JPS63283587A - 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 - Google Patents
植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法Info
- Publication number
- JPS63283587A JPS63283587A JP63103749A JP10374988A JPS63283587A JP S63283587 A JPS63283587 A JP S63283587A JP 63103749 A JP63103749 A JP 63103749A JP 10374988 A JP10374988 A JP 10374988A JP S63283587 A JPS63283587 A JP S63283587A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- gene
- region
- acceptor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 65
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 291
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims abstract description 81
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 45
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 34
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 66
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 61
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 6
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 128
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 111
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 77
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 50
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 32
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 26
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 24
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 21
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 20
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 description 19
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 17
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 17
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 16
- 230000006870 function Effects 0.000 description 16
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 16
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 16
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 16
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 16
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 11
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 11
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 9
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 9
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 101150086864 apt gene Proteins 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 7
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 241001058146 Erium Species 0.000 description 6
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 6
- 102000002027 Tuberin Human genes 0.000 description 6
- 108050009309 Tuberin Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- SZCZSKMCTGEJKI-UHFFFAOYSA-N tuberin Natural products COC1=CC=C(C=CNC=O)C=C1 SZCZSKMCTGEJKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 5
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 5
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 4
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000003491 array Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical group ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150005851 NOS gene Proteins 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 3
- 101150050191 apl gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 3
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 150000002972 pentoses Chemical group 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 2
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 2
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 244000178827 Leea guineensis Species 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 2
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- ZBAHWUPMIUQRQO-SOFGYWHQSA-N (e)-n-cyclohexyl-3-(5-nitrofuran-2-yl)prop-2-enamide Chemical compound O1C([N+](=O)[O-])=CC=C1\C=C\C(=O)NC1CCCCC1 ZBAHWUPMIUQRQO-SOFGYWHQSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCWLJSDMOMMDRF-SZWOQXJISA-N 3-[(3s,6r)-2-oxo-6-[(1s,2r,3r)-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl]morpholin-3-yl]propanamide Chemical compound NC(=O)CC[C@@H]1NC[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO)OC1=O HCWLJSDMOMMDRF-SZWOQXJISA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- ILQOASSPNGAIBC-UHFFFAOYSA-N Agropine Natural products OC(O)C(O)CC(O)C1CN2C(CCC2=O)C(=O)O1 ILQOASSPNGAIBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108091027551 Cointegrate Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000283986 Lepus Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000699811 Pedetidae Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150035718 Pno1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000006687 ag medium Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 244000000005 bacterial plant pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229940088530 claforan Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940075894 denatured ethanol Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000001152 parietal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- -1 phosphate ester Chemical class 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は組換え分子、その調製法、植物細胞へのその導
入法、およびゲノム中に外来ＤＮＡ配列を含んでいる植
物細胞またはその植物に関する。
入法、およびゲノム中に外来ＤＮＡ配列を含んでいる植
物細胞またはその植物に関する。
更に詳しくは、本発明は適当な宿主植物細胞中で発現さ
れるＤＮＡ配列に関する。本発明に係る組換えＤＮＡ分
子は、植物の成長、栄養物としてのその品質の改良、ま
たは有用な代謝物（例えばアルカロイドあるいはステロ
イドの前駆体）の生産、に有用なアミノ酸やポリペプチ
ドの如き生産物を暗号化している配列を有することをそ
の特徴としている。
れるＤＮＡ配列に関する。本発明に係る組換えＤＮＡ分
子は、植物の成長、栄養物としてのその品質の改良、ま
たは有用な代謝物（例えばアルカロイドあるいはステロ
イドの前駆体）の生産、に有用なアミノ酸やポリペプチ
ドの如き生産物を暗号化している配列を有することをそ
の特徴としている。
以下に本明細書で使用する用語について説明する。
ｂｏｗサイト 特異的にｍｏｂ機能体が相互作用して自
律的ＤＮＡ転移移動を開始させるＤＮＡ領域境界配列
Ｔ−ＤＮＡの末端を含むＤＮＡ配列広範囲宿主レプリコ
ン 多種多様の宿主細胞に転移（トランスファー）され
、保持され得るＤＮＡ分子 カルス組織 未組織、未分化の細胞の塊クローニング
無性生殖により、１個の生物またはＤＮＡ配列から一部
の該生物またはＤＮＡ配列を得る操作過程、または、よ
りわかり易く言えば、特定の生物またはその一部を分離
し、そのサブフラクションを均質な集団として増殖させ
る操作過程 クローニング媒体 宿主細胞中で複製し得るプラスミド
、ファージＤＮＡまたほそめ他のＤＮＡ配列であって、
そのＤＮＡ配列は、例えば複製、外殻蛋白質の生産など
、そのＤＮＡの必須の生物学的機能、あるいはプロモー
ターまたは結合部位を付随的に失なうことなく、その場
所で正確にその配列を切断することのできる１個または
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を持っており、また
、それが導入された細胞（形質転換された細胞）を同定
確認するのに有用なマーカー（例えばテトラサイクリン
耐性あるいはアンピシリン耐性）を持っていることで特
徴づけられる。クローニング媒体は、しばしばベクター
とも呼ばれる。
律的ＤＮＡ転移移動を開始させるＤＮＡ領域境界配列
Ｔ−ＤＮＡの末端を含むＤＮＡ配列広範囲宿主レプリコ
ン 多種多様の宿主細胞に転移（トランスファー）され
、保持され得るＤＮＡ分子 カルス組織 未組織、未分化の細胞の塊クローニング
無性生殖により、１個の生物またはＤＮＡ配列から一部
の該生物またはＤＮＡ配列を得る操作過程、または、よ
りわかり易く言えば、特定の生物またはその一部を分離
し、そのサブフラクションを均質な集団として増殖させ
る操作過程 クローニング媒体 宿主細胞中で複製し得るプラスミド
、ファージＤＮＡまたほそめ他のＤＮＡ配列であって、
そのＤＮＡ配列は、例えば複製、外殻蛋白質の生産など
、そのＤＮＡの必須の生物学的機能、あるいはプロモー
ターまたは結合部位を付随的に失なうことなく、その場
所で正確にその配列を切断することのできる１個または
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を持っており、また
、それが導入された細胞（形質転換された細胞）を同定
確認するのに有用なマーカー（例えばテトラサイクリン
耐性あるいはアンピシリン耐性）を持っていることで特
徴づけられる。クローニング媒体は、しばしばベクター
とも呼ばれる。
暗号配列 ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するＤＮ
Ａ配列 相互組込み体（コインテグレート） ２個の環状ＤＮＡ
分子間の単一交叉により得られる構造体トランス相補性
他のレプリコンに物理的に結合していないＤＮＡ分子
（レプリコン）が、その結合していない他のレプリコン
にとって必要かつ欠落している拡散性物質を供給するこ
とができる過程 接合（コンジュゲーション）細胞同志の接触により、１
つのタイプの細菌から他のタイプの細菌にＤＮＡが転移
すること ｆｔｍ、ｔ 相同なＤＮＡ配列間で遺伝物質が交換す
ること 欠損置換 １個のＤＮＡ配列が除去され、その代りとし
て異なったＤＮＡ配列で置換されること９（ｅ ある
細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得し、更にそれを維
持すること り、ＮＡ配列またはＤＮＡセグメント 隣接するペント
ースの３′位と５゛位の炭素間の燐酸ジエステル結合に
より互いに連結したヌクレオチド群の一直線の配列 二重乗換 相互組込み（コインテグレート）構造が２個
の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程は遺伝情報
を交換するのに利用される。このＤＮＡ環状体の一方は
、それによって組換えが生じ得る標的ＤＮＡと相同な２
つの領域を持っており、この２つの領域は、標的ＤＮＡ
と交換される非相同ＤＮＡ配列をはさんでいる。もし１
回目の交叉と２回目の交叉が同じＤＮＡ領域で起ると、
もとのＤＮＡ環状体が生成する。この２回目の交叉が第
２の相同領域で起ると、２つの環状体の間で遺伝子の交
換が起ることになる。
Ａ配列 相互組込み体（コインテグレート） ２個の環状ＤＮＡ
分子間の単一交叉により得られる構造体トランス相補性
他のレプリコンに物理的に結合していないＤＮＡ分子
（レプリコン）が、その結合していない他のレプリコン
にとって必要かつ欠落している拡散性物質を供給するこ
とができる過程 接合（コンジュゲーション）細胞同志の接触により、１
つのタイプの細菌から他のタイプの細菌にＤＮＡが転移
すること ｆｔｍ、ｔ 相同なＤＮＡ配列間で遺伝物質が交換す
ること 欠損置換 １個のＤＮＡ配列が除去され、その代りとし
て異なったＤＮＡ配列で置換されること９（ｅ ある
細胞の子孫が特殊な構造と機能を獲得し、更にそれを維
持すること り、ＮＡ配列またはＤＮＡセグメント 隣接するペント
ースの３′位と５゛位の炭素間の燐酸ジエステル結合に
より互いに連結したヌクレオチド群の一直線の配列 二重乗換 相互組込み（コインテグレート）構造が２個
の環状ＤＮＡ分子に分解する過程。この過程は遺伝情報
を交換するのに利用される。このＤＮＡ環状体の一方は
、それによって組換えが生じ得る標的ＤＮＡと相同な２
つの領域を持っており、この２つの領域は、標的ＤＮＡ
と交換される非相同ＤＮＡ配列をはさんでいる。もし１
回目の交叉と２回目の交叉が同じＤＮＡ領域で起ると、
もとのＤＮＡ環状体が生成する。この２回目の交叉が第
２の相同領域で起ると、２つの環状体の間で遺伝子の交
換が起ることになる。
＆里 構造遺伝子によりポリペプチドが生産される過
程。これは転写と翻訳の組合せである。
程。これは転写と翻訳の組合せである。
発現調節（コントロール）配列 構造遺伝子に有効に結
合された場合、それらの構造遺伝子の発現を調節し、統
制するヌクレオチド配列 Ｆ型プラスミド Ｆ因子（Ｆはｆｅｒｔｉｌｉｔｙ（生
殖力））を持ったプラスミドであって、Ｆ因子を持たな
い宿主に該プラスミドのコピーを移入することのできる
プラスミド 遺伝子 ２つの部分、即ち（１）遺伝子生産物のための
暗号配列および（２）その遺伝子が発現されるかどうか
を調節しているプロモーター領域内の配列、から構成さ
れているＤＮＡ配列 乞乙血 細胞またはゲイルスの全ＤＮＡ０これは、ま
ずポリペプチドを暗号化している構造遺伝子、更にオペ
レーター、プロモーター、リボゾームの結合配列および
相互作用配列（たとえばＳ ｈｉｎｅ−Ｄ ａ１ｇａｒ
ｎｏ配列）を含んでいる。
合された場合、それらの構造遺伝子の発現を調節し、統
制するヌクレオチド配列 Ｆ型プラスミド Ｆ因子（Ｆはｆｅｒｔｉｌｉｔｙ（生
殖力））を持ったプラスミドであって、Ｆ因子を持たな
い宿主に該プラスミドのコピーを移入することのできる
プラスミド 遺伝子 ２つの部分、即ち（１）遺伝子生産物のための
暗号配列および（２）その遺伝子が発現されるかどうか
を調節しているプロモーター領域内の配列、から構成さ
れているＤＮＡ配列 乞乙血 細胞またはゲイルスの全ＤＮＡ０これは、ま
ずポリペプチドを暗号化している構造遺伝子、更にオペ
レーター、プロモーター、リボゾームの結合配列および
相互作用配列（たとえばＳ ｈｉｎｅ−Ｄ ａ１ｇａｒ
ｎｏ配列）を含んでいる。
遺伝子型 ある生物に含まれている遺伝情報の全て
相同的（性）組換え 相同配列を含んでいるＤＮＡ上の
２つ領域間の組換え Ｉ型プラスミド Ｆとは異なる不和合性グループの一群
の自律転移性プラスミド 不和合性 選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕ
ｒｅ）がないと、同一の細胞に２個のＤＮＡが共存し得
ないこと 私 あるＤＮＡ配列を、別の分子のＤＮＡ配列内に付加
すること リーダー配列 ５“末端から最初の構造遺伝子の先端に
至るまでのｍＲＮＡ上の領域。これには構造遺伝子の暗
号配列の翻訳を開始するのに重要な部位が含まれている
。
２つ領域間の組換え Ｉ型プラスミド Ｆとは異なる不和合性グループの一群
の自律転移性プラスミド 不和合性 選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕ
ｒｅ）がないと、同一の細胞に２個のＤＮＡが共存し得
ないこと 私 あるＤＮＡ配列を、別の分子のＤＮＡ配列内に付加
すること リーダー配列 ５“末端から最初の構造遺伝子の先端に
至るまでのｍＲＮＡ上の領域。これには構造遺伝子の暗
号配列の翻訳を開始するのに重要な部位が含まれている
。
減数分裂 はじめの４ｎ個の染色体が、２回の連続した
分裂により生成した４個の細胞のそれぞれにＩｎ個ずつ
分布するようになる過程。この過程は有性生殖に於いて
重要である。
分裂により生成した４個の細胞のそれぞれにＩｎ個ずつ
分布するようになる過程。この過程は有性生殖に於いて
重要である。
ｍｏｂ （授動機能体） ｔｒａ機能体との組合せに
於いてのみＤＮＡの転移を促す一連の生成物。ｌ１ｏｂ
はｂｏｗサイトを含んでいるプラスミドの移動を促すこ
とができる。
於いてのみＤＮＡの転移を促す一連の生成物。ｌ１ｏｂ
はｂｏｗサイトを含んでいるプラスミドの移動を促すこ
とができる。
授動（モビリゼーション）別の細胞へ転移することので
きないＤＮＡ分子が、他のＤＮＡ分子の助けを借りて転
移する過程 授動ヘルパープラスミド 他のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ転移するための拡散性生成物を供給
することができるプラスミド非接合性組換えプラスミド
細胞同志の接触により、それ自体では、もとの宿主細
胞から他の宿主細胞へ転移することができないＤＮＡ分
子。転移するには、他のＤＮＡ、例えばヘルパープラス
ミドによって供給される機能体が必要となる。
きないＤＮＡ分子が、他のＤＮＡ分子の助けを借りて転
移する過程 授動ヘルパープラスミド 他のプラスミドが持っていな
い、別の宿主細胞へ転移するための拡散性生成物を供給
することができるプラスミド非接合性組換えプラスミド
細胞同志の接触により、それ自体では、もとの宿主細
胞から他の宿主細胞へ転移することができないＤＮＡ分
子。転移するには、他のＤＮＡ、例えばヘルパープラス
ミドによって供給される機能体が必要となる。
ヌクレオチド 糖部分（ペントース）、燐酸エステルお
よび含窒素異頃環塩基から構成される装置ＤＮＡまたは
ＲＮＡの単量体単位。この塩基は糖部分とゲリコシド結
合で連結しており（ペントースの１′位の炭素）、この
塩基と糖とが結合したものがヌクレオシドである。ヌク
レオチドの特性はこの塩基によって決まる。ＤＮＡの４
個の塩基はアデニン（“Ａ”）、グアニン（“Ｇ”）、
シトシン（Ｃ”）およびチミン（“Ｔ”）である。ＲＮ
Ａの４個の塩基はＡ、ＧＳＣおよびウラシル（“Ｕ”）
である。
よび含窒素異頃環塩基から構成される装置ＤＮＡまたは
ＲＮＡの単量体単位。この塩基は糖部分とゲリコシド結
合で連結しており（ペントースの１′位の炭素）、この
塩基と糖とが結合したものがヌクレオシドである。ヌク
レオチドの特性はこの塩基によって決まる。ＤＮＡの４
個の塩基はアデニン（“Ａ”）、グアニン（“Ｇ”）、
シトシン（Ｃ”）およびチミン（“Ｔ”）である。ＲＮ
Ａの４個の塩基はＡ、ＧＳＣおよびウラシル（“Ｕ”）
である。
表現形質 発育環境と遺伝子形質との相互関係によって
生成する個体の観察し得る特性プラスミド それ自体が
宿主細胞中で複製される、完全な（無傷の）レプリコン
からなる非染色体性の２本鎖ＤＮＡ配列。このプラスミ
ドを単細胞生物に入れると、そのプラスミドのＤＮＡに
よって、その生物の性質が変わる、即ち形質転換される
。例えば、テトラサイクリン耐性（Ｔｃ”）のための遺
伝子を持ったプラスミドにより、本来はテトラサイクリ
ンに感受性のある細胞が耐性のある細胞に形質転換され
る。プラスミドによって形質転換された細胞を形質転換
体と呼ぶ。
生成する個体の観察し得る特性プラスミド それ自体が
宿主細胞中で複製される、完全な（無傷の）レプリコン
からなる非染色体性の２本鎖ＤＮＡ配列。このプラスミ
ドを単細胞生物に入れると、そのプラスミドのＤＮＡに
よって、その生物の性質が変わる、即ち形質転換される
。例えば、テトラサイクリン耐性（Ｔｃ”）のための遺
伝子を持ったプラスミドにより、本来はテトラサイクリ
ンに感受性のある細胞が耐性のある細胞に形質転換され
る。プラスミドによって形質転換された細胞を形質転換
体と呼ぶ。
ポリペプチド 隣接するアミノ酸どうしがα−アミノ基
とカルボキシル基とのペプチド結合により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域 遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤＮＡ配列プロモーター配列
ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列であり、ポリメラー
ゼはそれより下流の配列の忠実な転写を促進する。
とカルボキシル基とのペプチド結合により互いに連結し
た線状のアミノ酸連鎖 プロモーター領域 遺伝子の転写を統制している、暗号
配列の開始点より上流のＤＮＡ配列プロモーター配列
ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列であり、ポリメラー
ゼはそれより下流の配列の忠実な転写を促進する。
組換えＤＮＡ分子または雑種（ハイブリッド）ＤＮＡ
少な（とも２個のヌクレオチド配列からなり、その一
方の配列は、自然界では通常第２の配列と共存しない、
その様な配列からなる雑種のＤＮＡ配列 、１ｍ、ｔ ＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の一部分の
新しい結合体を創製すること 相同領域 ＤＮＡの別の領域に於ける配列と同じＤＮＡ
配列を持っているＤＮＡ領域 レプリコン ＤＮＡの複製開始サイトおよび複製を支配
するのに必要な機能を指定している遺伝子を持った自己
複製遺伝子単位 制限フラグメント 特定の標的ＤＮＡ配列を認識する酵
素による２本鎖開裂によって生じるＤＮＡ分子 ＲＮＡポリメラーゼ ＤＮＡのＲＮＡへの転写をつかさ
どる酵素 選択可能なマーカー遺伝子 あるＤＮＡ配列であって、
それがある細胞内で発現された時、そのＤＮＡ配列を含
んでいない細胞より増殖しやすい有利性をその細胞に与
えるＤＮＡ配列。細胞を適当な選択的増殖培地に置くと
、この２つのタイプの細胞を区別することができる。通
常使用される選択可能なマーカー遺伝子は抗生物質耐性
を暗号化している遺伝子である。
少な（とも２個のヌクレオチド配列からなり、その一
方の配列は、自然界では通常第２の配列と共存しない、
その様な配列からなる雑種のＤＮＡ配列 、１ｍ、ｔ ＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の一部分の
新しい結合体を創製すること 相同領域 ＤＮＡの別の領域に於ける配列と同じＤＮＡ
配列を持っているＤＮＡ領域 レプリコン ＤＮＡの複製開始サイトおよび複製を支配
するのに必要な機能を指定している遺伝子を持った自己
複製遺伝子単位 制限フラグメント 特定の標的ＤＮＡ配列を認識する酵
素による２本鎖開裂によって生じるＤＮＡ分子 ＲＮＡポリメラーゼ ＤＮＡのＲＮＡへの転写をつかさ
どる酵素 選択可能なマーカー遺伝子 あるＤＮＡ配列であって、
それがある細胞内で発現された時、そのＤＮＡ配列を含
んでいない細胞より増殖しやすい有利性をその細胞に与
えるＤＮＡ配列。細胞を適当な選択的増殖培地に置くと
、この２つのタイプの細胞を区別することができる。通
常使用される選択可能なマーカー遺伝子は抗生物質耐性
を暗号化している遺伝子である。
単一乗換 ２個の環状ＤＮＡ分子を組換えて、相互組込
みされた大きい環状体を形成させる操作過程 構造遺伝子 ポリペプチドを暗号化している遺伝子 Ｔ−ＤＮＡ 植物細胞ゲノムに安定に組込まれること
が見い出されているＴｉプラスミドの部分子−領域 植
物細胞ゲノムへ転移するＤＮＡ配列を含んでいるＴｉプ
ラスミドの部分 子ｉプラスミド 感受性植物に腫瘍（クラウンガル）を
誘発させるための遺伝情報を含んでいるＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株に存在する大
きいプラスミド ＴＬ−ＤＮＡおよびＴＲ−ＤＮＡ オクトピンクラウ
ンガル腫瘍細胞は２つのＴ−ＤＮＡ配列、即ち左Ｔ−Ｄ
ＮＡ（ＴＬ−ＤＮＡ）および右Ｔ−ＤＮＡ（ＴＲ−ＤＮ
Ａ）を含有し得る。ＴＬ−ＤＮＡはツバリン腫瘍細胞の
Ｔ−ＤＮＡと共通している配列を持っているがＴＲ−Ｄ
ＮＡは持っていない。
みされた大きい環状体を形成させる操作過程 構造遺伝子 ポリペプチドを暗号化している遺伝子 Ｔ−ＤＮＡ 植物細胞ゲノムに安定に組込まれること
が見い出されているＴｉプラスミドの部分子−領域 植
物細胞ゲノムへ転移するＤＮＡ配列を含んでいるＴｉプ
ラスミドの部分 子ｉプラスミド 感受性植物に腫瘍（クラウンガル）を
誘発させるための遺伝情報を含んでいるＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株に存在する大
きいプラスミド ＴＬ−ＤＮＡおよびＴＲ−ＤＮＡ オクトピンクラウ
ンガル腫瘍細胞は２つのＴ−ＤＮＡ配列、即ち左Ｔ−Ｄ
ＮＡ（ＴＬ−ＤＮＡ）および右Ｔ−ＤＮＡ（ＴＲ−ＤＮ
Ａ）を含有し得る。ＴＬ−ＤＮＡはツバリン腫瘍細胞の
Ｔ−ＤＮＡと共通している配列を持っているがＴＲ−Ｄ
ＮＡは持っていない。
ｔｒａ （転移機能（体）） プラスミドに暗号化され
ている拡散性の生成物、および細胞間のＤＮＡ転移の際
に利用される作用部位の両者を指す。例えば２つの細胞
の間に橋を作るのに必要な生成物およびＤＮＡ転移が開
始する部位。
ている拡散性の生成物、および細胞間のＤＮＡ転移の際
に利用される作用部位の両者を指す。例えば２つの細胞
の間に橋を作るのに必要な生成物およびＤＮＡ転移が開
始する部位。
（亙 構造遺伝子からｍＲＮＡが生産される過程、また
は、塩基対（ベースペア）の形成により、ＤＮＡに含ま
れている遺伝情報に基きそれに相浦的な塩基配列をもつ
ＲＮＡ鎖が形成される過程形質転換 細胞のＤＮＡ補体
（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に外来性ＤＮＡが導入される
ことによって生じる遺伝的修飾 側獣 ｍＲＮＡからポリペプチドが生産される過程、あ
るいは、ｍＲＮＡ分子に存在する遺伝情報が、ポリペプ
チド合成において特定のアミノ酸の順序を指定する過程 非分化表現形質 いかなる特異な部分もなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクター 異なった宿主細胞間を転移するように設計さ
れたＤＮＡ分子 組換えＤＮＡ技術の進歩によって、微生物の遺伝子工学
に新たな展望が開けた。もし１個の体細胞から、完全な
生物を再生することができたら、これらの技術は多細胞
真核生物にまで広がるであろう。ある種の高等植物の細
胞は、優れた再生能力を有し、従って高等生物の遺伝子
工学にとってかっこうの材料となる。
は、塩基対（ベースペア）の形成により、ＤＮＡに含ま
れている遺伝情報に基きそれに相浦的な塩基配列をもつ
ＲＮＡ鎖が形成される過程形質転換 細胞のＤＮＡ補体
（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に外来性ＤＮＡが導入される
ことによって生じる遺伝的修飾 側獣 ｍＲＮＡからポリペプチドが生産される過程、あ
るいは、ｍＲＮＡ分子に存在する遺伝情報が、ポリペプ
チド合成において特定のアミノ酸の順序を指定する過程 非分化表現形質 いかなる特異な部分もなく、組織中の
細胞の外観が均一であること ベクター 異なった宿主細胞間を転移するように設計さ
れたＤＮＡ分子 組換えＤＮＡ技術の進歩によって、微生物の遺伝子工学
に新たな展望が開けた。もし１個の体細胞から、完全な
生物を再生することができたら、これらの技術は多細胞
真核生物にまで広がるであろう。ある種の高等植物の細
胞は、優れた再生能力を有し、従って高等生物の遺伝子
工学にとってかっこうの材料となる。
植物の遺伝子工学の主たる問題点は、外来性ＤＮＡを植
物ゲノムに導入する為の系の利用性にある。この様な系
には、ダラム陰性土壌細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｉ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓが持っている腫瘍誘起（Ｔ
ｉ）プラスミドがある。この微生物は、広範囲の双子
葉植物の損傷組織に、クラウンガル（ｃｒ。
物ゲノムに導入する為の系の利用性にある。この様な系
には、ダラム陰性土壌細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｉ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓが持っている腫瘍誘起（Ｔ
ｉ）プラスミドがある。この微生物は、広範囲の双子
葉植物の損傷組織に、クラウンガル（ｃｒ。
Ｖｎｇａｌｌ、冠状コブ）と呼ばれる腫瘍性形質転換を
引き起す原因となることがわかっている。この増殖性の
腫瘍は、オパイン（ｏｐｉｎｅｓ）と呼ばれるＴｉに特
異な新しい代謝物を合成する。この形質転換は、分子レ
ベルでみると、Ｔｉプラスミドの実体のはっきりわかっ
ているＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）フラグメントが植物細
胞ゲノムに転移して安定に組込まれたことによって起る
。換言すれば、クラウンガル腫瘍は、その染色体ＤＮＡ
に、腫瘍セルラインをもたらしたＴｉプラスミド中のＤ
ＮＡ配列と相同のＴ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡセグメン
トを含んでいる。あらゆる場合に於いて、このＴ−ＤＮ
Ａは、連続した一連のＴｉプラスミドＤＮＡに相当して
おり、また、これと共直線性である。
引き起す原因となることがわかっている。この増殖性の
腫瘍は、オパイン（ｏｐｉｎｅｓ）と呼ばれるＴｉに特
異な新しい代謝物を合成する。この形質転換は、分子レ
ベルでみると、Ｔｉプラスミドの実体のはっきりわかっ
ているＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）フラグメントが植物細
胞ゲノムに転移して安定に組込まれたことによって起る
。換言すれば、クラウンガル腫瘍は、その染色体ＤＮＡ
に、腫瘍セルラインをもたらしたＴｉプラスミド中のＤ
ＮＡ配列と相同のＴ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡセグメン
トを含んでいる。あらゆる場合に於いて、このＴ−ＤＮ
Ａは、連続した一連のＴｉプラスミドＤＮＡに相当して
おり、また、これと共直線性である。
従ってこれはＴ−領域と呼ばれる。
Ｔｉプラスミドはクラウンガル細胞で合成されたオパイ
ンのタイプによって分類される。クラウンガル細胞でツ
バリン［Ｎ−α−（１，３−ジカルボキシプロビル）−
Ｌ−アルギニンコの合成を惹起させるＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ株はツバリン株と呼ばれ、オクトピン［Ｎ−
α−（Ｎ−１−カルボキシエチル）−Ｌ−アルギニン］
を合成するものはオクトピン株と呼ばれる。これらが最
も普通に用いられるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株で
ある。
