CN101508996A - 利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法 - Google Patents

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Abstract

公开的材料和方法提供了与在植物中天然含有的多核苷酸或预先作为转基因引入到植物中的多核苷酸充分不同的多核苷酸分子，以允许在植物育种方法或植物转化方法中的性状堆积。本公开内容也提供了在植物中探测本发明的多核苷酸的方法和组合物。本发明涉及一种利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法。

Description

利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法
本申请是国际申请日为2003年7月10日的国际申请PCT/US2003/021551进入中国、申请号为03822167.5的题为“利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求于2002年7月18日提交的序号为60/396,665的美国临时申请的优先权。
技术领域
本发明与植物基因工程有关。更具体一点说，与构建人工多核苷酸的方法和用于减少植物中转基因沉默的方法相关。本发明也与含有该人工多核苷酸的植物细胞及从该细胞再生的植物相关，其中该植物细胞是被转化来表达该人工多核苷酸的。
背景技术
异源基因可以从除了将要转化进入的植物以外的来源分离得到或者这些基因可以被修饰或设计来使其具有不同的或改良的性质。植物基因工程的特别理想的目标性状和性质包括但不局限于对于昆虫，真菌疾病及其它害虫和能引发疾病的物质的抗性，对于除草剂的耐受性，增强的稳定性或保存期，产量，环境压力耐受性以及营养增强。
产生新的基因和蛋白的常规的分子生物学方法一般包括随机或定向的诱变。随机诱变的一个例子是作为“DNA改组”已知的一种重组技术，如在美国专利5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,837,458和国际申请WO98/31837，WO99/65927中所公开的，此处将其整体引入作为参考。一种可供选择的分子进化的方法包括体外诱变的交叉延伸过程(StEP)和核酸分子序列的重组，如在美国专利5,965,408中公开的，此处将其引入作为参考。定向诱变的例子是在多肽特定位点引入点突变。
当异源基因是来自于非植物来源的时候可用的可供选择的方案是设计人工杀虫基因，该基因使用玉米植物密码子使用表中最常用的密码子(Koziel等，1993，Biotechnology 11，194-200)。Fischhoff和Perlak(美国专利号5,500,365，此处将其引入作为参考)报道与在农作物中相比，当多核苷酸序列被修饰来减少去稳定化序列的出现之后苏云金芽孢杆菌(Bacillas thuringiensis)(Bt)杀虫蛋白的表达较高。在此处对于野生型的Bt多核苷酸序列的修饰是必要的，因为全长的野生型Bt多核苷酸序列不能在植物中表达在农业上起作用的足够水平的杀虫蛋白。
异源基因被克隆到适于转化植物的载体中。将异源基因整合到植物基因组中所用的转化和再生技术在本领域中已经为人们所熟知。在此之后基因可以在植物细胞中表达来展现附加的特征或性状。然而，通常作为转基因表达情况良好的异源基因当在同一植物中有超过一个拷贝的同样的基因表达的时候可能会发生基因沉默。这种情况可能发生在第一个异源基因与植物中的一个内源基因DNA序列十分相似的时候。其它的例子包括当一种转基因植物随后与其它含有相同或相似转基因的转基因植物杂交的时候或该转基因植物利用含有相同或相似基因的植物表达盒再一次转化的时候。相似的，如果性状堆积使用相同的遗传因子基因沉默也会发生，这些遗传因子是用于指导目标转基因表达的。为了堆积性状，应该利用不同的基因和遗传因子的组合建立稳定的转基因系来避免基因沉默。
N-膦酰甲基甘氨酸，也被称为草甘膦，是一种为人熟知的在植物物种中具有广谱活性的除草剂。草甘膦是
Figure A200810165671D0005122949QIETU
(Monsanto Co.)的活性成分，是一种安全的除草剂在环境中具有所需的较短的半衰期。当将其作用于植物的表面时，草甘膦会移动遍布植物。草甘膦由于其抑制莽草酸途径而具有植物毒性，该途径提供合成芳族氨基酸的前体。草甘膦抑制5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)。
草甘膦的耐受性也可以通过表达EPSPS的变体来达到，这些变体具有低的与草甘膦的亲和力并且因此在草甘膦存在的情况下保持其催化活性(美国专利号5,633,435，此处将其引入作为参考)。植物组织中能够降解草甘膦的酶(美国专利号5,463,175)也可以使植物获得对于草甘膦的细胞耐受性。这些基因被用来产生能够耐受草甘膦的转基因农作物，因此可以使草甘膦用于有效地野草控制并且使其对农作物的危害降到最低。例如草甘膦耐受性已经通过基因工程的方法加入玉米(美国专利号5,554,798)，小麦(美国专利申请号20020062503)，大豆(美国专利申请号20020157139)和canola(WO9204449)中，所有这些被引入作为参考。草甘膦耐受性的转基因和对其它除草剂耐受性的转基因，例如bar基因，(Toki等PlantPhysiol.，100：1503-1507，1992；Thompson等EMBO J.6：2519-2523，1987，phosphinothricin acetyltransferase，BAR geneisolated from streptomyces；DeBlock等EMBO J.6：2513-2522，1987，glufosinate herbicide)也可以用作选择性标记或评价标记并且可以提供一种对于连接有其它农业上有用的性状的植物进行选择的表型。
在本领域中所需要的是设计在植物中表达以改善农业上有用性状的基因的方法，该方法在多拷贝插入并与植物内源基因重组时避免基因沉默。
附图说明
图1.将两个人工的水稻EPSPS版本(OsEPSPS_AT，OsEPSPS_ZM)和天然的水稻EPSPS(OsEPSPS—Nat)的多核苷酸序列上的变化进行的堆积(pilenp)比较，每一个修饰的多肽都是草甘膦抗性的。
图2.将天然的(ZmEPSPS_Nat)和人工的(ZmEPSPS_ZM)玉米EPSPS的多核苷酸序列进行的堆积(pilenp)比较，每一个修饰的多肽都是草甘膦抗性的。
图3.将天然的(GmEPSPS_Nat)和人工的(GmEPSPS_GM)大豆EPSPS的多核苷酸序列进行的堆积(pilenp)比较，每一个修饰的多肽都是草甘膦抗性的。
图4.将天然的BAR基因(BAR1_Nat)和两个人工的利用玉米(Zeamays)密码子偏倚性(BAR1_ZM)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)密码子偏倚性(BAR1_AT)制成的版本的多核苷酸序列上的变化进行的堆积比较。
图5.将CTP2和CP4EPSPS的天然的(CTP2CP4_Nat)和人工的版本(CTP2CP4_AT，CTP2CP4_ZM，和CTP2CP4_GM)的多核苷酸序列上的变化进行的堆积比较。
图6.pMON54949的质粒图谱。
图7.pMON54950的质粒图谱。
图8.pMON30151的质粒图谱。
图9.pMON59302的质粒图谱。
图10.pMON59307的质粒图谱。
图11.pMON42411的质粒图谱。
图12.pMON58400的质粒图谱。
图13.pMON58401的质粒图谱。
图14.pMON54964的质粒图谱。
图15.pMON25455的质粒图谱。
图16.pMON30152的质粒图谱。
图17.pMON54992的质粒图谱。
图18.pMON54985的质粒图谱。
图19.pMON20999的质粒图谱。
图20.pMON45313的质粒图谱。
图21.pMON59308的质粒图谱。
图22.pMON59309的质粒图谱。
图23.pMON59313的质粒图谱。
图24.pMON59396的质粒图谱。
图25.pMON25496的质粒图谱。
序列表简述
SEQ ID NO：1     OsEPSPS_TIPS       水稻的EPSPS蛋白序列经过修
                                    饰使其具有草甘膦抗性并具有
                                    叶绿体转运肽。
SEQ ID NO：2     OsEPSPS_Nat水稻天然EPSPS多核苷酸序
                                    列，该多核苷酸序列经过修饰
                                    来编码草甘膦抗性蛋白。
SEQ ID NO：3     OsEPSPS_AT         一种水稻人工EPSPS多核苷酸
                                    序列，该多核苷酸序列是利用拟
                                    南芥属(Arabidopsis)密码子
                                    使用表和本发明的方法获得的，
                                    并且进一步修饰使其编码草甘
                                    膦抗性蛋白。
SEQ ID NO：4     OsEPSPS_ZM         一种水稻人工EPSPS多核苷酸
                                    序列，该多核苷酸序列是利用玉
                                     米密码子使用表和本发明的方
                                     法获得的，并且进一步修饰使其
                                     编码草甘膦抗性蛋白。
SEQ ID NO：5      GmEPSPS_IKS大豆的EPSPS蛋白序列经过修
                                     饰使其具有草甘膦抗性并具有
                                     叶绿体转运肽。
SEQ ID NO：6      GmEPSPS_Nat大豆天然EPSPS多核苷酸序
                                     列，该多核苷酸序列经过修饰来
                                     编码草甘膦抗性蛋白。
SEQ ID NO：7      GmEPSPS_GM         一种大豆人工EPSPS多核苷酸
                                     序列，该多核苷酸序列是利用大
                                     豆(Glycine max)密码子使用
                                     表和本发明的方法获得的，并且
                                     进一步修饰使其编码草甘膦抗
                                     性蛋白。
SEQ ID NO：8      ZmEPSPS_TIPS       玉米的EPSPS蛋白序列经过修
                                     饰使其具有草甘膦抗性并具有
                                     叶绿体转运肽。
SEQ ID NO：9      ZmEPSPS_Nat玉米天然EPSPS多核苷酸序
                                     列，该多核苷酸序列经过修饰来
                                     编码草甘膦抗性蛋白。
SEQ ID NO：10     ZmEPSPS_ZM         一种玉米人工EPSPS多核苷酸
                                     序列，该多核苷酸序列是利用玉
                                     米密码子使用表和本发明的方
                                     法获得的，并且进一步修饰使其
                                     编码草甘膦抗性蛋白。
SEQ ID NO：11     CTP2               从拟南芥属EPSPS基因得来的
                                     叶绿体转运肽2的蛋白序列。
SEQ ID NO：12     CTP2_Nat           从拟南芥属EPSPS得来的叶绿
                                     体转运肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：13     CTP2_AT            人工编码CTP2的多核苷酸序
                                     列，该多核苷酸序列是利用拟南
                                      芥属密码子使用表和本发明的
                                      方法获得的。
SEQ ID NO：14    CTP2_ZM              人工编码CTP2的多核苷酸序
                                      列，该多核苷酸序列是利用玉米
                                      密码子使用表和本发明的方法
                                      获得的。
SEQ ID NO：15    CP4EPSPS             从农杆菌属(Agrobacterium)
                                      菌株CP4得来的草甘膦抗性
                                      EPSPS蛋白的蛋白序列。
SEQ ID NO：16    CP4EPSPS_Nat         编码CP4EPSPS蛋白的天然的
                                      多核苷酸的多核苷酸序列(美国
                                      专利号5,633,435)。
SEQ ID NO：17    CP4EPSPS_AT编码CP4EPSPS的人工多核苷
                                      酸的多核苷酸序列，该多核苷酸
                                      序列是利用拟南芥属密码子使
                                      用表和本发明的方法获得的。
SEQ ID NO：18    CP4EPSPS_ZM编码CP4EPSPS的人工多核苷
                                      酸的多核苷酸序列，该多核苷酸
                                      序列是利用玉米密码子使用表
                                      和本发明的方法获得的。
SEQ ID NO：19    BAR1                 膦丝菌素乙酰转移酶的蛋白序
                                      列。
SEQ ID NO：20    BAR1_Nat             从链霉菌属(Streptomyces)
                                      中分离的编码膦丝菌素乙酰转
                                      移酶的天然多核苷酸的多核苷
                                      酸序列。
SEQ ID NO：21    BAR1_AT              编码膦丝菌素乙酰转移酶的人
                                      工多核苷酸的多核苷酸序列，该
                                      多核苷酸序列是利用拟南芥密
                                      码子使用表和本发明的方法获
                                      得的。
SEQ ID NO：22    BAR1_ZM              编码膦丝菌素乙酰转移酶的人
                                      工多核苷酸的多核苷酸序列，该
                                      多核苷酸序列是利用玉米密码
                                      子使用表和本发明的方法获得
                                      的。
SEQ ID NO：23    CP4EPSPS_Syn         具有双子叶植物密码子偏倚性
                                      的人工多核苷酸的多核苷酸序
                                      列。
SEQ ID NO：24    CP4EPSPS_AT_p1       用于诊断CP4EPSPS_AT多核
                                      苷酸的DNA引物分子。
SEQ ID NO：25    CP4EPSPS_AT_p2       用于诊断CP4EPSPS_AT多核
                                      苷酸的DNA引物分子。
SEQ ID NO：26    CP4EPSPS_ZM_p1       用于诊断CP4EPSPS_ZM多核
                                      苷酸的DNA引物分子。
SEQ ID NO：27    CP4EPSPS_ZM_p2       用于诊断CP4EPSPS_ZM多核
                                      苷酸的DNA引物分子。
SEQ ID NO：28    CP4EPSPS_Nat_p1      用于诊断CP4EPSPS_Nat多
                                      核苷酸的DNA引物分子。
SEQ ID NO：29    CP4EPSPS_Nat_p2      用于诊断CP4EPSPS_Nat多
                                      核苷酸的DNA引物分子。
SEQ ID NO：30C   P4EPSPS_Syn_p1       用于诊断CP4EPSPS_Syn多
                                      核苷酸的DNA引物分子。
SEQ ID NO：31    CP4EPSPS_Syn_p1      用于诊断CP4EPSPS_Syn多
                                      核苷酸的DNA引物分子。
SEQ ID NO：32    ZmAdh1引物1          用于诊断内源玉米Adh1基
                                      因的对照引物1。
SEQ ID NO：33    ZmAdh1引物2          用于诊断内源玉米Adh1基
                                      因的对照引物2。
SEQ ID NO：34    GNAGIAMKS            为植物提供草甘膦抗
                                      性的EPSPS基序。
SEQ ID NO：35    CTPEPSPSCP4_GM       利用大豆的密码子使用表制
                                      备的编码CP4EPSPS蛋白的
                                      人工的多核苷酸的多核苷酸
                                             序列。
发明内容
本发明提供了设计能编码目标蛋白的人工多核苷酸序列的方法和组合物，其中该人工多核苷酸是与植物中自然产生的多核苷酸或已经作为转基因转入植物的多核苷酸基本不同的并且该人工多核苷酸和多核苷酸编码基本相同的多肽。
本发明的人工多核苷酸能够编码能够为含有DNA构建体的转基因植物提供在农业上可以应用的表型的蛋白，该DNA构建体包括该人工多核苷酸。在农业上有用的表型包括：干旱耐受性，提高的产量，寒冷耐受性，对疾病的抗性，对昆虫的抗性和对除草剂的耐受性，但不局限于此。
本发明的另一个方面是能够编码除草剂抗性EPSPS蛋白，膦丝菌素乙酰转移酶蛋白，叶绿体转运肽蛋白的人工多核苷酸。在本发明优选的实施方案中，该人工多核苷酸分子选自SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：35。
本发明提供的DNA构建体包括：在植物中能起作用的启动子分子，该分子能够可操作地连接于本发明的人工多核苷酸分子上，能够可操作地连接于转录终止区域，其中该人工多核苷酸选自SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：35。
本发明进一步提供的DNA构建体包括：在植物中能起作用的启动子分子，该分子能够可操作地连接于能够编码叶绿体转运肽的人工多核苷酸分子上，能够可操作地连接于异源草甘膦抗性EPSPS，能够可操作地连接于转录终止区域，其中该人工多核苷酸与已知的能够编码同样的叶绿体转运肽的多核苷酸在多核苷酸序列上是基本不同的。
本发明提供的DNA构建体包括至少两个表达盒，第一个表达盒包括能够在植物中起作用的启动子分子，该分子能够可操作地连接于本发明的人工多核苷酸分子，能够可操作地连接于转录终止信号区域，第二个表达合包括包括能够在植物中起作用的启动子分子，该分子能够可操作地连接于多核苷酸分子，该多核苷酸分子与提到的人工多核苷酸编码基本同样的多肽但是在多核苷酸序列上与该人工多核苷酸的相似性小于85％，且该分子能够可操作地连接于转录终止信号区域。
本发明提供包含本发明的DNA构建体的植物细胞，植物或其后代。令人特别感兴趣的是选自小麦，玉米，水稻，大豆，棉花，马铃薯，canola，草坪草，森林树，高粱，蔬菜作物，观赏植物，饲料作物和水果作物的后代植物。
本发明能够减少在转基因植物繁殖过程中基因沉默的方法包括以下的步骤：
a)构建与已知的能够编码基本相同蛋白的多核苷酸基本不同的人工多核苷酸，并且
b)构建包括该人工多核苷酸分子的DNA构建体，并且
c)将该DNA构建体转化入植物细胞，并且
d)使该植物细胞再生成转基因植物；并且
e)将该转基因植物与能育的植物杂交，其中该能育的植物包括能够编码与该人工多核苷酸分子所编码的蛋白基本相同的蛋白的多核苷酸分子，并且其中该人工多核苷酸分子与该多核苷酸分子基本不同。
本发明的另一个方面是包括两种多核苷酸的转基因植物细胞，其中至少一种多核苷酸是转基因的并且两种多核苷酸编码基本相同的蛋白而且在多核苷酸序列上两者的相似性小于85％。
本发明的另一个方面是在转基因植物生产的过程中减少基因沉默的方法，包括以下的步骤：
a)构建与已知的能够编码基本相同蛋白的多核苷酸基本不同的人工多核苷酸，并且
b)构建第一个包括该人工多核苷酸分子的DNA构建体，并且
c)将该DNA构建体转化入植物细胞；并且
d)使该植物细胞再生成转基因植物；并且
e)利用第二个包括多核苷酸分子的DNA构建体再次转化来自于该转基因植物的细胞，其中多核苷酸分子能够编码与该人工多核苷酸编码的蛋白基本相同的蛋白并且该多核苷酸分子与该人工多核苷酸分子在多核苷酸序列基本上不同；并且
f)将步骤d中的该细胞再生成同时包含所提到的人工多核苷酸和提到的多核苷酸的转基因植物。
本发明进一步提供选择已经转化了本发明的DNA构建体的植物的方法，包括以下步骤：
a)利用本发明的DNA构建体转化植物细胞，并且
b)将该植物细胞在含有除草剂的选择性培养基中培养来选择性地杀死没有转化该DNA构建体的细胞，其中该除草剂选自：草甘膦和草铵膦；并且
c)将该植物细胞再生成能育的植物。
本发明的另一个方面是探测在转基因植物细胞，植物或其后代中的人工多核苷酸的方法，包括以下步骤：
a)利用DNA分子接触从该植物细胞，植物或其后代中分离得到的DNA样品，其中该DNA分子包括一对DNA分子中的至少一个，该DNA分子当用于核酸扩增的时候能够产生可诊断人工多核苷酸分子的扩增子，该人工多核苷酸分子选自：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：35。
a)进行核酸扩增反应，因此可以产生扩增子；并且
b)检测该扩增子。
进行上述的检测方法所需要的试剂包括但不局限于：能够特异性地与人工多核苷酸分子杂交的DNA分子，该人工多核苷酸分子选自：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22；以及分离的DNA分子，该分离的DNA分子选自SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
本发明提供包括DNA分子的植物及后代，该DNA分子选自：SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
本发明提供成对的DNA分子，这些DNA分子对选自：第一个DNA分子和第二个DNA分子，其中该第一个DNA分子是SEQ ID NO：24或其互补序列并且该第二个DNA分子是SEQ ID NO：25或其互补序列并且该对DNA分子在用于DNA扩增方法中时能够产生扩增子，以及另一个第一个DNA分子和第二个DNA分子，其中该第一个DNA分子是SEQ IDNO：26或其互补序列并且该第二个DNA分子是SEQ ID NO：27或其互补序列并且该对DNA分子在用于DNA扩增方法中时能够产生扩增子，其中该扩增子能够诊断在转移因植物的基因组中本发明的人工多核苷酸的存在。
本发明提供植物及其后代，该植物及其后代通过DNA扩增的方法鉴定在其基因组中含有DNA分子，该DNA分子选自：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
本发明提供和预期DNA检测试剂盒，该试剂盒包括：至少一个足够长以致能够与人工多核苷酸特异性同源或互补的DNA分子，其中该人工多核苷酸选自：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，其中该DNA分子用作DNA探针或DNA引物；或者至少一个与DNA引物同源或互补的DNA分子，该DNA引物选自SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
本发明进一步提供检测在DNA样品中编码草甘膦抗性EPSPS的人工多核苷酸的存在的方法，该方法包括：
a)从植物中提取DNA样品；并且
b)利用标记的足够长以致能够与人工多核苷酸特异性同源或互补的DNA分子来接触该DNA样品，其中该人工多核苷酸选自：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，其中该标记的DNA分子是DNA探针；并且
c)使该样品和DNA探针处于严格的杂交条件下；并且
d)检测杂交到该DNA样品上的DNA探针。
本发明提供分离的编码EPSPS酶的多核苷酸，该EPSPS酶包括SEQID NO：34的基序。本发明提供包含编码具有SEQ ID NO：34的基序的EPSPS酶的多核苷酸的DNA构建体。作为表达具有SEQ ID NO：34的基序的EPSPS酶的结果，植物细胞，植物或其后代具有草甘膦耐受性也是本发明的一个方面。
具体实施方式
提供以下的定义以更好地定义本发明并且引导那些本领域技术人员实践本发明。除非另外的注释，术语按照那些在相关领域技术人员常规的用法来理解。分子生物学的普通术语的定义也可以在Rieger等，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag：New York，(1991)；以及Lewin，Genes V，OxfordUniversity Press：New York，(1994)中找到。所用的DNA碱基的命名法是在37CFR§1.822提出的。所用的氨基酸残基命名法是标准的单字母或三字母命名法。
“氨基酸替代”，“氨基酸变体”优选是在蛋白的任意位置将单个氨基酸残基替代为另一个氨基酸残基。替代，缺失，插入或其任何的联合使用可以联合起来以获得最终的构建体。
本发明所用的“人工多核苷酸”是按照本发明的方法设计的DNA序列，并且作为分离的DNA分子来制造以用于DNA构建体中来在宿主细胞中表达蛋白，并且用于克隆到合适的构建体或对于本领域技术人员所知的其它应用。为了这些目的可以使用的计算机程序包括但不局限于University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI 53711，Genetics Computer Group(GCG)Inc.的Sequence AnalysisSoftware Package中的“BestFit”或者“Gap”程序。该人工多核苷酸可以通过本领域中已知的一种或更多的方法构建，这些方法包括但不局限于重叠PCR。本发明的人工多核苷酸与编码相同或几乎相同的蛋白的其它的多核苷酸基本不同。
术语“嵌和的”是指融合的核酸或蛋白序列。嵌合的核酸编码序列是由两个或更多的序列按照阅读框架连接在一起组成的并且可以编码嵌合蛋白。嵌合基因是指来源于包括基因在内的异源来源的多遗传因子。
短语“编码序列”，“可读框”和“结构序列”指连续有序的编码蛋白，多肽或肽序列的核酸三联体区域。
“密码子”是指限定特定氨基酸的三个核苷酸的序列。
“密码子使用”或“密码子偏倚性”是指在生物编码序列中编码氨基酸的密码子使用的频率。
“互补性”和“互补”当用于核酸序列的时候是指在相反的DNA或RNA链上腺嘌呤对胸腺嘧啶(在RNA中为尿嘧啶)和胞嘧啶对鸟嘌呤的特异性的结合。
“构建体”是指彼此可操作地连接在一起组成重组的DNA分子的异源遗传因子并且可以包括提供DNA多核苷酸分子在宿主细胞中表达的因子以及维持该构建体的因子。
“C-末端区域”是指从肽，多肽或蛋白链的中间到具有游离的羧基的氨基酸的末端的区域。
用于此处的术语“不同”是指对于编码相同或基本相同的蛋白或多肽的多核苷酸分子的比较。四字母遗传密码(A，G，C和T/U)构成指导t-RNA按照mRNA模板将氨基酸组装成多肽的三字母密码子。对于同一个氨基酸具有不止一个密码子被称为简并。简并密码子被用来构建编码相同多肽的基本不同的多核苷酸，其中这些分子具有完全长度的核苷酸序列，在该序列中它们的相同性小于85％并且没有超过23个核苷酸的核苷酸序列是相同的。
术语“编码DNA”是指编码此处讨论的任何蛋白的染色体DNA，质粒DNA，cDNA或人工DNA多核苷酸。
术语“内源”是指从生物或细胞中获得的材料。
“内切核酸酶”是指在内部水解双链DNA的酶。
“外源的”是指从生物或细胞外获得的材料。这一般是指用于产生转化或转基因宿主细胞和植物的核酸分子。
“外显子”是指实际翻译成蛋白的基因部分，即编码序列
术语“表达”是指多核苷酸的转录或翻译产生相应的基因产物，RNA或蛋白。
“片段”。基因片段是全长多核酸分子的一部分，该部分的最小长度需要能够转录成RNA，翻译成肽或作为探针或引物用于DNA检测方法中。
术语“基因”是指染色体DNA，质粒DNA，cDNA，人工DNA多核苷酸或其它能够编码肽，多肽，蛋白或RNA分子的DNA以及在编码序列侧面参与表达调节的遗传因子。
术语“基因组”当用于病毒时包括所有的包含在病毒壳体中的核酸序列。术语“基因组”当用于细菌时包含细菌宿主细胞中的染色体和质粒。因此本发明中导入细菌宿主细胞的编码核酸序列可以是染色体整合的或质粒定位的。术语“基因组”当用于植物细胞时不仅包括在核内发现的染色体DNA也包括在细胞内亚细胞成分中发现的细胞器DNA。因此本发明中导入植物细胞的核酸可以是染色体整合的或细胞器定位的。
术语“草甘膦”是指N-膦酰甲基甘氨酸及其盐，草甘膦是
Figure A200810165671D00171
除草剂(Monsanto Co.)的活性成分。除非额外提到，利用“草甘膦”处理植物是指利用
Figure A200810165671D00172
或Roundup 
Figure A200810165671D00173
除草剂制剂处理植物。草甘膦作为N-膦酰甲基甘氨酸及其盐(没有被制备为
Figure A200810165671D00174
除草剂)是用来选择具有草甘膦耐受性的细菌和植物或用来进行体外生化分析确定酶抗性的合成的培养基的成分。
“外源DNA”序列是指从外界来源或物种获得的多核苷酸序列，或如果从相同的来源获得，也是对该多核苷酸的起初的形式进行修饰而获得。
“内源DNA”是指从与受体细胞相同来源获得的DNA。
