JPS63267280A - 安定な二成分系アグロバクテリウムベクターおよびその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 植物ゲノムへの外来性ＤＮＡの導入は、アグロバクテリ
ウム・ツメファシェンス（Ａ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
＠　　ｊｕｍ６ｒａｃｉｅｎｃ）の腫瘍誘導性プラスミ
ド類から導かれるプラスミドベクター系を用いて行なわ
れることが最も多い。これらのプラスミド類の１つのフ
ラグメントであるＴ−ＤＮＡは、自然に起きるクラウン
ゴール（根頭がん腫）形成過程において植物の染色体に
移行する（トランスファーされる）［ゲイセンら（Ｇ　
ｈｅｙｓｅｎ）、（１９８５）の総説参照コ。

アグロバクテリウムの宿主域は極めて広範囲に及んでお
り、最近では、アグロバクテリウムによるユリ科植物の
形質転換が報告されている［ヘルナルステーンら（Ｈｅ
ｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ）、１９８４］。これは、アグロ
バクテリウム系の適用が双子葉植物に制限されることを
示した従来の観察結果に反するものである。しかしなが
ら、重要な穀類作物が含まれているイネ目でのアグロバ
クテリウム−媒介形質転換は未だ達成されていない。外
来性遺伝子を植物に導入する他の方法として、ポリエヂ
レングリコール処理、電気穿孔処理、あるいはそれらの
併用処理の後、プロトプラストにＤＮＡ自身を取り込ま
せる方法がある。これらの方法は、単子葉および双子葉
の両種に適用可能であるが、プロトプラストを使用する
と、形質転換後の正常な植物の再生を制限されることが
非常に多い。

今日では、広範なアグロバクテリウムベクター系が開発
されている。これらによれば外来性遺伝子を容易にクロ
ーニングでき、また、それらは単一の工程で大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）からＡ、ツメファシェンスに移行する。最
も大切なのは、幹、葉部、塊茎片、あるいは根茎等の傷
付いた植物部分に感染させた後に形質転換を起こすこと
ができるという点である。本発明に用いられるアグロバ
クテリウムベクターは、２つの観察に基づいて計画され
た。

第１は、クラウンゴールとは無関係に、植物ホルモンに
関与しているＴ−ＤＮＡ遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡの移行（
トランスファー）および組み込みに必要とされないとい
うことである。第２は、Ｔ−ＤＮＡ境界（ボーダー）（
２５ｂｐの直接的な反復配列を含む）は、Ｔ−ＤＮＡの
移行に関連する唯一必須のシス（ｃｉｓ）作用配列であ
るということである。

Ｔｉ−プラスミドから導かれる１つのタイプのベクター
は、レセプターのＴｉ−プラスミドとのホモローガスな
組換えにより組換えられる中間体ベクターまたはシャト
ルベクターである［ザムブリスキーら（ＺａＩＩｌｂｒ
ｙｓｋｉ）、１９８３コ。第２のタイプは、Ｔ−ＤＮＡ
がアグロバクテリウム内で複製可能なベクター分子によ
って担持されている、二成分系ベクター系である［ベバ
ンら（Ｂｅｖａｎ）、１９８４］。Ｔ−ＤＮＡの移行に
必要なＴｉ−プラスミド機能は、Ｔｉ−プラスミド誘導
体上に存在しているｖｉｒ遺伝子によってインドランス
（ｉｎ　　ｔｒ里）に補われている［ヘケマら（Ｈｏｅ
ｋｅｍａ）、１９８３］。アグロバクテリウム株の組み
立ては、組換えベクター、または二成分系ベクターを用
いて等しく容易に行なわれるが、二成分系ベクターを用
いると、サザーンンプロットおよびハイブリザイゼーシ
ョン分析によって組換えＴｉ−プラスミドの構造を証明
する必要がない。最も重要な点は、二成分系ベクターの
コスミド誘導体によって組み立てられた植物ゲノムＤＮ
Ａの全ライブラリーを、”まとめて（ｅｎ　　ｍａｓｓ
ｅ）”植物細胞内に移すことを期待し得ることである。

このことにより、生化学的突然変異を補い、あるいは優
勢な遺伝子の発現を選択することができる。得られた植
物細胞系統中の所望の遺伝子は、同時に移行されたＴ−
ＤＮＡ配列に基づいて容易に確認し得る。このことによ
り、該遺伝子のクローニングが可能となる。そのような
実験には多数のクローン類が関与しており、完全なライ
ブラリーがうまく移行されるか否かは、二成分系ベクタ
ーの安定性によって決定されるであろう。本明細書に記
載の二成分系ベクターは、ｐＲＫ２５２［ベバン（Ｂｅ
ｖａｎ）、１９８４］、およびｐＴＪＳ７５［アンら（
Ａｎ）１９８５］のような、Ｐ−タイププラスミドＲＫ
２から導かれるプラスミドのような広宿主域プラスミド
に基づくものか、あるいは、アグロバクテリウムプラス
ミド由来の複製超厚を含有しているものである。［ノー
モエンスら（Ｓ　ｉｅｍｏｅｎｓ）、１９８６コ。

しかしながら、これらのレプリコンを用いる上で配慮す
べき主要な点は、非−選択的な条件下でそれらがかなり
不安定であるということである［デベクタら（ＤｉｔＬ
ａ）、１９８５コ。従って、より安定なアグロバクテリ
ウムレプリコンを与え得るプラスミドが必要とされてい
る。

発明の目的および構成 本発明は、外来性遺伝子を植物細胞内に導入するための
二成分系ベクターであって、クローニングを容易ならし
めるとともに、それらが自律的に複製可能なアグロバク
テリウムに高頻度で移動可能であり、非選択的な条件下
での安定性が向上されているベクターを提供するもので
ある。

本発明の目的は、シュードモナスプラスミドｐｖＳｌの
複製起源を含有する二成分系ベクターが上記の所望の性
質を有するという驚くべき発見に基づいて達成された。

ｐＶｓｌは、水銀イオンおよびスルフォンアミドに対す
る耐性を付与する３０ｋｂのシュードモナス・アエルギ
ノサ（Ｐ　ｓｏｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏ
ｓａ）プラスミドである［スタニシュら（Ｓ　ｔａｎｉ
ｓｉｃｈ）、１９７７コ。ｐＶｓｌは、ＰプラスミドＲ
ＰＩによって、効率良くアグロバクテリウム内に移動す
る［イトウら（Ｉ　ｔｏｈ）、１９８４］。

本発明の主目的は、外来性遺伝子を植物細胞内に導入す
るための新規な二成分系ベクターであって、シュードモ
ナスプラスミドｐＶＳ１の複製起源、大腸菌のための複
製起源、および右および左側境界配列と境界を接してお
り、様々なアダプターフラグメントや転写調節シグナル
が付加された、オクトピン型Ｔｉ−プラスミドのＴＬ−
ＤＮＡのＴ−ＤＮＡ領域、を含有するベクターを提供す
ることである。

本発明によれば、植物細胞をアグロバクテリウムを介し
て形質転換するための新規な二成分系ベクターを組み立
てることができる。二成分系ベクターは、ホモローガス
な組換えによる固存のＴｉ−プラスミドへの組込みを必
要としない点において、“古典的“なベクター系よりも
実用上有利である。