ンのタイプによって分類される。クラウンガル細胞でツ
バリン［Ｎ−α−（１，３−ジカルボキシプロビル）−
Ｌ−アルギニンコの合成を惹起させるＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ株はツバリン株と呼ばれ、オクトピン［Ｎ−
α−（Ｎ−１−カルボキシエチル）−Ｌ−アルギニン］
を合成するものはオクトピン株と呼ばれる。これらが最
も普通に用いられるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株で
ある。
植物の遺伝手術にＴ−ＤＮＡをベクターとして使用する
試みがモデル実験で行なわれた。この実験では・インビ
ボにおいて、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔ３７
株のＴｉプラスミドからのＴ−ＤＮＡの右側境界部の近
くに１４ｋｂ細菌性トランスポツン（ｔｒａｎｓｐｏｓ
ｏｎ） Ｔｎ ７が挿入された。すると、このＴｉプラ
スミドを持っているアゲロバクチリアによって惹起され
る腫瘍中のツバリン合成が消滅した。更に、サザーン・
プロッティング・ハイブリダイゼーションの結果、その
様な挿入を行なわなければ正常であるＴ−ＤＮＡ配列の
一部分として、この腫瘍の染色体ＤＮＡ中に全Ｔｎ７が
存在することがわかった（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓら
、Ｎａｔｕｒｅ２８７（１９８０）、６５４−６５６；
Ｈｏ１ｓｔｅｒｓら、Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ
、 １８５ （１９８２） 、２８３−２８９）。こ
の様に、２３ｋｂＴ−ＤＮＡに１４ ｋｂＤ Ｎ Ａフ
ラグメントを導入しても、２３ ｋｂＴ−ＤＮＡの植物
細胞ゲノムへの転移能力に変化は見られなかった。
試みがモデル実験で行なわれた。この実験では・インビ
ボにおいて、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔ３７
株のＴｉプラスミドからのＴ−ＤＮＡの右側境界部の近
くに１４ｋｂ細菌性トランスポツン（ｔｒａｎｓｐｏｓ
ｏｎ） Ｔｎ ７が挿入された。すると、このＴｉプラ
スミドを持っているアゲロバクチリアによって惹起され
る腫瘍中のツバリン合成が消滅した。更に、サザーン・
プロッティング・ハイブリダイゼーションの結果、その
様な挿入を行なわなければ正常であるＴ−ＤＮＡ配列の
一部分として、この腫瘍の染色体ＤＮＡ中に全Ｔｎ７が
存在することがわかった（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓら
、Ｎａｔｕｒｅ２８７（１９８０）、６５４−６５６；
Ｈｏ１ｓｔｅｒｓら、Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ
、 １８５ （１９８２） 、２８３−２８９）。こ
の様に、２３ｋｂＴ−ＤＮＡに１４ ｋｂＤ Ｎ Ａフ
ラグメントを導入しても、２３ ｋｂＴ−ＤＮＡの植物
細胞ゲノムへの転移能力に変化は見られなかった。
７″リン、 ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴ ３７のＴ
ｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界部は非常に正確に調べ
られている。これは全／バリンＴｉプラスミドの極く一
部、約２３ｋｂに過ぎない。更に、このＴ−ＤＮＡの境
界部は知られている：即ち、このＴ−ＤＮＡの境界部を
決めているヌクレオチド配列が調べられ、ツバリンＴｉ
プラスミドの同じ領域と比較された（Ｚ ａｍｂｒｙｓ
ｋｉら、Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２０９ （１９８０）、
１３８５ １３９１：Ｚａｍｂｒｙｓｋｉら、Ｊ、 Ｍ
ｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 １（１９８２）
、−３６１−３７０”）。このＴ−領域の境界部が、Ｔ
−ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの組込みに最も関係してい
る様である。
ｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界部は非常に正確に調べ
られている。これは全／バリンＴｉプラスミドの極く一
部、約２３ｋｂに過ぎない。更に、このＴ−ＤＮＡの境
界部は知られている：即ち、このＴ−ＤＮＡの境界部を
決めているヌクレオチド配列が調べられ、ツバリンＴｉ
プラスミドの同じ領域と比較された（Ｚ ａｍｂｒｙｓ
ｋｉら、Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２０９ （１９８０）、
１３８５ １３９１：Ｚａｍｂｒｙｓｋｉら、Ｊ、 Ｍ
ｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 １（１９８２）
、−３６１−３７０”）。このＴ−領域の境界部が、Ｔ
−ＤＮＡの植物細胞ゲノムへの組込みに最も関係してい
る様である。
ＤＮＡを植物細胞へ転移させる為のベクターとしてＴｉ
プラスミドを使用するには、転移したＤＮＡの境界部を
決めているＴ−ＤＮＡ配列を知ることが基本的に必要で
ある。そうすれば、外来性ＤＮＡをこの境界内に挿入し
、確実に植物細胞ゲノムへ転移させることができる。更
に、この系を利用しようとすれば、形質転換された植物
細胞が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、正
常であるということが重要である。Ｔ−ＤＮＡ転移の後
、正常細胞を生産するには、Ｔ−ＤＮＡ自体によって暗
号化されている機能を知る必要がある。
プラスミドを使用するには、転移したＤＮＡの境界部を
決めているＴ−ＤＮＡ配列を知ることが基本的に必要で
ある。そうすれば、外来性ＤＮＡをこの境界内に挿入し
、確実に植物細胞ゲノムへ転移させることができる。更
に、この系を利用しようとすれば、形質転換された植物
細胞が、その生育特性において腫瘍の性質を持たず、正
常であるということが重要である。Ｔ−ＤＮＡ転移の後
、正常細胞を生産するには、Ｔ−ＤＮＡ自体によって暗
号化されている機能を知る必要がある。
従って、どの領域が腫瘍表現形質に関係しているか調べ
るために、ＴｉプラスミドのＴ−領域の徹底的な遺伝子
分析が行なわれた。
るために、ＴｉプラスミドのＴ−領域の徹底的な遺伝子
分析が行なわれた。
Ｔ−ＤＮＡは、クラウンガル表現形質の原因となる機能
体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡの特定
の領域に局在化している（ Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢ
ＯＪ、１（１９８２）、１４７−１５２ ； Ｗｉｌｌ
ｍｉｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）。
体を暗号化している。その遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡの特定
の領域に局在化している（ Ｌｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢ
ＯＪ、１（１９８２）、１４７−１５２ ； Ｗｉｌｌ
ｍｉｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）。
１３９−１４６ ）。一般に、腫瘍カルス組織の非分化
表現形質を支配している少なくとも４つの遺伝子が存在
している。これらの遺伝子の突然変異体（ミュータント
）は、新芽様のあるいは根の様な外観の形質転換組織を
形成させることができる。
表現形質を支配している少なくとも４つの遺伝子が存在
している。これらの遺伝子の突然変異体（ミュータント
）は、新芽様のあるいは根の様な外観の形質転換組織を
形成させることができる。
この後者の成果は、腫瘍組織ではなく正常植物組織中で
発現させる為にＤＮＡを植物に転移したいと思う場合に
は特に重要である。
発現させる為にＤＮＡを植物に転移したいと思う場合に
は特に重要である。
最近、完全な正常植物に再生することができる形質転換
新芽を誘導するＴｉプラスミド変異体がみつかった。こ
れらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分裂によってＴ
−ＤＮＡ特異配列を伝達することさえした：即ち、子孫
の植物もＴ−ＤＮＡ特異配列を含んでいた（Ｏｔｔｅｎ
ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ。
新芽を誘導するＴｉプラスミド変異体がみつかった。こ
れらの植物は繁殖力が旺盛であり、減数分裂によってＴ
−ＤＮＡ特異配列を伝達することさえした：即ち、子孫
の植物もＴ−ＤＮＡ特異配列を含んでいた（Ｏｔｔｅｎ
ら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、１８３（１９８１）、２０９−２１３ ）
。
。
しかし、この形質転換植物組織は、その染色体ＤＮＡ中
に、腫瘍表現形質を支配しているＴ−ＤＮＡ領域が除去
される大がかりな欠損（欠失）が発生したことにより、
著しく小さくなったＴ−ＤＮＡを含んでいた。この欠損
が当初の形質転換時に起つたのか、新芽の形成をもたら
すその後の過程で起ったのかは不明である。
に、腫瘍表現形質を支配しているＴ−ＤＮＡ領域が除去
される大がかりな欠損（欠失）が発生したことにより、
著しく小さくなったＴ−ＤＮＡを含んでいた。この欠損
が当初の形質転換時に起つたのか、新芽の形成をもたら
すその後の過程で起ったのかは不明である。
Ｔｉプラスミドは太きく（２００ｋｂ）、そのＴｉプラ
スミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子が植物
の形質転換に関係している。従って、Ｔ−領域内の適切
な場所に特殊なエンドヌクレアーゼ認識サイトを有し、
Ｔ−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定に挿入す
るのに必要な全ての機能を持ったＴｉプラスミド由来の
小型のクローニングベクターを組み立てることは不可能
である。
スミドの種々の場所に存在している多くの遺伝子が植物
の形質転換に関係している。従って、Ｔ−領域内の適切
な場所に特殊なエンドヌクレアーゼ認識サイトを有し、
Ｔ−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させて安定に挿入す
るのに必要な全ての機能を持ったＴｉプラスミド由来の
小型のクローニングベクターを組み立てることは不可能
である。
所望のＤＮＡフラグメントをＴｉプラスミドのＴ−領域
の特定の制限酵素開裂サイトに導入する為の既知の方法
の１つは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （大腸
ｍ）におけると同様、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕＩｌｌ
においても複製することができ、Ｔ−ＤＮＡの所望の制
限フラグメントを含んでいるクローニングプラスミドを
組み立てることである。この様なクローニングベクター
は「中間ベクター」と命名された。この様な中間ベクタ
ーは、Ｔ−領域によって暗号化されている機能を分析す
るのに使用された（ Ｌｅｅａ＋ａｎｓ ら、Ｊ、
Ｍｏ１． Ａｐｐｌｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １
（１９８１）、１４９−１６４）。
の特定の制限酵素開裂サイトに導入する為の既知の方法
の１つは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （大腸
ｍ）におけると同様、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕＩｌｌ
においても複製することができ、Ｔ−ＤＮＡの所望の制
限フラグメントを含んでいるクローニングプラスミドを
組み立てることである。この様なクローニングベクター
は「中間ベクター」と命名された。この様な中間ベクタ
ーは、Ｔ−領域によって暗号化されている機能を分析す
るのに使用された（ Ｌｅｅａ＋ａｎｓ ら、Ｊ、
Ｍｏ１． Ａｐｐｌｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １
（１９８１）、１４９−１６４）。
本発明は、発現し得る遺伝子を植物細胞ゲノムへ導入す
る方法に関するものである。本発明の１つの目的は所望
のあらゆる遺伝子（群）を導入することのできる改良さ
れたアクセプターＴｉプラスミドを提供することにある
。導入される所望の遺伝子（群）は、そのアクセプター
Ｔｉプラスミドの相当する領域と相同の領域を持った新
規な中間クローニングベクター内に含まれている。この
中間クローニングベクターを提供することも本発明の目
的の１つである。
る方法に関するものである。本発明の１つの目的は所望
のあらゆる遺伝子（群）を導入することのできる改良さ
れたアクセプターＴｉプラスミドを提供することにある
。導入される所望の遺伝子（群）は、そのアクセプター
Ｔｉプラスミドの相当する領域と相同の領域を持った新
規な中間クローニングベクター内に含まれている。この
中間クローニングベクターを提供することも本発明の目
的の１つである。
所望の遺伝子（群）のアクセプターＴｉプラスミドへの
導入は、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに保持されてい
るアクセプターＴｉプラスミドと中間クローニングベク
ターの２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一乗換
えによって達成される。この中間クローニングベクター
は、ヘルパープラスミドを使って、それが増殖するＥ
５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔからＡｇｒ。
導入は、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに保持されてい
るアクセプターＴｉプラスミドと中間クローニングベク
ターの２つの相同ＤＮＡセグメントの間で起る単一乗換
えによって達成される。この中間クローニングベクター
は、ヘルパープラスミドを使って、それが増殖するＥ
５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔからＡｇｒ。
ｂａｃｔｅｒｉｕｍに授動される。この様なヘルパープ
ラスミドおよび授動のための機能は知られている（Ｆ
ｉｎｎｅｇａｎら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、 １８５ （１９８２）、３４４ ３５１；
Ｆｉｇｕｒｓｋｉら、Ｐ ｒｏｃ。
ラスミドおよび授動のための機能は知られている（Ｆ
ｉｎｎｅｇａｎら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、 １８５ （１９８２）、３４４ ３５１；
Ｆｉｇｕｒｓｋｉら、Ｐ ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７６（１９７
９）；Ｄ １ｔｔａら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７７（１９８０）、
７３４７）。
９）；Ｄ １ｔｔａら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ７７（１９８０）、
７３４７）。
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍでの単一乗換えの結果、
ハイブリッドＴｉプラスミドベクターが得られる。この
様なハイブリッドＴｉプラスミドも本発明の目的の１つ
である。
ハイブリッドＴｉプラスミドベクターが得られる。この
様なハイブリッドＴｉプラスミドも本発明の目的の１つ
である。
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに保持されたこのハイブ
リッドプラスミドベクター（以降、ベクター組成物とい
う）を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所望の遺伝
子生成物の発現についてスクリーニングする。植物細胞
をベクター組成物で感染させて形質転換植物細胞を調製
するこの方法、その形質転換された植物細胞、およびそ
れから発生した植物を提供することも本発明の目的であ
る。この技法はＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの植物転
移性のプラスミド全てに適用することができる。
リッドプラスミドベクター（以降、ベクター組成物とい
う）を直接植物細胞の感染に使用し、次いで所望の遺伝
子生成物の発現についてスクリーニングする。植物細胞
をベクター組成物で感染させて形質転換植物細胞を調製
するこの方法、その形質転換された植物細胞、およびそ
れから発生した植物を提供することも本発明の目的であ
る。この技法はＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの植物転
移性のプラスミド全てに適用することができる。
以下に添付の図面について詳細に説明する。
第１図は、境界配列（１）および（２）を除き、Ｔ−領
域の内部部分を除去して得られる本発明のアクセプター
Ｔｉプラスミドの１態様を示している。
域の内部部分を除去して得られる本発明のアクセプター
Ｔｉプラスミドの１態様を示している。
この境界配列は、Ｔ−領域を植物細胞ゲノムに組込むの
に必須である。境界配列（１）と（２）の間の領域（３
）が、植物に転移されるであろうＤＮＡセグメントであ
る。このアクセプターＴｉプラスミドは、中間クローニ
ングベクターを単一乗換えによって組込まずことを可能
にしている中間クローニングベクター内のＤＮＡ配列の
少なくとも一部と相同のＤＮＡ配列を持ったＤＮＡセグ
メント（３）を含んでいる。Ｔｉプラスミド領域（４）
は、Ａｇｒｏｂａｃ ｔ ｅｒ ｉ ｕｍによってＴ−
領域が植物細胞ゲノムに転移するのに必要な機能を暗号
化している。この領域は、ｖｉｒ−領域と呼ばれる。
に必須である。境界配列（１）と（２）の間の領域（３
）が、植物に転移されるであろうＤＮＡセグメントであ
る。このアクセプターＴｉプラスミドは、中間クローニ
ングベクターを単一乗換えによって組込まずことを可能
にしている中間クローニングベクター内のＤＮＡ配列の
少なくとも一部と相同のＤＮＡ配列を持ったＤＮＡセグ
メント（３）を含んでいる。Ｔｉプラスミド領域（４）
は、Ａｇｒｏｂａｃ ｔ ｅｒ ｉ ｕｍによってＴ−
領域が植物細胞ゲノムに転移するのに必要な機能を暗号
化している。この領域は、ｖｉｒ−領域と呼ばれる。
第２図は、単一乗換えによって第１図のアクセプターＴ
ｉプラスミドに挿入される本発明の中間クローニングベ
クターを示している。このベクターは、所望の単一乗換
えを可能にするアクセプターＴｉプラスミドのＤＮＡセ
グメント（３）の少なくとも一部と相同なＤＮＡ配列を
持ったクローニング媒体ＤＮＡセグメント（３′）を含
んでいる。
ｉプラスミドに挿入される本発明の中間クローニングベ
クターを示している。このベクターは、所望の単一乗換
えを可能にするアクセプターＴｉプラスミドのＤＮＡセ
グメント（３）の少なくとも一部と相同なＤＮＡ配列を
持ったクローニング媒体ＤＮＡセグメント（３′）を含
んでいる。
更に、この中間クローニングベクターは、その天然のプ
ロモーター配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群（５）
を含んでいる。この組み立てに於いては、一般に植物の
遺伝子を使用することができる。
ロモーター配列を備えた遺伝子あるいは遺伝子群（５）
を含んでいる。この組み立てに於いては、一般に植物の
遺伝子を使用することができる。
それは、他のものに比較して発現され易いと思われるか
らである。しかし、原理的には、全ゆる所望の遺伝子を
挿入することができる。この中間クローニングベクター
は選択マーカー遺伝子（６）を含んでいてもよい。この
遺伝子は、植物細胞中でこの遺伝子の発現を可能にする
プロモーター配列を含んでいなければならない。このマ
ーカー遺伝子を含んでいる植物細胞は、それを含んでい
ない細胞より、成長の選択有利性を持っていなければな
らない。何故なら、この様にして、このマーカー遺伝子
を含んでいるＤＮＡによって形質転換された植物細胞を
、非形質転換細胞と区別することができるからである。
らである。しかし、原理的には、全ゆる所望の遺伝子を
挿入することができる。この中間クローニングベクター
は選択マーカー遺伝子（６）を含んでいてもよい。この
遺伝子は、植物細胞中でこの遺伝子の発現を可能にする
プロモーター配列を含んでいなければならない。このマ
ーカー遺伝子を含んでいる植物細胞は、それを含んでい
ない細胞より、成長の選択有利性を持っていなければな
らない。何故なら、この様にして、このマーカー遺伝子
を含んでいるＤＮＡによって形質転換された植物細胞を
、非形質転換細胞と区別することができるからである。
第３図は、第２図の中間クローニングベクターと類似の
、第１図のアクセプターＴｉプラスミドに単一乗換えに
よって挿入される本発明に係る中間クローニングベクタ
ーのもう１つの態様を示している。これは、クローニン
グ媒体ＤＮＡセグメン）（３’） 、所望の遺伝子の統
制のとれた発現を可能にする外来性プロモーター配列（
８）、および、所望により、マーカー遺伝子（６）を含
んでいる。
、第１図のアクセプターＴｉプラスミドに単一乗換えに
よって挿入される本発明に係る中間クローニングベクタ
ーのもう１つの態様を示している。これは、クローニン
グ媒体ＤＮＡセグメン）（３’） 、所望の遺伝子の統
制のとれた発現を可能にする外来性プロモーター配列（
８）、および、所望により、マーカー遺伝子（６）を含
んでいる。
第４図は、第１図のアクセプターＴｉプラスミドおよび
第２図並びに第３図の中間クローニングベクターからの
、単一乗換えによる本発明に係るハイブリッドＴｉプラ
スミドベクターの調製を示す模式図である。
第２図並びに第３図の中間クローニングベクターからの
、単一乗換えによる本発明に係るハイブリッドＴｉプラ
スミドベクターの調製を示す模式図である。
第５図は、Ｅ、 ｃｏｌｉからアクセプターＴｉプラス
ミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの、
中間クローニングベクターの遺伝子転移に関する諸過程
を概略したものである。第１段階は、中間クローニング
ベクターを含んでいるＥ、 ｃｏｌｉ株（１）と、その
後のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋との接合の為の
２つのへルバープラスミドを含んでいるもう１つのＥ、
ｃ。
ミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの、
中間クローニングベクターの遺伝子転移に関する諸過程
を概略したものである。第１段階は、中間クローニング
ベクターを含んでいるＥ、 ｃｏｌｉ株（１）と、その
後のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋との接合の為の
２つのへルバープラスミドを含んでいるもう１つのＥ、
ｃ。
ｌｉ株との接合である。１方のヘルパープラスミドはプ
ラスミド転移に重要なＤＮＡ配列（ｔｒａ）を含んでお
り、他方のヘルパープラスミドは授動に重要な配列（＋
＋＋ｏｂ）を含んでいる。接合によってこれらのヘルパ
ープラスミドがＥ、 ｃｏｌｉ株（１）に導入されると
、そこに含まれている中間クローニングベクターが他の
細菌株へ転移することができる様になる。ｔｒａおよび
ｍｏｂヘルパープラスミドは、中間クローニングベクタ
ーが持っている抗生物質耐性マーカー（Ａｂ”）とは異
なるマーカー、Ａｂ”およびＡｂ”をそれぞれ持ってい
る。従って、全てのプラスミドが存在するかどうかを選
択培地上でモニターすることができる。こうして授動株
（３）が得られる。
ラスミド転移に重要なＤＮＡ配列（ｔｒａ）を含んでお
り、他方のヘルパープラスミドは授動に重要な配列（＋
＋＋ｏｂ）を含んでいる。接合によってこれらのヘルパ
ープラスミドがＥ、 ｃｏｌｉ株（１）に導入されると
、そこに含まれている中間クローニングベクターが他の
細菌株へ転移することができる様になる。ｔｒａおよび
ｍｏｂヘルパープラスミドは、中間クローニングベクタ
ーが持っている抗生物質耐性マーカー（Ａｂ”）とは異
なるマーカー、Ａｂ”およびＡｂ”をそれぞれ持ってい
る。従って、全てのプラスミドが存在するかどうかを選
択培地上でモニターすることができる。こうして授動株
（３）が得られる。
この授勤株（３）を、第１図のアクセプターＴｉプラス
ミドを含んでいるＡ 、 ｔ ｕｍｅｆ ａｃ １ｅｎ
ｓ株（４）と接合させ、中間クローニングベクターの抗
生物質耐性マーカーで選択する。中間クローニングベク
ターはＡ ｇｒ□ｔ）ａｃｔｅｒｉｕＩ＋＋中で複製で
きないので、受容アクセプターＴｉプラスミドと相互組
込み体を形成した場合にのみ、保持されることができる
。
ミドを含んでいるＡ 、 ｔ ｕｍｅｆ ａｃ １ｅｎ
ｓ株（４）と接合させ、中間クローニングベクターの抗
生物質耐性マーカーで選択する。中間クローニングベク
ターはＡ ｇｒ□ｔ）ａｃｔｅｒｉｕＩ＋＋中で複製で
きないので、受容アクセプターＴｉプラスミドと相互組
込み体を形成した場合にのみ、保持されることができる
。
Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中のこの相互組込み構造
体（５）が、ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させるのに
使用される最終的なハイブリッドＴｉプラスミドである
。
体（５）が、ＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移させるのに
使用される最終的なハイブリッドＴｉプラスミドである
。
第６図は、第１図に示したものと同類のモデルアクセプ
ターＴｉプラスミド（タイプＡ）の組み立てを示してい
る。ここでは、Ｔｉプラスミドと、このもとのＴｉプラ
スミドの一部と置き換わるＤＮＡ配列を含んでいる別の
プラスミドとの間で、二重乗換えが起る。より具体的に
述べると、小さい方のプラスミドはクローニング媒体（
３）の中にＴ−領域の境界配列（１，２）を含んでいる
。二重乗換えの結果、Ｔ領域の内部のＴ部分が除去され
、代ってクローニング媒体で置き換えられる。得られた
アクセプターＴｉプラスミド（Ａ）は、境界配列（１，
２）の間に含まれているＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移
させることができる。得られた、形質転換されたＤＮＡ
は、Ｔｉプラスミド（Ａ）では腫瘍の増殖を支配してい
る遺伝子が除去されているので腫瘍性のクラウンガル組
織をつくらない。
ターＴｉプラスミド（タイプＡ）の組み立てを示してい
る。ここでは、Ｔｉプラスミドと、このもとのＴｉプラ
スミドの一部と置き換わるＤＮＡ配列を含んでいる別の
プラスミドとの間で、二重乗換えが起る。より具体的に
述べると、小さい方のプラスミドはクローニング媒体（
３）の中にＴ−領域の境界配列（１，２）を含んでいる
。二重乗換えの結果、Ｔ領域の内部のＴ部分が除去され
、代ってクローニング媒体で置き換えられる。得られた
アクセプターＴｉプラスミド（Ａ）は、境界配列（１，
２）の間に含まれているＤＮＡを植物細胞ゲノムに転移
させることができる。得られた、形質転換されたＤＮＡ
は、Ｔｉプラスミド（Ａ）では腫瘍の増殖を支配してい
る遺伝子が除去されているので腫瘍性のクラウンガル組
織をつくらない。
Ｔｉプラスミド（Ａ）は、クローニング媒体（３）と相
同性を有するあらゆる中間クローニングベクター用の極
めて普遍的なアクセプターＴｉプラスミドである。この
クローニング媒体（３）は通常のプラスミドでよく、例
えばｐＢＲ３２２またはその誘導体などによって置き換
えることができる。
同性を有するあらゆる中間クローニングベクター用の極
めて普遍的なアクセプターＴｉプラスミドである。この
クローニング媒体（３）は通常のプラスミドでよく、例
えばｐＢＲ３２２またはその誘導体などによって置き換
えることができる。
第７図は、中間クローニングベクターをＥ、ｃｏｌｉ宿
主細胞中で組み立てる工程を模式的に示したものである
。制限エンドヌクレアーゼサイトＲ，に囲まれた所望の
遺伝子（５）および制限エンドヌクレアーゼサイトＲ３
で囲まれた選択し得るマーカー遺伝子（６）を、酵素Ｒ
，およびＲ２の為のそれぞれ１つの制限サイトを含んで
いるクローニング媒体（３′）に挿入する。３つの分子
を全て制限酵素Ｒ，および／またはＲ１で消化し、ＤＮ
Ａリガーゼを用いてライゲーション（結紮）して中間ク
ローニングベクターを形成させる。このクローニング媒
体（３゛）は、細菌遺伝子学の選択マーカーとして使用
する抗生物質耐性（Ａｂ’りを暗号化しているもう１つ
のＤＮＡ配列を含んでいなければならない。所望の遺伝
子（５）はその天然のプロモーターまたは第２図および
第３図に概説した外来性プロモーターの支配下にある。
主細胞中で組み立てる工程を模式的に示したものである
。制限エンドヌクレアーゼサイトＲ，に囲まれた所望の
遺伝子（５）および制限エンドヌクレアーゼサイトＲ３
で囲まれた選択し得るマーカー遺伝子（６）を、酵素Ｒ
，およびＲ２の為のそれぞれ１つの制限サイトを含んで
いるクローニング媒体（３′）に挿入する。３つの分子
を全て制限酵素Ｒ，および／またはＲ１で消化し、ＤＮ
Ａリガーゼを用いてライゲーション（結紮）して中間ク
ローニングベクターを形成させる。このクローニング媒
体（３゛）は、細菌遺伝子学の選択マーカーとして使用
する抗生物質耐性（Ａｂ’りを暗号化しているもう１つ
のＤＮＡ配列を含んでいなければならない。所望の遺伝
子（５）はその天然のプロモーターまたは第２図および
第３図に概説した外来性プロモーターの支配下にある。
第８図は本発明に係るアクセプターＴｉプラスミド（タ
イプＢ）のもう１つの具体的態様を組み立てるための模
式図である。この態様では、境界配列（１）および（２
）のすぐ外側のＴｉ配列に相同の、それぞれＤＮＡ配列
（９）および（１０）を含んでいるクローニング媒体と
Ｔｉプラスミドとの間で二重乗換えが起る。この二重乗
換えによって、境界配列（１）および（２）を含んでい
るＴ−領域Ｔ全体が削除され、それがクローニング媒体
（３）で置き換えられる。Ｔｉプラスミド（Ｂ）は、境
界配列（１）および（２）の間にクローンされた所望の
遺伝子を含有している中間クローニングベクターのため
のアクセプターゼある（第９図参照）。
イプＢ）のもう１つの具体的態様を組み立てるための模
式図である。この態様では、境界配列（１）および（２
）のすぐ外側のＴｉ配列に相同の、それぞれＤＮＡ配列
（９）および（１０）を含んでいるクローニング媒体と
Ｔｉプラスミドとの間で二重乗換えが起る。この二重乗
換えによって、境界配列（１）および（２）を含んでい
るＴ−領域Ｔ全体が削除され、それがクローニング媒体
（３）で置き換えられる。Ｔｉプラスミド（Ｂ）は、境
界配列（１）および（２）の間にクローンされた所望の
遺伝子を含有している中間クローニングベクターのため
のアクセプターゼある（第９図参照）。
第９図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミド（Ｂ）
に単一乗換えによって挿入される本発明の中間クローニ
ングベクターを例示している。これは、所望の遺伝子（
５）の両端に位置する境界配列（１）および（２）を含
んでいる。これはまた、２つのプラスミド間の相同的組
換えを可能にするため、アクセプターＴｉプラスミド（
Ｂ）中のクローニング媒体配列と少なくとも一部が相同
であるクローニング媒体配列（３′）をも含んでいる。
に単一乗換えによって挿入される本発明の中間クローニ
ングベクターを例示している。これは、所望の遺伝子（
５）の両端に位置する境界配列（１）および（２）を含
んでいる。これはまた、２つのプラスミド間の相同的組
換えを可能にするため、アクセプターＴｉプラスミド（
Ｂ）中のクローニング媒体配列と少なくとも一部が相同
であるクローニング媒体配列（３′）をも含んでいる。
第１０図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミドおよ
びそれに対応する第９図の中間クローニングベクターか
ら、本発明のハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組
み立てを示す模式図である。
びそれに対応する第９図の中間クローニングベクターか
ら、本発明のハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組
み立てを示す模式図である。
単一乗換えによって第９図の中間クローニングベクター
が第８図のアクセプターＴｉプラスミド（Ｂ）に導入さ
れる。
が第８図のアクセプターＴｉプラスミド（Ｂ）に導入さ
れる。
第１１図〜第２０図は本発明をより具体的に例示するも
のである。
のである。
第１１図は、５．２ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメン
トＡｃｇＢ のｐＢＲ３２２への挿入を示している（Ｚ
ａｍｂｒｙｓｋｉ ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０９
（１９８０）。
トＡｃｇＢ のｐＢＲ３２２への挿入を示している（Ｚ
ａｍｂｒｙｓｋｉ ら、５ｃｉｅｎｃｅ ２０９
（１９８０）。
１３８５−１３９１）。このフラグメント ＡｃｇＢは
ツバリンＴｉプラスミドの左右の境界領域を含んでいる
。このクローンｐＡｃｇＢは、第６図に示した「Ａ−タ
イプ」のアクセプタープラスミド、ｐＧＶ３８５０の組
み立てに使用される。野生型Ｔｉプラスミドの左右の境
界領域を含んでいるこのクローンされた制限フラグメン
トを使って、クローンｐＡｃｇＢと類似のクローンを得
ることができることは、当業者には容易に理解されるは
ずである。
ツバリンＴｉプラスミドの左右の境界領域を含んでいる
。このクローンｐＡｃｇＢは、第６図に示した「Ａ−タ
イプ」のアクセプタープラスミド、ｐＧＶ３８５０の組
み立てに使用される。野生型Ｔｉプラスミドの左右の境
界領域を含んでいるこのクローンされた制限フラグメン
トを使って、クローンｐＡｃｇＢと類似のクローンを得
ることができることは、当業者には容易に理解されるは
ずである。
第１２図はツバリンＴｉプラスミドｐＧＶ３８３９のＴ
−領域を示している。Ｈｉｎｄｌｌｌ制限エンドヌクレ
アーゼサイトは（Ｈ）で示しである。変異したＨｉｎｄ
ｌｌｌフラグメント１９は（１９’）で示しである。カ
ナマイシンまたはネオマイシン耐性を付与するアセチル
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子はａｐｔで表わし、こ
れは黒（ぬりつぶした部分に存在している。Ｔ領域の境
界は矢印で示しである。ツバリンシンターゼ（ｓｙｎｔ
ｈａｓｅ）遺伝子はｎｏｓで表わした。数値は、Ｄ ｅ
ｐｉｃｋｅｒら（ｐｌａｓ＋ｓｉｄ。
−領域を示している。Ｈｉｎｄｌｌｌ制限エンドヌクレ
アーゼサイトは（Ｈ）で示しである。変異したＨｉｎｄ
ｌｌｌフラグメント１９は（１９’）で示しである。カ
ナマイシンまたはネオマイシン耐性を付与するアセチル
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子はａｐｔで表わし、こ
れは黒（ぬりつぶした部分に存在している。Ｔ領域の境
