得る（Ｃｒ
ｏｓｓｗａｙ　Ａら、　　（１９８６）　Ｍｏ１．　Ｇ
ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０２　：１７９−１８５）。

受精あるいは受粉中の植物細胞へのＤＮＡの導入につい
ては、　０ｎｔａ　Ｙ　（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８３　：　７１５−７１９．およ
びＺｈｏｕ　Ｇ−Ｙら、　　（１９８３）Ｍｅｔｈ、　
Ｅｎｚｙｍｏｌ、ｌＯｌ　：４３３−４８１によって、
それぞれ。

トウモロコシおよび綿について報告されている。

ＡＭＶについての　−、 アルファルファモザイクウィルス 分割−末鎖，正鎖１？ＮＡゲノムを有する植物ウィルス
のクラスのひとつである。このゲノム（サブゲノムＩ？
ＮＡ分子を除く）は、３つのＲＮＡ分子に分けられる。

このクラスには，次のものが包含される：アルファルフ
ァモザイクウィルス（ＡＭＶ）群、アイラーウイルス（
ｉ　Ｉａｒｖ　１ｒｕｓｅｓ）　＋　ブロモウィルス（
ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）　、　　ククモウイルス（
ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）およびホルデイウイルス
（ｈｏｒｄｅｉ−ｖｉｒｕｓｅｓ）　（ｖａｎＶｌｏｔ
ｅｎ−Ｄｏｔｉｎｇ　Ｌ　ら、　　（１９８１）Ｉｎｔ
ｅｒｖｉｒｏｌ、　ＩＦし１９８−２０３；Ｍａｔｌｈ
ｅｗｓ　ＲＥＦ　（１９８２）ウィルスの分類および体
系）。このゲノム分節は、別々に、異なった長さのバチ
ルス型粒子に囲まれている。３つのゲノムＲＮＡ成分（
ＲＮＡ１．　ＲＮＡ２およびＲＮＡ３）の他に、ウィル
ス標本中に、４番目のサブゲノムＲＮＡ　（ＲＮＡ４）
が見出される。３つのゲノムＲＮＡの混合物および少量
の被覆タンパクまたはそのメソセンジャーとともに、感
染を開始させるのにＲＮＡ４　（Ｂｏｌ　ＪＦら（１９
７１）　Ｖｉｒｏｌ、４６　：　７３−８５）が必要で
ある。

完全な配列のＡＭＶ　ＲＮＡ４が開示されている（Ｂｒ
ｅｄｅｒｏｄｅ　ＦＴら、　　（１９８０）、　Ａｃ１
ｄｓ　ｌ？ｅｓ、　８　：　２２１３−２２２３）。Ｒ
ＮＡ４は、その長さが８８１ヌクレオチドである。コー
ド領域は、３９ヌクレオチドの５゛−未翻訳領域および
１８２ヌクレオチドの３”−未翻訳領域が、側面に位置
する６６０ヌクレオチドである（開始および終止コドン
を含まない）。ＲＮＡ４の配列は。

ＲＮＡ３の３°−末端に存在し５位置する（Ｇｏｕｏｌ
ｄ　ＡＲおよびＳｙｍｏｎｓ　Ｒ１１（１９７８）　Ｅ
ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、９１　：２６９−２７
８）。

ＡＭＶ　ＲＮＡ３の完全なヌクレオチド配列が開示され
ている（Ｂａｒｋｅｒ　ＲＦ　ら＋　　（１９８３）　
Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ’Ｒｅｓ。

１１　：　２８８１−２８９１）。２４０塩基５゛−非
コート領域ハ。

９０３のヌクレオチド読み取り枠（ＯＲＦ）に先行して
いる。このＯＲＦの次には、４９の塩基シストロン内領
域および６６６のヌクレオチド０１２Ｆがある。この後
者のＯＲＦは、　ＡＭＶ被覆タンパクをコードする。

この被覆タンパク遺伝子の次には、１７９塩基３”−未
翻訳配列がある。　ＡＭＶ　ｌ？ＮＡ４は、　ＲＮＡ３
の３″末端と同一であり、それによって決定され、シス
トロン内領域の３６ヌクレオチド、被覆タンパク構造遺
伝子、および３゛−未翻訳配列を有する。

ＡＭＶ　ＲＮＡＩの完全なヌクレオチド配列が開示され
ている（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ　ＢＪＣら、　（１９
８３）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　　１１　：
　１２５３−１２６５）。Ｉ？ＮＡ　１は、その長さが
３６４５ヌクレオチドであり、９９ヌクレオチドの５゛
−未翻訳配列および１６３ヌクレオチドの３゛−未翻訳
領域が側面に位置するＭ、　１２５，６８５のタンパク
のＯＲＦを含有する。

これらの４つの＾ＭＶ　ＲＮＡすべでの３′−末端配列
の比較は、３゛末端１４０〜１５０ヌクレオチド間で大
きな相同性を示す（Ｉｌｏｕｗｉｎｇ　ＣＪおよびＪａ
ｓｐａｒｓ　ＥＭＪ（１９７８）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
１７　：　２９２７−２９３３）。ＡＭＶ　ＲＮＡの３
′−末端１４５ヌクレオチドにおいて、およそ２０の塩
基置換があるが、これらは、塩基対構造のループ中に位
置するか、または、　Ａ−Ｕ塩基対が、二次構築ヘアー
ピンの幹におけるＧ−Ｃ塩基対へ変換されている　（に
ｏｐｅｒ−Ｚｗａｒｔｈｏｆｆ　ＥＣら、　　（１９７
９）　Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓＲｅｓ、　７　：　１８８
７−１９００）。

（以下余白） 交ｊＩ記皿 交叉防御とは、ある株のウィルスによって感染した植物
が、関連ウィルスの他株による多重感染に対して未感染
の植物によりずっと感受性が低い現象のことを言う。交
叉防御、誘発された全身防御および感染中のウィルスの
相互作用、に関する講評には１次のものが含まれる。Ｆ
ｕｌｔｏｎ　Ｒイ（１９８２）Ａｃｔｉｖｅ　　Ｄｅｆ
ｅｎｓｅ　　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　　ｉｎ　　Ｐｌａ
ｎｔｓ、　　ｅｄ、：　　ＷｏｏｄＲＫＳ、　ｐｐ、２
３１−２４５；　Ｒｏｓｓ　ＡＦ　（１９７４）　Ａｃ
ｔａ　ｌ１ｏｒｔ、３６：２４７−２６０ｄ；　Ｄｅａ
ｎ　ＲＡおよびＫｕｃ　Ｊ　（１９８５）　Ｔｒｅｎｄ
ｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　３　：　１２５−１２９；
および５ｅｑｕｅｉｒａ　Ｌ　（１９８４）Ｔｒｅｎｄ
ｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２　：　２５−２９．交叉
防御は、八ＭＶについて証明されている（Ｓｃｈｍｅｌ
ｚｇｒ　Ｋ　（１９６３）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、　
Ｚ、　４６：　１７−５２；　”スノーボール　モザイ
ク　ウィルス”は、　ＡＭＶの同義語である）。

交叉防御の機構については、数多くの仮説によって説明
され得る（　Ｒｏ　ｓ　ｓ　＋前出ＨＦｕｌｔｏｎ、前
出；および５ｅｑｕｅｉｒａ、前出）。この機構は、す
べてのウィルスについて同一である必要はない（例えば
。

Ｆｕｌｔｏｎ、前出、　ｐｐ、２４０−２４１を参照の
こと）。ひとつの仮説によれば、植物組織中の被覆タン
パクの存在が、多重感染ウィルスによる感染の確立を妨
害する（ｄｅ　Ｚｏｅｔｅｎ　ＧＡおよびＦｕｌｔｏｎ
　ＲＷ　（１９７５）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、６５ｒ
　２２１−２２２　）　、しかしながら、交叉防御にお
ける被覆タンパクの役割は、まだ確立されていない。タ
バコモザイクウィルス（ＴＭＶ）株間の交叉防御に対す
るこのような仮説を支持する証拠が提示されている（Ｓ
ｈｅｒｗｏｏｄ　ＪＬおよびＦｕ　ｌ　ｔｏｎＲＷ　（
１９８２）　Ｖｉｒｏｌ、１１９　：　１５０−１５８
　）　、　しかし、被覆タンパクがＴＭＶ交叉防御に関
与しないことを示す他の証拠も存在する（Ｓａｒｋａｒ
　ＳおよびＳｍｉｔａＳｍｌｔａ　　　（１９ＥＨ）　
　　Ｍｏ１．　　　Ｇｅｎ、　　　Ｇｅｎｅｔ、　　　
１８４　　　：　　　１５Ｂ−１５９；　　　Ｚａｉｔ
ｌｉ■ Ｍ　（１９７６）　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、　６６：
　３８２−３８３　）　、ＡＭＶ株およびＴＭＶ株の交
叉防御に関する機構は、感染における被覆タンパクの役
割、ピリオン構造、被覆タンパク−被覆タンパク間の相
互作用の性質および被−環タンパクー核酸間の相互作用
の性質が、これら２つのウィルスでは異なっているよう
に、同じではあり得ない。

ウィルスに感染した植物細胞は、ピリオン（ウィルス粒
子）に組み込まれない被覆タンパク分子を本来含有して
いる。５ｅｑｕｅｉｒａ　（前出）は１次のことを示唆
している。すなわち、　ＴＭＶ被覆タンパクが、多重感
染しているピリオンの非被覆化の抑制に関与することが
証明されるならば、植物−発現性被覆タンパク遺伝子を
導入するために、　Ｔ−ＤＮＡベクターを使用すること
が有用である。Ｂｅｖｅｎ　ＭＷら（１９８５）　ＥＭ
ＢＯＪ、　８　：　１９２１−１９２６は、タバコ細胞
を形質転換させるために、このようなＴＭＶ被覆タンパ
ク遺伝子／ベクターの組み合わせを用いた。

低レベルのＴＭＶ被覆タンパクは、形質転換されたカル
ス）Ｊｉｍ中に蓄積されていたが、　ＴＭＶによる感染
からの防御については、報告されなかった。同様のベク
ター／遺伝子の組み合わせによって形質転換されたタバ
コ植物は、　ＴＭＶ感染に対する耐性を有し得るという
非公式な報告もある（例えば。

Ｂｉａｌｙ　ＨおよびＫｌａｕｓｈｅｒ　Ａ　（１９８
６）　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ。

４　：　９６；　Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｋ　（Ｆｅｂ、　１
９８６）　Ｇｅｎｅｔ、　Ｅｎｇ、　Ｎｅｗｓβ−（２
）：　１８）。