本発明のｐＶｓ１誘導ベクターの有用な特性を以下に示
す。

クローニングを容易ならしめるに十分な程度に小さい（
約１０ｋｂ）。

高頻度でアグロバクテリウム内に移動可能である。

複製起源（４ｋｂフラグメント）は、３０ｋｂｐＶＳ１
プラスミドから導かれているので、比較的大きいサイズ
の組換えプラスミドを複製し得る。

本発明の二成分系ベクターを用いるＴ−ＤＮＡの移行は
、組換え（リコンビネイショナル）ベクターを用いるの
と同等な効率である。従って、ｖｉｒ−遺伝子産物のト
ランス（ｔｒａｎｓ）相捕（コンプレメンテ−ジョン）
は、完全に有効と思われる。

二成分系ベクターをショットガンクローニング実験に用
いると、ｐＶｓ１誘導ベクターは、正常な増殖条件下に
おいても、植物の形質転換中においても、何等の不安定
性を示さないので、極めて有用である。

本発明の二成分系ベクターは遺伝子ライブラリー、即ち
、ゲノムライブラリーの、またはｃＤＮＡライブラリー
の有用な組み立て道具である。好ましい宿主生物はアグ
ロバクテリウムである。

６個の形質転換されたセルライン中のＴ−ＤＮＡ構造の
分子解析から以下のことが明らかとなった。

１）Ｔ−ＤＮＡ境界は大多数のＴ−ＤＮＡ挿入体をデリ
ニエート（脱線状化）していることが認められる。

２）挿入体のコピー数は、組換えベクターを用いて得ら
れる数と異なっていない。以下、添付図面に従って、本
発明をさらに詳しく説明する。

第１図は、ｐＶｓ１誘導二成分系ベクターｐＧＶ９４１
の組み立て模式図である。安定性と複製機能とを担って
いる、ｐＶＳ１の３　、　８　ｋｂＢａｍＨＩ／５ａｃ
ｌｌフラグメントをｐＧＶ８６７のＢａｍＨＩ／５ａｌ
Ｉ部位にクローニングすることにより、ｐＧＶ９２２を
組み立てた。。クローニングに先立ち、ＤＮＡポリメラ
ーゼ処理で５ａｃＩＩおよびＳａｌ■粘着末端を平滑末
端に転換した。粘着末端を充填（フィルイン）してｐＧ
Ｖ９２２の単一のＢａｍｒ−（１部位を消去し、この、
プラスミドを再ライゲートすることによってｐＧＶ９４
０を得た。ｐｃｖｓ１５［デブラエール（Ｄ　ｅｂｌａ
ｅｒａ）、１９８５］から単離され、オクトピンＴＬ−
ＤＮＡ境界配列を含有している１　、　８７　ｋｂＥｃ
ｏＲＩ　／　ＨｉｎｄＩ［Ｉフラグメントを、ｐＧＶ９
４０のＥ　ｃｏＲＩ　／　Ｉ−１ｉｎＤ　ｎＩ部位にク
ローンし、ｐＧＶ９４３を得た。ｍＧＶ２から、２　、
４　ｋｂＢａｍｌ（ＩフラグメントとしてキメラＮＰＴ
ＩＩ遺伝子を単離し、ｐＧＶ９４３の単一のＢｇｌ１１
部位に挿入した。得られたプラスミドｐＧＶ９４１はク
ローニングのための単一のＢａｍＩ（ＩおよびＨｐａＩ
部位を含有している。この構築物は、寄託番号ＤＳＭ３
８９３の下、Ｄ　Ｓ　Ｍ　　Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、’Ｆ
、Ｒ，Ｇ、ζこ寄託されている。

略語：ｃｂ：カルペニシリン耐性：Ｃｍ；クロラムフェ
ニコール耐性：Ｎｅｏ；植物のネオマイシン耐性：Ｓｌ
；ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシン耐性：
Ｂ　；ＢａｍＨＩ　：Ｂｇ：Ｂｇｌ　ＩＩ　：Ｅ　；Ｅ
ｃｏＲＩ　：ｈ；ＨｉｎｄＩ［［：Ｈｐ；ＨｐａＩ　：
Ｐ　；Ｐｓｔ　Ｉ　：Ｓ　；Ｓａｌ　Ｉ　：ｒｅｐニレ
ブリコン機能：ｓｔａ：安定性機能・ 第２図は、ｐＧＶ９４４で形質転換されたセルラインの
物理学的分析の結果を示す図である。

Ａ、　　ｐＧＶ９４４のＴ−領域の制限地図。点々を付
した領域はｐＧＶ９４４のベクタ一部分を表している。

破線はＴＬ−ＤＮＡの境界配列を示している。プローブ
として用いたフラグメントが示されている。

Ｂ、　　Ｃ５８ＣＩＲＣ５８ＣＩＲｉｆＲ（ｐＧＶ２２
６０Ｘｐで形質転換された６個の独立のセルラインのハ
イブリザイゼーションンパターン。全植物ＤＮＡ　１０
　ＢｇをＢｃｌｌで消化し、アガロースゲル電気泳動で
分離し、ナイロンフィルター上にブロッティングし、放
射活性に標識したプローブにハイブリサイズさせた。

プローブｌ：ＫｍＲ構造遺伝子を包含しているｐＫＣ７
のｌ　、　　ＯｋｂＢｃｌ　Ｉ　／　Ｓｍａフラグメン
ト（ラオおよびロジャース、１９７９）。

プローブ２：ＩＩ＋ＧＶ１（デデブラエール、１９８５
）から単離された、ＯｅＳ構造遺伝子を含有する１゜４
　ｋｂＢａｍＨＩ　／　ＰｖｕｌＩフラグメント。

プローブＶニブラスミドｐＧＶ９２２゜Ｃ，ｐＧＶ９４
４Ｔ−ＤＮＡのタンデムな２重構造を示す図であり、Ｂ
ｅ１ｌフラグメントの予想サイズが記載されている。可
能な連結フラグメントに対応するバンドをＢに星印で示
した。

第３図Ａは、二成分系ベクターｐＧｓｃ１７０１Ａ２の
組み立て模式図である。ｐＪＥ２１の８００ｂｐＰｖｕ
ｎ−Ｎｄｅｌフラグメントを単離し、ｐＧＶ９４３に導
入した。後者は、Ｎｄｅｌで部分消化した後、ＥｃｏＲ
１消化された。ｐＶＳ１の複製起原には余分なＮｄｅｌ
末端があるので、部分消化が必要であった。フレノウＤ
ＮＡポリメラーゼ処理の後、ＥｃｏＲＩ帖着末端表着末
端ｌＩ平滑末端をライゲートさせてもよい。次いで、得
られたプラスミドｐＧＶ９４３Ａを５ａｃｌおよびＮｄ
ｅｌで消化し、複製起原（ｏｒ　ｉ※）を含有するフラ
グメントをｐＧＳＣＩ７０＋に挿入した。後者のプラス
ミドも、同じ酵素で消化されている。この組み立てによ
って二成分系ベクターｐＧｓｃ１７０１Ａ２を得た。