界は矢印で示しである。ツバリンシンターゼ（ｓｙｎｔ
ｈａｓｅ）遺伝子はｎｏｓで表わした。数値は、Ｄ ｅ
ｐｉｃｋｅｒら（ｐｌａｓ＋ｓｉｄ。
３（１９８０）、１９３−２１１）の方法による制限フ
ラグメントの大きさを表わしている。Ｔｉプラスミドｐ
ＧＶ３８３９は、実施例１およびそこに挙げた２つの文
献に従って組み立てることができる。
ラグメントの大きさを表わしている。Ｔｉプラスミドｐ
ＧＶ３８３９は、実施例１およびそこに挙げた２つの文
献に従って組み立てることができる。
第１３図は、アクセプターＴｉプラスミドｐＧｖ３８５
０の組み立てを示している。プラスミドｐＢＲ３２２ｐ
ＡｃｇＢ （第１１図）は、線状化した形で描いである
。ｐＢＲ３２２の配列は斜線を入れた領域で示し、ｐＢ
Ｒ３２２のアンピシリン耐性遺伝子はＡｐＲで示した。
０の組み立てを示している。プラスミドｐＢＲ３２２ｐ
ＡｃｇＢ （第１１図）は、線状化した形で描いである
。ｐＢＲ３２２の配列は斜線を入れた領域で示し、ｐＢ
Ｒ３２２のアンピシリン耐性遺伝子はＡｐＲで示した。
第１２図に示したｐＧＶ３８３９のＴ−領域の一部がこ
こに描かれている： ｐＡｃｇＢ との相同的組換え
に関与するＨｉｎｄｌｌｌフラグメント（１０’）およ
び（２３）およびａｐｔ遺伝子が含まれている。二重乗
換えによってｐＧＶ３８５０および失われたａｐｔ遺伝
子を含むもう１つのレプリコンが組み立てられる。
こに描かれている： ｐＡｃｇＢ との相同的組換え
に関与するＨｉｎｄｌｌｌフラグメント（１０’）およ
び（２３）およびａｐｔ遺伝子が含まれている。二重乗
換えによってｐＧＶ３８５０および失われたａｐｔ遺伝
子を含むもう１つのレプリコンが組み立てられる。
第１４図は、実施例２に詳細に記載した中間クローニン
グベクターｐＧＶ７００の組み立てを模式的に示したも
のである。制限エンドヌクレアーゼサイトを示すのに以
下の略号を用いた： Ｂ＝ＢａｍＨＩ、 Ｂｇ ＝Ｂｇ
ｌ ＩＩ 、 Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、 Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉ 、 Ｓ−３ａｌ ｌ５Ｓａ＋＝ＳｍａＩ。抗生物質
耐性を示すのに以下の略号を用いた：Ａｐ＝アンピシリ
ン、Ｃ＋ｅ＝クロラムフェニコール、５Ｌ１１＝ストレ
プトマイシン、Ｔｃ＝テトラサイクリン。
グベクターｐＧＶ７００の組み立てを模式的に示したも
のである。制限エンドヌクレアーゼサイトを示すのに以
下の略号を用いた： Ｂ＝ＢａｍＨＩ、 Ｂｇ ＝Ｂｇ
ｌ ＩＩ 、 Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、 Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉ 、 Ｓ−３ａｌ ｌ５Ｓａ＋＝ＳｍａＩ。抗生物質
耐性を示すのに以下の略号を用いた：Ａｐ＝アンピシリ
ン、Ｃ＋ｅ＝クロラムフェニコール、５Ｌ１１＝ストレ
プトマイシン、Ｔｃ＝テトラサイクリン。
ＴＬ−ＤＮＡで示した図の下部の数値は、この領域のＲ
ＮＡ転写体を示している（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒら、Ｅ
ＭＢＯＪ、１（１９８２）、１３９−１４６）。
ＮＡ転写体を示している（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒら、Ｅ
ＭＢＯＪ、１（１９８２）、１３９−１４６）。
第１５図は中間クローニングベクターｐＧＶ７５０の構
造を示している。その組み立ては実施例２に記載した。
造を示している。その組み立ては実施例２に記載した。
制限エンドヌクレアーゼサイトは、キロ塩基対（ｋｂ）
の数で表わしたその相対的位置で示した。Ｐｓｔｌサイ
トは示していないかに♂／Ｎｍ”領域に３つ、ｃｂ”遺
伝子に１つ存在する。
の数で表わしたその相対的位置で示した。Ｐｓｔｌサイ
トは示していないかに♂／Ｎｍ”領域に３つ、ｃｂ”遺
伝子に１つ存在する。
左右の境界領域も示しである。ｐＧＶ７５０ の組み立
てに使用されたＢｇｌ ＩＩ／ ＢａｍＨＩサイトおよ
び）（ｐ３１ ／ Ｓｍａ Ｉサイトが示されているが
、これはｐＧＶ７５０ には存在しない。影をつけた領
域はＴＬ−ＤＮＡに、黒い領域はＫ ｍＲ／ Ｎ ｔａ
”領域に、白ぬき部分は隣接するＴｉプラスミド配列に
、そして線はクローニング媒体ｐＢＲ３２５にそれぞれ
相当する。その他の略号は以下の意味を有する：０ｃｓ
−オクトピンシンターゼ、Ｃｍ”＝クロラムフェニコー
ル４性、ｃｂ” ＝カルベニシリン（アンピシリン類似
体）耐性、Ｋ ｍＲ／ Ｎ ｍＲ＝カナマイシン耐性／
ネオマイシン耐性。
てに使用されたＢｇｌ ＩＩ／ ＢａｍＨＩサイトおよ
び）（ｐ３１ ／ Ｓｍａ Ｉサイトが示されているが
、これはｐＧＶ７５０ には存在しない。影をつけた領
域はＴＬ−ＤＮＡに、黒い領域はＫ ｍＲ／ Ｎ ｔａ
”領域に、白ぬき部分は隣接するＴｉプラスミド配列に
、そして線はクローニング媒体ｐＢＲ３２５にそれぞれ
相当する。その他の略号は以下の意味を有する：０ｃｓ
−オクトピンシンターゼ、Ｃｍ”＝クロラムフェニコー
ル４性、ｃｂ” ＝カルベニシリン（アンピシリン類似
体）耐性、Ｋ ｍＲ／ Ｎ ｍＲ＝カナマイシン耐性／
ネオマイシン耐性。
第１６図は実施例３に詳細に記載した中間ベクターｐＧ
Ｖ７４５の組み立てを示している。ｐＧ■７４５は、第
８図に示した「Ｂタイプ」アクセプタープラスミド、ｐ
ＧＶ２２６０の組み立てに使用される。制限エンドヌク
レアーゼサイトは以下の略号で示した： Ｂ＝Ｂａｆｆ
ｌＨＩ、 Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ％Ｒ＝ＥｃｏＲＩ０
アンピシリン耐性遺伝子はＡｐＲで示した。斜線を施し
た領域はオクトピンＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の
左側と相同のＤＮＡを、白ぬき領域はオクトピンＴｉプ
ラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の右側と相同のＤＮＡを示し
ている。
Ｖ７４５の組み立てを示している。ｐＧ■７４５は、第
８図に示した「Ｂタイプ」アクセプタープラスミド、ｐ
ＧＶ２２６０の組み立てに使用される。制限エンドヌク
レアーゼサイトは以下の略号で示した： Ｂ＝Ｂａｆｆ
ｌＨＩ、 Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ％Ｒ＝ＥｃｏＲＩ０
アンピシリン耐性遺伝子はＡｐＲで示した。斜線を施し
た領域はオクトピンＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の
左側と相同のＤＮＡを、白ぬき領域はオクトピンＴｉプ
ラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の右側と相同のＤＮＡを示し
ている。
出発物質であるプラスミドｐＧＶＯ２１９およびｐＧＶ
Ｏ１２０についての物理的位置および記述は、ＤｅＶｏ
ｓらのＰｌａｓｍｉｄ ６（１９８１）、２４９−２５
３にみられる。
Ｏ１２０についての物理的位置および記述は、ＤｅＶｏ
ｓらのＰｌａｓｍｉｄ ６（１９８１）、２４９−２５
３にみられる。
第１７図はアクセプタープラスミドｐＧＶ２２６０の組
み立てを示している。ｐＧＶ２２１７ 中の欠損置換が
、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を付与する
アセチルホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｔで表
わしである）を含んでいる黒色部分で示しである。中間
ベクターｐＧＶ７４５（第１６図参照）は線状化して描
いである。これは第１６図に示したｐＧＶ７４５のＨｉ
ｎｄｌｌｌサイトで開裂したものである。ｐＢ Ｒ３２
２の配列は斜線を施した部分で示し、アンピシリン耐性
遺伝子はＡｐｌで示しである。二重乗換えによって、ｐ
Ｇ Ｖ ２２６０が組み立てられ、ａｐｔ遺伝子が失わ
れる。制限エンドヌクレアーゼサイトは以下の略号で示
した： Ｂ＝ＢａｍＨｌ５Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ５Ｒ
＝ＥｃｏＲ’Ｉ０ 第１８図は、ツバリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）のプ
ロモーターの下流の遺伝子を発現するためのプラスミド
ｐＬＧＶ２３８１の組み立てを示している。５°および
３”はそれぞれ転写開始と転写終了を意味し、ＡＴＧお
よびＴＡＡは翻訳開始および翻訳終了に使われるコドン
を表わしている。
み立てを示している。ｐＧＶ２２１７ 中の欠損置換が
、ネオマイシンとカナマイシンに対する耐性を付与する
アセチルホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｔで表
わしである）を含んでいる黒色部分で示しである。中間
ベクターｐＧＶ７４５（第１６図参照）は線状化して描
いである。これは第１６図に示したｐＧＶ７４５のＨｉ
ｎｄｌｌｌサイトで開裂したものである。ｐＢ Ｒ３２
２の配列は斜線を施した部分で示し、アンピシリン耐性
遺伝子はＡｐｌで示しである。二重乗換えによって、ｐ
Ｇ Ｖ ２２６０が組み立てられ、ａｐｔ遺伝子が失わ
れる。制限エンドヌクレアーゼサイトは以下の略号で示
した： Ｂ＝ＢａｍＨｌ５Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ５Ｒ
＝ＥｃｏＲ’Ｉ０ 第１８図は、ツバリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）のプ
ロモーターの下流の遺伝子を発現するためのプラスミド
ｐＬＧＶ２３８１の組み立てを示している。５°および
３”はそれぞれ転写開始と転写終了を意味し、ＡＴＧお
よびＴＡＡは翻訳開始および翻訳終了に使われるコドン
を表わしている。
太線はｎｏｓプロモーター領域、白ぬき部分はｎｏｓ暗
号領域を示している。Ａｐｌはアンピシリン耐性、Ｋ♂
はカナマイシン耐性を示している。
号領域を示している。Ａｐｌはアンピシリン耐性、Ｋ♂
はカナマイシン耐性を示している。
第１９図は、完全なオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）暗
号配列を含んでいるプラスミドｐＡＧＶ４Ｑの組み立て
、およびプラスミドｐＬＧＶ２３８１（第１８図参照）
中ｎｏｓプロモーターの後部へのその挿入を示している
。太線はプロモーター領域、白ぬき部分はｏｃｓ暗号領
域を示している。その他の記号は第１８図と同じである
。
号配列を含んでいるプラスミドｐＡＧＶ４Ｑの組み立て
、およびプラスミドｐＬＧＶ２３８１（第１８図参照）
中ｎｏｓプロモーターの後部へのその挿入を示している
。太線はプロモーター領域、白ぬき部分はｏｃｓ暗号領
域を示している。その他の記号は第１８図と同じである
。
第２０図は、ツバリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子のプ
ロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列およびオクト
ピンシンターゼ遺伝子暗号領域と融合した後の同じ領域
の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合点は星印
（＊）で示した。いくつかの制限エンドヌクレアーゼサ
イト、即ち、Ｂａ１Ｈ１、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 、および
５ａｃｌｌ も示しである。
ロモーター領域の周囲のヌクレオチド配列およびオクト
ピンシンターゼ遺伝子暗号領域と融合した後の同じ領域
の周囲のヌクレオチド配列を示している。融合点は星印
（＊）で示した。いくつかの制限エンドヌクレアーゼサ
イト、即ち、Ｂａ１Ｈ１、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 、および
５ａｃｌｌ も示しである。
５′および３”は転写開始および終了を意味する。
ＡＴＧは翻訳に使われる最初のコドン、ＴＡＡは翻訳に
使われる終了コドンを表わしている。臼ぬきの大きい矢
印はツバリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢印はオ
クトピン遺伝子を表わしている。
使われる終了コドンを表わしている。臼ぬきの大きい矢
印はツバリン遺伝子の暗号化領域、縞の入った矢印はオ
クトピン遺伝子を表わしている。
以下に本発明の詳細な説明する。
第１図にアクセプターＴｉプラスミドを簡単に図式化し
て示した。このアクセプターＴｉプラスミドは、野生型
腫瘍誘起（Ｔ ｉ）プラスミドの２つの境界配列（１，
２）または領域を含んでいる。この境界配列は、Ｔｉプ
ラスミドのＴ−領域を植物細胞ゲノムへ組込むのに必須
である。換言すれば、あらゆるＤＮＡ配列（３）または
Ｔ−領域を、これらの配列間に存在している植物細胞ゲ
ノムに組込むのにこの境界配列が絶対に必要である。
て示した。このアクセプターＴｉプラスミドは、野生型
腫瘍誘起（Ｔ ｉ）プラスミドの２つの境界配列（１，
２）または領域を含んでいる。この境界配列は、Ｔｉプ
ラスミドのＴ−領域を植物細胞ゲノムへ組込むのに必須
である。換言すれば、あらゆるＤＮＡ配列（３）または
Ｔ−領域を、これらの配列間に存在している植物細胞ゲ
ノムに組込むのにこの境界配列が絶対に必要である。
このアクセプターＴｉプラスミドのＤＮＡ配列（３）に
は、第２図および第３図に示した中間クローニングベク
ターのＤＮＡ配列（３°）の少なくとも１部と相同のＤ
ＮＡセグメントが含まれている。
は、第２図および第３図に示した中間クローニングベク
ターのＤＮＡ配列（３°）の少なくとも１部と相同のＤ
ＮＡセグメントが含まれている。
この相同性は、中間クローニングベクターとアクセプタ
ーＴｉプラスミドが単一乗換え（相同性組換え）によっ
て相互組込みするのに必要である。
ーＴｉプラスミドが単一乗換え（相同性組換え）によっ
て相互組込みするのに必要である。
相互組込み体の得られる頻度は、基本的には相同領域の
長さできまる。相同性組換えを高頻度で起すには、通常
１〜４ｋｂの領域が使われる（Ｌｅｅｍａｎｓら、Ｊ
、 Ｍｏ１． ＡＩ）ｌ）１． Ｇｅｎｅｔ、
１ （１９８１）。
長さできまる。相同性組換えを高頻度で起すには、通常
１〜４ｋｂの領域が使われる（Ｌｅｅｍａｎｓら、Ｊ
、 Ｍｏ１． ＡＩ）ｌ）１． Ｇｅｎｅｔ、
１ （１９８１）。
１４９−１６４）。
アクセプターＴｉプラスミドは更に、Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍによってＴｉプラスミドのＴ−領域が植物細
胞ゲノムへ移動するのに必要な配列（４）を含んでいる
。
ｅｒｉｕｍによってＴｉプラスミドのＴ−領域が植物細
胞ゲノムへ移動するのに必要な配列（４）を含んでいる
。
この様なアクセプターＴｉプラスミドの組み立ておよび
第２図および第３図に示した中間クローニングベクター
とのその相互組込みについて、第４図を参照しながら以
下に詳述する。
第２図および第３図に示した中間クローニングベクター
とのその相互組込みについて、第４図を参照しながら以
下に詳述する。
第２図および第３図に、発現しようとする、即ち、植物
細胞中でプロモーターの支配下に転写され、翻訳される
所望の原核性または真核性遺伝子をクローンするための
中間クローニングベクターを簡略化した図で示した。こ
れらの中間クローニングベクターは、アクセプターＴｉ
プラスミドのＤＮＡセグメント（３）の少なくとも一部
と相同であり、従って単一乗換えを可能にするＤＮＡ配
列を含んでいるクローニング媒体からのＤＮＡセグメン
ト（３“）を含んでいる。さらに、この中間クローニン
グベクターは、その天然のあるいは外来性のプロモータ
ー配列を含む少なくとも１つの所望の遺伝子（５，７）
を含んでいる。このプロモーター配列によって、挿入さ
れた遺伝子配列の発現が可能である。所望の挿入遺伝子
（群）の発現を調整するために、外来性のプロモーター
配列（仕立て上げたプロモーター）を使うことも可能で
ある。
細胞中でプロモーターの支配下に転写され、翻訳される
所望の原核性または真核性遺伝子をクローンするための
中間クローニングベクターを簡略化した図で示した。こ
れらの中間クローニングベクターは、アクセプターＴｉ
プラスミドのＤＮＡセグメント（３）の少なくとも一部
と相同であり、従って単一乗換えを可能にするＤＮＡ配
列を含んでいるクローニング媒体からのＤＮＡセグメン
ト（３“）を含んでいる。さらに、この中間クローニン
グベクターは、その天然のあるいは外来性のプロモータ
ー配列を含む少なくとも１つの所望の遺伝子（５，７）
を含んでいる。このプロモーター配列によって、挿入さ
れた遺伝子配列の発現が可能である。所望の挿入遺伝子
（群）の発現を調整するために、外来性のプロモーター
配列（仕立て上げたプロモーター）を使うことも可能で
ある。
調整の各種の例として、以下のものを挙げることができ
る：（ｉ）組織に特異な発現、即ち、葉、根、茎、花な
ど、（ｉｉ）発現レベル、即ち、発現の強弱、（ｉｉｉ
）誘導性発現、即ち、温度、光または添加された化学的
因子による発現など。
る：（ｉ）組織に特異な発現、即ち、葉、根、茎、花な
ど、（ｉｉ）発現レベル、即ち、発現の強弱、（ｉｉｉ
）誘導性発現、即ち、温度、光または添加された化学的
因子による発現など。
中間クローニングベクター用の所望の遺伝子の例として
は、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成をコントロール
して植物の栄養価や成長度を改良する遺伝情報を持った
ＤＮＡフラグメントまたは配列、外部から病原物質に対
する保護、例えば病原生物またはストレスとなる環境因
子に対する耐性、を付与する生産物の合成をコントロー
ルする遺伝情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列
、遺伝子工学によって改良しようとする植物の基本的な
過程に情報を与える生産物の合成をコントロールする遺
伝情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列など。
は、アミノ酸や糖類の様な生産物の合成をコントロール
して植物の栄養価や成長度を改良する遺伝情報を持った
ＤＮＡフラグメントまたは配列、外部から病原物質に対
する保護、例えば病原生物またはストレスとなる環境因
子に対する耐性、を付与する生産物の合成をコントロー
ルする遺伝情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列
、遺伝子工学によって改良しようとする植物の基本的な
過程に情報を与える生産物の合成をコントロールする遺
伝情報を持ったＤＮＡフラグメントまたは配列など。
第２図および第３図は、選択可能なマーカー遺伝子（６
）を含んでいることもある中間クローニングベクターを
表わしている。選択可能なマーカー遺伝子としては、例
えば抗生物質または有毒な類似物質（例えばアミノ酸類
縁体）を暗号化している遺伝子、受容宿主細胞の欠損を
補う遺伝子などが挙げられる。
）を含んでいることもある中間クローニングベクターを
表わしている。選択可能なマーカー遺伝子としては、例
えば抗生物質または有毒な類似物質（例えばアミノ酸類
縁体）を暗号化している遺伝子、受容宿主細胞の欠損を
補う遺伝子などが挙げられる。
第４図は、ハイブリッドＴｉプラスミドベクターの組み
立てに関与する構成を示しており、第５図は、そのハイ
ブリッドＴｉプラスミドベクターを保持しているＡ ｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍの分離に関与する実際の接合
工程を表わしている。この工程は、中間クローニングベ
クターがＥ 、 ｃｏｌ ｉ中で組み立てられるので、
この中間クローニングベクターをＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ中のアクセプタープラスミドに転移させるのに
必要である。
立てに関与する構成を示しており、第５図は、そのハイ
ブリッドＴｉプラスミドベクターを保持しているＡ ｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍの分離に関与する実際の接合
工程を表わしている。この工程は、中間クローニングベ
クターがＥ 、 ｃｏｌ ｉ中で組み立てられるので、
この中間クローニングベクターをＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ中のアクセプタープラスミドに転移させるのに
必要である。
Ｔ−領域の一部が変更された配列で置換されている改良
Ｔｉプラスミドを調製するのに用いられる既知の転移手
法は多数の工程からなっている。
Ｔｉプラスミドを調製するのに用いられる既知の転移手
法は多数の工程からなっている。
通常、大抵のＤＮＡ組換え操作は、特別に設計されたク
ローニング媒体、例えばｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ
、 Ｇｅｎｅ ２（１９７７）、 ７５ ９３）中で行
なわれる。しかしこのクローニング媒体は、それ自体Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに移動することができない
。この問題は、既知の方法では次の様にして解決されて
いる： ａ） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中でも複製し得る
別の広範囲宿主用クローニング媒体、例えばｍ１ｎｉ−
３ａプラスミド（Ｌ ｅｅａ＋ａｎｓら、Ｇｅｎｅ １
９（１９８２）。
ローニング媒体、例えばｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ
、 Ｇｅｎｅ ２（１９７７）、 ７５ ９３）中で行
なわれる。しかしこのクローニング媒体は、それ自体Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに移動することができない
。この問題は、既知の方法では次の様にして解決されて
いる： ａ） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中でも複製し得る
別の広範囲宿主用クローニング媒体、例えばｍ１ｎｉ−
３ａプラスミド（Ｌ ｅｅａ＋ａｎｓら、Ｇｅｎｅ １
９（１９８２）。
３６１−３６４）でｐＢＲクローニング媒体配列を置換
する。この操作はＥ、ｃｏｌｉ中で行ない、中間クロー
ニングベクターが得られる。
する。この操作はＥ、ｃｏｌｉ中で行ない、中間クロー
ニングベクターが得られる。
ｂ）所望のＤＮＡを含有している中間クローニングベク
ターを保持したＥ、ｃｏｌｉ株と、Ａ ｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ中では複製できないがそれ自体および他のＤ
ＮＡのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移を仲介する
ことのできるヘルパープラスミドを保持した別のＥ。
ターを保持したＥ、ｃｏｌｉ株と、Ａ ｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ中では複製できないがそれ自体および他のＤ
ＮＡのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移を仲介する
ことのできるヘルパープラスミドを保持した別のＥ。
ｃｏｌｉ株との接合。
Ｃ）工程（ｂ）で得られるＥ、ｃｏｌｉとＴｉプラスミ
ドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中の接合
。ヘルパープラスミドは失われる。
ドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中の接合
。ヘルパープラスミドは失われる。
ｄ）中間クローニングベクターは、独立したレブリフン
としてＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中中で複製し、存
在することができるので、工程（ｃ）で得られた接合体
は、中間クローニングベクターとＴｉプラスミドとの相
互組込み体を含んでいる細胞、または中間クローニング
ベクターおよび相互組込みが起らなかったＴｉプラスミ
ドを含んでいる別の細胞の混合物である。相互組込み体
だけを特異的に分離する為に、Ｔｉプラスミドのない別
のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中株との接合をもう一
度行なわなければならない。この転移は、Ｔｉプラスミ
ド自体によって暗号化されている機能によって仲介され
る。この第２のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株への中
間クローニングベクターの転移は、Ｔｉプラスミドとの
相互組込み体の形でのみ行なわれる。
としてＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中中で複製し、存
在することができるので、工程（ｃ）で得られた接合体
は、中間クローニングベクターとＴｉプラスミドとの相
互組込み体を含んでいる細胞、または中間クローニング
ベクターおよび相互組込みが起らなかったＴｉプラスミ
ドを含んでいる別の細胞の混合物である。相互組込み体
だけを特異的に分離する為に、Ｔｉプラスミドのない別
のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中株との接合をもう一
度行なわなければならない。この転移は、Ｔｉプラスミ
ド自体によって暗号化されている機能によって仲介され
る。この第２のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株への中
間クローニングベクターの転移は、Ｔｉプラスミドとの
相互組込み体の形でのみ行なわれる。
ｅ）所望の置換を行なった最終的な改良Ｔｉプラスミド
を得るために、第２回目の乗換えが行なわれる （Ｌ
ｅｅｓａｎｓら、Ｊ 、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、
Ｇｅｎｅｔ。
を得るために、第２回目の乗換えが行なわれる （Ｌ
ｅｅｓａｎｓら、Ｊ 、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、
Ｇｅｎｅｔ。
１（１９８１）、１４９−１６４）。
僅かにもう１つの既知の方法は、上記工程（ｄ）におい
て、中間クローニングベクターと適合しない別のプラス
ミドをＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに導入することを
除けば、上の方法と基本的に同じである。この場合、独
立したレブリフンのままでいる中間クローニングベクタ
ーは全て失われるので、相互組込み（単一乗換え）を選
択することができる（Ｍａｔｚｋｅ ら、Ｊ、 Ｍｏ
１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 ｌ （１９
８１）、３９−４９ ）。
て、中間クローニングベクターと適合しない別のプラス
ミドをＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに導入することを
除けば、上の方法と基本的に同じである。この場合、独
立したレブリフンのままでいる中間クローニングベクタ
ーは全て失われるので、相互組込み（単一乗換え）を選
択することができる（Ｍａｔｚｋｅ ら、Ｊ、 Ｍｏ
１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 ｌ （１９
８１）、３９−４９ ）。
ここに本発明者らは、Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの
アクセプターＴｉプラスミドに中間クローニングベクタ
ーを導入する為の、新規な非常に簡素化された方法を提
供するものである。簡単に言えば、この方法は、多くの
通常使用されているクローニングプラスミド（例えばｐ
ＢＲ３２２）を直接Ａ ｇｒｏｂａｃ −ｔｅｒｉｕｍ
に転移させるのに、Ｅ、 ｃｏｌｉのヘルパープラスミ
ドが役立つということを見い出した事実に基づいている
。これらのプラスミドは、いづれもＡ ｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ中では複製できないので、アクセプターＴｉ
プラスミドと相互組込みし得るものだけが保持されるこ
とになる。さらに、本発明者らは、Ａ ｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ中のこの相互組込み体を、植物細胞への感染
の為の直接のベクター組成物として使用するのである。
アクセプターＴｉプラスミドに中間クローニングベクタ
ーを導入する為の、新規な非常に簡素化された方法を提
供するものである。簡単に言えば、この方法は、多くの
通常使用されているクローニングプラスミド（例えばｐ
ＢＲ３２２）を直接Ａ ｇｒｏｂａｃ −ｔｅｒｉｕｍ
に転移させるのに、Ｅ、 ｃｏｌｉのヘルパープラスミ
ドが役立つということを見い出した事実に基づいている
。これらのプラスミドは、いづれもＡ ｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ中では複製できないので、アクセプターＴｉ
プラスミドと相互組込みし得るものだけが保持されるこ
とになる。さらに、本発明者らは、Ａ ｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ中のこの相互組込み体を、植物細胞への感染
の為の直接のベクター組成物として使用するのである。
この様にして、本発明者らは前記の工程（ｄ）および（
ｅ）を省略した。これによって、改良ハイブリッドＴｉ
プラスミドを組み立てるのに要する時間が減少し、可能
な組み立てに柔軟性が増加し、か（して、植物細胞ゲノ
ムへＤＮＡを転移させる為のベクターとしてこのアクセ
プターＴｉプラスミドを使用できる可能性が著しく高ま
ったのである。
ｅ）を省略した。これによって、改良ハイブリッドＴｉ
プラスミドを組み立てるのに要する時間が減少し、可能
な組み立てに柔軟性が増加し、か（して、植物細胞ゲノ
ムへＤＮＡを転移させる為のベクターとしてこのアクセ
プターＴｉプラスミドを使用できる可能性が著しく高ま
ったのである。
即ち、第５図に概略を示した様に、アクセプターＴｉプ
ラスミドへの中間クローニングベクターの導入は２工程
で行なわれる。先づ、中間クローニングベクターを持っ
たＥ、 ｃｏｌｉ株（１）を、この中間クローニングベ
クターのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの授動を促す
２つのプラスミドを持った別のＥ。
ラスミドへの中間クローニングベクターの導入は２工程
で行なわれる。先づ、中間クローニングベクターを持っ
たＥ、 ｃｏｌｉ株（１）を、この中間クローニングベ
クターのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの授動を促す
２つのプラスミドを持った別のＥ。
ｃｏｌｉ株（２）と接合させる。これらのヘルパープラ
スミドの代表的な、そして好ましい例は、ｍｏｂ機能を
含んだＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｔｒａ機能を含んだｐＧ
Ｊ２８である（Ｆ ｉｎｎｅｇａｎら、Ｍｏ１． Ｇｅ
ｎ。
スミドの代表的な、そして好ましい例は、ｍｏｂ機能を
含んだＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｔｒａ機能を含んだｐＧ
Ｊ２８である（Ｆ ｉｎｎｅｇａｎら、Ｍｏ１． Ｇｅ
ｎ。
Ｇｅｎｅｔ、 １８５（１９８２）、３４４ ３５１）
。中間クローニングベクターのクローニング媒体上のｂ
Ｏ１１サイト（Ｗａｒｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ２７４（
１９７８）。
。中間クローニングベクターのクローニング媒体上のｂ
Ｏ１１サイト（Ｗａｒｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ２７４（
１９７８）。
２５９−２６１）が他の２つのプラスミドによって暗号
化されている機能体によって認識され、転移できる様に
なる。全てのプラスミドは、その存在を検出するために
抗生物質耐性マーカーを含んでいるのが好ましい。次い
で、得られたＥ、 ｃｏｌｉ株、即ち３つのプラスミド
全てを保持している授動株（３）を、中間クローニング
ベクターと相同の領域を持ったアクセプターＴｉプラス
ミドを保持しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと接
合させる。中間クローニングベクターとアクセプターＴ
ｉプラスミドとの単一乗換えが行なわれたかどうかは、
中間クローニングベクターの抗生物質耐性マーカーにつ
いての選択によって検出できる。
化されている機能体によって認識され、転移できる様に
なる。全てのプラスミドは、その存在を検出するために
抗生物質耐性マーカーを含んでいるのが好ましい。次い
で、得られたＥ、 ｃｏｌｉ株、即ち３つのプラスミド
全てを保持している授動株（３）を、中間クローニング
ベクターと相同の領域を持ったアクセプターＴｉプラス
ミドを保持しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと接
合させる。中間クローニングベクターとアクセプターＴ
ｉプラスミドとの単一乗換えが行なわれたかどうかは、
中間クローニングベクターの抗生物質耐性マーカーにつ
いての選択によって検出できる。
第６図は、第１図のアクセプターＴｉプラスミドの組み
立てに用いられたＤＮＡ分子を模式的に示したものであ
る。本明細書では、このプラスミドをアクセプターＴｉ
プラスミド（タイプＡ）と呼び、他のアクセプターＴｉ
プラスミド（タイプＢ）と区別することにする（第８図
参照）。この組み立てには、Ｔｉプラスミドと、クロー
ニング媒体（３）中に境界配列（１）および（２）を持
っているもう１つのプラスミドとの間に二重乗換えが起
ることが必要である。図に示した様に、クローニング媒
体配列（３）は左側の境界配列（１）と右側の境界配列
（２）との司にある。このＤＮＡ鎖の正しい極性を示す
ために、これを環上に描くことができる。
立てに用いられたＤＮＡ分子を模式的に示したものであ
る。本明細書では、このプラスミドをアクセプターＴｉ
プラスミド（タイプＡ）と呼び、他のアクセプターＴｉ
プラスミド（タイプＢ）と区別することにする（第８図
参照）。この組み立てには、Ｔｉプラスミドと、クロー
ニング媒体（３）中に境界配列（１）および（２）を持
っているもう１つのプラスミドとの間に二重乗換えが起
ることが必要である。図に示した様に、クローニング媒
体配列（３）は左側の境界配列（１）と右側の境界配列
（２）との司にある。このＤＮＡ鎖の正しい極性を示す
ために、これを環上に描くことができる。
しかし、二重乗換えに使用される相同領域を示すために
は、この環を開裂させて図示した。これは理解を助ける
為のやり方として重要であり、第８図に於けるアクセプ
ターＴｉプラスミド（Ｂ）の組み立てに於いても用いら
れている。即ち、もし境界配列（１）および（２）が、
単にクローニング媒体配列（３）ｒｌＭに挿入されたの
なら、二重乗換えによって、Ｔ−領域が削除されてはい
るがこの境界配列（１）および（２）の間のクローニン
グ媒体配列の落いＴｉプラスミドが得られることになる
。第６図に示した様に、二重乗換えによって、境界配列
（１）および（２）の間にもとのＴ−領域を持った環状
