JP2000502258A - 抗微生物タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 -Gln/Cys-AA₂-Pro/Ile-Asn/Thr/Leu-AA₅-AA₆-Cys-Cys-ALa/Asn-Gly/Lys-AA₁₁-AA₁₂-AA₁₃-AA₁₄-AA₁₅-（ただし、AA₂およびAA₁₄はシスティンとはならず、AA1がCysのときAA₄はLeu）の配列を有しぺプチドを含む抗微生物タンパク質。配列番号３、５または６の何れかの配列を含む抗微生物タンパク質。そのようなタンパク質をコードしている組み換えＤＮＡ。植物で利用可能なプロモーターおよびターミネーターに連結し発現可能であるそのようなＤＮＡを含むベクター。そのような組み換えＤＮＡで形質転換した植物、メンデルの方法で安定して組み込まれ遺伝可能となったそのＤＮＡを保有するそのような植物の子孫、および／またはそのような植物またはそのような子孫の種子。

Description

【発明の詳細な説明】 抗微生物タンパク質 本発明はビートから単離可能な抗微生物タンパク質に関与する。 本発明は-Gln/Cys-AA₂-Pro/Ile-Asn/Thr/Leu-AA₅-AA₆-Cys-Cys-Ala/Asn-Gly/L ys-AA₁₁-AA₁₂-AA₁₃-AA₁₄-AA₁₅-（ただし、AA₂およびAA₁₄はシスティンとはなら ず、AA₁がCysのときAA₄はLeu）の配列を有するペプチドを含む抗微生物タンパク 質を提供する。略号AA_xが通常の２０のアミノ酸のうちのひとつであることを意 味することは、当業者に理解されることである。 抗微生物タンパク質は、それ自体または他の物質と組み合わされて細菌（特に グラム陽性細菌）、ウィルスおよび特に菌類を含む微生物に対して、種々の環境 において有毒でありまたは増殖抑制性であるタンパク質である。そのような抗微 生物タンパク質には、微生物に接触して抗微生物活性を示すタンパク質、微生物 による同化または呼吸の結果として抗微生物的となるタンパク質が含まれる。 配列番号３、５または６の何れかの一つに示した配列を有する抗微生物タンパ ク質を本発明により提供する。 配列番号３を有し、８０の位置のＶａｌがＡｌａである抗微生物タンパク質の イソ型も含む。 さらに本発明では上述したタンパク質の何れかに本質的に類似する精製タンパ ク質を提供する。 「本質的に類似する」とは、前述（請求項１においても定義した）したベプチ ド配列と少なくとも９５％の類似性のあるアミノ酸配列を含む精製タンパク質お よび／または以下で示す配列番号３、５または６のアミノ酸配列と少なくとも６ ５％の類似性、好ましくは７５％の類似性、さらに好ましくは８５％の類似性、 特に好ましくは９５％の類似性のあるアミノ酸配列を含む精製タンパク質である ことを意味する。本発明の文書において、二つのアミノ酸配列における類似性の パーセンテージは、２ギャップまでを許容することとし（各ギャップに関し影響 を受けるアミノ酸残基が２以下であることを条件とする）、最適にアライメント したとき、少なくとも同一の位置で同一アミノ酸または同類置換されたアミノ酸 のパーセンテージを示す。 本発明の目的上、同類置換は以下に示すグループ内のアミノ酸で行う。 （ｉ）セリンおよびトレオニン、 （ii）グルタンミン酸およびアスパラギン酸、 （iii）アルギニンおよびリシン、 （iv）アスパラギンおよびグルタミン、 （ｖ）イソロイシン、ロイシン、バリンおよびメチオニン、 （vi）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、 （vii）アラニンおよびグリシン 本発明は、少なくとも抗微生物タンパク質の９０％の特異活性のある精製タン パク質、および本発明の抗微生物タンパク質と少なくとも９０％の同一性のある 精製タンパク質を含む。本出願の目的上、特異活性は、一定量の特定微生物に対 し一定量のタンパク質を使って生じる増殖抑制または分裂抑制の測定により行う 。 本発明には、さらに配列番号７〜１２および１４に示したタンパク質からなる グループより選択された一つ以上のタンパク質を組み合わせた精製タンパク質を 含む。そのように組み合わせたタンパク質は、さらに一つまたはそれ以上の既知 の「病因関係タンパク質」で組み合わせ得る。菌類またはウィルス性病原体を使 った植物への感染により、植物組織内では約１０ファミリーからなる病因関係タ ンパク質（ＰＲタンパク質）と相同性のあるタンパク質の全身的合成が誘導され る。そのようなＰＲタンパク質は五つのグループに分けることができる。ＰＲ− ２、ＰＲ−３およびＰＲ−５にそれぞれ含まれるタンパク質は、それぞれβ−１ ，３−グルカナーゼ様、キチナーゼ様およびタウマチン様タンパク質である。Ｐ Ｒ−１グループ、ＰＲ−４グループの特異機能は判明していない。ＰＲ−４タン パク質は、プロヒビン（prohevein）のＣ末端ドメインおよび一般に創傷により 誘導されるジャガイモのＷＩＮタンパク質（Ｎ末端のヒビン（hevein）ドメイン を欠 如している）に類似している。本発明のタンパク質は、Ｐ−Ｒ４グループに基本 的に相当する一つまたはそれ以上のタンパク質で組み合わされることが特に好ま しく、それはプロヒビン（prohevein）のＣ末端ドメインおよび創傷誘導性のジ ャガイモのＷＩＮタンパク質に類似するタンパク質に相当することを意味する。 好ましいことに、病因関係タンパク質に相当するタンパク質は、大麦または圧し 潰した大麦の葉から産生されるキチン結合ＷＩＮタンパク質である。 