JPS60227683A - 単子葉類の植物のゲノム中に異質ｄｎａの組込みの為の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、単子葉植物のゲノム中に外来性ＤＮＡ’に
組込む目的のために、ふされしい又は、ふされしく作ら
れた細菌により、その植物全感染させるか又はそれと共
に植物プロトプラス１ｆ（３） 培養する事による方法に関する。

の工うな多くの細菌が、遺伝的に植物細胞ケ自然に操作
できる。その細菌は、植物細胞壁に粘着しそして続いて
まだ説明されていない方法によって植物細胞中にＤＮＡ
フラグメントヲ挿入する○このＤＮＡフラグメント（Ｔ
−ＤＮＡＩは、細菌中ンズの場合において大プラスミド
（１２０〜１５０メガダルトン）の一部ハＴ１　−プラ
スミドと呼ばれそしてＡ・リゾジンズの場合Ｒｉ　−プ
ラスミドと呼ばれる０それから、’ｒ−ＤＮＡは植物細
胞の核ゲノム中に組み込まれる〔トマーショウＩＶＩＦ
。

などに、プロスイーディング　ナショナル　アカデミイ
　オブ　サイエンス（ＰｒｏｃｅｅｄｎｉｇＮａｔｉｏ
ｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ）、ア
メリカ７７、（１９８０）、ページ６４４８〜６４５２
〕、そのＴ−ＤＮＡ中に位置されたジーンが、ここで（
４） 発現しそしてその植物細胞は腫瘍細胞のよう（：行ｖＩ
ＪＪするだろう事を参照のこと〔オームス、Ｃ０などジ
ーン（Ｇｅｎｅ）　、１４．、（１，９８１）、ページ
３ｌ−５０Ｊ。他方、いかなるＤＮＡでもＴ一部位に連
結させる方法が開発されておりこの方法（ユおいては、
これをＴ−軸＝Ａ′と共Ｃ：同時に植物細胞中に挿入す
る事ができる（ヒル、Ｊ、など、ジャーナルオプ　ザ　
バクテリオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅＢａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　＋１５４．（１９８３Ｊ　、
ページ６０３〜７０１及びオーケマ、Ａ、など、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、３０３．（１９８３）　、ペ
ージ１７９〜１８０］。そのＴ−４イ＾′から０ｎｅ−
ジーンを取り出すことができる（ヒル、Ｊ、など、プラ
ントモレキュラー　バイオロジ４　（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）　＊２＊（”９８３）
　、ページ１５５〜１６３及びザンプルスキイ、Ｐ、な
ど、エムボ、Ｊ。

（ＥＭＢＯＪ、　）、２．（１９８３）、ページ２１４
３〜２１５０１゜これは細菌によって植物細胞（二確か
（＝伝達されるがしかしもはや腫瘍原性でないベクター
をもたらす〔ヒル、Ｊ、など、プラント　モレキュラー
　オブ　ザ　バイオロジイ（ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２．（１９８
３）。

ページ１５５〜１６３及びザンプルスキイ、Ｐ。

など、エムボ　Ｊ　、　（ＥＭＢＯＪ、　）　、　２．
　（１９８３）。

ページ２１４３〜２１５０）。これらの１不活性”ベク
ター（二より形質転換された植物細胞は新特質（Ｔ−、
Ｊ直に挿入されたジーン（二よってコードされた（ザン
プルスキー、Ｐ、ｆｒど、エムホＪ（ＥＭＢＯ’Ｊ、）
、２．（１９８３）ページ２１４３〜２１５０）を持つ
植物（二再生することができる。

もしりゾビウム細菌が上記のようなグラスミド又はこれ
らに由来するプラスミドを持つなら、それらはまた植物
細胞の遺伝的操作をすることができる（ツーカスなど、
１９７７）。現在、前記グラスミド（二加えてまた細菌
のＤＮＡの特別な他の配列、たとえば細胞壁【二細菌が
粘着のため（二様能する配列が必要である事が、自然３
二存在するリゾｅｆｙｂの菌株及びアグロバクテリウム
の突然変異体による実験かられかってきた。上記のこと
はアグロバクテリウムが植物ゲノム中にＴ−ＤＮＡを挿
入することができるただ１つの生物でなり事を意味する
。

もし他の細菌が、アグロバクテリウムから究極的に生じ
るプラスミド又はその誘導体を持つならその細菌は上記
のことが可能である。それらが、上で記載した必要な付
随したＤＮＡ−配列又は機能的な類似する物を利用し、
そしてＤＮＡの転移のため固有の妨げがないということ
が必要条件である。