ＤＮＡ分子が生成する。これはレプリコンではないので
消失する運命にある。この二重乗換えが起ったかどうか
は、例えばＴｉプラスミドのＴ−領域内に含まれる抗生
物質マーカーの欠落について選択したり、クローニング
媒体配列（３）内の抗生物質耐性マーカーについて選択
したりして、遺伝子学的に選択することができる。
は、この環を開裂させて図示した。これは理解を助ける
為のやり方として重要であり、第８図に於けるアクセプ
ターＴｉプラスミド（Ｂ）の組み立てに於いても用いら
れている。即ち、もし境界配列（１）および（２）が、
単にクローニング媒体配列（３）ｒｌＭに挿入されたの
なら、二重乗換えによって、Ｔ−領域が削除されてはい
るがこの境界配列（１）および（２）の間のクローニン
グ媒体配列の落いＴｉプラスミドが得られることになる
。第６図に示した様に、二重乗換えによって、境界配列
（１）および（２）の間にもとのＴ−領域を持った環状
ＤＮＡ分子が生成する。これはレプリコンではないので
消失する運命にある。この二重乗換えが起ったかどうか
は、例えばＴｉプラスミドのＴ−領域内に含まれる抗生
物質マーカーの欠落について選択したり、クローニング
媒体配列（３）内の抗生物質耐性マーカーについて選択
したりして、遺伝子学的に選択することができる。
第７図は、第２図および第３図の中間クローニングベク
ターの組み立てを示す模式図である。制限エンドヌクレ
アーゼサイトＲ１またはＲ３でそれぞれ囲まれた所望の
遺伝子（５）および選択可能なマーカー遺伝子（６）が
、酵素Ｒ８およびＲ２の為の特異な制限サイトを含んで
いるクローニング媒体ＩＬＪＩＩ（３’）に、これら全
ての分子の消化およびう。
ターの組み立てを示す模式図である。制限エンドヌクレ
アーゼサイトＲ１またはＲ３でそれぞれ囲まれた所望の
遺伝子（５）および選択可能なマーカー遺伝子（６）が
、酵素Ｒ８およびＲ２の為の特異な制限サイトを含んで
いるクローニング媒体ＩＬＪＩＩ（３’）に、これら全
ての分子の消化およびう。
イゲーションによって挿入される。得られた組換えＤＮ
Ａ分子は、Ｅ 、 ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換するの
に使用され、その形質転換体は、クローニング媒体配列
（３°）の抗生物質耐性マーカー（Ａｂ”）で選択され
る。
Ａ分子は、Ｅ 、 ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換するの
に使用され、その形質転換体は、クローニング媒体配列
（３°）の抗生物質耐性マーカー（Ａｂ”）で選択され
る。
第８図は本発明のもう１つの態様、即ちアクセプターＴ
ｉプラスミド（Ｂ）を組み立てるのに使用されるＤＮＡ
分子の模式図である。この場合は、境界配列（１）およ
び（２）のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列（９）および
（１０）の凹にクローニング媒体配列（３）′を含んで
いるプラスミドとＴｉプラスミドとの間で二重乗換えが
起る。乗換えに使用される相同領域を示す為に、小さい
方のプラスミドは開裂しである（第６図と同様）。二重
乗換えによる生成物は、アクセプターＴｉプラスミド（
Ｂ）と、もとのＴｉプラスミドからのＴ−領域およびＤ
ＮＡ配列（２）、（１０）、（９）および（１）を含ん
でいる、消失するもう１つの環状ＤＮＡ分子である。
ｉプラスミド（Ｂ）を組み立てるのに使用されるＤＮＡ
分子の模式図である。この場合は、境界配列（１）およ
び（２）のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列（９）および
（１０）の凹にクローニング媒体配列（３）′を含んで
いるプラスミドとＴｉプラスミドとの間で二重乗換えが
起る。乗換えに使用される相同領域を示す為に、小さい
方のプラスミドは開裂しである（第６図と同様）。二重
乗換えによる生成物は、アクセプターＴｉプラスミド（
Ｂ）と、もとのＴｉプラスミドからのＴ−領域およびＤ
ＮＡ配列（２）、（１０）、（９）および（１）を含ん
でいる、消失するもう１つの環状ＤＮＡ分子である。
遺伝子学的選択は第６図について記載したものと同様に
して行なうことができる。
して行なうことができる。
第９°図は、第８図のアクセプターＴｉプラスミドＢと
組み合せて使用される中間クローニングベクターの模式
図である。ここでは、所望の遺伝子（５）は、クローニ
ング媒体配列（３°）中に含まれている境界配列（１）
および（・２）の間に挿入される。
組み合せて使用される中間クローニングベクターの模式
図である。ここでは、所望の遺伝子（５）は、クローニ
ング媒体配列（３°）中に含まれている境界配列（１）
および（・２）の間に挿入される。
第１０図は、単一乗換えにより第９図の中間クローニン
グベクターがどの様にしてアクセプターＴｉプラスミド
（Ｂ）に挿入されるかを模式的に示している。この場合
、中間クローニングベクターのクローニング媒体配列（
３゛）の抗生物質耐性マーカーで選択すると、２つのプ
ラスミドの間の相互組込みの結果としてのハイブリッド
Ｔｉプラスミドを確実に見つけることができる。こうし
て境界配列（１）および（２）内に含まれている所望の
遺伝子を持ったハイブリッドＴｉプラスミドが得られる
。この様にして組み立てられたハイブリッドプラスミド
は、そのＴ−領域に、例えば第４図のハイブリッドＴｉ
プラスミド中の配列（３）および（３′）の様な直接反
復の配列を含有しておらず、従って、分子内組換えの結
果として、ハイブリッドベクターまたは植物細胞ゲノム
中に導入されたＤＮＡが不安定になる可能性が避けられ
る。
グベクターがどの様にしてアクセプターＴｉプラスミド
（Ｂ）に挿入されるかを模式的に示している。この場合
、中間クローニングベクターのクローニング媒体配列（
３゛）の抗生物質耐性マーカーで選択すると、２つのプ
ラスミドの間の相互組込みの結果としてのハイブリッド
Ｔｉプラスミドを確実に見つけることができる。こうし
て境界配列（１）および（２）内に含まれている所望の
遺伝子を持ったハイブリッドＴｉプラスミドが得られる
。この様にして組み立てられたハイブリッドプラスミド
は、そのＴ−領域に、例えば第４図のハイブリッドＴｉ
プラスミド中の配列（３）および（３′）の様な直接反
復の配列を含有しておらず、従って、分子内組換えの結
果として、ハイブリッドベクターまたは植物細胞ゲノム
中に導入されたＤＮＡが不安定になる可能性が避けられ
る。
本発明者らの研究室で行なった実験結果から、第９図の
中間ベクターの組み立てには、境界配列ｌおよび２の両
者を所有する必要はないことがわかった（未発表）。し
かし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込むには、少
なくとも右側の境界配列（２）（第１図および第９図参
照）を有することが必要十分条件である。
中間ベクターの組み立てには、境界配列ｌおよび２の両
者を所有する必要はないことがわかった（未発表）。し
かし、所望のＤＮＡ配列を植物ゲノムに組込むには、少
なくとも右側の境界配列（２）（第１図および第９図参
照）を有することが必要十分条件である。
ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｉのＴｉプラスミド、例えば
ツバリンまたはオクトピンＴｉプラスミドの制限エンド
ヌクレアーゼ地図についての知見（Ｄ ｅｐｉｃｋｅｒ
ら、Ｐｌａｓ＋＋１ｄ３（１９８０）、１９３ ２１１
；ＤｅＶｏｓら、Ｐｌａｓａｉｄ６（１９８１）、２４
９ ２５３）およびＴ−ＤＮＡ境界配列を含んでいる制
限フラグメントについての知見（Ｚ ａｍｂｒｙｓｋｉ
ら、Ｊ、Ｍｏｌ。
ツバリンまたはオクトピンＴｉプラスミドの制限エンド
ヌクレアーゼ地図についての知見（Ｄ ｅｐｉｃｋｅｒ
ら、Ｐｌａｓ＋＋１ｄ３（１９８０）、１９３ ２１１
；ＤｅＶｏｓら、Ｐｌａｓａｉｄ６（１９８１）、２４
９ ２５３）およびＴ−ＤＮＡ境界配列を含んでいる制
限フラグメントについての知見（Ｚ ａｍｂｒｙｓｋｉ
ら、Ｊ、Ｍｏｌ。
Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、 １（１９８２）、３６１
３７０；Ｄ ｅ Ｂ ｅｕｃｋｅｌｅｅｒら、Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １８３（１９８１）
、２８３−２８８）から、当業者であれば誰れでも、本
発明方法に従ってアクセプターＴｉプラスミドを組み立
てることができる。この他、通常の組換えＤＮＡ技術お
よび基礎的な細菌の遺伝子操作を実施できる能力が要求
されるに過ぎない。本発明は、ハイブリッドＴｉプラス
ミドベクターを組み立てるのに有効であることがわかっ
た本明細書に記載したアクセプターＴｉプラスミドを具
体的に提案している点でユニークなものである。更に、
これらのアクセプターＴｉプラスミドは、遺伝子を植物
細胞ゲノムへ導入するための方法の一部を構成する様に
設計されたものである。
３７０；Ｄ ｅ Ｂ ｅｕｃｋｅｌｅｅｒら、Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １８３（１９８１）
、２８３−２８８）から、当業者であれば誰れでも、本
発明方法に従ってアクセプターＴｉプラスミドを組み立
てることができる。この他、通常の組換えＤＮＡ技術お
よび基礎的な細菌の遺伝子操作を実施できる能力が要求
されるに過ぎない。本発明は、ハイブリッドＴｉプラス
ミドベクターを組み立てるのに有効であることがわかっ
た本明細書に記載したアクセプターＴｉプラスミドを具
体的に提案している点でユニークなものである。更に、
これらのアクセプターＴｉプラスミドは、遺伝子を植物
細胞ゲノムへ導入するための方法の一部を構成する様に
設計されたものである。
既述したアクセプターＴｉプラスミド、中間クローニン
グベクター、ハイブリッドＴｉプラスミドベクターおよ
びベクター組成物を更に例示し、植物細胞ゲノムへ組込
まれた外来性遺伝子の発現を示す形質転換植物細胞およ
び植物を提供するのにこのベクター組成物が有効である
ことを例証するだめに、以下に実施例を挙げる。
グベクター、ハイブリッドＴｉプラスミドベクターおよ
びベクター組成物を更に例示し、植物細胞ゲノムへ組込
まれた外来性遺伝子の発現を示す形質転換植物細胞およ
び植物を提供するのにこのベクター組成物が有効である
ことを例証するだめに、以下に実施例を挙げる。
実施例１ アクセプターＴｉプラスミドｐＧ■３８５０
（Ａタイプ）の組み立て 出発法およびプラスミド： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ４ａｃｉｅｎｓ
（野性型Ａｇｒｏｂａ−ｃｔｅｒｉｕｍ由来のりファ
ンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１およびクロラムフェニコール
−エリスロマイシン耐性株Ｃ５８Ｃ１） Ｔｉプラスミ）’＝ｐＧＶ３８３９ 第１１図のプラスミド＝ ｐＡｃｇＢ ＴｉプラスミドｐＧＶ３８３９はツバリンプラスミドｐ
Ｔｉ Ｃ５８ｔｒａｅ（１）ＧＶ３１００ ：Ｈｏｌｓ
ｔｅｒｓら、 Ｐ１ａｓａ＋ｉｄ ３（１９８０）、
２１２−２３０）から組み立てる。これはＴ−領域
の中央近（に欠失置換突然変異体（ミュータント）を含
んでいる：即ち、Ｈｉｎｄ ｉｌｌフラグメント１９の
内部のＳａａ Ｉフラグメント２４ （Ｄ ｅｐｉｃｋ
ｅｒら、Ｐｌａｓａｉｄ ３ （１９８０）、１９
３ ２１１）は、Ｔｉ５のａｐｔ （アセチルホスホト
ランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいるｐＫＣ７のＨｉ
ｎｄｌｌフラグメント （Ｒａｏら、Ｇｅｎｅ ７（１
９７９，７９−８２）で置換されている。この遺伝子は
アミノグリコシドネオマイシンおよびカナマイシンに対
する耐性を暗号化している。ｐＧＶ３８３９のＴ−領域
の制限地図を第１２図に示す。
（Ａタイプ）の組み立て 出発法およびプラスミド： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ４ａｃｉｅｎｓ
（野性型Ａｇｒｏｂａ−ｃｔｅｒｉｕｍ由来のりファ
ンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１およびクロラムフェニコール
−エリスロマイシン耐性株Ｃ５８Ｃ１） Ｔｉプラスミ）’＝ｐＧＶ３８３９ 第１１図のプラスミド＝ ｐＡｃｇＢ ＴｉプラスミドｐＧＶ３８３９はツバリンプラスミドｐ
Ｔｉ Ｃ５８ｔｒａｅ（１）ＧＶ３１００ ：Ｈｏｌｓ
ｔｅｒｓら、 Ｐ１ａｓａ＋ｉｄ ３（１９８０）、
２１２−２３０）から組み立てる。これはＴ−領域
の中央近（に欠失置換突然変異体（ミュータント）を含
んでいる：即ち、Ｈｉｎｄ ｉｌｌフラグメント１９の
内部のＳａａ Ｉフラグメント２４ （Ｄ ｅｐｉｃｋ
ｅｒら、Ｐｌａｓａｉｄ ３ （１９８０）、１９
３ ２１１）は、Ｔｉ５のａｐｔ （アセチルホスホト
ランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいるｐＫＣ７のＨｉ
ｎｄｌｌフラグメント （Ｒａｏら、Ｇｅｎｅ ７（１
９７９，７９−８２）で置換されている。この遺伝子は
アミノグリコシドネオマイシンおよびカナマイシンに対
する耐性を暗号化している。ｐＧＶ３８３９のＴ−領域
の制限地図を第１２図に示す。
プラスミドｐＡｃｇＢは、Ｔ−ＤＮＡの境界部だけを含
んでいるｐＢＲ３２２中のＡｃｇＢの挿入体である（第
１１図参照）。この境界部はＴ−ＤＮＡの末端部として
定義され、これらの領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞ゲノ
ムへの安定な組込みに役割を果たす。このクローンの起
源および分析については詳しく記載されている（Ｚ ａ
ｍｂｒｙｓｋｉ ら、５ｃｉｅｎｃｅ２０９ （１９
８０）、１３８５ １３９１）。
んでいるｐＢＲ３２２中のＡｃｇＢの挿入体である（第
１１図参照）。この境界部はＴ−ＤＮＡの末端部として
定義され、これらの領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞ゲノ
ムへの安定な組込みに役割を果たす。このクローンの起
源および分析については詳しく記載されている（Ｚ ａ
ｍｂｒｙｓｋｉ ら、５ｃｉｅｎｃｅ２０９ （１９
８０）、１３８５ １３９１）。
このクローンは、形質転換されたタバコＤＮＡからＴ−
ＤＮＡの部分を再分離することにより得られた。ｐＡｃ
ｇＢは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界を含、む様に縦列に並
んだ２つのＴ−ＤＮＡコピーの接合点を含んでいる。更
に、ｐＡｃｇＢは、その遺伝情報が右側Ｔ−ＤＮＡ境界
のすぐ近くに位置しているという理由でツバリンシンタ
ーゼ遺伝子を含んでいる。このプラスミドｐＡｃｇＢは
、「タイプＡ」アクセブ９−Ｔｉ プラスミド、 ｐＧ
Ｖ３８５０の組み立てに使用される。第６図は関与する
構造の概略を、第１３図はｐＧＶ３８５０を与える二重
乗換えに関与するＤＮＡ領域をより正確に示したもので
ある。
ＤＮＡの部分を再分離することにより得られた。ｐＡｃ
ｇＢは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界を含、む様に縦列に並
んだ２つのＴ−ＤＮＡコピーの接合点を含んでいる。更
に、ｐＡｃｇＢは、その遺伝情報が右側Ｔ−ＤＮＡ境界
のすぐ近くに位置しているという理由でツバリンシンタ
ーゼ遺伝子を含んでいる。このプラスミドｐＡｃｇＢは
、「タイプＡ」アクセブ９−Ｔｉ プラスミド、 ｐＧ
Ｖ３８５０の組み立てに使用される。第６図は関与する
構造の概略を、第１３図はｐＧＶ３８５０を与える二重
乗換えに関与するＤＮＡ領域をより正確に示したもので
ある。
上記のプラスミドｐＡｃｇＢは、そのｐＢ Ｒ３２２部
分にＣｏ１Ｅ１−特異ｂｏｗサイトを持っており、ヘル
ハーブラスミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８を使
ってＥ 、 ｃｏｌ ｉからＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕ＋ｓへ授動することができる。Ｅ、ｃｏｌｉに含まれ
ているプラスミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８は
、接合により、ｐＡ ｃｇ Ｂを持ったＥ、ｃｏｌｉ株
に導入される。トランス接合体は、アンピシリン耐性（
ｐＡｃｇＢのｐＢＲ３２２配列から）、ストレプトマイ
シン耐性（Ｒ６４ｄｒｄ ｌ １から）、およびカナマ
イシン耐性（ｐＧＪ２８から）コロニーとして選択され
る。
分にＣｏ１Ｅ１−特異ｂｏｗサイトを持っており、ヘル
ハーブラスミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８を使
ってＥ 、 ｃｏｌ ｉからＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕ＋ｓへ授動することができる。Ｅ、ｃｏｌｉに含まれ
ているプラスミドＲ６４ｄｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８は
、接合により、ｐＡ ｃｇ Ｂを持ったＥ、ｃｏｌｉ株
に導入される。トランス接合体は、アンピシリン耐性（
ｐＡｃｇＢのｐＢＲ３２２配列から）、ストレプトマイ
シン耐性（Ｒ６４ｄｒｄ ｌ １から）、およびカナマ
イシン耐性（ｐＧＪ２８から）コロニーとして選択され
る。
３つのプラスミドの全てを保持しているＥ。
ｃｏｌｉ株を、リファンピシン耐性でありＴｉプラスミ
ドｐＧＶ３８３９を含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１に接合させる。ツバリンＴｉプラス
ミドとの最初の単一乗換えを選択するのにｐＢＲ３２２
のアンピシリン耐性を利用する。アンピシリン耐性をＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋中で安定させることができ
る唯一の方法は、Ｔ−領域境界近くの相同領域の１つで
ｐＧＶ３８３９と相同組換えにより乗換えをすることで
ある。他の相同領域での２回目の乗換えにより、ａｐｔ
遺伝子（カナマイシン耐性）を含んでいるｐＧＶ３８３
９のＴ−領域の中央部がりｏ−ンｐＡｃｇＢのｐＢＲ３
２２配列で置換される。従って、第２の組換え体はアン
ピシリン耐性、カナマイシン感受性である。第２の組換
え体を分離する確率を高めるために、最初の組換え体（
ｐＡｃｇＢ ：：ｐＧ Ｖ ３８３９ ）を保持してい
るリファンピシン耐性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、
Ｔｉプラスミドを持っていない第２のクロラムフェニコ
ール／エリスロマイシン耐性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ株と接合させる。この様にして、約６００コロニー中
、１コロニーの割合で、アンピシリン耐性、カナマイシ
ン感受性のクロラムフェニコール／エリスロマイシン耐
性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐＧ Ｖ ３８５０を
得ることができる。
ドｐＧＶ３８３９を含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１に接合させる。ツバリンＴｉプラス
ミドとの最初の単一乗換えを選択するのにｐＢＲ３２２
のアンピシリン耐性を利用する。アンピシリン耐性をＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋中で安定させることができ
る唯一の方法は、Ｔ−領域境界近くの相同領域の１つで
ｐＧＶ３８３９と相同組換えにより乗換えをすることで
ある。他の相同領域での２回目の乗換えにより、ａｐｔ
遺伝子（カナマイシン耐性）を含んでいるｐＧＶ３８３
９のＴ−領域の中央部がりｏ−ンｐＡｃｇＢのｐＢＲ３
２２配列で置換される。従って、第２の組換え体はアン
ピシリン耐性、カナマイシン感受性である。第２の組換
え体を分離する確率を高めるために、最初の組換え体（
ｐＡｃｇＢ ：：ｐＧ Ｖ ３８３９ ）を保持してい
るリファンピシン耐性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、
Ｔｉプラスミドを持っていない第２のクロラムフェニコ
ール／エリスロマイシン耐性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ株と接合させる。この様にして、約６００コロニー中
、１コロニーの割合で、アンピシリン耐性、カナマイシ
ン感受性のクロラムフェニコール／エリスロマイシン耐
性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐＧ Ｖ ３８５０を
得ることができる。
勿論、ｐＧＶ３８５ｃｌイプノアクセブ９− Ｔ ｉ。
プラスミドを組み立てるのに使用することができるその
他のＴｉプラスミドもある。Ｔ−領域の中央近くに選択
し得るマーカー遺伝子を持ったＴｉプラスミドは全て受
容体として使用できる。更に、左境界フラグメント−ｐ
ＢＲ３２２−右境界フラグメントの方向に、左右の境界
フラグメントの中。
他のＴｉプラスミドもある。Ｔ−領域の中央近くに選択
し得るマーカー遺伝子を持ったＴｉプラスミドは全て受
容体として使用できる。更に、左境界フラグメント−ｐ
ＢＲ３２２−右境界フラグメントの方向に、左右の境界
フラグメントの中。
間にｐＢＲ配列が位置する様に、ｐＢＲ３２２にＴ−領
域境界フラグメントを挿入することによってｐＡｃｇＢ
様のプラスミドを組み立てることができる。例えば、ツ
バリンＴｉプラスミドの左および右境界フラグメントは
それぞれＨｉｎｄｌ１１フラグメント１０および２３で
ある（ Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｐｌａｓｉ＋ｉｄ ３（
１９８０）、１９３ ２１１）。
域境界フラグメントを挿入することによってｐＡｃｇＢ
様のプラスミドを組み立てることができる。例えば、ツ
バリンＴｉプラスミドの左および右境界フラグメントは
それぞれＨｉｎｄｌ１１フラグメント１０および２３で
ある（ Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｐｌａｓｉ＋ｉｄ ３（
１９８０）、１９３ ２１１）。
単一乗換えによって、ｐＢＲ３２２またはその誘導体に
挿入されている所望の遺伝子を含んだ中間クローニング
ベクターがｐＧＶ３８５０の改良されたＴ−ＤＮＡ領域
に導入される。唯一つ必要なことは、中間クローニング
ベクターのＥ、ｃｏｌｉからＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍへの転移を選択する為の手段として使用する為に、導
入されるＤＮＡが、既にｐＢＲ３２２に存在するものの
他にもう１つの耐性マーカー遺伝子を含んでいるという
ことである。
挿入されている所望の遺伝子を含んだ中間クローニング
ベクターがｐＧＶ３８５０の改良されたＴ−ＤＮＡ領域
に導入される。唯一つ必要なことは、中間クローニング
ベクターのＥ、ｃｏｌｉからＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍへの転移を選択する為の手段として使用する為に、導
入されるＤＮＡが、既にｐＢＲ３２２に存在するものの
他にもう１つの耐性マーカー遺伝子を含んでいるという
ことである。
この耐性マーカーは、ｐＢＲ配列内に含まれていてもよ
く （例えばｐＢＲ３２５のＣｌ３、またはｐＫＣ７の
ＫＩ′１）、植物細胞内で試験されるＤＮＡ内に含まれ
ていてもよい。更に、アクセプターＴｉプラスミドｐＧ
Ｖ３８５０におけるＡｐｌ遺伝子転子Ｒ３２２は、Ｋｍ
”の様な別の耐性マーカー遺伝子で置換してもよい。こ
の様にして、Ａｐ！であるｐＢＲ３２２含有中間ク含有
中間クローニング−ですら、このｐＧＶ３８５０タイプ
のアクセプターＴｉプラスミドに直接授動することがで
きる。
く （例えばｐＢＲ３２５のＣｌ３、またはｐＫＣ７の
ＫＩ′１）、植物細胞内で試験されるＤＮＡ内に含まれ
ていてもよい。更に、アクセプターＴｉプラスミドｐＧ
Ｖ３８５０におけるＡｐｌ遺伝子転子Ｒ３２２は、Ｋｍ
”の様な別の耐性マーカー遺伝子で置換してもよい。こ
の様にして、Ａｐ！であるｐＢＲ３２２含有中間ク含有
中間クローニング−ですら、このｐＧＶ３８５０タイプ
のアクセプターＴｉプラスミドに直接授動することがで
きる。
ｐＧＶ３８５０タイプのアクセプターＴｉプラスミドの
もう１つの利点は、形質転換された植物細胞で腫瘍をつ
くらないということである。ｐＧＶ３８５０の短かくな
ったＴ−ＤＮＡ領域は、依然としてツバリンシンターゼ
を暗号化している遺伝子を含んでいるので、ｐＧＶ３８
５０で形質転換された細胞は、ツバリンが存在するかど
うかを分析・することにより、非形質転換細胞から簡単
に選り分けることができる。勿論、アクセプターＴｉプ
ラスミドｐＧＶ３８５０に組込まれた中間クローニング
ベクターがマーカー遺伝子を含んでいたら、それも直接
スクリーニング、即ち選別にかけることができる。
もう１つの利点は、形質転換された植物細胞で腫瘍をつ
くらないということである。ｐＧＶ３８５０の短かくな
ったＴ−ＤＮＡ領域は、依然としてツバリンシンターゼ
を暗号化している遺伝子を含んでいるので、ｐＧＶ３８
５０で形質転換された細胞は、ツバリンが存在するかど
うかを分析・することにより、非形質転換細胞から簡単
に選り分けることができる。勿論、アクセプターＴｉプ
ラスミドｐＧＶ３８５０に組込まれた中間クローニング
ベクターがマーカー遺伝子を含んでいたら、それも直接
スクリーニング、即ち選別にかけることができる。
ｐＢＲ３２２配列を含んだ上記の中間クローニングベク
ターの単一乗換えによるアクセプターＴｉプラスミドへ
の挿入のほか、このアクセプターＴｉプラスミドは、「
ショットガン」タイプの実験に於いて、ｐＢＲ３２２ま
たはその誘導体中のクローンされたＤＮＡバンクの受容
体としても使用することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｌ中の全てのハイブリッドプラスミドベクターは
、植物細胞の感染に使用することができ、次いで所望の
選択可能な遺伝子（群）の発現についてスクリーニング
される。例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏している植物
細胞に全バンクを適用することにより、アミノ酸合成を
暗号化している遺伝子について簡単に選別することがで
きる。
ターの単一乗換えによるアクセプターＴｉプラスミドへ
の挿入のほか、このアクセプターＴｉプラスミドは、「
ショットガン」タイプの実験に於いて、ｐＢＲ３２２ま
たはその誘導体中のクローンされたＤＮＡバンクの受容
体としても使用することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｌ中の全てのハイブリッドプラスミドベクターは
、植物細胞の感染に使用することができ、次いで所望の
選択可能な遺伝子（群）の発現についてスクリーニング
される。例えば、選ばれたアミノ酸が欠乏している植物
細胞に全バンクを適用することにより、アミノ酸合成を
暗号化している遺伝子について簡単に選別することがで
きる。
アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０は、２つの
特徴的な表現形質を持っている：即ち、（ｉ）腫瘍生成
能力がないこと、および（ｉｉ）もしＴ−ＤＮＡが植物
細胞ゲノム内に転移したら、ツバリン合成能を有するこ
と、である。ｐＧＶ３８５０含有Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍで感染させた各種の植物組織のこれらの特徴を
調べるために、種々の実験を行なった。
特徴的な表現形質を持っている：即ち、（ｉ）腫瘍生成
能力がないこと、および（ｉｉ）もしＴ−ＤＮＡが植物
細胞ゲノム内に転移したら、ツバリン合成能を有するこ
と、である。ｐＧＶ３８５０含有Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍで感染させた各種の植物組織のこれらの特徴を
調べるために、種々の実験を行なった。
ａ）ジャガイモおよびニンジンディスクを用いた試験
ジャガイモおよびニンジンの切片にアクセプターＴｉプ
ラスミドｐＧＶ３８５０を接種すると、少量の硬結組織
が生成する。この組織にツバリンが存在するかどうかを
試験した所、陽性であることがわかった。この突然変異
体が少量の硬結組織を生産し得ることは興味あることで
ある。しかし、それは、これらのディスクを低濃度のオ
ーキシンおよびサイトキニンの両者を含んでいる培地で
生育させた時だけ得られる。
ラスミドｐＧＶ３８５０を接種すると、少量の硬結組織
が生成する。この組織にツバリンが存在するかどうかを
試験した所、陽性であることがわかった。この突然変異
体が少量の硬結組織を生産し得ることは興味あることで
ある。しかし、それは、これらのディスクを低濃度のオ
ーキシンおよびサイトキニンの両者を含んでいる培地で
生育させた時だけ得られる。
ｂ）全植物をアクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０で接種 ホルモンを含まない滅菌寒天培地で生育しているタバコ
およびペチュニアの苗木にｐＧＶ３８５０を接種する。
０で接種 ホルモンを含まない滅菌寒天培地で生育しているタバコ
およびペチュニアの苗木にｐＧＶ３８５０を接種する。
数カ月後に少量の組織成長が観察されただけである（通
常、２週間後に「野生型」腫瘍が検出される）。この組
織はホルモンを含まない培地では生育しないが、オーキ
シンおよびサイトキニン含有培地での滅菌組織培養では
、さらに増殖することができる。この組織もツバリン陽
性であることがわかった。
常、２週間後に「野生型」腫瘍が検出される）。この組
織はホルモンを含まない培地では生育しないが、オーキ
シンおよびサイトキニン含有培地での滅菌組織培養では
、さらに増殖することができる。この組織もツバリン陽
性であることがわかった。
Ｃ）さらに、ｐＧＶ３８５０ｒ形質転換」細胞は腫瘍性
ではないので、これらの細胞は、転移したＤＮＡセグメ
ントをそのゲノムに依然として保持している正常な植物
に再生することができる。この形質転換細胞を通常の再
生培地（実施例５を参照）で培養すると、正常植物が得
られよう。
ではないので、これらの細胞は、転移したＤＮＡセグメ
ントをそのゲノムに依然として保持している正常な植物
に再生することができる。この形質転換細胞を通常の再
生培地（実施例５を参照）で培養すると、正常植物が得
られよう。
ｐＧＶ３８５０の、アクセプタープラスミドとしての有
用性を証明する為に、以下の実験を行なった。ｐＢＲ３
２５中にオクトピンＴ−ＤＮＡの腫瘍機能を含んでいる
中間クローニングベクターを、ｐＧＶ３８５０を保持し
ているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに組み込んだ。単
一乗換えによって得られたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
中のハイブリッドＴｉプラスミドを、傷つけたタバコ植
物に接種した。２週間後に腫瘍組織があられれた。この
ことは、腫瘍誘導ＤＮＡがｐＧＶ３８５０に再導入され
、形質転換植物細胞中で適切に発現されたことを示して
いる。
用性を証明する為に、以下の実験を行なった。ｐＢＲ３
２５中にオクトピンＴ−ＤＮＡの腫瘍機能を含んでいる
中間クローニングベクターを、ｐＧＶ３８５０を保持し
ているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに組み込んだ。単
一乗換えによって得られたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
中のハイブリッドＴｉプラスミドを、傷つけたタバコ植
物に接種した。２週間後に腫瘍組織があられれた。この
ことは、腫瘍誘導ＤＮＡがｐＧＶ３８５０に再導入され
、形質転換植物細胞中で適切に発現されたことを示して
いる。
実施例２ 中間クローニングベクターｐＧＶ７００およ
びｐＧＶ７５０の組み立て この組み立ての概略を第１４図に模式的に示した。オク
トピンＴｉプラスミドＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの右側部
分であり、ｐＧＶＯ２０１（ＤｅＶＯ８ら、Ｐｌａｓｍ
ｉｄ６（１９８１）、２４９ ２５３）中に存在するＨ
ｉｎｄｌ１１フラグメント１を、まず、広範囲宿主性ベ
クターｐＧＶ ｌ １２２ （Ｌｅｅｍａｎｓら、Ｇｅ
ｎｅ １９（１９８２）、３６１ ３６４）のＨ４ｎ
ｄｌｌｌサイトに挿入する。組換えプラスミドｐＧＶＯ
２０１は、多コピーベクターｐＢ Ｒ３２２（Ｂｏｌｉ
ｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２（１９７７）、９５−１１３）
の特異なＨｉｎｄｌｌｌサイトに挿入されたＨｉｎｄｌ
ｌｌフラグメント１を含んでいる。ｐＧｖ０２０１およ
びｐＧＶ１１２２ＤＮＡは、Ｂｅｔｌａｃｈらが記載し
ている方法で調製される（Ｆｅｄ。
びｐＧＶ７５０の組み立て この組み立ての概略を第１４図に模式的に示した。オク
トピンＴｉプラスミドＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの右側部
分であり、ｐＧＶＯ２０１（ＤｅＶＯ８ら、Ｐｌａｓｍ
ｉｄ６（１９８１）、２４９ ２５３）中に存在するＨ
ｉｎｄｌ１１フラグメント１を、まず、広範囲宿主性ベ
クターｐＧＶ ｌ １２２ （Ｌｅｅｍａｎｓら、Ｇｅ
ｎｅ １９（１９８２）、３６１ ３６４）のＨ４ｎ
ｄｌｌｌサイトに挿入する。組換えプラスミドｐＧＶＯ
２０１は、多コピーベクターｐＢ Ｒ３２２（Ｂｏｌｉ
ｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２（１９７７）、９５−１１３）
の特異なＨｉｎｄｌｌｌサイトに挿入されたＨｉｎｄｌ
ｌｌフラグメント１を含んでいる。ｐＧｖ０２０１およ
びｐＧＶ１１２２ＤＮＡは、Ｂｅｔｌａｃｈらが記載し
ている方法で調製される（Ｆｅｄ。
Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７−２０４３）。
最終１１２０ ｔｔ（ｌ中、ｐＧＶＯ２０１ＤＮＡ ２
μｇを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ２単位（全ての制限酵素は
Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入し
た）を用いて、３７°Ｃで１時間完全に消化した。イン
キュベーション緩衝液は○’ Ｆ ａｒｒｅｌｌ らに
より記載されている（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ
１７９（１９８０）、４２１−４３５）。同じ条件下テ
ｐＧＶ １１２２ ＤＮＡ２μｇをＨｉｎｄｌｌｌで
完全に消化した。
μｇを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ２単位（全ての制限酵素は
Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入し
た）を用いて、３７°Ｃで１時間完全に消化した。イン
キュベーション緩衝液は○’ Ｆ ａｒｒｅｌｌ らに
より記載されている（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ
１７９（１９８０）、４２１−４３５）。同じ条件下テ
ｐＧＶ １１２２ ＤＮＡ２μｇをＨｉｎｄｌｌｌで
完全に消化した。
最終量２０ｔｔＱ中、Ｔ４リガーゼ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ ） ０．０２単位を用い、０