この構築物はＤＳＭ　Ｇ６ｔｔｉｎｇｅｎ、　Ｆ、Ｒ，
Ｇ、に、寄託番号ＤＳＭ４２８６の下、寄託されている
。

第３図Ｂは、発現ベクターｐＧｓＦＲ７６１Ａの組み立
て模式図である。この構築物は、ＤＳＭＧＯｔｔｉｎｇ
ｅｎ、　Ｆ、Ｒ，Ｇ、に、寄託番号ＤＳＭ４２８７の下
、寄託されている。構成的なプロモーターの支配下にあ
る３個の標識遺伝子をｐｃｓｃｔ７０１Ａ２のＴ−ＤＮ
Ａ境界の間に挿入した。ｐＧＳＦＲＩ　６１由来のＢａ
ｍＨｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩフラグメントを、ＢａｍＨＩお
よびＨｉｎｄｌＩ［で線状化したｐＧＳＣ１７０１Ａ２
のポリリンカー領域に挿入した。このフラグメントは、
分枝的に転写させるＴ−ＤＮＡ　　ＴＲプロモーターに
関連した（引っ掛けられた）屈およびｎｅｏ遺伝子を含
有している。

これにより、ｐＧｓＦＲ７６０Ａが得られる。次いで、
３５５プロモーターに融合し九石遺伝子を含有するキメ
ラ横築物をＢｇｌＩＩフラグメントとして単離し、フレ
ノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ｐＧｓＦＲ７
６０Ａの充填されたＢｇｌ■部位にクローンした。これ
によりｐｃ　Ｓ　Ｆ　Ｒ７６１Ａを得た。

全てのプラスミド構築物は模式的に表されており、それ
らのサイズは、プラスミド名の下にｋｂ単位で示されて
いる。オープンボックス（白枠）は、プラスミドの適当
な特徴を示している。略語：Ａ＋＋ｐＲ；アンピシリン
耐性：Ｓｍ；ストレプトマイシン／スペク勇ノマイシン
耐性＋ＲＢ、右側境界：ＬＢ；左側境界：ｐＶＳ　ｔ　
；ｐＶＳ　ｌｌｔ製起原超厚有する制限フラグメント：
３°７　；３’ｏｃｓ、　３’ｒ＋ｏｓ；それぞれ、Ｔ
−ＤＮＡ遺伝子７、オクトピン合成酵素（シンターゼ）
およびツバリン合成酵素の終止およびポリアデニル化シ
グナル：Ｔａ２”、ＴＲＩｏ、ＴＲＴ−ＤＮＡ遺伝子１
°および２′由来の分枝性転写プロモーター：ｂａｒ；
ビアラフオス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）耐性遺伝子：ｎｐ
ｔ　ＩＩ　；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■
遺伝子：ｈｙｇ；ハイグロマイシンホスホトランスフエ
ーゼ遺伝子：Ｔ−ＤＮＡオクトピン；境界フラグメント
間に残されたＴ−ＤＮＡ配列。

原料および方法 菌株およびプラスミド 組換えＤＮＡ実験を通じて大腸菌株に５１４［コルリン
ら（Ｃｏｌｓｏｎ）、１９６５コを用いた。アグロバク
テリウム株Ｃ５８ＣＩＲｉｆＲ（ｐＧＶ２２６０）ｎ　
　ｔｒａｎｓ）に付与するために用いた（デブラエール
ら、１９８５）。

ｐＧＶ８６７はストレプトマイシン耐性およびスペクチ
ノマイシン耐性をコードしている２、２５ｋｂＨｉｎｄ
ｌ［Ｉ／Ｂａｆｆ１ＨＩフラグメントを担っているｐＢ
ｒ（３２５の誘導体である。ｐＧＶ８１５およびｐＧＶ
８２５ｉ！非毒性（アビルレント）Ｔ　−Ｄ　ＮＡを含
有する中間体ベクターである（デブラエールら、１９８
５）。

ｐＧＶ２４８６はｐＧＶ２２６０およびｐｃｖｓ９１間
のレプリコン複合体（コインテグレート）である。ｐＧ
Ｖ８９１はｐＧＶ８３３と同じらノテある（デブラエー
ルら、１９８５）：キメラＮＩ’ＴＩＩ遺伝子は、ｍＧ
　Ｖ　２　（Ｐ　ｎｏｓ　−ｎｅｏ　−３’　ｏｃｓカ
ッセットでＭ１３ｍｐ７から導かれる）から、ＢａｍＨ
Ｉフラグメントとして単離され、ｐＧＶ８２５の単一の
Ｂｇ１１１部位に挿入された。次いで、鰹遺伝子をＢａ
ｍＨＩフラグメントとして上記の如く挿入し、ｐＧＶ８
３３を組み立てた。

ＤＮＡ技術 組換えＤＮＡ法は、記載のごとくにして行なわれた［マ
ニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８２］。

細菌接合 二成分系ベクターは、大腸菌からＡ、ツメファシェンス
に、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３［ディツタら（
Ｄ　１ｏｔａ）、１９８０］を用い、三ＩＪ！（）リパ
レンタル、ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ）交配により、移さ
れた。

指数増殖中の供与体、受容体、およびヘルパー株０．１
ｘρをＬＨ寒天プレートにブレーティングし、２８℃で
一夜インキユベートした。この移動性混合物を１０３Ｍ
　　Ｍｇ５Ｏ，２ｒ（ｌに回収し、その段階希釈液を選
択培地にブレーティングした。接合完了体をストレプト
マイシン（１０００ｕｇ／ｍｌ）とスペクチノマイシン
（３００ｕｇ／ｍｌ）を含んだ最小培地で選択した。当
業者は、す」機能をイン−トランス（如チμ咀）に与え
る他の大腸菌株やアグロバクテリウム株、並びに、本発
明を実施する上で同等に用い得る他のヘルパープラスミ
ドを知っている。

植物の形質転換 二成分系ベクターを担持しているアグロバクテリウム株
をプロトプラスト共生培養系で調べた。

ニコチアナ・タバクム（Ｎ　１ｃｏｔｉａｎａ　　　ｔ
ａｂａｃｕｍ）ｃｖ、プティーハバナ（Ｐｅｔｉｔ　　
Ｈａｖａｎａ）ＳＲ１［マリガら（Ｍｌｉｇａ）　ｌ　
９７３コからメソフィルプロトプラストを単離し、マー
トンら（１９７９）の記載に従って共生培養した。形質
転換された植物細胞を、トウーブロック（Ｄ　ｅ　　Ｂ
　１ｏｏｋ）の記載（１９８４）の如く、カナマイシン
耐性に関して選択した。

形質転換した細胞系統でのオクトピンシンターゼ活性を
リーマンスら（ＬｅｅｍａｎｓＸｌ　９８１　）らの方
法に従って測定した。

Ｔ−ＤＮＡ分析 既述［デラボータら（Ｄ　ｅｌｌａｐｏｒｔａ）、１９
８４］の如くにして、全植物ＤＮＡを単離した。消化し
た植物ＤＮＡを古典的なサザーンプロット法を用い、ハ
イボンドＮナイロン膜［アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）］に移した。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリザイゼーショ
ンは、供給者の指示した方法に従って行なわれた。

寒鼻餞 Ａ）二成分系ベクターの組み立て シュードモナスプラスミドＰＶＳＩの安定性と複製機能
は、３．８ｋｂＢａｍＨＩ／５ａｃＵ制限フラグメント
に担持されている（イトウら、１９８４）。