（発明の要旨） 本発明は、植物におけるウィルス感染の発生および経済
的に重要な植物種におけるこれらの感染に対して奮闘す
る園芸家および農学者の努力に関する。ウィルス感染は
、すべての既知の植物種において発生し、そしてすべて
の農業的および園芸的植物種の収穫および品質に著しい
減少をもたらす。このようなウィルスによって起こる損
害を免れる植物産業は１世界中のいかなる国にもみられ
ず、またこのようなウィルス感染を処理したり。

あるいは防御したりする一貫した治療法も知られていな
い。例えば、ケニャのカサヴア植物の９０％は、カサヴ
アモザイクウイルスに感染しており。

そのことにより収穫が７５％減少していると推定されて
いる。別の例としては、ガーナにおける最近のウィルス
性伝染病で１億以上のカカオの木が。

スウォーレンシュー）　（ｓｗｏｌｌｅｎ　５ｈｏｏｔ
）ウィルスの感染によって失われた。ウィルス性伝染病
および感染が、大きな経済的重要性を有することを明ら
かに得る他の例が数多く存在する。食糧作物の収穫の減
少も２着実に増加する世界の人口およびすでに存在する
慢性的な栄養不良に関連している。

従って、耐ウィルス性植物遺伝子型を生成する方法およ
びその結果得られる植物自体の両方が１世界の自給自足
の能力を増大させるために、極めて有用であることは明
らかである。

特に、アルファルファモザイクウィルスが１作物収穫の
重大な減少をもたらすことが示されている。ＡＭＶは、
アルファルファおよび他の一年生マメ科作物を感染させ
る。このことは、経済的に重要なことである；合衆国だ
けでも約３千万ニーカーにアルファルファが植えられて
いる。アルファルファモザイクウィルスは、さらに胡楊
、馬鈴薯。

セロリ、エントウ豆およびインゲン豆のような作物植物
において、経済的に重大な病気をもたらす。

アルファルファは、ありまきがウィルスを運搬する越年
性の宿主であり得る。このありまきの感染の形成に続い
て、この病気は、さらにアルファルファから他の品種植
物へと広がる。多くの場合。

ＡＭＶに感染した植物は、何ら症状を示さないため。

この病気の発生およびその拡がりを検出するのが困難で
ある。その他の場合、このモザイク病は明らかになるが
、それまでにこのウィルスは、はとんど確実に田畑の大
部分の植物に広がっている。

感染した植物の除去、およびウィルスを運搬するありま
きを殺すための殺虫剤の使用は別にして。

ＡＭＶの広がりを防ぐために開発された実際的な方法は
ない。従って、耐ＡＭＶ性遺伝子型を生成する方法およ
びその結果得られる植物の両方であれば。

数多くの作物の農業的生産性を高めるために極めて有用
であることは明らかである。

従って、新規の耐ウィルス性遺伝子を有する植物を提供
すること、特にＡＭＶ感染に対して耐性を存する植物を
提供することが１本発明の目的である。この目標に向け
て、耐ウィルス性遺伝子を生成するための方法、特にウ
ィルス複製の被覆タンパク遺伝子による抑制が提供され
る。さらに、耐ウィルス性発現型を有する植物材料のも
とになる被覆タンパク遺伝子を含有する植物、植物細胞
。

植物組織および植物種子が提供される。さらに。

このような耐ウィルス性植物を生成するために有用なり
Ｎ４分子についても述べられる。本発明は。

被覆タンパク遺伝子を、タバコ中へ移入することによっ
て例証される。この被覆タンパク遺伝子は。

翻訳可能なアルファルファモザイクウィルス被覆タンパ
クをコードする転写中に転写される。

自然界において、植物細胞は上記ウィルスに感染しない
限り、ウィルス性被覆タンパクを含有しない。感染した
植物は、被覆タンパクに加えて。

完全なウィルスゲノムを含有する。一般に、植物細胞は
、ウィルス感染しなければ、被覆タンパクを含有を生じ
ない。このことは、　ＡＭＶの場合、真実であると考え
られる。しかし、この説に対する例外は植物−発現性Ｔ
ＭＶ被覆タンパク遺伝子を含有するべく形質転換された
植物を含み得る（交叉防御を参照のこと）。交叉防御に
関する従来の技術の章で論じたように９本開示以前は、
被覆タンパクが植物の多重感染予防に関与するかどうか
は。

不明確であった。さらに、交叉防御のすべての例が、同
じ機構によるのかどうかも不確実であった。

言い換えれば、被覆タンパクの存在によって、ある特定
のウィルスによる感染から植物を防御すれば、その被覆
タンパクの存在によって、別の関連のないウィルスによ
る感染からの防御を推定し得るかどうかは不明確であっ
た。

本発明のＤＮＡは、プロモーターとウィルス被覆タンパ
ク構造遺伝子とを有し、該プロモーターと該構造遺伝子
とはお互いに被覆タンパクコード化ＲＮへが該プロモー
ターの制御のもとで転写されるような位置と方向にある
ＤＮＡ分子であって。

さらに転写ターミネータ−を有し、該プロモーター、該
構造遺伝子、および該ターミネータ−はプロモーターと
ターミネータ−との制御のもとで翻訳可能被覆タンパク
転写が植物細胞内で転写されるような位置と方向にある
。

らす、かつウィルスの被覆タンパクを含有する。

ウィルス抵抗性植物を生産する本発明の方法は。

ウィルス被覆タンパク構造遺伝子をコードするＤＮＡ分
節を作ること、および該構造遺伝子分節をプロモーター
に連結することを包含し；このプロモーターと構造遺伝
子とは、該プロモーターの制御のもとで被覆タンパクコ
ード化１？ＮＡが転写されるような相互の位置と方向を
持っている。

本発明の植物細胞、植物組織、植物種子、または植物は
、上記方法で生産される。

（発明の詳細な 説明細雪および特許請求の範囲におけるその利用の意図
または範囲に対して不明確さをなくすために、以下の定
義が与えられる。

１ユ至二叉二： プロモーターとは、転写の開始に関与する構造遺伝子の
５゛末端における配列を言う。植物−発現性プロモータ
ーは、少なくともひとつの発生段階における少な（とも
ひとつの型の植物細胞において、転写を行い得るプロモ
ーターである。真核プロモーター配列は８通常、正準型
５゛、・、　ＴＡＴＡ＾、・・３”（約１０〜３０塩基
対（ｂｐ）　）　、すなわち転写の５゛末端をコードす
るＤＮＡ配列の５”位（キャップ部位）。

に対して相同なりＮＡ配列の存在によって、認識される
。約３０ｂｐを有するＴＡＴＡＡ　（別のプロモーター
配列）の５°位が正準型５゛・・・ＣＣＡＡＴ・・・３
°と相同なりＮＡ配列の存在によって認識されることが
しばしば見出されている。

転　ターミネーター： 転写ターミネータ−とは、ここでは、転写の３゜末端の
位置を決定し得る核酸配列を言う。転写ターミネータ−
ＤＮＡ断片は、それ自体が、天然に存在するかあるいは
合成的、原核性あるいは真核性の複数の起源から導かれ
る断片の複合物であり。

かつゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ由来ｃ由来Ａからのも
のであり得る（ｍＲＮＡ　：メッセンジャーＲＮＡ）　
ｈ転写終了部位には、ポリアデニル化部位およびリポソ
ームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）、移入ＲＮＡ　（ｔＲＮＡ）
および非ポリアデニル化ｍＲＮＡの３°末端を決定する
部位が含まれている（例えば、ヒストンｍＲＮＡ　；　
Ｋｒｉｅｇ　Ｐ＾およびＭｅｌ　ｔｏｎＤＡ　（１９８
４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０８：２０３−２０６）。

ポリアデニル化部位は、真核生物における転写のポリア
デニル化と相関する核酸配列である。すなわち、転写終
了後にポリアデニル酸“尾”を。

ｍＲＮＡ前駆物質に添加する。転写の５゛から３”末端
までの長さの変化１部分的“読み過ごし、”および多重
の縮性正準型配列は珍しくないが、ポリアデニル化部位
は一般的に正準型５”・・・ＡＡＴＡＡＡ・・・３′に
対する相同体の存在によって認識される。転写３″末端
から下流に２０および３ｓｂｐ間のＤＮＡ配列が。

必要であると思われる（ＭｃＤｅｖｉｔｔ　ＭＡら、　
（１９８４）Ｃｅｌｌ　　３７：　９９３−９９９）。

正準な“ポリアデニル化部位”は、実際には、　ｍＲＮ
Ａの３°末端の位置を決定し得そしてポリアデニル化自
身を決定し得ないということが認識されるべきである（
　Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ　Ｎ　（１９８４）　Ｎａｔｕｒ
ｅ　　３０互４１２−４１３；　Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ　
ＭＬら。

（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４１：　３４９−３５９　）
。

配置を？１１１御する転′Ｆ： 配列を制御する転写とは、構造遺伝子の側面に位置する
プロモーター／転写ターミネータ一部位の組み合わせを
言う。特定の外来構造遺伝子の側面に位置するプロモー
ターおよびターミネータ−ＤＮＡ配列は、同じ起源遺伝
子（例えば、２つの異なるＴ−ＤＮＡ転写の対合）ある
いは同じ分類上の起源（例えば、植物、動物、菌類、酵
母、真核ウィルス、バクテリアおよび合成配列のような
非Ｔ−ＤＮＡ起源の配列を有するＴ−ＤＮＡの対合配列
）に由来する必要はない。

被覆タンパク遺云　転写および被覆タンパク田川：被覆
タンパク遺伝子転写とは、ここでは植物−発現性被覆タ
ンパク遺伝子の転写を言い、被覆タンパクｍＲＮＡとは
、ここではウィルスに感染中、天然に存在する被覆タン
パクコード化ｍＲＮへを言う。

“翻訳可能な転写”は、当該技術分野では、“メツセン
ジャーＲＮＡ　　”の同義語として認識されるが。

これらの２つの異なる言葉は、ここでは、ウィルス感染
中に合成されるメンセンジャーと本発明の被覆にタンパ
ク遺伝子の生産とを区別するために用いられる。

ン・　タンパク゛　云　： 被覆タンパク遺伝子とは、ここでは、プロモーター、被
覆タンパクをコードするＤＮＡ配列（すなわち、被覆タ
ンパク構造遺伝子）および転写ターミネータ−を言う。

これらのプロモーター、構造遺伝子およびターミネータ
−は、植物細胞中の場合に被覆タンパクコード化転写が
該プロモーターおよび該ターミネータ−の制御の下で合
成され得るような、互いの位置および配向を有する。被
覆タンパク遺伝子は、天然に存在するかあるいは合成的
な複数の起源に由来の分節の複合物であり得る。被覆遺
伝子転写には、原核ＤＮＡ　、真核ＤＮＡ　。