．１μ８のＨｉｎｄｌｌ＋消化ｐＧＶＯ２０１をＨｉｎ
ｄｌｌ＋消化ｐＧＶ１１２２とライゲーション（結紮）
した。インキュベーション緩衝液および条件は、製造業
者の指示に従った（ Ｂｒｏｃｈｕｒｅ″Ｔ４リガーゼ
”、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 １９
８０年８月、＃１０゜Ｍ、８８０．４８６ ）。ライゲ
ーション混合物のコンピテントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ ５
１４ ｈｓｒ−ｈｓｎ”細胞（Ｃｏｌｓｏｎら、Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ５２（１９６５）、 １０４３−１０５０）
への導入（形質転換）は、Ｄ ａｇｅｒｔおよびＥｈｒ
ｌｉｃｈの方法（Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、 ２３−
２８）に従って行なった。細胞を、ストレプトマイシン
（２０μｇ／ｘＱ＞およびスペクチノマイシン（５０μ
ｇ／ｘＱ）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ。
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ ） ０．０２単位を用い、０
．１μ８のＨｉｎｄｌｌ＋消化ｐＧＶＯ２０１をＨｉｎ
ｄｌｌ＋消化ｐＧＶ１１２２とライゲーション（結紮）
した。インキュベーション緩衝液および条件は、製造業
者の指示に従った（ Ｂｒｏｃｈｕｒｅ″Ｔ４リガーゼ
”、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 １９
８０年８月、＃１０゜Ｍ、８８０．４８６ ）。ライゲ
ーション混合物のコンピテントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ ５
１４ ｈｓｒ−ｈｓｎ”細胞（Ｃｏｌｓｏｎら、Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ５２（１９６５）、 １０４３−１０５０）
への導入（形質転換）は、Ｄ ａｇｅｒｔおよびＥｈｒ
ｌｉｃｈの方法（Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、 ２３−
２８）に従って行なった。細胞を、ストレプトマイシン
（２０μｇ／ｘＱ＞およびスペクチノマイシン（５０μ
ｇ／ｘＱ）を補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ。
Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎ
ｅｗＹ ｏｒｋ）に塗抹した。組換えプラスミドを含有
している形質転換体を、テトラサイクリン耐性を暗号化
している遺伝子への挿入によるその不活性化（Ｌ ｅｅ
ｍａｎｓ ら、Ｇｅｎｅ １９（１９８２）、３６１
−３６４）に基づき、テトラサイクリン感受性（１０μ
ｇ／ｘＱ）でスクリーニング（選り分け）した。ストレ
プトマイシンおよびスペクチノマイシンに耐性を示し、
テトラサイクリンに感受性を有するクローンを物理的に
同定した。マイクロスケールのＤＮＡ調製はＫ １ｅｉ
ｎらの方法（Ｐｌａ’５ｍ１ｄ３ （１９８０）。
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９７２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎ
ｅｗＹ ｏｒｋ）に塗抹した。組換えプラスミドを含有
している形質転換体を、テトラサイクリン耐性を暗号化
している遺伝子への挿入によるその不活性化（Ｌ ｅｅ
ｍａｎｓ ら、Ｇｅｎｅ １９（１９８２）、３６１
−３６４）に基づき、テトラサイクリン感受性（１０μ
ｇ／ｘＱ）でスクリーニング（選り分け）した。ストレ
プトマイシンおよびスペクチノマイシンに耐性を示し、
テトラサイクリンに感受性を有するクローンを物理的に
同定した。マイクロスケールのＤＮＡ調製はＫ １ｅｉ
ｎらの方法（Ｐｌａ’５ｍ１ｄ３ （１９８０）。
８８−９１）に従って実施した。ｐＧＶ１１２２のＨｉ
ｎｄｌｌｌサイト中のＨｉｎｄｌｌｌフラグメント１の
配向は、５ａｌｌ？Ｆｌ化によって決定した。組換えプ
ラスミドを消化しく０’ Ｆ ａｒｒｅｌｌ らの条件
、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１７９（１９８０）、
４２１−４３５Ｌアガロースゲル電気泳動にかけると２
個のフラグメントが得られた。α−配向には０．７７ｋ
ｂおよび２２．７６ｋｂのフラグメント、β−配向には
、１０．３３ｋｂおよび１３．２０ｋｂのフラグメント
があった。α−配向の組換えプラスミドをその後のクロ
ーニングに使用し、これをｐｃＶ１１６８と名付けた。
ｎｄｌｌｌサイト中のＨｉｎｄｌｌｌフラグメント１の
配向は、５ａｌｌ？Ｆｌ化によって決定した。組換えプ
ラスミドを消化しく０’ Ｆ ａｒｒｅｌｌ らの条件
、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１７９（１９８０）、
４２１−４３５Ｌアガロースゲル電気泳動にかけると２
個のフラグメントが得られた。α−配向には０．７７ｋ
ｂおよび２２．７６ｋｂのフラグメント、β−配向には
、１０．３３ｋｂおよび１３．２０ｋｂのフラグメント
があった。α−配向の組換えプラスミドをその後のクロ
ーニングに使用し、これをｐｃＶ１１６８と名付けた。
ＴＬ−ＤＮＡの左側部分く左の境界配列を含んでいる）
を含有しているＢｇｌ ｌｌ−５ａｌ ＋フラグメント
をＢｇｌ ｌｌ−３ａｔ Ｉで開裂したｐＧＶ１１６８
に導入する。このフラグメントは、ベクターｐＢＲ３２
２に挿入された、ｐＴｉＢ６Ｓ３ のＴ領域からの、Ｂ
ａｍＨＩフラグメント８を含んでいる組換えプラスミド
ｐＧＶＱ １５３ （Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ
６（１９８１）、 ２４９ ２５３）から得うレル。
を含有しているＢｇｌ ｌｌ−５ａｌ ＋フラグメント
をＢｇｌ ｌｌ−３ａｔ Ｉで開裂したｐＧＶ１１６８
に導入する。このフラグメントは、ベクターｐＢＲ３２
２に挿入された、ｐＴｉＢ６Ｓ３ のＴ領域からの、Ｂ
ａｍＨＩフラグメント８を含んでいる組換えプラスミド
ｐＧＶＱ １５３ （Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓｍｉｄ
６（１９８１）、 ２４９ ２５３）から得うレル。
ｐＧＶＯ１５３およびｐＧＶ１１６８ＤＮＡはＢ ｅｔ
１ａｃｈらの方法で調製する（Ｆｅｄ。
１ａｃｈらの方法で調製する（Ｆｅｄ。
Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７−２０４３）。
ｐＧＶＯ１５３ＤＮＡ１０μｇを１０単位のＢｇｌＩＩ
および１０単位の５ａｉｌを用い、最終量１００μＱ中
３７℃で１時間、完全に消化した。消化混合物をプレバ
ラティグ０．８％アガロースゲル上、Ａ ｌｌｉｎｇｔ
ｏｎらの方法（Ａ ｎａｌ、 Ｂ ｉｏｃｈｉｍ、
８５ （１９７８）、１８８−１９６）で電気溶出し
、ゲルから２．１４ｋｂ Ｂｉｇ ｌｌ−３ａｌ ＩＩ
フラグメントを回収した。ｐＧＶ １１６８ＤＮＡ ２
ｄｇを２単位のＢｇｌ ＩＩおよび２単位の５ａｉ１で
完全に消化した。
および１０単位の５ａｉｌを用い、最終量１００μＱ中
３７℃で１時間、完全に消化した。消化混合物をプレバ
ラティグ０．８％アガロースゲル上、Ａ ｌｌｉｎｇｔ
ｏｎらの方法（Ａ ｎａｌ、 Ｂ ｉｏｃｈｉｍ、
８５ （１９７８）、１８８−１９６）で電気溶出し
、ゲルから２．１４ｋｂ Ｂｉｇ ｌｌ−３ａｌ ＩＩ
フラグメントを回収した。ｐＧＶ １１６８ＤＮＡ ２
ｄｇを２単位のＢｇｌ ＩＩおよび２単位の５ａｉ１で
完全に消化した。
最終量２０ｕＱ中、Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ リガーセｏ、
ｏ２単位を用いてＢｇｌ Ｉｆ−Ｓａｌ Ｉフラグメン
トＤＮＡ０．１ｄｇを０．０２ａｇのＢｇｌ ｌｌｌ−
３ａｉｌ消化ｐＧＶ１１６８とライゲーションした。こ
のライゲーション混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ５１４ ｈｓｒ−ｈｓｍ”細胞（Ｄａｇｅｒｔおよび
Ｅ ｒｈｌｉｃｈ。
ｏ２単位を用いてＢｇｌ Ｉｆ−Ｓａｌ Ｉフラグメン
トＤＮＡ０．１ｄｇを０．０２ａｇのＢｇｌ ｌｌｌ−
３ａｉｌ消化ｐＧＶ１１６８とライゲーションした。こ
のライゲーション混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ
Ｋ５１４ ｈｓｒ−ｈｓｍ”細胞（Ｄａｇｅｒｔおよび
Ｅ ｒｈｌｉｃｈ。
Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３−２８）に導入した。
細胞をストレプトマイシン（２０ｌ１ｇ／ｚ（１）およ
びスペクチノマイシン（５０μｇ／ｘのを補足したＬＢ
培地（Ｍｉｌｌｅｒ、 ＥｘｐｅｒｉＩ！１ｅｎｔｓ
ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （１９７
２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬｏ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ ＹｏｒＫ）に塗抹した。
びスペクチノマイシン（５０μｇ／ｘのを補足したＬＢ
培地（Ｍｉｌｌｅｒ、 ＥｘｐｅｒｉＩ！１ｅｎｔｓ
ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ （１９７
２）、 Ｃｏ１ｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬｏ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ ＹｏｒＫ）に塗抹した。
ストレプトマイシン−およびスベクチノマイシンー耐性
形質転換体から、マイクロスケールＤＮＡプレバレージ
ョン（Ｋｌｅｉｎら、Ｐｌａｓｍｉｄ ３（１９８０）
、８８−９１）を行なった。２．１４ｋｂＢｇｌ ｌｌ
−５ａｌ ｌフラグメントがＢｇｌ ｌｌ−５ａｌ ＋
消化ｐＧＶ１１６８に挿入されている組換えプラスミド
をＢｇｌ ｌｌ−３ａｌ Ｉ消化により同定した。
形質転換体から、マイクロスケールＤＮＡプレバレージ
ョン（Ｋｌｅｉｎら、Ｐｌａｓｍｉｄ ３（１９８０）
、８８−９１）を行なった。２．１４ｋｂＢｇｌ ｌｌ
−５ａｌ ｌフラグメントがＢｇｌ ｌｌ−５ａｌ ＋
消化ｐＧＶ１１６８に挿入されている組換えプラスミド
をＢｇｌ ｌｌ−３ａｌ Ｉ消化により同定した。
この消化で２．１４ｋｂおよび２１，８２ｋｂの２つの
フラグメントが得られた。これらの分子量（２゜１４ｋ
ｂおよび２１．８２ｋｂ）に相当する消化パターンを持
ったプラスミドをｐＧＶ１１７１と名付け、さらにクロ
ーンするのに用いた。ｐＧＶ１１７１からの１２．６５
ｋｂフラグメントは、左右のＴＬ−ＤＮＡ境界配列（Ｄ
ｅ Ｂ ｅｕｃｋｅｌｅｅｒら、１ｎＰｒ。
フラグメントが得られた。これらの分子量（２゜１４ｋ
ｂおよび２１．８２ｋｂ）に相当する消化パターンを持
ったプラスミドをｐＧＶ１１７１と名付け、さらにクロ
ーンするのに用いた。ｐＧＶ１１７１からの１２．６５
ｋｂフラグメントは、左右のＴＬ−ＤＮＡ境界配列（Ｄ
ｅ Ｂ ｅｕｃｋｅｌｅｅｒら、１ｎＰｒ。
ｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｈｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎＰｌａｎｔ Ｐａｔ
ｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ、 Ｍ、Ｒｉｄｅ’
（ｅｄ、）（１９７８）、 Ｉ、 Ｎ、 Ｒ，Ａ
、、 Ａｎｇｒｅｓ、 １１５−１２６）および腫瘍
性の増殖を可能にする遺伝子（Ｌ ｅｅｍａｎｓら、Ｅ
ＭＢＯＪ、（１９８２）、１４７−１５２）を含んでい
る。このＨｉｎｄｌｌ＋フラグメントをプラスミドｐＢ
Ｒ３２５に挿入シた（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｇｅｎｅ４（
１９７８）、１２１ １３６）。
ｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎＰｌａｎｔ Ｐａｔ
ｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ、 Ｍ、Ｒｉｄｅ’
（ｅｄ、）（１９７８）、 Ｉ、 Ｎ、 Ｒ，Ａ
、、 Ａｎｇｒｅｓ、 １１５−１２６）および腫瘍
性の増殖を可能にする遺伝子（Ｌ ｅｅｍａｎｓら、Ｅ
ＭＢＯＪ、（１９８２）、１４７−１５２）を含んでい
る。このＨｉｎｄｌｌ＋フラグメントをプラスミドｐＢ
Ｒ３２５に挿入シた（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｇｅｎｅ４（
１９７８）、１２１ １３６）。
ｐＧＶ１１７１およびＰＢＲ３２５はＢｅｔｌａｃｈら
の方法で調製した（Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、 ３５（
１９７，６）。
の方法で調製した（Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃ、 ３５（
１９７，６）。
２０３７−２０４３）。それぞれのＤＮＡ２μｇを２単
位のＨｉｎｄｌｌｌを用い、３７℃で１時間完全に消化
したくインキニバーション緩衝液はＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ
らにより記載されている（Ｍｏ１． Ｇ ｅｎ、 Ｇ
ｅｎｅｔ、１７９（１９８０）、４２１−４３５））。
位のＨｉｎｄｌｌｌを用い、３７℃で１時間完全に消化
したくインキニバーション緩衝液はＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ
らにより記載されている（Ｍｏ１． Ｇ ｅｎ、 Ｇ
ｅｎｅｔ、１７９（１９８０）、４２１−４３５））。
０．１μｇのＨｉｎｄｌｌｌ消化したｐＧＶ１１７１を
、Ｈｉｎｄｌｌｌで線状化した０、０５μｇのｐＢ Ｒ
３２５と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．０２単位を用いてラ
イゲーションした。ライゲーション混合物によるコンピ
テントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ ５１４ ｈｓｒ−ｈｓｍ”
の形質転換はＤ ａｇｅｒｔおよびＥｈｒｌｉｃｈの方
法で行なった（Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３ ２８
）。細胞を、カルベニシリン（１００μｇ／ｘＱ’）を
補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ
（１９７２）＋ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に塗
抹した。カルベニシリン耐性コロニーを、テトラサイク
リン耐性を暗号化してい、る遺伝子に挿入することによ
るその不活性化に基づき、テトラサイクリン（１０μｇ
／ｌの感受性でスクリーニングした（Ｂｏｌｉｖａｒ、
Ｇｅｎｅ ４（１９７８）、１２１−１３６）。カル
ベニシリン耐性、テトラサイクリン感受性のコロニーを
、そのコロニーから調製したＤＮＡの制限酵素消化によ
り、マイクロスケール技法（Ｋ １ａｉｎら、Ｐｌａｓ
ｍｉｄ ３（１９８０）、８８ ９１）によって物理的
に特性化した。即ち、ＢａｍＨＩ消化により、４つのＤ
ＮＡフラグメントが得られる：α配向の場合は０．９８
ｋｂ、４．７１ｋｂ、５．９８ｋｂおよび７．０２ｋｂ
のフラグメントが得られ、β配向の場合は０１９８ｋｂ
、 ４．７１ｋｂ％１．７１ｋｂおよび１１．２０ｋｂ
のフラグメントが得られる。こうして得られたα配向の
組換えプラスミドはｐＧＶ７００と名付けられ、更にそ
の後の実験に用いられた。
、Ｈｉｎｄｌｌｌで線状化した０、０５μｇのｐＢ Ｒ
３２５と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．０２単位を用いてラ
イゲーションした。ライゲーション混合物によるコンピ
テントＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ ５１４ ｈｓｒ−ｈｓｍ”
の形質転換はＤ ａｇｅｒｔおよびＥｈｒｌｉｃｈの方
法で行なった（Ｇｅｎｅ ６（１９８０）、２３ ２８
）。細胞を、カルベニシリン（１００μｇ／ｘＱ’）を
補足したＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ
（１９７２）＋ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に塗
抹した。カルベニシリン耐性コロニーを、テトラサイク
リン耐性を暗号化してい、る遺伝子に挿入することによ
るその不活性化に基づき、テトラサイクリン（１０μｇ
／ｌの感受性でスクリーニングした（Ｂｏｌｉｖａｒ、
Ｇｅｎｅ ４（１９７８）、１２１−１３６）。カル
ベニシリン耐性、テトラサイクリン感受性のコロニーを
、そのコロニーから調製したＤＮＡの制限酵素消化によ
り、マイクロスケール技法（Ｋ １ａｉｎら、Ｐｌａｓ
ｍｉｄ ３（１９８０）、８８ ９１）によって物理的
に特性化した。即ち、ＢａｍＨＩ消化により、４つのＤ
ＮＡフラグメントが得られる：α配向の場合は０．９８
ｋｂ、４．７１ｋｂ、５．９８ｋｂおよび７．０２ｋｂ
のフラグメントが得られ、β配向の場合は０１９８ｋｂ
、 ４．７１ｋｂ％１．７１ｋｂおよび１１．２０ｋｂ
のフラグメントが得られる。こうして得られたα配向の
組換えプラスミドはｐＧＶ７００と名付けられ、更にそ
の後の実験に用いられた。
ｐＧｖ７５０は、ｐＧＶ７００に挿入サレタＴＬ−領域
の内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している３、４９ｋ
ｂ Ｂｇｌｎ−３ｅａｌフラグメントの代わりに、カナ
マイシン耐性を暗号化している２、８１ ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ−Ｈｐａｌルミｌフラグメントすることにより、ｐ
ＧＶ７００から誘導される。カナマイシン耐性を暗号化
しているＢａｍＨＩ −Ｈｐａｌルミｌフラグメント：
Ｔｎ５（Ｂｅｒｇら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎ ａｔ ｌ。
の内部の腫瘍に必須の機能を暗号化している３、４９ｋ
ｂ Ｂｇｌｎ−３ｅａｌフラグメントの代わりに、カナ
マイシン耐性を暗号化している２、８１ ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩ−Ｈｐａｌルミｌフラグメントすることにより、ｐ
ＧＶ７００から誘導される。カナマイシン耐性を暗号化
しているＢａｍＨＩ −Ｈｐａｌルミｌフラグメント：
Ｔｎ５（Ｂｅｒｇら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎ ａｔ ｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７２（１９７５）、３６２
８−３６３２ ）から得られる。λ：：Ｔｎ５の調製は
Ｍｉ １１ｅｒにより記載されている（Ｅ ｘｐｅｒｆ
＊ｅｎｔｇ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ（１９７２）＋ Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
ｏ ｐＧ Ｖ ７００ＤＮＡはＢｅｔｌａｃｈらの方法
で調製する（Ｆｅｄ。
８−３６３２ ）から得られる。λ：：Ｔｎ５の調製は
Ｍｉ １１ｅｒにより記載されている（Ｅ ｘｐｅｒｆ
＊ｅｎｔｇ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ（１９７２）＋ Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
ｏ ｐＧ Ｖ ７００ＤＮＡはＢｅｔｌａｃｈらの方法
で調製する（Ｆｅｄ。
Ｐｒｏｃ、３５（１９７６）、２０３７ ２０４３）。
ｐＧＶ７００ ＤＮＡ ２μｇを２単位ノＢｇｌＩ
Ｉおよび２単位のＳｍａｌで完全に消化した。λ：：Ｔ
ｎ５ＤＮＡ２μｇを２単位のＢａｍＨＩおよび２単位の
Ｈｐａｌで完全に消化した。１μｇのＢａｍＨＩ −Ｈ
ｐａＩ消化λ：：Ｔｎ５を、最終量１０ｔｔ（ｌ中、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ０．５単位を用いて、０．２μｇ
のＢｇＩｎ−３ｍａＩ消化ｐＧＶ７００とライゲージ目
ンした（製造業者の指示する条件に従った）。このライ
ゲーション混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ５１
４ ｈｓｒ−ｈｓｍ”細胞（Ｄ ａｇｅｒｔおよびＥｒ
ｈｌｉｃｈ。
Ｉおよび２単位のＳｍａｌで完全に消化した。λ：：Ｔ
ｎ５ＤＮＡ２μｇを２単位のＢａｍＨＩおよび２単位の
Ｈｐａｌで完全に消化した。１μｇのＢａｍＨＩ −Ｈ
ｐａＩ消化λ：：Ｔｎ５を、最終量１０ｔｔ（ｌ中、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ０．５単位を用いて、０．２μｇ
のＢｇＩｎ−３ｍａＩ消化ｐＧＶ７００とライゲージ目
ンした（製造業者の指示する条件に従った）。このライ
ゲーション混合物をコンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ５１
４ ｈｓｒ−ｈｓｍ”細胞（Ｄ ａｇｅｒｔおよびＥｒ
ｈｌｉｃｈ。
Ｇｅｎｅ６（１９８０）、２３ ２８）に導入した。
細胞を、カルベニシリン（１００μｇ／ｚｉ２）および
カナマイシン（２５μｇ／ｘＱ）を補足したＬＢ培地（
Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）＋
Ｃｏ１ｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）上に塗抹した。マイ
クロスケール技法（Ｋ １ｅｉｎら、Ｐ１ａｓ＋＋＋ｉ
ｄ ３（１９８０）、８８ ９１）に従って調製したＤ
ＮＡの制限酵素分析により、ＣｂＲおよびＫｍ”コロニ
ーを物理的に特性化した。
カナマイシン（２５μｇ／ｘＱ）を補足したＬＢ培地（
Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）＋
Ｃｏ１ｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）上に塗抹した。マイ
クロスケール技法（Ｋ １ｅｉｎら、Ｐ１ａｓ＋＋＋ｉ
ｄ ３（１９８０）、８８ ９１）に従って調製したＤ
ＮＡの制限酵素分析により、ＣｂＲおよびＫｍ”コロニ
ーを物理的に特性化した。
このＤＮＡをＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩで二重消化すると
、３．９４ｋｂ、 ５．８９ｋｂおよび８．０９ｋｂの
３つのフラグメントが、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化すると２
．６８ｋｂ、５．９９ｋｂおよび９．２５ｋｂの３つの
フラグメントが得られる。この消化パターンを示すプラ
スミドをｐＧＶ７５０と名付け、第１５図に模式的に示
した。
、３．９４ｋｂ、 ５．８９ｋｂおよび８．０９ｋｂの
３つのフラグメントが、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化すると２
．６８ｋｂ、５．９９ｋｂおよび９．２５ｋｂの３つの
フラグメントが得られる。この消化パターンを示すプラ
スミドをｐＧＶ７５０と名付け、第１５図に模式的に示
した。
ｐＧＶ７００とｐＧＶ７５０１ｔ、オクトピンＴｉプラ
スミドｐＴｉＢ６ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの左右の境界配列
を含む、２つの相異なる中間クローニングベクターであ
る。更に、これら２つのプラスミドではＴ−領域内の削
除の程度が異なっている。
スミドｐＴｉＢ６ｓ３のＴＬ−ＤＮＡの左右の境界配列
を含む、２つの相異なる中間クローニングベクターであ
る。更に、これら２つのプラスミドではＴ−領域内の削
除の程度が異なっている。
ｐＧＶ７００は、オクトピンシンターゼ（トランスクリ
プト３）およびその他３つの生成物、即ち４．６ａおよ
び６ｂ（Ｔ−領域の生成物についてはＷ ｉｌ １ｍ１
ｔｚｅｒら、ＥＮＢＯＪ、 １ （１９８２）。
プト３）およびその他３つの生成物、即ち４．６ａおよ
び６ｂ（Ｔ−領域の生成物についてはＷ ｉｌ １ｍ１
ｔｚｅｒら、ＥＮＢＯＪ、 １ （１９８２）。
１３９−１４６参照）のための遺伝情報を持った縮小Ｔ
−領領域含んでいる。この３つの生成物（４，６ａおよ
び６ｂ）の組み合せが形質転換された植物の新芽形成を
促す。ｐＧＶ７５０はもっと小さいＴ−領域、即ちオク
トピンシンターゼ遺伝子だけを含んでいる。生成物４，
６ａおよび６ｂの為の情報は、カナマイシン（ネオマイ
シン）耐性を暗号化している抗生物質耐性マーカー遺伝
子によって置換されてしまっている。
−領領域含んでいる。この３つの生成物（４，６ａおよ
び６ｂ）の組み合せが形質転換された植物の新芽形成を
促す。ｐＧＶ７５０はもっと小さいＴ−領域、即ちオク
トピンシンターゼ遺伝子だけを含んでいる。生成物４，
６ａおよび６ｂの為の情報は、カナマイシン（ネオマイ
シン）耐性を暗号化している抗生物質耐性マーカー遺伝
子によって置換されてしまっている。
ｐＧＶ７００およびｐＧＶ７５０は、Ｂタイプのアクセ
プターＴｉプラスミド（第８図および後記実施例３参照
）と共に使用し得る中間クローニングベクターの例であ
る。これらのベクターは、それらが所望の遺伝子を含ん
でいないことを除けば、第９図に示したものと部分的に
類似している。これらのベクターは、その改良Ｔ−領域
内にクローンする為の１個の制限エンドヌクレアーゼサ
イトを含んでいるので、所望の遺伝子を簡単にそれらの
ベクターに挿入することができる（第１４図および第１
５図参照）。
プターＴｉプラスミド（第８図および後記実施例３参照
）と共に使用し得る中間クローニングベクターの例であ
る。これらのベクターは、それらが所望の遺伝子を含ん
でいないことを除けば、第９図に示したものと部分的に
類似している。これらのベクターは、その改良Ｔ−領域
内にクローンする為の１個の制限エンドヌクレアーゼサ
イトを含んでいるので、所望の遺伝子を簡単にそれらの
ベクターに挿入することができる（第１４図および第１
５図参照）。
実施例３ アクセプターＴｉプラスミドｐＧ■２２６０
（タイプＢ）の組み立て 出発株およびプラスミド。
（タイプＢ）の組み立て 出発株およびプラスミド。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ （野生型Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから誘導さ
れる、リファンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１よびエリスロマ
イシン−クロラムフェニコール耐性株Ｃ５８Ｃ１） Ｔｉプラスミド＝ｐＧＶ２２１７ 中間ベクター（第１６図）＝ｐＧＶ ７４５Ｔｉプラス
ミドｐＧＶ２２１７の組み立てについては詳細に記載さ
れている（ Ｌ ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１
９８２）、１４７−１５２）。これは、オクトピンＴｉ
プラスミドの全ＴＬ−領域の欠失置換突然変異体を含ん
でいる：即ち、ＢａｍＨＩフラグメント８．３０ｂ、２
８．１７ａおよびＢａ＋＊Ｈ■フラグメント２の左の３
．７６ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｄ
ｅ Ｖｏｓら、Ｐ １ａｓａ＋ｉｄ ６ （１９８１）
、２４９−２５３）が、Ｔｎ５のａｐｔ （アセチルホ
スホトランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいるｐＫＣ７
のＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩフラグメント（Ｒａｏ ＆
Ｒｏｇｅｒｓ、 Ｇｅｎｅ ７（１９７９）、 ７
９−８２）で置き換えられている。この遺伝子はアミノ
グリコシド、ネオマイシンおよびカナマイシンに対する
耐性を暗号化している。
ｓ （野生型Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから誘導さ
れる、リファンピシン耐性株Ｃ５８Ｃ１よびエリスロマ
イシン−クロラムフェニコール耐性株Ｃ５８Ｃ１） Ｔｉプラスミド＝ｐＧＶ２２１７ 中間ベクター（第１６図）＝ｐＧＶ ７４５Ｔｉプラス
ミドｐＧＶ２２１７の組み立てについては詳細に記載さ
れている（ Ｌ ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１
９８２）、１４７−１５２）。これは、オクトピンＴｉ
プラスミドの全ＴＬ−領域の欠失置換突然変異体を含ん
でいる：即ち、ＢａｍＨＩフラグメント８．３０ｂ、２
８．１７ａおよびＢａ＋＊Ｈ■フラグメント２の左の３
．７６ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｄ
ｅ Ｖｏｓら、Ｐ １ａｓａ＋ｉｄ ６ （１９８１）
、２４９−２５３）が、Ｔｎ５のａｐｔ （アセチルホ
スホトランスフェラーゼ）遺伝子を含んでいるｐＫＣ７
のＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩフラグメント（Ｒａｏ ＆
Ｒｏｇｅｒｓ、 Ｇｅｎｅ ７（１９７９）、 ７
９−８２）で置き換えられている。この遺伝子はアミノ
グリコシド、ネオマイシンおよびカナマイシンに対する
耐性を暗号化している。
中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立てを第１６図に模式
的に示した。これについて以下に詳述する。組換えプラ
スミドｐＧＶ７１３を、α配向でＨｉｎｄ１１１フラグ
メント１４．１８ｃ、２２ｅおよび３８ｃを含む、オク
トビンＴｉプラスミドサブクローンｐＧＶＯ２１９（Ｄ
ｅ Ｖｏｓら、Ｐ ｌａｓｍｉｄ ６ （１９８１）、
２４９−２５３）から誘導した。ｐｃｖ０２１９ＤＮＡ
をＢａｍＨＩで完全に消化し、次いで自己結紮（セルフ
ライゲーション）に有利な条件下でライゲーションした
（ライゲーション混合物中のＤＮＡの最終濃度＜ １８
ｇ ＤＮＡ／ｎ＋Ｑ）。アンピシリン耐性で形質転換体
を選別し、制限酵素による消化で物理的に特性化した。
的に示した。これについて以下に詳述する。組換えプラ
スミドｐＧＶ７１３を、α配向でＨｉｎｄ１１１フラグ
メント１４．１８ｃ、２２ｅおよび３８ｃを含む、オク
トビンＴｉプラスミドサブクローンｐＧＶＯ２１９（Ｄ
ｅ Ｖｏｓら、Ｐ ｌａｓｍｉｄ ６ （１９８１）、
２４９−２５３）から誘導した。ｐｃｖ０２１９ＤＮＡ
をＢａｍＨＩで完全に消化し、次いで自己結紮（セルフ
ライゲーション）に有利な条件下でライゲーションした
（ライゲーション混合物中のＤＮＡの最終濃度＜ １８
ｇ ＤＮＡ／ｎ＋Ｑ）。アンピシリン耐性で形質転換体
を選別し、制限酵素による消化で物理的に特性化した。
こうしてｐＧＶＯ２１９に存在する６、５ｋｂ Ｂａｍ
ＨＩフラグメントをもはや含んでいないクローンを分離
し、こｈをｐＧＶ７１３と名付け、その後のクローニン
グに使用した（以下の記載参照）６ＢａｍＨＩフラグメ
ント２を含んでいるｐＧＶ Ｏ１２０（Ｄｅ Ｖｏｓら
、Ｐｌａｓ＋＋ｉｄ ６（１９８１）、２４９ ２５３
）から組換えプラスミドｐＧＶ７３８を誘導した。ｐＧ
ＶＱ１２０ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＧＶ７１３
の場合と同様にして自己結紮させた。形質転換体をアン
ピシリン耐性によって選別し、制限酵素消化により分析
した。ＥｃｏＲＩフラグメント２０．１２およびＥｃｏ
ＲＩフラグメント１９ａの一部とｐＢＲ３２２の一部を
含んでいる２、９５ｋｂＥｃ。
ＨＩフラグメントをもはや含んでいないクローンを分離
し、こｈをｐＧＶ７１３と名付け、その後のクローニン
グに使用した（以下の記載参照）６ＢａｍＨＩフラグメ
ント２を含んでいるｐＧＶ Ｏ１２０（Ｄｅ Ｖｏｓら
、Ｐｌａｓ＋＋ｉｄ ６（１９８１）、２４９ ２５３
）から組換えプラスミドｐＧＶ７３８を誘導した。ｐＧ
ＶＱ１２０ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＧＶ７１３
の場合と同様にして自己結紮させた。形質転換体をアン
ピシリン耐性によって選別し、制限酵素消化により分析
した。ＥｃｏＲＩフラグメント２０．１２およびＥｃｏ
ＲＩフラグメント１９ａの一部とｐＢＲ３２２の一部を
含んでいる２、９５ｋｂＥｃ。
Ｒ１フラグメントが全て除去されたクローンをｐＧＶ７
３８と名付け、更にその後のクローニングに利用した。
３８と名付け、更にその後のクローニングに利用した。
このプラスミドは、依然としてＢａａ＋ＨＩフラグメン
ト２の右側部分カラノ５．６５ｋｂ ＥｃｏＲ１−Ｂａ
ｍＨＩフラグメントを含んでいる（ＤｅＶｏｓら、Ｐ１
ａｓａ＋ｉｄ ６（１９８１）、 ２４９−２５３）
。
ト２の右側部分カラノ５．６５ｋｂ ＥｃｏＲ１−Ｂａ
ｍＨＩフラグメントを含んでいる（ＤｅＶｏｓら、Ｐ１
ａｓａ＋ｉｄ ６（１９８１）、 ２４９−２５３）
。
次いでｐＧＶ７１３ ＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩおよび
ＢａｍＨＩで消化し、消化物をブ“レパラティブアガロ
ースゲルにかけた。電気泳動の後、ｐＧＶ７１３内に含
まれている２、３０ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨ
ｌフラグメントを電気溶出で純化した（Ａｉｌｉｎｇｔ
ｏｎら、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅａ＋、 ８５（
１９７５）、 １８８−１９６）。このフラグメント
をＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで完全に消化した
ｐＧＶ７３８とライゲーションした。形質転換後、アン
ピシリン耐性コロニーを、制限酵素消化により物理的に
特性化する。例えば、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ消化に
より、それぞれ３．９８ｋｂ（＝ベクタ一部分）と７．
９５ｋｂ（＝挿入部分）の２つのフラグメントが得られ
るはずである。この特性を持った組換えプラスミドはｐ
ＧＶ７４５と命名され、アクセプターＴｉプラスミドｐ
ＧＶ２２６０を組み立てるための中間ベクターとして使
用された。
ＢａｍＨＩで消化し、消化物をブ“レパラティブアガロ
ースゲルにかけた。電気泳動の後、ｐＧＶ７１３内に含
まれている２、３０ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨ
ｌフラグメントを電気溶出で純化した（Ａｉｌｉｎｇｔ
ｏｎら、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅａ＋、 ８５（