このフラグメントを用いてプラスミドｐＡＧＶ９４３を
組み立てた（第１図参照）。この二成分系ベクターは、
ｐＢｒｔ３２５のカルベニシリン耐性と複製起源を与え
るセグメントを含有している。後者は、ｐｖｓ＋が大腸
菌内で複製しないので、必要トなる。ｐＡＧＶ９４３は
、細菌性のストレプトマイシンースベクチノマイシン耐
性マーカーを担っており、アグロバクテリウムでの選択
を容易にする。レプリコン複合体形成ベクターｐＧＶ８
１５（デブラエールら、１９８５）から再クローニング
され、オクトピン’ｒＬ−ＤＮＡの左および右境界配列
を含有している１、８７ｋｂのＴ−ＤＮＡフラグメント
も包含された。この無毒なＴ−ＤＮＡはＢａ１ｔＩＨＩ
、ＢｇｌｌｌおよびＩ−ｒｐａｌのクローニングのため
の単一の制限部位を含有している。

コントロールとして用いるために、広域宿主レプリコン
ｐＲＫ４０４（ディツタら、１９８５）に基づイテ、ｐ
ＧＶ９４３同様のＴ−ＤＮＡを含有する二成分系ベクタ
ーｐＧＶＱＩ２を組み立てた。

無毒のＴ−ＤＮＡとストレプトマイシンースペクチノマ
イシン耐性遺伝子を担っている２、８ｋｂＰｖｕＩＩフ
ラグメントをｐｃｖ８２５（デブラエールら、１９８５
）から単離し、ｐＲＫ４０４のＳｍａＩ部位にクローン
し、ＰＧＶ９１２を得た。ｐＧＶ９１２の安定性と植物
形質転換能をｐＧＶ９４３のそれと比較した。

これらの二成分系ベクターを植物の形質転換実験に成功
裏に用いるために、優勢な選択マーカー遺伝子として、
キメラネオマイシンホスホトランスフェラーゼＵ（ＮＰ
ＴＩＩ）遺伝子を含有させた［ヘレラーエスッレラら（
Ｈｅｒｒｅｒａ　−Ｅｓｔｒｅｌｌａ）、１９８３、ベ
バンら、１９８３、フラレイら（Ｆｒａｌｅｙ）、１９
８３］。キメラＮＰＴＩＩ遺伝子は、２゜３　ｋｂＥｃ
ｏＲＩ　／　Ｓ　ａｌ　Ｉフラグメントとして、ｐＬＧ
Ｖｎｅｏｌ　１０３から単離されたＵレーンら（Ｌ６ｒ
ｚ）、１９８５］。これを、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
のフレノウフラグメントで処理して平滑末端化し、Ｍ１
３ｍｐ７の）ｌｉｎｃ１１部位にサブクローニングし［
ビエイラ（Ｖ　１ｅｉｒａ）およびメッシング（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ）、１９８２］、ｍＧＶ２を得た。ＮＰＴＩＩ
遺伝子をＢａｍＨＩフラグメントとして再クローニング
し、ｐＧＶ９１２およびｐＧＶ９４３の単一のＢｇｌＩ
Ｔ部位に挿入し、それぞれ、ｐＧＶ９１５およびｐＧＶ
９４１を得た。組み立てられたｐＧＶ９４１は、Ｄ　ｅ
ｕｔｓｃｈｅ　　Ｓ　ａｍｍｌｕｎｇ　　ｆｉｉｒ　　
Ｍ　ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（Ｄ　Ｓ　Ｍ）に、
寄託番号３８９３の下、寄託されている。

モデル実験では、ｍＧＶｌから、１．４ｋｂＢａｍＨＩ
フラグメントとして、オクトピンシンターゼ（庄１）遺
伝子を単離し、レプリコン複合体形成ベクターに関して
記載したように（デブラエールら、１９８５）、ｐＧＶ
９１５およびｐＧＶ９４１の単一のＢａｍ８１部位に挿
入し、それぞれ、ｐＧＶ９３９およびｐＧＶ９４４を組
み立てた。％１活性は、形質転換された植物細胞内で容
易に検出されるので、Ｔ−ＤＮＡに付加導入された遺伝
子の発現を検出する目的で選択された（リーマンスら、
１９８１）。

Ｂ、アグロバクテリウム内での二成分系ベクターの安定
性 二成分系ベクターｐＧＶ９３９およびｐＧＶ９４４は、
ヘルパーとしテＨＢ　１０１（ｐＲＫ２０１３）を用い
た、トリバレンタル交配において、大腸菌株からアグロ
バクテリウム株０５８ＣＩＲｉｒＲ（ｐＧＶ２２６０）
に移された。ストレプトマイシンースペクチノマイシン
耐性接合完了体は、両受差において頻度１％で生じた。

ベクタープラスミドの安定性は、ストレプトマイシン（
３００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００
μｓ／ｍｌ）を含んだ選択的ＬＢ培地中で一夜培養した
０５８ＣＩＲｉｒＲ（ｐＧＶ　２２６０ＸｐＧＶ　９３
９）およびｃ５８ＣＩＲｉｆＲ（ｐＧＶ２２６０ＸｐＧ
Ｖ９４４）の培養中で測定された。細菌を非−選択的Ｌ
Ｂ寒天培地にブレーティングし、えられたコロニーをス
ペクチノマイシン耐性に関してスクリーニングした。

さらに、培養物を希釈し、非−選択的な液体培地で７．
１４および２１世代増殖させた後、非−選択的なＬＢプ
レートにブレーティングした。再度、コロニーを、スペ
クチノマイシン耐性に関してスクリーニングした。表１
は、ｐｖｓｔおよびその誘導体プラスミドがアグロバク
テリウム内で完全に安定であるのに対して、ｐＲＫ４０
４およびその誘導体ｐＧＶ９３９が非−選択的な増殖中
に高頻度で失われることを示している。

表−上　アグロバクテリウム株Ｃ３ＢＣＩＲ１ｆＲ中で
のプラスミドの安定性 プラスミド 数値は、非選択的な増殖培養をスクリーニングした後の
抗生物質耐性菌の比率（％）を示している。

ｐＶｓｌはサルファチアゾール耐性（２５０μｇ／ｒｈ
■）、ｐＲＫ４０４はテトラサイクリン耐性（５μｇ／
ｍｌ）に関して、そして他のプラスミドは、スペクチノ
マイシン耐性（１００μｇ／＋１）に関してスクリーニ
ングされた。

両ベクターの消失の測定は、古典的なタバコプロトプラ
ストの共生培養実験の条件下でも行なわれた。選択的に
増殖した細菌培１１１０ｕｌをプロトプラスト懸濁液Ｌ
１に加えた。培地からサンプルを２４時間毎に採取し、
細菌を、抗生物質耐性に関してスクリーニングした。こ
こでもｐｖｓｔ誘導ｐＧＶ９４４は完全な安定性を示し
た（スペクヂノマイシン耐性　〉　９９％）が、ｐＧＶ
９３９は感染の２４時間後に、６８％のアグロバクテリ
ウム細胞中に含有されていたにすぎない。