“杂交”是指一条核酸链通过碱基配对与互补的链结合。杂交是当两条核酸链上的互补序列彼此结合时发生的。本发明的核酸探针和引物是在严格的条件下与目标DNA序列进行杂交的。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用来鉴定在样品中来自转基因事件的DNA的存在。在一定的环境下核酸分子或其片段能够特异地与另外核酸分子进行杂交。如此处用到的，如果两个核酸分子能够形成反向平行的双链核酸结构那么可以说这两个分子能够特异性地相互杂交。如果一个核酸分子与另一个核酸分子能够展现完全的互补性那么它们被称为“互补”。如在此处所用的，当其中一个分子的每一个核苷酸都与另一个分子的核苷酸互补的时候这两个分子被称为展现“完全互补性”。如果两个分子能够彼此杂交并具有足够的稳定性的时候这两个分子被称为“最小互补”，其中足够的稳定性是指至少在常规的“低严格性”条件下能够使它们相互退火。相似地，如果分子能够彼此杂交并具有足够的稳定性的时候这两个分子被称为“互补”，其中足够的稳定性是指至少在常规的“高严格性”条件下能够使它们相互退火。常规的严格条件如在Sambrook等1989，和Haymes等，In：Nucleic AcidHybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)所描述的一样，此处将这些参考文献整体引入作为参考。因此与完全互补有一定的偏离是允许的，只要这样的偏离没有使这些分子完全丧失形成双链结构的能力。为了使核酸分子作为引物或探针起作用，它只要在序列上有足够的互补性以便在所使用的特定溶剂和盐浓度的情况下能够形成稳定的双链结构即可。
如此处所用，基本同源的序列是能够特异性杂交到该核酸序列的互补序列的核酸序列，并且是在高严格的条件下进行比较的。术语“严格条件”是关于在使用特异的杂交方法使核酸探针与目的核酸杂交(即，对于特定的目标核酸序列)的功能性定义，其中特异的杂交方法在Sambook等1989，在9.52-9.55中有所讨论。也可见，Sambrook等，1989在9.47-9.52，9.56-9.58此处将该参考文献整体引入作为参考；Kanehisa，(Nucl.Acids Res.12：203-213，1984，此处将该参考文献整体引入作为参考)以及Wetmur及Davidson，(J.Mol.Biol.31：349-370，1988，此处将该参考文献整体引入作为参考)。因此本发明的核苷酸序列可以由于其选择性的与互补的一段DNA片段形成双链体分子的能力而得到应用。根据设想的应用的不同，可能需要使用不同的杂交条件来达到探针对于目的序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，一般需要使用相对严格的条件来形成杂交物，例如，将会选择相对低盐和/或高温的条件，例如可使用大约0.02M到大约0.15M NaCl在大约50℃到大约70℃的温度下。严格的条件，例如，为用高严格性洗涤缓冲液(0.2X SSC，0.1％SDS，65℃)洗涤杂交滤器至少两次。合适的严格性条件将会促进DNA杂交，例如，6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)在大约45℃的温度下杂交，之后利用2.0X SSC在50℃洗，这些合适严格性的条件对于本领域技术人员来说是众所周知的或者可以在Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中发现。例如，洗涤步骤中盐的浓度可以从低严格性的大约2.0X SSC 50℃到高严格性的大约0.2XSSC在50℃中选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从低严格性条件的室温，大约22℃，升高到高严格性条件的大约65℃。温度和盐可以同时变化或者温度或盐浓度之一可以保持为恒定值而另一个发生变化。即便这样的选择条件可以耐受探针与模板或目的链之间的错配也只能耐受很少的错配。通过杂交来检测DNA序列对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且美国专利号4,965,188和5,176,995中的教导是杂交分析方法中的示例。
“同一性”是指两个多核酸或蛋白序列间的相似性程度。可以通过适当的计算机程序对于两个序列进行比对。得到广泛应用和接受的进行序列比对的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson等，Nucl.Acid Res.，22：4673-4680，1994)。匹配的碱基或氨基酸的数目用碱基或氨基酸的总数来除，并且乘以100来得到百分比同一性。例如，如果两个580个碱基对的序列中有145个碱基匹配，它们有25％的同一性。如果比较的两个序列的长度不同，匹配的数目用两个序列中短的序列的来除。例如，在200和400个氨基酸的两个蛋白中，有100个氨基酸是匹配的，考虑到较短的序列它们具有50％的同一性。如果较短的序列的长度少于150个碱基或50个氨基酸，匹配的数目用150(对于核酸碱基来说)或50(对于氨基酸来说)来除，并且乘以100来获得百分比同一性。
如此处所描述的一个蛋白可以与其它相关蛋白是“基本同一的”。这些具有基本的同一性的蛋白通常包括至少一个多肽序列，该多肽序列与其相关的其它多肽序列具有至少98％的序列同一性。GeneticsComputer Group，Inc.的WISCONSIN PACKAGE中的Gap程序10.0-UNIX版本是基于Needleman和Wunsch的方法的(J.Mol.Biol.48：443-453，1970)，该方法利用一系列默认的参数来进行逐对的比较(对于氨基酸序列比较：产生缺口的罚分＝8，延伸缺口的罚分＝20)；或利用在BLAST2.2.1软件包中的TBLASTN程序(Altschul等，NucleicAcids Res.25：3389-3402)，利用BLOSUM62矩阵(Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919，1992)和一系列默认的参数来进行逐对的比较(产生缺口得分＝11，延伸缺口得分＝1)。在BLAST中，E值，或期望值，代表具有与原始序列比对得分S相等或更好的得分的不同比对的数目，该不同比对预期在数据库搜索中偶然地发生。E值越低，匹配越显著。因为数据库的大小是E值计算的一个要素，所以从公用数据库利用“BLASTing”得到的E值对于任何给定的查询查/登录项的匹配通常会随时间而增加，其中公用数据库如GenBank。百分比同一性是指在利用BLAST算法比对的部分序列长度中存在的完全匹配的氨基酸残基的百分比。
“内含子”是指基因中不翻译成蛋白的部分，即使它转录成了RNA。
“分离的”核酸序列是从自然存在核酸的生物的细胞中的通常与该核酸序列结合在一起的其它的核酸序列中基本分离或纯化出来的核酸序列，这些结合在一起的核酸序列即，其它染色体或染色体外DNA。该术语包括利用生化手段纯化来基本去除核酸污染和其它细胞成分得到的核酸。该术语也包括重组的核酸和化学合成的核酸。
“分离的”“纯化的”“均一的”多肽。如果多肽是从自然状态下伴随其存在的细胞成分(核酸，脂类，糖类和其它多肽)中分离出来的或它是化学合成的或重组的那么称该多肽为“分离的”。当样品重量中的至少60％由多肽组成，优选的90％或更多，更优选的95％或更多，最优选的超过99％的时候可称该单体多肽是分离的。蛋白纯度或均一性利用以下手段来显示，例如，利用蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后将聚丙烯酰胺凝胶染色使单一的多肽的带可见；高压液相层析；或其它常规的方法。蛋白可以通过本领域中已知的任何的手段来纯化，例如在Guide to Protein Purification，ed.Deutscher，Meth.Enzymol.185，Academic Press，San Diego，1990；和Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer Verlag，New York，1982中描述的。
“标记”或“标记的”。现在有很多种常规的方法和试剂可以标记多核苷酸和多肽及其片段。一般的标记包括放射性同位素，配体或配体受体，荧光团，化学发光剂和酶。标记的方法以及针对于不同目的来选择合适的标记的指南已经有所讨论，例如在Sambrook等，Molecular Clonging：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1989)和Current Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel等，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，(1992)中。
“成熟蛋白编码区”，这个术语是指加工后的蛋白产物的序列，即在叶绿体转运肽被移除之后的成熟的EPSP合酶。
“天然”，该术语“天然”通常是指天然存在(“野生型”)的多核酸或多肽。然而，在本发明的上下文中，可能对分离的多核苷酸或多肽进行一些修饰来提供具有特定的表型的多肽，例如，在草甘膦敏感的EPSPS上的氨基酸替代来提供草甘膦抗性的EPSPS。在本发明中为了比较的目的，分离的含有为了提供除草剂抗性的氨基酸修饰而进行少数核苷酸替代的多核苷酸当与利用本发明的方法生成的基本不同的多核苷酸比较的时候被称为“天然的”多核苷酸。然而，照这种方式修饰的该“天然的”多核苷酸关于正常发现的连接到天然存在的非修饰多核苷酸的遗传因子而言是非天然的。
“N-末端区域”是指从肽，多肽或蛋白链的含有游离的氨基的氨基酸到链中间的区域。
“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
核酸符号：A＝腺嘌呤；C＝胞嘧啶；G＝鸟嘌呤；T＝胸腺嘧啶。合成寡核苷酸所使用的符号：N＝等摩尔的A，C，G和T；I＝脱氧肌苷；K＝等摩尔的G和T；R＝等摩尔的A和G；S＝等摩尔的C和G；W＝等摩尔的A和T；Y＝等摩尔的C和T。
“核酸片段”或“核酸分子片段”是从特定的物种的全基因组DNA中分离的核酸分子或合成的核酸分子。“核酸片段”术语包括DNA片段，重组载体，质粒，粘粒，噬菌粒、噬菌体，病毒等等。
“核苷酸序列变体”，技术人员可以利用熟知的方法方便地分别制备基因和蛋白的核苷酸和氨基酸序列的变体。例如，本发明的“变体”DNA分子是含有在EPSPS基因序列中的改变的DNA分子，这种改变即包括EPSPS基因序列中的一个或更多的核苷酸被缺失，添加和/或替代的改变，这样EPSPS基因变体能够编码保留EPSPS活性的蛋白。变体DNA分子可以通过，例如，标准的DNA突变发生技术或化学合成变体DNA分子或其一部分得到。化学合成核酸的方法已经有所讨论，例如，在Beaucage等，Tetra.Letts.22：1859-1862(1981)，和Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103：3185-(1981)。化学合成核酸可以通过，例如，自动寡聚核苷酸合成仪来进行。这样的变体优选地不改变核酸蛋白编码区的阅读框并且优选地编码的蛋白没有改变，或者只有少量的减少。
“可读框(ORF)”是指DNA或RNA编码肽，多肽或蛋白的区域。
“可操作连接的”。当第一个核酸序列被以能起作用的关系连接在第二个核苷酸序列时称第一个核苷酸序列被“可操作地”连接到第二个核苷酸序列。例如，如果一个启动子能够实现编码序列的转录或表达那么该启动子被可操作地连接到蛋白编码序列上。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的并且当需要的时候以同一阅读框连接两个蛋白编码区。
“超表达”是指表达由导入宿主细胞的DNA编码的RNA或多肽或蛋白，其中该RNA或多肽或蛋白是在宿主细胞中正常不存在的或者其中该RNA或多肽或蛋白在该宿主细胞中存在的水平比由编码该RNA或多肽或蛋白的内源基因正常表达的水平要高。
术语“植物”包括任何高等植物及其后代，包括单子叶植物(例如，玉米，水稻，小麦，大麦等等)，双子叶植物(例如，大豆，棉花，canola，西红柿，马铃薯，拟南芥属，烟草等等)，裸子植物(松树，杉树，雪松等等)并且包括植物的一部分，包括植物的繁殖单元(例如，种子，鳞茎，块茎，果实，花等等)或植物能够繁殖的其它部分或组织。
“植物表达盒”是指包含可操作连接的用以提供在植物中转基因产物的表达的调节元件的嵌合DNA片段。
“质粒”是指环状的，染色体外的，自我复制的DNA片段。
“多腺苷酸化信号”或“poly A信号”是指定位在编码区3’端的能够引起腺苷酸核苷酸加入到从编码区转录得到的mRNA的3’端的核酸序列。
“聚合酶链反应(PCR)”是指利用酶学技术来产生一个核酸序列(扩增子)的多拷贝的DNA扩增的方法。DNA分子的拷贝是通过在两个扩增引物之间穿梭DNA聚合酶来获得的。这种扩增方法的基础是利用温度变化的多次循环，以用来变性然后重新退火扩增引物(DNA引物分子)，然后延伸来合成位于两侧扩增引物之间的新的DNA链。核酸扩增可以通过本领域中所知的任何的核苷酸扩增方法来完成，包括聚合酶链反应(PCR)。本领域中所知的各种扩增方法特别在美国专利号4,683,195和4,683,202和PCRProtocols：A Guide to Methods andApplications，ed.Innis等，Academic Press，San Diego，1990中有所描述。PCR扩增方法已经被发展可以用来扩增一直到22kb的基因组DNA和一直到42kb的噬菌体DNA(Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5695-5699，1994)。这些方法与本领域中已知的DNA扩增的其他方法都可以被用于本发明的实践之中。
多核苷酸是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)分子的长度大于二，它们被连接起来形成更大的分子。
多肽片段。本发明也包含缺少天然的全长蛋白的至少一个残基但基本保持蛋白活性的蛋白片段。
术语“启动子”或“启动子区域”是指一种多核酸分子，该分子作为调节元件起作用，通常在编码序列的上游(5’)出现，通过提供RNA聚合酶和/或其它转录在正确位点起始必须因子的识别位点来控制信使RNA(mRNA)的合成进而控制编码序列的表达。作为此处所预期的，启动子或启动子区域包括通过连接各种调节序列的方法，随机或定向突变发生的方法和加入或重复增强子序列的方法获得的启动子的变体。此处公开的启动子区域和其生物学功能等价物在作为合适的重组载体的一部分导入到宿主中时负责驱使编码序列在其控制下转录，如由其产生mRNA的能力所证实的。
“重组”。“重组”的核酸是通过将两个本来分离的序列片段结合在一起来获得的，例如，通过化学合成，或者通过基因工程技术来处理分离的核酸片段。
术语“重组DNA构建体”或“重组载体”是指任何制剂例如质粒，粘粒，病毒，自主复制序列，噬菌体，或线状或环状的单链或双链DNA或RNA核苷酸序列，该制剂源自任何来源，能够进行基因组整合或自主复制，包含一个或多个DNA序列已以功能性操作方式连接的DNA分子。这样的重组DNA构建体或载体能够将5’调节序列或启动子区域和选择的基因产物的DNA序列以这样的方式引入细胞，从而该DNA序列转录成一个功能性的mRNA并且被翻译和因此得到表达。重组的DNA构建体或重组载体可以被构建以便表达反义RNAs来抑制特异的目标RNA的翻译。
“再生”是指从一个植物细胞(例如植物原生质体或外植体)长成一个植物的过程。
“报告基因”是指当在转基因生物中表达的时候能够产生可以利用化学或分子的方法来检测的产物或产生可见表型的基因和相应的基因产物。
“抗性”是指在毒素存在的时候能够起作用的酶，例如，草甘膦抗性II类EPSP合酶。一种具有对于一种毒素抗性的酶具有使毒素解毒的功能，例如，膦丝菌素乙酰转移酶，草甘膦氧化还原酶，或者是具有催化活性的突变的酶，该催化活性不受在野生型酶中破坏相同活性的除草剂的影响，例如乙酰乳酸合酶，突变的I类EPSP合酶。
“限制酶”是指识别双链DNA上特殊回文核苷酸序列并剪切两条链的酶；也可以称为限制性内切核酸酶。剪切一般发生在限制位点内。
“选择性标记”是指编码一种蛋白的多核酸分子，该种蛋白使得具有该多核酸分子的细胞具有能够方便鉴定的表型。选择性标记包括提供抗生素(例如，氨苄青霉素，卡那霉素)抗性的，补充营养缺陷的(例如，尿嘧啶，组氨酸，亮氨酸)，或者给于可见区别性特性的(例如颜色变化或者荧光)基因。有用的显性的选择性标记基因包括那些能够编码抗生素抗性基因(例如，新霉素磷酸转移酶，aad)；和除草剂抗性基因(例如，膦丝菌素乙酰转移酶，II类EPSP合酶，修饰的I类EPSP合酶)的基因。可用的选择除草剂抗性转化体的策略已经有所描述，例如在，Vasil，CellCulture and Somatic Cell Geneticsof Plants，Vols.I-III，Laboratory Procedures and TheirApplications Academic Press，New York(1984)。
术语“对于(目的序列)...特异的”指DNA探针或DNA引物在给定的杂交条件下在含有目的序列的样品中只与目的序列杂交。
术语“基本纯化的”，在此处是指将一个分子从天然状态下与该分子正常结合在一起的其它分子中分离出来。更优选地，基本纯化的分子在制剂中占主要的部分。基本纯化的分子可以是在自然的混合物中大于60％，优选地75％，更加优选地90％地不含其它分子(除溶剂之外)。术语“基本纯化”不包含处于其天然状态的分子。
“耐受的”或“耐受性”是指降低生物或非生物制剂对于生物和植物成长和发育过程中的影响，该制剂例如害虫或除草剂。
“转录”是指从DNA模板产生RNA拷贝的过程。
“转化”是指将外源多核酸分子(如DNA构建体、重组多核酸分子)导入细胞或原生质体的过程并且该外源多核酸分子被整合到染色体中或者能够自主复制。
“转化的”或“转基因的”是指外源多核酸进入的细胞，组织，器官或生物，这样的外源多核酸例如DNA载体或重组多核酸分子。“转基因的”或“转化的”细胞或生物也包括该细胞或该生物的后代以及从育种程序得到的后代，该育种程序在杂交中使用这样的“转基因”植物作为亲本并且能表现由于该外来多核酸分子的存在而变化的表型。
术语“转基因”是指转化入细胞或生物的对于该细胞或生物非天然的任何多核酸分子。“转基因”也包括通过定向重组或位点特异性突变将非天然的多核酸分子插入而修饰的天然植物基因中的组分。
“转运肽”或“引导肽”分子，这些术语通常是指当将其连接到目标蛋白的时候能够指导该蛋白进入到特定的组织，细胞，亚细胞定位，或细胞器中的肽分子。例子包括，叶绿体转运肽，核导向信号和液泡信号，但不局限于此。叶绿体转运肽在本发明中具有能指导EPSPS酶在叶绿体内表达的特定用途。
术语“翻译”是指从mRNA产生相应的基因产物，即，肽，多肽或蛋白。
“载体”是指运载外来DNA进入宿主生物的质粒，粘粒，噬菌体或病毒。
多核苷酸
本发明的方法包括设计能够为植物提供目标性状的基因，其中该植物是导入该基因的植物。农业上的目标转基因能为农作物提供农业上有益的性状，例如包括包含除草剂抗性(美国专利号.5,633,435；美国专利号.5,463,175)，增加的产量(美国专利号.5,716,837)，昆虫控制(美国专利号.6,063,597；美国专利号.6,063,756；美国专利号.6,093,695；美国专利号.5,942,664；美国专利号.6,110,464)，真菌疾病抗性(美国专利号.5,516,671；美国专利号.5,773,696；美国专利号.6,121,436；美国专利号.6,316,407和美国专利号.6,506,962)，病毒抗性(美国专利号.5,304,730和美国专利号.6,013,864)，线虫抗性(美国专利号.6,228,992)，细菌疾病抗性(美国专利号.5,516,671)，淀粉产量(美国专利号.5,750,876和美国专利号.6,476,295)，修饰油产量(美国专利号.6,444,876)，高的油产量(美国专利号.5,608,149和美国专利号.6,476,295)，修饰脂肪酸含量(美国专利号.6,537,750)，高蛋白产量(美国专利号.6,380,466)，果实成熟(美国专利号.5,512,466)，增加的动物和人营养(美国专利号.5,985,605和美国专利号.6,171,640)，生物聚合体(美国专利号.5,958,745和美国专利公开号US20030028917)，环境应激抗性(美国专利号.6,072,103)，药物性肽(美国专利号.6,080,560)，改良加工性状(美国专利号.6,476,295)，改良的可消化性(美国专利号.6,531,648)，低棉籽糖(美国专利号.6,166,292)，工业酶的产量(美国专利号.5,543,576)，改良的风味(美国专利号.6,011,199)，固氮作用(美国专利号.5,229,114)，杂种种子产量(美国专利号.5,689,041)和生物燃料的产量(美国专利号.5,998,700)的遗传因子，但不局限于此，以上所列的专利所描述的遗传因子和转基因此处引入作为参考。
转基因植物已经展示具有耐受性并且本发明的方法可以应用的除草剂包括：草甘膦，草铵膦，磺酰脲，咪唑啉酮，溴苯腈，delapon，cyclohezanedione，原卟啉原氧化酶抑制剂和isoxasflutole除草剂，但不局限于此。编码在除草剂抗性中起作用的蛋白的多核苷酸分子在本领域中是已知的并且包括编码针对于草甘膦耐受性的5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS，在美国专利号5,627,061，5,633,435，6,040,497；Padgette等Herbicide ResistantCrops，Lewis Publishers，53-85，1996；和Penaloza-Vazquez，等Plant Cell Reports 14：482-487，1995中有所描述)和aroA(美国专利号.5,094,945)；对于溴苯腈耐受性的溴苯腈腈水解酶(Bxn)(美国专利号.4,810,648)；针对于达草灭抗性的八氢番茄红素脱氢酶(crtI，Misawa等(1993)Plant J.4：833-840和(1994)Plant J.6：481-489)；乙酰羟酸合成酶(AHAS，aka ALS，Sathasiivan等Nucl.AcidsRes.18：2188-2193，1990)；和对于草铵膦和双丙氨酰膦抗性的bar基因(Deblock等，EMBO J.6：2513-2519，1987)的多核苷酸分子，但不限于此。
除草剂抗性对于农作物来说是一种需要的表型。N-膦酰甲基甘氨酸，也被称为草甘膦，是一种为人熟知的在植物物种中具有广谱活性的除草剂。草甘膦是
Figure A200810165671D0026124807QIETU
(Monsanto Co.)的活性成分，是一种安全的除草剂，在环境中具有所需的较短的半衰期。当将其作用于植物的表面时，草甘膦会移动遍布植物。草甘膦由于其抑制莽草酸途径而具有植物毒性，该途径提供合成芳族氨基酸的前体。特定地，草甘膦影响磷酸烯醇丙酮酸和3-磷酸莽草酸转变成5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸是通过抑制5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸合酶(下文中称为EPSP合酶或EPSPS)来完成的。为了本发明的目的，术语“草甘膦”可以被认为是包含N-膦酰甲基甘氨酸的任何具有除草效用的形式(包括其任何盐)以及能够最终在植物中能够产生草甘膦阴离子的其它形式。
通过植物基因工程的方法，通过将DNA分子插入到植物基因组中以便产生更高水平的野生型的EPSPS(shah等，Science 233：478-481，1986)来获得草甘膦抗性植物是可能的。草甘膦抗性也可以通过表达EPSPS变体来得到，其中该EPSPS变体与草甘膦的亲和力较低因此可以在草甘膦存在的情况下保持其催化活性(美国专利号.5,633,435)。在植物组织中降解草甘膦的酶(美国专利号.5,463,175)也能够提供细胞对草甘膦的抗性。因此，这样的基因使得对于草甘膦具有抗性的转基因农作物能够生产，因此使得草甘膦能被用来以最小的对农作物的损害有效地进行杂草控制。例如，草甘膦抗性已经通过基因工程整合到玉米(美国专利号.5,554,798，6,040,497)，小麦(Zhou等，Plant Cell Rep.15：159-163，1995)，大豆(WO 9200377)和canola(WO 9204449)中。
野生型EPSPS酶的变体已经被分离出来，这些变体是通过对EPSPS氨基酸编码序列进行改变的结果使其具有草甘膦抗性(Kishore等，Annu.Rev.Biochem.57：627-663，1988；Schulz等Arch.Microbiol.137：121-123，1984；Sost等，FEBS Lett.173：238-241，1984；Kishore等，在“Biotechnology for Crop Protection”中ACSSymposium Series No.379.eds.Hedlin等，37-48，1988)。这些变体与野生型的EPSPS酶比起来一般具有对于草甘膦更高的Ki值，因此使其具有草甘膦抗性表型，然而这些变体特征也在于对PEP高的Km值，这使得酶在动力学上的效率较低。例如，来源于大肠杆菌(E.coli)的天然的EPSPS对于PEP的表观Km值和对于草甘膦的表观Ki值为10μM和0.5μM，然而对于具有在第96位的甘氨酸被丙氨酸替代的单个氨基酸替代的草苷胺抗性分离物来说分别为220μM和4.0μM。美国专利号.6,040,497报导称为TIPS突变(由异亮氨酸替代102位氨基酸苏氨酸以及由丝氨酸替代106位氨基酸脯氨酸)包括两个突变，当这两个突变被引入到玉米的EPSPS的多肽序列中时使该酶具有草甘膦抗性。包括这个突变酶的转基因植物对于草甘膦是抗性的。也可以对从其它植物来源的草甘膦敏感的EPSPS酶进行同样的突变来产生草甘膦抗性的酶。
各种天然的和变体EPSPS酶已经在转基因植物中表达来提供草甘膦抗性(Singh等，在“Biosynthesis and Molecular Regulation ofAmino Acids in Plants”中，Amer Soc Plant Phys.Pubs.1992)。一些这些EPSPS的例子包括在美国专利号.4,490,835，美国专利号.4,971,908，美国专利号.5,145,783，美国专利号.5,188,642，美国专利号.5,310,667和美国专利号.5,312,910中描述的和/或按照其分离的那些酶。它们也可以来源于结构上不同类的非同源EPSPS基因，例如按照美国专利号.5,633,435和美国专利号.5,627,061中描述从农杆菌属物种CP4菌株中分离得到的II类EPSPS基因。
叶绿体转运肽(CTPs)被设计来融合到细菌EPSPS的N末端以便指导草甘膦抗性酶进入植物叶绿体。在天然的植物EPSPS中，叶绿体转运肽区域包含在天然编码序列中(例如，CTP2，Klee等，Mol.Gen.Genet.210：47-442，1987，此处将其整体引入作为参考)。在构建转基因植物表达盒时天然的CTP可以用异源CTP取代。许多叶绿体定位蛋白，包括EPSPS，是由核基因作为前体表达的并且通过叶绿体转运肽(CTP)导向在叶绿体中，该肽在输入的步骤中被去掉。其它这样的叶绿体蛋白的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(SSU)，铁氧还蛋白，铁氧还蛋白氧化还原酶，捕获光能的叶绿素复合蛋白I和II，以及硫氧还蛋白F。已经有证据显示通过应用具有CTP的蛋白融合可在体内或体外将非叶绿体蛋白导向叶绿体并且CTP序列足够将蛋白导向到叶绿体。已经有证据显示整合一种合适的叶绿体转运肽可以将异源的EPSPS蛋白序列导向到转基因植物的叶绿体中，这样的肽例如，拟南芥EPSPS CTP(Klee等，Mol.Gen.Genet.210：437-442，1987)和碧冬茄EPSPS CTP(della-Cioppa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：6873-6877，1986)。通过表达包含氨基末端CTP和草甘膦抗性EPSPS酶的融合蛋白来产生草甘膦抗性的植物对于本领域技术人员来说是众所周知的(美国专利号5,627,061，美国专利号.5,633,435，美国专利号.5,312,910，EP0218571，EP189707，EP508909和EP924299)。本领域技术人员会认识到可以构建各种嵌合构建体这样可以利用特定的CTP的功能来将草甘膦抗性的EPSPS酶输入到植物细胞叶绿体中。
本发明的多核苷酸可以在结构上进行修饰和改变并且仍然获得能够编码具有所需特性的功能蛋白或肽的分子。以下是基于对于第一个多核苷酸进行密码子替代来产生等价的或者甚至是更好的二代人工多核苷酸的方法，其中这个新的人工多核苷酸可用于在转基因基因堆叠和增强表达的方法中。可以预期在第二代多核苷酸中的密码子替代可能在特定的情形中产生与第一个多核苷酸至少一个氨基酸的不同。氨基酸替代可能为该蛋白例如草甘膦抗性EPSP合酶提供更好的特性，或者它可能是一种保守的变化，并不基本影响该蛋白的特性。该方法提供了利用密码子使用表通过将多肽序列反向翻译成多核苷酸所得的人工多核苷酸，然后通过几个步骤来增加该人工多核苷酸的特性以使它可以特异的用于转基因植物。
在本发明的特定的实施方案中，可以预期通过修饰的编码除草剂抗性蛋白的多肽可以应用于以下的至少一种：为转化的或转基因植物提供除草剂抗性，改善植物中的除草剂抗性基因的表达，用作选择性标记以将其他目标性状导入植物中，以及防止与相似内源植物基因或已存在的转移基因产生重组并且进一步允许产生基因堆叠而不产生基因沉默。
已知遗传密码是简并的。氨基酸及其RNA密码子被列在以下的表1中。
表1氨基酸以及编码该氨基酸的RNA密码子。
氨基酸                              密码子
全名；3字母密码；单字母密码
丙氨酸；Ala；A                       GCA GCC GCG GCU
半胱氨酸；Cys；C                     UGC UGU
天冬氨酸；Asp；D                     GAC GAU
谷氨酸；Glu；E                       GAA GAG
苯丙氨酸；Phe；F                     UUC UUU
甘氨酸；Gly；G                       GGA GGC GGG GGU
组氨酸；His；H                       CAC CAU
异亮氨酸；Ile；I                     AUA AUC AUU
赖氨酸；Lys；K                       AAA AAG
亮氨酸；Leu；L                       UUA UUG CUA CUC CUG CUU
甲硫氨酸；Met；M                     AUG
天冬酰胺；Asn；N                     AAC AAU
脯氨酸；Pro；P                       CCA CCC CCG CCU
谷氨酰胺；Gln；Q                     CAA CAG
精氨酸；Arg；R                       AGA AGG CGA CGC CGG CGU
丝氨酸；Ser；S                       AGC AGU UCA UCC UCG UCU
苏氨酸；Thr；T                       ACA ACC ACG ACU
缬氨酸；Val；V                       GUA GUC GUG GUU
酪氨酸；Trp；W                       UGG
色氨酸；Tyr；Y                       UAC UAU
密码子是利用RNA碱基来描述的，例如，腺嘌呤，尿嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶，mRNA是直接翻译成多肽的。当设计用于构建体的DNA多核苷酸的时候DNA碱基应该被替代，例如，胸腺嘧啶替代尿嘧啶，这是可以理解的。
提供具有多种农业上改良的表型的转基因植物是需要的。除草剂抗性经常被用于帮助产生具有另外的农业上重要基因的转基因植物的选择性标记。通过传统的育种方法或通过对第一个转基因植物进行额外植物表达盒的重新转化所产生的转基因堆叠可能包括导入具有一样或基本一样的多核苷酸序列的基因或遗传因子。含有这样的堆叠基因的后代可能由于基因沉默而易于产生基因表达的丢失。本发明的方法提供编码除草剂抗性蛋白的修饰的多核苷酸分子。该多核苷酸分子被设计成与其它的编码同样除草剂抗性蛋白的多核苷酸分子充分不同的。那么这些分子可以在同一个植物细胞中共存而没有基因沉默。
不同的多核苷酸序列是通过利用从各种植物来源的已知的编码序列构建的密码子使用表来制造的。例如，来自拟南芥，玉米和大豆的密码子使用表可以用于本发明中的方法来设计多核苷酸。来源于其它植物的其它密码子使用表也可以为本领域技术人员所应用。
设计新的编码除草剂抗性蛋白的人工多核苷酸分子的方法的第一步是利用密码子使用表来在一个植物物种中确定该除草剂抗性蛋白的每一个氨基酸所使用的密码子的百分比，然后利用从该密码子使用表中选出来的不同密码子来替换每八个连续密码子中的至少一个并且调整该多核苷酸编码的每一个氨基酸的密码子使用百分比来达到与在密码子使用表中基本相同的百分比密码子使用。额外的步骤可以包括在该新多核苷酸序列的第二和第三个可读框之间引入翻译终止密码子；消除第二和第三可读框之间的一些翻译起始密码子；调整局部GC：AT比例使在大约50个核苷酸范围内达到大约2:1；打乱潜在的多腺苷酸化信号或潜在的内含子剪接位点；移除至少一个由六个或更多连续核苷酸构成的限制酶位点；并且比较该新的人工多核苷酸与已存在的编码相同或相似蛋白的多核苷酸的同一性以便使两个多核苷酸的序列同一性不大于85％。
将蛋白序列反向翻译成核苷酸序列可能需要利用密码子使用表来完成，例如，在Genetics Computer Group(GCG)SeqLab或其它对于DNA分析领域中技术人员已知的DNA分析程序或本发明所提供的表2，3和4中可发现的。拟南芥(表2)，玉米(表3)和大豆(表4)的密码子使用表是可以用于植物物种构建所使用的表的例子，密码子使用表也可以被构建来表现单子叶植物或双子叶植物密码子的使用。
表2 拟南芥的密码子使用表
 