エピソームＤＮＡ　、　　プラスミド ゲノムＤＮＡ　、　ｃＤＮＡ，　　ウィルスＤＮＡ　、
　　ウィルスｃＤＮＡ。

化学的に合成されたＤＮＡなどから全部または部分的に
４かれた配列を含み得る。さらに、被覆タンパク遺伝子
が，転写制御配列，転写された配列あるいはウィルスｃ
ＤＮＡのいずれかにおいて，１またはそれ以上の修飾を
含み得ることが期待される。

これらの配列またはウィルスｃＤＮＡは，上記被覆タン
パクの生物学的活性または化学的構造，発現率。

または発現制御の方法に影響を及ぼし得る。このような
修飾は．１またはそれ以上のヌクレオチドの突然変異、
挿入、欠失および置換、そして被覆タンパクの機能また
は被覆タンパク転写を変更しないが被覆タンパクまたは
その転写の細胞間の局在化、輸送または安定性に影響を
及ぼす修飾を含むが、これらに限定されることはない。

被覆タンパク遺伝子をコードするＤＮＡは、連続的な構
造遺伝子であり得る。あるいは適当な植物−機能的接合
部分によって結合した１またはそれ以上のイントロンを
含み得る。これらのイントロンは１合成的または天然に
存在する起源から得られる。

昶ＮＡふ■輔ｌ鱒Ｄ−： この用語は、当該技術分野において良く理解されている
が３次にあげる２つの意味を有する。（１）ｃＤＮＡは
、ＲＮＡ（例えば、ウィルスｍＲＮＡ）に相補的なｊｌ
ｌＷＤＮＡであり得る。（２１ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、二重
鎖ＤＮＡ断片であり得る。この二重鎖のうちの一方はＲ
ＮＡに相補的であり、他方は上記ＲＮＡと同等の配列を
有する鎖である（ＵをＴに置き換えたもの）。一般的に
、二重ｆＡｃＤＮＡは、単鎖ｃＤＮＡから導かれる。し
かしながら、ここで定義されるように、　ｍＲＮＡ配列
をコードする二重鎖ＤＮＡ　、例えば構造遺伝子のＤＮ
Ａは、　ｃＤＮＡという用語の中に包含される。この明
細書においては、　ｃＤＮＡの意味は１前後関係から定
義され、当業者によって良く理解される。

止ｊ口と瓜四ノ、： 正鎖ウィルスとは、ウィルスのｍＲＮＡの配列と同等の
配列を持つゲノムを有するウィルスのことを言う。すな
わち、ウィルス粒子中に見出されるｌ？ＮＡは、ウィル
スｍＲＮＡに相補的ではない。正鎖ウィルスのウィルス
ＲＮ＾は、しばしばｍＲＮ八として働き得る。ＡＭＶは
、正鎖ウィルスのひとつの例である；ＡＭＶピリオン中
に見出される４つのＲＮＡの各々が。

ｍＲＮＡとして働き得る。“負鎖”またはアンチセンス
ＲＮ＾とは、正鎖の相補体のごとを言う。

トリパータイトＲＮＡゲノムニ トリパータイト（Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）　ＲＮＡゲノ
ムとは。

１？ＮＡゲノムとは、ウィルスの遺伝物質の構成のこと
を言う。“ゲノム”とは、ウィルスの全遺伝物質のこと
を言う。“ＲＮ＾ゲノム”とは、ピリオン中（ウィルス
粒子）に存在するように、ゲノムが１？ＮＡ型であるこ
とを言う。トリパータイトは、ゲノムが３つの独立した
ＲＮＡ分子に分離されることを示す。トリパータイトＲ
ＮＡゲノムを有するウィルスの一例はＡＭＶである。Ａ
ＭＶのゲノムは、　ＡＭＶＲＮＡ　１．２および３によ
って運搬される。ＲＮＡ　４の配列は、完全にＲＮ＾３
に含有され、　ＲＮＡ　４は、複製されない；従って、
　ＲＮＡ　４は、サフ゛ゲノムＲＮＡと呼ばれ、ゲノム
ＲＮＡのひとつとしてはみなされない。

朋ｔＪＩ的Ｗ佼： 翻訳開始部位とは、ここでは、構造遺伝子の５゛末端に
おける５’ＡＵＧ３”翻訳開始コドン、　ＡＩＩＧ　！
、：続くヌクレオチドおよび八〇Ｇに先行する３ヌクレ
オチドのことを言う　（Ｋｏｚａｋ　Ｍ　（１９８３）
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｒｅｖ、４ご７：　１−４５．およびＫｏｚａｋ　Ｍ　
（１９８４）　Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓＲｅｓ、１２：　
８５７−８７２を参照のこと）。

Ｌ末鉗駅父剋： ５″未翻訳配列とは、ここで、　ｍＲＮＡ、またはその
５゛末端（または“キャップ部位”）および翻訳開始コ
ドン間の転写のことを言う。

省　−一　　γ　口２　たはスクリーン口２なマーカー
二 このマーカーは、ここでは、植物細胞において機能的な
遺伝マーカーのことを言う。選択可能なマーカー（例え
ば、カナマイシン耐性遺伝子）は。

そのマーカーを含みそして発現する細胞をそのマーカー
を発現しない細胞の生長には好ましくない条件下で生長
させる。スクリーン可能なマーカー（例えば、ヘークー
ガラクトシダーゼ遺伝子）は。

このマーカーを発現する細胞の同定を容易にする。

本貫呵笠全長並■： 木質的な全長ｃＤＮＡとは、ここでは、全ｍＲＮＡに相
補的であるｃＤＮＡを言うが、おそら＜　ｍＲＮＡ配列
のいずれかの末端における数個の（例えば、約５つの）
ヌクレオチドは除かれる。

皿π五喚： 形質転換とは、細胞にその本来の部分ではない核酸分子
または配列を含有するようにさせる作用のことを言う。

櫃皇組員 植物組織は、植物の分化および未分化組織を含む。この
植物は、根、苗条、花粉２種子、腫瘍組織（例えば、根
頭癌腫）および、栽培中の植物細胞のさまざまな形の集
合体（例えば、胚および癒合組繊）を包含するが、これ
らに限定されるものではない。

殖」１」胸： ここで用いられているように、植物細胞はインブランク
の植物細胞および栽培中の植物細胞およびプロトプラス
トを包含する。

以下の言葉は、当該技術分野で既知であり、ここでは、
詳細にまたは特別に定義されていない：構造遺伝子、単
鎖、ゲノム、アルファルファモザイクウィルス群（Ｍａ
ｔｔｈｅｗｓ　ＲＥＦ　（１９８２）　Ｃ１ａｓｓｉｆ
ｉｃａ−ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ
　ｏｆ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｐ、１７７を参照のこと）
　、　ＣａＭＶ　１９Ｓプロモーター（ｌｌｏｈｎ　Ｔ
ら（１９Ｂ２）　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、９６：　１９３−２３６を
参照のこと）、オクトピン型Ｔ−ＤＮＡ　　（位置。

配向および０ＲＦｓは、　Ｂａｒｋｅｒ　ＲＦら（１９
８３）　ＰｌａｎｔＭａｔ、　Ｂｉｏｌ、　２：　３３
５−３５０によって命名されたように定義されている）
　、　Ｔ−ＤＮＡボーダー反復、翻訳可能３　プロモー
ターの制御下の転写、結合、子孫。

および構造遺伝子。

被覆タンパク遺伝子を発現する遺伝学的に修飾された細
胞を生成するには２本発明に開示の特異的な方法が、当
業者に公知の種々の方法および手段と組み合わされる。

はとんどの場合、全過程の各段階に１代わりの手段が存
在する。手段の選択は２次のような変動要因に依存する
。すなわち。

この変動要因には、抵抗性が必要な特別なウィルスの選
択、被覆タンパク遺伝子の導入およびその安定な維持の
ための基準ベクターシステム、修飾され得る植物品種、
所望の再生戦略、用いられる特定の転写制御配列などが
ある。これらの全てが。

別の過程段階に存在する。所望の結果を達成するために
、この段階は、当業者が選択され得、使用可能である。

植物細胞における外来ＤＮＡの安定した挿入および転写
のために、新しい方法が開発されると、当業者は、所望
の結果を達成するために５これらの代わりの過程段階の
間で選択され得るだろう。本発明の根本的な局面は、形
質転換された植物のウィルス感染に対する抵抗性を与え
るための被覆タンパク遺伝子の性質およびその使用であ
る。他の局面では、被覆タンパクの構造遺伝子配列の性
質や構造、および植物ゲノムにおけるその挿入手段や発
現手段が含まれる。遺伝的に修飾された植物を得るため
のより好ましい実施Ｂ様の残りの段階には、被覆タンパ
ク遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入すること、修飾されたＴ−
ＤＮＡを植物細胞に転移すること５が含まれる。この植
物細胞では、修飾されたＴ−ＤＮＡは、植物細胞ゲノム
の一部として安定に組み込まれる。インビトロ培養およ
び全植物への最終的な再生のための方法には、形質転換
された植物細胞の選択段階および検出段階、４人された
被覆タンパク遺伝子を、最初に形質転換された株から、
市販の適当な栽培品種に移植させる段階、および、形質
転換された植物における発現を検査する段階が含まれて
いる。

被覆タンパク遺伝子の構築のための出発点は。

ウィルス配列のＤＮＡクローンを得ることである。

このウィルスがＤＮＡウィルスであれば、この［ｌＮへ
クローンは、公知の組換え型ＯＮ八へ法を用いて得られ
る。このウィルスがＲＮ＾ウィルスであれば。

ｃＯＮＡＤＮＡクローン望のウィルス配列から作られる
べきである。ｃＤＮＡクローンを作るための数多くの方
法がｆＪｉ　１１１え型ＤＮＡ技術において公知である
。

方法の選択は、ポリアデニル化、　ＲＮＡの長さ、　Ｒ
ＮＡ配列についてあらかじめわかっている情報、他のｃ
ＤＮＡクローニング実験に関する特別な研究についての
前調製などのような変動要因に依存すると思われる。

より好ましい実施態様における本発明の主な特徴は、植
物−発現性の転写を制御する配列（すなわち、これらの
用語が前記で定義されているように、プロモーターと転
写ターミネータ−との間での転写）の制御下において、
挿入された遺伝子を有するＴ−ＯＮＩＮ誘導体の構築で
ある。被覆タンパクをコードする構造遺伝子は、このプ
ロモーターに関して、正しい位置および方向に挿入され
なければならない。位置は、構造遺伝子が挿入される側
の位置に関連している。大部分のプロモーターが、。