本発明は、さらに上述で開示した抗微生物タンパク質のアミノ酸配列を持つタ ンパク質をコードする組み換えＤＮＡを含む。特にＤＮＡにおいては、配列番号 ７〜１２および１４に加えて配列番号３、５および６に示したアミノ酸配列のう ち少なくとも一つがコードされている。好ましくは配列番号３、５または６に示 したアミノ酸配列を持つタンパク質をコードする配列は、配列番号１（ＩＷＦ５ に相当する配列番号６を持つタンパク質において）、配列番号２（ＩＷＦ６に相 当する配列番号３を持つタンパク質において）、または配列番号４（ＩＷＦ７に 相当する配列番号５を持つタンパク質において）に示したｃＤＮＡ配列である。 この組み換えＤＮＡにはさらに除草剤抵抗性、植物成長促進作用、抗カビ性、抗 菌性、抗ウィルス性、および／または抗線虫性タンパク質がコードされていても よい。異種生物に当該ＤＮＡを導入した場合、既知であるｍＲＮＡの不安定性モ チーフ（ＡＴリッチのような領域）およびポリアデニル化シグナル（もし存在す るならば）を除去するように当該ＤＮＡは修飾される。さらに、組み換えＤＮＡ を導入する生物の好むコドンを使用してもよい。それは本発明の抗微生物タンパ ク質を保有する生物内において非修飾の組み換えＤＮＡによる発現タンパク質と 実質的に類似するタンパク質が当該修飾ＤＮＡの発現により産生されるようにす るためである。 本発明では、上記で述べた「類似する」ものには、さらに組み換えＤＮＡも含 む。「類似しているＤＮＡ」とは、発明の組み換えＤＮＡ配列とハイブリダイズ 可能なテスト配列と相補する配列を意味する。テスト配列および発明配列が二重 鎖であるとき、テスト配列を構成する核酸のＴＭは発明配列のＴＭの２０℃以内 となる。テスト配列および発明配列を混合して同時に変性させると、好ましいこ とに配列のＴＭ値は互いに１０℃以内となる。さらに好ましくは、ハイブリダイ ゼーションは、好ましくは支持体に固定されているテストＤＮＡ、発明ＤＮＡの いずれかを用いて、激しい条件下で行う。好ましくは変性したテスト配列または 発明配列は、第一に支持体に結合し、ハイブリダイゼーションは、０．１％ＳＤ Ｓを含む２×標準食塩クエン酸緩衝液（ＳＳＣ）中で５０℃〜７０℃で一定時間 作用させた後、濃度を下げた同一温度のＳＳＣにて支持体をリンスする。必要と する激しさ、および配列の類似性に応じて、６０℃のような特定の温度にて１× 、０．５×および０．１×のように０．１％ＳＤＳを含むＳＳＣの濃度を下げて 用いる。類似性の高い配列では、濃度を下げた緩衝液の洗浄によるハイブリダイ ゼーションへの影響は少ない。最も好ましいことに、テスト配列および発明配列 は非常に類似しているため、これらのハイブリダイゼーションでは０．１％ＳＤ Ｓを含む０．１×ＳＳＣの洗浄またはインキュベーションによる影響をほどんど 受けない。 本発明は、激しい条件下で本発明の組み換えＤＮＡとハイブリダイズするＤＮ Ａと相補的なＤＮＡ配列をさらに含む。 植物内で利用可能なプロモーターおよびターミネーターと連結し発現可能であ る上記で開示のＤＮＡを含むベクター、そのようなＤＮＡを使って形質転換した 植物、メンデルの方法で安定して組み込まれ遺伝可能となったＤＮＡを保有する そのような植物の子孫、および／またはそのような植物および子孫の種子、以上 の事項も本発明に含む。植物の形質転換はさまざまな既知の方法（アグロバクテ リウムのＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミド、エレクトロポレーション、マイ クロインジェクション、ミクロプロジェクチルガン等）で行われ、いずれの方法 においても本発明のＤＮＡで形質転換された植物細胞またはプロトプラストの再 生が含まれる。形質転換された細胞は、核酸がゲノムに安定して組み込まれると 、適当な条件下では個体全体にまで再生する。単子葉植物および双子葉植物のい ずれも、この方法が行える。本発明において形質転換できる植物の実施例には、 次のものが含まれる。トマト、マンゴー、桃、りんご、西洋なし、イチゴ、バナ ナおよびメロンを含める果物、アブラナ（canola）、ヒマワリ、タバコ、ビート 、 穀類（小麦、大麦および米）、トウモロコシおよび綿のような作物ならびにジャ ガイモ、ニンジン、レタス、キャベツおよび玉ネギのような野菜である。好まし い植物はビートおよびトウモロコシである。 本発明には前述のＤＮＡの発現から得られるタンパク質、および組み換えＤＮ Ａで形質転換された植物内の発現により生ずる抗微生物タンパク質がさらに含ま れる。 本発明の抗微生物タンパク質のうち、一つまたはそれ以上のタンパク質で構成 される抗微生物組成物、それらのタンパク質を菌類に作用させて菌類を死滅させ る方法、ならびにマセレーションおよび溶媒抽出で生物材料（特に微生物由来の もの）から抗微生物タンパク質を抽出する方法が本発明には含まれる。前の文章 で述べた生物材料の出所である微生物に対して抗微生物タンパク質の作用がある にしろ少しだけであることは評価に値する。 以下の記載および添付図および配列表から本発明は、さらに分かり易いものと なる。 Ｆｉｇｕｒｅ１は、インターセルラーウォッシングフルイド（intercellularw ashingf luid）をＣＭ−セファロースカラムで精製した典型的な溶出プロファイ ルであり、 Ｆｉｇｕｒｅ２は、Ｆｉｇｕｒｅ１の０．３Ｍ ＮａＣｌ画分をＭｏｎｏ Ｓ ＦＰＬＣカラムで精製した典型的な溶出プロファイルであり、 Ｆｉｇｕｒｅ３は、Ｆｉｇｕｒｅ２のピーク４で示されるタンパク質をＲＰ− ＨＰＬＣカラムで精製した典型的な溶出プロファイルであり、 Ｆｉｇｕｒｅ４は、Ｆｉｇｕｒｅ３のピーク４．