氨基酸        密码子        数字             /1000          比例
Gly           GGG          188335.00        10.18          0.16
Gly           GGA          443469.00        23.98          0.37
Gly           GGT          409478.00        22.14          0.34
Gly           GGC          167099.00        9.03           0.14
Glu           GAG          596506.00        32.25          0.48
Glu           GAA          639579.00        34.58          0.52
Asp           GAT          683652.00        36.96          0.68
Asp           GAC          318211.00        17.20          0.32
Val           GTG          320636.00        17.34          0.26
Val           GTA          185889.00        10.05          0.15
Val           GTT          505487.00        27.33          0.41
Val           GTC          235004.00        12.71          0.19
Ala           GCG          162272.00        8.77           0.14
Ala           GCA          323871.00        17.51          0.27
Ala           GCT          521181.00        28.18          0.44
Ala           GCC          189049.00        10.22          0.16
Arg           AGG          202204.00        10.93          0.20
Arg           AGA          348508.00        18.84          0.35
Ser           AGT          260896.00        14.11          0.16
Ser           AGC          206774.00        11.18          0.13
Lys           AAG          605882.00        32.76          0.51
Lys           AAA          573121.00        30.99          0.49
Asn           AAT          418805.00        22.64          0.52
Asn           AAC          385650.00        20.85          0.48
Met           ATG          452482.00        24.46          1.00
Ile           ATA          235528.00        12.73          0.24
Ile           ATT          404070.00        21.85          0.41
Ile           ATC          341584.00        18.47          0.35
Thr           ACG          140880.00        7.62           0.15
Thr           ACA          291436.00        15.76          0.31
Thr           ACT          326366.00        17.65          0.34
Thr           ACC          190135.00        10.28          0.20
 