ＤＮＡに沿った方向のみにおいて、転写および翻訳の開
始を制御することが知られている。プロモーター制御下
に存在するＤＮＡの領域は、“下流側制御”あるいは、
プロモーターの“背部”もしくは“３゛方向に”のどち
らかで存在すると言われている。従って、プロモーター
によって制御されるように、構造遺伝子の正しい位置は
、プロモーターから“下流側”とされるべきである。方
向とは。

構造遺伝子の方向性を意味する。ウィルス性被覆タンパ
クのアミノ末端をコードする被覆タンパク−コードＤＮ
Ａの部分は、構造遺伝子の５゛−末端で終了する。他方
、このタンパクのカルボキシル末端近くのアミノ酸をコ
ードする末端は、構造遺伝子の３゛−末端で終了する。

ＤＮＡをコードする被覆タンパクの正しい方向は、プロ
モーターに対する５゛−末端基部とともにある。同様に
、このプロモーター領域に対して、転写ターミネータ−
は、被覆タンパク構造遺伝子と関連する正しい位置およ
び方向に位置ぎめされるべきである。この位置および方
向はこの構造遺伝子の３”−末端に対する基部である。

被覆タンパク遺伝子発現あるいは発生制御の速度の相違
は、被覆タンパク構造遺伝子を運搬する成分、プロモー
ター、転写ターミネータ−１側面のＤＮＡ配列、あるい
は形質転換された植物ゲノムへの挿入部位を変えること
により、ｒ＆察され得る。被覆タンパク遺伝子転写の蓄
積も、被覆タンパク遺伝子の転写二次構造の詳細、特に
幹ループ（ｓ　ｔｅｍ−１ｏｏｐ）構造によって、大き
く影害され得る。発現された被覆タンパク遺伝子自体の
安定性、細胞内局在化、転写後のプロセッシングのよう
な特性、および他の機能的な特性を含む（しかし、これ
に限定されない）異なった特性は、遺伝子の成分を変え
た場合に観察され得る。このような変化は、全て、植物
細胞、植物組織および全植物中の所望の物理学的特性に
依存して、ウィルス抵抗発現型の機能的特性を処理し、
制御する多くの機会を提供する。

本発明の板木的原理は、植物細胞中の被覆タンパクの存
在が、その細胞に対する少なくともあるレベルのウィル
ス抵抗性を与え得ることである。

本発明は、抵抗の方法あるいはメカニズムによって制限
されない。この被覆タンパク遺伝子は、十分な長さの構
造遺伝子をコードする必要はない。

ウィルス感染に抵抗するコードされた被覆タンパク構造
遺伝子の誘導体で十分である。

ウィルスの生存周期に抵抗し得るように、植物細胞中に
存在する十分な被覆タンパクを有することが重要である
。存在する被覆タンパクがあまりにも少量であれば、感
染は抑制されない。翻訳効率を最大にすることは、被覆
タンパクの蓄積を増加させるのに役立つだろう。当業者
は、数種の要因が翻訳効率に影響を及ぼすことを認めて
いる。

これらの要因には１次の要因が含まれる。すなわち、コ
ドン利用、翻訳可能な被覆タンパク転写の５゛−末端間
の距＃（“キャップ部位゛）およびＡＬＩＧ翻訳開始コ
ドン、転写二次構造、キャップ部位と翻訳開始部位との
間のＡＵＧコドンの欠如、翻訳開始部位の配列などであ
る。一般に、進歩に伴って。

被覆タンパク構造遺伝子のコドン利用が大いに最適化さ
れていた。過度に長い５°−非翻訳配列は。

翻訳効率を低下させ得る。一般には、より短い“リーダ
ー”配列が望ましい。過剰の二重鎖二次構造１例えば幹
ループ構造は、翻訳効率を低下させると考えられる。し
かし、ある二次構造は、　ＲＮＡの機能または安定性の
ために必要であると考えられる。一致した翻訳開始部位
が誘導されている。

八 すなわち、５°ＣＣＣＣ泗Ｇ３’　（Ｋｏｚａｋ　Ｍ　
（１９８６）　Ｃｅ１ｌ４４　：　２８３−２９２　、
および、ここで引用されている文献、特にＫｏｚａｋ　
Ｍ　（１９８３）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ＲｅＶ、　
４７：１−４５．およびＫｏｚａｋ　Ｍ　（１９８４）
　Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ。

１２：　８５７−８７２を参照）。ＡＵＧは翻訳開始コ
ドンである。この一致からはずれると、翻訳効率が低下
する。キャップ部位と翻訳開始部位との間のＡＵＧコド
ンの存在も、翻訳効率を低下させることが知られている
（例えば、　Ｒｏｇｅｒｓ　ＳＧ　（１９８５）　Ｐｌ
ａｎＬ　Ｍｏｌ。

は、非ウィルス性配列を含み得る。十分な長さのに存在
する。しばしば、これらの非ウィルス性成分は、プロモ
ーターあるいは転写ターミネータ−転写後のプロセッシ
ングなどに影音を及ぼし得る。

ＲＮＡの安定性は、５゛−カップリングおよび３゛−ポ
リアデニル化のような末端構造によって、および内部構
造の広がり（すなわち７分子内塩基対）に小胞体へ結合
される傾向にある。イントロンは。

被覆タンパク中に含有され得る。ただし、このスプライ
ス部位が２つの異なった遺伝子から誘導されるならば、
イントロンのスプライス部位は和合可能である。

被覆タンパク遺伝子を形成すべく、ウィルス性。

非つィルス性、プロモーターを含をするＤＮＡ分節と、
転写ターミネータ−配列とを組み合わせることは２組換
え型ＤＮＡ技術における通常の技術により理解され知ら
れている方法によって、達成される。プロモーターの選
択は、所望の発生規制に依存する。植物における遺伝子
発現のために発生的に規制されたプロモーターの使用は
、従来技術の章に記述されている。このＴ−ＤＮＡプロ
モーターまたはＣａＭＶプロモーターは、構成要素であ
るときに有用である。このＲｕ［’−Ｃａｓｅ小サブユ
ニットプロモーターは、被覆タンパク遺伝子で形質転換
された植物の緑色組織における発現のために有用とされ
得る。より好ましい実施態様では、この転写ターミネー
タ−は、ポリアデニル化部位である。このポリアデニル
化部位、プロモーターおよび被覆タンパク構造遺伝子が
、転写および転写後のプロセッシングに対し和合可能で
あるなら、ポリアデニル化部位の植物遺伝子源は重要で
はない。

この技術分野における当業者には明らかなように、被覆
タンパク遺伝子の組み合わせは、プラスミド（これで遺
伝子が運搬される）からのこの組み合わせを取り除くの
に都合よ＜、シかも選択の植物形質転換ベクターに挿入
するのに都合の良い制限部位間に配置され得る。例えば
、　Ｔ−ＤＮＡ内の被覆タンパク遺伝子挿入部位の配置
は、　Ｔ−１１１ＮＡ　Ｓ＆部をすぐに取り囲む配列の
移入機能が分断されない限り１重大ではない。従来技術
での研究において、これらの領域が、修飾されたＴ−Ｄ
ＮＡを植物ゲノムに挿入するために不可欠なことは明ら
かだからである。この組み合わせは、当業者に公知の標
準的な技術により、植物形質転換ベクターへ挿入される
。集められた被覆タンパク遺伝子の方向は。

内因性のベクター遺伝子の転写および翻訳の方向に関し
て、ふつうは重大ではない。一般に、この２つの可能な
方向のいずれかが目的に合っている。

背景の章（ＴｉプラスミドＤＮＡ　）において再考察し
たように、アグロバクテリウム（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｗ）株が、ある種のｔｒａｎｓ−作用遺伝子を含み
、その機能がＴ−ＤＮＡの植物細胞への移入を促進し得
るなら、ミクロ−ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡは、アグ
ロバクテリウム（七皿閃叩肛ｉｕｍ）株から植物細胞に
移入し得る。ミクロ−Ｔｉプラスミドは、小さくかつ直
接処理するのが比較的容易である点で有利である。この
プラスミドは、相同性の組み換えによって、シャトルヘ
クターからＴ−ＤＮＡに遺伝子を移入させる必要性を取
り除く。所望の被覆タンパク遺伝子が挿入された後、そ
れらは、　　ｔｒａｎｓ−作用ｖｉｒ遺伝子を含有する
アグロバクテリウｌ、（ハエｏ　−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）細胞へ直接、容易に導入され得る。このｖｉｒ遺伝子
は、ふつうは“ヘルパー　プラスミド”上にあり、それ
はＴ−ＤＮＡ移入を促進する。アグロバクテリウム（紅
皿ハ叩肛旦畦株への導入は。

アグロバクテリウム（知見穎弘肛ｎ煎株の形質転換、ま
たはドナーバクテリア細胞からの対移入（ｃｏｎｊｕｇ
ａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）のいずれかにより、うまく達
成される。この技術は２通常の当業者に公知である。植
物ゲノム中に新規なりＮＡ配列を導入するために、Ｔｉ
プラスミド、Ｒｉプラスミド、ミクロ−Ｔｉプラスミド
および染色体に組み込まれるＴ−ＤＮＡは。

機能的に同等であると考えるべきである。

被覆タンパク遺伝子を有するＴ−ＤＮＡは、ある公知技
術により、植物細胞に移入され得る。例えば。

この移入は、アグロバクテリウム（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）株と植物細胞あるいは植物組織との共培養に
より最もうまく達成される。これらの方法を用いて。

植物細胞のある部分が形質転換され（すなわち。

ここで移入されるＴ−ＤＮＡを有する）、植物細胞ゲノ
ム中に挿入される。いずれかの場合、この形質転換され
た細胞は、非形質転換細胞から区別するために１選択あ
るいはスクリーンされなければならない。選択は、被覆
タンパク遺伝子に加えて。

Ｔ−ＤＮＡに組み入れられた選択可能なマーカーを供給
することにより、最も容易に達成される。人工的マーカ
ーの例には、背景で再考察されたマーカーが含まれてい
る（キメラ遺伝子の章を参照のこと）。さらに、このＴ
−ＤＮＡは、Ｒ１−誘導腫゛瘍根の異常形態を制御する
遺伝子（Ｓ）、およびアミノ酸類似物のような毒性化合
物に対する耐性（このような耐性は、オビン合成酵素２
例えば」によって供給される）を調節する遺伝子（Ｓ）
のような内因性マーカーを供給する。当業者に公知のス
クリーニング方法には、オピン生成の検定、核酸配列を
特徴づけるための特異的なハイブリダイゼーション（例
えば、被覆タン′／マク転写あるいはＴ−ＤＮＡ）また
は特定のタンパク（例えば、被覆タンパク）に関する免
疫学的検定が含まれるが、これに限定されない。さらに
１発現された被覆タンパク遺伝子の発現型（例えば、標
的ウィルスに対する抵抗性）は、形質転換されたＭｌ織
を同定するのに用いられ得る。ウィルス耐性の検定は、
　ｔｉ！物ウィつス学の分野で公知の多くの方法のうち
のひとつによって実施され得る。この検定は、ウィルス
成分（例えば、ウィルスＲＮＡあるいはウィルスタンパ
ク）の生成減少の検出、プロトプラスト感染または局部
的なレソション（Ｉｅｓｓｉｏｎ）検定によって検定さ
れるような感染性の減少の検出、子孫ウィルスの生成減
少の検出なども含まれる。