さらにヴイルレンスのためのプラスミド　ジーン及びＴ
−ＤＮＡが実際（ニブラスミド上（−位置するがこと絶
対的Ｃ二必要でない事が以前（二実施したわれわれのグ
ループの研究でわかった。たとえばＴ−ＤＮＡは、細菌
染色体上に位置することができ、他方ヴイールレンスの
ためのプラスミド　ジーンは独立したプラスミド上口位
置することができる。

文献データー（二よると、上記糸は、双子葉植物だけが
アゲロバクチリアｔ−より腫瘍形成されるので、双子葉
類の植物（二とってだけベクターとじて用いる事ができ
る（リピンコッ）、Ｊ、Ａ、及びリピンコット、Ｂ、Ｂ
、アニュアル　リビュウオプ　マイクロバイオロジイ（
Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇＹ　）　ｅ　２９　＋　（１９７５）　ｓページ３
７７〜４０７〕。

単子葉類の植物の細胞壁は双子葉類の植物の細胞壁と異
なるという事実がその理由である（リビンコット、Ｊ、
Ａ、及びリピンコット、Ｂ、Ｂ。

（１９８０））。

”ハクテリアル　アドヒレンス　イン　レセプター　ア
ンド　レドグニイション６〔（ＢａｃｔｅｒｉａｌＡｄ
ｈｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｆｄ　
Ｒｅｄｏｇｎｉｔｉｏｎ”）（Ｅ、Ｈ，バーチリイ版〕
、ページ３７７〜３９６及びラオ、Ｓ、Ｓ、など、フィ
ジオロジカル　プラント（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　ｐｌａｎｔｓ　）　、　５６　＋　（１９８２）＋ベ
ージ３７４−３８０〕。そこで、現行の′意見は、前記
プラスミドが、単子葉植物の遺伝的操作のためのベクタ
ーとして適切でないという事である〔フラベル、Ｒ０及
びマシアス、Ｒ，ネイテユア−（Ｎａｔｕｒｅ　）　、
３０７．１９８４．ページ１０８〜１０９）。

（７） しかし単子葉植物中（二は穀物及びチューリップのよう
な球根植物、ラッパスイセン及びゆりなどのよう（二ひ
じよう（二重袋な農業作物及び園芸作物がある。下記（
二記載されている研究を単子葉植物のためのベクターと
してＴｉ−プラスミドを使用する可能性が無いとする現
行の意見が事実圧しいかどうか見分ける為Ｃ：実施した
。この研究においては、いろいろな種の単子葉植物をい
ろいろなタイプのＴｉ−又はＲｉ−プラスミドを別々（
−持っているか、そのようなプラスミドの組合せを有す
るか、いずれかのＡ、ツメファシ／ズの菌株ζ二よって
感染させた。驚くべき事（−１単子葉植物の細胞はＡ、
ツメファシンズ（二よって明確１：形質転換されたとい
う事がこの実験かられかった。これは、Ｔｉ−フ”ラス
ミド（又はそれらから由来したグラスミド〕が単子葉植
物の遺伝的操作の為にふされしいξいうことを最初に示
した。

実験： Ｔ−ＤＮＡ＋二は、植物ホルモンの合成を０ｎｅ−ジー
ンに関与する〔オームズ　Ｇ、など、ジーン（８） （Ｇｅｎｅ　）　＠　１４　＋　（１９８１）　＋ベー
ジ３３〜５０及びガーフィンクル　Ｄ、Ｊ、など、セル
（Ｃｅｌｌ）。

２７、（１９８１）、ページ１４３〜１５３〕ほかに、
”オーバイン″（ｏｐｉｎｅｓ″）の生合成（二関与す
る酵素をコードするジーンがまた存在する。オクトビン
及びツバリンのような腫瘍（二特徴的なアミノ酸の誘導
体が存在するしテンプ、Ｊ、及びゴールドマン、Ａ、″
モレキュラー　バイオロジイ　オブプラント　ツモア”
　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎ
ｔ　Ｔｕｍｏｒｓ　）　、　（１９８２）　、　（Ｇ−
カールｋ（ｆ　Ｊ　。

スケル版）、ページ４２７〜４４９〕。オーバインは、
普通の植物細胞中（＝は存在せずそして、それ故にたと
え腫瘍細胞の形成を導ひく形質転換の問題が無いにシて
も、植物細胞中でのＴ　−ＤＮＡの導入及び発現のため
の特徴的な指示体として考慮することができる。異なっ
たオーバインの生合成に関与する酵素のためのジーンを
担持する、いいろいろなタイプのＴ−ＤＮＡが存在する
。最っとも良く知られているものはオクトビン及びツバ
リンのそれぞれのＴ−ＤＮＡである。