Trp        TGG     231618.00     12.52       1.00
End        TGA     19037.00      1.03        0.43
Cys        TGT     196601.00     10.63       0.60
Cys        TGC     131390.00     7.10        0.40
End        TAG     9034.00       0.49        0.20
End        TAA     16317.00      0.88        0.37
Tyr        TAT     276714.00     14.96       0.52
Tyr        TAC     254890.00     13.78       0.48
Leu        TTG     389368.00     21.05       0.22
Leu        TTA     237547.00     12.84       0.14
Phe        TTT     410976.00     22.22       0.52
Phe        TTC     380505.00     20.57       0.48
Ser        TCG     167804.00     9.07        0.10
Ser        TCA     334881.00     18.11       0.20
Ser        TCT     461774.00     24.97       0.28
Ser        TCC     203174.00     10.99       0.12
Arg        CGG     88712.00      4.80        0.09
Arg        CGA     115857.00     6.26        0.12
Arg        CGT     165276.00     8.94        0.17
Arg        CGC     69006.00      3.73        0.07
Gln        CAG     280077.00     15.14       0.44
Gln        CAA     359922.00     19.46       0.56
His        CAT     256758.00     13.88       0.62
His        CAC     160485.00     8.68        0.38
Leu        CTG     183128.00     9.90        0.11
Leu        CTA     184587.00     9.98        0.11
Leu        CTT     447606.00     24.20       0.26
Leu        CTC     294275.00     15.91       0.17
Pro        CCG     155222.00     8.39        0.17
Pro        CCA     298880.00     16.16       0.33
Pro        CCT     342406.00     18.51       0.38
Pro        CCC     97639.00      5.28        0.11
表3 玉米的密码子使用表
 
氨基酸         密码子       数字        /1000        比例
Gly            GGG         8069.00     15.19        0.21
Gly            GGA         7100.00     13.37        0.18
Gly            GGT         7871.00     14.82        0.20
Gly            GGC         15904.00    29.94        0.41
Glu            GAG         22129.00    41.67        0.68
Glu            GAA         10298.00    19.39        0.32
Asp            GAT         11996.00    22.59        0.41
Asp            GAC         17045.00    32.09        0.59
Val            GTG         13873.00    26.12        0.38
Val            GTA         3230.00     6.08         0.09
Val            GTT         8261.00     15.55        0.23
Val            GTC         11330.00    21.33        0.31
Ala            GCG         11778.00    22.18        0.24
Ala            GCA         8640.00     16.27        0.18
Ala            GCT         11940.00    22.48        0.24
Ala            GCC         16768.00    31.57        0.34
Arg            AGG         7937.00     14.94        0.27
Arg            AGA         4356.00     8.20         0.15
Ser            AGT         3877.00     7.30         0.10
Ser            AGC         8653.00     16.29        0.23
Lys            AAG         22367.00    42.11        0.74
Lys            AAA         7708.00     14.51        0.26
Asn            AAT         6997.00     13.17        0.36
Asn            AAC         12236.00    23.04        0.64
Met            ATG         12841.00    24.18        1.00
Ile            ATA         3997.00     7.53         0.16
Ile            ATT         7457.00     14.04        0.31
Ile            ATC         12925.00    24.34        0.53
Thr            ACG         5665.00     10.67        0.22
Thr            ACA         5408.00     10.18        0.21
Thr            ACT         5774.00     10.87        0.22
Thr            ACC         9256.00     17.43        0.35
Trp            TGG         6695.00     12.61        1.00
 
氨基酸        密码子       数字         /1000        比例
End           TGA         591.00       1.11         0.45
Cys           TGT         2762.00      5.20         0.30
Cys           TGC         6378.00      12.01        0.70
End           TAG         411.00       0.77         0.32
End           TAA         299.00       0.56         0.23
Tyr           TAT         4822.00      9.08         0.31
Tyr           TAC         10546.00     19.86        0.69
Leu           TTG         6677.00      12.57        0.14
Leu           TTA         2784.00      5.24         0.06
Phe           TTT         6316.00      11.89        0.32
Phe           TTC         13362.00     25.16        0.68
Ser           TCG         5556.00      10.46        0.14
Ser           TCA         5569.00      10.49        0.15
Ser           TCT         6149.00      11.58        0.16
Ser           TCC         8589.00      16.17        0.22
Arg           CGG         4746.00      8.94         0.16
Arg           CGA         2195.00      4.13         0.07
Arg           CGT         3113.00      5.86         0.10
Arg           CGC         7374.00      13.88        0.25
Gln           CAG         13284.00     25.01        0.64
Gln           CAA         7632.00      14.37        0.36
His           CAT         5003.00      9.42         0.39
His           CAC         7669.00      14.44        0.61
Leu           CTG         13327.00     25.09        0.28
Leu           CTA         3785.00      7.13         0.08
Leu           CTT         8238.00      15.51        0.17
Leu           CTC         12942.00     24.37        0.27
Pro           CCG         8274.00      15.58        0.27
Pro           CCA         7845.00      14.77        0.26
Pro           CCT         7129.00      13.42        0.23
Pro           CCC         7364.00      13.87        0.24
表4 大豆的密码子使用表
 
氨基酸        密码子      数字       /1000       比例
Gly           GGG        3097.00    12.82       0.18
Gly           GGA        5434.00    22.49       0.32
Gly           GGT        5248.00    21.72       0.31
Gly           GGC        3339.00    13.82       0.20
Glu           GAG        8296.00    34.33       0.50
Glu           GAA        8194.00    33.91       0.50
Asp           GAT        7955.00    32.92       0.62
Asp           GAC        4931.00    20.40       0.38
Val           GTG        5342.00    22.11       0.32
Val           GTA        1768.00    7.32        0.11
Val           GTT        6455.00    26.71       0.39
Val           GTC        2971.00    12.29       0.18
Ala           GCG        1470.00    6.08        0.08
Ala           GCA        5421.00    22.43       0.31
Ala           GCT        6796.00    28.12       0.38
Ala           GCC        4042.00    16.73       0.23
Arg           AGG        3218.00    13.32       0.28
Arg           AGA        3459.00    14.31       0.30
Ser           AGT        2935.00    12.15       0.17
Ser           AGC        2640.00    10.92       0.15
Lys           AAG        9052.00    37.46       0.59
Lys           AAA        6370.00    26.36       0.41
Asn           AAT        5132.00    21.24       0.48
Asn           AAC        5524.00    22.86       0.52
Met           ATG        5404.00    22.36       1.00
Ile           ATA        3086.00    12.77       0.23
Ile           ATT        6275.00    25.97       0.47
Ile           ATC        3981.00    16.47       0.30
Thr           ACG        1006.00    4.16        0.08
Thr           ACA        3601.00    14.90       0.29
Thr           ACT        4231.00    17.51       0.34
Thr           ACC        3562.00    14.74       0.29
Trp           TGG        2866.00    11.86       1.00
 