１９７５）、 １８８−１９６）。このフラグメント
をＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで完全に消化した
ｐＧＶ７３８とライゲーションした。形質転換後、アン
ピシリン耐性コロニーを、制限酵素消化により物理的に
特性化する。例えば、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ消化に
より、それぞれ３．９８ｋｂ（＝ベクタ一部分）と７．
９５ｋｂ（＝挿入部分）の２つのフラグメントが得られ
るはずである。この特性を持った組換えプラスミドはｐ
ＧＶ７４５と命名され、アクセプターＴｉプラスミドｐ
ＧＶ２２６０を組み立てるための中間ベクターとして使
用された。
プラスミドｐＧＶ７４５４ｔ ｐＢＲ３２２部分にＣｏ
１Ｅｌ特異的ｂｏｗサイトを持っており、実施例１に記
載した様に（アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立てについて）、ヘルパープラスミドＲ６４ｄ
ｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８を使ッテＥ、 ｃｏｌｉから
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ授動させることができる
。
１Ｅｌ特異的ｂｏｗサイトを持っており、実施例１に記
載した様に（アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立てについて）、ヘルパープラスミドＲ６４ｄ
ｒｄｌｌおよびｐＧＪ２８を使ッテＥ、 ｃｏｌｉから
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ授動させることができる
。
ｐＧＶ７４５を、リファンピシン耐性でありＴｉプラス
ミドｐＧＶ２２１７を含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１に授動させた。最初の乗り換えは
、実施例１（アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立て）に記載した方法と同じ方法で、ｐＢＲ３
２２のアンピシリン耐性を使って選択したｃ２回目の乗
り換えにより、ｐＧＶ２２１７に存在する欠失置換突然
変異体がプラスミドｐＧＶ７４５のｐＢＲ３２２配列に
よッテ置換される。ｐＧＶ７４５のＰＧＶ２２１７との
相互組込みの結果得られるアンピシリン耐性トランス接
合体を、カナマイシン耐性の欠落により直接選別するこ
とにより第２の組換え体を得た。この様にして、ｐＧＶ
２２６０（アンピシリン耐性、・カナマイシン感受性）
を含んでいるリファンピシンＡ ｇｒ□ｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ株Ｃ５８Ｃ１を得た。
ミドｐＧＶ２２１７を含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ株Ｃ５８Ｃ１に授動させた。最初の乗り換えは
、実施例１（アクセプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５
０の組み立て）に記載した方法と同じ方法で、ｐＢＲ３
２２のアンピシリン耐性を使って選択したｃ２回目の乗
り換えにより、ｐＧＶ２２１７に存在する欠失置換突然
変異体がプラスミドｐＧＶ７４５のｐＢＲ３２２配列に
よッテ置換される。ｐＧＶ７４５のＰＧＶ２２１７との
相互組込みの結果得られるアンピシリン耐性トランス接
合体を、カナマイシン耐性の欠落により直接選別するこ
とにより第２の組換え体を得た。この様にして、ｐＧＶ
２２６０（アンピシリン耐性、・カナマイシン感受性）
を含んでいるリファンピシンＡ ｇｒ□ｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ株Ｃ５８Ｃ１を得た。
このＴｉプラスミドｐＧＶ２２６０＋ｔ、ｐｃｖ７００
−またはｐＧＶ７５０−タイプの中間クローニングベク
ター用のアクセプタープラスミド（Ｂタイプ）として使
用されるものである。これらは、（ｉ）アンピシリン耐
性遺伝子、複製起源およびｐＢＲ３２２のｂｏｗサイト
を持ったり、ＮＡフラグメント、（ｉｉ）ＴＬ−ＤＮＡ
の左右の境界配列のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列およ
び、中間クローニングベクターのＥ、 ｃｏｌｉからＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移並びにそのアクセ
プターＴｉプラスミドｐＧｖ２２６０への相互組込みを
遺伝学的に選別し得る、ｐＢＲ３２２に既に存在してい
る耐性マーカーとは別の、もう１つの耐性マーカーを含
んでいるＤＮＡフラグメント、で構成されている。
−またはｐＧＶ７５０−タイプの中間クローニングベク
ター用のアクセプタープラスミド（Ｂタイプ）として使
用されるものである。これらは、（ｉ）アンピシリン耐
性遺伝子、複製起源およびｐＢＲ３２２のｂｏｗサイト
を持ったり、ＮＡフラグメント、（ｉｉ）ＴＬ−ＤＮＡ
の左右の境界配列のすぐ外側に位置するＤＮＡ配列およ
び、中間クローニングベクターのＥ、 ｃｏｌｉからＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの転移並びにそのアクセ
プターＴｉプラスミドｐＧｖ２２６０への相互組込みを
遺伝学的に選別し得る、ｐＢＲ３２２に既に存在してい
る耐性マーカーとは別の、もう１つの耐性マーカーを含
んでいるＤＮＡフラグメント、で構成されている。
例えば、本発明者らは、ｐＧＶ２２６０とｐｃｖ７００
との間の相互組込み体を持っているＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍは、所望のＤＮＡ配列（Ｔ−ＤＮＡ境界の間に
含まれている）を植物細胞ゲノムへ転移させ得ることを
立証した。この形質転換された植物細胞は、もしｐＧＶ
７００が３つの生産物のための遺伝情報（４，６ａｑ
６ｂ； Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、１（１
９８２）、１３９−１４６）を含んでいる場合は、期待
される表現形質、即ち新芽を生じる腫瘍を示す。この様
に、本発明者らは、ＢタイプのアクセプターＴｉプラス
ミドは、第９図に示し、更に実施例２に記載したタイプ
の中間クローニングベクターとの相互組込み体として使
用すると、ＤＮＡを植物細胞に転移させることができる
ことを証明した。
との間の相互組込み体を持っているＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍは、所望のＤＮＡ配列（Ｔ−ＤＮＡ境界の間に
含まれている）を植物細胞ゲノムへ転移させ得ることを
立証した。この形質転換された植物細胞は、もしｐＧＶ
７００が３つの生産物のための遺伝情報（４，６ａｑ
６ｂ； Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒら、ＥＭＢＯＪ、１（１
９８２）、１３９−１４６）を含んでいる場合は、期待
される表現形質、即ち新芽を生じる腫瘍を示す。この様
に、本発明者らは、ＢタイプのアクセプターＴｉプラス
ミドは、第９図に示し、更に実施例２に記載したタイプ
の中間クローニングベクターとの相互組込み体として使
用すると、ＤＮＡを植物細胞に転移させることができる
ことを証明した。
実施例４ 植物に発現させようとする遺伝子を含んだ中
間クローニングベクターの組み立て本発明が完成される
まで、ＴｉプラスミドのＴ−領域内の、多かれ少なかれ
でたらめな位置に全遺伝子を挿入しても、その外来性の
配列が植物ゲノムへ転移した後発現されるということは
なかった。本発明方法に従えば、所望の外来性遺伝子（
群）の暗号領域を、植物細胞中で機能することが知られ
ている転写開始および終了信号に連結することができる
。この方法の有用性は、ツバリンシンターゼ遺伝子を暗
号化しているＤＮＡ配列が関与する、本発明、の実験に
よって例証される。この遺伝子の全配列および正確な転
写開始および終了は既知である（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、
Ｊ 、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ’、１
（１９８２）、５６１ ５７４）。本発明によれば外来
性遺伝子の蛋白質暗号化領域はｎｏｓプロモーターの隣
りに挿入することができる。外来性遺伝子配列の例とし
て、オクトピンシンターゼ遺伝子の暗号領域（Ｄｅ Ｇ
ｒｅｖｅら、Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｉ、 Ｇｅｎｅｔ
、 １（１９８２）、 ４９９ ５１２）をｎｏｓ
プロモーターに隣接させて挿入する。この構造物はアク
セプターＴｉプラスミド内に授勤され、植物を感染させ
るのに使用される。生成した腫瘍組織にオクトピンが存
在するかどうかを分析した所、陽性であることがわかっ
た。
間クローニングベクターの組み立て本発明が完成される
まで、ＴｉプラスミドのＴ−領域内の、多かれ少なかれ
でたらめな位置に全遺伝子を挿入しても、その外来性の
配列が植物ゲノムへ転移した後発現されるということは
なかった。本発明方法に従えば、所望の外来性遺伝子（
群）の暗号領域を、植物細胞中で機能することが知られ
ている転写開始および終了信号に連結することができる
。この方法の有用性は、ツバリンシンターゼ遺伝子を暗
号化しているＤＮＡ配列が関与する、本発明、の実験に
よって例証される。この遺伝子の全配列および正確な転
写開始および終了は既知である（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、
Ｊ 、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ’、１
（１９８２）、５６１ ５７４）。本発明によれば外来
性遺伝子の蛋白質暗号化領域はｎｏｓプロモーターの隣
りに挿入することができる。外来性遺伝子配列の例とし
て、オクトピンシンターゼ遺伝子の暗号領域（Ｄｅ Ｇ
ｒｅｖｅら、Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｉ、 Ｇｅｎｅｔ
、 １（１９８２）、 ４９９ ５１２）をｎｏｓ
プロモーターに隣接させて挿入する。この構造物はアク
セプターＴｉプラスミド内に授勤され、植物を感染させ
るのに使用される。生成した腫瘍組織にオクトピンが存
在するかどうかを分析した所、陽性であることがわかっ
た。
キメラツバリンプロモーターを含有している中間クロー
ニングベクターの組み立て：オクトピンシンターゼ構造
遺伝子を第１８図〜第２０図に示す。
ニングベクターの組み立て：オクトピンシンターゼ構造
遺伝子を第１８図〜第２０図に示す。
簡単に言えば、ｎｏｓ遺伝子を含んでいる制限フラグメ
ントＨｉｎｄ １Ｉｌ−２３をインビトロで処理してｎ
ｏｓ暗号配列の大部分を除去する一方、制限エンドヌク
レアーゼサイトＢａ＋ａＨＩに隣接しているｎｏｓプロ
モーターは保持する（第１８図）。１０ＭｇのｐＧＶＯ
４２２（完全なｎｏｓ遺伝子を含むＨｉｎｄ １ｌＩ−
２３フラグメントを持ったｐＢＲ３２２誘導体； Ｄｅ
ｐｉｃｋｅｒら、 Ｐｌａｓｍｉｄ （１９８０）、
１９３−２１１）を５ａｕ３Ａで消化し、ｎｏｓプロモ
ーターを含んた３５０ｂｐのフラグメントをプレバラテ
ィグ５％ポリアクリルアミドゲルで分離する。このプロ
モーターフラグメントを、５゛−末端燐酸エステル基を
除去するために予め細菌性アルカリホスファターゼ（Ｂ
ＡＰ）で処理シた、Ｂｇｌ １１＝切断ｐＫＣ７（Ｒａ
ｏら、Ｇｅｎｅ７（１９７９）、７９−８２）に結合さ
せる。得られたプラスミド（ｐＬＧｖ１３）２０Ｍｇを
Ｂｇｌ １１テ消化し、４００μＱの１２１１Ｍ Ｍｇ
ＣＱｔ、１２ＩＩＩＭＣａＣ（ｈ、０．６Ｍ ＮａＣ＆
、１ｏ＋Ｍ ＥＤＴＡおよび２０ＩＩＭトリスーＨＣｌ
２（ｐＨ８，０）中、３０℃でＢａｌ・３１エキソヌク
レアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ、 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
） ７単位を用いて４〜１０分間処理する。この間、約
２０〜５０ｂｐのＤＮＡが除去される。このＢａ１３１
−処理分子をＢａａ＋ＨＩで消化した後、ＤＮＡポリメ
ラーゼのＫ ｌｅｎｏｗフラグメントと４つのデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェート（それぞれ１０ＭＭ）と
共にインキュベートして、その末端を満たす。充填され
たＢａｍＨＩ末端とＢａｔ３１除去末端とのライゲーシ
ョンから得られる再生Ｂａ５ＨＩサイトを持ったプラス
ミドを選別する。
ントＨｉｎｄ １Ｉｌ−２３をインビトロで処理してｎ
ｏｓ暗号配列の大部分を除去する一方、制限エンドヌク
レアーゼサイトＢａ＋ａＨＩに隣接しているｎｏｓプロ
モーターは保持する（第１８図）。１０ＭｇのｐＧＶＯ
４２２（完全なｎｏｓ遺伝子を含むＨｉｎｄ １ｌＩ−
２３フラグメントを持ったｐＢＲ３２２誘導体； Ｄｅ
ｐｉｃｋｅｒら、 Ｐｌａｓｍｉｄ （１９８０）、
１９３−２１１）を５ａｕ３Ａで消化し、ｎｏｓプロモ
ーターを含んた３５０ｂｐのフラグメントをプレバラテ
ィグ５％ポリアクリルアミドゲルで分離する。このプロ
モーターフラグメントを、５゛−末端燐酸エステル基を
除去するために予め細菌性アルカリホスファターゼ（Ｂ
ＡＰ）で処理シた、Ｂｇｌ １１＝切断ｐＫＣ７（Ｒａ
ｏら、Ｇｅｎｅ７（１９７９）、７９−８２）に結合さ
せる。得られたプラスミド（ｐＬＧｖ１３）２０Ｍｇを
Ｂｇｌ １１テ消化し、４００μＱの１２１１Ｍ Ｍｇ
ＣＱｔ、１２ＩＩＩＭＣａＣ（ｈ、０．６Ｍ ＮａＣ＆
、１ｏ＋Ｍ ＥＤＴＡおよび２０ＩＩＭトリスーＨＣｌ
２（ｐＨ８，０）中、３０℃でＢａｌ・３１エキソヌク
レアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ、 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
） ７単位を用いて４〜１０分間処理する。この間、約
２０〜５０ｂｐのＤＮＡが除去される。このＢａ１３１
−処理分子をＢａａ＋ＨＩで消化した後、ＤＮＡポリメ
ラーゼのＫ ｌｅｎｏｗフラグメントと４つのデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェート（それぞれ１０ＭＭ）と
共にインキュベートして、その末端を満たす。充填され
たＢａｍＨＩ末端とＢａｔ３１除去末端とのライゲーシ
ョンから得られる再生Ｂａ５ＨＩサイトを持ったプラス
ミドを選別する。
い（つかの候補のＢａｍＨＩ −３ａｃ ＩＩフラグメ
ントのサイズを６％尿素−ポリアクリルアミドゲル中で
見積り、サイズが２００〜２８０ヌクレオチドの範囲に
ある候補のヌクレオチド配列を決定する。プロモーター
を持った２０３ｂｐのＳａｃｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメ
ントを含んでいるクローンｐＬＧＶ８１を、ｐＧＶＯ４
２２の ｎｏｓ遺伝子転子Ｓ ａｃ Ｉｌ−ＢａｍＨＩ
フラグメントと置換するのに使用する・この最終プ
ロモーターベクターはｐＬＧＶ２３８１と呼ばれる。全
ての組換えプラスミドはＥ 、 ｃｏｌ ｉ株ＨＢＩＯ
Ｉの形質転換により選択する。
ントのサイズを６％尿素−ポリアクリルアミドゲル中で
見積り、サイズが２００〜２８０ヌクレオチドの範囲に
ある候補のヌクレオチド配列を決定する。プロモーター
を持った２０３ｂｐのＳａｃｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメ
ントを含んでいるクローンｐＬＧＶ８１を、ｐＧＶＯ４
２２の ｎｏｓ遺伝子転子Ｓ ａｃ Ｉｌ−ＢａｍＨＩ
フラグメントと置換するのに使用する・この最終プ
ロモーターベクターはｐＬＧＶ２３８１と呼ばれる。全
ての組換えプラスミドはＥ 、 ｃｏｌ ｉ株ＨＢＩＯ
Ｉの形質転換により選択する。
この様に処理したｎｏｓプロモータを含んでいるプラス
ミドベクターをＢａｍＨＩで消化し、ＢａｎＨＩフラグ
メントに含まれているＯＣＳの暗号配列をこのサイトに
挿入する。このＯＣＳ暗号配列も、インビトロで処理し
、第１９図に示した様に、ＢａａＨ１制限エンドヌクレ
アーゼサイトで囲まれる様にする。オクトビンＴｉプラ
スミドＢ６Ｓ３のＢａａ＋ＨＩフラグメント１７ａ １
０μｓ （Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓｇ＋ｉｄ ６（１
９８１）、２４９−２５３）をＢａｍＨＩおよびＳｍａ
Ｉで消化し、ｏｃｓ−暗号配列を含むフラグメントを１
％アガロースゲルから分離し、ｐＢ Ｒ３２２の大きい
ＢａｍＨＩ −ＰｖｕＩＩ ７ラグメントに結合させる
；得られたプラスミド、ｐＡＧＶ８２８（２０μｇ）
をＢａｍＨＩで消化し、第１８図に示した様にエキソヌ
クレアーゼＢａ１３１で処理し、次いでＨｉｎｄｌｌｌ
で消化し、末端を充填し、自己結合させる。Ｂａ１３１
除去体のサイズは６％ポリアクリルアミドゲル中で見積
る。いくつかの候補のヌクレオチド配列を決定し、５°
−非翻訳リーダー配列の残り７ｂｐだけを持った候補を
選択して以下の操作に付す（ｐＯｃｓ△）。ｏｃｓ配列
をＢａｍＨＩサイトで囲むために、Ｃ１ａｌ −Ｒｓａ
Ｉフラグメントを充填し、ｐＬＣ２３６（Ｒｅｗ＋ａｕ
ｔら、Ｇｅｎｅ １５（１９８１）、８１ ９３）の
Ｂａ１ｌサイトにサブクローンする。得られたプラスミ
ドｐＡＧＶ４０をＢａｍＨｌで消化し、ｏｃｓ配列を持
ったフラグメントをプレバラティ１１％アガロースゲル
から電気溶出により分離し、予めＢａｍＨＩで消化しＢ
ＡＰ（細菌性アルカリホスファターゼ）で処理したｐＬ
ＧＶ２３８１に結合させる。ｏｃｓ配列のｐＬＧＶ２３
８１への挿入により、両方の配向のものが得られる（ｐ
Ｎｏ−１およびｐＮｏ−２）。
ミドベクターをＢａｍＨＩで消化し、ＢａｎＨＩフラグ
メントに含まれているＯＣＳの暗号配列をこのサイトに
挿入する。このＯＣＳ暗号配列も、インビトロで処理し
、第１９図に示した様に、ＢａａＨ１制限エンドヌクレ
アーゼサイトで囲まれる様にする。オクトビンＴｉプラ
スミドＢ６Ｓ３のＢａａ＋ＨＩフラグメント１７ａ １
０μｓ （Ｄｅ Ｖｏｓら、Ｐｌａｓｇ＋ｉｄ ６（１
９８１）、２４９−２５３）をＢａｍＨＩおよびＳｍａ
Ｉで消化し、ｏｃｓ−暗号配列を含むフラグメントを１
％アガロースゲルから分離し、ｐＢ Ｒ３２２の大きい
ＢａｍＨＩ −ＰｖｕＩＩ ７ラグメントに結合させる
；得られたプラスミド、ｐＡＧＶ８２８（２０μｇ）
をＢａｍＨＩで消化し、第１８図に示した様にエキソヌ
クレアーゼＢａ１３１で処理し、次いでＨｉｎｄｌｌｌ
で消化し、末端を充填し、自己結合させる。Ｂａ１３１
除去体のサイズは６％ポリアクリルアミドゲル中で見積
る。いくつかの候補のヌクレオチド配列を決定し、５°
−非翻訳リーダー配列の残り７ｂｐだけを持った候補を
選択して以下の操作に付す（ｐＯｃｓ△）。ｏｃｓ配列
をＢａｍＨＩサイトで囲むために、Ｃ１ａｌ −Ｒｓａ
Ｉフラグメントを充填し、ｐＬＣ２３６（Ｒｅｗ＋ａｕ
ｔら、Ｇｅｎｅ １５（１９８１）、８１ ９３）の
Ｂａ１ｌサイトにサブクローンする。得られたプラスミ
ドｐＡＧＶ４０をＢａｍＨｌで消化し、ｏｃｓ配列を持
ったフラグメントをプレバラティ１１％アガロースゲル
から電気溶出により分離し、予めＢａｍＨＩで消化しＢ
ＡＰ（細菌性アルカリホスファターゼ）で処理したｐＬ
ＧＶ２３８１に結合させる。ｏｃｓ配列のｐＬＧＶ２３
８１への挿入により、両方の配向のものが得られる（ｐ
Ｎｏ−１およびｐＮｏ−２）。
ｎｏｓ ： ｏｃｓ融合の正確な接合点を示すヌクレオ
チド配列を第２０図に示す。
チド配列を第２０図に示す。
更に、処理したｎｏｓプロモーターを含有しているプラ
スミドベクターは、酵素ジヒドロフオレートレダクター
ゼを暗号化しているプラスミドＲ６７からのＤＮＡを挿
入するのに使用される。ジヒドロフオレートレダクター
ゼ遺伝子を含んでいる暗号配列は、ＢａｍＨＩに含まれ
ており （０’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７８（１９８１
）、１５２７−１５３１）、従って既述した様に、プロ
モーター領域に隣接するＢａｍＨＩサイトを含んでいる
ｎｏｓプロモーターベクターに容易に挿入される。この
遺伝子は、発現されると抗生物質メトトレキセートに対
する耐性を付与するので、選択可能なマーカー遺伝子の
１つの例である（第２．３．４．５および７図参照）。
スミドベクターは、酵素ジヒドロフオレートレダクター
ゼを暗号化しているプラスミドＲ６７からのＤＮＡを挿
入するのに使用される。ジヒドロフオレートレダクター
ゼ遺伝子を含んでいる暗号配列は、ＢａｍＨＩに含まれ
ており （０’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７８（１９８１
）、１５２７−１５３１）、従って既述した様に、プロ
モーター領域に隣接するＢａｍＨＩサイトを含んでいる
ｎｏｓプロモーターベクターに容易に挿入される。この
遺伝子は、発現されると抗生物質メトトレキセートに対
する耐性を付与するので、選択可能なマーカー遺伝子の
１つの例である（第２．３．４．５および７図参照）。
この中間クローニングベクターが野生型ツバリンアクセ
プターＴｉプラスミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍに授動されると、単一乗換えが起り、ハイブ
リッドＴｉプラスミドベクターが得られる。このベクタ
ー組成物を、植物の感染に使用する。得られた腫瘍組轍
は、０．５μｇ／ ＊Ｑのメトトレキセートの存在下で
継続して生長し得ることがわかった。
プターＴｉプラスミドを含んでいるＡ ｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍに授動されると、単一乗換えが起り、ハイブ
リッドＴｉプラスミドベクターが得られる。このベクタ
ー組成物を、植物の感染に使用する。得られた腫瘍組轍
は、０．５μｇ／ ＊Ｑのメトトレキセートの存在下で
継続して生長し得ることがわかった。
ＯＣＳおよび上記のｎｏｓプロモーターの後のジヒドロ
フオレートレダクターゼ暗号領域を含んでいる中間クロ
ーニングベクターを組み立て、Ａｇｒｏ−ｂａｃｔｅｒ
ｉｕａ＋のＴｉプラスミドと相互組込みした後、形質転
換−物細胞に転移、発現させることにより、本発明方法
によって外来性遺伝子を植物細胞に転移し、発現させる
ことができるということが証明される。
フオレートレダクターゼ暗号領域を含んでいる中間クロ
ーニングベクターを組み立て、Ａｇｒｏ−ｂａｃｔｅｒ
ｉｕａ＋のＴｉプラスミドと相互組込みした後、形質転
換−物細胞に転移、発現させることにより、本発明方法
によって外来性遺伝子を植物細胞に転移し、発現させる
ことができるということが証明される。
実施例５ 染色体中に所望の挿入遺伝子を含む植物細胞
および植物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれかを使って、
非腫瘍性アクセプターＴｉプラスミド誘導体（例えばｐ
ＧＶ３８５０）で形質転換された植物細胞および全植物
を得た。
および植物の分離 本発明者らは、以下の３つの方法のいづれかを使って、
非腫瘍性アクセプターＴｉプラスミド誘導体（例えばｐ
ＧＶ３８５０）で形質転換された植物細胞および全植物
を得た。
（１）インビボでの全植物の接種、次いで新芽の再生が
可能な培地上、インビトロでの培養、（２）損傷部位で
直接新芽の生成を促す他のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ
株の存在下、インビボにおける全植物の相互感染、 （３）インビトロでの単一植物細胞プロトブラストの共
生培養。
可能な培地上、インビトロでの培養、（２）損傷部位で
直接新芽の生成を促す他のＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ
株の存在下、インビボにおける全植物の相互感染、 （３）インビトロでの単一植物細胞プロトブラストの共
生培養。
これらの方法について以下に詳述する。
最初の方法は、クラウンガル組織の生産をもたらす全植
物組織の野生型Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株による
感染体を得る為に通常使用される方法を改良したもので
ある。ｐＧＶ３８５０は腫瘍を形成しないＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ誘導体であるので、感染部位において腫
瘍の増殖はみられない。しかし感染した組織を取り除き
、組織培養で増殖させると、形質転換された組織を容易
に得ることができる。初期培養期間（単に組織の量を増
やすため）の後、損傷部位組織を新芽形成が可能な条件
下で増殖させる。
物組織の野生型Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株による
感染体を得る為に通常使用される方法を改良したもので
ある。ｐＧＶ３８５０は腫瘍を形成しないＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ誘導体であるので、感染部位において腫
瘍の増殖はみられない。しかし感染した組織を取り除き
、組織培養で増殖させると、形質転換された組織を容易
に得ることができる。初期培養期間（単に組織の量を増
やすため）の後、損傷部位組織を新芽形成が可能な条件
下で増殖させる。
非形質転換細胞およびｐＧＶ３８５０−形質転換細胞の
両者が新芽を発生する。形質転換新芽は、ツバリンの存
在をみる簡単な分析により容易に区別することができる
。
両者が新芽を発生する。形質転換新芽は、ツバリンの存
在をみる簡単な分析により容易に区別することができる
。
本発明者らは、次のプロトコールに従って、Ｎ１ｃｏｔ
ｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３８
の頭部を切断したタバコの苗木から、ｐＧＶ３８５０−
形質転換カルスおよび新芽を得たく全ての操作はラミナ
ーフローフード中、無菌条件下で行なった）。
ｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３８
の頭部を切断したタバコの苗木から、ｐＧＶ３８５０−
形質転換カルスおよび新芽を得たく全ての操作はラミナ
ーフローフード中、無菌条件下で行なった）。
（１）小さなびん（直径１０ｃｍ、高さＬｏａｍ）の中
で、０．８％の寒天を含む固形のＭｕｒａｓｈｉｇｅ
＆Ｓ ｋｏｏｇ（Ｍ Ｓ ）培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
およびＳ ｋｏｏｇ。
で、０．８％の寒天を含む固形のＭｕｒａｓｈｉｇｅ
＆Ｓ ｋｏｏｇ（Ｍ Ｓ ）培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
およびＳ ｋｏｏｇ。
Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｐｌａｎｔ、 １５（１９６２
）、 ４７３ ４９７）で生育させた６周令のタバコ
の苗木を使用する。
）、 ４７３ ４９７）で生育させた６周令のタバコ
の苗木を使用する。
（２）外科用メスで最も若い頭頂の葉を切り取って捨て
る。
る。
（３）選択的条件（例えばＴｉプラスミドｐＧｖ３８５
０を含んでいるリファンピシン耐性、アンピシリン耐性
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の場合は、１００μｇ／
ｚＱのリファンピシンと１００μｓ／ｚＱのカルベニシ
リンを含んでいるＹＥＢ培地を使用する；ＹＥＢ培地＝
５ ｇ／ Ｑ Ｂ ａｃｔｏビーフェキス、Ｉｇ／Ｑ
Ｂａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／ｆ２ペプトン、５ｇ／
Ｑシュクロース、２ ×１０−’ Ｍ ＭｇＳ Ｏａ
。
０を含んでいるリファンピシン耐性、アンピシリン耐性
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の場合は、１００μｇ／
ｚＱのリファンピシンと１００μｓ／ｚＱのカルベニシ
リンを含んでいるＹＥＢ培地を使用する；ＹＥＢ培地＝
５ ｇ／ Ｑ Ｂ ａｃｔｏビーフェキス、Ｉｇ／Ｑ
Ｂａｃｔｏ酵母エキス、５ｇ／ｆ２ペプトン、５ｇ／
Ｑシュクロース、２ ×１０−’ Ｍ ＭｇＳ Ｏａ
。
ｐＨ７，２，１５ｇ＃！寒天）で増殖させた新鮮な平板
培養からのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋を、スパーチ
ルまたはつまようじで損傷表面に接種する。各ｐＧＶ３
８５０組み立て物を、少なくとも８本の苗木に接種する
。
培養からのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋を、スパーチ
ルまたはつまようじで損傷表面に接種する。各ｐＧＶ３
８５０組み立て物を、少なくとも８本の苗木に接種する
。
（４）２週間インキュベートする。接種部位にほとんど
あるいは全く反応が表われないはずであるが、時々非常
に小さいカルス（ｃａｌｌｉ）が観察される。
あるいは全く反応が表われないはずであるが、時々非常
に小さいカルス（ｃａｌｌｉ）が観察される。
（５）損傷表面から厚さ１ＩＩＩＩ１１以下の薄い切片
を切り取る。損傷表面を、オーキシンおよびサイトキニ
ン（１＋ｇ／ＣＮＡＡ、０．２ｓ＋ｇ／ＱＢＡＰ）およ
び１％シュクロースを添加したＬ １ｎｓＩＩｌａｉｅ
ｒ ＆Ｓ ｋｏｏｇ（ＬＳ）寒天培地（Ｌ ｉｎｓｍａ
ｉｅｒ ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ、 Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、
Ｐｌａｎｔ、１８（１９６５）、１００ １２７）を含
む平板上で培養する。
を切り取る。損傷表面を、オーキシンおよびサイトキニ
ン（１＋ｇ／ＣＮＡＡ、０．２ｓ＋ｇ／ＱＢＡＰ）およ
び１％シュクロースを添加したＬ １ｎｓＩＩｌａｉｅ
ｒ ＆Ｓ ｋｏｏｇ（ＬＳ）寒天培地（Ｌ ｉｎｓｍａ
ｉｅｒ ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ、 Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、
Ｐｌａｎｔ、１８（１９６５）、１００ １２７）を含
む平板上で培養する。
（６）約６週間後、カルスはその一部をとってツバリン
の存在を試験するのに十分なだけの大きさになる（少な
くとも直径が約５ｍｍになる）。全ての損傷カルスがツ
バリンを生産する訳ではない。４本の植物の内約１本が
ツバリン陽性損傷カルスをつ（る。
の存在を試験するのに十分なだけの大きさになる（少な
くとも直径が約５ｍｍになる）。全ての損傷カルスがツ
バリンを生産する訳ではない。４本の植物の内約１本が
ツバリン陽性損傷カルスをつ（る。
（７）ツバリン陽性カルスを再生培地を含む寒天平板に
移す二上記のＬＳ培地＋１％シュクロースおよびｌ ｍ
ｇ／Ｑ Ｂ Ａ Ｐサイトキニン（８）約４〜６週間後
に良好なサイズの新芽（高さＩＣＩ）が出る。更に成長
させ、根を形成させるために、この新芽を、ホルモンを
含まないＬＳ培地＋１％シュクロースを含有している新
しい寒天平板に移す。
移す二上記のＬＳ培地＋１％シュクロースおよびｌ ｍ
ｇ／Ｑ Ｂ Ａ Ｐサイトキニン（８）約４〜６週間後
に良好なサイズの新芽（高さＩＣＩ）が出る。更に成長
させ、根を形成させるために、この新芽を、ホルモンを
含まないＬＳ培地＋１％シュクロースを含有している新
しい寒天平板に移す。
（９）ツバリンの存在を試験するのに、その一部（１〜
２枚の小さな葉）を切り取れる様に、この新芽を１〜２
週間成長させる。
２枚の小さな葉）を切り取れる様に、この新芽を１〜２
週間成長させる。
（１０）ツバリン陽性の新芽を、（１）と同じＭＳ培地
を入れたやや大きい容器（上記と同じ１０ｃ＋ａのびん
）に移し、更に成長させる。
を入れたやや大きい容器（上記と同じ１０ｃ＋ａのびん
）に移し、更に成長させる。
注）感染させた組織のための全ての植物培養培地には、
ｐＧＶ３８５０含有Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対
する選択的毒物として、抗生物質セフォタ牛シム（ｃｅ
ｆｏｔａｘｉｍｅ、 Ｃ１ａｆｏｒａｎ” 、ヘキスト
）５００μｇ／ＩＩＱが含まれている。この薬物は、全
てのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（カルベニシリン耐
性のものを含む）の生長をよく阻止する。
ｐＧＶ３８５０含有Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対
する選択的毒物として、抗生物質セフォタ牛シム（ｃｅ
ｆｏｔａｘｉｍｅ、 Ｃ１ａｆｏｒａｎ” 、ヘキスト
）５００μｇ／ＩＩＱが含まれている。この薬物は、全
てのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（カルベニシリン耐
性のものを含む）の生長をよく阻止する。
本発明者らの研究室で、形質転換された新芽を出す組織
を得る別の方法が開発された。この方法は、Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍのある種のミューラントＴｉプラスミ
ド株が、新芽を出すクラウンガル腫瘍を生成させるとい
うことを観察したことに基いて開発された。この様な新
芽−誘起（ｓｈｉ）に関する突然変異は、Ａ、 ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ（転移
ＤＮＡセグメント）の特定の領域に位置している（ Ｌ
ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、１４
７−１５２； Ｊｏｏｓら、 Ｃｅ１ｌ ３２（１
９８３）、１０５７−１０６７）。誘起された新芽は完
全に正常な非形質転換細胞で構成されていることが多い
。従って本発明者らは、２つの異なったＡ ｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉａ、即ち１つはオクトピンＴｉプラスミド放
出（ｓｈｏｏｔｅｒ）ミュータントを持ったもの、もう
１つはｐＧＶ３８５０を持ったもの、の混合物で植物を
接種した。この様にすることは、オクトピン放出ミニ−
チージョンが、ｐＧＶ３８５０で形質転換された根を誘
起することが出来るよい機会を与える。Ｔｉプラスミド
ｐＧＶ３８５０およびオクトピン新芽誘起Ｔｉプラスミ
ドを５：１の割合で含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍを植物に接種した。こうすることによりｐＧＶ３８
５０−形質転換新芽を得た。この新芽は、ツバリンの存
在について分析することにより、容易に選別することが
できる。この方法は、精功な組織培養法を必要としない
。ツバリン陽性新芽を、更に成長させるために、長調節
ホルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含んだ培地に移す。
を得る別の方法が開発された。この方法は、Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍのある種のミューラントＴｉプラスミ
ド株が、新芽を出すクラウンガル腫瘍を生成させるとい
うことを観察したことに基いて開発された。この様な新
芽−誘起（ｓｈｉ）に関する突然変異は、Ａ、 ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ（転移