ひしょうじ多くのテストが現在実施された。そロロファ
イタム　カペンス（ＣｈｌｏｒｏｐｈｙｔｕｍＣａｐｅ
ｎｓｅ　）］　の科からの、及びアマリリダシアＣＶ、
ペーパーホワイト〕科からの単子葉植物を傷菌株（二よ
っｔ感染させた。使用された菌株は次のものであった：
ＬＢＡ２８８（アヴイールラント；非１゛ｉ−プラスミ
ドＪ、ｌ、ＢＡＩＯＩＯ（オクトピン　Ｔｉ−プラスミ
ドを含む）、ＬＢＡ２３１．８（ツバリン　Ｔｉ−グラ
スミドを含む）、ＬＢＡｌ　０２０　（Ｒｉ−プラスミ
ドを含む）、ＬＢＡ２３４７（ツバリンＴｉ−グラスミ
ド＋Ｒｉ−プラスミドを含む）、ＬＢＡＩ　５１６　（
Ｖｉｒ−突然変異によるオクトピンＴｉ−プラスミドを
含む；アヴイールラント〕。数週間後、植物材料を感染
位置から取り出しセしてオーバインを分析した〔オッテ
ン、　Ｌ、　Ａ、　Ｂ、　Ｍ、及びスキルベニルート、
ＲｏＡ、バイオケミ力　イト　バイオフイズイカ　アク
タ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａ　Ａｃｔａ　）　ｅ５２７、（１９７８）、ページ４
９７〜５００）。ヴイールレント菌株（二よる感染の後
傷口の１わ暢月二しばしばわずかな肥厚が観察される事
Ｃ二注目すべきである。肥厚腫瘍は形成されなかった。

アヴイールレント菌株（二よる感染の場合においては、
肥厚を１つたく観察しなかった。傷つけられなかったか
又は傷つけられたが、しかし感染されなかった単子葉植
物からの植物材料は、オクトピンもツバリンのどちらも
含まないことが明らか（二なった。

オーバインはＬＢＡ２８８又はＬＢＡｉ５１６のアヴイ
ールラント菌株【：よって感染させられた植物から分離
した植物材料中にもまた発見されなかった。しかしなが
ら、ヴイール２ントＡ、ツメフ７シンズの菌株（：よっ
て感染させられた傷部位から得られた植物細胞は、はと
んど常（ニオ−バインを含有しているよう見えた。ツバ
リンＴｉ−プラスミド（ＬＢＡ２３１８．ＬＢＡ２３４
７）を持つ菌株（二よる感染の後、ツバリンは存在して
いるかのよう（二見えたが、オクトピンＴｉ−プラスミ
ド（１１） （ＬＢＡ　１０１０）を持つ菌株Ｃ二よる感染の後、オ
クトピンが存在しているよう（二見えた。

菌株ＬＢＡ２３４７＋二よって得られた結果は最っとも
再現性ある陽性結果を当えた。すべてのこが単子葉植物
細胞（二Ｔ−ＤＮＡを移行させることができ、そしてさ
らＣ二Ｔ−ＤＮ’Ａジーン（オーパインの生合成（−お
ける酵素（二幾分かの関与をする〕が単子葉植物細胞中
に発現する証拠を提供している。その結果、１′ｉ−プ
ラスミドは単子葉植物細胞のためのベクターとして適切
であるという事を結論することができる。さらし、その
結論は、オーパインの発現（−関与する調節域が、機能
領域でありそして単子葉植物細胞中で発現丁べきキメラ
ジーンを作るための建築石のようＬ：ひじよう１二ふさ
れしい事を引き出丁ことができる。

結果的（二、この発明は、単子葉植物中（二外米性ＤＮ
Ａを組込む目的のため（二、ふされしい又はふされしく
作られた細菌で二よりその植物を感染させるか又はそれ
と共に植物グロトプラストを培養す（１２） る事に関し、そして前記目的のため（二、元々アグロバ
クテリアム細菌から生じる、腫瘍−誘導プラスミド、た
とえばＴｉ−％しくはＲｉ−プラスミド、又はそれらの
誘導体、又はそれらの一部の利用から成る。