４で示されるタンパク質をＲ Ｐ−ＨＰＬＣカラムで精製した典型的な溶出プロファイルであり、 Ｆｉｇｕｒｅ５は、Ｆｉｇｕｒｅ３のピーク４．３で示されるタンパク質をＲ Ｐ−ＨＰＬＣカラムで精製した典型的な溶出フロファイルであり、 Ｆｉｇｕｒｅ６は、Ｆｉｇｕｒｅ２のピーク５で示されるタンパク質をＲＰ− ＨＰＬＣカラムで精製した典型的な溶出プロファイルであり、 Ｆｉｇｕｒｅ７は、Ｆｉｇｕｒｅ６のピーク５．４で示されるタンパク質をＲ Ｐ−ＨＰＬＣカラムで精製した典型的な溶出プロファイルであり、 Ｆｉｇｕｒｅ８および９は、Ｆｉｇｕｒｅ４のピーク４．４で示される様々な 量のタンパク質（配列番号６）の抗菌類活性を示し、 Ｆｉｇｕｒｅ１０は、Ｆｉｇｕｒｅ５のピーク４．３で示されるタンパク質（ ８０の位置のＶａｌがＡｌａである配列番号３）の抗菌類活性を示し、 Ｆｉｇｕｒｅ１１は、Ｆｉｇｕｒｅ７のピーク５．４で示されるタンパク質（ 配列番号５）の抗菌類活性を示す。 配列番号６はＦｉｇｕｒｅ４のピーク４．４で示されるタンパク質のアミノ酸 配列を示し、配列番号３（８０の位置のＶａｌがＡｌａであるとき）はＦｉｇｕ ｒｅ５のピーク４．３で示されるタンパク質のアミノ酸配列を示し、配列番号５ はＦｉｇｕｒｅ７のピーク５．４で示されるタンパク質のアミノ酸配列を示し、 配列番号７〜１２および１４は既知の抗菌類タンパク質のアミノ酸配列を示す。抵抗性の誘発 六週間経過後のビート(ベータ・ブルガリス Ｌ．， 変種 モノバ（Beta vu lgaris L.，cv．Monova)，Ｄａｎｉｓｃｏ Ｓｅｅｄ）を、二日に渡って断続的 に２５ｐｐｍの２，６-ジクロロイソニコチン酸（ＩＮＡ）で四回処理する。Ｉ ＮＡを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で溶解後、浸潤するまで向軸の葉の表面にこ れを散布する。最終処理から二日後、インターセルラーウォッシングフルイド（ intercellular washing fluid）（ＩＷＦ）を、以下に記載したように分離した 。ＩＮＡ処理していない葉から分離したインターセルラーウォッシングフルイド （intercellular washing fluid）にも、本発明のタンパク質が含まれている。インターセルラーウォッシングフルイド（Intercellular Washing Fluid）の分 離 ２０ｍＭ ＨＡｃ（ｐＨ４．５）の溶液に５００〜７００ｇのビートの葉を浸 し、ＩＷＦを分離する。その浸した葉をエクシケイターおよびバキュームに移し 、５分間、４トル（最大）で浸透させる。葉の表面を風乾した後、５００ｍｌの 遠 心管を使って１５分間、５００×ｇの遠心を行いＩＷＦを回収した。陽イオン交換クロマトグラフィー 陽イオン交換クロマトグラフィーである１０ｍｌ ＣＭ−セファロースカラム （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）をスターティングバッファー（２０ｍＭ ＨＡ ｃ（ｐＨ４．５））で平衡化し、これを用いてＩＷＦを分画する。分画は４℃、 流速 ２５ｍｌ／ｈで行う。画分は３ｍｌ回収する。カラムに結合しないタンパ ク質は、スターティングバッファーで十分に洗浄し除去する。結合したタンパク 質は、スターティングバッファーに含まれる塩濃度をステップワイズで上げて溶 出させる。すなわち、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ N ａＣｌのように上げる。溶出において２８０ｎｍの吸収を測定し、タンパク質を 含む画分の判定には、マイクロタイタープレートバイオアッセイを用い、セルコ スポラ・ベチコラ（C．beticola）に対して抗菌類活性を測定することにより行 う。それは既に開示済みである（ＰＣＴ特許出願番号 ＰＣＴ／ＤＫ９２／００ １０８、公開番号 ＷＯ９２／１７５９１、サンドリミテッドへ譲渡）。 典型的な溶出プロファイルはＦｉｇｕｒｅ１に示す。０．３Ｍ ＮａＣｌを含 むスターティングバッファーの溶出画分を以下の記載のように、さらに精製した 。ＣＭ−セファロースカラムより０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出した抗菌類タンパク質 の精製 ＦＰＬＣクロマトグラフィー ０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出したタンパク質画分は、４℃にて２０ｍＭ ＨＡｃ （ｐＨ４．５）で終日、透析（分子量画分：１ｋＤａ）し、脱塩する。透析した タンパク質画分にベタインを終濃度５％になるよう添加する。５％ベタインを含 む２０ｍＭ ＨＡｃ（ｐＨ４．５）（Ａ-バッファー）でＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５ ／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）を平衡化し、陽イオン交換高速タン パク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）で、そのタンパク質画分４ｍｌを分 画する。３０ｍｌのバッファーを流す間に０Ｍ ＮａＣｌから０．３Ｍ Ｎａ Ｃｌとなるよう直線状の塩濃度勾配をかけて結合したタンパク質を溶出させ、そ の後に同バッファーに含まれる塩濃度を１．０Ｍ ＮａＣｌにステップし溶出さ せる。流速は１ｍｌ／ｍｉｎである。 ０．