Ｃ）植物細胞の形質転換 ニコチアナ・タバクム　ＣＶ　　ブチ・ハバナ　５ｒｔ
ｌからメソフィルプロトプラストを単離し、以下の株：
Ｃ５８ＣＩ　ＲｉｆＲ（ｐＧＶ　２２６０ＸｐＧＶ９３
９）、Ｃ５８ＣＩＲｉｆＲ（ｐＧＶ２２６０ＸｐＧＶ９
４４）およびＣ５８ＣＩＲｉｆＲ（ｐＧＶ２４８６）で
共生培養した。ｐＧＶ２４８６は二成分系ベクターと同
じ＜Ｔ−ＤＮＡを含有している、但し、レプリコン複合
体形成ベクター中である。形質転換された植物細胞を、
ドウ・ブロック（１９８４）の記載に従い、固形培地上
、カナマイシン耐性（５０μｇ／ｎ＋Ｉ）に関してスク
リーニングした。カナマイシン耐性カリ（ｃａｌｌｉ）
をレプリコン複合体形成ベクターｐＧＶ２４８６につい
て、頻度４％で、二成分系ベクターｐＧＶ９３９および
ｐＧＶ９４４それぞれについて！および５％で得た。

カナマイシン耐性カリをさらにカナマイシン５０μｇ／
ｍｌを含んだ固形培地で培養し、オクトピンシンターゼ
活性についてスクリーニングした。

０５８ＣＩＲｉｆＲ（ｐＧＶ２２６０ＸｐＧＶ９４４）
で形質転換したクローン中のカナマイシン耐性とオクト
ピン合成活性との１００％相関関係を観察した。ｐＲＫ
４０４誘導ｐＧＶ９３９で形質転換された２４のクロー
ンでは、ｐＧＶ２４８６で形質転換されたものと同様、
１７が様々なオクトピンシンターゼ活性を示したが、７
ｇのカリからは、オクトピンの生産は検出されなかった
。

Ｄ）形質転換されたセルラインでのＴ−ＤＮＡ欅毒 ６個の、カナマイシン耐性のｐＧＶ９４４形質転換セル
ライン由来の全植物ＤＮＡをサザーンブロツティング法
によって分析し、Ｔ−ＤＮＡのコピー数および構造を決
定した。Ｔ−ＤＮＡの左および右側部分から導かれたプ
ローブを用いたハイブリザイゼーションにより、Ｔ−Ｄ
ＮＡのコピー数を正確に求めることができる。ハイブリ
ザイゼーションパターンから、ライン３．４および６は
唯１個のＴ−ＤＮＡ挿入体を有するが、ラインｌ（３コ
ピー）、ライン２（２コピー）およびライン５（〉４コ
ピー）は複数の挿入体を有することが分かる（第２図参
照）。

Ｔ−ＤＮＡ境界配列が挿入されたＴ−ＤＮＡをデリニエ
ートに認識されているか否かを調べるために、プローブ
としてＰＧＶ９２２を用いた。ｐＧＶ　９２２ハＴ−Ｄ
ＮＡを欠くことを除けば、ｐｃｖ９４４中に存在する全
ベクター配列を含有している。セルライン５の唯１個の
Ｔ−ＤＮＡコピーがベクター配列とハイブリサイズした
。

セルラインｌはＴ−ＤＮＡの左および右両側とハイブリ
サイズする５ｋｂフラグメントを含有している。これは
、複数のＴ−ＤＮＡ挿入体がタンデムに編成されている
ことの特徴である。ライン５にも同様の連結フラグメン
トが認められるがライン２には認められない。

Ｅ）その他の二成分系ベクター構築物およびΔ１外 古典的な、植物のためのアグロバクテリウム媒介形質転
換法は２つの主工程からなる。最初に植物組織を、問題
のプラスミドベクターを担っているアグロバクテリウム
株の培養で感染させる。次いで、植物の汚染を避けるた
めに抗生物質を用いてアゲロバクチリアを除去する。通
常、抗生物質セフォタキシムが用いられる。後者が不安
定であるために、再生期間中、植物の外植体を頻繁に継
代培養しなければならず、このことは、ある種の形質転
換行程において不都合である。別法として、より安定な
抗生物質であるカルベニシリンを培地中に用いることも
できる。このためには、二成分系ベクターｐＧＶ９４３
からアンピシリンおよびカルベニシリン耐性を付与する
β−ラクタマーゼ遺伝子を欠失させる必要がある（第１
図参照）。第３Ａ図に示されているように、突然変異し
たＣｏ１Ｅｌｆｆｌ製起源を含有しているｐＪＥ２１［
ボタ−マン（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ）、　ｌ　９８８コの
Ｐｖｕｌｌ−Ｎｄｅｌフラグメントで、ｐＧＶ９４３の
β−ラクタマーゼ遺伝子とＣｏ１Ｅ１複製起源を含有す
るＥｃｏＲ［−Ｎｄｅｌフラグメントを置換する。この
ことにより、ｐＧＶ９４３Ａが得られる。このプラスミ
ドは、ストレプトマイシンと、スペクチノマイシン　Ｓ
ｍ（２０ｐ　ｇ／　ｍｌ）および５ｐ（５０μｇ／ｍｌ
）を含んだ選択的ＬＢ−寒天プレート（大腸菌用）、並
びに、Ｓｍ（１００μｇ／ｍｌ）およびＳ　ｐ（３００
μｇ／ｍｌ）を含んだ選択的ＬＢ−寒天プレート（アグ
ロバクテリウム用）上、大腸菌およびアグロバクテリウ
ム内で完全に安定である。

さらに、ポリリンカー領域、および終止シグナルおよび
ポリアデニル化シグナルをコードしているフラグメント
を挿入することによって、より有用なベクターが組み立
てられる。ｐＧｓｃ１７０１の５ａｃＩ−Ｎｄｅｌフラ
グメントをｐＧＶ９４３Ａに置換挿入することでｐＧｓ
ｃ１７０１Ａ２が得られる。ｐＧｓｃ１７０１は、ｐＵ
ｏｌＢ［ヤニッシューベロンら（Ｙ　ａｎｉｓｈ　−Ｐ
　ｅｒｒｏｎ）、１９８５コ由来のポリリンカーおよび
オクトピンＴ−ＤＮＡ遺伝子７［ベルテン（Ｖｅｌｔｅ
ｒ＋）およびシェル（Ｓｈｅｌｌ）、１９８５コの３°
末端を含有しているｐＧＶ９４１の誘導体である。興味
ある遺伝子と融合した転写開始シグナルを含有するキメ
ラ遺伝子を終止シグナルの前のポリリンカー内に容易に
挿入することができる。

ｐＧｓｃ１７０１Ａ２は、植物の形質転換に用いられる
様々なキメラ構築物のための基礎的なプラスミドベクタ
ーであった。このプラスミドは、Ｃ５８ＣＩ　ＲｉｆＲ
（ｐＭＰ　９０）［コンク（Ｋｏｎｃｚ）およびシェル
（Ｓ　ｃｈｅｌｌ）、１９８７コ、またはＣ５８ＣＩ　
Ｒｉｆ”　（ｐＧＶ　２２７５）Ｃソモエンンスら（Ｓ
ｉｍｏｅｎｓ）、１９８６コに移動可能である。ｐＮＰ
９０およびｐＧＶ２２７５は、インドランスにハエ機能
を与えるＴｉ−プラスミドであり、カルベニシリンに対
する耐性遺伝子を含有していない。