氨基酸         密码子       数字        /1000       比例
End            TGA         221.00      0.91        0.36
Cys            TGT         1748.00     7.23        0.49
Cys            TGC         1821.00     7.54        0.51
End            TAG         143.00      0.59        0.23
End            TAA         256.00      1.06        0.41
Tyr            TAT         380B.00     15.76       0.51
Tyr            TAC         3667.00     15.17       0.49
Leu            TTG         5343.00     22.11       0.24
Leu            TTA         2030.00     8.40        0.09
Phe            TTT         4964.00     20.54       0.49
Phe            TTC         5067.00     20.97       0.51
Ser            TCG         1107.00     4.58        0.06
Ser            TCA         3590.00     14.86       0.21
Ser            TCT         4238.00     17.54       0.24
Ser            TCC         2949.00     12.20       0.17
Arg            CGG         683.00      2.83        0.06
Arg            CGA         964.00      3.99        0.08
Arg            CGT         1697.00     7.02        0.15
Arg            CGC         1538.00     6.36        0.13
Gln            CAG         4147.00     17.16       0.46
Gln            CAA         4964.00     20.54       0.54
His            CAT         3254.00     13.47       0.55
His            CAC         2630.00     10.88       0.45
Leu            CTG         2900.00     12.00       0.13
Leu            CTA         1962.00     8.12        0.09
Leu            CTT         5676.00     23.49       0.26
Leu            CTC         4053.00     16.77       0.18
Pro            CCG         1022.00     4.23        0.08
Pro            CCA         4875.00     20.17       0.37
Pro            CCT         4794.00     19.84       0.36
Pro            CCC         2445.00     10.12       0.19
密码子使用表对于本领域是众所周知的并且可以在基因数据库中找到例如Genbank数据库。密码子使用数据库是CUTG(来源于Genbank的密码子使用表)扩展的WWW版本。每种生物中的密码子使用频率都被做成可通过这个环球网站点搜索的(Nakamura等Nucleic AcidsRes.28：292，2000)。
在本发明的多种实施方案中，这些步骤可以以任何的顺序或同时来完成。这些步骤中的任何一个或全部可以在设计本发明的人工多核苷酸的过程中完成。以下对每一个步骤进行详细描述。
对于特定氨基酸的不同密码子应基于密码子使用表中对于特定物种近似的百分比密码子使用而分布于整个多核苷酸中。应该避免相同的密码子在局部聚成一簇。每八个连续密码子中的至少一个要被替代以便为该多核苷酸序列与编码相同或相近蛋白的多核苷酸序列提供足够的差异。除了特别需要的地方例如提供除草剂抗性的酶，该编码的蛋白虽然由一个密码子替代另一个密码子但仍保持不变，这些密码子是在表1中所列的翻译成同一氨基酸的密码子。
在本发明的实施方案中，可以通过调整局部GC:AT比例来校正多核苷酸局部GC:AT比例到大约与全长多核苷酸相同的比例，但不高于该多核苷酸分子在大约50个核苷酸的范围时的2倍。利用来源于双子叶植物的密码子使用表的多核苷酸的GC:AT比例的范围应该为大约0.9到大约1.3并且对于单子叶植物为大约1.2到大约1.7。局部GC:AT比例对于维持合适的RNA二级结构是重要的。包含有许多连续的A+T碱基或G+C碱基的区域预计可由于自身互补而具有更高的形成发夹结构的可能性。因此，利用不同密码子替代可以减少自身互补二级结构的形成的可能性，发夹结构在一些生物中已知可以减少转录和/或翻译。在大部分例子中通过利用不含有超过五个连续A+T碱基或G+C碱基的多核苷酸分子可以使不利的影响最小化。最长的局部GC段长度(没有任何AT核苷酸)不应该超过10个核苷酸。因此编码富含Gly，Ala，Arg，Ser和Pro的蛋白的密码子可以被替代来防止长的GC核苷酸簇的产生。列出的富含GC的密码子可以与富含AT的氨基酸Lys，Asn，Ile，Tyr，Leu，Phe的密码子联合使用来调整局部GC:AT的比例并且反之亦然。
利用例如GAP程序(GCG，Madison，WI)这样的序列比对工具来进行的序列同一性检测可以在反向翻译之后并且确定产生的序列具有合适的序列多样性的程度之后立即完成。邻近的超过23个核苷酸长度的多核苷酸序列如果具有100％的序列同一性就应该通过在这种长度的序列中进行密码子替代来消除。
翻译起始密码子(对于DNA来说是ATG，对于RNA来说是AUG)出现在第二个阅读框(框“b”)，第三个阅读框(框“c”)和反向阅读框(框“d”，“e”，“f”)。第二和第三个框起始密码子可能开始翻译，然而比在第一个中出现的效率要低很多。因此，如果一个或两个AUG出现于框“b”或“c”中mRNA分子残基的S′端附近，那么在框“a”至少含有第一个三联Met密码子的多核苷酸区域中消除它们是有利的。同样，如果蛋白序列在框“a”不含有多于一个的Met，那么从“b”或“c”正向框中尽可能多的消除。为了完成这个目的，例如，目标蛋白中的氨基酸，Asp，Asn，Tyr，His的密码子可以被替代来消除第二个框中的起始密码子，这些氨基酸之后可以是以下的任何的氨基酸：Gly，Glu，Asp，Val或Ala。序列GATGGG编码氨基酸Asp-Gly并且在阅读框“b”形成ATG。当序列被修饰成为GACGGG，ATG起始被消除并且该序列仍编码Asp-Gly。相似的策略可以被用来消除在阅读框“c”中的起始密码子。选自Gly，Glu，Val，Ala，Arg，Lys，Ile，Thr，Cys，Tyr，Leu，Ser，His或Pro的氨基酸与之后的Trp联合会导致在该基因的第三个阅读框形成ATG。在这样的情况中，第一个密码子能够被改变来使核苷酸A不在第三个的位置。
要消除该基因的互补DNA链上的备选的框(“d”，“e”和/或“f”)中的ATG密码子而不改变该蛋白的氨基酸序列能够通过相似的方法来完成。即使转基因以使得反向互补mRNA能够从天然植物启动子转录的方向整合到植物基因组中这种修饰也会降低翻译的可能性。可以按以下所描述的通过在所有的三个反向阅读框导入终止密码子来使对任何反向阅读框的翻译最小化。
互补的DNA的所有三个框中产生终止密码子可以按以下方案完成。Leu(TTA和CTA)和Ser(TCA)密码子可以在反向互补链产生三个不同的终止密码。如果那些氨基酸能在目标蛋白的C末端发现，那么它们的密码子能够被用来在互补链的阅读框“d”产生终止。为了在互补链的阅读框“e”产生终止密码子，在目标蛋白中找到氨基酸Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gly，His，Ile，Leu，Phe，Pro，Ser，Thr，Tyr或Val，其之后是氨基酸Gln，His或Tyr。例如，编码氨基酸Ala-His的多核苷酸序列GCCCAC能够被修饰成为GCTCAC。互补序列，GTGAGC，将具有以斜体字显示的终止密码子TGA。当目标蛋白具有Ala，Ile，Leu，Phe，Pro，Ser，Thr或Val之后是氨基酸Arg，Asn，Ile，Lys，Met或Ser时互补链的阅读框可以被修饰以便在互补链的阅读框“f”得到终止密码子。编码Ile和Ser的多核苷酸序列ATATCT可以被修饰成为ATCAGT来在互补链中生成以斜体字显示的终止密码子，ACTGAT。Phe的密码子之后是Asn，Ile，Lys，Met或Thr的任意一个密码子的联合总会在互补链框“e”或“f”产生终止密码子。
为了在正向阅读框“b”产生终止密码子，阅读框“a”必须以TA或TG核苷酸结尾。搜索该目标蛋白的氨基酸Ile，Leu，Met或Val与之后是任何以下的氨基酸Ala，Arg，Asn，Asp，Glu，Gly，Ile，Lys，Met，Ser，Thr或Val的组合。例如，如果编码氨基酸Met-Ser的多核苷酸序列是ATGTCT，它可以被修饰成ATGAGT来在第二个阅读框产生TGA终止密码子。
为了能在阅读框“c”产生终止密码子，阅读框“a”一定要在第三个位置具有核苷酸T并且接下来的密码子必需以AA，AG或GA开始。为了找到合适的密码子来修饰，在目标蛋白中搜索以下任何的氨基酸：Ala，Asn，Asp，Arg，Cys，Gly，His，Ile，Leu，Phe，Pro，Ser，Thr，Tyr或Val，其之后是以下任何的氨基酸：Arg，Asn，Asp，Glu，Lys或Ser。例如，如果对于氨基酸Gly-Glu的核苷酸序列是GGAGAG，序列可以被修饰成为GGTGAG以便在第三个阅读框中产生TGA终止密码子。
其它的本发明的可用的在人工多核苷酸设计方法中的修饰是为了消除不必要的限制位点以及其它的特异序列模型。限制位点可能干扰进一步基因克隆和操作。例如，一些限制位点通常用于基因克隆，包括，但不局限于，对于在以下表5中所列的由6或更多非-N碱基构成的II型限制酶，表5是从New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA，USA)限制性内切核酸酶数据库中引用的。对于限制酶识别位点的搜索可以通过利用在GCG SeqLab找到的Map功能应用或对于DNA分析领域技术人员所知的其它DNA分析程序包含的相似的应用来完成。限制酶也能被加入到序列中来促进克隆。例如，ClaI限制位点被放入CP4EPSPS版本AT(SEQ ID NO：17)和ZM(SEQ ID NO：18)中以通过片段交换来产生重组序列并且利用能够组合到整个基因的核苷酸片段来促进基因合成。转运肽CTP2的多核苷酸序列(SEQ ID NO：12)通过SphI限制位点来连接到CP4EPSPS以便促进利用不同的CTP2(SEQID NO：13，SEQ ID NO：14)核苷酸版本或编码不同叶绿体转运肽的多核苷酸来替代CTP2。例如，在水稻EPSPS中，NgaMIV限制位点在所有的人工版本中都在大约205位核苷酸上，以促进叶绿体转运肽编码区的交换。同样，对于大豆EPSPS而言，叶绿体转运肽的多核苷酸序列是利用SacII内切核酸酶的限制位点从成熟的肽中分离出来的。
可以理解对于内切核酸酶位限制点的修饰不是必需的，但是对于进一步DNA分子的操作来说是有用的。表5提供了限制性内切核酸酶的列表，本发明特殊感兴趣的那些利用星号标记出来。对本发明的人工多核苷酸进行消除或添加所需的其它内切核酸酶限制位点对于本领域中技术人员是很明显的并且不局限于列在表5中的那些。
表5.限制酶识别序列
酶              识别序列                   酶          识别序列
AatII           G_ACGT^C                   AsuII       TT^CG_AA
*AccI           GT^MK_AC                   AvaI        C^YCGR_G
Acc65I          G^GTAC_C                   AvaIII      ATGCAT
AceII           G_CTAG^C-                  AvrII       C^CTAG_G
AclI            AA^CG_TT                   BalI        TGG^CCA
AcyI            GR^CG_YC                   *BamHI      G^GATC_C
AfeI            AGC^GCT                    BanI        G^GYRC_C
AflII           C^TTAA_G                   BanII       G_RGCY^C
*AflIII         A^CRYG_T                   *BbeI       G_GCGC^C
AgeI            A^CCGG_T                   BbvCI       CC^TCA_GC
AhaIII          TTT^AAA                    *BclI       T^GATC_A
ApaI            G_GGCC^C                   BetI        W^CCGG_W
ApaLI           G^TGCA_C                   BfrBI       ATG^CAT
ApoI            R^AATT_Y                   *BglII      A^GATC_T
AscI            GG^CGCG_CC                 BloHII      CTGCA^G
AseI            AT^TA_AT                   BlpI        GC^TNA_GC
AsiSI           GCG_AT^CGC                 Bmel580I    G_KGCM^C
酶         识别序列                 酶             识别序列
BmgI       GKGCCC                   Eco47III       AGC^GCT
Bpu10I     CC^TNA_GC                EcoNI          CCTNN^N_NNAGG
BsaI       GGTCTCN^NNNN_            EcoO109I       RG^GNC_CY
BsaAI      YAC^GTR                  *EcoRI         G^AATT_C
BsaHI      GR^CG_YC                 *EcoRV         GAT^ATC
BsaWI      W^CCGG_W                 EspI           GC^TNA_GC
BsbI       CAACAC                   *FseI          GG_CCGG^CC
BsePI      G^CGCG_C                 *FspI          TGC^GCA
BseSI      G_KGCM^C                 FspAI          RTGC^GCAY
BsiI       C^ACGA_G                 GdiII          C^GGCC_R
BsiEI      CG_RY^CG                 HaeI           WGG^CCW
BsiWI      C^GTAC_G                 HaeII          R_GCGC^Y
BsmI       GAATG_CN                ^HgiAI          G_WGCW^C
Bsp1286I   G_DGCH^C                 HgiCI          G^GYRC_C
Bsp1407I   T^GTAC_A                 HgiJII         G_RGCY^C
BspEI      T^CCGG_A                 *HincII        GTY^RAC
BspGI      CTGGAC                   HindII         GTY^RAC
BspHI      T^CATG_A                 *HindIII       A^AGCT_T
BspLU11II  A^CATG_T                 *HpaI          GTT^AAC
BspMII     T^CCGG_A                 KasI           G^GCGC_C
BsrBI      CCG^CTC                  *KpnI          G_GTAC^C
BsrDI      GCAATG_NN               ^LpnI           RGC^GCY
BsrFI      R^CCGG_Y                 McrI           CG_RY^CG
BsrGI      T^GTAC_A                 MfeI           C^AATT_G
BssHII     G^CGCG_C                 *MluI          A^CGCG_T
BssSI      C^ACGA_G                 MscI           TGG^CCA
BstAPI     GCAN_NNN^NTGC            MspAlI         CMG^CKG
BstBI      TT^CG_AA                 MstI           TGC^GCA
BstEII     G^GTNAC_C                NaeI           GCC^GGC
BstXI      CCAN_NNNN^NTGG           NarI           GG^CG_CC
BstYI      R^GATC_Y                 *NcoI          C^CATG_G
BstZ17I    GTA^TAC                  *NdeI          CA^TA_TG
Bsu36I     CC^TNA_GG                *NgoMIV        G^CCGG_C
BtgI       C^CRYG_G                 *NheI          G^CTAG_C
BtrI       CAC^GTC                  Nli3877I       C_YCGR^G
BtsI       GCAGTG_NN               ^*NotI          GC^GGCC_GC
CfrI       Y^GGCC_R                 *NruI          TCG^CGA
Cfr10I     R^CCGG_Y                 *NsiI          A_TGCA^T
*ClaI      AT^CG_AT                 NspI           R_CATG^Y
DraI       TTT^AAA                  NspBII         CMG^CKG
DraII      RG^GNC_CY                *PacI          TTA_AT^TAA
DrdII      GAACCA                   *PciI          A^CATG_T
DsaI       C^CRYG_G                 Pfl1108I       TCGTAG
EaeI       Y^GGCC_R                 *PflMI         CCAN_NNN^NTGG
EagI       C^GGCC_G                 PmaCI          CAC^GTG
Ecl136II   GAG^CTC                  PmeI           GTTT^AAAC
酶          识别序列              酶           识别序列
PmlI        CAC^GTG               *VspI        AT^TA_AT
Ppu10I      A^TGCA_T              *XbaI        T^CTAG_A
*PpuMI      RG^GWC_CY             *XhoI        C^TCGA_G
PshAI       GACNN^NNGTC           XhoII        R^GATC_Y
PsiI        TTA^TAA               *XmaI        C^CCGG_G
*PspOMI     G^GGCC_C              XmaIII       C^GGCC_G
PssI        RG_GNC^CY             XmnI         GAANN^NNTTC
*PstI       C_TGCA^G              ZraI         GAC^GTC
*PvuI       CG_AT^CG
*PvuII      CAG^CTG
RsrII       CG^GWC_CG
*SacI       G_AGCT^C
*SacII      CC_GC^GG
*SalI       G^TCGA_C
SanDI       GG^GWC_CC
SapI        GCTCTTCN^NNN
SauI        CC^TNA_GG
SbfI        CC_TGCA^GG
*ScaI       AGT^ACT
SciI        CTC^GAG
SduI        G_DGCH^C
SexAI       A^CCWGG_T
SfcI        C^TRYA_G
SfeI        C^TRYA_G
SfiI        GGCCN_NNN^NGGCC
SfoI        GGC^GCC
SgfI        GCG_AT^CGC
SgrAI       CR^CCGG_YG
*SmaI       CCC^GGG
SmlI        C^TYRA_G
SnaI        GTATAC
*SnaBI      TAC^GTA
*SpeI       A^CTAG_T
*SphI       G_CATG^C
SplI        C^GTAC_G
SrfI        GCCC^GGGC
Sse232I     CG^CCGG_CG
Sse8387I    CC_TGCA^GG
Sse8647I    AG^GWC_CT
*SspI       AAT^ATT
*StuI       AGG^CCT
*StyI       C^CWWG_G
*SwaI       ATTT^AAAT
TatI        W^GTAC_W
UbaMI       TCCNGGA
UbaPI       CGAACG
模式搜索可以用来寻找潜在的去稳定化序列和多腺苷酸化位点并且然后按照美国专利号.5,500,365中描述的来破坏或消除它们。一定长度连续的富含AT区域，例如序列基序ATTTA(或者在RNA中显示为AUUUA)已经被显示在哺乳动物细胞mRNA中为去稳定化序列(Shaw和Kamen，Cell 46：659-667，1986)。许多短的有生物活性的mRNA具有富含A+T的3’非翻译区域，并且这些区域经常含有ATTTA序列，有时以多拷贝或多聚体(例如，ATTTATTTA...)的形式出现。Shaw和Kamen展示将不稳定的mRNA的3’末端转移到稳定的RNA(珠蛋白或VA1)上将显著的降低稳定的RNA的半衰期。他们进一步展示ATTTA五聚体对于稳定的信息具有很大的去稳定化作用，并且无论这种信号定位在3’末端或者在编码序列内都能够发挥它的作用。然而，ATTTA序列的数目和/或它们出现的前后序列看来也对于它们是否起去稳定化序列作用很重要。他们还显示对于mRNA的稳定性ATTTA的三聚体比五聚体具有少很多的作用并且二聚体或单体对于稳定性没有作用。应该注意例如象五聚体这样的ATTTA的多聚体自动的产生A+T的富含区域。在其它不稳定的mRNA中，ATTTA序列可能仅以单拷贝的形式出现，但是经常包含在富含A+T区域。11个AUUUA五聚体的重复已经显示在植物中引导报道基因转录物快速降解(OhmeTakagi等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA90，11811-11815，1993)。ATTTA序列能够通过将氨基酸Ile(ATT)和Tyr(TAT)的密码子联合来形成，如ATTTAT所示。另一个例子可以是以AT结尾的密码子例如Asn，Asp，His或Tyr之后是Leu的TTA密码子(例如AATTTA)。也可以是当将Phe(UUU)的密码子放在以A结尾和以A开头的密码子之间，将会形成ATTTA基序。为了消除这样的基序通常单核苷酸的改变就足够了，例如在以下例子中所显示的：GCATTTAGC换成GCATTCAGC或GCCTTTAGC。所有显示的三个多核苷酸均编码Ala-Phe-Arg。
在植物或其它系统中的引导转录物快速周转的更多反式作用序列已经被鉴定(Abler和Green，Plant Mol.Biol.32：63-78，1997)。那些序列包括DST组件，该组件由在SAUR转录物的终止密码子的下游发现的两个可变区域分隔的三个高度保守的亚区域组成(Newmaan等，Plant Cell 5：701-714，1993)。DST保守序列由GGAG(N5)CATAGATTG(N7)CATTTGTAT所组成，其中高度保守的残基以斜体字表示出来。DST组件的第二和第三个亚区域包含在DST组件中不变的残基并且分别称为ATAGAT和GTA。那两个亚结构域对于DST功能是必需的。对新的人工多核苷酸序列筛选DST组件的保守基序GGAG，ATAGATT，CATTT和CATTTTGTAT的存在。那些序列可以通过对密码子进行碱基替代来消除并保持由该多核苷酸编码的蛋白序列不变。出现在与保守DST序列相似的簇或模式中的DST序列基序GGAG，ATAGAT，CATTT和GTAT也通过碱基替代来消除。
可能起多腺苷酸化位点作用的多核苷酸序列在新的多核苷酸设计中被消除(美国专利号.5,500,365)。这些多腺苷酸化信号可能不像正常的poly A位点起作用而是作为异常的位点起作用导致不稳定的mRNA。
对mRNA3’末端加入多腺苷酸化列对于大部分真核mRNA是普通的。在该mRNA转录物中含有多腺苷酸化和形成正确3’末端的信号。这种在3’末端的加工包括对mRNA的剪接以及对成熟3’末端加入poly A。通过对植物和动物mRNA接近poly A区域的一致序列的搜索已经可能鉴定出明显参与到poly A加入以及3’末段剪接的一致序列。同样的一致序列看来对于这些加工是重要的。这些信号一般是序列AATAAA的变体。在动物细胞中，此序列的一些变体已经被鉴定出来了；在植物细胞中，似乎存在功能序列的扩大范围(Dean等，Nucl Acid Res.，14：2229-2240，1986；Hunt，Annu Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol 45：47-60，1994；Rothine，Plant Mol.Biol.32：43-61，1996)。所有这些一致序列是AATAAA的变体，因此，它们都是富含A+T序列。
一般，为了在植物中获得修饰的转基因足够的表达，存在的编码目标蛋白的结构多核苷酸编码序列(“结构基因”)通过移除ATTTA序列和假定的多腺苷酸化信号来修饰，移除是通过对于包含结构基因的DNA进行定点诱变来完成的。虽然仅移除一些以上鉴定的多腺苷酸化信号序列经常可观察到提高的表达水平，但是在修饰的多核苷酸中移除基本所有的已知的多腺苷酸化信号和ATTTA序列。可选择地，如果人工多核苷酸被制备来编码目标蛋白那么应该选择密码子来避免ATTTA序列和假定的多腺苷酸化信号。对于本发明的目的，假定的多腺苷酸化信号包括但不必须局限于：AATAAA，AATAAT，AACCAA，ATATAA，AATCAA，ATACTA，ATAAAA，ATGAAA，AAGCAT，ATTAAT，ATACAT，AAAATA，ATTAAA，AATTAA，AATACA和CATAAA。
对所选的DNA序列进行扫描以鉴定含有超过四个连续的腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)核苷酸的区域。扫描A+T区域来寻找潜在的植物多腺苷酸化信号。虽然缺少五个或更多的连续的A或T核苷酸会消除大部分植物的多腺苷酸化信号，但如果在彼此十个核苷酸内具有超过一个已经鉴定的次级多腺苷酸化信号，那么这个区域的核苷酸序列被改变来移除这些信号并且保持原有的编码的氨基酸序列。
下一步是确认富含A+T区域周围的大约15个到大约30个的核苷酸残基。如果周围的区域A+T含量少于80％，应该检查该区域是否具有多腺苷酸化信号。该区域基于多腺苷酸化信号的的改变依赖于(1)存在的多腺苷酸化信号的数目和(2)主要的植物多腺苷酸化信号的存在。对于多腺苷酸化信号的移除是通过对于密码子替换的前后的DNA序列进行碱基替代完成的。
在美国专利号.5,500,365中没有鉴定的两个额外的模式在本发明的实施方案中被搜索出来并消除了。序列AGGTAA和GCAGGT分别是单子叶植物和双子叶植物的内含子的5’和3’剪接位点的一致序列。对于精确的匹配来说仅需要5’剪接连接位点的GT和3’剪接位点的AG。然而当对这些一致序列进行搜索的时候不允许有每一碱基的错配。
在每一步之后利用来自GCG的MAP程序进行序列作图来决定可读框的定位和鉴定需要进一步被修饰的序列模式。最后的步骤应该是利用程序进行序列同一性分析来决定序列趋异的程度和同一性百分比，这样的程序例如来自GCG程序包中的GAP程序。
多肽
通常，从人工多核苷酸翻译得来的蛋白与从未修饰的编码区翻译得来的蛋白具有相同的氨基酸序列。然而，对编码提供蛋白功能性同源物氨基酸的密码子进行替代是本发明的一个方面。例如，在蛋白结构中某些氨基酸被其他氨基酸所替代而没有明显的结构上的相互作用结合能力的丧失例如，抗体的抗原结合区或底物分子的结合位点。因为是蛋白的相互作用能力和特性赋予蛋白的生物学功能活性，所以可以在蛋白序列中某些氨基酸序列进行替代并且当然可以在其原始的DNA编码序列中进行，并且仍然可以获得具有相似性质的蛋白。因此发明者预期可以在公开的组合物的肽序列上引入多种变化，这是通过在相应的编码该肽的DNA序列上进行变化而完成的，并且其中该肽没有明显的丢失其生物学效用或生物学活性。
本发明的进一步的方面包括功能性同源物，也就是通过对一个或更多的氨基酸进行保守的替代结果得到与此处提供的多肽在一个或更多的氨基酸上不同的多肽。天然序列中的一个或更多的氨基酸可以被至少一种另外氨基酸所替代在本领域中是众所周知的，其中该氨基酸的电荷和极性与天然氨基酸的相似，因此造成沉默改变。例如，缬氨酸是丙氨酸的保守替代物并且苏氨酸是丝氨酸的保守替代物。对于天然多肽序列中的氨基酸的保守替代可以从天然存在的氨基酸所属的类中的其它成员中选择。氨基酸可以被分为以下四组：(1)酸性氨基酸，(2)碱性氨基酸，(3)中性极性氨基酸和(4)中性非极性氨基酸。这些不同组中的代表氨基酸包括但不局限于：(1)酸性(负电荷)氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(正电荷)氨基酸例如精氨酸，组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸例如甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺；以及(4)中性非极性(疏水)氨基酸例如丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。对于天然氨基酸序列中的氨基酸的保守替代物可以从天然存在的氨基酸所属的组中的其它成员中选择。例如，具有脂族侧链的氨基酸的组是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的氨基酸的群是丝氨酸和苏氨酸；具有含有酰胺侧链的氨基酸的组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸的组是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；并且具有含硫的侧链的氨基酸的组是半胱氨酸和甲硫氨酸。自然地保守的氨基酸替代的组是：缬氨酸-亮氨酸，缬氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
DNA构建体
外源遗传物质可以通过利用为了应用农杆菌属，微粒轰击或本领域技术人员所知的其它方法的目的设计的DNA构建体转入植物中。设计这样的DNA构建体是本领域中公知的技术(Plant MolecularBiology：A Laboratory Manual，eds.Clark，Springer，New York(1997))。能够转入外源遗传物质的植物的例子包括，但不局限于苜蓿，拟南芥属，大麦，芥属(Brassia)，嫩基花椰菜，卷心菜，柑桔，棉花，大蒜，燕麦，油菜籽，洋葱，canola，亚麻，玉米，观赏用一年生和观赏用多年生植物，豌豆，花生，胡椒，马铃薯，水稻，黑麦，高粱，大豆，草莓，甘蔗，甜菜，西红柿，小麦，杨树，松树，杉树，桉树，苹果，莴苣，小扁豆，葡萄，香蕉，茶，草坪草，向日葵，油椰子，菜豆属(Phaseolus)，树木，灌木，蔓生植物等等。众所周知农业上重要的植物包括基因型，变种和栽培品种，本发明的方法和组合物可以由领域的技术人员植物分子生物学和植物育种领域的技术人员在这些植物中测试。
大量的分离的DNA启动子分子可以作为植物细胞中转基因的遗传因子起作用，这些已经有所描述。这些启动子包括胭脂碱合酶(P-nos)启动子(Evert等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：5745-5749，1987，此处将其整体引入作为参考)，章鱼氨酸合酶(P-ocs)启动子，其在根癌农杆菌(Agrobacterium)，花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等，Plant Mol.Biol.9：315-324，1987此处将其整体引入作为参考)以及CaMV35S启动子(Odell等，Nature 313：810-812，1985，此处将其整体引入作为参考)，玄参花叶病毒35S启动子(美国专利号.6,018,100，此处将其整体引入作为参考)，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)光诱导型启动子，Adh启动子(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：6624-6628，1987，此处将其整体引入作为参考)，蔗糖合酶启动子(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：4144-4148，1990，此处将其整体引入作为参考)，R基因复合物启动子(Chandler等，Plant Cell 1：1175-1183，1989，此处将其整体引入作为参考)，和叶绿素a/b结合蛋白基因启动子，等等。
各种在营养组织中例如叶，茎，根和块茎，特异地起作用的启动子，能够被用来表达本发明的核苷酸分子。块茎特异的启动子的例子包括，但不局限于I和II类patatin启动子(Bevan等，EMBO J.8：1899-1906，1986；Koster-Topfer等，Mol Gen Genet.219：390-396，1989；Mingery等，Gene 62：27-44，1988；Jefferson等，PlantMol.Biol.14：995-1006，1990，此处将其整体引入作为参考)，马铃薯块茎ADPGPP基因启动子的大亚基和小亚基；蔗糖合酶启动子(Salanoubat和Belliard Gene 60：47-56，1987，Salanoubat和Belliard，Gene 84：181-185，1989，此处将其整体引入作为参考)；主要块茎蛋白包括22kd蛋白复合物和蛋白酶抑制剂的启动子(Hannapel，Plant Physiol.101：703-704，1993，此处将其整体引入作为参考)。叶子特异的启动子的例子包括但不局限于核酮糖二磷酸羧化酶(RbcS或RuBISCO)启动子(可见例如Matsuoka等Plant J.6：311-319，1994此处将其整体引入作为参考)；集光叶绿素a/b结合蛋白基因启动子(可见例如，Shiina等Plant Physiol.115：477-483，1997；Casal等Plant Physiol.116：1533-1538，1998，此处将其整体引入作为参考)和拟南芥myb相关基因启动子(Atmyb5)(Li等，FEBS Lett.379：117-121，1996，此处将其整体引入作为参考)。根特异的启动子的例子包括但不局限于酸性壳多糖酶基因启动子(Samac等，Plant Mol.Biol.25：587-596，1994，此处将其整体引入作为参考)；已经鉴定的根特异的CaMV35S启动子亚结构域(Lam等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86：7890-7894，1989，此处将其整体引入作为参考)；来源于主根农杆菌(Agrobacterium Mizogenes)的在根中展现高活性的ORF13启动子(Hansen等，Mol.Gen.Genet.254：337-343，1997，此处将其整体引入作为参考)；烟草根特异基因RB7启动子(美国专利5,750,386；Yamamoto等，Plant Cell 3：371-382，1991，此处将其整体引入作为参考)；和由Conkling等报告的根细胞特异启动子(Conkling等Plant Physiol.93：1203-1211，1990，此处将其整体引入作为参考)；以及POX1(Pox1，pox1)启动子(Hertig等，Plant Mol.Biol.16：171，1991)。
另一类可用的营养组织特异性启动子是分生组织(根尖和苗端)启动子。例如，“SHOOTMERISTEMLESS”和“SCARECROW”启动子可以被应用，它们是在发育的苗和根尖端的分生组织中有活性的(DiLaurenzio等，Cell 86：423-433，1996；Long，Nature 379：66-69，1996；此处将其整体引入作为参考)。另一个可用的启动子的例子是控制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶HMG2基因表达的启动子，该基因的表达是严格的在分生或花(柱头的分泌区，成熟的花粉粒，雌蕊群维管组织和已受精的胚珠)组织(可见例如，Enjuto等，PlantCell.7：517-527，1995，此处将其整体引入作为参考)。还有另一个可用的启动子的例子是来自于玉米和其它物种的控制kn1相关基因表达的启动子，它显示了分生组织特异性表达(可见例如，Granger等，Plant Mol.Biol.31：373-378，1996；Kerstetter等，Plant Cell6：1877-1887，1994；Hake等，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.350：45-51，1995，此处将其整体引入作为参考)。另一个分生组织启动子的例子是拟南芥KNAT1启动子。在苗端，KNAT1转录物主要定位在苗端分生组织中；在苗芽分生组织中，KNAT1的表达在花的转变过程中减少并且特异定位在开花茎的皮层中(可见例如，Lincoln等，Plant Cell 6：1859-1876，1994，此处将其整体引入作为参考)。
合适的种子特异的和增强的启动子可以从以下的基因中衍生得到：来自玉米的MACl(Sheridan等，Genetics 142：1009-1020，1996，此处将其整体引入作为参考)；来自玉米的Cat3(Genbank No.L05934，Abler等，Plant Mol.Biol.22：10131-1038，1993，此处将其整体引入作为参考)；来自于拟南芥属的vivparous-1(Genbank No.U93215)；来自拟南芥属的Atimycl(Urao等，Plant Mol.Biol.32：571-57，1996；Conceicao等，Plant 5：493-505，1994，此处将其整体引入作为参考)；来自油菜(Brassica napus)的napA(GenbankNo.J02798)；来自油菜的napin基因家族(Sjodahl等，Planta 197：264-271，1995，此处将其整体引入作为参考)。
对于BEL1基因的胚珠特异性启动子(Reiser等Cell 83：735-742，1995，Genbank No.U39944；Ray等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5761-5765，1994，在此将所有文献整体引入作为参考)也可以被应用。卵和中央细胞特异的MEA(FIS1)和FIS2启动子也是有用的生殖组织特异性启动子(Luo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：10637-10642，2000；Vielle-Calzada等，Genes Dev.13：2971-2982，1999；此处将其整体引入作为参考)。
玉米花粉特异性启动子已经在玉米中被鉴定出来(Guerrero等，Mol.Gen.Genet.224：161-168，1990，此处将其整体引入作为参考)。其它的在花粉中特异表达的基因已经有所描述(可见，例如Wakeley等，Plant Mol.Biol.37：187-192，1998；Ficker等，Mol.Gen.Genet.257：132-142，1998；Kulikauskas等，Pl ant Mol.Biol.34：809-814，1997；Treacy等，Plant Mol.Biol.34：603-611，1997；此处将其整体引入作为参考)。
从编码胚胎贮存蛋白的基因获得的启动子也可以被应用，这包括来自于油菜的编码2S贮存蛋白的基因(Dasgupta等，Gene 133：301-302，1993此处将其整体引入作为参考)；来自于拟南芥属的2S种子贮存蛋白基因家族；来自油菜的编码20kD的油质蛋白的基因(Genbank No.M63985)；来自大豆的编码油质蛋白A(GenbankNo.U09118)和油质蛋白B(Genbank No.U09119)的基因；来自拟南芥属编码油质蛋白的基因(Genbank No.217657)；来自玉米的编码18KD油质蛋白的基因(Genbank No.J05212，Lee，Plant Mol.Biol.26：1981-1987，1994，此处将其整体引入作为参考)；以及来自于大豆的编码富含硫的低分子量蛋白的基因(Choi等，Mol.Gen.Genet.246：266-268，1995，此处将其整体引入作为参考)。
来自于玉米醇溶蛋白编码基因(包括15kD，16kD，19kD，22kD，27kD和γ基因；Pedersen等，Cell 29：1015-1026，1982，此处将其整体引入作为参考)的启动子也可以被应用。玉米醇溶蛋白是在玉米胚乳中发现的一组贮存蛋白。
其它已知的在玉米中起作用的启动子例如，包括对于以下基因的启动子：waxy，Brittle，Shrunken2，分支酶I和II，淀粉合酶，支链淀粉酶，油质蛋白，谷蛋白和蔗糖合酶。对于玉米胚乳表达特别优选的启动子是来自于水稻的谷蛋白基因的启动子，更加具体的Osgt-1启动子(Zheng等，Mol.Cell Biol.13：5829-5842，1993，此处将其整体引入作为参考)。适合在小麦中表达的启动子的例子包括对于ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPP)亚基的，颗粒体结合或其它淀粉合酶，分支酶和支链淀粉酶，胚胎发生-富含蛋白，麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的启动子。在水稻中这样的启动子的例子包括针对于ADPGPP亚基的，颗粒体结合或其它淀粉合酶，分支酶，支链淀粉酶，蔗糖合酶和谷蛋白的启动子。特别优选的启动子是对于水稻谷蛋白的启动子，Osgt-1。对于大麦这样的启动子的例子包括针对于ADPGPP亚基的，颗粒体结合或其它淀粉合酶，分支酶，支链淀粉酶，蔗糖合酶，大麦醇溶蛋白，胚胎球蛋白和糊粉特异蛋白的启动子。
番茄的在果实成熟，衰老和叶子脱落以及在更小的程度上花的脱落过程中有活性的启动子可以被应用(Blume等，Plant J.12：731-746，1997，此处将其整体引入作为参考)。其它示例性的启动子包括马铃薯(Solanum tuberosum L.)SK2基因中的雌蕊特异性启动子，它编码雌蕊特异性碱性内切壳多糖酶(Ficker等，Plant Mol.Biol.35：425-431，1997，此处将其整体引入作为参考)；来自豌豆(Pisum sativumcv.Alaska)的Blec4基因，该基因在转基因紫花苜蓿的营养和花的苗端表皮组织中有活性。这使得它成为将外源基因的表达定位在活化生长的苗的表皮层的有用工具。来自番茄的组织特异性E8启动子也可用于指导基因在果实中表达(Deikman等，Plant Physiology 100：2013-2017，1992)。
由于在大多数的例子中调节序列的精确的边界并没有被完全确定所以不同长度的DNA片段可能具有同样的启动子活性这一点已经被进一步地认识到了。
已知或发现的能够导致DNA在植物细胞中转录的启动子可以用于本发明。这样的启动子可以从不同的来源获得例如植物和植物病毒。除了能够导致DNA在植物细胞中转录的启动子以外，其它的可能被鉴定用于本发明的启动子分子中，这可以通过筛选植物cDNA文库来检索选择性或优选他在目标组织或细胞内表达的基因并分离该鉴定的cDNA的5’基因组区域来获得。
构建体或载体可能也包括目标编码区域和一个多核酸，该多核酸完全或部分地终止该区域转录。例如，这样的序列已经被分离出来，其包括Tr7 3’序列和nos 3’序列(Ingelbrecht等，The Plant Cell1：671-680，1989，此处将其整体引入作为参考；Bevan等，NucleicAcids Res.11：369-385，1983，此处将其整体引入作为参考)。
载体或构建体可能也包括调节组件。这样的例子包括Adh内含子1(Callis等，Genes and Develop.1：1183-1200，1987，此处将其整体引入作为参考)，蔗糖合酶内含子(Vasil等，Plant Physiol.91：1575-1579，1989，此处将其整体引入作为参考)和TMVω元件(Gallie等，Plant Cell 1：301-311，1989，此处将其整体引入作为参考)。当合适的时候这些和其它的调节组件也可以被包括进来。
载体或构建体也可能包括选择性标记。选择性标记也可能被用于选择包含外源遗传物质的植物或植物细胞。这样的例子包括，但不局限于，neo基因(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199：183-188，1985，此处将其整体引入作为参考)它编码卡那霉素抗性并且可用卡那霉素、G418等进行选择；bar基因，它提供双丙氨酰膦的抗性；突变的EPSP合酶基因(Hinchee等，Bio/Technology 6：915-922，1988，此处将其整体引入作为参考)它提供草甘膦抗性；腈水解酶基因，它提供溴苯腈的抗性(Stalker等，J.Biol.Chem.263：6310-6314，1988，此处将其整体引入作为参考)；突变的乙酰乳酸合酶基因(ALS)它提供咪唑啉酮或磺酰脲；以及氨甲蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，J.Biol.Chem.263：12500-12508，1988，此处将其整体引入作为参考)。
载体或构建体可能也包括筛选标记。筛选标记可能用于检测表达。示例性的筛选标记包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，该基因编码一种酶，这种酶的各种显色底物已知(Jefferson，Plant Mol.Biol，Rep.5：387-405，1987此处将其整体引入作为参考；Jefferson等，EMBO J.6：3901-3907，1987，此处将其整体引入作为参考)；R-locus基因，它编码的产物调节花色素苷色素(红色)在植物组织中的产生(Dellaporta等，Stadler Symposium 11：263-282，1988，此处将其整体引入作为参考)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)75：3737-3741，1978，此处将其整体引入作为参考)，该基因编码的酶的各种显色底物已知(例如，PADAC，一种显色的头孢菌素)；萤光素酶基因(Ow等，Science 234：856-859，1986，此处将其整体引入作为参考)；xylE基因(Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)80：1101-1105，1983，此处将其整体引入作为参考)，该基因编码儿茶酚双加氧酶，这种酶能转化显色的儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikatu等，Bio/Technol.8：241-242，1990，此处双)；酪氨酸酶基因(Katz等，J.Gen.Microbiol.129：2703-2714，1983，此处双)，该基因编码一种能够氧化酪氨酸成DOPA和多巴醌并且随后浓缩成黑色素的酶和α-半乳糖苷酶。
将多核苷酸导入植物
有很多种将转化性核酸分子导入植物细胞的方法。可以相信合适的方法实际上包括任何可以将核酸分子导入细胞的方法，例如通过农杆菌感染或直接将核酸分子导入，例如，通过PEG介导的转化，通过电穿孔或通过对DNA包被的微粒加速等等(Potrykus，Ann.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.42：205-225，1991，此处将其整体引入作为参考；Vasil，Plant Ml.Biol.25：925-937，1994，此处将其整体引入作为参考)。例如，电穿孔已经被用于转化玉米原生质体(Fromm等，Nature 312：791-793，1986，此处将其整体引入作为参考)。
其它的合适于将转化性DNA导入到宿主植物细胞内的载体系统包括但不局限于二元人工染色体(BIBAC)载体(Hamilton等，Gene 200：107-116，1997，此处将其整体引入作为参考)，和利用RNA性病毒载体转染(Della-Cioppa等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1996，792ppEngineering Plants for Commercial Products and Applications，pp57-61，此处将其整体引入作为参考)。
对于本领域技术人员来说将DNA导入细胞的技术是众所周知的。已经有四种常规的将基因导入细胞的方法被描述：(1)化学方法(Graham和van der Eb，Virology 54：536-539，1973，此处将其整体引入作为参考)；(2)物理的方法例如微注射(Capecchi，Cell 22：479-488，1980，此处将其整体引入作为参考)，电穿孔法(Wong和Neumann，Biochem.Biophys.Res.Commun.107：584-587，1982；Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82：5824-5828，1985；美国专利号.5,384,253此处全部将其整体引入作为参考)和基因枪(Johnston和Tang，Methods Cell Biol.43：353-365，(1994)，此处将其整体引入作为参考)；(3)病毒载体(Clapp，Clin.Perinatol.20：155-168，1993；Lu等，J.Exp.Med.178：2089-2096，1993；Eglitis和Anderson，Biotechniques 6：608-614，1988，此处将其整体引入作为参考)和(4)受体介导机制(Curiel等，Hum.Gen.Ther.3：147-154，1992，Wanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6099-6103，1992，此处全部将其整体引入作为参考)。
可能被用到的加速的方法包括，例如，微粒轰击等。递送转化性核酸分子到植物细胞内的方法一个例子是微粒轰击。这种方法已经在Yang和Christou，eds.，Particle Bombardment Technology for GeneTransfer，Oxford Press，Oxford，England，1994中有所评述，此处将其整体引入作为参考。非生物学粒子(微粒)可以用核酸包被并且通过推进力递送入细胞。示例性的粒子包括那些由钨，金，铂等构成的。
农杆菌介导的转移对于将基因导入植物细胞是一种广泛应用的系统因为DNA可以被导入到整个的植物组织中，因此避开了从原生质体再生成一个完整植物的需要。利用农杆菌介导的植物整合载体来将DNA导入到植物细胞中在本领域中是众所周知的。可见，例如由Fraley等，Bio/Technology 3：629-635，1985和Rogers等，Methods Enzymol.153：253-277，1987中描述的方法，此处将两者整体引入作为参考。进一步，Ti-DNA的整合是在极少数的重排中产生的相对精确的加工。将要转移的DNA区域是通过边界序列定义的且间插DNA通常是按照以下的描述插入到植物基因组中(Spielmann等，Mol.Gen.Genet.205：34，1986，此处将其整体引入作为参考)。
来自于农杆菌转化方法的转基因植物经常在一个染色体上包含单一基因。这样的转基因植物被认为对于加入基因是半合子的。更优选的是转基因植物对于加入的结构基因是纯合的；即转基因植物含有两个加入的基因，在一对染色体中每一个染色体的相同的位置各有一个基因。纯合的转基因植物能够通过如下方法获得，即，将含有单一加入基因的独立分离的转基因植物进行有性交配(自交)，产生一些种子并且分析所得植物中的目标基因。
也可以理解两种不同的转基因植物可以通过交配来产生含有两种独立分离的加入的外源基因的后代。合适的后代的自交能够产生对两种加入的能够编码目标多肽的外源基因纯合的植物。与亲本回交和与非转基因植物远交也可以被预期，营养繁殖也是如此。
从单一的植物原生质体转化体或多个转化的外植体再生，发育并培养成植物在本领域中是众所周知的(Weissbach和Weissbach，In：Methods for Plant Molecular Biology，(eds.)，Academic Press，Inc.San Diego，CA，(1988)，此处将其整体引入作为参考)。这样的再生和成长的过程一般包括以下的步骤，即对于转化细胞的选择，将这些个体化的细胞培养到经过正常胚胎发育阶段。转基因的胚和种子被相似地再生。之后将得到的转基因的有根的苗植入合适的植物生长培养基例如土壤中。
对于含有外来的，外源的能够编码目标蛋白的基因的植物的发育和再生在本领域中是众所周知的。优选的，再生的植物自体授粉来产生纯合的转基因植物。否则，从再生植物获得的花粉与在农业上重要的品系的由种子成长的植物杂交。相反地，来自于这样重要品系的花粉也被用于授粉到再生植物。包含所需的多肽的本发明的转基因植物利用本领域技术人员所熟知的方法来培养。
本发明也提供本发明的植物的部分。植物的部分包括但不局限于种子，胚乳，胚珠和花粉。在本发明的优选的实施方案中，植物的部分是种子。
主要应用根癌农杆菌转化双子叶植物并获得转基因植物的方法已经被发表例如，棉花(美国专利号.5,004,863，美国专利号.5,159,135，美国专利号.5,518,908，此处全部将其整体引入作为参考)，大豆(美国专利号.5,569,384此处将其整体引入作为参考)和芥属(美国专利号.5,463,174，此处将其整体引入作为参考)。
利用电穿孔，微粒轰击和农杆菌对于单子叶植物转化也已经被报告。例如，对于芦笋，大麦，玉米(Formm等，Bio/Technology 8：833，(1990)，Armstrong等，Crop Science 35：550-557，(1995)，此处全部将其整体引入作为参考)；燕麦；水稻，黑麦，甘蔗；高酥油草(tallfescue)和小麦(美国专利号.5,631,152，此处将其整体引入作为参考)的转化和植物再生已经实现了。
除了以上讨论的方案，从业者对于描述大分子(例如DNA分子，质粒等)的构建，操作和分离，重组生物的再生和克隆的筛选和分离的特定条件和程序的标准来源材料是熟悉的(见例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，(1989)；Mailga等，Methods in Plant Molecular Biology，ColdSpring Harbor Press，(1995)，此处将其整体引入作为参考；Birren等，Genome Analysis：Detecting Genes，1，Cold Spring Harbor，NewYork，(1998)，此处将其整体引入作为参考；Birren等，GenomeAnalysis：Analyzing DNA，2，Cold Spring Harbor，New York，(1998)，此处将其整体引入作为参考；Plant Molecular Biology：A LaboratoryManual，eds.Clark，Springer，New York，(1997)，此处将其整体引入作为参考)。
现在已经对本发明进行了一般性的描述，在参考以下的实施例的情况下可以更容易地理解本发明，以下的实施例是以说明的方式给出的，并且在没有特别提出的情况下是不限制本发明的。
实施例
实施例1
当含有编码序列的分离的天然的植物多核苷酸被重构成转移基因，然后通过植物转化的方法转入植物的时候存在内源的同源植物基因的表达对转基因的表达起到负的相互作用的风险。为了避免这些负的相互作用可能必须提供在序列上与天然植物基因基本不同的转基因多核苷酸。人工多核苷酸可以通过本发明的方法制备并用来减少转基因沉默的发生。
这个实施例的目的是说明本发明的方法，该方法的结果是产生编码修饰的植物EPSP合酶的多核苷酸。天然水稻(Oryzae sativa)EPSPS酶和叶绿体转运肽被用来构建人工多核苷酸分子，该分子也包括编码在水稻EPSPS酶中不天然存在的替代的氨基酸的密码子。这些替代的氨基酸提供了草甘膦抗性水稻EPSPS酶(OsEPSPS_TIPS，SEQ ID NO：1)。
在表6中描述的步骤用于构建这样的人工多核苷酸序列(OsEPSPS_AT，SEQ ID NO：3)，该序列应用拟南芥属密码子使用表和用于构建基本不同的多核苷酸分子的参数，该序列在植物中表达的时候编码一种修饰的对于草甘膦除草剂抗性的水稻EPSPS酶。命名为OsEPSPS_Nat(SEQ ID NO：2)的天然水稻EPSPS基因序列与利用这种方法利用拟南芥属密码子使用表修饰的多核苷酸分子，OsEPSPS_AT(SEQ ID NO：3)以及利用玉米密码子使用表修饰的序列OsEPSPS_ZM(SEQIDNO：4)的比较在图1中显示，其中天然的水稻EPSPS基因序列已经预先被修饰来编码草甘膦抗性的酶。图1显示在与OsEPSPS_Nat，SEQ ID NO：2比较的修饰的多核苷酸的核苷酸中碱基的变化。
表6.为产生修饰的水稻EPSP合酶设计的多核苷酸(OsEPSPS_AT)
1.在173和177位进行氨基酸替代来产生对于草甘膦除草剂抗性的修饰的水稻EPSPS酶，在SEQ ID NO：1中显示。
2.利用拟南芥密码子使用表(表2)将SEQ ID NO：1反向翻译来产生人工多核苷酸序列。
3.将天然OsEPSPS多核苷酸序列(SEQ ID NO：2)和人工多核苷酸序列进行序列比对来决定序列同一性程度，确定可读框，选择模式来搜索并鉴定限制酶识别序列。
4.对该人工多核苷酸序列所使用的密码子进行校正来达到所需的序列同一性百分比和避免相同密码子成簇。这对于以高频率出现的氨基酸，即，丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸和缬氨酸，是非常重要的。在该多核苷酸序列中密码子使用的大约分布按照拟南芥属密码子使用表，表2。
5.该多核苷酸序列被检查来发现在大约50个连续核苷酸范围内GC:AT比例高于约2的局部区域。按需要对该多核苷酸序列进行调整，通过在这些区域中进行密码子替代以使得局部的GC:AT比例小于约2并且整个多核苷酸组成在0.9-1.3的范围之内。
6.在翻译框“b”，“c”，“d”，“e”和“f”引入终止密码子。通过在该人工多核苷酸末尾的大约130个碱基对内替换一个或更多的密码子来在翻译框“b”，“c”，“d”，“e”和“f”中产生翻译终止密码子并且不改变框一的氨基酸编码序列。
7.从正向的(框“b”和“c”)和反向可读框(框“d”，“e”和“f”)中消除ATG密码子。前正向的和反向的阅读框被检查来发现ATG密码子的存在。在该多核苷酸序列框“b”和“c”中发现的在框“a”第三个Met之前的任何ATG密码子通过替代重叠ATG的一个或多个密码子从而改变一个核苷酸而不改变框“a”的氨基酸编码序列来消除。在反向阅读框中，通过替代ATG或引入终止密码子来中断潜在的阅读框。
8.消除不必要的限制酶识别模式和其它的特异模式(多腺苷酸化，RNA剪接，序列去稳定化模式)。该多核苷酸序列被检查来发现任何不必要的多核苷酸模式的存在并且这样的模式通过在这些区域进行密码子替代来破坏。
9.检查第一条多核苷酸与通过本发明方法产生的该人工多核苷酸的序列同一性。消除长度超过23bps的连续多核苷酸的序列同一性。消除长度大于15bps的序列同一性是需要的。从例如丝氨酸，精氨酸和亮氨酸这样有6个密码子的氨基酸或从含有4个密码子的氨基酸中选择出合适的氨基酸对于消除序列同一性是有作用的。
10.检查从步骤1到9中任何一个产生的该人工多核苷酸是否符合步骤4-9中鉴定的任何序列特征，并且如果序列不符合条件则对序列进行额外的密码子替代直到符合步骤4-9中的条件。
11.利用本领域中已知的方法来构建该人工多核苷酸分子，例如，利用重叠的引物的混合物进行PCR。基因末端的引物可能含有方便的限制位点来使得可以简单的将该基因克隆到所选的载体中。在含有ATG起始密码子的序列中的5’末端通常A1fIII，BspHI，NcoI，NdeI，PciI，或SphI是最方便的，然而如果修饰的多核苷酸被设计来与另一个多核苷酸片段产生融合体，例如，叶绿体转运肽与EPSPS编码序列，那么也可使用其它的酶。
12.对该人工多核苷酸进行DNA序列分析来确认在该所需的多核苷酸分子中产生合成的构建体。如果发现错误，那么通过DNA突变发生领域技术人员所知的许多方法的定点诱变来消除这些错误。
对于草甘膦抗性的水稻EPSPS酶序列(具有TIPS突变的水稻EPSPS酶，SEQ ID NO：1)的玉米密码子使用(玉米，表3)版本已经制出。编码这种酶的多核苷酸包括编码在天然水稻EPSPS酶中没有的替代氨基酸的密码子。这些替代的氨基酸提供了具有草甘膦抗性的水稻EPSPS酶。在表7中所描述的步骤被用于构建基于玉米密码子使用表的修饰的人工多核苷酸序列(OsEPSPS_ZM，SEQ ID NO：4)，该核苷酸序列编码修饰的对于草甘膦除草剂抗性的水稻EPSPS酶。OsEPSPS_Nat多核苷酸序列(SEQ ID NO：2)与利用玉米密码子使用得到的Os EPSPS_ZM人工多核苷酸序列(SEQ ID NO：4)的比较在图2中显示。
表7.编码修饰的水稻EPSP合酶的多核苷酸构建体(OsEPSPS_ZM)
1.利用玉米密码子使用表(表3)将SEQ ID NO：1反向翻译来产生人工多核苷酸序列。
2.将天然OsEPSPS多核苷酸序列(SEQ ID NO：2)和人工多核苷酸序列进行序列比对来确定序列同一性程度，确定可读框，选择模式来搜索并鉴定限制酶识别序列。
3.对该人工多核苷酸序列所使用的密码子进行校正来达到所需的序列同一性百分比和避免相同密码子成簇。这对于以高频率出现的氨基酸，即，丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸和缬氨酸，是非常重要的。在该多核苷酸序列中密码子使用的大约分布按照玉米密码子使用表，表3。
4.该多核苷酸序列被检查来发现在大约50个连续核苷酸范围内GC:AT比例高于约2的局部区域。按需要对该多核苷酸序列进行调整，通过在这些区域中进行密码子替代以使得局部的GC:AT比例小于约2并且整个多核苷酸组成在1.2-1.7的范围之内。
5.按照表6的步骤6-12进行。
表8.在OsEPSPS多核苷酸之间的序列同一性百分比。
 