３Ｍ ＮａＣｌ画分には、いくらかの異なるタンパク質が含まれ、量的に 重要なものにはピーク１−５のように番号を付け、これをＦｉｇｕｒｅ２に示す 。強い抗菌類活性がピーク４および５に示されるタンパク質に見られる。ファス トシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）を使ってＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析し、 １０-１５％の勾配ファストゲルまたは高密度ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫ Ｂ）を銀染色すると、ピーク４および５には、いずれにも約１０種の異なるタン パク質が見られる。逆相ＨＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｓカラムから得られたタンパク質のピーク４および５（Ｆｉｇｕｒ ｅ２に示した）は、Ｖｙｄａｃ Ｃ₄シリカ カラム（Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔ ｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使い逆相（ＲＰ−）ＨＰＬＣにより、 さらに精製する。溶媒成分はＡ：０．１％ＴＦＡを含む水およびＢ：０．１％Ｔ ＦＡを含むアセトニトリルである。サンプルをロード後、１８分の間にＢ-バッ ファーが５％から４５％となるよう直線状の勾配をかける。その後、２分間Ｂ− バッファーを６０％に保持する。流速は０．７ｍｌ／ｍｉｎである。２１４ｎｍ および２８０ｎｍの吸収によりタンパク質を検出する。分離したタンパク質は回 収し、凍結乾燥する。その凍結乾燥したタンパク質は、純度および抗菌類活性の 分析前に水で二度洗浄し、再び凍結乾燥し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）で溶解する。ピーク４で示される材料は、ＲＰ-ＨＰＬＣカラムで９〜 １０の異なるタンパク質ピークに分離する（Ｆｉｇｕｒｅ３）。ピーク４．３お よび４．４には強い抗菌類活性がみられ、それゆえＲＰ-Ｃ４カラムで再度分画 する（Ｆｉｇｕｒｅ４および５）。その後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析（銀染色）す ると、これら二つのタンパク質は精製させれた等質物であることが分かる（デー タ示さず）。さらにＮ末端アミノ酸シークエンスにより、それぞれのピークには 一種類のみのタンパク質が存在することが分かる。ピーク４．３および４．４を 、それぞれＩＷＦ６およびＩＷＦ５とする。Ｆｉｇｕｒｅ２のピーク５で示され る材料は、後のＲＰ-ＨＰＬＣ精製にて８〜１０の異なるタンパク質ピークに分 離する（Ｆｉｇｕｒｅ６）。それらのタンパク質のうち、ピーク５．４には、強 い抗菌類活性がみられる。続く２回目のＲＰ-ＨＰＬＣ（Ｆｉｇｕｒｅ７）の結 果、そのタンパク質は単一のタンパク質となる。それはＳＤＳ-ＰＡＧＥおよび アミノ酸シークエンスより分かる。このタンパク質をＩＷＦ７とする。抗菌類活性 当該タンパク質のみの場合またはＷＩＮ Ｎ（ヘジガードら（FEBS Letters,3 07，389-392(1992)）により報告されているように、大麦または圧し潰した大麦 の葉から精製できる）と組み合わせた場合、いずれの場合のタンパク質をおよび ／または配列番号７〜１２および１４の何れかのうち、少なくとも１つの配列に 該当する配列を保有するタンパク質をセルコスポラ・ベチコラ（C．beticola） の胞子とともにインキュベートする。その検定溶液（２４０μｌ）には、ジャガ イモデキストロースブイヨン（Ｄｉｆｃｏ）１００μｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ８．０）および２０ｍＭ ＮａＣｌに懸濁したサンプルタンパク質４０μ １（コントロールではバッファーを使用）および約４００個の胞子の入った水１ ００μｌを含む。マイクロタイタープレートは揮発と細菌汚染を避けるためテー プでシールし、その後アジテイターを使い２００ｒｐｍ、室温でインキュベート する。８日間、６２０ｎｍの吸収を測定し、各濃度について時間に対してプロッ トする。ＩＷＦ５で示されるタンパク質はセルコスポラ・ベチコラ（C．beticol a）に対して強い増殖抑制を示した。１０μｇ／ｗｅｌｌ（４０μｇ／ｍｌ）で は菌類の増殖は検知されず（Ｆｉｇｕｒｅ８）、４μｇ／ｗｅｌｌでは増殖は顕 著に遅延し、強力に抑制された（Ｆｉｇｕｒｅ９）。ＩＷＦ６で示されるタンパ ク質もまたセルコスポラ・ベチコラ（C．beticola）に対して強い増殖抑制がみ られる。その活性レベルはＩＷＦ５のレベルと同程度であり、〜５μｇ／ｗｅｌ ｌで、ほぼ完全に増殖が阻害される（Ｆｉｇｕｒｅ１０）。さらにＩＷＦ７で示 されるタンパク質もまた、セルコスポラ・ベチコラ（C．beticola）に対して強 い増殖抑制がみられる。１０μｇ／ｗｅｌｌでは菌類の増殖は全くみられなかっ た（Ｆｉｇｕｒｅ１１）。さらに顕微鏡解析から、当該タンパク質により分生子 の発芽が抑制される様子がみられる。それゆえＩＷＦ７は菌糸の成長および胞子 の発芽に影響を与える。アミノ酸配列 ＣＭ-セファロースカラムの０．３Ｍ ＮａＣｌ画分（Ｆｉｇｕｒｅ１）から 得たＦｉｇｕｒｅ４のピーク４．４、Ｆｉｇｕｒｅ５のピーク４．３およびＦｉ ｇｕｒｅ７のピーク４．４にあたる精製された抗菌類タンパク質は、カルボキシ メチル化され、Ｖｙｄａｃ Ｃ₄カラムを使いＲＰ−ＨＰＬＣで精製する。