第３Ｂ図に示すように、このプラスミドのＴ−ＤＮＡ境
界の間に３個の発現単位を導入した。ｐＧＳＦＲ１６１
由来のＢ　ａｍＨＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントは
二重のＴ−ＤＮＡプロモーターフラグメント（ペルトン
およびシェル、１９８５）に関連したｎｅｏおよびｂａ
ｒ遺伝子を含有している。これらの遺伝子は、それぞれ
、ネオマイシンポスホトランスフェラーゼ■およびホス
フィノスリシンアセチルトランスフェラーゼを含有して
おり、それぞれ、カナマイシンおよびホスフィノスリシ
ンに対する耐性を付与する。植物の形質転換に両遺伝子
を使用することは既に記載されている（ヘレラーエステ
レララ、１９８３、ドウ・ブロックら、１９８７）。ｐ
ｔｔｙｇｅ　３３由来のＩ３ｇ劃フ側グメントは、カリ
フラワーモザイクウィルスの３ＢＳプロモーター［オデ
ルら（Ｏｄｅｌり、　１９８５　］のコントロール下に
あるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子
［ファン・アン・エルツエン（Ｖａｎｄｅｎ　　Ｅ　１
ｚｅｎ）ら、１９８５］を含有している。この遺伝子は
ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する。最終組み
立て物、ＰＧＳＦＲ７０１ＡはＴ−ＤＮＡ境界の間に囲
まれた３個のマーカー配列を含有している。それらは、
異なった構成的に活性なプロモーターに関連されており
、様々な終止およびポリアデニル化シグナルを付与され
ている：Ｔ−ＤＮＡ遺伝子ｌの遺伝子端、ネパリンンン
ターゼの３°末端、およびオクトピンシンターゼの３°
末端である。すべてのマーカー遺伝子は、形質転換され
た植物細胞内で独立して選択可能である。従って、この
ベクターは、植物の形質転換実験において、様々な選択
マーカーを評価、比較するために理想的なベクターであ
り、アゲロバクチリアを除去するための抗生物質の使用
に柔軟性を与える。本明細書に記載のベクターを、様々
な植物種の形質転換に用い、成功を収めた。

以下に本明細書中に引用した文献を示す。

引用文献 アン、ワトソン、スタンシエル、ゴートンおよびネスタ
ー（Ａｎ、Ｇ、　、Ｗａｔｓｏｎ、Ｂ、　Ｐ、　、５ｔ
ａｃｈｅ１、Ｓ、　、Ｇｏｒｄｏｎ、Ｍ、　Ｐ、　、ａ
ｎｄ　　Ｎｅ５ｔｅｒ、Ｅ、　Ｗ。

Ｘ１９８５）ＥＭＢＯＪ、４．２７７−２８４ベバン（
Ｂｅｖａｎ、Ｍ、　Ｗ、　ＸＩ　Ｑ　８４）　　ヌクレ
イツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　
　Ｒｅμ、）１２．８７１１−８７２１ ベバン、フラベル、およびチルトン（Ｂｅｖａｎ、Ｍ。

Ｗ、　、Ｆｌａｖｅｌ、Ｒ，Ｂ、　、ａｎｄ　　Ｃｈｉ
ｌｔｏｎ、Ｍ、　Ｄ、　）（１９８３）＊イチュ７−（
Ｃ７：／ド：／）３０４．１８コルソン、プロバー、シ
モンズ、およびスタセイ（Ｃｏｌｓｏｎ、Ｃ，、Ｇｌｏ
ｖｅｒ、Ｓ、　Ｗ、　、Ｓｙｍｏｎｄｓ、Ｎ。

、ａｎｄ　　５ｔａｃｅｙ、に、　Ａ、　、ＸＩ　９６
５）、ジェネティックス、５２．１０４３−１０５０ デブラエール、ビテビアー、ドウ・グレーグ、ドウ・ヘ
ック、シェル、ヴアン・モンターニュ、およびリーマン
ス（Ｄ　ｅｂｌａｅｒｅ、　Ｒ、、Ｂ　ｙｔｅｂｉｅｒ
、　Ｂ　。

、Ｄｅ　　Ｇｒｅｖｅ、ｆ（、、Ｄｅ　　Ｂｏｅｃｋ、
Ｆ、　、５ｃｈｅｌｌ。

Ｊ、　、Ｖａｎ　　Ｍｏｎｔａｇｕｅ、Ｍ、　ａｎｄ　
　Ｌｅｅｍａｎｓ、Ｊ、　）（１９８５）、ヌクレイツ
ク・アシッド・リサーチ、１３．４７７７−４７８８ ドウ　ブロック、ヘレラーエステレラ、ヴアン・モンタ
ーニュ、シェル、およびツアムブリスキ（Ｄｅ　　Ｂｌ
ｏｏｋ、Ｍ、　、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｅｒｅｌｌａ
、Ｌ、　。

Ｖａｎ　　Ｍｏｎｔａｇｕｅ、Ｍ、　、５ｃｈｅｌｌ、
Ｊ、　ａｎｄ　　Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ、Ｐ、ＸＩ　９８
４）ＥＭＢＯＪ、３．１６８デラボルタ（Ｄｅｌｌａｐ
ｏｒｔａ、Ｓ　、　Ｊ　、　）（Ｉ　９８３）プラント
、モル、バイオ口、リポータ−（Ｐ　Ｉａｎｔ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅ　ｏｒｔｅｒ　　）Ｉ、１９−
２１ジツタ、スタンフィールド、コルビン、およびヘリ
ンスキー（Ｄ　１ｔｔａ、　Ｇ　、　、　Ｓ　ｔａｎｆ
ｉｅｌｄ、　Ｓ　、　、　Ｃ。

ｒｂｉｎ、Ｄ、　　ａｎｄ　　Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ、Ｄ、
　Ｒ，Ｘｉ　９８０）プロシーディンゲス・オヴ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オヴ・サイエンスイズ、ＵＳ
Ａ、７７．ジッタ、シュミットハウザー、ヤコブソン、
ル、リャン、フィンレイ−、ギネイ、およびヘリンスキ
ー（Ｄｉｔｔａ、Ｇ、　、Ｓｓｂ＊１ｄｈａｕｓｅｒ、
Ｔ、　、Ｙａｋｏｂｓ。

ｎ、Ｅ、　　、Ｌｕ、　　、Ｐ、　　、Ｌｉａｎｇ、Ｘ
、　　Ｗ、　　、Ｆｉｎａｌａｙ。

Ｄ、　　ｎ、　　、Ｇｕｉｎｅｙ、Ｄ、　ａｎｄ　　Ｈ
ｅ１ｉｎｓｋｉ、Ｄ、　　Ｒ，）（１９８５）プラスミ
ド　１３．１４９−１５３フラレイ、ロジャー、ホルシ
ュ、サンダース、フリック、アダムス、ピットナー、ブ
ランド、フィフク、フライ、ガルピ、ゴールドバーブ、
ホッフマン、およびウー（ＦｒａｌｅｙＪｔ、　Ｔ、　
、Ｒｏｇｅｒｓ、Ｓ。

Ｇ、　、５ａｎｄｅｒｓ、Ｐ、　Ｒ，、Ｆｌｉｃｋ、Ｊ
、　Ｓ、　、Ａｄａｍｓ、Ｓ、　Ｐ、　、Ｂｉｔｔｎｅ
ｒ、Ｍ、　Ｌ、　、Ｂｒａｎｄ、Ｌ、　Ａ、　。

Ｆｉｎｋ、Ｃ，Ｌ、　、Ｆｒｙ、Ｊ、　Ｓ、　、Ｇａ１
ｌｕｐｉ、Ｇ、　Ｒ。

、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ｓ、　Ｂ、　、Ｈｏｆｆｏ＋ａｎ
、Ｎ、　Ｌ、　、ａｎｄ。