好ましい実施態様では、ミクロ−Ｔｉプラスミドの使用
が含まれているが、当該分野で既知の他のＴ−ＤＮＡ基
阜ベクターは、容易に置換される。さらに２本発明の好
ましい実施態様では、被覆タンパク遺伝子の組み込みの
ためのＴ−ＤＮＡ　ｉ準アグロバクテリウム（紅皿堕旦
肛ｎ畦−媒介系を、形質転換されるべき植物のゲノムへ
組み込んでいるが。

被覆タンパク遺伝子を移入し、そして組み込むための他
の方法も１本発明の範囲内に含まれる。被覆タンパク遺
伝子の植物ゲノムへの安定した組み込みのための方法は
さらに、ウィルスゲノム、ミニ染色体、トランスボゾン
の使用、さらに、植物染色体への相同性あるいは非相同
性組み換えも含んでいる。植物細胞へのこれらのベクタ
ーのもうひとつの形の供給には、ベクターを含有するリ
ポソームあるいはバクテリアのスフェロプラストとの融
合、微注射法、感染様工程の前のウィルス被覆タンパク
におけるエンカプシデーション（ｅｎｃａｐｓ　１ｄａ
−ｔｉｏｎ）　、およびおそらく、電気パルス、レザー
もしくは化学薬品による形質膜透過性の誘発後のＤＮＡ
の直接的な取込みが含まれるが、これらに限定されない
。一過性の組み込みおよび／または発現の方法も本発明
の範囲内に含まれる。アグロバクテリウム（匂二自に印
わ」畦細胞およびＴ−ＤＮＡに基づく系は、バクテリア
から植物細胞へＤＮＡを移入させることによって、双子
葉および単子葉植物を含む被子植物を形質転換させるた
めに使用され得る。

ベクターあるいはヘククー供給のための方法に基づくシ
ステムは、裸子植物および被子植物を形質転換させるた
めに用いられ得る。

形質転換された細胞および組織の再生は、公知の技術に
よって達成される。再生段階の目的は。

正常に生育しそして再生産するが９組み込まれたＴ−Ｄ
ＮＡを保持する植物全体を得ることである。再生技術は
、当該分野に既知の原理に従って幾分変化し、そして植
物形質転換ベクターおよび形質転換された植物の品種に
依存し得る。形質転換されたタバコ植物、ツクバネアサ
ガオ植物および関連品種植物の再生は、当該分野に既知
である。他の植物品種の再生のための方法が開発された
ため。

当業者は、過度の実験を行うことなく、形質転換された
植物細胞および植物組織からの植物の再生のために、こ
れらの新しく開発された方法の適用法を理解できる。

形質転換された植物Ｕ織の遺伝子型が、その細胞が、試
験管内培地において容易に生育し、そして再生されるた
め、および、使用する選択的薬剤に対する感光性のため
に１度々選択される。農耕法の栽培品種がこれらの操作
に不適切であれば。

より修正可能な品種がまず形質転換される。再生後、新
しく導入された被覆タンパク遺伝子は、植物の品種改良
や遺伝の分野における当業者に良く知られている技術を
用いて、所望の農業品種へ容易に移入されうる。農業品
種を用いて、形質転換された植物の交配を行うことによ
って、最初の雑種が得られる。これらの雑種は、この後
、所望の遺伝的背景の植物を用いて、もどし交配され得
る。

咀み込まれた被覆タンパク遺伝子ＤＮＡ　、　Ｔ−ＤＮ
Ａの連続した存在に対して、もしべは被覆タンパクまた
は（挿入されたＤＮＡによって運ばれた）他の遺伝子発
現の結果として生じる新しい発現型に対して、子孫は、
連続的にスクリーンおよび／または選択される。このよ
うにして、このもどし交配および選択を繰り返してのち
、挿入されたＤＮＡ配列の添加を用いて、農学的に所望
の両親と基本的には同一の遺伝子型を有する植物が生成
され得る。

被覆タンパク遺伝子を含む植物細胞を作るために、植物
ゲノムへの被覆タンパク遺伝子の組み込みの別法は、こ
の植物中において維持され得るベクターウィルス性ＲＮ
Ａを用いて、植物を感染させることである。このウィル
スＲＮＡは、標的ウィルス（すなわち、ベクターウィル
スから明らかな防御が望まれるウィルス）に対して被覆
タンパクをコードする配列を有する。代表的には、ベク
ターウィルスおよび標的ウィルスの三木１’ｆｃＤＮＡ
配列は。

租み換えＤＮＡ技術を用いて、処理される。所望のベク
ターＲＮＡ　／標的被覆タンパクｃＤＮＡの組み合わせ
のＤＮＡ配列に相当するＤＮへ配列の集合の後、植物ウ
ィルス性ヘクターｃＤＮＡ／被覆タンパクの組み合わせ
が、試験管内転写を行い得るプロモーターの後に位置さ
れ得る。その使用のための、このようなベクターおよび
条件の説明については、　ＭｅｌｔｏｎＤＡ　ら　（１
９８４）　　Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、１
２　　二　７０３５−７０５６゜Ｋｒｉｅｇ　　ＰＡ　
　ａｎｄ　　Ｍｅｌｔｏｎ　　ＤＡ　　（１９８４）　
　Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ。

上２：　　７０５７−７０７０．　　Ａｈｌｑｕｉｓｔ
　　Ｐ　　ａｎｄ　　Ｊａｎｄａ　　Ｍ　　（１９８４
）Ｍｏ１．Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　４　：　２８７６
−２８８２．　ａｎｄ　Ｆｒｅｎｃｈ　Ｒら（１９８６
）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３し：　１２９４−１２９７に
含まれている。そのようなウィルス性ベクター／標的被
覆タンパク／試験管内転写ベクターの組み合わせが集め
られた後、ウィルス性ベクターＲＮＡ　／標的被覆タン
パク配列の組み合わせが、試験管内転写によって生成さ
れ、植物細胞中のウィルス性ベクターの維持に必要な他
のあらゆるウィルス性ＲＮＡ成分と混合されうる。植物
細胞のベクター／被覆タンパク配列の組み合わせによる
感染は１次いで既知方法により行われ、そして標的ウィ
ルスあるいは標的ウィルスＲＮＡを用いた接種後、感染
の抑制やウィルス性成分の生成が当該分野で周知の方法
によって検定されうる。そのような方法を用いて。

高レベルのタンパク転写物および被覆タンパクが蓄積さ
れる。

同様に、植物ウィルス性ＤＮＡベクターは、植物細胞へ
の被覆タンパク遺伝子の導入のために用いられる。その
ようなベクターの利用については。

Ｂｒ１ｓｓｏｎ　Ｎら（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３
１０：　５１．１−５１４によって検討されている。本
発明により教示されるように２機能的な被覆タンパク遺
伝子をつくるための方法は、当業者による植物ＤＮＡウ
ィルス−基卓ヘクターの使用と組み合わせられうる。適
当な植物宿主細胞の感染後、標的の抑制、ウィルス感染
が上記のように検定されうる。

（以下余白） 去意拠 次の例は本発明の範囲内の特定の実施例を説明する目的
で提示したもので、範囲を制限するためのものではなく
、範囲は特許請求の範囲で規定されている。当業者には
容易に種々の変更を行うことができるだろう。

実施例は分子生物学の技術やＴ−ＤＮＡとＡ　ｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍの操作に精通した当業者にはなじみ深い
広く知られた技術を使っている：その方法は、ここで詳
細に説明されていなければ１か所以上の引用した参考文
献に詳しく記載されている。この明細書の中で引用した
参考文献は総じて参考文献の項に掲載されている。酵素
は一般商業経路を通じて得たもので業者の奨めに従って
使用され、他の変更は技術的には広く知られている。試
薬、緩衝液、および培養条件もまた。当業者にはよく知
られている。

この標準技術を含め参考となる研究は次の通りである：
　Ｗｕ　Ｒ，ｅｄ、　（１９７９）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、　６８　；　ＷｕＲら、　ｅｄｓ、　　（
１９８３）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　１００
　ａｎｄ　１０１　：Ｇｒｏｓｓｍａｎ　Ｌ　ａｎｄ　
Ｍｏ１ｄａｖｅ　Ｋ、　ｅｄｓ、　（１９８０）　Ｍｅ
ｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　６５　：　Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ　
Ａ　ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓｂａｃｈｌｌ、　　ｅｄｓ。

（１９８６）　Ｍｅｔｈ、　ＩＥｎｚｙｍｏｌ、　　１
１８　（Ｒｏｇｅｒｓ　ＳＧら、　ｐｐ。

６２７−６４０を特に参照のこと）　；　Ｍｉｌｌｅｒ
　Ｊｔ（（１９７２）Ｅｘ　　ｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉ
ｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　；
　　Ｄａｖｉｓ　　Ｒら、　　（１９８０）　　八ｄｖ
ａｎｃｅｄ　　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ　　；　　５ｃｈｌｅｉｆＲＦ　ａｎｄ　Ｗｅｎｓｉ
ｎｋ　ＰＣ（１９８２）　　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ　　；　　Ｗａｌｋｅｒ　月　ａｎｄ　Ｇａａｓｔｒ
ａ　　Ｗ。

ｅｄｓ、　　（１９８３）　　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　
　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　　　；ａｎ
ｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔら　（１９８２）　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　。

さらに、　Ｌａｔｈｅ　ＲＦら　（１９８３）　Ｇｅｎ
ｅｔ、　Ｅｎｇｉｎ、　４　：■−５６もＤＮＡ操作に
有用な注意を与えてくれる。

制限エンドヌクレアーゼの名前を分離して原文通りで使
用している場合１例えば“　Ｂｃｌ［”は酉γ素消化に
その酵素を使用したことを意味している。

しかしその酵素の作用を受けやすい配列部位１例えば制
限部位、をさし示す図解は除く。テキストの中で、制限
部位は作用“部位”をさらにつげることによって１例え
ば“　Ｂｃ１１部位”のように示される。さらに“断片
“をさらにつけ加えると。