ＤＮＡセグメント）の特定の領域に位置している（ Ｌ
ｅｅｍａｎｓら、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、１４
７−１５２； Ｊｏｏｓら、 Ｃｅ１ｌ ３２（１
９８３）、１０５７−１０６７）。誘起された新芽は完
全に正常な非形質転換細胞で構成されていることが多い
。従って本発明者らは、２つの異なったＡ ｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉａ、即ち１つはオクトピンＴｉプラスミド放
出（ｓｈｏｏｔｅｒ）ミュータントを持ったもの、もう
１つはｐＧＶ３８５０を持ったもの、の混合物で植物を
接種した。この様にすることは、オクトピン放出ミニ−
チージョンが、ｐＧＶ３８５０で形質転換された根を誘
起することが出来るよい機会を与える。Ｔｉプラスミド
ｐＧＶ３８５０およびオクトピン新芽誘起Ｔｉプラスミ
ドを５：１の割合で含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍを植物に接種した。こうすることによりｐＧＶ３８
５０−形質転換新芽を得た。この新芽は、ツバリンの存
在について分析することにより、容易に選別することが
できる。この方法は、精功な組織培養法を必要としない
。ツバリン陽性新芽を、更に成長させるために、長調節
ホルモンと共に単純な塩類と蔗糖を含んだ培地に移す。
新芽が十分な大きさに達した後、容易に繁殖の為の土壌
に移すことができる。
に移すことができる。
この共感染法は、簡単に組織培養しにくい種類の植物を
形質転換するのに特に有用である。従って、あらゆる範
囲の農学的にあるいは経済的に重要な植物、例えば豆科
植物、薬用植物および装飾植物をＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒ ｉｕｍで処置することができよう。
形質転換するのに特に有用である。従って、あらゆる範
囲の農学的にあるいは経済的に重要な植物、例えば豆科
植物、薬用植物および装飾植物をＡ ｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒ ｉｕｍで処置することができよう。
第３の方法は、Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ
プロトプラストの単離およびホルモン−非依存性のＴ−
ＤＮＡ−形質転換細胞クローンの選択を、そのプロトプ
ラスト−由来細胞と腫瘍性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
株との共培養後に実施し得るものである。他の優勢な選
択マーカー、例えば高等植物細胞で発現される様に組み
立てられた抗生物質耐性遺伝子を使用すれば（実施例３
参照）、形質転換細胞を選択するのに類似の方法を使用
することができる。しかしこの場合は、それぞれのケー
スについて選択の最適条件をみつける必要がある（選択
剤の濃度、形質転換と選択の間の時間、選択培地中のプ
ロトプラスト−由来細胞または細胞コロニーの濃度など
）。
プロトプラストの単離およびホルモン−非依存性のＴ−
ＤＮＡ−形質転換細胞クローンの選択を、そのプロトプ
ラスト−由来細胞と腫瘍性Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
株との共培養後に実施し得るものである。他の優勢な選
択マーカー、例えば高等植物細胞で発現される様に組み
立てられた抗生物質耐性遺伝子を使用すれば（実施例３
参照）、形質転換細胞を選択するのに類似の方法を使用
することができる。しかしこの場合は、それぞれのケー
スについて選択の最適条件をみつける必要がある（選択
剤の濃度、形質転換と選択の間の時間、選択培地中のプ
ロトプラスト−由来細胞または細胞コロニーの濃度など
）。
形質転換細胞の選択ができない場合、例えばｐｃＶ３８
５０またはｐＧ Ｖ ２２１７ （Ｌ ｅｅｍａｎｓら
、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、１４７−１５２）の様
な非毒性のＴ−ＤＮＡ ミュータントを用いたために選
択が不可能な場合は、遺伝学的形質転換の後に細胞をオ
ーキシン−およびサイトキニン−含有培地（例えば２
ｍｇ＃！のＮＡＡ（α−ナフタレン酢酸）および０．３
１１１ｇＩＱのカイネチンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅお
よびＳ ｋｏｏｇ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳ
ｋｏｏｇ、 Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ １５（
１９６２）、４７３ ４９７））で培養し、形質転換コ
ロニーをそのオパイン（ｏｐｉｎｅ）含有量で同定する
ことができる。この様にして、アグロビン（ａｇｒｏｐ
ｉｎｅ）およびマノピン（ｍａｎｎ。
５０またはｐＧ Ｖ ２２１７ （Ｌ ｅｅｍａｎｓら
、ＥＭＢＯＪ、１（１９８２）、１４７−１５２）の様
な非毒性のＴ−ＤＮＡ ミュータントを用いたために選
択が不可能な場合は、遺伝学的形質転換の後に細胞をオ
ーキシン−およびサイトキニン−含有培地（例えば２
ｍｇ＃！のＮＡＡ（α−ナフタレン酢酸）および０．３
１１１ｇＩＱのカイネチンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅお
よびＳ ｋｏｏｇ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳ
ｋｏｏｇ、 Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ １５（
１９６２）、４７３ ４９７））で培養し、形質転換コ
ロニーをそのオパイン（ｏｐｉｎｅ）含有量で同定する
ことができる。この様にして、アグロビン（ａｇｒｏｐ
ｉｎｅ）およびマノピン（ｍａｎｎ。
ｐｉｎｅ）合成の電気泳動分析（方法についてはＬ ｅ
ｅｓａｎｓら、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、
Ｇｅｎｅｔ、 １（１９８１）。
ｅｓａｎｓら、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ａｐｐｌ、
Ｇｅｎｅｔ、 １（１９８１）。
１４９−１６４参照）の後、約６６０コロニーが、ｐＧ
Ｖ２２１７で感染後に得られ、ＴＲ−暗号化オパイン・
マノピン（Ｎ”−（１−マニチル）−グルタミン）を合
成する Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｓ
Ｒ１セルラインであることがわかった。このセルライン
のカルス切片を再生培地（唯一の植物成長調節剤として
ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）（Ｉｍｇ＃）を含
むＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ’ Ｓ ｋｏｏｇ培地）
上で培養すると、数多くの新芽が形成した。分析した２
０の新芽の全てが、依然としてマノピンを合成すること
ができた。ホルモンを含まないＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎ
ｄ Ｓｋｏｏｇ培地に移した後、これらの新芽は、依然
としてマノピンを含有し、形態学的に正常なタバコ植物
に成長した。
Ｖ２２１７で感染後に得られ、ＴＲ−暗号化オパイン・
マノピン（Ｎ”−（１−マニチル）−グルタミン）を合
成する Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｓ
Ｒ１セルラインであることがわかった。このセルライン
のカルス切片を再生培地（唯一の植物成長調節剤として
ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）（Ｉｍｇ＃）を含
むＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ’ Ｓ ｋｏｏｇ培地）
上で培養すると、数多くの新芽が形成した。分析した２
０の新芽の全てが、依然としてマノピンを合成すること
ができた。ホルモンを含まないＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎ
ｄ Ｓｋｏｏｇ培地に移した後、これらの新芽は、依然
としてマノピンを含有し、形態学的に正常なタバコ植物
に成長した。
Ｎ、 ｔａｂａｃｕｍについて次に記載するプロトプラ
ストの分離および形質転換法は、Ｎ、 ｐｌｕｍｂａｇ
ｉｎｉｆｏｌｉａにも用いることができる。
ストの分離および形質転換法は、Ｎ、 ｐｌｕｍｂａｇ
ｉｎｉｆｏｌｉａにも用いることができる。
２、実験手法
２．１．新芽培養条件
培養室内の無菌条件下（１日１６時間、１５００ルツク
スの白色蛍光（“ＡＣＥＣＬＦ ５８Ｗ／２４３００
”Ｋ Ｅｃｏｎｏｍｙ”）、２４℃、相対湿度７０％）
、２５０ＩＩＩＱのガラスびんに入れたホルモン不含の
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ培地（Ｍｕ
ｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ
、 Ｐｌａｎｔ １５（１９６２）。
スの白色蛍光（“ＡＣＥＣＬＦ ５８Ｗ／２４３００
”Ｋ Ｅｃｏｎｏｍｙ”）、２４℃、相対湿度７０％）
、２５０ＩＩＩＱのガラスびんに入れたホルモン不含の
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓ ｋｏｏｇ培地（Ｍｕ
ｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ
、 Ｐｌａｎｔ １５（１９６２）。
４７３−４９７）上でＮ １ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂ
ａｃｕｍの新芽培養を維持する。５週令の新芽培養をプ
ロトプラストの分離に使用する。
ａｃｕｍの新芽培養を維持する。５週令の新芽培養をプ
ロトプラストの分離に使用する。
２．２．プロトプラストの分離
プロトプラストの分離および培養における全ての工程は
無菌操作で行なう。混合酵素法によりプロトプラストを
分離する。長さ２（！Ｉ１１以下の非常に若い葉を除く
、全ての葉をプロトプラストの分離に使用することがで
きる。鋭利な外科用のメスで、葉を幅約２−３鶴の細長
い小片に切断する。この葉材料２〜３ｇを、酵素混合物
５〇−中、暗所で、２４°Ｃにて１８時間静置培養する
。この酵素混合物ハ、ホルモン不含のに３培地中、０．
Ｓ％セルラーゼＯｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０および０．２
％マセロザイムＯｎｏｚｕｋａＲ−１０からなっている
（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐｆｌａ
ｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、 ７８（１９７６）、４５
３−４５５）。この混合物は、０．２２μｍ細孔膜を通
して濾過減菌し、顕著な活性の低下をきたすことなく、
−２０℃で少くとも６力月間貯蔵することができる。
無菌操作で行なう。混合酵素法によりプロトプラストを
分離する。長さ２（！Ｉ１１以下の非常に若い葉を除く
、全ての葉をプロトプラストの分離に使用することがで
きる。鋭利な外科用のメスで、葉を幅約２−３鶴の細長
い小片に切断する。この葉材料２〜３ｇを、酵素混合物
５〇−中、暗所で、２４°Ｃにて１８時間静置培養する
。この酵素混合物ハ、ホルモン不含のに３培地中、０．
Ｓ％セルラーゼＯｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０および０．２
％マセロザイムＯｎｏｚｕｋａＲ−１０からなっている
（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐｆｌａ
ｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、 ７８（１９７６）、４５
３−４５５）。この混合物は、０．２２μｍ細孔膜を通
して濾過減菌し、顕著な活性の低下をきたすことなく、
−２０℃で少くとも６力月間貯蔵することができる。
２．３．プロトプラスト培養
１８時間培養した後、プロトプラストを放出するために
混合物を穏やかに撹拌する。次いでこの混合物を５０μ
ｍのふるいを通して濾過し、濾液を１０−の遠心管に移
す。振動バケツローターに入れて６０〜８０ｇで６分間
遠心分離すると、プロトプラストが暗緑色の浮遊バンド
（帯）を形成する。プロトプラストの下層の液およびペ
レット状の残骸を、螺動ポンプに連結した毛細管を使っ
て取り除く。プロトプラストを１つの遠心管に集め、培
養培地で２回洗浄する。この培養培地は、ＮＡＡ（０，
１ｍｇ／Ｑ）およびカイネチン（０，２ｏ＋ｇ、Ｑ）を
成長調節剤として含有するに３培地である（Ｎａｇｙお
よびＭａｌｉｇａ、 Ｚ 、 Ｐ ｆｌａｎｚｅｎ
ｐｈｙｓｉｏｌ。
混合物を穏やかに撹拌する。次いでこの混合物を５０μ
ｍのふるいを通して濾過し、濾液を１０−の遠心管に移
す。振動バケツローターに入れて６０〜８０ｇで６分間
遠心分離すると、プロトプラストが暗緑色の浮遊バンド
（帯）を形成する。プロトプラストの下層の液およびペ
レット状の残骸を、螺動ポンプに連結した毛細管を使っ
て取り除く。プロトプラストを１つの遠心管に集め、培
養培地で２回洗浄する。この培養培地は、ＮＡＡ（０，
１ｍｇ／Ｑ）およびカイネチン（０，２ｏ＋ｇ、Ｑ）を
成長調節剤として含有するに３培地である（Ｎａｇｙお
よびＭａｌｉｇａ、 Ｚ 、 Ｐ ｆｌａｎｚｅｎ
ｐｈｙｓｉｏｌ。
７８ （１９７６）、４５３−４５５）。この培地はｐ
Ｈ５，６に調節し、０．２２μｍの濾過膜を通して減菌
する。２回目の洗浄の後、Ｔ ｈｏｍａ血球計算器（“
Ａｓ５ｉｓｔａｎｔ”、西ドイツから入手）を用いてプ
ロトプラストを計測し、最終密度１０５プロトプラスト
／ｍ（ｌとなる様に培養培地に懸濁する。直径９ｃｍの
組織培養用良質ペトリ皿当たり１０ｍ（の容量でプロト
プラストを培養する。このペトリ皿をＰａｒａｆｉｌｍ
Ｒでシールし、２４℃で、暗所次いでかすかな光（５０
０−１ｃ）００ルツクス）を当てて２４時間培養する。
Ｈ５，６に調節し、０．２２μｍの濾過膜を通して減菌
する。２回目の洗浄の後、Ｔ ｈｏｍａ血球計算器（“
Ａｓ５ｉｓｔａｎｔ”、西ドイツから入手）を用いてプ
ロトプラストを計測し、最終密度１０５プロトプラスト
／ｍ（ｌとなる様に培養培地に懸濁する。直径９ｃｍの
組織培養用良質ペトリ皿当たり１０ｍ（の容量でプロト
プラストを培養する。このペトリ皿をＰａｒａｆｉｌｍ
Ｒでシールし、２４℃で、暗所次いでかすかな光（５０
０−１ｃ）００ルツクス）を当てて２４時間培養する。
２．４．共生培養による形質転換
分離５日後にプロトプラスト培養株を感染させる。Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎを液体ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅ
ｒ。
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎを液体ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅ
ｒ。
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ。
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２）、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ。
Ｎ ｅｗ Ｙ ｏｒｋ）中で１８時間培養後、２Ｘ１
０”細胞／ＩＩＩＱの密度となる様にに３培養培地に再
懸濁する。この懸濁液５０μｇを植物プロトプラスト培
養株に加え、Ｐａｒａｆ ｉｌｍ”でシールした後、こ
の培養株を２．３．と同じ条件下で培養する。４８時間
後に培養株を１０ｍｆ２の遠心管に移し、振動バケツロ
ーターに入れ、６０〜８０ｇで６分間遠心分離する。浮
遊バンドおよびペレットを集め、抗生物質（カルベニシ
リン１０００μｇ／ｍＱまたはセフォタ牛シム５００μ
ｇ／ｌａｌ ）を補足したに３培地（ＮａｇｙおよびＭ
ａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎ ｐｈｙｓ
ｉｏｌ。
０”細胞／ＩＩＩＱの密度となる様にに３培養培地に再
懸濁する。この懸濁液５０μｇを植物プロトプラスト培
養株に加え、Ｐａｒａｆ ｉｌｍ”でシールした後、こ
の培養株を２．３．と同じ条件下で培養する。４８時間
後に培養株を１０ｍｆ２の遠心管に移し、振動バケツロ
ーターに入れ、６０〜８０ｇで６分間遠心分離する。浮
遊バンドおよびペレットを集め、抗生物質（カルベニシ
リン１０００μｇ／ｍＱまたはセフォタ牛シム５００μ
ｇ／ｌａｌ ）を補足したに３培地（ＮａｇｙおよびＭ
ａｌｉｇａ、 Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎ ｐｈｙｓ
ｉｏｌ。
７８（１９７６）、４５３−４５５）１０ｍｉ２に再懸
濁する。
濁する。
培養２週間後、プロトプラスト−由来マイクロカルスを
遠心分離し、前記と同濃度の成長調節剤および抗生物質
を含むがシュクロースに関しては０．４Ｍの代りに０．
３Ｍ含むに３培地（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、
Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、 ７８（
１９７６）、４５３−４５５）に再懸濁する。この培地
の細胞密度は約２５Ｘ１０３マイクロカルス／１ａ（ｌ
に調節する。同じ条件下で更に２週間培養した後、カル
スを、前記と同濃度の抗生物質を含むが、より低濃度の
シュクロース（０，２Ｍ）と成長調節剤（ＮＡＡＯ，Ｏ
１ｍｇ／１２ 、カイネチン０．０２ｍｇ＃りを含むに
３培地に移す。更に２〜３週間培養後、形質転換体と推
定されるものは、その淡緑色の密な外観、およびより良
好な成長度から認識することができる。これらのコロニ
ーを、より低濃度の抗生物質（カルベニシリン５００μ
ｓ／ｄまたはセフオタキシム２５０μｇ／ｍＱ ）を含
むがホルモン不含の０６％寒天固形培地（Ｌ ｉｎｓ＋
５ａｉｅｒおよびＳ ｋｏｏｇ。
遠心分離し、前記と同濃度の成長調節剤および抗生物質
を含むがシュクロースに関しては０．４Ｍの代りに０．
３Ｍ含むに３培地（ＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、
Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、 ７８（
１９７６）、４５３−４５５）に再懸濁する。この培地
の細胞密度は約２５Ｘ１０３マイクロカルス／１ａ（ｌ
に調節する。同じ条件下で更に２週間培養した後、カル
スを、前記と同濃度の抗生物質を含むが、より低濃度の
シュクロース（０，２Ｍ）と成長調節剤（ＮＡＡＯ，Ｏ
１ｍｇ／１２ 、カイネチン０．０２ｍｇ＃りを含むに
３培地に移す。更に２〜３週間培養後、形質転換体と推
定されるものは、その淡緑色の密な外観、およびより良
好な成長度から認識することができる。これらのコロニ
ーを、より低濃度の抗生物質（カルベニシリン５００μ
ｓ／ｄまたはセフオタキシム２５０μｇ／ｍＱ ）を含
むがホルモン不含の０６％寒天固形培地（Ｌ ｉｎｓ＋
５ａｉｅｒおよびＳ ｋｏｏｇ。
Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ、１８（１９６５）、１０
０−１２７）に移す。形質転換体と推定されるものが直
径約３−４ ｍｌ１１に達した時、ホルモン不含の培地
で生育しているそれらにオバイン試験を施すことができ
る。各コロニーの半分を、オクトビンおよびツバリン（
Ａ ｅｒｔｓら、 Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ、 Ｌｅ
ｔｔ。
０−１２７）に移す。形質転換体と推定されるものが直
径約３−４ ｍｌ１１に達した時、ホルモン不含の培地
で生育しているそれらにオバイン試験を施すことができ
る。各コロニーの半分を、オクトビンおよびツバリン（
Ａ ｅｒｔｓら、 Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ、 Ｌｅ
ｔｔ。
１７（１９７９）、４３−５０）またはアグロピンおよ
びマノピン（Ｌ ｅｅｍａｎｓら、 ＪｏＭｏｌ、
ＡＰＰＩ。
びマノピン（Ｌ ｅｅｍａｎｓら、 ＪｏＭｏｌ、
ＡＰＰＩ。
Ｇｅｎｅｔ、１（１９８１）、１４９ １６４）の検出
に使用する。この試験により、ホルモン不含の培地で選
択されたコロニーの形質転換された性質を確認すること
ができる。その後、選択されたコロニーを抗生物質不含
の培地で培養することができる。
に使用する。この試験により、ホルモン不含の培地で選
択されたコロニーの形質転換された性質を確認すること
ができる。その後、選択されたコロニーを抗生物質不含
の培地で培養することができる。
２．５．ホルモン不含培地上の選択なしの共生培養
形質転換細胞の為の選択ができない（例えば無毒性Ｔ−
ＤＮＡ ミュータントを使ったため）場合、またはそれ
が必要でない場合（抗生物質耐性遺伝子の様な優勢な選
択し得るマーカーがＴ−ＤＮＡに存在している為）、プ
ロトプラスト−由来細胞の処理を簡略化することができ
る（ホルモン減少工程はもはや必要でない）。感染段階
まで、プロトプラストを既述した様に処理する。細菌を
加えて４８時間後にプロトプラスト−由来細胞を遠心分
離しく６分、６０６０−８Ｏ、非常に低密度で細胞の成
長を維持することができるＡＧ培地（Ｃａｂ。
ＤＮＡ ミュータントを使ったため）場合、またはそれ
が必要でない場合（抗生物質耐性遺伝子の様な優勢な選
択し得るマーカーがＴ−ＤＮＡに存在している為）、プ
ロトプラスト−由来細胞の処理を簡略化することができ
る（ホルモン減少工程はもはや必要でない）。感染段階
まで、プロトプラストを既述した様に処理する。細菌を
加えて４８時間後にプロトプラスト−由来細胞を遠心分
離しく６分、６０６０−８Ｏ、非常に低密度で細胞の成
長を維持することができるＡＧ培地（Ｃａｂ。
ｃｈｅ、Ｐｌａｎｔａ １４９（１９８０）、７−１８
）に再懸濁する。Ｆ ｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ計
数チェインバー（“Ａｓ５ｉｓｔａｎｔ”、西ドイツよ
り入手）を使って計測し、以下の操作に必要な密度にな
る様に再懸濁する。オパイン試験のためにコロニーを個
々に操作しなければならない場合は、低細胞密度（１＋
Ｑ当たり１００プロトプラスト−由来細胞および細胞コ
ロニー）で植えつけると、１力月の培養で大きい細胞コ
ロニーが得られる。形質転換細胞を薬物で選択できる場
合は、細胞を高密度（１０’−１０’／ｆｆ１Ｑ）で培
養し、各タイプの選択に最適な時期及び濃度で、その使
用する選択剤を培地に添加する。
）に再懸濁する。Ｆ ｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ計
数チェインバー（“Ａｓ５ｉｓｔａｎｔ”、西ドイツよ
り入手）を使って計測し、以下の操作に必要な密度にな
る様に再懸濁する。オパイン試験のためにコロニーを個
々に操作しなければならない場合は、低細胞密度（１＋
Ｑ当たり１００プロトプラスト−由来細胞および細胞コ
ロニー）で植えつけると、１力月の培養で大きい細胞コ
ロニーが得られる。形質転換細胞を薬物で選択できる場
合は、細胞を高密度（１０’−１０’／ｆｆ１Ｑ）で培
養し、各タイプの選択に最適な時期及び濃度で、その使
用する選択剤を培地に添加する。
２．６．カルス組織から全植物の再生
カルス組織から正常植物を容易に得ることができる（例
えばプロトプラスト形質転換から、または全植物接種か
ら（２，７参照）得られる）。カルス組織を、１ ｍｇ
／ｍ（！のＢＡＰを含んでいるＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎ
ｄ Ｓ ｋｏｏｇ培地で増殖させる：この培地は１〜２
力月後に新芽を形成させる。この新芽をホルモン不含の
培地に移し、根を形成させ、完全な植物をつ（らせるこ
とかできる。
えばプロトプラスト形質転換から、または全植物接種か
ら（２，７参照）得られる）。カルス組織を、１ ｍｇ
／ｍ（！のＢＡＰを含んでいるＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎ
ｄ Ｓ ｋｏｏｇ培地で増殖させる：この培地は１〜２
力月後に新芽を形成させる。この新芽をホルモン不含の
培地に移し、根を形成させ、完全な植物をつ（らせるこ
とかできる。
２．７．タバコ苗木への腫瘍の誘導
タバコの種子（例えば裁培品種Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３
８）の表面を７０％変性エタノール／Ｈ，Ｏで２分間、
次いで１０％の市販の標白剤と０．１％ドデシル硫酸ナ
ト、リウム（ＳＤＳ）で処理して滅菌し、更に滅菌水で
５回洗浄する。この滅菌した種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇ
ｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（０，７％寒天）培地の塩
類を含む大型試験管（幅２５ｍｍ、ポリカーボネート製
のキップ付）にまく。次いでこの試験管を培養室（１２
，０００ルツクス、１６時間照射／８時間非照射、７０
％相対湿度、２４℃）に入れて培養する。４〜６週間経
つと植物は使用できる状態になる。少な（ともその後１
カ月間は最適の状態を維持する。苗木は少なくとも高さ
３ｃ＋ａになり、４枚またはそれ以上の葉を持つはずで
ある。新しい外科用メスで植物の最も若い箱間を通して
横に頭部を切断する。植物の上の部分を試験管から取り
除き、火にかけたスパーチルで平板寒天培養から細菌を
損傷表面に塗抹する。野生型の場合は２週間後に、ある
種の変性ミュータント株の場合はもっと後に腫瘍が現れ
る。この方法は、タバコ（Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔ
ａｂａｃｕｍ）、Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｉｂ
ａｇｉｎｉｆｏｌｉａおよびびＰ ｅｔｕｎｉａ ｈ
ｙｂｒｉｄａを接種するのに使われる。
８）の表面を７０％変性エタノール／Ｈ，Ｏで２分間、
次いで１０％の市販の標白剤と０．１％ドデシル硫酸ナ
ト、リウム（ＳＤＳ）で処理して滅菌し、更に滅菌水で
５回洗浄する。この滅菌した種子を、Ｍｕｒａｓｈｉｇ
ｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（０，７％寒天）培地の塩
類を含む大型試験管（幅２５ｍｍ、ポリカーボネート製
のキップ付）にまく。次いでこの試験管を培養室（１２
，０００ルツクス、１６時間照射／８時間非照射、７０
％相対湿度、２４℃）に入れて培養する。４〜６週間経
つと植物は使用できる状態になる。少な（ともその後１
カ月間は最適の状態を維持する。苗木は少なくとも高さ
３ｃ＋ａになり、４枚またはそれ以上の葉を持つはずで
ある。新しい外科用メスで植物の最も若い箱間を通して
横に頭部を切断する。植物の上の部分を試験管から取り
除き、火にかけたスパーチルで平板寒天培養から細菌を
損傷表面に塗抹する。野生型の場合は２週間後に、ある
種の変性ミュータント株の場合はもっと後に腫瘍が現れ
る。この方法は、タバコ（Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｔ
ａｂａｃｕｍ）、Ｎ １ｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｉｂ
ａｇｉｎｉｆｏｌｉａおよびびＰ ｅｔｕｎｉａ ｈ
ｙｂｒｉｄａを接種するのに使われる。
以上述べた如（、本発明は、野生型ＴｉプラスミドのＴ
−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブリッドＴｉプラ
スミドを保持しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで
、初めて植物を形質転換することを可能ならしめたもの
である。Ｔｉプラスミドから植物細胞へのＤＮＡの転移
に及ぼすＴ〜領領域腫瘍機能の影響は知られていないの
で、それでも所望の遺伝子を含んでいる改良Ｔ−領領域
植物細胞への転移が起ることは驚くべきことである。こ
の転移ＤＮＡは植物細胞ゲノムに相互組込みされ、安定
に保持される。更に、選択した所望の遺伝子は、その遺
伝子が適当なプロモーター配列を含んでいるか、あるい
は含む様に組み立てられると発現することができる。所
望の遺伝子を含んでいる中間クローニングベクターと、
特別に設計されたアクセプターＴｉプラスミドとの間で
単一乗換えを行わせるという本発明の概念（アイディア
）は、植物細胞の形質転換の為のハイブリッドＴｉプラ
スミドベクターの組み立てを著しく簡単なものにするも
のである。この特別に設計されたアクセプターＴｉプラ
スミドは、所望の遺伝子（これは中間クローニングベク
ターの一部と同じであるかまたはこれに関連しているク
ローニング媒体中に挿入されている）が単一乗換えによ
って相互組込み体を形成することができる様に、通常の
クローニング媒体のＤＮＡセグメントを含んでいる。こ
のクローニング媒体の２つのセグメントが、組換えの為
に必要な相同領域を提供する。
−領域の腫瘍機能が欠落しているハイブリッドＴｉプラ
スミドを保持しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで
、初めて植物を形質転換することを可能ならしめたもの
である。Ｔｉプラスミドから植物細胞へのＤＮＡの転移
に及ぼすＴ〜領領域腫瘍機能の影響は知られていないの
で、それでも所望の遺伝子を含んでいる改良Ｔ−領領域
植物細胞への転移が起ることは驚くべきことである。こ
の転移ＤＮＡは植物細胞ゲノムに相互組込みされ、安定
に保持される。更に、選択した所望の遺伝子は、その遺
伝子が適当なプロモーター配列を含んでいるか、あるい
は含む様に組み立てられると発現することができる。所
望の遺伝子を含んでいる中間クローニングベクターと、
特別に設計されたアクセプターＴｉプラスミドとの間で
単一乗換えを行わせるという本発明の概念（アイディア
）は、植物細胞の形質転換の為のハイブリッドＴｉプラ
スミドベクターの組み立てを著しく簡単なものにするも
のである。この特別に設計されたアクセプターＴｉプラ
スミドは、所望の遺伝子（これは中間クローニングベク
ターの一部と同じであるかまたはこれに関連しているク
ローニング媒体中に挿入されている）が単一乗換えによ
って相互組込み体を形成することができる様に、通常の
クローニング媒体のＤＮＡセグメントを含んでいる。こ
のクローニング媒体の２つのセグメントが、組換えの為
に必要な相同領域を提供する。
本発明方法によって調製された微生物、中間クローニン
グベクター、アクセプターＴｉプラスミド、およびハイ
ブリッドプラスミドベクターは、１９８３年１２月２１
日、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＤＳＭ）（Ｇｏｅｔｔｉ
ｎｇｅｎ）に寄託され、確認された以下の培養株で例示
される＝（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｋ １２ＨＢ １０１中ノ中間ベクタープラスミドｐＡ
ｃｇＢ。
グベクター、アクセプターＴｉプラスミド、およびハイ
ブリッドプラスミドベクターは、１９８３年１２月２１
日、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＤＳＭ）（Ｇｏｅｔｔｉ
ｎｇｅｎ）に寄託され、確認された以下の培養株で例示
される＝（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｋ １２ＨＢ １０１中ノ中間ベクタープラスミドｐＡ
ｃｇＢ。
（２）カルベニシリン耐性アクセプターＴｉプラスミド
ｐＧＶ３８５０を保有しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃｌ
リファンピシン耐性株、 （３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２
株に５１４（ｔｈｒ ｌｅｕ ｔｈｉ ｌａｃ
ｈｓｄＲ）中の中間ベクタープラスミドｐＧＶ７ＱＱ
。
ｐＧＶ３８５０を保有しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃｌ
リファンピシン耐性株、 （３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２
株に５１４（ｔｈｒ ｌｅｕ ｔｈｉ ｌａｃ
ｈｓｄＲ）中の中間ベクタープラスミドｐＧＶ７ＱＱ
。
（４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株
に５１４（（３）と同じ）中の中間ベクタープラスミド
ｐｃ、ｖ７５０゜ （５）カルベニシリン耐性アクセプターＴｉプラスミド
ｐＧＶ２２６０を保有しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１リフ
ァンピシン耐性株、 （６）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ ｌ
２ ＨＢ １０１中の、ツバリンプロモーター支配
下のオクトピンシンターゼ暗号領域を保有している中間
ベクタープラスミドｐＮｏ−１、 （７）中間ベクターのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＠へ
の授動に使用された株；授動プラスミドｐＧ Ｊ ２８
およびＲ６４ｄｒｄｌｌ（Ｖａｎ Ｈａｕｔｅら、Ｅ
ＭＢＯＪ。
に５１４（（３）と同じ）中の中間ベクタープラスミド
ｐｃ、ｖ７５０゜ （５）カルベニシリン耐性アクセプターＴｉプラスミド
ｐＧＶ２２６０を保有しているＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１リフ
ァンピシン耐性株、 （６）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ ｌ
２ ＨＢ １０１中の、ツバリンプロモーター支配
下のオクトピンシンターゼ暗号領域を保有している中間
ベクタープラスミドｐＮｏ−１、 （７）中間ベクターのＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＠へ
の授動に使用された株；授動プラスミドｐＧ Ｊ ２８
およびＲ６４ｄｒｄｌｌ（Ｖａｎ Ｈａｕｔｅら、Ｅ
ＭＢＯＪ。
２（１９８３）、４１１−４１８）を保有しているＧＪ
２３．ＧＪ２３はＥ ５ｃｈｅｒｉｃ）ｒｉ−ａ ｃ
ｏｌｉ Ｋ １２、ＪＣ２９２６，ＡＢ１１５７のｒ
ｅｃＡ誘導体である（Ｈｏｖａｒｄ −Ｆ １ａｎｄｅ
ｒｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４９（１９６４）、
２３７−２４６）。
２３．ＧＪ２３はＥ ５ｃｈｅｒｉｃ）ｒｉ−ａ ｃ
ｏｌｉ Ｋ １２、ＪＣ２９２６，ＡＢ１１５７のｒ
ｅｃＡ誘導体である（Ｈｏｖａｒｄ −Ｆ １ａｎｄｅ
ｒｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４９（１９６４）、
２３７−２４６）。
これらの培養株の受理番号は、それぞれ２７９２（１）