Ｗｏｏ、Ｓ、　Ｃ１Ｘ１９８３）プロシーディンゲス・
オヴ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オヴ・サイエンス
イズ、ＵＳＡ８０．４８０３−４８０７ゲイセン、ダー
ス、ファン・モンターニュ、およびシェル（Ｇ　ｈｅｙ
ｓｅｎ、　Ｇ　、　、　Ｄ　ｈａｅｓｅ、　Ｐ　、　、
　Ｖ　ａｎＭｏｎｔａｇｕｅ、Ｍ、　ａｎｄ　　５ｃｈ
ｅｌｌ、Ｊ　、　）（１９８５）ジェネティック・フラ
ックス・イン・ブラソフ、ホーンおよびデニス（Ｈｏｈ
ｎ、Ｂ、　ａｎｄ　　Ｄｅｎｎｉｓ、Ｅ、　Ｓ。

）編、（アドヴアンスイズ・イン・プラント・ジーン・
リサーチ、２巻）１１−４７、ウィーン、スプリンゲル
・ヴエルラーグ ヘルナルステーン、チア・ジーン、シェル、およびファ
ン・モンター二ｘ　（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ、　Ｊ
　。

Ｐ、　、Ｔｈｉａ−Ｔｏｏｎｇ、Ｌ、　、５ｃｈｅｌｌ
、Ｊ、　ａｎｄ　　Ｖａｎ　　Ｍｏｎｔａｇｕｅ、Ｍ、
　ＸＩ　９８５）ＥＭＢＯＪ、、３．３０３９−３０４
１ ヘレラーエステレラ、ドウ・ブロック、メツセンス、ヘ
ルナルステーン、ファン・モンターニュ、およびシェル
（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｅｒｅｌｌａ、Ｌ、　、Ｄｅ
Ｂｌｏｃｋ、Ｍ、　、Ｍｅｓｓｅｎｓ、Ｅ、　、Ｈｅｒ
ｎａｌｓｔｅｅｎｓ、Ｊ。

Ｐ、　、Ｖａｎ　　Ｍｏｎｔａｇｕｅ、Ｍ、　ａｎｄ　
　５ｃｈｅ１１．Ｊ、　Ｘｌ９８３）ＥＭＢＯＪ、、２
．９８７−９９５へクマ、ピルシュ、ホイカー久、およ
びシルペルート（）Ｉｏｅｋｅｉａ、Ａ、　　、Ｐｉｒ
ｓｃｈ、Ｐ、　　Ｒ，、Ｈｏｒｙｋａａｓ、Ｐ、　Ｊ、
　Ｊ、　、ａｎｄ　　５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ、Ｒ，
Ａ、　）（１９８３）ネイチュアー（ロンドン）、３０
３．１イトウ、ワトソン、ハースおよびレイシンガー（
Ｉ　ｔｏｈ、Ｙ、　　、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ　、　　Ｍ、
　　、Ｈａａｓ、Ｄ、　　、ａｎｄＬｅｉｓｉｎｇｅｒ
、Ｔ、　ＸＩ　９８４）プラスミド、１１．クレー、ヤ
ノフスキーおよびネスター（Ｋｌｅｅ。

Ｈ，Ｊ、　、Ｙａｎｏｆｓｋｉ、Ｍ、　Ｆ、　、ａｎｄ
　　Ｎｅ５ｔｅｒ、Ｅ。

Ｗ、（１９８５）バイオ／テクノロジー３．６３７リー
マンス、シャク、デブラエール、ドウ・グレーグ、ヘル
ナルステーン、ファン・モンターニュ、およびシェル（
Ｌｅｅｍａｎｓ、Ｊ、　、Ｓｈａｗ、Ｃ，、ＤｅｂＩａ
ｅｒｅ、Ｒ，、Ｄｅ　　　　Ｇｒｅｖｅ、Ｈ，、Ｈｅｒ
ｎａｌｓｔｅｅｎｓ、Ｊ。

Ｐ、　、Ｖａｎ　　Ｍｏｎ’ｔａｇｕｅ、Ｍ、　、ａｎ
ｄ　　５ｃｈｅｌｌ、Ｊ、　）（１９８１）ジェイ・モ
ル・アブル・ジェネト（Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇ
ｅｎｅｔ、　）Ｌ　　Ｉ　４９−１６４レルツ、ベイカ
ー、およびシェル（Ｌｏｒｚ、Ｈ，。

Ｂａｋｅｒ、Ｂ、　、ａｎｄ　　５ｃｈｅｌｌ、Ｊ、　
ＸＩ　９８５）モル・ジエン・ジェネト（Ｍｏ１．　Ｇ
ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　）Ｉ　９９．１７８−１８２ マリガ、プレズノヴイッッ、およびマートン（Ｍａｌｉ
ｇａ、Ｐ、　、Ｂｒｅｚｎｏｖｉｔｚｅ、Ａ、　ａｎｄ
　　Ｍａｒｔｏｎ、Ｌ。

Ｘ１９７３）ネイチュアー・ニュー・バイオ０（Ｎａｔ
ｕｒｅ　　Ｎｅｗ　　Ｂｉｏｌ、　）２４４．２９−３
０マニアチス、フリッブ、およびサムプルツク（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、Ｔ、　、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、　Ｆ、　、
ａｎｄ　　Ｓａｍｂｒｏ。

ｋ、Ｊ　、　）（１９８２）、モレキュラー・クローニ
ング；実験室マニュアル（コールド・スプリング・ハー
バ−、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバ−
ラボラトリ−） マートン、ウレムス、モレンジック、およびシルペルー
ト（Ｍａｒｔｏｎ、Ｌ、　、Ｗｕｌｌｅｍｓ、Ｇ、　　
Ｊ、　、Ｍｏ１ｅｎｄｉｊｋ、Ｌ、　ａｎｄ　　５ｃｈ
ｉｌｐｅｒｏｏｒｔ、Ｒ，Ａ、　Ｘｌ９７９）ネイチュ
アー（ロンドン）２７７、＋２９ラオおよびロジャース
（Ｒａｏ、Ｒ，Ｎ１．ａｎｄ　　Ｒｏｇｅｒｓ、Ｓ、　
Ｇ、　ＸＩ　９７９）ジーン７．７９−８２スタニツシ
ユ、ベネット、およびリッチモンド（Ｓｔａｎｉｓｉｃ
ｈ、Ｖ、　Ａ、　、Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｐ、　Ｍ、　ａｎ
ｄＲｉｃｈｍｏｎｄ、Ｍ、　Ｈ，ＸＩ　９７７）ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジ−１２９，１２７７−１２
３３ヴイエイラおよびスプリング（Ｖ　１ｅｉｒａ、　
Ｊ　、　、ａｎｄ　　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、　）（１９
Ｂ　２）ジーン１９．２５サムブリスキー、ジョース、
ジェネテロ、リーマンス、ファン・モンターニュおよび
シェル（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ、Ｐ、　、Ｊｏｏｓ、Ｈ，
、Ｇｅｎｅｔｅｌｌｏ、Ｃ，、Ｌｅｅｍａｎｓ、Ｊ、　
、Ｖａｎ　　Ｍｏｎｔａｇｕ、Ｍ、　、ａｎｄ　　５ｃ
ｈｅｌｌ。