例えば“　Ｂｃｌｌ断片”は、指名された酵素の作用に
よって生じた末端を有する直線状二本鎖ＤＮＡ分子を示
す（例：制限断片）。“Ｂｃｌｌ　／コＩ断片”という
ような語句は制限断片が２つの異なった酵素、ここでは
Ｂｃｌｌ　とＳｍａｌ　、の作用によって生じた。すな
わち２つの末端が異なった酵素の作用で生じたことを示
している。

プラスミドには、さらに言えばプラスミドのみに、′ｐ
”を前につける□例：　ｐＴｉ１５９５５あるいはｐＨ
４００−、そしてかっこを使った菌種の表示でその中に
繁殖しているプラスミドを示している１例：　Ａ、　　
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　（ｐＴｉ１５９５５）あるい
はＥ。

ｃｏｌｉ　Ｋ２Ｏ２（ｐＨ４００）。次の菌種は寄託さ
れており。

特許になれば当業者に入手可能となる。

Ｌ　並旦ＭＣｌ０６Ｌ　（ｐＨ４００Ａ４）　　　　Ｎ
ＲＲＬ　８４８０６１Ｅ、　　　ｃｏｌｉ　　Ｋ２Ｏ２
（ｐＨ４−１）　　　　　　　　　　　　ＮＲＬＬ　　
Ｂ−１８００９Ａ、　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　（ｐ
Ｔｉ１５９５５）　　　　ＡＴＣＣ１５９５５Ｅ、延Ｃ
５Ｈ５２（ｐｓＵＰ１０６）　　　　　ＮＲＩ？Ｌ　Ｂ
−１５４８１Ｅ、　　ｃｏｌｉ　５Ｍｌ０　　　　　　
　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１５４８１Ｅ、吐５１７−Ｉ　
　　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１５４８３（ＡＴＣ
Ｃ：　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　　　１２３０１Ｐａ
ｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒ、、　　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　
　ＭＤ　　２０８５２　　ＵＳＡ　　；　　ＮＲＲＬ　
　：ＡＲＳ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｎ
ｏｒｔｈｅｒｎ　　Ｉ？ｅｇｉｏｎａｌ　　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈＣｅｎｔｅｒ、　　１８１５　Ｎ、　　Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ　Ｓｔ、、　　Ｐｅｏｒｉａ、　　（Ｌ　
６１６０４υＳＡ、）他のプラスミドと菌種は一般に広
く利用され得、当業者には入手可能である。

’　　　　Ｉ　　１　　：　　ＡＭＶ　　ＲＮＡ４　　
ｃＤＮＡ　　のＵｐｓＰ６５Ａ４　（１、ｏｅｓｃｈ−
Ｆｒｉｅｓ　ＬＳら　（１９８５）　Ｖｉｒｏｌ、１４
６　：１７？−１８７）はｐＳＰ６５内にＡ　Ｍ　Ｖ　
ＲＮ　Ａ　４の完全な長さのｃＤＮＡを運搬する。ｐＳ
Ｐ６５はハタテリオファージＳＰ６プロモーターの制御
の下でインビトロ転写を行うように設計される（Ｍｅｌ
Ｌｏｎ　ＤＡ　ら（１９８４）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ
ｓＲｅｓ、　　　　１２　　　：　　　７０３５−７０
５６　　　：　　　ＫｒｉｅｇＰＡ　　ａｎｄ　　Ｍｅ
ｌＣｏｎ　　ＤＡ（１９８４）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　１２　ニア０５７−７０７０）。ｐｓＰ
６５Ａ４はＡＭＶ被覆タンパクコード配列の合成を指図
する。

それがインビトロでＳｍａ　Ｉ　とＥｃｏＲＩにより切
断されるとき、転写は実質的に完全な長さの被覆タンパ
クｍＲＮＡ配列である。

１２　：　ＣａＭＶ　云＋Ｊ’：配置のｆすｐＤＯ８５
１２（これはカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ
）転写制御配列（Ｏｒ、　Ｋｅｎ　Ｒｉｃｈａｒｄｓ、
　ＣｅｎｔｒｅＮａｔｉｏｎａｌ　　ｄｅ　　ｌａ　　
Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ、　　
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｄｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅ　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｉｒｅ　ｅｔ　Ｃｅ１ｌｕｌａｉｒｅ、１５．
ｒｕｅＤｅｓｃａｒｔｅｓ、　Ｆ−６７０８４Ｓｔｒａ
ｓｂｏｕｒｇ、　Ｆｒａｎｃｅから得られた）を運搬す
る〉は１次のようにして構築された：　　（ＣａＭＶに
ついての総説はＨｏｈｎ　Ｔら（１９８２）Ｃｕｒｒ、
　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　　９６　：　１９３−２３６．）ＣａＭＶ　１９ＳＲ
ＮＡ７’Ｏモ一ターｇＭ域（ＣａＭｖヌクレオチド５３
７６−５８５１　）を運ぶ」圏ｄｍ断片はｐＢＲ３２２
に挿入され、　１９Ｓ転写キャップ部位の塩基対１個以
内に刈り整えられた。ＣａＭＶ　１９Ｓ転写ターミネー
タ−（ＣａＭｖヌクレオチド７０１８−７７９４）を運
ぶＨｉｎｃＩｒ断片に」憇旧リンカ−を添加し１次に１
９３プロモーターの後に挿入した；その結果生じたプラ
スミドをｐＤＯＢ４１２と指定した。ρＤＯＢ４１２　
ＤＮＡを」紅■と５ａｉｌで消化し＋　Ｅ、　　ｃｏｌ
ｔ　ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で充填し９次
に再連結し、それによってＤＮＡを削除しくこれはＣａ
ＭＶ位置７６４４ＪｄＩ［部位とｐＢＲ３２２位置６５
０５ａｉｌ部位とのあいだに」憇旧とＨｉｎｄＩＩ［部
位を含有している）、そしてＩ１１部位を再生している
。この結果生じたプラスミドはｐＤＯＢ５１２と指定さ
れた。

コ（７）　Ｈｒ　ｎｄ　ｍ直線化ｐＤＯ［ｌ５１２　［
ＩＮＡの粘性末端をクレノー断片（または代わりに７４
　ＤＮＡポリメラーゼ）によって充填した。この平滑末
端を有するｐＤＯＢ５１２　ＤＮＡを市販のＩＩＩリン
カ−と混合してこれと連結する。次にこの連結混合物を
Ｅ、　　ｃｏｌｉＫ８０２に形質転換し、そしてρＤＯ
Ｂ５１３と指定されたプラスミドを内在させているアン
ピシリン抵抗性形質転換体を単離した。ｐＤＯＢ５１３
はｍＩＩ断片上にＣａＭＶ　Ｌ９Ｓ９Ｓ転写制御配持っ
ている。Ｓｍａ　Ｉ部位とＢａｍＨＩ部位がｐＤＯＢ４
１２．　ｐＤＯＢ５Ｌ２．　ｐＤＯＢ５１３のプロモー
ターをもつＤＮＡ分節とポリアデニル化部位のあいだに
存在し、これにより転写のための型となるべき外来ＤＮ
Ａの挿入に都合の良い位置を提供し得る。

ｐｓＰ６５Ａ４　ＤＮＡをＥｃｏ［トＳｍａｌ　１’消
化し、　０．８９ｋｂｐ　ＡＭＶ　ｃＤＮＡを電気泳動
法で分離したのちアガロースゲルから？８出させること
により精製した。ＥｃｏＲＩの粘性末端をＥ、　　ｃｏ
ｌｉ　　ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片とインキ
ュベートすることにより平滑末端に変換した。Ｓｍａ　
Ｉ直線状化ｐＤＯＢ５１３　ＤＮＡを平滑末端ｃＤＮＡ
と混合してこれと連結したのち、この連結生成物を１１
Ｃ１０６１に形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転
換体をＡＭＶ　ＲＮＡ４プローブに対するコロニーハイ
ブリダイゼーションによってスクリーニングした。コロ
ニーは、　ｐＤＯＢＡ４と１旨定されたプラスミドを包
含しＣａＭＶ　１９Ｓ転写制御配列間に挿入されたＡＭ
Ｖ　ｃＤＮＡをもって同定された。この転写制御配列は
、　（転写されたとき被覆タンパクコード転写が合成さ
れる：すなわち、　　ＥｃｏＲＩ末端と」憇旧部位がプ
ロモーターに近位で転写ターミネータ−には遠位である
）ように方向づけられた。

ＣａＭＶ転写制御配列／ＡＭＶ被覆タンパク構造遺伝子
コンビネーションは、　１．９２ｋｂｐ　　Ｂ■■断片
上にて。

ｐＤＯＢＡ４から取り除かれ得る。

？１４：）１４００　　ミクロＴｉブースミドの　−ｐ
Ｈ４−１はＬ　並置に８０２（ｐＨ４−１）に包含され
ているミクロ−Ｔｉプラスミドで、これはＮＲＲＬ　Ｂ
−１８００９として蓄えられている。ｐＨ４−１は５ｕ
ｔｔｏｎ　ＤＷらの米国特許出願第７７８，３８４号（
これは参考文献としてここに挿入されている）、および
Ｍｅｒｌｏ　Ｄら（１９８５）　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、
　１ｓｔ　Ｉｎｔ、　Ｃｏｎｇ、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．
　Ｂｉｏｌ、。

ｅｄ、　：　Ｇａ１ａｕ　ＧＡ、　ｐＨ４−１は２個の
Ｔ−ＤＮＡ断片、６０２と２．２９０の位置に橋をかけ
（Ｂａｒｋｅｒ　ＲＦら（１９８３）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ
１．　Ｒｉｏｔ、　２　：　３３５−３５０によって定
義されている）、ＴＬの左のボーダーおよび０ＲＦＩと
関連のあるプロモーター配列を運搬している一〇１ｎｄ
ｌｌ［断片を１個、および１１　、２０７と１４．７１
１の位置に橋をかけ、３”−欠失」畦、完全ｏｃｓ、　
ＴＬの右のボーダーを持っている一５ｍａｌ　／　Ｂｃ
ｌｌ断片１個を含有している。これらの２つの断片の位
置３，３９０　１１ｉｎｄＩ［［部位と位置１１，２０
７　Ｓａ＋ａＩ部位（このＳｍａ　１部位は」■■リン
カーの部位挿入によって」〔■にすでに転換されている
）のあいだは植物発現性の選択可能マーカーである。こ
のマーカーは、　ＣａＭＶ　１９ｓプロモ一ター１個、
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■をコードする
勤５カナマイシン抵抗性の構造遺伝子１個、および位置
２Ｌ７２７と２２，４４０でＨｉｎｃ１１部位に橋をか
けているＴ−ＤＮＡによって供与された２個のポリアデ
ニル化部位（そのうちの１個はＣａＭＶ由来、もう１個
はＴ−ＤＮＡ　０ＲＰ２６由来である）を持っている。