好葦しくは、アグロバクテリアム細菌を使する、この細
菌は、Ｔ−領域でな（Ｔｉ−（腫瘍誘導）プラスミドの
Ｖｉｒ−領域を持つ少なくとも１つのプラスミドを有し
すしてＶｉｒ−領域でなく、外来性ＤＮＡをその中（−
組み込れるＴｉ−領域を持つ少なくとも１つの他のプラ
スミドを有する。この発明の方法のため（二適当なアク
ロバクテリアム細菌、及びこれらの細菌を得ることがで
きる方法（二ついては、１だ公表されていないヨーロッ
パ特許出願８４２００２３９．６中（二すで（−権利を
請求した。

単子葉植物細胞中の外来性ジーンを発現するために、Ｔ
−ＤＮＡ−ジーンの調節部位、特Ｃ二、オクトビン合成
及びツバリン合成のためのジーンヲ使用することができ
る。

以下余白 ｒＪＪイ、　：：　＃　ｙ’＝’ｅＱ　（、−１，■、
３ン、ＣＪＢ−＋Ｊ、ラｊ、”ラドリアムロ：’７−フ
イ７　Ｌ７　／　”イ／ｒ＋ｊ　’、；”イｌｘ　７ａ
　＝７’ｘ　７７７５　＞、　ｂＥ　Ｌｆ　７゜特許出
願人 リジエクスユニｌ＼゛−シテイト　リ〜デン（外１１名
〕 特軒出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也 （１５） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，４識別記号　庁内整理番−（０発　明
　者　ゲールトリュイ　マル　オランダ国。

タ　シビリグ　バンス ログテレン ０発　明　者　ロベルタ　アドリアン　オランダ国。

シュイルペロルト　− リーデン、コンドルホルスト　１２６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物のゲノム中に外来性ＤＮＡ’Ｔｈ組込む目的の
   ためにふされしい又はふされしく作られた細菌によって
   これらの植物？感染させるか又はそれらと共に植物プロ
   トプラスト全培養することにより植物ゲノム中に外来性
   ＤＮＡ’に組込む方法であって、この目的の為にふされ
   しい又はふされしく作られた細菌によって単子葉類の植
   物を感染させ又は単子葉植物のプロトプラストラそれら
   と共に培養し、それらの細菌は、もともとアグロバクテ
   リアム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又は次のような
   細菌に由来する１つ又は複数の腫瘍−誘導プラスミド、
   又はそれらの誘導体を持ち、前記細菌は細菌ＤＮＡ中の
   他の位置に組込まれた、上記プラスミドから生じるＴ−
   ＤＮＡ及び／又は上記プラスミドから生じるヴイールラ
   ンスジーンを持つ事を特徴とする方法。 ２、前記感染又は培養のためにアグロバクテリアム又は
   リゾビアム細菌？使用する特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ３．１つ又は複数のＴｉ　−もしくはＲｉ−プラスミド
   又はそれらの誘導体？持つ細菌を使用する特許請求の範
   囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４、使用された前記細菌は、Ｔ−領域中に組込まれた外
   来性ＤＮＡとともにプラスミ）”ｐＴｉＢ６及びそれら
   が組込まれていないプラスミドＲ７７２から構成された
   安定な共一体ｆヒプラスミド？持つ特許請求の範囲第３
   項に記載の方法。 ５、Ｔ−領域でなくＴｉ−（腫瘍誘導）プラスミドのＶ
   ｌｒ−領域ケ持つ少なくとも１つのプラスミドとＶｉｒ
   −領域でなく外来性ＤＮＡ’ｉその中に組入れているＴ
   −領域を持つ少なくとも１つの他のプラスミドとを含む
   細菌？使用する特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれ
   か１項に記載の方法。 ６、前の特許請求のどれかによる方法？適用する事に工
   って得られた、元の植物又は植物細胞の遺伝的性質が変
   えられている単子葉植物及び植物細胞。 ７、特許請求第１〜第５項のどれかによる方法の適用に
   よって得られた細胞全培養しそして所望の物質全分離す
   る事を特徴とする化学的及び／又は医薬的外生成物の製
   造方法。 ８、前記培養？発酵及び場合に工ってはそれに続く固定
   ｆヒによって実施する特許請求の範囲第７項に記載の方
   法。 ９、Ｔ−ＤＮＡ−ジーン、特にオクトピン合成及びツバ
   リン合成の為のジーンのタンパク質コート領域の前後に
   配置された調節部位を単子葉植物細胞におけて外米性ジ
   ーン會発現する為に使用する特許請求の範囲第１項〜第
   ５項及び第７項又は第８項のどれかに記載の方法。