Ｊ、Ｘ１９８３）ＥＭＢＯＪ、２．２１４３−シモエン
ス、アリオッテ、メンデル、マラー、シュマン、ファン
・リジェベッテンス、シェル、ファン・モンターニュ、
およびインゼ（Ｓ　ｉｍｏｅｎｓ。

Ｃ，、Ａ１１ｉｏｔｔｅ、Ｔ、　、Ｍｅｎｄｅｌ、Ｒ，
、Ｍｕｌｌｅｒ、Ａ。

、Ｓｃｈｕｍｎｎ、Ｊ、　、Ｖａｎ　　Ｌｉｊｓｅｂｅ
ｔｔｅｎｓ、Ｍ、　、５ｃｈｅｌｆ、Ｊ、　、Ｖａｎ　
　Ｍｏｎｔａｇｕ、Ｍ、　ａｎｄ　　Ｉｎｚｅ、Ｄ、　
）（１９８６）ヌクレイツク・アシッズ・リサーチｆ４
．８０７３−８０９０ ボタ−マン（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ、　Ｊ　、　）Ｐ　ｈ
Ｄ　　ディサ−チージョン、Ｇ　ｈｅｈｔ州立大学、１
９８６ベルテンおよびシェル（Ｖ　ｅｌｔｅｎ、　Ｊ　
、　ａｎｄ　　Ｓ　ｃｈｅｌｌ、Ｊ、　）（Ｉ　９８５
）ヌクレイツク・アシッズ・リサーチＩ３．６９８１−
６９９８ ヤニツシユーペロン、ビエラおよびメツシング（Ｙａｎ
ｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅｒｒａ、Ｊ、　ａ
ｎｄ　　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ　、　Ｘｉ　９８５）ジー
ン３３．１０３−１１９コンツおよびシェル（Ｋｏｎｃ
ｚ、Ｃ，’ａｎｄ　　５ｃｈｅｌｌ。

Ｊ、　Ｘｉ　９８７）モル・ジエン・ジェネト（１９８
６）、２０４．３８３−３９６ ヘレラーエステレラ、ドウ　ブロック、メツセンス、ヘ
ルナルステーンス、ファン　モンターニュ、およびメツ
シング（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｅｒｅｌｌａ、Ｌ、　
。

Ｄｅ　　Ｂｌｏｖｋ、Ｍ、　、Ｍｅｓｓｅｎｓ、Ｅ、　
、Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓ。

Ｊ、　Ｐ、　、Ｖａｎ　　Ｍｏｎｔａｇｕ、Ｍ、　ａｎ
ｄ　　５ｃｈｅｌｌ、Ｊ。

Ｘ１９８３）ＥＭＢＯＪ、２．９８７−９９８ドウ　ブ
ロツック、ボタ−マン、ファンデヴイエル、ドックス、
トーエン、ゴゼル、モル、トンプソン、ファン　モンタ
ーニュ、およびリーマンス（Ｄｅ　　Ｂｌｏｖｋ、Ｍ、
　、Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ、Ｊ、　、Ｖａｎｄｅｗｉｅｌ
ｅ、Ｉ−１、Ｄｏｃｋｘ、Ｊ、　Ｔｈｏｅｎ、Ｃ，、Ｇ
ｏｓｓｅｌｅ、Ｖ。

、Ｍｏｖｖａ、Ｎ、　、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｃ，、Ｖａ
ｎ　　Ｍｏｎｔａｇｕ。

Ｍ、　ａｎｄ　　Ｌｅｅｍａｎｓ、Ｊ、　）（１９８７
）ＥＭＢＯＪ、９．２５１３−２５１８ ファン・デン・アイゼン、タウンセンド、ソー、および
ベッドプルツク（Ｖａｎ　　ｄｅｎ　　Ｅｉｚｅｎ、Ｐ
、　。

Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、Ｊ　、　、Ｌｅｅ、に、　ａｎｄ　
　Ｂｅｄｂｒｏｏｋ、Ｊ、　）（１９８５）プラント・
モレキュラー・バイオロジー、５．２９９−３０２ オデル、ナギおよびシュア（Ｏｄｅｌｌ、　Ｊ　、　、
Ｎａｇｙ。

Ｆ、　ａｎｄ　　Ｃｈｕａ、Ｎ、　Ｈ，ＸＩ　９８５）
ネイチュア−３１３，８１０

【図面の簡単な説明】

第１図は二成分系ベクターｐＧＶ９４１の組み立て模式
図、第２図はｐＧＶ９４４で形質転換されたセルライン
のＴ−ＤＮＡ構造を物理学的分析法で解析した結果であ
って、ＡはＴ−ＤＮＡ領域の制限地図、Ｂは各セルライ
ンのハイブリザイゼーションのパターン図、ＣはＴ−Ｄ
ＮＡのタンデム二重構造を示す模式図、第３図Ａは二成
分系ベクターｐＧＧＳＣ１７０１Ａ２の組み立て模式図
、Ｂは発現ベクターｐＧｓＦ１７６１Ａの組み立て模式
図である。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、２Ａ ０　　　　１　　　　２　　　　３　　　　４　　　　
５ｋｂＦＩＧ、２Ｂ ライン１　　フィン２　　ライン３　　ライン４　　ツ
イン５　ライン６貫２Ｖ１２Ｖ１２Ｖ１２Ｖ＋２Ｖ１２
Ｖの Ｑつ 、−。 ψ ロー 入具 α旨＝　　８　＝ ←　　−−７５，％

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、外来性ＤＮＡを植物細胞に導入するための二成分系
   ベクターであって、シュードモナスプラスミドｐＶＳ１
   の複製起原およびオクトピンＴｉ−プラスミドのＴ＿Ｌ
   −ＤＮＡの境界配列を含んだＴ−ＤＮＡ領域を含有する
   ベクター。 ２、さらに付加的に、境界配列間に植物の形質転換のた
   めの選択マーカー、転写調節シグナルおよびアダプター
   フラグメントを、また、所望により、細菌性選択マーカ
   ーを含有してなる第１項記載のベクター。 ３、植物の形質転換のための選択マーカーが、キメラ・
   カナマイシン耐性遺伝子である第２項記載のベクター。 ４、ｐＧＶ９４１（ＤＳＭ　Ｎｏ．３８９３）である第
   １−３項のいずれかに記載のベクター。 ５、さらに、所望の遺伝子産物をコードしている遺伝子
   をも含有している第１−４項のいずれかに記載のベクタ
   ー。 ６、ｐＧＶ９４４である第５項記載のベクター。 ７、ベクターｐＧＳＣ１７０１Ａ２（ＤＳＭ　Ｎｏ．４
   ２８６）。 ８、ベクターｐＧＳＦＲ７６１Ａ（ＤＳＭ　Ｎｏ．４２
   ８７）。 ９、第１−４項のいずれかに記載の二成分系ベクターを
   含有する、アグロバクテリウム内で安定に複製し得る遺
   伝子ライブラリー。 １０、第１−８項のいずれかに記載の二成分系ベクター
   で形質転換された宿主細胞。 １１、アグロバクテリウム内で安定に複製し得る二成分
   系ベクターの構築にシュードモナスプラスミドｐＶＳ１
   の複製起原を用いる方法。