カナマイシン抵抗性遺伝子はｏｃｓｈ　ｔｍｌに平行で
０ＲＦＩプロモーターに反平行の向きを示している。Ｔ
−ＤＮＡ／選択可能マーカーの組合せは、　　ｐｓＵＰ
１０６　（すなわち　Ｌ　延と釦印ｂａｃｔ肛側りの両
方で維持可能なｌ１ｋｂｐ巾広宿主領域プラスミド）の
Ｈｉｎｄ１１１部位に挿入された（Ｐｒｉｅｆｅｒ　Ｕ
Ｂら　（１９８５）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　
１６３　：３２４−３３０　、　Ｅ、延、Ｃ３Ｈ５２（
ｐｓＵＰ１０６）はＮＲＲＬ　Ｂ−１５８４６として蓄
えられている）。このＴ−ＤＮＡは、　　ｐｓＵＰ１０
６内でＴＬ右ボーダーがｐｓＬＩＰ１０６クロラムフエ
ニコール抵抗性遺伝子内に存在するｐｓＵＰ１０６　Ｅ
ｃｏＲＴ部位に近位になるように方向づけられている。

ｐｌ＋４−１は韮１１部位２個をもち、これらはいずれ
も」旦選択可能マーカーの側面をかためている。

皿ＩＩ部位の一方が取り除かれ、それにより次のように
して体外コード化ＯＮへの挿入にとって有用な特異な４
ｎ部位を残すことができる：　ｐＨ４−１ＤＮＡをｎｌ
Ｉで部分消化させ、完全長の直線状ＤＮＡを電気泳動法
により単離した。次に粘性末端を。

Ｌｃｏｌｉ　ＤＮ八へリメラーゼ■のクレノー断片と一
緒に培養することにより取り除いた。その結果生した平
滑末端ＤＮＡをそれ自身に連結し、　Ｅ、　　ｃｏｌｉ
に形質転換した。クロラムフェニコールに抵抗性の形質
転換体から単離したプラスミドＤＮＡを、制限分析でス
クリーニングした結果、　　ｐＨ４００と指定されたプ
ラスミドを包含するコロニーが確認された。ｐＨ４００
は、１１１部位が」Ｕ遺伝子とＯＲＦ　１プロモーター
のあいだにはなく、かつ特異なｐＨ４００」し１１部位
が」■遺伝子とｏｃｓ遺伝子の間に存在すること以外は
、　　ｐＨ４−１と同一であった。

乍　５：＾ＭＶ４　　・タンパク゛　云　の　１１４０
０への腫大 ｐＤＯＢＡ４　ＯＮＡを」■■で消化し１次に」「■−
直直線肌脱燐化れたｐＨ４００ＤＮＡと混合してこれと
連結した。ＭＣ１０６１に形質転換し、クロラムフェニ
コール抵抗に対して選択されたのち、プラスミドＤＮＡ
を制限分析で性質を調べた。コロニーはｐ　Ｈ４００」
訂■部位に挿入されている被覆タンパク遺伝子を有し、
　　ｐＨ４００Ａ４と指定されたプラスミドを包含して
いることが確認された。このｐ）１４００Ａ４は完全長
のＡＭＶ　ＲＮＡ４配列をもつ被覆タンパク遺伝子を存
し、この遺伝子は３°−欠失」旦遺転子、」並。

およびカナマイシン選択可能マーカーに平行に方向づけ
られている。

１１６：植　ヅー転喚 ｐＨ４００Ａ４を当該分野で広く知られている３親交配
法（Ｒｕｖｋｕｎ　ＧＯａｎｄ　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ＦＭ
　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ匡：　８５−８８）、　
　またはＬ　並置１例えば５Ｍｌ０　（ＮＲＲＬＢ−１
５４８１）または５１７４（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５４８３
）　　（Ｓｉｍｏｎ　Ｒら（１９８２）　Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ、　　ｌ　：　７８４−７９１）の可動菌種か
ら交配によってＡ、　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　　Ｌ
ＢＡ４４０４　（Ｏｏｍｓ　Ｇら（１９８１）　Ｇｅｎ
ｅ　　１４　：　３３−５０）　、　　ｖｉｒ遺伝子包
含ミクロ−Ｔｉ可動菌種に移入した。タバコ葉組織はＭ
ａｇｅｎ　ｔａ箱内で無菌的に生育した生育４週間また
は５週間のＸａｎｔｈｉＮｃ植物から採取した。

接種はＨｏｒｓｃｈ　ＲＢら（１９８５）　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　　２２７　：１２２９−１２３１の方法の改良法
によった。接種剤はし一プロス１０ｍ１にアゲロバクチ
リア２ループを植えつけて調製した。パスツールピペッ
トを用いた強制的なピペット移入により懸濁させた後、
接種剤を直ちに適用した。葉を切り取り、中筋を取り除
いた；切断表面をし一ブロスで湿らし１葉が湿った状態
を保つようにした。葉片は巾約２〜４龍で長さ約７〜１
０１歳であった。葉断片を接種剤に５〜１０分漬けた。

しかしある実験では２葉片を簡単に接種剤に漬けた場合
やファクムフラスコ中で接種剤に浸潤した場合もある。

次に葉片を滅菌濾紙上で吸い取って乾燥し、　Ｘａｎｔ
ｈｉ懸濁培養液から調製した培養皿（ｆｅｅｄｅｒ　ｐ
ｌａｔｅ）上で逆さまに置いた。培養皿にはＳＭＰｉ培
養基が入れられている（ＳＭｌ’ｉ　：　　０．１可／
ｌｐ−りｏｏフェノキシ酢！　（ｐＣＰＡ）と７．５ｍ
ｇ／ｆｆ６−　（８，８−ジメチルアリルアミノ）プリ
ン（２ｉＰ）を追加したＭＸ−；　ＭＸ−：　１．６５
　ｇ　／　ｌ　　ＮＩｌ、ＮＯ３゜１．９ｇ／　ｌ　Ｋ
ＮＯｘ、　４４０＊／　Ｉ　ＣａＣ１ｚ　・２ＨｚＯ，
３７０ｒｒｅ／Ｉ　ＭｇＳＯ４・７Ｈｚ０．　１７０ｍ
ｇ／ｆ　ＫＩＩｚＰＯａ、　０．８３ｍｇ／　ｌ　Ｋｌ
、　６．２ｍｇ／　１１１ＪＯｉ、　２２．３ｍｇ／　
ｌ　ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０，８，６ｎｗ／１ＺｎＳＯ，
・７ＨｚＯ，０，２５ｗ／Ｎ　Ｎａ２ＭｏＯ，・２Ｈｚ
Ｏ，０，０２５ｗ／　ｊ！　　Ｃｕ５Ｏｎ　・５ＨｚＯ
，０，０２５ｍｇ／　ｌＣｏＣ１ｚ　−５ＨｚＯ，３７
，２３ｍｇ／　ｌ　Ｎａｚ・ＥＤＴＡ、　　２７．８５
ｍｇ／７！ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０，１ｇ　／　Ｉｔイノ
シトール、５０ｍｇ／ｌニコチン酸、５０■／ｌビロキ
シジン・ＨＣＩ、　５０■／ｌチアミン・ＨＣｌ、　　
３０ｇ／ｌ蔗糖、　ｐＨ５，８゜８ｇ／ｌカンテンで固
化）。４〜６日後葉片を培養皿から取り出し、５００■
／ｌカルベニシリン。

５０■／ｌクロキサシリン、１００〜３００■／ｌカナ
マイシン（最適２００ｍｇ／　ｌ　）を追加したＳＭＰ
ｉ培養基の上に置いた。この結果生じた分枝を切り取り
１００〜３００■／ｌカナマイシン（最適２００■／１
）を追加したＭＸ−培養基の上に置いた。

（ｐＨ４００Ａ４）によって形質転換された細胞の系統
をひくもので、自己培養されたものである。形質転換体
の中に被覆タンパクが存在することが酵素結合免疫吸着
剤検定（ＥＬＩＳＡ）　（表１）によって確認され、被
覆タンパク遺伝子転写の存在がノーザンブロソト分析で
確かめられた。この結果生じた種子は１００〜３００■
／βカナマイシン（最適２００■／ｌ）を追加したＭＸ
−上で発芽し、被覆タンパク遺伝子保有Ｔ−ＤＮＡを含
有する極植物となる。被覆タンパクが検出できる濃度で
存在することは被覆タンパクの存在と絶対的な相関関係
にはない；ごれは、挿入された遺伝子発現の相対的濃度
が、異なった形質転換現象から生じる組織の中では、変
化することを明らかにしたＴ−ＤＮＡ形質転換の研究か
ら予測される。形質転換していない対照のタバコ植物と
被覆タンパク遺伝子含有タバコ植物とがカーポランダム
研磨葉にＡＭＶピリオン（ウィルス粒子）を接種するこ
とにより検討された。対照植物にくらべて被覆タンパク
遺伝子をもっている植物は、　　ＡＭＶ感染に対して抵
抗力があるかまたは症状の程度が低いかまたは遅れて現
れ、そしてそれはその植物の組織中の被覆タンパクの濃
度に依存していることが観察された。

・　　１８：　・　　ンパク　２のインビトロ１゜ＡＭ
Ｖ惑染感染立は被覆タンパク依存性であることが知られ
ている。この被覆タンパクは接種剤（遊離被覆タンパク
としてまたはバイロンの形態。

のいずれかで）の一部として供給されるかまたは接種剤
の中にＲＮＡ４がある場合は、感染の過程の初期に合成
され得る。もし形質転換された原形質体が被覆タンパク
を含んでいるならば、感染の確立はもはや接種剤中の被
覆タンパクやメソセンジャー　ＲＮＡの存在に依存しな
いだろう。タバコ原形質体はＳａｍａｃ　ＤＡら（１９
８３）ν１ｒｏ１．１３１　：　４５５−４６２が記述
した方法に従って調製され実質的に接種された。主な改
良は、　　ＲＮＡを原形質体ペレットに少量（例：　１
０”　ｌ　）加え９次にこれをポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）添加の前に残りの上澄液に懸濁させたことに
ある。ＡＭＶ　ＲＮＡ４に欠けるＲＮＡ製剤で被覆タン
パク含有原形質体の接種を行うと、高度に感染を生じた
；形質転換していない原形質体を同様に接種すると１本
質的には全く感染を生じなかった（表２）。実際、被覆
タンパクｍＲＮＡを欠いた調製物での形質転換原形質体
の感染レベルは。