OsEPSPS_ZM OsEPSPS_AT OsEPSPS_Nat
OsEPSPS_ZM 100.00 73.51 71.58
OsEPSPS_AT 100.00 74.03
OsEPSPS_Nat 100.00
表9.对于水稻EPSPS基因序列修饰的多核苷酸序列的核苷酸组成和GC:AT比例。
Figure A200810165671D00601
两种水稻EPSPS人工多核苷酸序列(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)被修饰以便与SEQ ID NO：2相比或相互的百分比同一性小于75％(表8)。水稻EPSPS基因序列的核苷酸组成和多核苷酸序列的GC:AT比例在表9中显示。这些多核苷酸可以被选择来和不同调节组件一起用于植物表达构建体中或者它们可以通过重新用DNA构建体转化或通过植物育种的方法来组合于单一的植物中。当DNA构建体的同源DNA的水平减少的时候基因沉默和重组问题会减少。
实施例2
玉米(Zea mays)已经被遗传修饰来具有对草甘膦除草剂的抗性(美国专利号.6,040,497)。这些玉米植物包括修饰了具有草甘膦耐受性的玉米EPSP合酶转基因。本发明的方法可以被用来构建编码玉米EPSP合酶的新的人工多核苷酸，该多核苷酸与内源玉米EPSP合酶基因在同一性百分比上基本不同。新构建的玉米EPSP合酶人工多核苷酸可以在选择可能具有额外的转基因农业性状的转基因植物品系的过程中用作选择性标记。在杂交玉米种子产生过程中，利用非干涉转基因可用于两个亲本具有草甘膦耐受性。
表10.修饰玉米EPSP合酶的多核苷酸构建体(ZmEPSPS_ZM，SEQ IDNO：10)
1.利用玉米密码子使用表(表3)将SEQ ID NO：8反向翻译来产生多核苷酸序列。
2.将ZmEPSPS_Nat多核苷酸序列(SEQ ID NO：9)和人工多核苷酸序列进行序列比对来决定序列同一性程度，确定可读框，选择模式来搜索并鉴定限制酶识别序列。
3.对该人工多核苷酸序列所使用的密码子进行校正来达到所需的序列同一性百分比和避免相同密码子成簇。这对于以高频率出现的氨基酸，即，丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸和缬氨酸，是非常重要的。在该多核苷酸序列中密码子使用的大约分布按照玉米密码子使用表，表3。
4.该人工多核苷酸序列被检查来发现在大约50个连续核苷酸范围内GC:AT比例高于约2的局部区域。按需要对该多核苷酸序列进行调整，通过在这些区域中进行密码子替代以使得局部的GC:AT比例小于约2并且整个多核苷酸组成在1.2-1.7的范围之内。
5.按照表6的步骤6-12进行。
表11.ZmEPSPS多核苷酸之间的序列同一性百分比。
 