溶媒 組成は、Ａ：０．１％ＴＦＡを含む水およびＢ：０．１％ＴＦＡを含むアセトニ トリルである。タンパク質は、若干異なる保持時間にシングルピークとして現れ る。エンド−Ｒ−プロテイナーゼでタンパク質のＣ末端を切断し、Ｖｙｄａｃ Ｃ₁₈カラムを使いＲＰ−ＨＰＬＣで逐次精製することによりタンパク質のＣ末端 配列が得られる。ＩＷＦ５，ＩＷＦ６およびＩＷＦ７／ｃＤＮＡのクローニング ＩＷＦ５、ＩＷＦ６およびＩＷＦ７のｃＤＮＡ配列は、既に（ニールセンら． 1996;Plant Mol．Biol.，31:539-552）述べられているように以下のプライマー ３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥを使用して得られる。 Ａ．３’ＲＡＣＥプライマー Ｂ．５’ＲＡＣＥプライマー ＩＷＦ５ ３’ＲＡＣＥ ３’ＲＡＣＥにより一部のｃＤＮＡクローンの単離を目的とし二つの縮重オリ ゴヌクレオチドプライマーを構築した。それはＩＷＦ５タンパク質のアミノ酸配 列をもとに構築した。コリンゲら．１９８７（Plant Mol．Biol 8:405-414）に 従い、セルコスポラ・ベチコラ（C．beticola）をビート(変種 モノバ（cv．Mo nova）)の葉に接種して六日経過後のものからトータルＲＮＡを精製する。ＰＣ Ｒを使った逆転写にはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒのキットを用い、操作はキット のプロトコールに従った。簡単にふれると、トータルＲＮＡ１μｇおよびＱ_T-プ ライマー２．５ｐｍｏｌに逆転写酵素を添加後４２℃で４５分間インキュベーシ ョンし、その後９９℃で５分間インキュベーションし、５℃で５分間インキュベ ーションする。最初のＰＣＲでは、Ｑ₀プライマー４０ｐｍｏｌを下流プライマ ーとして用い、縮重プライマー（５’−ＧＣ（ＡＣＧＴ）ＴＧ（ＣＴ）（ＡＣ） Ｇ（ＡＣＧＴ）ＴＧ（ＣＴ）ＡＴＧＡＡ：ＩＷＦ５ ｃＤＮＡ配列の３１５−３ ３１の位置）１５０ｐｍｏｌを上流プライマーとして用いた。入れ子状態である 二回目のＰＣＲでは、Ｑ₁プライマー５０ｐｍｏｌを下流プライマーとして用い 、縮重プライマー（５’−ＧＧ（ＡＣＧＴ）ＡＴ（ＡＣＴ）ＡＡ（ＣＴ）ＣＡ（ ＣＴ）ＡＡ（ＧＡ）ＴＡ：ＩＷＦ５ ｃＤＮＡ配列の３５４−３７０の位置）５ ０ｐｍｏｌを上流プライマーとして用いた。ＰＣＲのサイクルは９４℃１分間、 ４２℃２分間、５０℃１分間、７２℃５分間を１サイクル、その後９４℃１分間 、４２℃２分間、７２℃３分間を３５サイクル、さらにその後７２℃１０分間保 温する。二回目のＰＣＲ後、３９０ｂｐの一本鎖ＤＮＡ産物が得られる。そのＤ ＮＡ産物はｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、サーモ シ ークエネース フローレセント サイクル シークエンシング キット（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ）およびＡＬＦ ＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って、 塩基配列を決定した。 ＩＷＦ５ ５’ＲＡＣＥ 三つの遺伝子特異的プライマー（３’ＲＡＣＥより得られるｃＤＮＡ配列の一 部をもとに構築したプライマー）を使うＧｉｂｃｏ ＢＲＬの５’ＲＡＣＥシス テムを用いて、ＩＷＦ５ ｃＤＮＡの５’末端の配列は５’ＲＡＣＥにより得ら れる。簡単にふれると、３’ＲＡＣＥのときに使用したのと同じトータルＲＮＡ １μｇおよび遺伝子特異的プライマーＧＳＰ５-１（５’-ＴＧＧＡＡＴＴＧＧ- ＡＧＡＴＴＡＴＧＴＡＡＧ：ＩＷＦ５ ｃＤＮＡ配列の６１９−６４３の位置） ２．５ｐｍｏｌを混合し、７０℃１０分間インキュベーションした後、逆転写酵 素を添加し、４２℃３０分間、７０℃１５分間インキュベーションする。その後 ＲＮａｓｅＨを添加し、さらに５５℃１０分間インキュベーションする。Ｇｉｂ ｃｏ ＢＲＬのプロトコールに従うとｃＤＮＡの尾部はｄＣとなる。尾部のつい たｃＤＮＡで２度ＰＣＲを行う。最初のＰＣＲでは、５’-ＡＮＫＥＲプライマ ー２０ｐｍｏｌを上流プライマーとして用い、遺伝子特異的プライマ−ＧＳＰ５ -２（５’-ＴＣＡＣＴＴＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡ-ＣＡＴＧ：ＩＷ Ｆ５ ｃＤＮＡ配列の５９６−６２２の位置）２０ｐｍｏｌを下流プライマーと して用いた。二番目のＰＣＲでは５’-ＵＮＩプライマー５０ｐｍｏｌを上流プ ライマーとして用い、遺伝子特異的プライマ−ＧＳＰ５-３（５’-ＴＡＡＧＣＡ ＧＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡ-ＴＧ：ＩＷＦ５ ｃＤＮＡ配列の５４８− ５７２の位置）５０ｐｍｏｌを下流プライマーとして用いた。最初のＰＣＲは９ ４℃１分間、５１℃１分間、７２℃２分間で３５サイクルした後、７２℃１０分 間保温する。二度目のＰＣＲは９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間で３ ５サイクルした後、７２℃１０分間保温する。６００ｂｐの一本鎖ＤＮＡ産物を ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、サーモシークエネース フローレセント サイクル シークエンシング キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およ びＡＬＦ ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って、塩基配列を 決定した。 