４つの成分全部を有するＲＮＡｊ１Ｍ製物で非形質転換
原形質体の接種に対してよりも高くさえあった。

これは形質転換された原形質体が生物学的に活性である
ことを実証している。

タバコ原形質体は、　　ＲＮＡについて上に述べたよう
にしてＡＭＶピリオンにより本質的にインビトロで感染
される。形質転換したタバコ植物または対照のタバコ植
物に由来するタバコ原形質体を使用した典型的な実験で
は、対照の原形質体は、被覆タンパクを含をしている原
形質体より感染のレベルが低いことがＥＬＩＳＡ検定で
示された（表３）。

保護の程度は異なるが、　　ＡＭＶ被覆タンパクを含む
原形質体についての感染レベルは、非形質転換の対照に
ついて観察されたものより常に低かった。

このことから、植物細胞中にＡＭＶ被覆タンパクが存在
すると、アルファルファモザイクウィルスによる感染か
ら細胞が防護され得ることが実証された。

（以下余白） 表１ り丑　　タバコにおける　　タンパクの１４−５　　　
　　　　　　＋　　　　　　　２３１８　　　　　　　
　２１０２７−４　　　　　　　　　＋　　　　　　　
　１３１　　　　　　　　２１２７−３５　　　　　　
　　＋　　　　　　　　５９１　　　　　　　　４８３
７−２　　　　　　　　　＋　　　　　　　　１３２７
　　　　　　　　１０１３７−４　　　　　　　　　＋
　　　　　　　　１４１０　　　　　　　　１７６３７
−５　　　　　　　　　＋　　　　　　　　５０２　　
　　　　　　５１表ユ 形質転換されたタバコにおける被覆タンパクの防護作用
形質転換されて　　　　　　　０６２ いないタバコ 形蕾云換体　１４−１　　　　３８　　　　　　　　　
　　３２実験２ 形ηオ云模されて　　　　　　！ＪＤ　　　　　　　　
　　　　　９８いないタハ”コ 形質転換体　１４−Ｉ　　　　　ＮＯ２１１４−５ＮＯ
４４ 実験３ 形宮云換されて　　　　　　　０　　　　　　　　　　
　　　５０いないタバコ 形嘗云挨体　１４−１　　　　　３．９　　　　　　　
　　　　９３０５　　　　　１．２　　　　　　　　　
　５６３０６　　　　　０．４　　　　　　　　　　３
６（発明の要約） 本発明は、目標の植物ウィルスの被覆タンパクを含有す
る植物細胞の製造法を開示する。さらに。

被覆タンパク遺伝子の構築および被覆タンパク遺伝子の
植物細胞中への移入を教授する。このような細胞は、被
覆タンパクを含有しない細胞と比較すると、目標のウィ
ルスによる感染に対してかなりの耐性を有する。その上
、被覆タンパクを含有する植物細胞を生産する方法およ
びその生産に有用なりＮＡ分子を開示する。

以　　−ヒ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プロモーターとウィルス被覆タンパク構造遺伝子と
   を有し、該プロモーターと該構造遺伝子とはお互いに被
   覆タンパクコード化ＲＮＡが該プロモーターの制御のも
   とで転写されるような位置と方向にあるＤＮＡ分子。 ２、さらに転写ターミネーターを有し、該プロモーター
   、該構造遺伝子、および該ターミネーターはプロモータ
   ーとターミネーターとの制御のもとで翻訳可能被覆タン
   パク転写が植物細胞内で転写されるような位置と方向に
   ある特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 ３、前記被覆タンパクが一本鎖、正鎖構造の３分割ＲＮ
   Ａゲノムをもった植物ウィルスのＤＮＡである特許請求
   の範囲第２項に記載のＤＮＡ。 ４、前記被覆タンパクがアルファルファモザイクウィル
   スグループのウィルスのものである特許請求の範囲第３
   項に記載のＤＮＡ。 ５、前記ウィルスがＡＭＶである特許請求の範囲第４項
   に記載のＤＮＡ。 ６、前記ウィルスがＡＭＶ株４２５である特許請求の範
   囲第５項に記載のＤＮＡ。 ７、前記プロモーターがＣａＭＶ　１９Ｓプロモーター
   である特許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。 ８、前記転写ターミネーターがポリアデニレーション部
   位である特許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。 ９、前記ポリアデニレーション部位がＣａＭＶポリアデ
   ニレーション部位である特許請求の範囲第８項に記載の
   ＤＮＡ。 １０、さらに植物−発現可能、選択可能またはスクリー
   ニング可能なマーカーを有する特許請求の範囲第２項に
   記載のＤＮＡ。 １１、前記選択可能マーカーがネオマイシンフォスフォ
   トランスフェラーゼをコードする特許請求の範囲第１０
   項に記載のＤＮＡ。 １２、さらに￥ｏｃｓ￥遺伝子を有する特許請求の範囲
   第１０項に記載のＤＮＡ。 １３、ＤＮＡがさらにｐＨ４００のＴ−ＤＮＡを有する
   特許請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ。 １４、ＤＮＡがｐＨ４００Ａ４である特許請求の範囲第
   １３項に記載のＤＮＡ。 １５、さらにＴ−ＤＮＡボーダーリピートを有する特許
   請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ。 １６、ＤＮＡがバクテリア細胞に含有される特許請求の
   範囲第２項に記載のＤＮＡ。 １７、特許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡを含有する
   バクテリア細胞。 １８、前記プロモーター／前記構造遺伝子／前記ターミ
   ネーターの組み合わせが植物ＤＮＡで側面をかためられ
   ている特許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ。 １９、ＤＮＡが植物細胞、植物組織、植物種子、または
   植物により含有されている特許請求の範囲第１８項に記
   載のＤＮＡ。 ２０、特許請求の範囲第１８項に記載のＤＮＡを含有す
   る植物細胞、植物組織、植物種子、または植物。 ２１、ＤＮＡが植物細胞、植物組織、植物種子、または
   植物に含有される特許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ
   。 ２２、特許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡを含有する
   植物細胞、植物組織、植物または植物種子。 ２３、ウィルスにおかされておらず、かつウィルスの被
   覆タンパクを含有する植物細胞、植物組織、植物種子ま
   たは植物。 ２４、前記ウィルスが一本鎖、正鎖、３分割ＲＮＡゲノ
   ムをもつ特許請求の範囲第２３項に記載の細胞、組織、
   種子、または植物。 ２５、前記ウィルスがアルファルファモザイクウィルス
   グループのウィルスである特許請求の範囲第２４項に記
   載の細胞、組織、種子または植物。 ２６、前記ウィルスがＡＭＶである特許請求の範囲第２
   ５項に記載の細胞、組織、種子または植物。 ２７、前記ウィルスがＡＭＶ株４２５である特許請求の
   範囲第２６項に記載の細胞、組織、種子または植物。 ２８、ウィルス抵抗性植物を生産する方法であって、該
   方法は、ウィルス被覆タンパク構造遺伝子をコードする
   ＤＮＡ分節を作ること、および該構造遺伝子分節をプロ
   モーターに連結することを包含し；このプロモーターと
   構造遺伝子とは、該プロモーターの制御のもとで被覆タ
   ンパクコード化ＲＮＡが転写されるような相互の位置と
   方向を持っている、方法。 ２９、特許請求の範囲第２８項に記載の方法であって、
   該方法はさらに該構造遺伝子分節を転写ターミネーター
   に連結することを包含し、該プロモーター、該構造遺伝
   子、そして該ターミネーターはプロモーターとターミネ
   ーターの制御のもとで翻訳可能タンパク転写が植物細胞
   内で転写されるような相互の位置と方向を持ち、これに
   よって被覆タンパク遺伝子が形成される、方法。 ３０、特許請求の範囲第２９項に記載の方法であって、
   該方法は最初の植物細胞を形質転換させてプロモーター
   、ウィルス被覆タンパク構造遺伝子をコードするＤＮＡ
   断片および転写ターミネーターを有するＤＮＡ分子を含
   有させることをさらに包含し、該プロモーター、該構造
   遺伝子分節、および該ターミネーターは翻訳可能被覆タ
   ンパク転写が最初の植物細胞から世代の下った第２の植
   物細胞の内で該プロモーターと該ターミネーターの制御
   のもとで転写されるような相互位置および方向関係にあ
   る。 ３１、前記被覆タンパクが一本鎖、正鎖、３分割ＲＮＡ
   ゲノムをもつ植物ウィルスのものである特許請求の範囲
   第２９項に記載の方法。 ３２、前記被覆タンパクがアルファルファモザイクウィ
   ルスグループのウィルスのものである特許請求の範囲第
   ３１項に記載の方法。 ３３、前記ウィルスがＡＭＶである特許請求の範囲第３
   ２項に記載の方法。 ３４、前記ウィルスがＡＭＶ株４２５である特許請求の
   範囲第３３項に記載の方法。 ３５、前記ＤＮＡ分子がさらに植物−発現可能、選択可
   能またはスクリーニング可能マーカーを有する特許請求
   の範囲第３０項に記載の方法。 ３６、前記選択可能マーカーがネオマイシンフォスフォ
   トランスフェラーゼをコードする特許請求の範囲第３５
   項に記載の方法。 ３７、特許請求の範囲第３５項に記載の方法であって、
   該方法は選択可能マーカーが抵抗を授与する選択性試薬
   の存在で第１または第２植物細胞を培養することを包含
   する、方法。 ３８、前記選択性試薬がカナマイシンまたはその類似物
   である特許請求の範囲第３７項に記載の方法。 ３９、特許請求の範囲第３０項に記載の方法であって、
   該方法は該ＤＮＡを￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥細
   胞に導入することをさらに包含し、形質転換工程がＤＮ
   Ａを含む￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥細胞で最初の
   植物細胞を感染させることによって完成し、かつ該形質
   転換工程の被覆タンパク、遺伝子保有ＤＮＡはさらにＴ
   −ＤＮＡボーダーリピートを有する、方法。 ４０、前記ＤＮＡはさらに￥ｏｃｓ￥を有する特許請求
   の範囲第３９項に記載の方法。 ４１、さらにアミノエチルシステインの存在下で第１植
   物細胞または第２植物細胞を培養することを包含する特
   許請求の範囲第４０項に記載の方法。 ４２、前記ＤＮＡがさらにｐＨ４００を有する特許請求
   の範囲第４０項に記載の方法。 ４３、前記ＤＮＡがｐＨ４００Ａ４である特許請求の範
   囲第４２項に記載の方法。 ４４、特許請求の範囲第２９項に記載の方法で生産され
   た植物細胞、植物組織、植物種子、または植物。 ４５、特許請求の範囲第３０項に記載の方法で生産され
   た第１細胞を祖先とする植物細胞、植物組織、植物種子
   、または植物。 ４６、特許請求の範囲第３０項に記載の方法で生産され
   た第２細胞を含む植物細胞、植物組織、植物種子、また
   は植物。