ZmEPSPS_ZM ZmEPSPS_Nat
ZmEPSPS_ZM 100.00 74.81
ZmEPSPS_Nat 100.00
玉米EPSPS基因核苷酸序列也被修饰来减少合成的和天然基因之间的同一性并且维持单子叶植物一般的总GC:AT比例。ZmEPSPS_ZM序列的GC:AT比例是1.38。天然的(ZmEPSPS_Nat，SEQ ID NO：9)和合成的(ZmEPSPS_ZM，SEQ ID NO：10)序列同一性被减少到大约75％。
编码EPSPS的天然多核苷酸的组成显示叶绿体转运肽是基因最不同的片断。编码玉米和水稻的酶的成熟的肽的核苷酸序列的相似性高于88％，并且一些保守的区域在50bps长度内具有序列同一性。对于少至60的多核苷酸的序列已观察到转录后基因沉默(Sijen等，PlantCell，8：2277-2294，1996；Mains，Plant Mol.Biol.43：261-273，2000)。
实施例3
大豆(Glycine max)已经被遗传修饰通过表达从农杆菌属中分离出来的II类EPSPS来具有草甘膦耐受性(Padgette等，Crop Sci.35：1451-1461，1995)。大豆天然EPSPS基因序列已经被鉴定并且人工多核苷酸序列利用本发明的方法来设计。该人工多核苷酸编码一种蛋白序列该蛋白序列，是通过在GNAGTAMRP基序中进行T到I，R到K和P到S的氨基酸替代来进行修饰产生草甘膦抗性的EPSPS酶(GmEPSPS.LKS.SEQ ID NO：5)，其结果是产生修饰的具有GNAGIAMKS基序(SEQ ID NO：34)的大豆EPSPS酶，也可称为IKS突变型。通过利用转基因植物表达盒来转化以在植物细胞中表达修饰的EPSPS酶可以赋予该植物草甘膦抗性，该转基因植物表达盒包含编码具有GNAGIAMKS基序的修饰的EPSPS的多核苷酸。用于替代该基序中的精氨酸(R)的额外氨基酸也包括天冬氨酸(N)。
表12.编码修饰的大豆EPSP合酶基因的多核苷酸构建体(GmEPSPS_GM，SEQ ID NO：7)
1.利用大豆密码子使用表(表4)将SEQ ID NO：5反向翻译来产生人工多核苷酸序列。
2.将GmEPSPS_Nat多核苷酸序列(SEQ ID NO：6)和人工多核苷酸序列进行序列比对来决定序列同一性程度，确定可读框，选择模式来搜索并鉴定限制酶识别序列。
3.对该人工多核苷酸序列所使用的密码子进行校正来达到所需的序列同一性百分比和避免相同密码子成簇。这对于以高频率出现的氨基酸，即，丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸和缬氨酸，是非常重要的。在该多核苷酸序列中密码子使用的大约分布按照大豆密码子使用表，表4。
4.该多核苷酸序列被检查来发现在大约50个连续核苷酸范围内GC:AT比例高于约2的局部区域。按需要对该多核苷酸序列进行调整，通过在这些区域中进行密码子替代以使得局部的GC:AT比例小于约2并且整个多核苷酸组成在0.9-1.3的范围之内。
5.按照表6的步骤6-12进行。
表13.在多核苷酸序列水平上对于修饰的GmEPSPS的序列同一性百分比的比较。
 
GmEPSPS_GM GmEPSPS_Nat
GmEPSPS_GM 100.00 72.43
GmEPSPS_Nat 100.00
大豆天然EPSPS基因利用大豆密码子表(表4)和本发明方法的条件来修饰。在修饰基因中的相对的GC:AT比例没有改变，然而两者之间的序列同一性被减少到72％。
实施例4
从农杆菌属菌株CP4(美国专利号.5,633,435此处将其整体引入作为参考)中分离的能够编码草甘膦抗性的EPSP合酶(SEQ ID NO：15)的天然aroA多核苷酸基因可以通过本发明中的方法来修饰以便提供利用拟南芥属，玉米或大豆密码子使用表的多核苷酸。对于CP4EPSPS的合适表达以对植物提供草甘膦耐受性，叶绿体转运肽必须融合到CP4EPSPS编码序列来将酶累积定位到叶绿体。CTP2叶绿体转运肽通常用来在转基因植物中表达这种基因(Nida等，J.Agric，Food Chem.44：1960-1966，1996)。具有CTP2多核苷酸(SEQ ID NO：11)的CP4EPSPS序列已经通过本发明的方法来修饰。其它的在本领域中已知的叶绿体转运肽可以被融合到CP4EPSPS来指导该酶定位到叶绿体中。
表14.aroA：CP4EPSP合酶编码序列的多核苷酸构建体(CP4EPSPS_AT，CP4EPSPS_ZM或CP4EPSPS_GM)
1.将CTP2转运肽序列(SEQ ID NO：11)放在CP4EPSPS(SEQ IDNO：15)之前来形成融合多肽。利用拟南芥密码子使用表(表2)或玉米密码子使用表(表3)或大豆密码子使用表(表4)将该融合多肽反向翻译来产生人工多核苷酸序列。
2.将天然的CTP2(SEQ ID NO：12)和天然的CP4EPSPS多核苷酸序列(SEQ ID NO：16)和该人工多核苷酸序列进行序列比对来决定序列同一性程度，确定可读框，选择模式来搜索并鉴定限制酶识别序列。
3.对该人工多核苷酸序列所使用的密码子进行校正来达到所需的序列同一性百分比和避免密码子序列成簇。这对于以高频率出现的氨基酸，即，丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸和缬氨酸，是非常重要的。在该多核苷酸序列中密码子使用的大约分布依赖于所用的表按照拟南芥密码子使用表，表2或玉米密码子使用表(表3)。
4.该多核苷酸序列被检查来发现在大约50个连续核苷酸范围内GC:AT比例高于约2的局部区域。按需要对该多核苷酸序列进行调整，通过在这些区域中进行密码子替代以使得局部的GC:AT比例小于约2并且整个多核苷酸组成当使用表2的时候在0.9-1.3的范围之内，当使用表3的时候在1.2-1.7的范围之内。
5.按照表6的步骤6-12进行。
表15.人工CP4EPSPS多核苷酸序列同一性百分比的比较。
 
CTP2CPGM CTP2CP4_AT CTP2CP4_ZM CTP2CP4_Syn CTP2CP4NAT
CTP2CP4_GM 100.00 75.66 74.12 75.15 74.37
CTP2CP4_AT 100.00 76.13 74.56* 72.93
CTP2CP4_ZM 100.00 77.76* 82.58
CTP2CP4_Syn 100.00 82.70
CTP2CP4_NAT 100.00
*同一性百分比与CP4EPSPS并且不包括转运肽。
表16.CP4EPSPS基因序列的人工多核苷酸序列的核苷酸组成和GC:AT比例。
Figure A200810165671D00641
多核苷酸序列CTP2_Nat(SEQ ID NO：12)加上CP4EPSPS_Nat(SEQID NO：16)被称为CTP2CP4_Nat，其与利用本发明方法制备的被称为CTP2CP4_AT(CTP2_AT，SEQ ID NO：13融合到CP4EPSPS_AT，SEQ IDNO：17)和CTP2CP4_ZM(CTP2_AT，SEQ ID NO：14融合到CP4EPSPS_ZM，SEQ ID NO：18)的人工多核苷酸序列的比较列在表15中。与天然序列CTP2CP4_NAT和CTP2CP4EPSPS_Syn最不同的多核苷酸序列是CTP2CP4_AT，分别具有73％和75％的序列同一性。CTP2CP4_ZM多核苷酸序列与CTP2CP4_Nat和CP4EPSPS_Syn两条序列比较序列同一性分别是大约83％和78％。
选择结合到植物中的转基因的主要的标准就是百分比同一性。当已知受体植物已经具有超过一个CP4EPSPS多核苷酸时表15可以用来选择作为植物表达盒构建体的CP4EPSPS多核苷酸分子。在天然的CP4EPSPS中GC:AT的比例大约是1.7。利用玉米密码子偏倚性的人工版本被以非常相似的GC:AT比例制备。在拟南芥属密码子版本中GC:AT比例被降低到大约1.2。
基因表达也是选择将要表达的转基因的标准。在不同的农作物植物中对转基因的表达会有变化，因此具有几个人工多核苷酸编码序列以便在不同的农作物植物和基因型，变种或栽培品种中测试是本发明的优点和一个方面。
实施例5
编码膦丝菌素乙酰转移酶蛋白(SEQ ID NO：19)的bar多核苷酸序列(SEQ ID NO：20)已经被用来遗传修饰植物以具有对草铵膦除草剂的抗性。两种新的bar多核苷酸序列已经利用本发明的方法设计出来。BAR1_Nat和两种新的人工BAR1多核苷酸的序列比对在图4中显示。
表17.编码BAR1_AT(SEQ ID NO：21)和BAR1_ZM(SEQ ID NO：22)的多核苷酸基因构建体
1.利用拟南芥密码子使用表(表2)或玉米密码子使用表(表3)将SEQ ID NO：19反向翻译来产生多核苷酸序列。
2.将BAR1_Nat多核苷酸序列(SEQ ID NO：20)和人工多核苷酸序列进行序列比对来决定序列同一性程度，确定可读框，选择模式来搜索并鉴定限制酶识别序列。
3.对该人工多核苷酸序列所使用的密码子进行校正来达到所需的序列同一性百分比和避免相同密码子成簇。这对于以高频率出现的氨基酸，即，丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸和缬氨酸，是非常重要的。在该多核苷酸序列中密码子使用的大约分布依赖于所使用的表按照拟南芥密码子使用表，表2或玉米密码子使用表(表3)。
4.该多核苷酸序列被检查来发现在大约50个连续核苷酸范围内GC:AT比例高于约2的局部区域。按需要对该多核苷酸序列进行调整，通过在这些区域中进行密码子替代以使得局部的GC:AT比例小于约2并且整个多核苷酸组成当使用表2的时候在0.9-1.3的范围之内，当使用表3的时候在1.2-1.7的范围之内。
5.按照表6的步骤6-12进行
人工BAR多核苷酸的序列同一性在范围73-77％之内(表18)。该天然多核苷酸是高度富含GC的。利用玉米密码子偏倚性的人工版本(BAR1_ZM)已经将GC:AT比例降到大约1.3并且利用拟南芥属密码子偏倚性的人工版本(BAR1_AT)的比例是大约1.0(表19)。
表18.在多核苷酸序列水平上bar基因之间的序列同一性百分比。
 
BAR1_ZM BAR1_AT BAR1_Nat
BAR1_ZM 100.00 77.35 76.99
BAR1_AT 100.00 73.73
BAR1_Nat 100.00
表19.bar基因序列的人工多核苷酸序列的核苷酸组成和GC:AT比例。
Figure A200810165671D00661
实施例6
这个实施例是为了展示用于在植物中表达本发明的人工多核苷酸的DNA构建体。转基因DNA植物表达盒包含控制从盒转录到mRNA的调节组件。植物表达盒被构建以包括在植物中起作用的启动子，它被可操作地连接到5’引导区域，该区域被可操作地连接到目标DNA序列，该序列被可操作地连接到3’终止区域。这些盒被构建到质粒载体中然后这些载体能够以农杆菌介导的转化方法或植物转化领域技术人员所知的其他方法转移到植物中。以下的质粒载体构建体被展示出来是提供含有包含本发明的人工多核苷酸分子的植物表达盒的质粒的例子并且不局限于这些例子。
本发明的人工多核苷酸分子，例如，CP4EPSPS_AT和CP4EPSPS_ZM是利用重叠引物合成的。然后全长产物利用含有突出的SphI(正向引物)和EcoRI(反向引物)的基因特异性引物来扩增。基因被克隆到载体pCRII-TOPO(Invitrogen，CA)。得到的质粒pMON54949(CP4EPSPS_AT，图6)和pMON54950(CP4EPSPS_ZM，图7)包含该人工多核苷酸并且这些多核苷酸能够利用DNA序列测定方法测序，来证实由本发明的方法来设计的修饰被包含在该人工多核苷酸中。在下一步中，编码CTP2叶绿体转运肽的人工多核苷酸被连接到CP4EPSPS多核苷酸的5’末端。具有重复的增强子(P-CaMVe35S和利用SphI和HindIII消化来自于pMON30151(图8)的水稻肌动蛋白1内含子(I-OsActl))的CaMV35S启动子连接到CTP2CP4EPSPS多核苷酸来产生pMON59302(CTP2CP4EPSPS_AT，图9)和pMON59307(CTP2CP4EPSPS_ZM，图10)质粒。
为了在单子叶植物中表达新的人工多核苷酸，基因被放置在植物表达盒中，该盒含有在该多核苷酸的5’末端的启动子和内含子，5’非翻译区域和在该多核苷酸的3’末端的转录终止信号。为了这个目的，将含有P-CaMV35S：en，I-HSP70，CTP2CP4_Nat和NOS3’的pMON42411(图11)利用NcoI和EcoRI限制酶来消化。pMON59302(图9)和pMON59307(图10)利用同样的限制酶消化。片段利用Qiagen凝胶纯化试剂盒进行凝胶纯化并连接来形成pMON58400(CP4EPSPS_AT，图12)和pMON58401(CP4EPSPS_ZM，图13)。额外的含有P-OsAct1/I-OsAct1的载体pMON54964(图14)通过利用HindIII/NcoI得到的来自于pMON25455(图15)的片段来替代来自于pMON58400(图12)的P-e35S/I-Hsp70来制成。为了产生含有P-FMV启动子的单子叶植物表达载体，pMON30152(图16)利用NheI来消化，末端在4种dNTP(200μM)和NcoI存在的情况下用T4DNA聚合酶来平端化。CTP2CP4_AT或CTP2CP4_ZM DNA片段是从pMON59302(图9)或pMON59307(图10)中分离出来，分别是用EcoRI消化，T4DNA聚合酶平端化和NcoI消化。凝胶纯化的DNA片段被连接并且新的质粒pMON54992(CTP2CP4_AT，图17)和pMON54985(CTP2CP4_ZM，图18)被制备。在每一个例子中成功的质粒构建体通过限制性内切核酸酶消化来确认，选用除了其他之外的ClaI(导入到两个人工多核苷酸)和PstI(导入到CP4EPSPS_ZM)。在亲本载体中存在的CP4EPSPS_Nat具有ClaI和两个PstI限制位点，这些位点在与人工多核苷酸中位置不同的编码区内。
为了在双子叶植物中表达人工CP4EPSPS多核苷酸，有两种亲本的载体被使用：pMON20999(P-FMV/CTP2CP4_Syn/3’E-9，图19)和pMON45313(P-e35S/CTP2CP4_Syn/3’E9，图20)。在每一个质粒中，含有CTP2CP4_Syn多核苷酸的DNA片段被CTP2CP4_AT或CTP2CP4_ZM所替代。为了产生pMON59308(P-CaMVe35S/CTP2CP4_AT，图21)或pMON59309(P-CaMVe35S/CTP2CP4_ZM，图22)，利用NcoI和EcoRI来消化pMON45313并且来自于NcoI/EcoRI消化pMON59302(CTP2CP4_AT，图9)或pMON59307(CTP2CP4_ZM，图10)的DNA限制片段被分别连接起来。为了产生pMON59313(P-FMV/CTP2CP4_AT/3’E-9，图23)和pMON59396(P-FMV/CTP2CP4_ZM/3’E-9，图24)，利用NcoI和BamHI来消化亲本质粒pMON20999以便移除CTP2CP4_Syn并且来自于NcoI/BamHI消化pMON59308(CTP2CP4_AT，图21)或pMON59309(CTP2CP4_ZM，图22)的片段被分别连接起来。
实施例7
通过测试该人工多核苷酸来确定赋予转基因植物草甘膦耐受性的效率。具有新的人工CP4EPSPS多核苷酸的五种不同的表达盒(表20)被转化入玉米并且得到的转基因玉米与商业标准(Roundup 603，Monsanto Co.)作比较。包含在商业标准中的pMON25496质粒(图25)具有CP4EPSPS_Nat多核苷酸的两个拷贝，表达是分别由P-CaMVe35S(P-CaMVe35S)和P-OsAct1启动子启动的。含有该新的人工CP4EPSPS多核苷酸的质粒仅含有要被测试的多核苷酸的单拷贝。这些多核苷酸的表达是由具有热激蛋白内含子I-Hsp70的P-CaMVe35S启动子或具有水稻葡萄糖合酶内含子(I-OsSS)的P-FMV启动子驱动的。质粒pMO54964含有具有第一个天然内含子的水稻肌动蛋白1启动子(美国专利号.5,641,876，此处将其整体引入作为参考)。
这些质粒是通过农杆菌介导的方法转入玉米细胞中的并且转基因玉米品系是在草甘膦选择时再生的。转基因玉米可以通过农杆菌介导的转化方法来产生。使用的是具有本发明的二元构建体的无害的农杆菌属菌株C58(ABI)。这是通过三亲株交配的方法转入农杆菌属中的(Ditta等，Proc.Natl.Acad.Sci.77：7347-7351)。农杆菌属的液体培养开始于甘油原种或新鲜的划线平板并且在含有合适抗生素的pH7.0的液体LB培养基中在26℃-28℃摇动(大约150rpm)培养过夜到对数生长中期。农杆菌属细胞被重悬在接种培养基(CM4C液体)中并且密度被调节到OD660为1。然后将含有构建体的农杆菌属接种到新鲜的分离的II型未成熟HiIIxLH198和HiII玉米胚中并且在黑暗中在23℃共培养几天。然后将胚转移到延迟培养基(delaymedia)中并在28℃温育几天到更多天。所有的以后的培养都保持在这个温度下。胚被转入第一个含有羧苄青霉素500/0.5mM草甘膦的选择培养基中。两周之后仍然存活的组织被转入第二个含有羧苄青霉素500/1.0mM草甘膦的选择培养基中。每两周传代培养存活的愈伤组织直到结果能被鉴定出来。这可能会发生3次在1.0mM草甘膦中的传代培养。一旦结果被鉴定出来，扩大组织以进行再生。然后具有根的植物被转入土壤。玉米转化领域的技术人员可以修饰这种方法来提供基本相同的含有本发明的DNA组合物的转基因玉米。
对于每个质粒构建体要测试大约30个转基因玉米品系，并且转化效率和CP4EPSPS酶的表达水平被显示在表20中。转基因玉米品系通过草甘膦来处理，处理是以作为新生植株以64盎斯/英亩的比率来做，存活的植株利用CP4EPSPSELISA来检测(Padgette等，Crop Sci.35：1451-1461，1995)，以便决定CP4EPSPS蛋白的表达水平(CP4exp％)，结果显示在表20中，表达水平与商业上可获得的草甘膦耐受性玉米(Roundup 
Figure A200810165671D00691
 603，Monsanto Co.，St.Louis，MO)作比较并作为由商业标准决定的蛋白表达的量的百分比。通常以64盎斯/英亩喷洒草甘膦超过50％的玉米品系会存活。存活的植株显示出具有高水平的CP4EPSPS表达，该表达为商业标准603的大约75到86％的范围。
表20.来自转化不同的CP4-alt构建体的转化效率(TE)，CP4表达(平均％)
 
pMON 启动子/内含子# TE(％) CP4exp(％)*
58400(CP4_AT) P-CaMVe35S/IHsp70 5.4 75.5
58401(CP4_ZM) P-CaMVe35S/IHsp70 7.2 84.7
54964(CP4_AT) P-OsActl 8.2 78.1
54985(CP4_ZM) P-FMV/IOsSS 11.5 85.7
54992(CP4_AT) P-FMV/IOsSS 11.5 78.2
nk603(control) P-OsAct1/P-e35S： - 100
*CP4EPSPS表达是作为在草甘膦喷洒(64盎斯/英亩)存活的植株进行的对照(603)的百分比的形式计算的。
实施例8
在转基因棉花中三种质粒构建体被评估(表21)。对照构建体(pMON20999)含有P-FMV/CP4EPSPS_Syn，这种表达盒被包含在商业上可得到的草甘膦耐受性的棉花品系1445中(Roundup ReadyCorn603，Monsanto Co.，St.Louis，MO)。质粒构建体，pMON59313和pMON59396分别含有CP4EPSPS_AT和CP4EPSPS_ZM多核苷酸，被分析转化效率以及相对于商业上草甘膦耐受性的表达盒的CP4EPSPS酶水平。对于每一个构建体大约五十个转基因棉花品系被分析。由P-FMV启动子驱动的该人工CP4EPSPS_AT多核苷酸使得具有单一插入片段的植物具有更高的百分比，并且由ELISA测定的相对于pMON20999表达盒的CP4EPSPS酶的表达水平提高。
表21 从不同的CP4EPSPS构建体转化得来的R0棉花品系的转化效率(TE)，平均CP4EPSPS表达。
 
pMON 启动子 TE(％) CP4Exp(％)
20999(CP4EPSPS_Syn) P-FMV 15.0 100.0
59313(CP4EPSPS_AT) P-FMV 15.0 116.4
59396(CP4EPSPS_ZM) P-FMV 16.1 52.0
实施例9
含有该人工CP4EPSPS多核苷酸的构建体CP4EPSPS_AT和CP4EPSPS_ZM在大豆中进行评估(表22)。质粒构建体都含有P-FMV启动子来驱动新的CP4EPSPS多核苷酸的表达并且与包含在pMON20999中的P-FMV/CP4EPSPS_Syn进行比较。每个构建体产生大约25到30个转基因大豆植株。转化效率和CP4EPSPS酶水平被检测。在含有CP4EPSPS_ZM编码序列的大豆植株中能够检测到令人惊奇的CP4EPSPS蛋白的高表达水平(表22)。
表22.从不同CP4EPSPS构建体转化得来的转化效率(TE)，平均CP4表达。
 
pMON 启动子 TE(％) CP4Exp(％)
20999(CP4_Syn) P-FMV 0.55 100.0
59313(CP4_AT) P-FMV 0.40 66.6
54996(CP4_ZM) P-FMV 0.29 242.5
实施例10
三种含有不同CP4EPSPS多核苷酸序列的质粒构建体被转化到烟草细胞中并且再生成植物。对于每个构建体大约评价二十个转基因品系。每个CP4EPSPS多核苷酸的表达是由P-CaMVe35S重复的增强的启动子启动的(表23)。转化效率和CP4EPSPS酶水平被评估。不同的CP4EPSPS多核苷酸构建体显示在转基因烟草中大约相同的转化效率和表达。
表23 从不同的CP4EPSPS构建体转化得来的R0烟草品系的转化效率(TE)，平均CP4表达。
 
pMON 启动子 TE(％) CP4exp.(％)
59308CP4EPSPS_AT P-CaMVe35S 35 100.0
59309CP4EPSPS_ZM P-CaMVe35S 35 91.0
54313CP4EPSPS_Syn P-CaMVe35S 35 100.0
实施例11
拟南芥是通过真空渗入转化四种质粒构建体的(Bechtold N，等，CR Acad Sci Paris Sciences di la vie/life sciences316：1194-1199，1993)并且V1后代被评估来比较不同的CP4EPSPS多核苷酸序列的效率以及用于植物在草甘膦不同启动子上进行选择的效率(表24)。
每个构建体大约产生30个转基因V1植株(+)。由具有重复的增强子(pMON45313，pMON59308和pMON59309)的P-CaMVe35驱动的构建体经过ELISA测定显示在叶子中表达水平上没有明显的差异。由具有P-FWV启动子驱动的CP4EPSPS_Syn的pMON26140转化植株，这些植株显示最好的表达水平，这些植株中检测到的测试的构建体的表达水平与pMON26140进行比较。
表24.在拟南芥属中不同的CP4表达盒的评测。
 
pMON 启动子/ 产生的植物 CP4exp.(％)
45313(CPEPSPS4_Syn) P-CaMVe35S + 82.1
59308(CP4EPSPS_AT) P-CaMVe35S + 79.3
59309(CP4EPSPS_ZM) P-CaMVe35S + 77.3
26140(CP4EPSPS_Syn) P-FMV + 100.0
实施例12
利用新的CP4EPSPS多核苷酸转化的小麦植株比较转化效率并用ELISA来决定CP4EPSPS酶表达(表25)。CP4EPSPS_ZM比CP4EPSPS_AT提供至少高出七倍的CP4EPSPS酶表达。在来自于含有CP4EPSPS_ZM多核苷酸的小麦的叶子中CP4EPSPS的平均表达大约为在含有双重盒构建体，pMON30139：P-e35S/I-Hsp70/CP4EPSPS_Nat和P-OsAct1/I-OsAct1/CP4EPSPS_Nat(WO/0022704)的草甘膦抗性小麦中发现的水平的64％。
表25 在小麦中不同的CP4EPSPS多核苷酸的表现
 
pMON 启动子/内含子 TE(％) CP4Exp.(％)
58400CP4EPSPS_AT P-e35S/I-Hsp70 0.25 9.2
58401CP4EPSPS_ZM P-e35S/I-Hsp70 0.35 64.0
30139CP4EPSPS_Nat P-e35S：P-OsActl - 100.0
实施例13
这个实施例目的是展示在转基因植物中不同人工多核苷酸的检测，特别是CP4EPSPS_AT和CP4EPSPS_ZM。其它的人工多核苷酸OsEPSPS_AT，OsEPSPS_ZM，GmEPSPS_GM，ZmEPSPS_ZM，CTP2_AT，CTP2_ZM，Bar1_AT和Bar1_ZM也可以通过提供DNA扩增子或将DNA探针与植物样品杂交的方法来在转基因植物中检测。DNA检测领域中的技术人员可以很容易的从本发明提供的人工多核苷酸序列设计引物分子来使得特异检测植物样品中的人工多核苷酸的方法可行。在这里，对于提供针对于此处公开的人工多核苷酸同源或互补的DNA引物或探针的方法或试剂盒的应用也是本发明的一个方面。
一种DNA检测方法(聚合酶链反应，PCR)被设计用于检测在转基因植物中的该人工CP4EPSPS多核苷酸。在表26中显示的独特的DNA引物组是被设计用于扩增特异性的CP4EPSPS多核苷酸并且来提供不同大小的扩增子。这些扩增子在多核苷酸长度上在各种CP4EPSPS多核苷酸中具有足够的不同，这使得可以通过普通的琼脂糖凝胶电泳来分离这些扩增子。可以利用多重PCR方法来检测在植物中存在的超过一个的人工多核苷酸。
表26.用于检测在转基因植物中不同的CP4基因所用的引物的序列。
 
引物对 基因特异性 PCR产物(bps)
SEQ ID NOs：24和25 CP4EPSPS_AT 938(940)
SEQ ID NOs：26和27 CP4EPSPS_ZM 595(600)
SEQ ID NOs：28和29 CP4EPSPS_Nat 712(710)
SEQ ID NOs：30和31 CP4EPSPS_Syn 443(440)
DNA引物对(表26)被用来产生用于诊断在转基因植物中包含的特异的CP4EPSPS多核苷酸的扩增子。这些引物对包括，但不局限于：对于CP4EPSPS_AT多核苷酸的SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；对于CP4EPSPS_ZM的SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；对于CP4EPSPS_Nat的SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29和对于CP4EPSPS_Syn多核苷酸分子的SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31。除了这些引物对，任何来自于SEQID NO：17或SEQ ID NO：18的引物对，当用于DNA扩增反应时产生用于分别诊断CP4EPSPS多核苷酸的DNA扩增子，是本发明的一个方面。
这种分析的扩增条件被展示在表27和表28中，然而，包括利用本发明的DNA分子的片段或其互补序列作为引物分子在内的任何对于这些条件的修饰是包括在本领域的基本技术之中的，其中这些引物分子是用来产生用于诊断此处描述的人工多核苷酸的扩增子DNA分子。本发明的DNA分子至少包括SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：17，SEQID NO：18，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：35。作为引物分子的DNA分子包括但不局限于SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，其中的引物分子是用于检测该人工多核苷酸的存在的DNA扩增方法中的。
在确定本发明中的多核苷酸存在的方法中，植物组织DNA提取物样品的分析应该包括已知包含该人工多核苷酸的正对照和来自于不是转基因的植物或不含有该人工多核苷酸的植物的负对照DNA提取物以及在DNA提取物中没有模板的负对照。
额外的足够长度的DNA引物分子可以从SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18中选择并且为了产生扩增子的最优化的条件可以与表27和表28中显示的不同，但是可以得到用于诊断该人工多核苷酸的扩增子。对表27和28中的方法进行或不进行修饰而应用与SEQ ID NO：17和SEQID NO：18同源或互补的这些DNA引物序列是在本发明的范围之内的。对于CP4EPSPS_AT和CP4EPSPS_ZM扩增子的分析可以通过应用表28中显示的Stratagene Robocycler，MJ Engine，Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler或其它本领域技术人员所知的方法和设备来进行。
表27.用于确认玉米中人工EPSPS多核苷酸CP4EPSPS..AT的DNA扩增程序和反应混合物。
 
步骤 试剂 量 备注
1 无核酸酶的水 加至最终体积20μl -
2 1010X反应缓冲液(含MgCl2) 2.0μl 1X终浓度的缓冲液，1.5mM终浓度的MgCl2     
3 10mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP的溶液                     0.4μl 每种dNTP的终浓度为200μM
4 引物(SEQ ID NO：24)(垂悬在1X的TE缓冲液中成无柱酸酶的水中至浓度为10μM) 0.4μl 终浓度0.2μM
5 引物(SEQ ID NO：25)(垂悬于1X的TE缓冲液中成无柱酸酶的水中至浓度为10μM) 0.4μl 终浓度0.2μM
6 对照引物(SEQ ID NO：32)(垂悬于1X TE缓冲液中成无柱酸酶的水中至浓度为10μM) 0.2μl 终浓度0.1μM
7 对照引物(SEQ ID NO：33)(垂悬于1X TE缓冲液中或无柱酸酶的水中至浓度为10μM) 0.2μl 终浓度0.1μM
8 不含DNase的RNase(500ng/μl) 0.1μl 50ng/反应
9 REDTaq DNA聚合物(1单位/微升)    1.0μl(建议在下步操作前换移液管)                  1单位/反应
10 提取DNA(模板)：·要被分析的样品*单独的叶子*集中的叶子(最多50片叶子/堆·负对照·负对照·正对照               ·基因级DNA 10-200ng·基因级DNA 200ng·50ng非转基因植物的基因级DNA·无模板DNA·5ng质粒DNA             -
表28.建议的对于不同的的thermocycler PCR参数轻柔混合并且如果需要(在没有保温帽的thermocycler中)，在每个反应的上边加入1-2滴矿物油。利用以下的循环参数在Stratagene Robocycler，MJ Engine，Perkin-Elmer 9700或EppendorfMastercycler Gradient thermocycler中进行PCR。
注意：MJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradientthermocycler应该以计算的模式运行。运行Perkin-Elmer 9700thermocycler的时候扫描速度应该设到最大。
 
循环数 设备：Stratagene Robocycler
1 94℃   3分钟
38 94℃   1分钟60℃   1分钟72℃   1分钟和30秒
1 72℃   10分钟
 
循环数 设备：MJ Engine or Perkin-Elmer 9700
1 94℃   3分钟
38 94℃   10秒60℃   30秒72℃   1分钟
1 72℃   10分钟
 
循环数 设备：Eppendorf Mastercycler Gradient
1 94℃   3分钟
38 94℃   15秒60℃   15秒72℃   1分钟
1 72℃   10分钟
所有此处公开和请求保护的组合物和方法都可以按照现在所公开的内容来制备或执行。尽管本发明的组合物和方法已经被描述出来，但对于本领域技术人员来说对于此处讨论的组合物和方法以及这些方法的步骤或步骤的顺序在不离开本发明的概念，精神和范围的条件下进行变化是显而易见的。更特异的，很明显利用化学和物理性质都相关的特定的试剂来替代此处讨论的试剂也可以得到相同或相似的结果。所有这样对于本领域技术人员很明显的相似的替代或修饰被认为是在本发明的精神，范围和概念之内的，就像附加的权利要求中定义的那样。
此处所应用的所有的出版物和专利申请都被整体引入作为参考，其程度与每一个单独的出版物或专利申请是特异地并且单独地被引入作为参考一样。
序列表
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<151>2002-07-18
<160>35
<170>PatentIn version 3.2
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<212>PRT
<213>水稻
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<212>DNA
<213>水稻
<400>2
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<213>水稻
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<213>水稻
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<213>大豆
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<213>大豆
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<212>DNA
<213>大豆
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<213>玉米
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<213>玉米
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<212>DNA
<213>玉米
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<213>拟南芥
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<212>DNA
<213>拟南芥
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<213>拟南芥
<400>13
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<213>拟南芥
<400>14
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<213>根癌农杆菌
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<213>根癌农杆菌
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<213>根癌农杆菌
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Figure A200810165671D01021
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<213>根癌农杆菌
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<212>PRT
<213>吸水链霉菌
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<212>DNA
<213>吸水链霉菌
<400>20
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<213>吸水链霉菌
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<213>吸水链霉菌
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<213>吸水链霉菌
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Figure A200810165671D01071
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<213>人工序列
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<223>DNA引物分子
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>DNA引物分子
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<212>DNA
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<212>DNA
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<212>DNA
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<223>DNA引物分子
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>DNA引物分子
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA引物分子
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Figure A200810165671D01093
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<212>DNA
<213>玉米
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Figure A200810165671D01094
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<212>DNA
<213>玉米
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>为植物提供草甘膦抗性的EPSPS基序
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<212>DNA
<213>根癌农杆菌
<400>35
Figure A200810165671D01103

Claims (10)

1.一种人工多核苷酸分子，该人工多核苷酸分子选自：SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：35和其互补序列。
2.一种DNA构建体，包括：在植物中起作用的启动子分子，其可操作地连接到权利要求1中的该人工多核苷酸分子。
3.含有权利要求2中的DNA构建体的植物细胞。
4.权利要求3中的植物细胞，其中该细胞为选自小麦，玉米，水稻，大豆，棉花，马铃薯，canola，草坪草，森林树，高粱，蔬菜作物，观赏植物，饲料作物和水果作物的植物的细胞。
5.包含权利要求1中的该人工多核苷酸分子的植物细胞。
6.一种在植物细胞，植物或其后代中检测权利要求1的人工多核苷酸的方法，包括以下步骤：
(a)将从该植物细胞，植物或其后代中分离的DNA样品与一对DNA引物分子接触，该一对DNA引物分子当用于核酸扩增反应时产生用于诊断权利要求1中的该人工多核苷酸分子的扩增子；
(b)进行核酸扩增反应，由此产生该扩增子；和
(c)检测该扩增子。
7.权利要求6中的方法，其中所述人工多核苷酸是SEQ ID NO：17，且其中所述一对DNA引物分子是SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25。
8.DNA分子，其包括：与权利要求1中的人工多核苷酸分子特异性杂交的多核苷酸分子。
9.一种DNA检测试剂盒，其包括至少一种足够长度的连续核苷酸的DNA分子，该DNA分子与权利要求1中的该人工多核苷酸同源或互补，其中该DNA分子起DNA探针或DNA引物的作用。
10.一种检测DNA样品中编码草甘膦抗性的EPSPS的人工多核苷酸的存在的方法，该方法包括：
(a)从植物中提取DNA样品；和
(b)将足够长度的连续核苷酸的与权利要求1的该人工多核苷酸同源或互补的DNA分子与该DNA样品接触，其中该DNA分子是DNA探针；和
(c)使该样品和DNA探针处于严格的杂交条件下；和
(d)检测杂交到该DNA样品上的DNA探针。
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