ＩＷＦ６ ３’ＲＡＣＥ ３’ＲＡＣＥにより一部のｃＤＮＡクローンの単離を目的とし二つの縮重オリ ゴヌクレオチドプライマーを構築した。それはＩＷＦ６タンパク質のアミノ酸配 列をもとに構築した。コリンゲら．１９８７（Plant Mol．Biol 8:405-414）に 従い、セルコスポラ・ベチコラ（C．beticola）をビート（変種 モノバ（cv．M onova））の葉に接種して六日経過後のものからトータルＲＮＡを精製する。Ｐ ＣＲを使った逆転写にはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒのキットを用い、操作はキッ トのプロトコールに従った。簡単にふれると、トータルＲＮＡ１μｇおよびＱ_T- プライマー２．５ｐｍｏｌに逆転写酵素を添加後４２℃で４５分間インキュベー ションし、その後９９℃で５分間インキュベーションし、５℃で５分間インキュ ベーションする。最初のＰＣＲでは、Ｑ₀プライマー４０ｐｍｏｌを下流プライ マーとして用い、縮重プライマー（５’-ＧＧ（ＡＧＣＴ）ＴＡ（ＣＴ）ＴＧ（ ＣＴ）ＡＡ（ＣＴ）ＡＴ（ＡＣＴ）（ＴＣ）Ｔ：ＩＷＦ６ ｃＤＮＡ配列の２９ ７−３１３の位置）１５０ｐｍｏｌを上流プライマーとして用いた。入れ子状態 である二回目のＰＣＲでは、Ｑ₁プライマー５０ｐｍｏｌを下流プライマーとし て用い、縮重プライマー（５’-ＡＡ（ＣＴ）ＧＴ（ＡＣＧＴ）ＴＧ（ＣＴ）Ｔ Ｇ（ＣＴ）ＧＣ（ＡＣＧＴ）ＧＧ：ＩＷＦ６ ｃＤＮＡ配列の３１４−３３２の 位置）５０ｐｍｏｌを上流プライマーとして用いた。ＰＣＲのサイクルは９４℃ １分間、４２℃２分間、５０℃１分間、７２℃３分間を１サイクル、その後９４ ℃１分間、４２℃２分間、７２℃３分間を３５サイクル、さらにその後７２℃１ ０分間保温する。二回目のＰＣＲ後、３２０ｂｐの一本鎖ＤＮＡ産物が得られる 。そのＤＮＡ産物はｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、サ ーモ シークエネース フローレセント サイクル シークエンシングキット（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）およびＡＬＦ ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を 使って、塩基配列を決定した。 ＩＷＦ６ ５’ＲＡＣＥ 三つの遺伝子特異的プライマー（３’ＲＡＣＥより得られるｃＤＮＡ配列の一 部をもとに構築したプライマー）を使うＧｉｂｃｏ ＢＲＬの５’ＲＡＣＥシス テムを用いて、ＩＷＦ６ ｃＤＮＡの５’末端の配列は５’ＲＡＣＥにより得ら れる。簡単にふれると、３’ＲＡＣＥのときに使用したのと同じトータルＲＮＡ １μｇおよび遺伝子特異的プライマーＧＳＰ６-１（５’-ＣＡＴＣＡＡＧＡ-Ａ ＧＴＣＣＡＴＡＡＴＴＧＴＣＴＡＧ：ＩＷＦ６ ｃＤＮＡ配列の５０８−５３２ の位置）２．５ｐｍｏｌを混合し、７０℃１０分間インキュベーションした後、 逆転写酵素を添加し、４２℃３０分間、７０℃１５分間インキュベーションする 。その後ＲＮａｓｅＨを添加し、さらに５５℃１０分間インキュベーションする 。Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬのプロトコールに従うとｃＤＮＡの尾部はｄＣとなる。尾 部のついたｃＤＮＡで２度ＰＣＲを行う。最初のＰＣＲでは、５’-ＡＮＫＥＲ プライマー２０ｐｍｏｌを上流プライマーとして用い、遺伝子特異的プライマー ＧＳＰ６-２（５’-ＴＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＧＡＣ-ＡＡＡＣＡＧＡＣＧＣ：Ｉ ＷＦ６ ｃＤＮＡ配列の４７３−４９８の位置）２０ｐｍｏｌを下流プライマー として用いた。二番目のＰＣＲでは５’-ＵＮＩプライマー５０ｐｍｏｌを上流 プライマーとして用い、遺伝子特異的プライマーＧＳＰ６-３（５’-ＡＣＡＧＡ ＣＡＣＧＣＴＡＧＴＴ-ＡＧＡＴＧＡＣＴＡＡＧＣ：ＩＷＦ６ ｃＤＮＡ配列の４ ５６−４８２の位置）５０ｐｍｏｌを下流プライマーとして用いた。最初のＰＣ Ｒは９４℃１分間、５１℃１分間、７２℃２分間で３５サイクルした後、７２℃ １０分間保温する。二度目のＰＣＲは９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分 間で３５サイクルした後、７２℃１０分間保温する。５１０ｂｐの一本鎖ＤＮＡ 産物をｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、サーモ シーク エネース フローレセント サイクル シークエンシング キット（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ）およびＡＬＦ ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って、塩 基配列を決定した。 ＩＷＦ７ ３’ＲＡＣＥ ３’ＲＡＣＥにより一部のｃＤＮＡクローンの単離を目的とし二つの縮重オリ ゴヌクレオチドプライマーを構築した。それはＩＷＦ７タンパク質のアミノ酸配 列をもとに構築した。コリンゲら．１９８７（Plant Mol．Biol 8:405-414）に 従い、セルコスポラ・ベチコラ（C．beticola）をビート（変種 モノバ（cv．M onova））の葉に接種して六日経過後のものからトータルＲＮＡを精製する。Ｐ Ｃ Ｒを使った逆転写にはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒのキットを用い、操作はキット のプロトコールに従った。簡単にふれると、トータルＲＮＡ１μｇおよびＱ_T-プ ライマー２．５ｐｍｏｌに逆転写酵素を添加後４２℃で４５分間インキュベーシ ョンし、その後９９℃で５分間インキュベーションし、５℃で５分間インキュベ ーションする。最初のＰＣＲでは、Ｑ₀プライマー４０ｐｍｏｌを下流プライマ ーとして用い、縮重プライマー（５’-ＧＡ（ＡＧ）ＣＡ（ＡＧ）ＡＡ（ＡＧ） ＣＣ（ＡＣＧＴ）ＴＧＡ（ＣＴ）（ＣＴ）Ｔ：ＩＷＦ７ ｃＤＮＡ配列の２４７ −２６３の位置）１５０ｐｍｏｌを上流プライマーとして用いた。入れ子状態で ある二回目のＰＣＲでは、Ｑ₁プライマー５０ｐｍｏｌを下流プライマーとして 用い、縮重プライマー（５’-ＴＧ（ＣＴ）ＧＧ（ＡＣＧＴ）ＴＡ（ＣＴ）ＴＡ （ＣＴ）ＡＡ（ＡＧ）ＡＡ：ＩＷＦ７ ｃＤＮＡ配列の２６５−２８６の位置） ５０ｐｍｏｌを上流プライマーとして用いた。ＰＣＲのサイクルは９４℃１分間 、４２℃２分間、５０℃１分間、７２℃３分間を１サイクル、その後９４℃１分 間、４２℃２分間、７２℃３分間を３５サイクル、さらにその後７２℃１０分間 保温する。二回目のＰＣＲ後、２７０ｂｐの一本鎖ＤＮＡ産物が得られる。その ＤＮＡ産物はｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、サーモ シークエネース フローレセント サイクル シークエンシング キット（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ）およびＡＬＦ ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使っ て、塩基配列を決定した。 ＩＷＦ７ ５’ＲＡＣＥ 三つの遺伝子特異的プライマー（３’ＲＡＣＥより得られるｃＤＮＡ配列の一 部をもとに構築したプライマー）を使うＧｉｂｃｏ ＢＲＬの５’ＲＡＣＥシス テムを用いて、ＩＷＦ７ ｃＤＮＡの５’末端の配列は５’ＲＡＣＥにより得ら れる。簡単にふれると、３’ＲＡＣＥのときに使用したのと同じトータルＲＮＡ １μｇおよび遺伝子特異的プライマーＧＳＰ７-１（５’-ＣＣＴＡＡＴＴＴＣ- ＣＣＴＣＡＡＡＴＣＡＣＧ：ＩＷＦ７ ｃＤＮＡ配列の４４３−４６３の位置） ２．５ｐｍｏｌを混合し、７０℃１０分間インキュベーションした後、逆転写酵 素を添加し、４２℃３０分間、７０℃１５分間インキュベーションする。その後 ＲＮａｓｅＨを添加し、さらに５５℃１０分間インキュベーションする。Ｇｉｂ ｃｏ ＢＲＬのプロトコールに従うとｃＤＮＡの尾部はｄＣとなる。尾部のつい たｃＤＮＡで２度ＰＣＲを行う。最初のＰＣＲでは、５’-ＡＮＫＥＲプライマ ー２０ｐｍｏｌを上流プライマーとして用い、遺伝子特異的プライマーＧＳＰ７ -２（５’-ＡＡＴＴＴＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧ：ＩＷＦ７ｃ ＤＮＡ配列の４３６−４６０の位置）２０ｐｍｏｌを下流プライマーとして用い た。二番目のＰＣＲでは５’-ＵＮＩプライマー５０ｐｍｏｌを上流プライマー として用い、遺伝子特異的プライマーＧＳＰ７-３（５’-ＴＣＧＴＣＡＧＴＴＴ ＴＧＧＣＴＣＡＴＴＴＴＧＧＧ：ＩＷＦ７ ｃＤＮＡ配列の４００−４２３の位 置）５０ｐｍｏｌを下流プライマーとして用いた。最初のＰＣＲは９４℃１分間 、５１℃１分間、７２℃２分間で３５サイクルした後、７２℃１０分間保温する 。二度目のＰＣＲは９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間で３５サイクル した後、７２℃１０分間保温する。４５０ｂｐの一本鎖ＤＮＡ産物をｐＴ７Ｂｌ ｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、サーモ シークエネース フローレ セント サイクルシークエンシング キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＡＬＦ ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って、塩基配列を決定した。形質転換された植物の産物 本発明のタンパク質をコードする遺伝子は植物に導入できる。遺伝子特異的プ ライマーを用いて、そのタンパク質をコードする遺伝子領域を該当するｍＲＮＡ よりＰＣＲを使い合成する。プロモーター配列およびターミネーター配列の付加 後、当該タンパク質をコードする遺伝子を植物形質転換ベクターに組み込む。そ のベクターは、ＷＩＮタンパク質をコードする遺伝子を任意に含む。それは例え ば大麦または圧し潰した大麦の葉から得られるタンパク質をコードする遺伝子お よび／または配列番号４〜９のうち一つまたはそれ以上のタンパク質をコードす る遺伝子、および／またはキチナーゼおよび、またはグルカナーゼをコードする 遺伝子といったものである。これに該当する可能性のあるキチナーゼには、ＰＣ Ｔ特許出願番号ＰＣＴ／ＤＫ９２／００１０８（公開番号ＷＯ９２／１７５９１ ）に記載されているキチナーゼ４がある。例えば、アグロバクテリウム・トゥメ ファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）が、これらのベクターで形質転換 できる。植物細胞は、形質転換されたアグロバクテリウムにより形質転換され、 新しい核酸が安定してゲノム内に組み込まれた個体全体へと再生する。しかしな がら、本発明のタンパク質（またはそのようなタンパク質を組み合わせたもの） をコードするＤＮＡ、さらに任意に他のタンパク質をコードするＤＮＡが他の既 知の方法（ミクロプロジェクチルガン、エレクトロポレーション、エレクトロト ランスフォーメーションおよびマイクロインジェクション等の使用を含む）によ り植物細胞へ導入され得ること、および形質転換された植物細胞の再生が、当業 者に知られる方法（再生頻度を改善するためサイトカインが必要な場合または望 ましい場合、これによる細胞の処理を含む）により行えることは評価に値する。 さらに適当な微生物（すなわち本発明のタンパク質からなる産物があまり毒性と はならない微生物）は、そのような遺伝子（数種の遺伝子）を含むベクターで形 質転換され、そのため形質転換された微生物はそのようなタンパク質を産生する 。ＷＩＮタンパク質および／または配列番号４〜９のうち、一つまたはそれ以上 の配列を持つタンパク質といった、他のタンパク質をコードする遺伝子をその微 生物が保有し得る。そのような他のタンパク質には、さまざまなキチナーゼおよ び／またはグルカナーゼが含まれる。そのような他のタンパク質のうち、ＰＣＴ 特許出願番号ＰＣＴ／ＤＫ９２／００１０８（公開番号ＷＯ９２／１７５９１） に記載されているキチナーゼ４が該当する可能性がある。 これらの微生物は植物の病原体を死滅させるのに利用できる。例えば、形質転 換した微生物を乾燥させ、感染した植物または感染の恐れのある植物に散布でき る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ブルンステット，ヤンネ デンマーク、デーコー―4000ロスキレ、デ ューホルム18番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．本発明により提供された、-Gln/Cys-AA₂-Pro/Ile-Asn/Thr/Leu-AA₅-AA₆-Cys -Cys-Ala/Asn-Gly/Lys-AA₁₁-AA₁₂-AA₁₃-AA₁₄-AA₁₅-（ただし、AA₂およびAA₁₄は システィンとはならず、AA₁がCysのときAA₄はLeu）の配列を有するペプチドを含 む抗微生物タンパク質。 ２．配列番号３、５または６の何れかの配列を含む抗微生物タンパク質。 ３．請求項１のタンパク質と少なくとも９５％の類似性のある精製タンパク質。 ４．請求項２のタンパク質に少なくとも６５％の類似性、好ましくは７５％の類 似性、さらに好ましくは８５％の類似性、特に好ましいのは９５％の類似性のあ る精製タンパク質。 ５．配列番号７〜１２および１４からなるグループより選択した少なくとも一つ 以上のタンパク質との組み合わせである、請求項１〜４の何れか１項の精製タン パク質。 ６．除草剤抵抗性、植物成長促進作用、抗カビ性、抗菌性、抗ウィルス性および ／または抗線虫性のあるタンパク質のうち少なくとも一つ以上のタンパク質との 組み合わせである請求項１〜５の何れか１項の精製タンパク質。 ７．請求項１〜６の何れか１項のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む組み 換えＤＮＡ。 ８．配列番号１、２または４に示したｃＤＮＡ配列を有する請求項７の組み換え ＤＮＡ。 ９．配列番号４〜９および１１のうち少なくとも一つ以上のタンパク質をコード するＤＮＡ配列を含む請求項７または８の組み換えＤＮＡ配列。 １０．除草剤抵抗性、植物成長促進作用、抗カビ性、抗菌性、抗ウィルス性およ び／または抗線虫性のあるタンパク質をさらにコードする請求項７〜９の何れか １項の組み換えＤＮＡ。 １１．既知であるｍＲＮＡの不安定性モチーフおよびポリアデニル化シグナルが 除去修飾され、および／または導入する生物の好むコドンが使用される（そのタ ンパク質を内因的に保有する生物内において非修飾組み換えＤＮＡによる発現タ ンパク質と類似するタンパク質を組み換えＤＮＡを導入した生物内にて修飾ＤＮ Ａの発現により産生させるように）請求項７〜１０の何れか１項の組み換えＤＮ Ａ。 １２．激しい条件下、請求項７〜１１の何れか１項のＤＮＡとハイブリダイズす るＤＮＡと相補的なＤＮＡ配列。 １３．植物で利用可能なプロモーターおよびターミネーターを連結し発現する請 求項７〜１２の何れか１項のＤＮＡ配列を含むベクター。 １４．請求項７〜１２の何れか１項のＤＮＡまたは請求項１３のベクターを含む 生物学的方法。 １５．メンデルの方法で安定して組み込まれ遺伝可能となった請求項７〜１２の 何れか１項の組み換えＤＮＡを保有する植物の子孫、および／またはその植物お よび子孫の種子を含む当該組み換えＤＮＡで形質転換された植物。 １６．請求項１５の植物または子孫またはそれらの種子が保有する組み換えＤＮ Ａの発現により産生する抗微生物タンパク質を含む請求項７〜１２の何れか１項 のＤＮＡの発現から誘導されるタンパク質。 １７．請求項１〜６および１６の何れか１項のタンパク質のうち一つまたはそれ 以上タンパク質を含む抗微生物組成物。 １８．請求項１〜６、１６および１７の何れか１項のタンパク質または組成物を 菌類に作用させて菌類を死滅させる方法。 １９．マセレーションおよび溶媒抽出で、抗微生物タンパク質を含む生物材料（ 微生物または植物由来の生物材料であることが特徴である）から請求項１〜６ま たは１６の何れか１項のタンパク質を抽出する方法。