、２７９８（２）、２７９６（３）、２７９７（４）、
２７９９（５）、２８３３（６）、および２７９３（７
）である。
、２７９８（２）、２７９６（３）、２７９７（４）、
２７９９（５）、２８３３（６）、および２７９３（７
）である。
本発明の態様を色々と記述したが、その基本的な構成を
変化させれば本発明に係る方法および組成物を利用する
その他の態様が得られることは言うまでもない。
変化させれば本発明に係る方法および組成物を利用する
その他の態様が得られることは言うまでもない。
第１図はアクセプターＴｉプラスミドの模式図、第２図
および第３図はアクセプターＴｉプラスミドに挿入され
る中間クローニングベクターの模式図、第４図はハイブ
リッドＴｉプラスミドベクターの調製法を示す模式図、
第５図は中間クローニングベクターの遺伝子転移過程の
概略を示す模式図、第６図はＡタイプのアクセプターＴ
ｉプラスミドの組み立てを示す模式図、第７図は中間ク
ローニングベクターの組み立てを示す模式図、第８図は
ＢタイプのアクセプターＴｉプラスミドの組み立てを示
す模式図、第９図はＢタイプのアクセプターＴｉプラス
ミドに挿入される中間クローニングベクターの模式図、
第１Ｏ図はノーイブリッドＴｉプラスミドベクターの組
み立てを示す模式図、第１１図は５ 、２ ｋｂ Ｈ１
ｎｄｌｌｌフラグメントＡｃｇＢのｐＢＲ３２２への挿
入を示す模式図、第１２図はツバリンＴｉプラスミドｐ
ＧＶ３８３９のＴ−領域を示す模式図、第１３図はアク
セプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０の組み立てを示
す模式図、第１４図は中間クローニングベクターｐｃｖ
’７゜Ｏの組み立てを示す模式図、第１５図は中間クロ
ーニングベクターｐＧＶ７５０の構造を示す模式図、第
１６図は中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立てを示す模
式図、第１７図はアクセプタープラスミドｐＧＶ２２６
０の組み立てを示す模式図、第１８図はプラスミドｐＬ
ＧＶ２３８１の組み立てを示す模式図、第１９図はプラ
スミドｐＡＧＶ１０の組み立て、およびその、プラスミ
ドｐＬＧＶ２３８１への挿入を示す模式図、第２０図は
オクトピンシンターゼ遺伝子暗合化領域と融合する前後
のツバリンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域の周囲
のヌクレオチド配列を示す模式図である。
および第３図はアクセプターＴｉプラスミドに挿入され
る中間クローニングベクターの模式図、第４図はハイブ
リッドＴｉプラスミドベクターの調製法を示す模式図、
第５図は中間クローニングベクターの遺伝子転移過程の
概略を示す模式図、第６図はＡタイプのアクセプターＴ
ｉプラスミドの組み立てを示す模式図、第７図は中間ク
ローニングベクターの組み立てを示す模式図、第８図は
ＢタイプのアクセプターＴｉプラスミドの組み立てを示
す模式図、第９図はＢタイプのアクセプターＴｉプラス
ミドに挿入される中間クローニングベクターの模式図、
第１Ｏ図はノーイブリッドＴｉプラスミドベクターの組
み立てを示す模式図、第１１図は５ 、２ ｋｂ Ｈ１
ｎｄｌｌｌフラグメントＡｃｇＢのｐＢＲ３２２への挿
入を示す模式図、第１２図はツバリンＴｉプラスミドｐ
ＧＶ３８３９のＴ−領域を示す模式図、第１３図はアク
セプターＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０の組み立てを示
す模式図、第１４図は中間クローニングベクターｐｃｖ
’７゜Ｏの組み立てを示す模式図、第１５図は中間クロ
ーニングベクターｐＧＶ７５０の構造を示す模式図、第
１６図は中間ベクターｐＧＶ７４５の組み立てを示す模
式図、第１７図はアクセプタープラスミドｐＧＶ２２６
０の組み立てを示す模式図、第１８図はプラスミドｐＬ
ＧＶ２３８１の組み立てを示す模式図、第１９図はプラ
スミドｐＡＧＶ１０の組み立て、およびその、プラスミ
ドｐＬＧＶ２３８１への挿入を示す模式図、第２０図は
オクトピンシンターゼ遺伝子暗合化領域と融合する前後
のツバリンシンターゼ遺伝子のプロモーター領域の周囲
のヌクレオチド配列を示す模式図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域の２つの境
界配列（１）および（２）、 （ｂ）単一乗換えが可能な下記の中間クローニングベク
ター中のＤＮＡ配列の少なくとも１部と相同なＤＮＡ配
列を含み、２つの境界配列の間に設置された、クローニ
ング媒体由来の、野生型Ｔ−ＤＮＡの腫瘍形成機能を欠
くＤＮＡセグメント（３）、および （ｃ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる、野生型Ｔｉ
プラスミドのＴ−領域の植物細胞ゲノム中への転移に必
須であるＤＮＡ配列を含んでいる野生型Ｔｉプラスミド
のセグメント（４） を含んでいる植物において腫瘍を誘起しないアクセプタ
ーＴｉプラスミドと、 （イ）少なくとも１つの所望の遺伝子（５）、および （ロ）上記アクセプターＴｉプラスミド中のＤＮＡ配列
と相同なＤＮＡ配列を含んでいるクローニング媒体セグ
メント（３′） を含んでいる中間クローニングベクターからなるベクタ
ー組成物。 ２、中間クローニングベクターが、所望の遺伝子（５）
に隣接して少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子
を更に含有していることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載のベクター組成物。 ３、中間クローニングベクターに含まれる所望の遺伝子
（５）がその天然のプロモーターの支配下にあることを
特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のベクター組成
物。 ４、中間クローニングベクターに含まれる所望の遺伝子
（５）が外来性プロモーターの支配下にあることを特徴
とする特許請求の範囲第１項に記載のベクター組成物。 ５、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の
ベクター組成物を含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ。 ６、（ａ）Ｔ−領域およびＴ−領域の２つの境界配列を
持たない野生型ＴｉプラスミドのＤＮＡセグメント（４
）、および （ｂ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域の２つの境界配
列を含んでいる下記の中間クローニングベクターのＤＮ
Ａ配列の少なくとも１部と相同なクローニング媒体由来
のＤＮＡ配列（３） を含んでいる植物において腫瘍を誘起しないアクセプタ
ーＴｉプラスミドと共に使用し得る中間クローニングベ
クターであって、 （イ）野生型ＴｉプラスミドのＴ−領域の２つの境界配
列（１）および（２）、 （ロ）上記アクセプターＴｉプラスミド中のＤＮＡ配列
と相同なＤＮＡ配列を含んでいるクローニング媒体セグ
メント（３′）、および （ハ）植物ゲノム中に組込まれるように、２つの境界配
列の間に設置された少なくとも１つの所望の遺伝子（５
） を含んでいる中間クローニングベクター。 ７、所望の遺伝子（５）に隣接して少なくとも１つの選
択可能なマーカー遺伝子を更に含有している特許請求の
範囲第６項に記載の中間クローニングベクター。 ８、所望の遺伝子（５）がその天然のプロモーターの支
配下にあることを特徴とする特許請求の範囲第６項に記
載の中間クローニングベクター。 ９、所望の遺伝子（５）が外来性プロモーターの支配下
にあることを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の
中間クローニングベクター。 １０、特許請求の範囲第６項〜第９項のいずれかに記載
の中間クローニングベクターをアクセプターＴｉプラス
ミドとともに含んでいるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP83100255.5 | 1983-01-13 | ||
| EP83100255 | 1983-01-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63283587A true JPS63283587A (ja) | 1988-11-21 |
| JP2726267B2 JP2726267B2 (ja) | 1998-03-11 |
Family
ID=8190232
Family Applications (6)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59005512A Granted JPS59140885A (ja) | 1983-01-13 | 1984-01-13 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP62129585A Expired - Lifetime JP2769539B2 (ja) | 1983-01-13 | 1987-05-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP63103749A Expired - Fee Related JP2726267B2 (ja) | 1983-01-13 | 1988-04-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP2236922A Pending JPH03108478A (ja) | 1983-01-13 | 1990-09-05 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP4261509A Pending JPH06105629A (ja) | 1983-01-13 | 1992-09-30 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP2000186437A Pending JP2001029092A (ja) | 1983-01-13 | 2000-06-21 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59005512A Granted JPS59140885A (ja) | 1983-01-13 | 1984-01-13 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP62129585A Expired - Lifetime JP2769539B2 (ja) | 1983-01-13 | 1987-05-25 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2236922A Pending JPH03108478A (ja) | 1983-01-13 | 1990-09-05 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP4261509A Pending JPH06105629A (ja) | 1983-01-13 | 1992-09-30 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
| JP2000186437A Pending JP2001029092A (ja) | 1983-01-13 | 2000-06-21 | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (6) | JPS59140885A (ja) |
| AT (2) | ATE282692T1 (ja) |
| AU (1) | AU546542B2 (ja) |
| CA (2) | CA1341524C (ja) |
| DE (3) | DE3382839D1 (ja) |
| DK (1) | DK173104B1 (ja) |
| IL (1) | IL70610A (ja) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE282692T1 (de) * | 1983-01-13 | 2004-12-15 | Max Planck Gesellschaft | Nichtonkogenisches ti-plasmidvektorsystem und für das einschleusen expressionsfähiger gene in pflanzengenomen verwendbare rekombinante dna- moleküle |
| JPS60500438A (ja) * | 1983-01-17 | 1985-04-04 | モンサント カンパニ− | 植物細胞を形質転換するためのプラスミド |
| SU1582990A3 (ru) * | 1983-01-17 | 1990-07-30 | Монсанто Компани (Фирма) | Способ получени трасформированных клеток двудольных растений |
| WO1984002913A1 (en) * | 1983-01-17 | 1984-08-02 | Monsanto Co | Chimeric genes suitable for expression in plant cells |
| NL8300699A (nl) * | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
| NZ207766A (en) * | 1983-04-15 | 1987-03-06 | Lubrizol Genetics Inc | Plant structural gene expression |
| NZ209338A (en) * | 1983-09-14 | 1988-02-12 | Lubrizol Genetics Inc | Plasmid for the transformation of a plant cell |
| US4658082A (en) * | 1984-07-25 | 1987-04-14 | Atlantic Richfield Company | Method for producing intact plants containing foreign DNA |
| BR8600161A (pt) * | 1985-01-18 | 1986-09-23 | Plant Genetic Systems Nv | Gene quimerico,vetores de plasmidio hibrido,intermediario,processo para controlar insetos em agricultura ou horticultura,composicao inseticida,processo para transformar celulas de plantas para expressar uma toxina de polipeptideo produzida por bacillus thuringiensis,planta,semente de planta,cultura de celulas e plasmidio |
| US5180873A (en) * | 1985-04-16 | 1993-01-19 | Dna Plant Technology Corporation | Transformation of plants to introduce closely linked markers |
| EP0267159A3 (de) * | 1986-11-07 | 1990-05-02 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen |
| EP2077275A3 (en) | 1998-06-02 | 2009-08-12 | Nihon University | IgA nephropathy-related DNA |
| JP4623825B2 (ja) | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
| CA2785941C (en) | 2000-10-06 | 2017-01-10 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Antibody composition-producing cell |
| JP4627601B2 (ja) * | 2001-02-28 | 2011-02-09 | 株式会社パイロットコーポレーション | 筆記具用ペン芯およびそれを用いた筆記具 |
| SG135907A1 (en) | 2001-03-15 | 2007-10-29 | Sumitomo Chemical Co | Analysis of agonist-activity and antagonist-activity to cytokinin receptor |
| AU2002336288C1 (en) | 2001-10-19 | 2009-04-30 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Weed controller metabolism proteins, genes thereof and use of the same |
| AU2003296151A1 (en) | 2002-12-26 | 2004-07-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing dipeptide |
| WO2007037245A1 (ja) | 2005-09-29 | 2007-04-05 | Shionogi & Co., Ltd. | 血管新生抑制作用を有するポリペプチド |
| JP5242382B2 (ja) | 2006-04-14 | 2013-07-24 | 株式会社医学生物学研究所 | エフェクター機能を有するポリペプチド変異体 |
| EP2067857B1 (en) | 2006-09-25 | 2012-04-11 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd | Method for production of dipeptide |
| JPWO2008090960A1 (ja) | 2007-01-24 | 2010-05-20 | 協和発酵キリン株式会社 | ガングリオシドｇｍ２に特異的に結合する遺伝子組換え抗体組成物 |
| CN101679966B (zh) | 2007-01-24 | 2014-03-12 | 协和发酵麒麟株式会社 | 具有增强的效应子活性的遗传重组抗体组合物 |
| US20100075343A1 (en) | 2007-01-25 | 2010-03-25 | Motoo Yamasaki | Novel peptides |
| SG192433A1 (en) | 2007-09-27 | 2013-08-30 | Shionogi & Co | Method for producing hydroxylated adamantane using cytochrome p450 |
| JP5620106B2 (ja) | 2007-10-24 | 2014-11-05 | 株式会社糖鎖工学研究所 | 増強されたエフェクター機能を有するポリペプチド |
| JP5662149B2 (ja) | 2008-08-13 | 2015-01-28 | 協和発酵キリン株式会社 | 遺伝子組換えプロテインｓ組成物 |
| CN102232111B (zh) | 2008-10-09 | 2014-12-03 | 协和梅迪克斯株式会社 | 果糖基肽氧化酶 |
| EP2543727B1 (en) | 2010-03-02 | 2016-08-31 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Modified antibody composition |
| EP2554669B1 (en) | 2010-03-26 | 2018-09-19 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Novel antibody having modification site introduced therein, and antibody fragment |
| JP5058332B2 (ja) | 2010-07-14 | 2012-10-24 | 住友ゴム工業株式会社 | イソプレンオリゴマー、ポリイソプレン、及びこれらの製造方法、ゴム組成物、並びに空気入りタイヤ |
| US9944970B2 (en) | 2013-07-09 | 2018-04-17 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Glycated hexapeptide oxidase and use thereof |
| JP6448194B2 (ja) | 2014-01-20 | 2019-01-09 | 住友ゴム工業株式会社 | シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び、ＮｏｇｏＢｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、シス型プレニルトランスフェラーゼ及びＮｏｇｏＢｒｅｃｅｐｔｏｒを発現させた形質転換体、並びに該形質転換体を用いたポリイソプレノイドの製造方法 |
| JP6557989B2 (ja) | 2015-02-23 | 2019-08-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 |
| JP6719174B2 (ja) | 2015-02-23 | 2020-07-08 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 |
| JP6557990B2 (ja) | 2015-02-23 | 2019-08-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 |
| TWI831365B (zh) | 2017-01-10 | 2024-02-01 | 國立大學法人山口大學 | 抗ｇｐｃ３抗體 |
| JP2020195326A (ja) | 2019-06-03 | 2020-12-10 | 住友ゴム工業株式会社 | 天然ゴムの製造方法、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP6923166B2 (ja) | 2019-07-16 | 2021-08-18 | 住友ゴム工業株式会社 | 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP2021080204A (ja) | 2019-11-19 | 2021-05-27 | 住友ゴム工業株式会社 | 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| WO2021177074A1 (ja) | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 住友ゴム工業株式会社 | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP2023040705A (ja) | 2021-09-10 | 2023-03-23 | 住友ゴム工業株式会社 | トランス型ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換生物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP2023127870A (ja) | 2022-03-02 | 2023-09-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ｃｐｔ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP2023127868A (ja) | 2022-03-02 | 2023-09-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ｃｐｔ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
| JP2023127869A (ja) | 2022-03-02 | 2023-09-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ｃｐｔ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT373279B (de) * | 1977-11-08 | 1984-01-10 | Genentech Inc | Verfahren zur herstellung eines rekombinationsclonbildungstraegers |
| JPS595512A (ja) * | 1982-06-30 | 1984-01-12 | 松下電工株式会社 | 接点材料 |
| ATE282692T1 (de) * | 1983-01-13 | 2004-12-15 | Max Planck Gesellschaft | Nichtonkogenisches ti-plasmidvektorsystem und für das einschleusen expressionsfähiger gene in pflanzengenomen verwendbare rekombinante dna- moleküle |
| JPS62129585A (ja) * | 1985-11-29 | 1987-06-11 | Kyocera Corp | ポンプ運転装置 |
-
1983
- 1983-12-22 AT AT89102441T patent/ATE282692T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 DE DE3382839T patent/DE3382839D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-22 DE DE3382838T patent/DE3382838T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-22 AT AT88105808T patent/ATE255162T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 DE DE8383112985T patent/DE3381568D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-01-03 IL IL70610A patent/IL70610A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-01-11 CA CA004451015A patent/CA1341524C/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-11 CA CA000617136A patent/CA1341419C/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-12 DK DK198400136A patent/DK173104B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-01-13 JP JP59005512A patent/JPS59140885A/ja active Granted
- 1984-01-13 AU AU23274/84A patent/AU546542B2/en not_active Expired
-
1987
- 1987-05-25 JP JP62129585A patent/JP2769539B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-04-25 JP JP63103749A patent/JP2726267B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-09-05 JP JP2236922A patent/JPH03108478A/ja active Pending
-
1992
- 1992-09-30 JP JP4261509A patent/JPH06105629A/ja active Pending
-
2000
- 2000-06-21 JP JP2000186437A patent/JP2001029092A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK13684D0 (da) | 1984-01-12 |
| DE3382838T2 (de) | 2004-04-15 |
| IL70610A (en) | 1992-08-18 |
| DE3382838D1 (de) | 2004-01-08 |
| ATE282692T1 (de) | 2004-12-15 |
| JPS59140885A (ja) | 1984-08-13 |
| DK173104B1 (da) | 2000-01-17 |
| JP2769539B2 (ja) | 1998-06-25 |
| AU2327484A (en) | 1984-07-19 |
| AU546542B2 (en) | 1985-09-05 |
| DE3381568D1 (de) | 1990-06-21 |
| CA1341419C (en) | 2003-02-11 |
| JP2001029092A (ja) | 2001-02-06 |
| DE3382839D1 (de) | 2004-12-23 |
| JPH06105629A (ja) | 1994-04-19 |
| ATE255162T1 (de) | 2003-12-15 |
| JPH03108478A (ja) | 1991-05-08 |
| JPH0258917B2 (ja) | 1990-12-11 |
| CA1341524C (en) | 2007-04-03 |
| DK13684A (da) | 1984-07-14 |
| JP2726267B2 (ja) | 1998-03-11 |
| JPS6339587A (ja) | 1988-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0116718B1 (en) | Process for the introduction of expressible genes into plant cell genomes and agrobacterium strains carrying hybrid ti plasmid vectors useful for this process | |
| JPS63283587A (ja) | 植物細胞ゲノムへの発現可能な遺伝子の導入法 | |
| US5188958A (en) | Transformation and foreign gene expression in brassica species | |
| US5750871A (en) | Transformation and foreign gene expression in Brassica species | |
| US5668298A (en) | Selectable marker for development of vectors and transformation systems in plants | |
| US7060876B2 (en) | Method for transforming monocotyledons | |
| JP3102888B2 (ja) | 植物の形質転換方法及びそのためのベクター | |
| Torisky et al. | Development of a binary vector system for plant transformation based on the supervirulent Agrobacterium tumefaciens strain Chry5 | |
| EP0270615B1 (en) | TRANSFORMATION AND FOREIGN GENE EXPRESSION IN $i(BRASSICA) SPECIES | |
| US6376234B1 (en) | Method of inserting viral DNA into plant material | |
| JPS63267280A (ja) | 安定な二成分系アグロバクテリウムベクターおよびその使用法 | |
| US20140223607A1 (en) | Transformation system in camelina sativa | |
| US20090151023A1 (en) | Transformation system for Camelina sativa | |
| US6365799B1 (en) | Hygromycin-resistant transgenic plants | |
| US5929306A (en) | KYRT1, a disarmed version of a highly tumorigenic Agrobacterium tumefaciens strain identified as Chry5 | |
| US20090075358A1 (en) | Vectors for transformation of plant cells | |
| AU782896B2 (en) | Enhanced plant cell transformation by addition of host genes involved in T-DNA integration | |
| DK174310B1 (da) | Intermediær kloningsvektor, bakterie indeholdende denne, fremgangsmåde til transformering af en plantecelle, fremgangsmåde til fremstilling af en plante, transformeret plantecelle og plante af sådanne celler og frø af en sådan plante | |
| JPH03187381A (ja) | グルタミンシンテターゼインヒビター耐性に関するダイズ植物の遺伝子操作方法 | |
| US20030079254A1 (en) | Enhanced plant cell transformation by addition of host genes involved in T-DNA integration | |
| Li et al. | Gene transfer strategy for kiwifruit to obtain pure transgenic plant through inducing adventitious roots in leaf explants with Agrobacterium tumefaciens | |
| WALDEN | 4 Agrobacterium-Mediated |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |